CN113136446A

CN113136446A - 一种非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的方法、引物组以及试剂盒

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Publication number: CN113136446A
Application number: CN202110612187.0A
Authority: CN
Inventors: 何炯; 张辉; 黄成琛
Original assignee: Shanghai Kangli Diagnostic Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Kangli Diagnostic Technology Co ltd
Priority date: 2021-06-02
Filing date: 2021-06-02
Publication date: 2021-07-20

Abstract

本发明提供一种非结核分枝杆菌鉴定及其耐药基因突变检测的方法、引物组以及试剂盒。通过采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱技术，可以快速鉴定32种非结核分枝杆菌，同时针对大环内脂类和氨基糖苷类药物相关的耐药基因突变进行检测。根据本发明提供的方法、引物组以及试剂盒具有灵敏度高、特异性高、检测周期短、成本低、功能范围广的优点，为非结核分枝杆菌的临床检测、治疗和流行病学研究提供了新型检测方法。

Description

一种非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的方法、引物组以及试剂盒

技术领域

本发明涉及病原微生物检测，更具体地涉及一种非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的方法、引物组以及试剂盒。

背景技术

非结核分枝杆菌(Nontuberculous mycobacteria，简称NTM)是指除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的其它分枝杆菌，系条件致病菌。近年来，非结核分枝杆菌(NTM)病呈快速增多趋势，并已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题。迄今为止，已发现近200种NTM，其中已知具有致病性的有至少40余种。NTM的高危人群主要是慢性呼吸道疾病患者、老年人及免疫功能缺陷者，特別是艾滋病患者。随着人口老龄化、各种免疫抑制剂的使用、艾滋病的流行及医源性感染机会增多、环境污染等诸多因素，导致NTM病呈快速增多趋势。

NTM可以侵犯人体肺脏、淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等组织器官，并可引起全身播散性疾病。NTM感染肺脏，引起肺部病变称为非结核分枝杆菌肺病。NTM肺病临床表现无特征性，与肺结核在临床症状和影像学方面极为相似。实验室检测方面，NTM与MTB(M.tuberculosis，结核分枝杆菌)均为抗酸染色阳性，仅抗酸染色涂片和分枝杆菌培养的方法，不能很好地鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。因此，NTM肺病易被误诊为肺结核病，且疗效较差，影响结核病的防控工作，因此要加大对非结核分枝杆菌感染的重视力度，增强其临床快速鉴定能力。

近年来，NTM病的发病率、患病率在一些国家和地区呈上升趋势，甚至超过结核病的发病率和患病率。我国1979年全国第一次结核病流行病学调查中，NTM的分离率为4.3％。2000年全国第三次结核病流行病学调查结果显示：我国NTM总感染率为11.9％。2010年第五次全国结核病流行病学调查表明，NTM占分枝杆菌分离株的22.9％，较1979年4.3％的分离率明显上升。

NTM菌种分布具有明显地域差异是NTM病的另一流行特点，世界各地菌种分布均有所不同。我国由于南北方气候差异各地NTM菌种分布也不尽相同，北京结核病控制研究所报道，1991年从临床痰标本中分离出的NTM以鸟-胞内分枝杆菌复合体(MAC)、龟-脓肿分枝杆菌复合群、戈登分枝杆菌为主。梁莉等报道，1998-2004年上海市NTM感染菌种以Ⅳ群龟分枝杆菌最多，其次为MAC、堪萨斯分枝杆菌等。

目前，国内的实验室通常用色谱方法分析特定菌体成分(如脂肪酸、分枝菌酸等)特性，进行分枝杆菌菌种鉴定。色谱法主要有：柱色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。其中气相色谱法、高效液相色谱法是可以进行定量分析的色谱法。同时，色谱检测器的发展还伴随着数据处理技术的发展，检测获得的数据随即进行计算处理，使研究者获得更多信息。

1)气相色谱技术：分枝杆菌细胞壁中含有丰富的分枝菌酸(Mycolic acid，MA)。Torkko等[20]采用气相色谱分析全细胞脂肪酸对缓慢生长分枝杆菌的标准菌株检测证实，该技术和传统鉴定方法结果具有良好的一致性，是一种准确度高、实用性强的分枝杆菌菌种鉴定方法。国内刘志辉等应用气相色谱技术对14株分枝杆菌参考菌株和727株分枝杆菌临床分离株进行菌种鉴定，同时采用传统方法进行比对，认为气相色谱技术和传统鉴定方法结果具有良好的一致性，且可通过一次性实验操作将临床中常见的分枝杆菌鉴定到种。

2)高效液相色谱技术：将分枝杆菌皂化、提取MA、衍生化为溴代苯甲酰脂肪酸酯而进行高效液相色谱技术分析，对分枝杆菌的鉴别可达种间水平。陈保文等应用反相高效液相色谱法将44株NTM标准株准确鉴定出42株，仅爱知分枝杆菌和罗德岛分枝杆菌无法鉴别。应用色谱法进行NTM菌种鉴定，具有检测时间短、方法稳定可靠、结果准确的特点，但该法需借助较昂贵的仪器来完成，操作复杂，对操作人员技术要求高，且不能鉴别出新的NTM菌种。

3)PCR-RFLP技术PCR-RFLP是在PCR和DNA序列分析基础上产生的技术，是一种常见的微生物分型方法。采用相同的限制性内切酶消化不同微生物的DNA扩增片段，经琼脂糖凝胶电泳可得到特征性的限制性片段谱带，通过对电泳图谱的分析可对病原体进行分型。该法结合了PCR快速灵敏与RFLP准确、特异的优点，成本低廉、结果稳定、操作简单，结合软件可分析更为复杂的DNA电泳图谱。常用于PCR-RFLP法诊断分枝杆菌的种特异性保守序列有：IS6110、16S rRNA基因、16S～23S rRNA ITS区、hsp 65基因、rpoB基因等。

rpoB基因序列PCR：采用双重PCR的方法，以rpoB基因为靶基因设计引物，分别扩增结核分枝杆菌(MTB)和NTM的235和136bp的基因片段，对44株分枝杆菌参考株和379株临床分离株进行检测，并进一步对186株NTM选用限制性内切酶MspI、HaeII进行酶切鉴定和序列测定。结果表明，该方法可以准确、快速的对MTB和NTM进行鉴别，敏感性和特异性均为100％，并能将NTM鉴定到种。

hsp65基因序列PCR-RFLP分析技术：编码热休克蛋白的hsp65基因保守性较强，存在于所有分枝杆菌中，以hsp65基因作为PCR扩增的靶基因结合产物直接测序可以很好的将NTM鉴定到种，克服了因扩增产物长度不够而难以对NTM种及亚种鉴定的缺陷。

4)PCR-SSCP技术：MTB的16S rDNA在123～276bp完全相同，与其它22种分枝杆菌存在几个碱基的差异。国内靳晓红等用PCR-SSCP方法通过设计2对引物分别扩增16SrDNA 2条片段，根据SSCP电泳图谱与结核分枝杆菌标准株的相似性鉴别结核分枝杆菌、NTM，对98株临床分离株进行分析。结果表明，该方法对MTB及NTM的鉴别比细菌学方法快速，仅用3天，且与细菌学方法具有良好的一致性。该方法可及时鉴别MTB与NTM，对于临床复治、难治结核病的诊断及药物选择有重要作用。

5)基因芯片技术：基因芯片法是指将大量核酸分子以预先设计的方式固定在载体上，检测带标记的待测样品DNA，与传统检测方法相比，具有检测时间短、通量高等优点，是一种大规模分析遗传差异的新方法。目前商品化的分枝杆菌菌种鉴定试剂盒如博奥生物公司DNA微阵列芯片法可以快速检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、戈氏分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌等17种临床常见分枝杆菌，将常规的检测时间大大缩短，在8h内即可得到结果。

6)基因探针技术：基因探针技术包括以德国Hain Lifescience公司的LiquidArray代表的DNA探针技术和以美国Gene Probe公司的AccuProbe技术为代表的RNA探针技术，同时还包括基因芯片技术。LiquidArray应用生物素标记的特异性探针，探针序列为各种标准菌株23SrRNA的特异序列，标记的探针通过与亲和素标记的PCR产物杂交显色后，不同NTM菌种会在试纸条上出现特定的条带，最后通过条带显色的差异区分不同的菌种类别。该试剂包括常见NTM HAIN基因分型试剂盒(CM)和非典型NTM HAIN基因分型试刺盒(AS)两种，CM试纸能鉴定临床最常见的15种NTM，如鸟-胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌等；AS试纸能鉴定临床致病较少见的NTM，如耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌、胃分枝杆菌等。

然而，NTM对抗结核药物具有极高的耐药性，其对异烟肼、对氨基水杨酸钠、乙胺丁醇、利福平、链霉素等常用抗结核药物存在不同程度的耐药，且大部分菌株对多种抗结核药物耐药。NTM对大多数抗结核药物天然耐药的生理基础可能是NTM细胞表面的高疏水性及细胞壁的通透屏障。发展可靠的药敏检测方法及有效的防治措施，已成为NTM病防控的关键。

目前关于NTM感染、发病的流行病学研究的较少，且尚未建立早期、快速、敏感和特异的标准化诊断技术。NTM肺病的临床表现、X线检查、痰抗酸染色等均与肺结核相似，常常造成临床上的错误诊断及治疗。NTM的误诊可对结核病的防治工作产生影响，如果按照结核病方案治疗NTM，则导致过度治疗，不仅对患者造成不良反应，而且造成医疗资源浪费，影响肺结核的治疗管理。由于现有的诊断方法各有利弊，因此，NTM的实验室诊断方面迫切需要进行更加深入的研究，且亟待标准化。

发明内容

本发明的目的是提供一种非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的方法、引物组以及试剂盒，从而解决现有技术针对非结核分枝杆菌的检测方法存在灵敏度低、周期长、成本高、检测范围窄等缺点，并且无法同时实现非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种非结核分枝杆菌鉴定的引物组，所述非结核分枝杆菌鉴定的引物组包括如下所示的7对扩增引物：

；所述非结核分枝杆菌鉴定的引物组还包括如下所示的40条延伸引物：

根据本发明的第二方面，提供一种非结核分枝杆菌耐药基因突变检测的引物组，所述非结核分枝杆菌耐药基因突变检测的引物组包括如下所示的4对扩增引物：

；所述非结核分枝杆菌耐药基因突变检测的引物组还包括如下所示的8条延伸引物：

菌种鉴定的基因和位点是从NTM上百个基因中通过特有的技术遴选出来的，具有高灵敏度，高特异性，临床应用快速，结果明确，不需要处理大量的数据，这是该方法大大优于其他诊断方法的地方，也是该发明创新之处。

根据本发明的第三方面，提供一种非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的引物组，所述引物组包括如上面所述的非结核分枝杆菌鉴定的引物组，以及如上面所述的非结核分枝杆菌耐药基因突变检测的引物组。

根据本发明的第四方面，提供一种非结核分枝杆菌鉴定的方法，用于非疾病的诊断目的，所述方法包括采用如上面所述的引物组检测相关基因位点是否符合特征碱基，若符合即可确定相应非结核分枝杆菌的存在。

根据本发明的第五方面，提供一种非结核分枝杆菌耐药基因突变检测的方法，用于非疾病诊断目的，所述方法包括采用如上面所述的引物组检测相关基因位点是否存在突变；其中，任何一个检测位点出现突变，即可判定针对与该检测基因对应的药物具有耐药性，实现对大环内脂类和氨基糖苷类这两类抗NTM药物耐药性的检测，如下表所示：

根据本发明的第六方面，提供一种非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的方法，用于非疾病的诊断目的，所述方法包括如上面所述的非结核分枝杆菌鉴定的方法，以及如上面所述的非结核分枝杆菌耐药基因突变检测的方法。

根据本发明提供的上述方法，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统同时实现非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测。

根据本发明的第七方面，提供一种非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的试剂盒，所述试剂盒包括根据如上面所述的非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的引物组。

根据本发明的一个优选方案，所述试剂盒的PCR扩增的反应体系如下：

根据本发明的一个优选方案，所述试剂盒的SAP反应体系如下：

SAP缓冲液 0.17μL

SAP酶 0.5U

水补齐至2μL。

根据本发明的一个优选方案，所述试剂盒的iPLEX延伸的反应体系如下：

根据本发明，相对现有技术最主要的贡献在于可以同时鉴定32种非结核分枝杆菌(M.arosiense,M.abscessus,M.bolletii,M.massiliense,M.avium,M.chelonae,M.kansasii,M.xenopi,M.intracellulare,M.chimaera,M.smegmatis,M.simiae,M.terrae_A,M.terrae_B,M.fortuitum,M.ulceran,M.immunogenum,M.mucogenicum,M.peregrinum,M.malmoense,M.szulgai,M.scrofulaceum,M.gordonae,M.branderi,M.marium,M.nonchromogenicum,M.intermedium,M.triplex,M.triviale,M.phlei,M.lentiflavum,M.parascrofulaceum)。同时还针对这32种NTM各自特异性基因变异位点，以及它们对于常用的两大类主要抗生素---大环内酯类(含克拉霉素、阿奇霉素)和氨基糖苷类(含阿米卡星、卡那霉素、庆大霉素)耐药位点，本发明分别设计了相应的引物，能够同时对耐药基因突变进行检测。

本发明采用飞行时间质谱MassArray技术，对国内临床98％以上常见分枝杆菌菌种或菌群进行鉴定及耐药基因突变检测，可在3个工作日内完成从样本制备到结果报告的全过程，具有覆盖度高、结果准确、快速、自动化程度高和价格低等优势。

本发明所采用的飞行时间质谱MassArray技术是近年来发展起来的一种新型电离质谱技术，针对临床样本中常见的非结核分枝杆菌种类，通过各物种基因组中特异性位点设计基因panel，不同菌种DNA样本经过飞行时间质谱仪后，在不同的位置产生峰值，与各种NTM标准品DNA文库进行比对，从而将NTM鉴定至种。结合本地区的NTM分型及流行病学状况，对NTM肺病耐药情况进行研究，可以提高对NTM肺病的认识，加强NTM鉴定及NTM致病菌种的药敏试验，减少误诊漏诊，提高对NTM病的诊治水平。

本发明利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted LaserDesorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)，在MassARRAY平台采取与PCR相结合的方法，对临床样本中的非结核分枝杆菌进行菌种鉴定，并且同时检测其对治疗药物的耐药突变，确定样本中非结核分枝杆菌的耐药情况，辅助临床选择有效的治疗方案。

MassARRAY系统是使用质谱分析精确测量PCR扩增产物的非荧光检测平台。质谱分析与终点法PCR相结合，在通用的循环条件下实现了高度多重性的反应，以提供精确、快速且经济高效的分析。MassARRAY是基于MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离-飞行时间)质谱的检测方法。此系统使用PCR来扩增含有每个SNP的基因片段，其中延伸引物在多态性碱基附近退火，并且最后一个碱基与检测的SNPs互补，因此当反应扩增至此碱基时，此片段的延伸反应终止。由于最后一个碱基的质量也有所不同，因此通过质谱可检测不同基因片段之间的质量差异，进而计算出此片段中存在的SNPs。

脉冲紫外激光将产物进行电离，高压静电场使离子化的DNA分子从真空管底部加速到达顶部。由于更轻的离子在电场中运动得更快，因此较轻的DNA分子可以更早地撞击到检测管顶部的检测器。在每次激光脉冲发射之后，检测器会记录每个分析物的相对飞行时间，从而可以计算出DNA片段的质量，进而确定检测片段上的多态性位点处存在的SNPs的具体类型。由于激光发射到信号检测的整个过程只需几毫秒，因此可以在不到50分钟的时间内分析多达384个样品。MassARRAY系统利用有限的加入样本为靶向基因检测提供了独特的解决方案。与全基因组关联分析(GWAS)相比，MassARRAY系统的自定义功能更强，可以对有限的具有重要意义的SNPs进行精准分析，从而提高准确性和时效性。

综上所述，本发明提供了一种非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的方法、引物组以及试剂盒，通过采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱技术，可以快速鉴定32种非结核分枝杆菌，同时对其针对大环内脂类和氨基糖苷类这两类常用的抗NTM药物耐药性进行检测，同时该方法以及试剂盒具有灵敏度高、特异性高、检测周期短、成本低、功能范围广的优点，为非结核分枝杆菌的临床检测、治疗和流行病学研究提供了新型检测方法。

附图说明

图1是病例一分别于2020-04-10(A)，2020-10-02(B)拍摄的胸部CT。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

1.1检验原理

本发明采用的检测方法为核酸飞行质谱。首先通过PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。

1.2主要组成成分

10×PCR buffer；MgCl₂溶液；dNTP溶液；HS Taq；3-Pt Calibrant；iPlex BufferPlus-10×；iPlex Termination Mix；iPlex Enzyme；SAP Buffer；SAP Enzyme；引物；ddH₂O；阳性对照品；干燥树脂；芯片板。

1.3配套仪器

通用PCR仪；Massarray Nanodispenser点样仪，型号RS1000(Agena Bioscience)；质谱仪Massarray Analyser Four，型号Massarray Analyser Four System 96/24Genotyping(Agena Bioscience)。

1.4样本要求

本品适用于从痰液、血液、尿液、灌洗液、脑脊液等临床样本或培养物中提取的结核分枝杆菌基因组DNA，要求DNAA260/A280比值应介于1.8到2.0之间。冷冻DNA样本应保存在-20℃以下，并且避免反复冻融。

1.5检验方法

1.5.1PCR反应

1)在PCRⅠ区，从-20℃冰箱中将各试剂(盒)取出，置于冰上(4℃)融解，再从4℃冰箱取出扩增引物，均涡旋震荡10s后简短离心，备用。

2)按表1依次加入相关试剂组分配置PCR反应混合液，并做好标记，分装至96孔板中，3μL/孔；分装完后从PCRⅠ区通过传递窗传至Ⅱ区。PCR混合液组成如表1所示。

表1：PCR混合液

试剂	最后在5μL反应液中的浓度	5μL中的试剂体积(μL)
			水	N/A	1.3
10×PCR缓冲液(20mM MgCl<sub>2</sub>)	2mM MgCl<sub>2</sub>	0.5
			25mM MgCl<sub>2</sub>	2mM	0.4
25mM dNTP	500μM	0.1
			1μM扩增引物混合液	0.1μM	0.5
5U/μLPCR酶	1U/rxn	0.2
			5ng/μL DNA	10ng/rxn	2.0
总体积	N/A	5.0

3)在PCRⅡ区，从-20℃冰箱取出DNA 模板，冰上(4℃)融解，涡旋震荡10s后简短离心，吸出一定量DNA稀释至5ng/μl，备用。

4)向96孔板中每孔加入2μL 5ng/μL DNA模板，盖上管盖，涡旋震荡10s后简短离心，从PCRⅡ区通过传递窗传至Ⅲ区，再从PCRⅢ区通过传递窗传至Ⅳ区，每次实验时必须设定空白对照(2μL ddH₂O)、阴性对照(2μLDNA提取洗脱液)和阳性对照。

5)将96孔板放入扩增仪，运行程序：pcr，具体程序如下：

1.5.2 SAP反应

PCR反应结束后，根据表2在1.5mL EP管中配制SAP混液。表2的数字是以一块96孔板加上38％过剩额计算出来的。该配置过程在PCRⅠ区完成。

表2：SAP反应混合液

1)将配制好的SAP混液由PCRⅠ区传递至Ⅳ区，加2μL SAP混液到每一个孔里(加混液后总体积：7μL)。

2)把板用膜(用life的或其它公司质量较好的膜)封好，涡旋震荡和离心(4000rpm5秒)。

3)将板放上PCR仪进行以下程序：

37℃40分钟，

85℃5分钟，

4℃保温。

1.5.3延伸反应

1)取出SAP反应板2000rpm离心1min。

2)根据表3在1.5mL管中配制iPLEX延伸反应液。表3的数字是以一块96孔板加上38％过剩额计算出来的。请根据实际反应的数量调整数字。该配置过程在PCRⅠ区完成。

表3：iPLEX延伸反应液

3)将iPLEX延伸混液由PCRⅠ区传递至Ⅳ区，每一个孔加入2μL iPLEX延伸混液并混好(加混液后总体积：9μL)。

4)把板用膜封好，涡旋震荡和离心(4000rpm 5秒)。

5)将96孔板放上PCR仪进行以下热循环：

1.5.4调节(样本脱盐)

以下程序为一块96孔板而设，请根据实际孔的数量调节程序。戴上手套和护眼镜。

1)把洁净树脂(Resin)铺平在96/15mg dimple plate上，风干最少10分钟。

注意：先用勺子将树脂铺放在板上，然后用刮板刮从左至右或从右至左刮树脂，使96个孔都被树脂填满，当96个孔都被填满后再用刮板轻轻地刮一遍并将表面残留的树脂刮下去，防止干扰下步贴膜。当树脂由深黄变为淡黄色，即表明树脂已经干的差不多了。

2)在样本板的每一个有样本的孔里加入41μL水，封膜(用普通的膜即可)，然后离心。

3)加入15mg洁净树脂(Resin)：轻轻将样本板凌空反转，放在已放树脂的dimpleplate上，一定要孔对孔！然后将dimple plate连样本板一起反转(过程中两块板不可水平移动)，让树脂掉到孔里。

4)用膜(用普通的膜即可)把板封好，放在旋转器上颠倒摇匀15分钟。

5)以3200g(标准板离心机的4000rpm)将板离心5分钟。

1.5.5点样

按照Massarray Nanodispenser操作说明将PCR产物转移至芯片板。

1.5.6质谱分析

1)从点样仪中取出芯片板。

2)用镊子将芯片板转移至Massarray Analyser Four芯片槽，芯片印有文字的一面朝外，并用镊子将芯片向左下方方向挤压。

3)按照Massarray Analyser Four操作说明，进行飞行质谱检测及结果读出。

1.6检验结果的解释

1)试剂盒有效性判定：标准品可以检测对应基因型，空白对照品(ddH₂O)无信号检出，弱阳性对照可以检出对应阳性信号时，此次检测结果有效，否则此次检测结果无效。

1.7检验方法的局限性

1)本方法可能受到检测样本DNA质量的影响，如果检测样本DNA质量较差，可能出现假阴性结果。

2)本检测结果仅供临床用药参考，用于指导个体化用药，不能作为临床用药的唯一依据。

3)当本品检出对应位点的基因型为敏感型时，不能排除该基因还有其它位点的突变。

案例一

1.病例特点：

1.1王某，女，68岁，汉族，已婚。因咳嗽、咳痰20多天，2020年10月2日到安徽医科大学附属安庆医院首次就诊。

1.2既往史：①既往有糖尿病病史14年，口服格列齐特(80mg,q12h)、二甲双胍(0.5g,qd)降糖治疗，血糖控制不佳；②30年前发现肺结核病史，未重视，未治疗；1年前在外院接受2HREZ/4HR方案抗结核治疗；③无手术、外伤史，无药物过敏史；否认结核病人密切接触史。否认吸烟、饮酒史。无特殊家族史。

1.3现病史：患者此次就诊20天前无明显诱因下出现咳嗽、咳痰，咳嗽较剧，咳黄痰，量较多，伴有胸闷、盗汗，无发热、咯血、胸痛、心悸、呼吸困难等不适，就诊于望江县人民医院，检查胸部CT(2020.10.02)：双肺纹理增粗紊乱，双肺内多发斑片状、结节状阴影，部分病灶内可见不规则空洞，纵隔内未见明显肿大淋巴结。较前(2020.04.10)比较，病灶较前进展。病程中，患者饮食、睡眠欠佳，二便无明显异常，否认近期体重明显下降。T36.8℃，P121次/分，R21次/分，BP100/57mmHg。神志清楚，精神一般，双肺呼吸音低，未闻及明显干湿啰音，无胸膜摩擦音。心率121次/分，心律整齐，心音正常，无杂音，无心包摩擦音。双下肢无水肿。

1.4辅检：血常规：WBC11.61*10⁹/L，N85.0％，RBC3.66*10¹²/L，HGB98g/L。ESR82mm/h。糖化血红蛋白比8.30％。空腹葡萄糖9.75mmol/l(↑)。CRP142.52mg/L(↑)，PCT0.562ng/ml(↑)。甲状腺功能：T3 0.90nmol/L(↓)，FT3 1.71pmol/l(↓)，TSH 6.46uIU/ml(↑)。凝血功能：D-二聚体1.63μg/ml，活化部分凝血活酶时间49.6s，纤维蛋白原4.73g/l。肝肾功能、心肌酶、电解质：无明显异常。肿瘤指标：糖类抗原125：267.0U/mL(↑)，糖类抗原153：52.7U/mL(↑)，铁蛋白738.0μg/L(↑)，糖类抗原724：15.90IU/ml(↑)。2020-10-06痰液培养：无致病菌生长。痰找霉菌*2次：阴性。2020-10-13痰结核分枝杆菌培养：未培养出。结核抗体弱阳性(+)，肺炎支原体抗体：1:80弱阳性(+)。结核核酸测定：阳性(+)。PPD试验、G试验：阴性。痰抗酸性染色找抗酸性杆菌*3次：+。痰Gene-Xpert*2次：G-Xpert阴性，RFP阴性。心脏彩超：左室舒张功能减退，EF：62％。胸部CT比较如图1中的A、B所示。

2.初步诊断：

1)继发性肺结核，双侧，涂(阳)，Gene-Xpert(阴)，复治

2)2型糖尿病。

3.诊疗计划：

1)于2020.10.03予以HREZ方案抗结核以及化痰等治疗。

2)糖尿病饮食，健康宣教，予以门冬胰岛素、重组甘精胰岛素降糖治疗。

4.预后：

治疗后患者咳嗽、咳痰稍有好转，但反复午后起热，体温最高达39.2℃，于2020.10.08加用阿米卡星抗结核治疗。

可能性包括：①NTM肺病，②真菌感染，③其它特殊病原体感染，④非感染性疾病。

2020-10-08送上海康黎医学检验所基因检测。

5.基因检测结果：

5.1分枝杆菌检测结果

5.2一线药物耐药基因突变检测结果(TB)

应当理解是，在临床实践中，在对患者样本进行NTM检测之前，还需首先对样本进行TB检测。

未检出	检出
		/	/

5.3二线药物耐药基因突变检测结果(TB)

未检出	检出
		/	/

5.4NTM药物耐药基因突变检测结果

6.修正诊断：

1)非结核分枝杆菌肺病；

2)2型糖尿病。

7.治疗方案的调整：

采用利福平+阿奇霉素+阿米卡星治疗，导致了患者右耳听力下降；停用阿米卡星，加用乙胺丁醇，患者出现腹泻，呈稀水样，约2～5天一次；停用阿奇霉素，加用克拉霉素；最终方案：利福平+阿奇霉素+乙胺丁醇。

8.出院随访：出院后2周，患者在门诊随访，患者诉咳嗽、咳痰较前好转，无发热、咯血、胸闷，复查血常规、肝肾功能正常。

案例二

1.病例特点：江某某，女性，50岁，农民。既往糖尿病10年，平素自服二甲双胍、格列齐特。患者2020.2月受凉后出现咳嗽咳痰，未重视。2020.8.3突发咯血1口，量约5mL，来蚌埠市传染病医院就诊，摄胸部CT提示左上肺结核可能。

2.入院检查：生命体征正常，一般情况可。肺：两肺呼吸音粗,两肺可闻及散在湿啰音，余未见异常。心、腹、神经系统阴性。

3.第一次住院：2020.8.4入院，血常规正常，生化常规：Alb：39.5g/L,ALP：122u/L,LDH:21.9u/L,Glu:9.04mmol/L，余正常，尿常规：Glu 3+。血沉：60.4mm/h。肿瘤标志物未见异常。糖基化血红蛋白：12.6％。痰涂片找抗酸杆菌阴性。PPD试验13×14mm。痰培养见肺炎克雷伯菌感染。结核耐药基因检测：阴性。心电图正常，腹部超声正常，心脏彩超：三尖瓣轻度关闭不全，左心舒张功能减低。

4.初步诊断：诊断为初治菌阴肺结核，予HRZE方案抗结核及抗感染、止血等治疗，期间因不能耐受利福平调整为利福喷丁，后患者症状缓解出院。8.21出院方案：H(0.3g)RFT(0.6g biw)Z(1.5g)E(0.75g)。

5.第二次住院：出院后患者仍间断有咳嗽，伴有黄褐色脓痰。2020.9.27因右侧胸痛，再次入院治疗。血常规：WBC：5.61×10⁹/L，N％：63.6％，L％：27.5％，RBC：4.06×10¹²/L，Hb：122g/L，PLT：321×10⁹/L，CRP:19.99mg/L。血沉：95.7mm/h。凝血五项：FIB:5.36g/L。

6.生化常规：Alb：35.5g/L,Glu12.23mmol/L,Bun:2.76mmol/L,Cr:18.1μmol/L，尿酸380μmol/L，CK31μ/L、CK-MB26.9ng/mL。尿常规：酮体(+-)，Glu(1+)。痰涂片找抗酸杆菌(2+，2+，2+)。痰涂片革兰染色检及G+球菌，G-球菌，G-杆菌，未检见真菌。肿瘤五项及肺癌两项：CEA:5.25ng/mL,CA125:77.53u/mL,CA153:49.64u/mL。免疫八项未见异常。大便常规+OB：正常。痰结核基因检测：阳性，未查见耐药基因。痰结核培养+药敏回归：阳性，未见耐药。

7.诊断结果：继发性肺结核左肺涂(阳)培(未)初治伴感染，2型糖尿病。2020.9.28H(0.3g)、RFT(0.6g biw)、Z(1.5g)、E(0.75g)+头孢曲松舒巴坦2.0qd治疗，10.24因咯血，予止血、抗感染治疗。期间反复查痰菌抗酸杆菌均为阳性。10.29复查胸部CT。11.7予雾化吸入INH0.2+Am0.2。支气管镜检查：气管粘膜未见明显病变。为进一步明确，进行基因检测(TBC及NTM核酸质谱检测)。

8.基因检测结果：

8.1分枝杆菌检测结果

8.2一线药物耐药基因突变检测结果(TB)

8.3二线药物耐药基因突变检测结果(TB)

8.4NTM药物耐药基因突变检测结果

9.调整后的治疗方案及效果：2020.11.27予以更改方案：莫西沙星0.4g，环丝氨酸0.5g，利奈唑胺0.6g，卡那霉素0.6g，对氨基水杨酸钠10.0g，吡嗪酰胺1.5g+阿奇霉素0.5g，治疗1周后，2020.12.4复查痰涂片找抗酸杆菌阴性。2020.12.10痰结核菌耐药基因检测：异烟肼、利福平耐药。2020.12.7复查胸部CT病灶较前进一步吸收。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海康黎诊断技术有限公司

<120> 一种非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的方法、引物组以及试剂盒

<160> 70

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgttggatg cagttgattg cgagagctg 29

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acgttggatg aatgattgcc agacacagtt ctag 34

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acgttggatg cacgcgccct taaacactta ccacttaac 39

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acgttggatg tgatccgcta cgacctccag 30

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<212> DNA

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acgttggatg cgatcagggc atcatccagc 30

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<212> DNA

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acgttggatg gtttcggcgt gagtaaggt 29

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acgttggatg acgatgtaga tcggtcgcac 30

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aacgctgacg aaaagg 16

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cgggtaagcg cactccccat tg 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cccaacgtgt ctctcaag 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ccgggtggaa catcgacaat gcgc 24

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

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aaccggctgg aacatcgaca agggc 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cagcgggtgg cagatcgctt cggga 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

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atggctggaa gatcgcctaa ccc 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ggctggaaca tcgactcggg a 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ctgagacaac acttcaggcg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gacaacactg ctggca 16

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tgtgtaattt cttttacttt ac 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gaaatgtgta atttctgttt ctg 23

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

atcgacgtcg ccgctgcggg g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tcgaacctgc cgcaggagt 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ccggctggac cgacata 17

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<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cacatcgatt ctctgg 16

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ctatctgggg tacttcga 18

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cgctggaaca tcaaacagcc ttc 23

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cggctggaac atcgacgcca gcta 24

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tggaacatcg acgagggg 18

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

atttacgtgg cggggaccgg t 21

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

catggaacat cgatgcaggt 20

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

gggtggaaca tcgacaatgg cc 22

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

tccggctgga acatcgatgc tttgg 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aataagccga caggggg 17

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctggaacatc gacgagggt 19

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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atggaacatc gacgcaggc 19

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

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acggctggaa catcgatgca gga 23

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

aggccggctg gaacatcgtg ggtact 26

<210> 44

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

ttgaacatcg attcgggc 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

tggaaggtcg aaacgggg 18

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

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agatcgacgt cgccaatggc ggt 23

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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ataagccgga cacgaccaac 20

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

cacgctgccc aaccgcggtg aa 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gtgaacgcag acggcacgaa ggg 23

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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gctggaacat caacgtttgg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

tccggctgga atatcgattc ggga 24

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gctggaagat cgatgagggt 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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aatgttcgac ggtggggcgc a 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aacctgccgc agaggt 16

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

acgttggatg aatggcgtaa cgacttctca actgt 35

<210> 56

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acgttggatg gcaccagagg ttcgtccgtc cc 32

<210> 57

<211> 31

<212> DNA

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acgttggatg atgacgtcaa gtcatcatgc c 31

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acgttggatg aggtgatcca gccgcacctt c 31

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<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

acgttggatg cgctcgccaa cgacgagcag ctcg 34

<210> 60

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

acgttggatg gagcgaacac cggattcggc 30

<210> 61

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

acgttggatg acggcgcgct gacggcacat ctg 33

<210> 62

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

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acgttggatg gcgccgcctg atcaccagca c 31

<210> 63

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

ctcgttacgc gcggcacgag ga 22

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

gtgaaggtcc cgtcgggt 18

<210> 65

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

ttgtacacac ccccgg 16

<210> 66

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

accgactttg accatg 16

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

gttaccgact ttgatcac 18

<210> 68

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

ttggtcgcgc caacgg 16

<210> 69

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

ctggttgctg ccgg 14

<210> 70

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

tatccgctca ctgatgactg gggccgg 27

Claims

1.一种非结核分枝杆菌鉴定的引物组，其特征在于，所述非结核分枝杆菌鉴定的引物组包括如下所示的7对扩增引物：

基因位点扩增引物(5’-3’) T SEQ ID No.1～2 RB-1 SEQ ID No.3～4 RB-2 SEQ ID No.5～6 mce3B-1 SEQ ID No.7～8 ITS1 SEQ ID No.9～10 mce3B-2 SEQ ID No.11～12 BGAL SEQ ID No.13～14

所述非结核分枝杆菌鉴定的引物组还包括如下所示的40条延伸引物：

2.一种非结核分枝杆菌耐药基因突变检测的引物组，其特征在于，所述非结核分枝杆菌耐药基因突变检测的引物组包括如下所示的4对扩增引物：

基因位点扩增引物(5’-3’) rrl23 SEQ ID No.55～56 rrs1406 SEQ ID No.57～58 erm_28 SEQ ID No.59～60 erm_276 SEQ ID No.61～62

所述非结核分枝杆菌耐药基因突变检测的引物组还包括如下所示的8条延伸引物：

基因位点延伸引物(5’-3’) rrl2058 SEQ ID No.63 rrl2059 SEQ ID No.64 rrs1406 SEQ ID No.65 rrs1408 SEQ ID No.66 rrs1409 SEQ ID No.67 erm_28 SEQ ID No.68 erm_276 SEQ ID No.69 erm_64 SEQ ID No.70

。

3.一种非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的引物组，其特征在于，所述引物组包括根据权利要求1所述的非结核分枝杆菌鉴定的引物组，以及根据权利要求2所述的非结核分枝杆菌耐药基因突变检测的引物组。

4.一种非结核分枝杆菌鉴定的方法，用于非疾病的诊断目的，其特征在于，所述方法包括采用如权利要求1所述的引物组检测相关基因位点是否符合特征碱基，若符合即可确定相应非结核分枝杆菌的存在。

5.一种非结核分枝杆菌耐药基因突变检测的方法，用于非疾病的诊断目的，其特征在于，所述方法包括采用如权利要求2所述的引物组检测相关基因位点是否存在突变；其中，任何一个检测位点出现突变，即可判定针对与该检测基因对应的药物具有耐药性，实现对大环内脂类和氨基糖苷类这两类抗NTM药物耐药性的检测，如下表所示：

基因位点敏感耐药药物名 rrl2058 A C/G/T 大环内酯类抗生素 rrl2059 A C/G/T 大环内酯类抗生素 rrs1406 T A 氨基糖苷类抗生素 rrs1408 A G 氨基糖苷类抗生素 rrs1409 C T 氨基糖苷类抗生素 erm_28 C T 大环内酯类抗生素 erm_276 A T/C 大环内酯类抗生素 erm_64 G C 大环内酯类抗生素

。

6.一种非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的方法，用于非疾病的诊断目的，其特征在于，所述方法包括如权利要求4所述的非结核分枝杆菌鉴定的方法，以及如权利要求5所述的非结核分枝杆菌耐药基因突变检测的方法。

7.根据权利要求6所述的非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的方法，其特征在于，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统同时实现非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测。

8.一种非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括根据权利要求3所述的非结核分枝杆菌鉴定及耐药基因突变检测的引物组。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR扩增的反应体系如下：

所述试剂盒的SAP反应体系如下：

SAP缓冲液 0.17μL

SAP酶 0.5U

水补齐至2μL；

所述试剂盒的iPLEX延伸的反应体系如下：