CN112941210A - 结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变检测试剂盒及方法，具体地，本发明公开了一种基于荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的方法及试剂盒，能够在体外快速定性检测结核病患者的结核分枝杆菌复合群阳性的痰液培养物样本中利福平耐药基因rpoB和异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC耐药决定区耐药突变。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和分子诊断领域，具体地说，本发明涉及一种结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变检测试剂盒及方法。
背景技术
结核病为结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的慢性传染性疾病。利福平(rifampicin，RIF)是利福霉素的半合成衍生物，是目前最主要的一线抗MTB药物，该药物通过与细菌RNA聚合酶β亚基结合干扰并抑制细菌的转录过程，实现杀菌效果。研究表明，约有95％以上的利福平耐药性是由rpoB基因的81bp(编码密码子507-533位)的利福平耐药决定区(rifampicin resistance determing region,RRDR)的突变包括点突变或短的插入、缺失突变等引起，使DNA依赖性RNA聚合酶β亚单位酶活性改变，利福平不能与细菌RNA聚合酶β亚单位结合而表现为耐药。rpoB基因突变一般是单个碱基突变或数个碱基联合突变，约80％-86％的碱基突变发生在3个氨基酸位点上，分别为531位的丝氨酸转换为亮氨酸、526位的组氨酸转换为酪氨酸、516位的天冬氨酸转换为缬氨酸、酪氨酸、甘氨酸等。
异烟肼(isoniazid,INH)，是抗结核病的常用一线药物，在结核病的治疗中一直起着重要的作用。但大多数结核病患者如果长期用药易产生耐药性，这主要是由于长期使用INH可诱导细菌产生基因突变，从而使细菌对INH的耐药性增强。目前已发现数个涉及异烟肼体内代谢过程中活性中间体形成有关的基因，其中katG、ahpC和inhA基因发生突变的频度最高。异烟肼耐药基因katG基因的3个突变密码子309、315、316，inhA基因的2个突变密码子-8、-15，ahpC基因的12个突变碱基-46、-44、-40，-39、-34、-32、-30、-15、-12、-10、-9、-6和3个突变密码子2、3、5进行耐药筛选。
MTR-TB的早期诊断和治疗是目前结核病控制的热点和难点之一。目前已有的分子生物学检测方法有Xpert MTB/RIF系统用于结核病的快速诊断和利福平耐药性检测及PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)以及基因测序(genetic sequencing)等检测MTB耐药基因，供临床选择应用。但这些方法PCR后处理操作步骤繁琐，对技术人员要求较高，且存在一定的交叉污染，不利于广泛推广。
(1)Xpert MTB/RIF快速检测利福平的耐药性：这是一种全新的快速诊断结核病和检测MTB耐药性的系统，该系统针对MTB的81bp利福平耐药核心区间设计引物、探针，并进行扩增检测，根据其是否发生基因突变来检测样本中是否含有MTB及其是否对利福平耐药，可以全自动地对样本进行核酸提取、纯化及浓缩，在2h内出结果。但是Gene-xpertMRT/RIF法出现假阴性的可能性较大，有可能导致患者被误诊为耐多药结核病而使疗程延长，不良反应增多，因此有其局限性，最终结果仍需结核菌药敏结果证实。
(2)聚合酶链反应-单链构象多态性分析(Polymerase Chain Reaction-SingleStrand Conformation Polymorphism,PCR-SSCP)：细菌的DNA基因片段在大多情况下，片段中单一碱基的置换即足以引起单链DNA空间构象的改变，这种改变又可导致该单链DNA电泳迁移率的相应变化，SSCP技术正是采用这一原理将含有突变的DNA片段与正常DNA片段通过电泳加以区分。不足之处主要是可能检出假阴性结果，对于未知基因变异的检测，假阴性结果就难以百分之百地消除。
(3)DNA直接测序法：细菌基因组DNA直接测序法(Direct Sequencing,DS)是利用PCR扩增待测基因，产物纯化或克隆化，取其DNA片段直接测序，其碱基序列与标准敏感株的同一DNA片段比较异同，寻找碱基突变的位置和分布，现在已把DNA测序作为检测细菌基因突变的“金标准”。但是缺点是周期长，费用大，且容易发生交叉污染。
因此亟需研发出一种检测成本低、检测周期短、灵敏度高、特异性好的结核分枝杆菌耐药突变检测技术，以满足临床需求。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变检测试剂盒及方法。具有检测成本低、检测周期短、灵敏度高、特异性好的优点。
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测结核分枝杆耐药突变的引物对集，所述引物对集包括：
第一引物对，所述第一引物对包括：
如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第二引物对，所述第二引物对包括：
如SEQ ID NO.8所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.9所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第三引物对，所述第三引物对包括：
如SEQ ID NO.10所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.11所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第四引物对，所述第四引物对包括：
如SEQ ID NO.12所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.13所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
内标引物对，所述内标引物对包括：
如SEQ ID NO.19所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.20所示的反向引物。
本发明的第二方面，提供了一种多重检测结核分枝杆耐药突变的探针集，所述探针集包括第一探针组：
所述第一探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4、5、6、7所示的探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括第二探针组：
所述第二探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.14、15、16所示的探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括第三探针组：
所述第三探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括第四探针组：
所述第四探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括内标探针组：
所述内标探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的探针。
在另一优选例中，各探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，各探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
本发明的第三方面，提供了一种用于多重检测结核分枝杆耐药突变的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含第一引物探针混合液，所述第一引物探针混合液中包含序列如SEQ ID NO.1、2所示的引物对，SEQ IDNO.19、20所示的引物对，以及SEQ ID NO.3、4、21所示的探针。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含第二引物探针混合液，所述第二引物探针混合液中包含序列如SEQ ID NO.1、2所示的引物对，SEQ IDNO.19、20所示的引物对，以及SEQ ID NO.5、6、7、21所示的探针。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含第三引物探针混合液，所述第三引物探针混合液中包含序列如SEQ ID NO.8、9所示的引物对，SEQ IDNO.10、11所示的引物对，SEQ ID NO.19、20所示的引物对，以及SEQ ID NO.14、15、18、21所示的探针。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含第四引物探针混合液，所述第四引物探针混合液中包含序列如SEQ ID NO.12、13所示的引物对，SEQ IDNO.8、9所示的引物对，SEQ ID NO.19、20所示的引物对，以及SEQ ID NO.17、16、21所示的探针。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第五容器，所述第五容器包含PCR缓冲液。优选地，所述PCR缓冲液包含选自下组的一种或多种组分：(NH4)2SO4、Tris-HCl、MgCl2、和Tween-20。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第六容器，所述第六容器包含PCR反应酶系。优选地，所述PCR反应酶系包括选自下组的一种或多种组分：热启动Taq酶、dNTPs、UDG酶、热启动Taq抗体酶。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第七容器，所述第七容器包含阴性对照。如，纯化水。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第八容器，所述第八容器包含阳性对照。优选地，所述阳性对照为人工合成的结核分枝杆菌rpoB、KatG、inhA、aphC基因野生型的质粒。
本发明的第四方面，提供了一种基于荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆耐药突变的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的核酸样本；
(2)制备PCR反应体系并进行PCR扩增反应：
其中，所述PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针组。
在另一优选例中，所述PCR反应体系包括：
体系1、体系2、体系3、和体系4；
其中，
体系1包括检测利福平耐药基因rpoB的引物SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和探针SEQID NO：3，SEQ ID NO：4；以及内控引物探针SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21；和，所述核酸样本；
体系2包括检测利福平耐药基因rpoB的引物SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和探针SEQID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，以及内控引物探针SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQID NO：21；和，所述核酸样本；
体系3包括检测异烟肼药基因aphC的引物SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9和探针SEQID NO：15，SEQ ID NO：14，KatG的引物SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和探针SEQ ID NO：18，以及内控引物探针SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21；和，所述核酸样本；
体系4包括检测异烟肼耐药基因inhA引物SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，探针SEQID NO：17，aphC的引物SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9和探针SEQ ID NO：16，以及内控引物探针SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21；和，所述核酸样本。
在另一优选例中，所述核酸样本可来自痰液样本、或环境样本。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。
在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括PCR反应酶系。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
(3)检测PCR扩增反应产物的Tm值或熔解峰判断核酸样本中是否存在突变。
本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针组的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测结核分枝杆耐药突变。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1检测结核阴性样本的Texas-Red通道的PCR结果
图2检测结核阴性样本的CY5通道的PCR结果
图3检测结核阴性样本的VIC通道的PCR结果
图4检测rpoB基因第511密码子突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图5检测rpoB基因第513密码子突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图6检测rpoB基因第516密码子突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图7检测rpoB基因第533密码子突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图8检测rpoB基因第522密码子突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图9检测rpoB基因第526密码子突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图10检测rpoB基因第510-512密码子缺失突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图11检测rpoB基因第517-518密码子缺失突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图12检测ahpC基因第-46碱基突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图13检测ahpC基因第-44密码子突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图14检测ahpC基因第-40碱基突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图15检测ahpC基因第-39碱基型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图16检测ahpC基因第-34碱基突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图17检测ahpC基因第-32碱基突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图18检测ahpC基因第-30碱基突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图19检测ahpC基因第-15碱基突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图20检测ahpC基因第-12碱基突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图21检测ahpC基因第-10碱基突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图22检测ahpC基因第-9碱基突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图23检测ahpC基因第-6碱基突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图24检测ahpC基因第2密码子突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图25检测ahpC基因第3密码子突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图26检测ahpC基因第5密码子突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图27检测katG基因第315密码子突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图28检测katG基因第316密码子突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图29检测katG基因第-15密码子突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图30检测katG基因第-8密码子突变型PCR反应管结核耐药阳性样本和结核耐药阴性样本的PCR结果
图31对照体系1的检测结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种基于荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的方法及试剂盒，能够在体外快速定性检测结核病患者的结核分枝杆菌复合群阳性的痰液培养物样本中利福平耐药基因rpoB和异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC耐药决定区耐药突变。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
多重PCR
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
影响多重PCR反应的因素有很多，比如：
(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
基于荧光PCR熔解曲线法的结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变检测方法是一种简单快速的PCR检测技术，其主要检测原理为耐药基因的基因突变会导致DNA双链的结合力下降，从而导致相应的Tm值下降，即野生型基因有特定的Tm值而突变型基因因为结合能力下降导致Tm值发生变化，据此可以区分和检测出突变型和野生型。
本发明中，荧光PCR熔解曲线法采用闭管法，即将检测样本和检测试剂集中于反应管中，在反应过程中无须打开，避免了扩增产物的污染，有利于反应后熔解曲线的分析。
目前市面上存在的结核病耐药的检测试剂盒较多，但是都是针对耐单一药物的结核菌进行检测，随着耐多药结核菌的逐渐增多，这一类型试剂盒显然不能满足临床检测的要求。本试剂盒通过针对利福平耐药和异烟肼耐药基因设计特异性探针，可同时检测利福平和异烟肼耐药结核菌。耐多药结核是耐药结核的一种特定形式。在结核细菌对至少两种最强有力的抗结核药物异烟肼和利福平具有耐药性时，产生耐多药结核。
本发明提供了一种基于荧光PCR熔解曲线法，体外快速定性检测结核病患者的结核分枝杆菌复合群阳性的痰液培养物样本中利福平耐药基因rpoB和异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC耐药决定区耐药的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒，具有操作流程简单、检测时间短、检测成本低等优点。
本发明的技术方案如下：
一种基于实时荧光PCR平台，体外快速定性检测结核病患者的结核分枝杆菌复合群阳性的痰液培养物样本中利福平耐药基因rpoB和异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC耐药决定区耐药的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒。提供了用于检测利福平耐药基因rpoB和异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC耐药决定区所需的特异性引物及探针。
在本发明一个优选地实施方式中，本发明公开了一种快速定性检测结核病患者的结核分枝杆菌复合群阳性的痰液培养物样本中利福平耐药基因rpoB耐药决定区耐药和异烟肼耐药基因KatG、inhA和aphC基因的引物、探针。
较佳地，所述检测利福平耐药基因rpoB的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述检测利福平耐药基因rpoB的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
较佳地，所述检测利福平耐药基因rpoB的511、513、516突变密码子的探针核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述检测利福平耐药基因rpoB的531、533突变密码子的探针核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示；
所述检测利福平耐药基因rpoB的522、526突变密码子的探针核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示；
所述检测利福平耐药基因rpoB的510-512密码子缺失的探针核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示；
所述检测利福平耐药基因rpoB的517-518密码子缺失的探针核苷酸序列如SEQ IDNO：7所示。
较佳地，所述检测异烟肼耐药基因KatG上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；所述检测异烟肼耐药基因KatG下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
较佳地，所述检测异烟肼耐药基因inhA上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；所述检测异烟肼耐药基因inhA下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
较佳地，所述检测异烟肼耐药基因aphC上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述检测异烟肼耐药基因aphC下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
较佳地，所述检测内控基因DXO上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示；所述检测内控基因DXO下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
较佳地，所述检测异烟肼耐药inhA基因-15、-8突变密码子的探针核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。
较佳地，所述检测异烟肼耐药KatG基因315、316突变密码子的探针核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。
较佳地，所述检测异烟肼耐药aphC基因-46、-44、-40、-39、-34、-32、-30突变碱基的探针核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；
所述检测异烟肼耐药aphC基因-15、-12、-10、-9、-6突变碱基的探针核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；
所述检测异烟肼耐药aphC基因2、3、5突变密码子探针核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
较佳地，所述检测内控基因DXO的的探针核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示。
进一步地，所述SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18探针核苷酸序列的5’端标记有Texas Red，3’端标记有BHQ2。
进一步地，所述SEQ ID NO：15探针核苷酸序列的5’端标记有VIC，3’端标记有BHQ1。
进一步地，所述SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7探针的核苷酸序列的5’端标记有CY5，3’端标记有BHQ2。
进一步地，所述SEQ ID NO：17探针的核苷酸序列的5’端标记有CY5，3’端标记有BHQ2。
进一步地，内控探针SEQ ID NO：21的核酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ1。
优选地，内控及野生型和突变型基因检测上游引物在反应体系中的终浓度为40pmol/μL，所述检测下游引物在反应体系中的终浓度为20pmol/μL，所述内控探针及突变型和野生型检测探针在反应体系中的终浓度为20pmol/μL；
所述内控及野生型和突变型基因检测引物和探针序列如下表1：
表1引探序列信息
上述PCR引物和标有不同类型荧光基团的探针可分别用于对利福平耐药基因rpoB的511、513、516、531、533、522、526密码子突变及510-512密码子缺失、517-518密码子缺失进行检测，及异烟肼耐药基因inhA突变密码子-8，-15，基因aphC突变碱基-46、-44、-40、-39、-34、-32、-30、-15、-12、-10、-9、-6和突变密码子2、3、5和KatG基因突变密码子315、316耐药突变位点进行检测。
通过荧光PCR仪检测荧光信号，根据各通道检测的Tm值或熔解峰判断模板是否发生突变。
对于点突变类型，当模板为野生型时，探针与模板的匹配度最佳，Tm值最高；若模板为纯突变型，探针与模板不能完全匹配，Tm值下降；若模板为不均一突变则检测结果为两个熔解峰。
对于缺失突变型，若模板为野生型则无熔解峰，若模板为纯突变或不均一突变则存在熔解峰。
上述特异性引物和探针所制备的试剂盒，基于PCR平台可快速定性检测利福平和异烟肼耐药突变，为耐多药结核病的辅助诊断提供有效的技术指导。
在本发明另一个优选地实施方式中，本发明还公开了结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变检测试剂盒，包括用于配制PCR反应液的引物探针混合液、5×DNA buffer、热启动Taq抗体酶、对照样本和纯化水。其中，引物探针混合液包括如下成分，如表2：
表2引物探针混合液
所述PCR反应液的5×Buffer包括如下成分，如表3：
表3 5×RT Buffer
| 编号 | 组分 | 组分中的主要成分 |
| 1 | 5×RT Buffer | (NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>、Tris-HCl、MgCl<sub>2</sub>、Tween-20 |
所述对照品包括如下成分，如表4：
表4对照样本
本发明所述试剂盒适用样本为结核病患者的结核分枝杆菌复合群阳性痰液培养物。
本发明所述试剂盒用于判定检测有效性的标准为：
待检样本Tm值使用Tm S表示，具体数值由仪器自动读取对应的反应孔得到。当检测峰型为单一熔解峰时，可直接通过计算阳性质控品Tm W(野生型样本Tm值)与待检样本对应通道Tm S值的差值进行判读。
若任一TB RIF反应管中Texas Red和CY5通道满足Tm W-Tm S≥2℃，则为结核分枝杆菌利福平耐药突变阳性；若任一TB INH反应管C、D中Texas Red、CY5、VIC通道满足Tm W-Tm S≥2℃，则为结核分枝杆菌异烟肼耐药突变阳性。反之，则为结核分枝杆菌耐药突变阴性。
在本发明另一个优选地实施方式中，本发明还公开了结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变检测的方法，具体步骤如下：
1.痰液样本采集和培养：
1.1样本采集
1.1.1样本采集要求：所采集的样本应为临床诊断为结核分枝杆菌复合群阳性的痰液样本。
1.1.2样本采集方法：
采样前准备：痰液标本的容器(采用国际通用螺旋盖痰液瓶，或选用直径40mm、高20mm有螺旋盖可密封的塑料盒)，容器上应注明患者姓名、编号、检查项目、痰液标本序号及送检日期。
采样：人痰液样本，包括即时痰、清晨痰和夜间痰，使用其中任意一种痰液样本培养即可。即时痰为患者就诊时深呼吸后咳出的痰液，清晨痰为清晨晨起立即用清水漱口后深咳出的痰液，夜间痰为送痰前一日夜间咳出的痰液；合格的痰液标本应是脓样、干酪样或脓性黏液样性质的痰液，痰量以3mL～5mL为宜。痰液标本应由检验人员或经培训合格的专人验收，痰液不合格者，要求重新送检；当难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状，以便分析结果时参考。
1.2样本保存和运送
当天不能制备培养的痰液标本应置2-8℃冰箱内保存，时间不能超过7天。痰液标本如需在机构之间运送应按照规定取得相关许可，然后冷藏运送。
1.3结核分枝杆菌菌株培养
结核分枝杆菌采用罗氏酸性培养基培养。
2.核酸提取
推荐采用本公司生产的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20181263号)，具体的操作步骤详见试剂说明书。
3.PCR检测
3.1配制反应体系，反应体系构成如表5
表5反应体系
3.2将PCR反应管放入仪器样品槽内，并记录放置顺序。
3.3荧光通道选择：选择FAM，CY5，Texas-Red和VIC通道，并选择各样品孔需要收集的荧光基团。
3.4设置循环条件如下表，反应体系体积设置为25μL。
4.检测原理
本申请采用的是PCR熔解曲线法，检测原理如下：
本试剂盒采用荧光PCR熔解曲线法，使用特异引物经PCR扩增得到与探针序列互补的单链寡核苷酸序列，在扩增完成后进行熔解曲线分析，通过荧光PCR仪检测荧光信号，然后仪器软件系统通过计算各荧光通道的荧光值与温度的负导数自动绘制熔解曲线，并得到熔解峰及熔点(Tm)，根据各通道检测的熔点或熔解峰判断模板是否发生突变。
对于点突变类型，当模板为野生型时，探针与模板的匹配度最佳，Tm值最高；若模板为纯突变型，探针与模板不能完全匹配，Tm值下降；若模板为不均一突变则检测结果为两个熔解峰。
对于缺失突变型，若模板为野生型则无熔解峰，若模板为纯突变或不均一突变则存在熔解峰。
本试剂盒添加了防污组分(尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG)，其作用机理是选择性水解断裂含有dU的双链或者单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，在碱基介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供了一种体外快速定性检测结核病患者的结核分枝杆菌复合群阳性的痰液培养物样本中利福平耐药基因rpoB和异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC耐药决定区耐药的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒。
(2)优化了特异性引物探针，分别针对rpoB基因的81bp(编码密码子507-533位)的利福平耐药决定区位点，以及异烟肼耐药基因katG基因的3个突变密码子309、315、316，inhA基因的2个突变密码子-8、-15，ahpC基因的15个突变位点-46、-44、-40、-39、-34、-32、-30、-15、-12、-10、-9、-6、2、3、5进行耐药筛选。与药敏法相比，极大的简化了操作过程，降低了研究成本和技术复杂性，缩短了检测时间。
(3)本发明与传统方法相比，它能够将药敏检测时间从2个月缩短至3小时，与目前国际国内同类产品相比，本试剂盒可以同时对利福平盒异烟肼耐药基因耐药决定区进行检测，具有硬件要求低，自动化程度高、检测药物种类多等优势。在耐多药结核分枝杆菌日渐增多的大背景下，本试剂盒值得推广应用。
(4)本发明经过多轮筛选验证，从大量引物探针组合中获得了灵敏度高、特异性强、重复性好，适用于荧光PCR熔解曲线法检测，并且能够进行多重检测的引物探针组合，检测限可达4拷贝/微升。
本发明适用于对结核分枝杆菌核酸的检测，为结核病鉴定和防控提供可靠的依据，值得推广应用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在院感防控过程中，使用本发明的检测方法对环境样本进行检测，这些可以满足院感管理之需。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1.试剂盒及检测方法
结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变检测试剂盒的组成成分、包装及数量(以24人份/盒为例)，如表6：
表6试剂盒的组成成分、包装及数量
具体实施步骤如下：
1.样本处理和核酸提取(样本处理区)
推荐采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20181263号)；具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。本试剂盒中的内标溶液需参与各样本提取过程，若提取试剂盒未说明内标使用方法，请按样本体积：内标溶液体积＝40：1的比例在各样本中加入内标溶液后进行核酸提取。
2.PCR试剂准备(试剂准备区)
从试剂盒中取出PCR引物和探针反应混合液和酶系置于室温融化后振荡混匀，8,000rpm离心数秒后使用。取2N个(N＝待测样本个数+阴性质控品+阳性质控品)PCR反应管。分别按照下表反应体系的用量，计算需要配制的各反应管总量，并分别配制成混合液。
PCR反应管体系(1人份)
| 引物探针混合液 | 酶系 | 总体积 |
| 17μL | 3μL | 20μL |
将各管各组分充分混合后进行短时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底，之后分别将20μL扩增体系分装到PCR管中。
3.加样(样本制备区)
往上述配制的PCR反应管中分别依次加入5μL提取后的待测样本核酸、TB RIF阴性质控品、TB RIF阳性质控品、TB INH阳性质控品、TB INH阳性质控品。盖紧管盖，8000rpm瞬时离心后转移至扩增检测区。
4.PCR扩增(扩增检测区，Bio-Rad CFX 96Deep well Dx System PCR仪)
4.1将反应管放入样品槽中，点击Close lid盖上盖子。
4.2 Bio-Rad CFX 96Deep well Dx System仪器设置：
4.2.1在Bio-Rad软件的主界面依次点击“File”→“New”→“Protocol”，之后到“Protocol editor”界面，并在此界面左边的列表里根据试剂盒的上机程序(表7)设置好后点击右下方的OK键。
表7试剂盒的上机程序
4.2.2进入“run setup”的界面，点击“plate”，进入反应板的设置界面，在此界面下首先点击“create New”，进入“plate editor”界面，再按照加样的位置顺序设定样品名称、类型，包括待检样本、阴性质控品、阳性质控品，并在右边列表里点击“selectFluorophores”，选择“FAM”，“Texas Red”，“CY5”，“VIC”通道。
4.3点击OK，并根据对话框提示保存plate的设置文件，之后显示“run setup”的界面，点击“start run”，根据对话框提示将文件保存，开始运行程序。
5.结果分析
反应结束后自动保存结果，在“Data analysis”界面的工具栏显示不同的分析，点击“Melt curve”可查看熔解曲线，求导后的熔解峰以及各荧光通道的Tm值，可根据勾选不同的通道对各个通道进行分析。
实施例2：特异性检测
用本试剂盒检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药基因检测试剂用国家参考品(购自中国食品药品检定研究院)中的10份异烟肼、利福平敏感型国家参考品，编号分别为N1～N10，采用实施例1的方法进行特异性检测，结果如表8所示。
表8敏感型国家参考品检测结果
| 编号 | 检测结果 |
| N1 | 突变阴性 |
| N2 | 突变阴性 |
| N3 | 突变阴性 |
| N4 | 突变阴性 |
| N5 | 突变阴性 |
| N6 | 突变阴性 |
| N7 | 突变阴性 |
| N8 | 突变阴性 |
| N9 | 突变阴性 |
| N10 | 突变阴性 |
实施例3：准确性检测
用本试剂盒检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药基因检测试剂用国家参考品(购自中国食品药品检定研究院)中的32份耐药型利福平和异烟肼耐药基因检测试剂用国家参考品。对于利福平耐药位点分别有531密码子突变，516密码子突变，526密码子突变，516密码子突变，522密码子突变，510-512密码子缺失，513密码子突变，533密码子突变，517-518密码子缺失，对于异烟肼耐药位点分别有inhA基因的第-15和-8密码子突变，ahpC基因第-6和-12碱基突变，katG基因第315密码子突变。采用实施例1的方法进行检测，结果如表9所示。
表9耐药国家参考品检测结果
阴性对照和阳性检测结果分别如图1-图30所示。
实施例4：灵敏度检测
用实施例1的方法检测利福平和异烟肼耐药最低检出量国家参考品共5份(购自中国食品药品检定研究院)，编号为SR，S，SRd，SI，SID，分别梯度稀释为1×104拷贝/微升、1×103拷贝/微升、1×102拷贝/微升、1×101拷贝/微升、4拷贝/微升。检测结果如表10所示。
表10最低检出限参考品检测结果
| 编号 | 检测结果 | 类型 |
| SR | 突变阳性 | 混合菌液参考品，利福平耐药 |
| S | 突变阳性 | 混合菌液参考品，利福平和异烟肼耐药 |
| SRd | 突变阳性 | 单细胞耐药菌，利福平耐药 |
| SI | 突变阳性 | 混合菌液参考品，异烟肼耐药 |
| SID | 突变阳性 | 单细胞耐药菌，异烟肼耐药 |
各质控品准确性的检测结果阳性率为100％，表明本发明试剂盒的准确性检测符合要求。
梯度稀释的4拷贝/微升的样品，检测结果阳性率仍为100％，表明本发明试剂盒的最低检出限可达4拷贝/微升。
对比例1
本发明人针对利福平和异烟肼耐药基因各目标序列分别设计了数十对引物和数十条探针，期望能够获得扩增效果好，灵敏度高，准确率高的引物组和检测探针。
由于引物特异性差异、退火温度不一致、以及形成二聚体等原因，不同引物探针组合对于试剂检测灵敏度影响较大，很难获得较优的多重PCR扩增引物以及探针序列。本发明人通过大量的实验，对设计的引物和探针进行优化选择并验证，最终确定了可以用于本试剂盒所采用的引物、探针序列及其组合。
实验中发现，即使在已经基本确定针对各目标核酸的引物对和探针序列的情况下，不同引物对组合进行多重扩增的效果也存在显著差异。
例如，使用如下的对照体系进行检测，其它检测步骤和条件同上述实施例：
表11对照体系1
按照实施例1的方法进行检测，仅使用对照体系1中的rpoB基因引物和探针进行单重检测时能够进行正常检测；加入内控基因引物和探针后，进行多重检测的检测结果如图31所示，结果表明对照体系1无法得到熔解曲线，因而不能进行多重检测。
表12对照体系2
按照实施例1的方法进行检测。检测结果表明对照体系2对低浓度核酸样本检测熔解曲线较差，灵敏度仅能达到100拷贝/微升。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中山大学达安基因股份有限公司
<120> 结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变检测试剂盒及方法
<130> 020086
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ctctatcaat attctctc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cactctcact tacatacc 18
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ttccatctta tccaatcatt acca 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ccttactact tctctctttc tccat 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
ctttcctctt cttttaccca caat 24
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tttctcacca tccaatcatt accatcccac 30
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ccttatcatt acaaccctct tctttccat 29
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
tctatcacct cttctctat 19
<210> 9
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
tatcttatct taat 14
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
tcttaatatc tctattc 17
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
tctcttttct ccata 15
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
cttactctct tacataccta 20
<210> 13
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
ctcattcttt catca 15
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
cttcttttat atatcacctt cctacatctc tccct 35
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
cttctatata tcatccactc taacctccct 30
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
ttctactcac ttcactatta attctcaa 28
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
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ctttcttcta tactatattt ccccat 26
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<211> 33
<212> DNA
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cttcttaata ctctatcacc atctcatctc cct 33
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
ttcctctctc ttctac 16
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<211> 18
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<400> 20
taaactcctc cattccat 18
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
cttcttatct ccacatatca tttcccct 28
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
gtacaatggg tcttccaaaa ggat 24
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
ggatatgact ggtgaataac caaac 25
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
aatcgttcca tcttatccaa tca 23
<210> 25
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
gccatgccct tactacttct ctctttctcc atgctatgc 39
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
ctgcggtagg tatcaatctt atcg 24
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
cgtaatccgc tagact 16
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
ggctgatctt tcttctatac tata 24
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
ctgctcatgc atcaatctta tcg 23
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
cgtaatccgt gtcccaact 19
Claims (10)
1.一种用于检测结核分枝杆耐药突变的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：
第一引物对，所述第一引物对包括：
如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
2.如权利要求1所述的引物对集，其特征在于，所述引物对集还包括：
第二引物对，所述第二引物对包括：
如SEQ ID NO.8所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.9所示的反向引物；
和/或，所述引物对集还包括：
第三引物对，所述第三引物对包括：
如SEQ ID NO.10所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.11所示的反向引物；
和/或，所述引物对集还包括：
第四引物对，所述第四引物对包括：
如SEQ ID NO.12所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.13所示的反向引物；
和/或，所述引物对集还包括：
内标引物对，所述内标引物对包括：
如SEQ ID NO.19所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.20所示的反向引物。
3.一种多重检测结核分枝杆耐药突变的探针集，其特征在于，所述探针集包括第一探针组：
所述第一探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4、5、6、7所示的探针；
和/或，所述探针集还包括第二探针组：
所述第二探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.14、15、16所示的探针；
和/或，所述探针集还包括第三探针组：
所述第三探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的探针；
和/或，所述探针集还包括第四探针组：
所述第四探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的探针；
和/或，所述探针集还包括内标探针组：
所述内标探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的探针。
4.一种用于多重检测结核分枝杆耐药突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对集。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求3所述的探针集。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含第一引物探针混合液，所述第一引物探针混合液中包含序列如SEQ ID NO.1、2所示的引物对，SEQ ID NO.19、20所示的引物对，以及SEQ ID NO.3、4、21所示的探针；
和/或，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含第二引物探针混合液，所述第二引物探针混合液中包含序列如SEQ ID NO.1、2所示的引物对，SEQ ID NO.19、20所示的引物对，以及SEQ ID NO.5、6、7、21所示的探针；
和/或，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含第三引物探针混合液，所述第三引物探针混合液中包含序列如SEQ ID NO.8、9所示的引物对，SEQ ID NO.10、11所示的引物对，SEQ ID NO.19、20所示的引物对，以及SEQ ID NO.14、15、18、21所示的探针；
和/或，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含第四引物探针混合液，所述第四引物探针混合液中包含序列如SEQ ID NO.12、13所示的引物对，SEQ ID NO.8、9所示的引物对，SEQ ID NO.19、20所示的引物对，以及SEQ ID NO.17、16、21所示的探针。
7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第五容器，所述第五容器包含PCR缓冲液；
和/或，所述试剂盒还包括第六容器，所述第六容器包含PCR反应酶系；
和/或，所述试剂盒还包括第七容器，所述第七容器包含阴性对照；
和/或，所述试剂盒还包括第八容器，所述第八容器包含阳性对照。
8.一种基于荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆耐药突变的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的核酸样本；
(2)制备PCR反应体系并进行PCR扩增反应：
其中，所述PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针组。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系包括：
体系1、体系2、体系3、和体系4；其中，
体系1包括检测利福平耐药基因rpoB的引物SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和探针SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：4；以及内控引物探针SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21；和，所述核酸样本；
体系2包括检测利福平耐药基因rpoB的引物SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和探针SEQ IDNO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，以及内控引物探针SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：21；和，所述核酸样本；
体系3包括检测异烟肼药基因aphC的引物SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9和探针SEQ IDNO：15，SEQ ID NO：14，KatG的引物SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和探针SEQ ID NO：18，以及内控引物探针SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21；和，所述核酸样本；
体系4包括检测异烟肼耐药基因inhA引物SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，探针SEQ IDNO：17，aphC的引物SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9和探针SEQ ID NO：16，以及内控引物探针SEQID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21；和，所述核酸样本。
10.权利要求1所述的引物对集、和/或权利要求4所述的探针组的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测结核分枝杆耐药突变。
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