CN101144099A - 检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测临床生物样品中结核分枝杆菌的存在及其耐药基因突变的方法和试剂盒，特别是涉及以反向斑点杂交技术快速检测临床痰液、支气管灌洗液、血液、腹水、脑脊液等生物样品中结核分枝杆菌的存在及其耐药基因突变的方法和试剂盒。
Description
所属领域
本发明涉及检测临床生物样品中结核分枝杆菌及其耐药基因突变的方法及试剂盒，特别是涉及以反向斑点杂交技术快速检测临床痰液、血液、支气管灌洗液、腹水及脑脊液等生物样品中结核分枝杆菌菌的存在及其耐药基因突变的方法和所使用的试剂盒。
发明背景
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)导致的一种传染性疾病。据世界卫生组织估计，目前全球约有20亿人感染结核分枝杆菌，每年死于结核的约有300万[Raviglione M C，et al.Global epidemiology of tuberculosis.Morbidity and mortality of a worldwide epidemic.JAMA，1995，273：220-226.]。近年来，由于流动人口的增加和艾滋病发病率的升高，全球结核病发病率大幅度上升。尤其是结核分枝杆菌对抗结核药物的耐药性更加剧了结核病在大范围内的流行和传播。耐药结核杆菌尤其是多药耐药结核杆菌(Multi drug-resi stantMycobacterium tuberculosis，MDR-TB)传播速度快，患者病情进展迅速，死亡率高，有些病例从诊断到死亡仅为4～6周。在一般临床实验室中，结核分枝杆菌药物敏感性检测仍采用传统的方法，如绝对浓度法、比例法和抗性比率法，由于结核杆菌生长缓慢，在得到分离培养物后仍需1～2个月才能获得结果，因此，依赖传统的细菌培养和药敏实验会延误宝贵的治疗时间。尽管近年来发展起来的BACTEC TM MGITTM960系统能缩短结核杆菌培养和药敏实验的周期，但仍需要一周左右的时间。而且，其仪器设备和试剂相当昂贵，所以仅能在极少数的医院开展。众多研究表明，快速核酸检测结核杆菌病原体比传统的痰涂片和结核杆菌培养检测要更灵敏、更有利于临床早期诊断。目前核酸检测如荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌已广泛应用于临床实验室，此外，核酸检测也已大量用于结核杆菌的耐药性分析。异烟肼和利福平是临床最常用的治疗药物，有作者报告约90％的结核分枝杆菌耐利福平同时也对异烟肼耐药，因而，对结核杆菌进行利福平和异烟肼耐药性分析可作为耐多药结核杆菌的筛选指标[Ramaswamy S，Musser JM.Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacteriumtuberculosis：1998update.Tuberc Lung Dis，1998，79：3-91.]。
研究表明，结核杆菌重要代谢酶基因或抗菌药物作用靶点的突变是导致抗痨药耐药的主要分子机制。rpoB基因含有3534bp的开放读码框，编码1178个氨基酸。rpoB基因内少数密码子突变引起编码RNA聚合酶β亚基构象发生改变，失去结合利福平的能力，而导致细菌耐药的发生。统计资料表明，在结核分枝杆菌耐利福平分离株中，近95％菌株能检出rpoB基因突变[Pozzi G，Meloni M，Zona E，et al.rpoB mutation in multidrug-resistant strains of Mycobacteriumtuberculosis isolated in Italy.J Clin Microbiol，1999，37：1197-1199.]。rpoB基因突变一般发生在该基因内一个高度保守的81bp区域内(507-533位27个氨基酸密码子)。其中最常见的突变位点为531位丝氨酸(Ser)→亮氨酸(Leu)，526位组氨酸(His)→酪氨酸(Tyr)、天门冬氨酸(Asp)，516位天门冬氨酸(Asp)→缬氨酸(Val)，此外，常见的点突变还有513位，511位等。研究表明，结核杆菌对异烟肼耐药性产生主要与过氧化氢酶—过氧化物酶基因KatG以及烯酰基还原酶基因inhA启动子区域的突变有关。katG基因最常见的点突变为315位丝氨酸(AGC)→苏氨酸(ACC)，inhA基因启动子区域最常见突变为inhA-15位(C-T)突变。据文献报道，近60-80％的耐异烟肼结核分枝杆菌分离株均能检测出katG基因和/或inhA基因启动子区域突变。katG和inhA启动子区基因突变是结核杆菌耐异烟肼的主要分子机制。
目前常用的结核杆菌耐药基因突变检测方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)、序列特异性引物(PCR-SSP)、单链构象多态性(PCR-SSCP)、荧光PCR、DNA序列测定分析。特别是，近年来又发展了以核酸杂交技术为基础的基因检测技术。一般说来，该技术通常是以玻璃片或者尼龙膜为基质，并将探针固定在基质上，以荧光分子标记引物，通过聚合酶链反应使PCR产物和探针杂交。例如，国内有人开发了一种诊断结核杆菌及其耐药性的DNA芯片(参见专利申请号00133796.3)，以及一种检测结核杆菌抗药性相关基因突变的DNA芯片(参见专利申请号00119877.7和美国专利申请号20030297134(2003，7，7))。然而，在普通的实验室，很少有荧光扫描仪等芯片检测设备，而且都存在技术复杂、成本高和效率较低等缺点。以生物素标记引物、PCR扩增、膜条杂交检测系统如结核杆菌耐药性基因芯片检测系统(中国专利申请号200410009231.5)；结核杆菌耐药基因检测试剂盒及其制备方法(中国专利申请号20041083826.5)和美国专利申请号US20020058422(2002，1，30))的发明大大降低了检测成本，但是这些发明多用的样本为初步分离培养后的临床结核杆菌分离株，对培养前的生物样本直接检测准确性较低，且存在不能同时鉴定结核分枝杆菌或者检测位点较少等缺点。由于结核病人痰液样品的结核杆菌基因组DNA提取效率低，因此对常规PCR检测的灵敏度要求很高。所以对于真正用到临床检测样本来说，这些现有技术仍存在一些临床适用性上的缺陷。
因此，建立一种简单快速的突变检测方法对于早期诊断结核病和防治结核病的传播具有重要的意义。本发明人试图使用具有更高灵敏度的巢式PCR技术并结合已知的点印迹杂交技术和过滤杂交方法，在筛选一系列最佳引物和探针组合的基础上，建立一种可以在相对较短时间内既能检测结核分枝杆菌病原体，同时又能分析该结核分枝杆菌的耐药基因突变的方法。
发明内容
本发明涉及检测临床生物样品中结核分枝杆菌菌及其耐药基因突变的方法和试剂盒，特别是涉及以反向斑点杂交技术快速检测临床痰液、支气管灌洗液、血液、腹水、脑脊液等生物样品中结核分枝杆菌菌及耐药基因突变的方法及试剂盒。
因此，本发明的一个目的是提供一种使用反向斑点杂交技术检测临床生物样品中可能存在的结核分枝杆菌，并检测相关的耐利福平和/或异烟肼抗性基因突变的方法，该方法包括：(1)分离待检靶核酸样品；(2)利用小分子标记引物并进行聚合酶链反应扩增靶DNA片断；(3)在一定的基质上使特异性寡核甘酸探针与靶核酸杂交；(4)检测杂交结合物并借以判断靶DNA的rpoB基因、katG基因、inhA基因启动子区域和插入序列IS1081基因，特征在于巢式聚合酶链反应扩增体系中使用的正向和反向引物分别为：
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根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的靶核酸样品是得自被检者痰液、血液、支气管灌洗液、腹水以及脑脊液中结核分枝杆菌基因组DNA。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的检测是使用带有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置、恒温水浴或空气浴装置完成的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的标记引物的小分子可以是生物素，异羟基洋地黄毒苷，荧光素。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的基质可以是尼龙膜、硝酸纤维素膜、载玻片。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的靶DNA的相关基因包括rpoB基因、katG基因、inhA基因启动子区域和插入序列IS1081基因。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的DNA突变类型包括结核分枝杆菌rpoB基因高频突变区域内的8种不同的点突变，分别是511位CTG→CCG，513位CAA→CCA，516位GAC→GTC，522位TCG→TTG，526位CAC→TAC，526位CAC→GAC，526位CAC→CGC，531位TCG→TTG，533位CTG→CCG突变；katG基因最常见的315AGC→ACC突变以及inhA基因调控区-15C→T突变。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应扩增是首先用四对外引物扩增，然后再以该第一轮扩增所得到的产物作为模板，利用另外四对标记的内引物进行进一步的核酸扩增。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测检测临床生物样品，包括痰液、血液、支气管灌洗液、腹水以及脑脊液中结核分枝杆菌菌种鉴定，以及检测相关耐利福平、异烟肼基因突变的试剂盒，该试剂盒包括：(1)核酸提取试剂；(2)聚合酶链反应试剂；(3)杂交反应试剂。特征在于巢式聚合酶链反应扩增体系中的所使用的正向和反向引物分别为：
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根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的核酸提取试剂包括由DNA提取液和灭菌生理盐水组成的提取待检样品DNA的抽提液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应试剂包括由引物、含有脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、耐热Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG酶)等组成的PCR反应混合液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的杂交反应试剂包括杂交液I(2×SSC-0.1％SDS)和II(0.5×SSC-0.1％SDS)、溶液I(250u/ml偶联辣根过氧化物酶的链酶亲和素溶液)、II(0.1mol/L的柠檬酸钠溶液)、III(2mg/ml的四甲基联苯胺溶液)和Ⅳ(3％的过氧化氢溶液)、膜条以及标准对照品(结核杆菌野生型基因组DNA)。
本发明的一个目的是提供一种使用反向斑点杂交技术检测痰液、血液、支气管灌洗液、腹水及脑脊液等生物样品中结核分枝杆菌鉴定和耐药性的方法，该方法包括：(1)分离待检靶核酸样品；(2)利用小分子标记引物并进行聚合酶链反应扩增靶DNA片断；(3)在一定的基质上使特异性寡核甘酸探针与靶核酸杂交；(4)检测杂交结合物并借以判断靶DNA的rpoB基因、katG基因、inhA基因启动子区域和插入序列IS1081基因，特征在于巢式聚合酶链反应扩增体系中使用的正向和反向引物分别为：
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1：5′CAGCCAGCTGAGCCAATTCAT3′(SEQ ID NO：17)
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根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的靶核酸样品是得自被检者痰液、血液、支气管灌洗液、腹水以及脑脊液中结核分枝杆菌基因组DNA。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的检测是使用带有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置、恒温水浴或空气浴装置完成的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的标记引物的小分子可以是生物素，异羟基洋地黄毒苷，荧光素。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的基质可以是尼龙膜、硝酸纤维素膜、载玻片。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的靶DNA的相关基因包括rpoB基因、katG基因、inhA基因启动子区域和插入序列IS1081基因。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的DNA突变类型包括结核分枝杆菌rpoB基因高频突变区域内的8种不同的点突变，分别是511位CTG→CCG，513位CAA→CCA，516位GAC→GTC，522位TCG→TTG，526位CAC→TAC，526位CAC→GAC，526位CAC→CGC，531位TCG→TTG，533位CTG→CCG突变；katG基因最常见的315AGC→ACC突变以及inhA基因调控区-15C→T突变。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应扩增是首先用四对外引物扩增，然后再以该第一轮扩增所得到的产物作为模板，利用另外四对标记的内引物进行进一步的核酸扩增。
反向斑点杂交试验是建立在PCR基础上，利用寡核甘酸探针与PCR产物杂交来检测点突变的技术。与传统的斑点杂交技术不同，通常使用的点印迹杂交方法是将靶DNA固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，使标记的探针与待检靶DNA接触并杂交，显色后判断结果。这种方法每次杂交反应只能检测待测DNA是否含有某一种探针的同源序列，即用于判断一种基因型。如果某些基因座位有多个等位基因(如HLA-DRB位点或地中海贫血突变基因等)，用这种点杂交方法检测就很繁杂，甚至很难完成。而反向斑点杂交方法则是先将针对各等位基因特异性的探针分别点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后再使待测DNA样品(一般是使用5’-端标记有生物素等分子的引物PCR扩增目的片断后的产物)与之杂交，这样待测样本就会与具有同源序列的探针结合。经洗涤去除未结合的DNA后，即可直接或间接地显示出并检测到代表杂交信号的生物素等标记物。因此，使用该方法可一次同时检测某一基因座位的大部分或全部等位基因。
简单地说，为了完成本发明的方法，首先制备待检生物样品中结核分枝杆菌基因组DNA。样品经雾化、浓缩和DNA提取液处理后离心收集上清液，并将该上清液用于PCR扩增反应。以如上得到的结核分枝杆菌基因组DNA为模板，并使用合成的正向和反向寡核苷酸引物进行PCR扩增。变性处理所得到的DNA扩增产物后，使之分别与揭示不同野生型和突变型的寡核苷酸探针杂交。最后，根据杂交产物显色后的颜色变化判断结核分枝杆菌不同的基因型。现针对本发明方法的几个主要步骤，分别详细描述如下。
1、引物的设计和合成
为了特异、高效地扩增待检核酸样品中的目的基因，我们从Gene Bank中调出结核分枝杆菌全基因组DNA序列，针对rpoB，katG，inhA，IS1081基因多态性位点，按照引物设计的一般性原则，采用primer premier5.0和oligo6.0软件分别设计并合成了巢式PCR所用的正向和反向引物，其中反向引物rpoBR2，katGR2，inhAR2，IS1081R的5’端是用生物素标记的：
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2、探针的合成和标记
针对rpoB，katG，inhA，IS1081基因多态性位点，设计并合成了19条探针。此外，另设计一条用于控制显色反应的显色探针(探针20)，以其作为对照借以控制显色反应。为了保证各探针均能在同一温度下与特定的靶DNA成功地杂交，须将探针的Tm值和GC含量严格控制在特定范围内。合成的探针经20％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并纯化后，分别进行NH2基团标记以用于继后的杂交反应。杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：
1：5′CAGCCAGCTGAGCCAATTCAT3′(SEQ ID NO：17)
2：5′TTCATGGACCAGAACAACCCGC3′(SEQ ID NO：18)
3：5′AACCCGCTGTCGGGGTTGACC3′(SEQ ID NO：19)
4：5′TTGACCCACAAGCGCCGACTGTC3′(SEQ ID NO：20)
5：5′GCCGACTGTCGGCGCTGG3′(SEQ ID NO：21)
6：5′CAGCCAGCCGAGCCAATTCAT3′(SEQ ID NO：22)
7：5′CTGAGCCCATTCATGGACCAG3′(SEQ ID NO：23)
8：5′GCCAATTCATGGTCCAGAACAACC3′(SEQ ID NO：24)
9：5′ACAACCCGCTGTTGGGGTTGA3′(SEQ ID NO：25)
10：5′TTGACCTACAAGCGCCGACTGTC3′(SEQ ID NO：26)
11：5′TTGACCGACAAGCGCCGACTGTC3′(SEQ ID NO：27)
12：5′TTGACCCGCAAGCGCCGACTGTC3′(SEQ ID NO：28)
13：5′CGCCGACTGTTGGCGCTGG3′(SEQ ID NO：29)
14：5′ACTGTCGGCGCCGGGGCC3′(SEQ ID NO：30)
15：5′ATCACCAGCGGCATCGAGGTC3′(SEQ ID NO：31)
16：5′ATCACCACCGGCATCGAGGTC3′(SEQ ID NO：32)
17：5′CGCGGCGAGACGATAGGTTGT3′(SEQ ID NO：33)
18：5′CGCGGCGAGATGATAGGTTGT3′(SEQ ID NO：34)
19：5′ CTTCTGGCTGACCAACTCGCA3′(SEQ ID NO：35)
20：5′TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT3’(SEQ ID NO：36)
3、杂交载体的制备
用作杂交载体的膜可以是由硝酸纤维素、尼龙或醋酸纤维素等材料制成的膜，大小约为3.2cm×2.5cm的多孔条。膜条使用前需用10％的EDC(N-乙基-N’-[二甲基氨丙基]-碳二亚胺，Sigama公司)溶液充分浸泡活化处理。新合成的探针(100pm/μl)经稀释后，按每孔1.0μl在膜条的适当位置上以固定格式点加。点样后用NaOH溶液处理膜条并充分洗涤，然后保存于—20℃备用。
4、核酸的提取
采用常规DNA提取液提取生物样品中结核分枝杆菌基因组DNA。例如可以用氢氧化钠溶液雾化痰液，磷酸盐洗涤后离心收集沉淀。然后依次向其中加入常规核酸共沉剂、DNA提取液，以抽提细菌基因组DNA。所得到的DNA经离心后收集上清液，将其作为核酸扩增的模板。
5、核酸扩增体系的优化
为了进一步提高检测的灵敏度，我们采用巢式PCR结合多重PCR的方法对待检靶DNA进行扩增。为此，首先用优选的四对外引物扩增四个目的基因，然后再以扩增产物作为模板，再用另外优选的四对内引物进行第二轮扩增。实验中，我们经过反复摸索找出最佳退火温度，借以提高核酸扩增的特异性和高效性，从而大大提高了检测灵敏度。结果发现，该方法可以使低拷贝数的样品DNA得到很好扩增效果，其检测下限甚至达到101～102IU/ml(见附图2)。同时，为了尽可能地减少污染，我们使用dUTP-UNG酶处理待检核酸。特别是，我们调整了PCR扩增中所使用的引物和其浓度，并调整和优化了Mg2+、模板、PCR佐剂等其他反应物的浓度，也有利于防止和减少污染。
6、反向斑点杂交体系的优化
反向斑点杂交的操作过程包括：首先将如前制备的检测膜条固定在杂交仪上，然后在膜条的适当加样点加载经变性处理的扩增的样品DNA。杂交反应完成后，经洗膜和显色步骤以显示杂交斑点的存在，并根据所使用的探针的不同来判断样本的基因型。该方法不仅能检测rpoB基因常见的8个突变位点(511CTG→CCG，513CAA→CCA，516GAC→GTC，522TCG→TTG，526CAC→TAC，526CAC→GAC，526CAC→CGC，531TCG→TTG，533CTG→CCG)以及katG基因315AGC→ACC点突变，inhA基因启动子-15C-T突变，而且还可判断是否存在其它的突变或缺失。此外，使用本发明的方法可同时检测出各种生物样本中是否存在结核分枝杆菌。
由图3所示的检测实例可以看出，如果探针19显色则判断为所检测的病原体为结核分枝杆菌，否则为非结核分枝杆菌。九份实例样品检测结果如下：探针1、3、4、5、8、15、18、19、20显色，可判定结核分枝杆菌rpoB基因516GAC→GTC突变，inhA基因启动子区-15C-T突变；探针1、2、4、5、9、16、18、19、20显色，可判定结核分枝杆菌rpoB基因522TCG→TTG突变，katG基因315AGC→ACC突变，inhA基因启动子区-15C-T突变；探针1、2、3、5、10、18、19、20显色，可判定结核分枝杆菌rpoB基因526CAC→TAC突变，katG基因315其它突变或缺失，inhA基因启动子区-15C-T突变；探针1、2、3、5、11、16、18、19、20显色，可判定结核分枝杆菌rpoB基因526CAC→GAC突变，katG基因315AGC→ACC突变，inhA基因启动子区-15C-T突变；探针1、2、3、5、12、18、19、20显色，可判定结核分枝杆菌rpoB基因526CAC→CGC突变，katG基因315位点其它突变和缺失，inhA基因启动子区-15C-T突变；探针1、2、3、4、13、17、19、20显色，可判定结核分枝杆菌rpoB基因531TCG→TTG突变，katG基因315位点其它突变和缺失；探针1、2、3、4、14、15、18、19、20显色，可判定结核分枝杆菌rpoB基因533CTG→CCG突变，inhA基因启动子区-15C-T突变；探针1、3、4、5、15、18、19、20显色，可判定结核分枝杆菌rpoB基因516位点其它类型突变，inhA基因启动子区-15C-T突变；探针1、2、3、4、5、16、18、19、20显色，可判定结核分枝杆菌katG315AGC→ACC突变，inhA基因启动子区-15C-T突变。
另外，本发明通过摸索不同的杂交温度和探针浓度(例如，将杂交温度设定在60℃，型特异性探针和显色控制探针浓度定为10μmol/L时，可使检测的结果更为准确可靠，并具有更好的检测稳定性(可重复性)。
本发明中，由于发明人对靶DNA片段的扩增体系和杂交体系进行了优化，设计并合成了特异性强的探针和引物，同时检测中使用了配备有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置，所以确保了方法的快捷和检测结果的可靠性。
如前所述，由于反向斑点杂交方法能够同时检测目的基因内多个碱基的突变或多态性，所以在病原体及复杂遗传性疾病的检测中有着更为简便的优越性。由于结核分枝杆菌耐药性的产生主要是因为编码药物代谢酶基因的位点突变引起的，并且涉及到的相关基因以及突变位点众多，因此，单纯检测一两个基因或者一两个位点都不能满足分析需要。本发明采用低密度的基因芯片技术，使实验设计上能够涵盖尽可能多的高频突变位点。与高密度的基因芯片相比，在芯片制作方面，不需要精密昂贵的微阵列点样设备；在检测方面，不需要昂贵的荧光扫描装置，所以也大大减少了检测成本，普通的基层实验室均可开展。本发明的结核杆菌耐药检测方法显然可以为临床医生对结核病的治疗提供一种快速、简便的检测手段和依据。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测检测临床生物样品，包括痰液、血液、支气管灌洗液、腹水以及脑脊液中结核分枝杆菌菌种鉴定，以及检测相关耐利福平、异烟肼基因突变的试剂盒，该试剂盒包括：(1)核酸提取试剂；(2)聚合酶链反应试剂；(3)杂交反应试剂。特征在于巢式聚合酶链反应扩增体系中的所使用的正向和反向引物分别为：
rpoBF1：5′CGT CGAGGT GCC GGT GGAAAC3′(SEQ IDNO：1)
rpobR1：5′CAC CGA CAG CGA GCC GAT CAG3′(SEQ ID NO：2)
KatGF1：5′CTG GCT CGG CGATGA GCG TT3′(SEQ ID NO：3)
KatGR2：5′AGG GCT CTTCGT CAG CTC CCA3′(SEQ ID NO：4)
inhA F1：5′AGG GCG TCAATA CAC CCG CA3′(SEQ ID NO：5)
inhAR2：5′CGG ACC CTG GTG CTC TTC TA3′(SEQ ID NO：6)
IS1081F1：5’-CACTGCTCGGTGCTGTGGATT-3’(SEQ ID NO：7)
IS1081R1：5’-CACGGGTGTCGAAATCACGGT-3’(SEQ ID NO：8)
rpoBF2：5′GGTCGG CAT GTC GCG GAT G3′(SEQ IDNO：9)
rpoBR2：5′GCA CGT CGC GGA CCTCCA G3′(SEQ ID NO：10)
katGF2：5′GAAACAGCGGCGCTGGATCG3′(SEQ ID NO：11)
katGR2：5′GTTGTCCCATTTCGTCGGG3′(SEQ ID NO：12)
inhAF2：5′CCTCGCTGCCCAGAAAGGG3′(SEQ ID NO：13)
inhAR2：5′ATCCCCCGGTTTCCTCCGG3′(SEQ ID NO：14)
IS1081F2：5′TCG CGT GAT CCT TCG AAA CG3′(SEQ ID NO：15)
IS1081R2：5′GCC GTT GCG CTG ATT GGA CC3′(SEQ ID NO：16)
并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：
1：5′CAGCCAGCTGAGCCAATTCAT3′(SEQ ID NO：17)
2：5′TTCATGGACCAGAACAACCCGC3′(SEQ ID NO：18)
3：5′AACCCGCTGTCGGGGTTGACC3′(SEQ ID NO：19)
4：5′TTGACCCACAAGCGCCGACTGTC3′(SEQ ID NO：20)
5：5′GCCGACTGTCGGCGCTGG3′(SEQ ID NO：21)
6：5′CAGCCAGCCGAGCCAATTCAT3′(SEQ ID NO：22)
7：5′CTGAGCCCATTCATGGACCAG3′(SEQ ID NO：23)
8：5′GCCAATTCATGGTCCAGAACAACC3′(SEQ ID NO：24)
9：5′ACAACCCGCTGTTGGGGTTGA3′(SEQ ID NO：25)
10：5′TTGACCTACAAGCGCCGACTGTC3′(SEQ ID NO：26)
11：5′TTGACCGACAAGCGCCGACTGTC3′(SEQ ID NO：27)
12：5′TTGACCCGCAAGCGCCGACTGTC3′(SEQ ID NO：28)
13：5′CGCCGACTGTTGGCGCTGG3′(SEQ ID NO：29)
14：5′ACTGTCGGCGCCGGGGCC3′(SEQ ID NO：30)
15：5′ATCACCAGCGGCATCGAGGTC3′(SEQ ID NO：31)
16：5′ATCACCACCGGCATCGAGGTC3′(SEQ ID NO：32)
17：5′CGCGGCGAGACGATAGGTTGT3′(SEQ ID NO：33)
18：5′CGCGGCGAGATGATAGGTTGT3′(SEQ ID NO：34)
19：5′CTTCTGGCTGACCAACTCGCA3′(SEQ ID NO：35)
20：5′TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT3’(SEQ ID NO：36)
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的核酸提取试剂包括由DNA提取液和灭菌生理盐水组成的提取待检样品DNA的抽提液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应试剂包括由引物、含有脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、耐热Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG酶)等组成的PCR反应混合液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的杂交反应试剂包括杂交液I(2×SSC-0.1％SDS)和II(0.5×SSC-0.1％SDS)、溶液I(250u/ml偶联辣根过氧化物酶的链酶亲和素溶液)、II(0.1mol/L的柠檬酸钠溶液)、III(2mg/ml的四甲基联苯胺溶液)和Ⅳ(3％的过氧化氢溶液)、膜条以及标准对照品(结核杆菌野生型基因组DNA)。
如前所说，为简单快速地检测痰液、血液、支气管灌洗液、腹水及脑脊液等生物样品中结核分枝杆菌和耐药性，本发明提供了相应的结核分枝杆菌耐药基因突变检测试剂盒。具体地说，本发明的试剂盒提供：(1)痰液、血液、支气管灌洗液、腹水及脑脊液等生物样品结核杆菌核酸提取试剂，包括DNA提取液(500μl/管)、灭菌纯水(20ml/管)、生理盐水(10ml/管)；(2)聚合酶链反应试剂，包括PCR反应混合液A、B、C各10管(每管含PCR反应缓冲液，终浓度为2.5mmol/L的Mgcl2、0.2mmol/L的dNTPs、0.2umol/L的正反向引物，)、Taq酶(3u/μl15μl)1管、UDG酶(1U/μl)1管；(3)杂交检测试剂，主要为常规的20×SSC(主要含NaCL，柠檬酸钠等)、SDS(十二烷基磺酸钠)、POD(链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶结合物)、TMB(四甲基联苯胺)等。包括杂交液I(2×SSC-0.1％SDS，50ml/瓶)1瓶、杂交液II(0.5×SSC-0.1％SDS，35ml/瓶)1瓶、溶液I(250u/mlPOD，20μl/管)1管、溶液II(0.1mol/L柠檬酸钠，30ml/瓶)1瓶、溶液III(2mg/mlTMB，1ml/管)1管、溶液Ⅳ(3％H2O2，10μl/管)1管，标准对照品，另外还包括用作杂交反应载体的膜条10张。
本发明的试剂盒除提供了各位点所对应的特异性探针外，还配有显色控制探针和标准对照品。由于本发明由于采用了巢式PCR扩增，大大提高了检测灵敏度，对临床生物样本可以直接进行检测、而不需要经过核酸扩增前结核杆菌的分离、培养步骤。结合使用了配备有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置，其导流杂交的特性大大提高了核酸分子的扩散率、局部反应的浓度和核酸杂交效率。一般说来，使用本发明的方法和试剂盒，从样本的处理到判读基因型检测结果仅需要8小时左右的时间。若使用常规的水浴和空气浴杂交装置，结果需要大约10小时。因此，本发明的方法和试剂盒特别适用于临床标本的快速检测和大样本的普查。
附图说明
图1显示所使用的探针在膜条上的排列图。1号探针具有SEQ ID NO：17的序列，2号探针具有SEQ ID NO：18示的序列，3号探针具有SEQ ID NO：19示的序列，4号探针具有SEQ ID
NO：20的序列，5号显色控制探针具有SEQ ID NO：21的序列，6号探针具有SEQ ID NO：22的序列，7号探针具有SEQ ID NO：23的序列，8号探针具有SEQ ID NO：24的序列，9号探针具有SEQ
ID NO：25的序列，10号探针具有SEQ ID NO：26的序列，11号探针具有SEQ ID NO：27的序列，12号探针具有SEQ ID NO：28的序列，13号探针具有SEQ ID NO：29示的序列，14号探针具有SEQ ID NO：30的序列，15号探针具有SEQ ID NO：31的序列，16号探针具有SEQ ID NO：32的序列，17号探针具有SEQ ID NO：33的序列，18号探针具有SEQ ID NO：34的序列，19号探针具有SEQ ID NO：35的序列，20号探针具有SEQ ID NO：36的序列。1～5号探针为rpoB基因野生型探针，6～14号探针为rpoB基因突变型探针；15～16分别为katG基因野生型和突变型探针；17～18分别为inhA基因野生型和突变型探针：19号为结核分枝杆菌特异性探针；20号为显色控制探针。
图2显示靶DNA扩增片段灵敏度实验，包括2％的琼脂糖凝胶电泳图和产物杂交图。其中FigA为rpoB和IS1081基因扩增图，Fig B为katG和inhA基因扩增图，0、1、2、3、4分别表示样本含量为100、101、102、103、104IU/ml，N为阴性对照，M泳道为标准分子量标志，扩增大小均在预期范围。Fig C、D、E、F分别对应含量为101、102、103、104IU/ml的样本扩增后的杂交结果图(基因型为：rpoB基因526CAC→GAC突变，katG基因315AGC→ACC突变，inhA基因启动子区-15C-T突变)。
图3显示九种不同突变类型的样品反向斑点杂交检测的结果(参见下列表1和图3)。
表1
| 样品号 | 探针显色情况 | 基因型 |
| 1 | 1、3、4、5、8、15、18、19、20 | rpoB基因516GAC→GTCinhA基因启动子区-15C-T |
| 2 | 1、2、4、5、9、16、19、20 | rpoB基因522TCG→TTG，katG基因315AGC→ACC，inhA基因启动子区-15C-T |
| 3 | 1、2、3、5、10、18、19、20 | rpoB基因526CAC→TAC，katG基因315其它突变或缺失，inhA基因启动子区-15C-T |
| 4 | 1、2、3、5、11、16、18、19、20 | rpoB基因526CAC→GAC突变，katG基因315AGC→ACC突变，inhA基因启动子区-15C-T突变 |
| 5 | 1、2、3、5、12、18、19、20 | rpoB基因526CAC→CGC，katG基因315位点其它突变和缺失，inhA基因启动子区-15C-T |
| 6 | 1、2、3、4、13、17、19、20 | rpoB基因531TCG→TTG，katG基因315位点其它突变和缺失 |
| 7 | 1、2、3、4、14、15、18、19、20 | rpoB基因533CTG→CCG，inhA基因启动了区-15C-T |
| 8 | 1、3、4、5、15、18、19、20 | rpoB基因516位点其它类型突变，inhA基因启动了区-15C-T |
| 9 | 1、2、3、4、5、16、18、19、20 | katG315AGC→ACC，inhA基因启动了区-15C-T突变 |
发明的具体实施方式
实施例1：痰液标本靶核酸的制备
向装有痰液的玻璃管中加入4倍体积的4％NaOH(含1％，W/V)，摇匀后室温放置15～30分钟。取液化后的标本1ml加至1.5ml离心管，12,000rpm离心5分钟，去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12,000rpm离心5分钟。去上清，保留约50μl沉淀液，加入10μl提取液A(使用前充分混匀)，再加入200μl提取液B，振荡混匀，室温放置5分钟。8,000rpm离心1分钟，小心吸去上清。然后加200μl提取液B，充分混匀(用移液器吹打)，8,000rpm离心1分钟，小心吸去上清后加75％乙醇1000μl充分混匀(用移液器吹打)，8,000rpm离心1分钟，小心吸去上清。然后65℃干燥10分钟。加入40μl TE，充分混匀(用移液器吹打)，90℃，保温15分钟溶出DNA。8,000rpm离心1分钟后取上清液5μl作为PCR反应模板。
实施例2：靶核酸的PCR扩增
取单管单人份PCR反应液A若干管，每管加入0.5μl UDG酶，再直接加入5μl模板(或阴阳性标准品)，充分混匀，瞬时(3秒)离心后将各反应管放入PCR仪。50℃预处理3分钟后采用下列条件扩增：93℃5分钟，然后按93℃30秒，65℃45秒，72℃45秒，共30个循环。分别取上述1μl扩增产物加到PCR反应液B和C中，瞬时(3秒)离心，将各反应管放入PCR仪，采用下列条件扩增：93℃5分钟，然后按93℃30秒，64℃45秒，72℃30秒，共40个循环。终产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测(见附图2)。
实施例3：反向斑点杂交检测
杂交前，取杂交液I(2×SSC-0.1％SDS)与杂交液II混合并预热至60℃备用。根据待检样品的数目取数个1.5ml离心管，各管分别加入0.5ml杂交液I并预加热至60℃。将PCR扩增产物B和C混合后97℃变性处理5分钟，立即置于冰水混合物中放置2-5分钟。然后取1000μl杂交液I+2μl溶液I(1000：2)混合溶液作为结合液4℃保存备用。取溶液II：溶液III：溶液IV(1900：200：1)的混合物(19ml溶液II+2ml溶液III+10μl溶液IV)作为显色液避光备用。
杂交前用蒸馏水充满反应室，放置好金属多孔板，打开水泵以排出多孔板上的水分。设定杂交仪温度为60℃。首先将塑料垫片置于金属多孔板上并将分型膜条置于塑料垫片上，然后盖好硅胶分隔室和压扣盖。再在变性后的PCR扩增产物内加入60℃预热的0.5ml杂交液I，混匀后加入杂交槽中温育5分钟并打开泵进行杂交导流。然后加入预热的杂交液II清洗膜条(每孔1ml，重复洗3次)。设定杂交仪温度为25℃(或室温)并加入结合液(每孔1ml)。静置2分钟后泵出结合液，再加入室温杂交液I清洗膜条(每孔1ml，各重复洗3次)。随后加入溶液II静置2分钟后泵干，最后加入新鲜配制的显色液(每孔1ml)，显色6～8分钟并开泵抽干显色液观察结果(参见附图3)。
由图3所示的结果可以看出，各探针显色清晰可见，无非特异性杂交。根据附图1所示的排列格式可判读出耐药基因的突变位点。
实施例4：不同突变位点的生物样品反向斑点杂交基因分型检测结果判定
使用本发明的方法和试剂盒，对44份结核分枝杆菌耐药株进行了基因型检测。rpoB检测结果：511位CTG→CCG1例，513位CAA→CCA1例，516位GAC→GTC3例，522位TCG→TTG1例，526位CAC→TAC6例，526位CAC→GAC2例，526位CAC→CGC5例，531位TCG→TTG13例，533位CTG→CCG2例，其他突变和缺失7例，三例未检出突变。katG基因检测结果是：315AGC→ACC突变25例，katG315其他突变或缺失3例；inhA基因启动子区-15C-T突变5例。结果表明：rpoB基因突变检测灵敏度达93％，katG基因检测灵敏度达64％，inhA基因检测灵敏度为11％。为了进一步证实本发明方法的准确性，对所有样品的PCR产物进行序列测定，结果表明，使用本发明的试剂盒检测的结果和测序基本吻合，仅有一例杂交检测为531TCG→TTG的突变与531TCG野生型共存，但测序证实为531TCG→TTG突变。可见本发明方法的准确性高达98％。
实施例5：13种非结核分枝杆菌生物样品反向斑点杂交基因分型检测结果判定
按照实施例2和3所述的方法，对鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌、海鱼分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、勘萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、母牛分枝杆菌、龟脓分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、草分枝杆菌、龟亚型分枝杆菌等十三株非结核分枝杆菌进行了检测，结果IS1081基因检测均为阴性，特异性达100％。
序列表
<110>中山大学安达基因股份有限公司
<120>检测结核分枝杆菌及耐药基因突变的方法和试剂盒
<140>
<141>
<160>28
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>1
CGT CGA GGT GCC GGT GGAAAC
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>2
CAC CGA CAG CGA GCC GATCAG
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>3
CTG GCTCGG CGATGAGCGTT
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>4
AGG GCT CTT CGT CAG CTC CCA
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>5
AGG GCG TCAATACAC CCG CA
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>6
CGG ACC CTG GTG CTC TTC TA
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>7
CACTGCTCGGTGCTGTGGATT
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>8
CACGGGTGTCGAAATCACGGT
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>9
CACGGGTGTCGAAATCACGGT
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>10
GCA CGT CGC GGA CCTCCA G
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>11
GAAACAGCGGCGCTGGATCG
<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>12
GTTGTCCCATTTCGTCGGG
<210>13
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>13
CCTCGCTGCCCAGAAAGGG
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>14
ATCCCCCGGTTTCCTCCGG
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>15
TCG CGTGATCCTTCGAAACG
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>16
GCC GTTGCG CTGATTGGACC
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>17
CAGCCAGCTGAGCCAATTCAT
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>18
TTCATGGACCAGAACAACCCGC
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>19
AACCCGCTGTCGGGGTTGACC
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>20
TTGACCCACAAGCGCCGACTGTC
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>21
GCCGACTGTCGGCGCTGG
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>22
CAGCCAGCCGAGCCAATTCAT
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>23
CTGAGCCCATTCATGGACCAG
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>24
CTGAGCCCATTCATGGACCAG
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>25
ACAACCCGCTGTTGGGGTTGA
<210>26
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>26
TTGACCTACAAGCGCCGACTGTC
<210>27
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>27
TTGACCGACAAGCGCCGACTGTC
<210>28
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>28
TTGACCCGCAAGCGCCGACTGTC
<210>29
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>29
CGCCGACTGTTGGCGCTGG
<210>30
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>30
ACTGTCGGCGCCGGGGCC
<210>31
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>31
ATCACCAGCGGCATCGAGGTC
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>32
ATCACCACCGGCATCGAGGTC
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>33
CGCGGCGAGACGATAGGTTGT
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>34
CGCGGCGAGATGATAGGTTGT
<210>35
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>35
CTTCTGGCTGACCAACTCGCA
<210>36
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>36
TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT
Claims (7)
1.一种检测临床生物样品中结核分枝杆菌及耐药基因突变的方法，该方法包括：(1)分离待检靶核酸样品；(2)聚合酶链反应扩增靶DNA片段；(3)使特异性寡核甘酸探针与靶核酸杂交；(4)检测杂交结合物并借以判断靶DNA的rpoB基因、katG基因、inhA基因启动子区域和插入序列IS1081基因，特征在于巢式聚合酶链反应扩增体系中使用的正向和反向引物分别为：
rpoBF1：5′CGT CGA GGT GCC GGT GGA AAC 3′(SEQ ID NO：1)
rpobR1：5′CAC CGA CAG CGA GCC GAT CAG 3′(SEQ ID NO：2)
KatGF1：5′CTG GCT CGG CGA TGA GCG TT 3′(SEQ ID NO：3)
KatGR2：5′AGG GCT CTT CGT CAG CTC CCA 3′(SEQ ID NO：4)
inhAF1：5′AGG GCG TCA ATA CAC CCG CA 3′(SEQ ID NO：5)
inhAR2：5′CGG ACC CTG GTG CTC TTC TA 3′(SEQ ID NO：6)
IS1081F1：5’-CACTGCTCGGTGCTGTGGATT-3’ (SEQ ID NO：7)
IS1081R1：5’-CACGGGTGTCGAAATCACGGT-3’ (SEQ ID NO：8)
rpoBF2：5′GGTCGG CAT GTC GCG GAT G 3′ (SEQ ID NO：9)
rpoBR2：5′GCA CGT CGC GGA CCTCCA G3′(SEQ ID NO：10)
katGF2：5′GAAACAGCGGCGCTGGATCG3′(SEQ ID NO：11)
katGR2：5′GTTGTCCCATTTCGTCGGG3′(SEQ ID NO：12)
inhAF2：5′CCTCGCTGCCCAGAAAGGG 3′(SEQ ID NO：13)
inhAR2：5′ATCCCCCGGTTTCCTCCGG 3′(SEQ ID NO：14)
IS1081F2：5′TCG CGT GAT CCT TCG AAA CG 3′(SEQ ID NO：15)
IS1081R2：5′GCC GTT GCG CTG ATT GGA CC 3′(SEQ ID NO：16)
并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：
1：5′CAGCCAGCTGAGCCAATTCAT 3′(SEQ ID NO：17)
2：5′TTCATGGACCAGAACAACCCGC 3′(SEQ ID NO：18)
3：5′AACCCGCTGTCGGGGTTGACC 3′(SEQ ID NO：19)
4：5′TTGACCCACAAGCGCCGACTGTC 3′(SEQ ID NO：20)
5：5′GCCGACTGTCGGCGCTGG 3′(SEQ ID NO：2 1)
6：5′CAGCCAGCCGAGCCAATTCAT 3′(SEQ ID NO：22)
7：5′CTGAGCCCATTCATGGACCAG 3′(SEQ ID NO：23)
8：5′GCCAATTCATGGTCCAGAACAACC 3′(SEQ ID NO：24)
9：5′ACAACCCGCTGTTGGGGTTGA 3′(SEQ ID NO：25)
10：5′TTGACCTACAAGCGCCGACTGTC 3′(SEQ ID NO：26)
11：5′TTGACCGACAAGCGCCGACTGTC 3′(SEQ ID NO：27)
12：5′TTGACCCGCAAGCGCCGACTGTC 3′(SEQ ID NO：28)
13：5′CGCCGACTGTTGGCGCTGG 3′(SEQ ID NO：29)
14：5′ACTGTCGGCGCCGGGGCC 3′(SEQ ID NO：30)
15：5′ATCACCAGCGGCATCGAGGTC 3′(SEQ ID NO：31)
16：5′ATCACCACCGGCATCGAGGTC 3′(SEQ ID NO：32)
17：5′CGCGGCGAGACGATAGGTTGT 3′(SEQ ID NO：33)
18：5′CGCGGCGAGATGATAGGTTGT 3′(SEQ ID NO：34)
19：5′CTTCTGGCTGACCAACTCGCA3′(SEQ ID NO：35)
20：5′TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT 3’(SEQ ID NO：36)
2.根据权利要求1的方法，其中所说的靶核酸样品是得自被检者痰液、血液、支气管灌洗液、腹水以及脑脊液中结核分枝杆菌基因组DNA样品。
3.根据权利要求1的方法，其中所说的检测是使用带有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置或恒温水浴装置完成的。
4.根据权利要求1的方法，其中所说的靶DNA片断包括结核分枝杆菌基因组rpoB基因、katG基因、inhA基因启动子区，以及结核分枝杆菌插入序列IS1081片断。
5.根据权利要求1的方法，其中所说的DNA突变类型包括结核分枝杆菌rpoB基因高频突变区域内的8种不同的点突变，分别是511位CTG→CCG，513位CAA→CCA，516位GAC→GTC，522位TCG→TTG，526位CAC→TAC，526位CAC→GAC，526位CAC→CGC，531位TCG→TTG，533位CTG→CCG突变；katG基因最常见的315AGC→ACC突变以及inhA基因调控区-15C→T突变。
6.根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应扩增是首先用四对外引物扩增，然后再以该第一轮扩增所得到的产物作为模板，利用另外四对标记的内引物进行进一步的核酸扩增。
7.一种用于检测临床生物样品中结核分枝杆菌及耐药基因突变的试剂盒，该试剂盒包括：(1)核酸提取试剂；(2)聚合酶链反应试剂；(3)杂交反应试剂，特征在于聚合酶链反应扩增体系中使用的正向和反向引物分别为：
rpoBF1：5′CGT CGA GGT GCC GGT GGA AAC 3′(SEQ ID NO：1)
rpobR1：5′CAC CGA CAG CGA GCC GAT CAG 3′(SEQ ID NO：2)
KatGF1：5′CTG GCT CGG CGA TGA GCG TT 3′(SEQ ID NO：3)
KatGR2：5′AGG GCT CTT CGT CAG CTC CCA 3′(SEQ ID NO：4)
inhAF1：5′AGG GCG TCA ATA CAC CCG CA 3′(SEQ ID NO：5)
inhAR2：5′CGG ACC CTG GTG CTC TTC TA 3′(SEQ ID NO：6)
IS1081F1：5’-CACTGCTCGGTGCTGTGGATT-3’(SEQ ID NO：7)
IS1081 R1：5’-CACGGGTGTCGAAATCACGGT-3’(SEQ ID NO：8)
rpoBF2：5′GGTCGG CAT GTC GCG GAT G 3′(SEQ IDNO：9)
rpoBR2：5′GCA CGT CGC GGA CCTCCA G3′(SEQ ID NO：10)
katGF2：5′GAAACAGCGGCGCTGGATCG3′(SEQ ID NO：11)
katGR2：5′GTTGTCCCATTTCGTCGGG3′(SEQ ID NO：12)
inhAF2：5′CCTCGCTGCCCAGAAAGGG 3′(SEQ ID NO：13)
inhAR2：5′ATCCCCCGGTTTCCTCCGG 3′(SEQ ID NO：14)
IS1081F2：5′TCG CGTGATCCTTCGAAACG 3′(SEQIDNO：15)
IS1081R2：5′GCC GTT GCG CTG ATT GGA CC 3′(SEQ ID NO：16)
并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：
1：5′CAGCCAGCTGAGCCAATTCAT 3′(SEQ ID NO：17)
2：5′TTCATGGACCAGAACAACCCGC 3′(SEQ ID NO：18)
3：5′AACCCGCTGTCGGGGTTGACC 3′(SEQ ID NO：19)
4：5′TTGACCCACAAGCGCCGACTGTC 3′(SEQ ID NO：20)
5：5′GCCGACTGTCGGCGCTGG 3′(SEQ ID NO：21)
6：5′CAGCCAGCCGAGCCAATTCAT 3′(SEQ ID NO：22)
7：5′CTGAGCCCATTCATGGACCAG 3′(SEQ ID NO：23)
8：5′GCCAATTCATGGTCCAGAACAACC 3′(SEQ ID NO：24)
9：5′ACAACCCGCTGTTGGGGTTGA 3′(SEQ ID NO：25)
10：5′TTGACCTACAAGCGCCGACTGTC 3′(SEQ ID NO：26)
11：5′TTGACCGACAAGCGCCGACTGTC 3′(SEQ ID NO：27)
12：5′TTGACCCGCAAGCGCCGACTGTC 3′(SEQ ID NO：28)
13：5′CGCCGACTGTTGGCGCTGG 3′(SEQ ID NO：29)
14：5′ACTGTCGGCGCCGGGGCC 3′(SEQ ID NO：30)
15：5′ATCACCAGCGGCATCGAGGTC 3′(SEQ ID NO：31)
16：5′ATCACCACCGGCATCGAGGTC 3′(SEQ ID NO：32)
17：5′CGCGGCGAGACGATAGGTTGT 3′(SEQ ID NO：33)
18：5′CGCGGCGAGATGATAGGTTGT 3′(SEQ ID NO：34)
19：5′CTTCTGGCTGACCAACTCGCA3′(SEQ ID NO：35)
20：5′TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT 3’(SEQ ID NO：36)
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