CN102229999A

CN102229999A - 鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN102229999A
Application number: CN201110146256XA
Authority: CN
Inventors: 邹耀东; 张新丽; 任维; 曲敬
Original assignee: YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Current assignee: YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Priority date: 2011-06-01
Filing date: 2011-06-01
Publication date: 2011-11-02

Abstract

本发明是利用双通道荧光定量的优点，能够一次性区分鉴别结核和非结核分枝杆菌的荧光定量核酸检测技术，检测时间短，检测结果可靠而且能够定量。本发明的技术方案为提供一种鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒，包括对待测菌株进行PCR扩增的引物和荧光定量检测的探针。本发明通过不同分枝杆菌的基因序列的差异来设计荧光探针，区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，从细菌的基因序列和分子结构水平来区分和鉴定，分类更准确，更可靠。解决了传统鉴定方法中通过细菌的生长形态来区分需耗时长达4-6周的问题。

Description

鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及结核和非结核分枝杆菌检测领域，具体涉及检测结核和非结核分枝杆菌的方法及专用试剂盒。

背景技术

结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌以外的非结核分枝杆菌(NTM)引起的疾病称为非结核分枝杆菌病，可累及淋巴结、皮肤、软组织和肺。非结核分枝杆菌感染肺脏，引起肺部病变称为非结核分枝杆菌肺病。其中非结核分枝杆菌(NTM)在世界上报道的有150多种，其中命名了54种，有致病性的分枝杆菌有37种，中国境内分离出了20多种。

NTM是一种环境分枝杆菌，大部分是腐物寄生菌，主要存在于自然环境中，现在普遍被接受的观点是，人可从环境中感染NTM而患病，水和土壤是重要的传播途径，人与人之间传播尚未得到证实，但可以通过动物传染给人。

世界各国由于地理、环境、气候的不同，各国经济、文化水平、医疗技术水平的差异和对疾病的调查方法、标准不同，NTM病流行情况千差万别，但目前几乎是结核病倾向减少，NTM病有逐渐增加趋势。

非结核分枝杆菌致病性特点：

(1)老年人身患多种疾病易发病。非结核分枝杆菌通常作为继发性或伴随性疾病，感染具有机会性是此菌致病性的一个显著特点。往往在慢性阻塞性肺疾病、老年人、恶性肿瘤病人、肾透析、脏器移植时接受免疫抑制剂以及应用肾上腺皮质激素者，本病发生率增加。我们有1例90岁非结核分枝杆菌肺病患者，基础病为慢性阻塞性肺疾病、冠心病、血管性痴呆、前列腺肥大等多种疾病及长期机械通气反复肺部感染。

(2)致病性低。一般认为NTM对人类的致病性比结核分枝杆菌低。刘敬东认为，全国感染NTM者估计在1亿以上，但发病者仅百余例。我病区同时期有9例患者使用呼吸机，其中8例患者从痰中检测到抗酸杆菌，通过结核菌培养加菌种鉴定，其中7例患者无结核复合群。这8例患者中仅1例有明确的肺部阴影。

(3)临床症状差异较大。一般认为NTM引起的肺部病变与肺结核十分相似，症状大多较轻，缺少特征性。一般表现为咳嗽、咳痰、低热和疲乏或偶有咯血，有些患者无明显临床症状和体征。因多数患者有肺部基础疾病，蓁咳嗽、咳痰的症状往往被误诊为基础疾病所致。

(4)艾滋病及HIV感染者多发。在美洲和欧洲艾滋病病人中，发现50％患者感染分枝杆菌，其中10％～15％为鸟-胞内复合群分枝杆菌。

(5)耐药率高。有报道非结核分枝杆菌的耐药率为95.9％。

结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。我国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。分枝杆菌感染严重危害着广大人民群众的身体健康，已成为重大的公共卫生问题和社会问题。

1997年我国第一次结核病流行病学抽样调查显示，8省市52万人痰菌培养阳性681份，经菌种鉴定29株为NTM，分离率为4.3％。1990年第三次全国结核病流行病学抽样调查结果显示，NTM感染率为15.35％，浙江省最高为44.89％。2000年全国流调中NTM菌株占11.1％。

当前，我国结核感染防控面临两大问题：一是结核多药耐药(MDR)的产生与传播，使结核分枝杆菌感染难以控制，再度发展为难治倾向，MDR是结核病高病死率的主要原因之一；二是非结核分枝杆菌(NTM)所引发的疾病发病率增加，越来越为人们所关注。由于传统的检测方法需要6到8周才能得到结果，延误了病人的早期治疗，使病人处于盲目用药状态。

大量研究以及临床治疗病例表明多数传统抗痨药对非结核分枝杆菌病(NTM)病很少或没有疗效，因此，对结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的区分检测对指导临床治疗有着重要的意义。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是通过不同分枝杆菌的基因序列的差异来设计荧光探针，进行荧光定量PCR检测，从细菌的基因序列和分子结构水平来区分和鉴定结核和非结核分枝杆菌。

本发明提供的技术方案为提供一种鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒，包括对待测菌株进行PCR扩增的引物和荧光定量检测的探针，其特征在于，所述引物为上游引物MF1和下游引物MR1或上游引物MF2和下游引物MR2，所述引物能与分枝杆菌的特异片段结合，所述用于检测分枝杆菌设计的探针1其序列为M1、M2、M3中的任意一个，用于检测结核分枝杆菌设计的探针2序列为T1、T2、T3中的任意一个，所述探针1和探针2的3’端带有淬灭物质，所述探针1和探针2的5’端的荧光物质不同，

所述上游引物MF1的核苷酸序列为序列表中的序列1；

所述下游引物MR1的核苷酸序列为序列表中的序列2；

所述上游引物MF2的核苷酸序列为序列表中的序列3；

所述下游引物MR2的核苷酸序列为序列表中的序列4；

所述探针M1的核苷酸序列为序列表中的序列5；

所述探针M2的核苷酸序列为序列表中的序列6；

所述探针M3的核苷酸序列为序列表中的序列7；

所述探针T1的核苷酸序列为序列表中的序列8；

所述探针T2的核苷酸序列为序列表中的序列9；

所述探针T3的核苷酸序列为序列表中的序列10。

优选的，所述引物为上游引物MF1和下游引物MR1，所述用于检测分枝杆菌属设计的探针为探针M3，用于检测结核分枝杆菌设计的探针为探针T3。

优选的，所述探针1的5’端标记HEX，探针2的5’端标记荧光物质FAM，探针1和探针2的3’端都是标记淬灭物质BHQ。

优选的，所述特异片段为16S rRNA和23S rRNA之间的插入序列(ITS序列)的变异区，所述16S rRNA和23S rRNA为分枝杆菌和非结核分枝杆菌按沉降系数分类的rRNA。

本发明提供的另一个技术方案为提供一种鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤：用权利要求1至4中任一项所述的鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒，对待测菌株的核酸进行荧光定量PCR扩增，检测所得到的PCR产物的荧光信号；如果同时检测到探针1和探针2的荧光信号，则待测菌为结核分枝杆菌；如果能检测到探针1的荧光信号，而不能检测到探针2的荧光信号，则待测菌为非结核分枝杆菌。

本发明的有益效果为利用了不同分枝杆菌的基因序列的差异来设计荧光探针，区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，利用双通道荧光定量的优点，能够一次性区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的荧光定量核酸检测技术，该技术是目前能同时区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测技术，检测时间短，从细菌的基因序列和分子结构水平来区分和鉴定，分类更准确，更可靠。解决了传统鉴定方法中通过细菌的生长形态来区分需耗时长达4-6周的问题。

附图说明

图1：10倍梯度稀释结核分枝杆菌核酸和其他阴性样本为模板进行扩增样本荧光定量PCR检测结果图；

图2：10倍梯度稀释至10000copies/mL的结核分枝杆菌样品和其它菌株样本进行检测结果图。

具体实施方式

细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5s、16s和23s rRNA。16srdna和23s rRNA是细菌染色体上编码16s rRNA和23s rRNA相对应的dna序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成。而16s rRNA和23s rRNA之间的插入序列(its序列)的变异区可以充分区分各种分枝杆菌，是进行分枝杆菌的菌种鉴定最理想的区域，可以用来鉴别结核分枝杆菌；同时保守区域又极端保守，能够识别分枝杆菌属，因此，我们的产品选取16s rRNA和23s rRNA之间的插入序列(its序列)作为我们的目的基因片段，根据保守区域和可变区域同时设计不同的探针来同时检测，用于鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。

根据分枝杆菌的16s rRNA和23s rRNA之间的插入序列所处的特殊位置，我们在探针的上游和下游分别设计引物，根据公知技术引物设计原则分别设计两条上游引物和两条下游引物，通过试验选取其中扩增效率最高的一对引物作为该专利技术使用引物。设计的两对引物如下：

引物名称	引物序列
		MF1	tgttgggtcctgaggcaaca
MR1	atgctcgcaaccactaccca
		MF2	cactgttgggtcctgaggca
MR2	ttgatgctcgcaaccactat

其中扩增效果最好的一对引物是：

引物名称	引物序列
		MF1	tgttgggtcctgaggcaaca
MR1	atgctcgcaaccactaccca

把这对引物作为该项目的优先引物对。

根据不同的分枝杆菌的16s rRNA和23s rRNA之间的插入序列的不同，经过大量的基因序列比对和筛选，我们对结核分枝杆菌和分枝杆菌分别设计了2-3条探针，从这些探针中分别选取一种效果最好的探针作为该结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的鉴别检测探针。设计的探针如下：

探针的优选方案将设计的三条分枝杆菌属探针和三条结核分枝杆菌探针按照自由组合的方式组合成9种探针的组合，组合形式如下：

	M1	M2	M3
				T1	T1+M1	T1+M2	T1+M3
T2	T2+M1	T2+M2	T2+M3
				T3	T3+M1	T3+M2	T3+M3

将这9种组合的探针分别配制成检测试剂，以确定的分枝杆菌菌株提取的dna作为模板，进行检测优选检测，优选出灵敏度最好，特异性最强的一组组合探针，最终确定为优选的探针组合形式(从分枝杆菌探针和结核分枝杆菌探针中各挑选一条探针组成探针组合，作为最优的探针组合，每个组合有2条探针)，具体的组合探针如下：

通过探针的筛选，不仅能够消除探针之间的交叉反应而且又能准确区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。

实施例1分枝杆菌提取试剂盒

准备好4％NaOH溶液、1.5mL无菌离心管及无菌吸头。收集临床痰样，加入等量的化痰试剂(4％的NaOH)，充分振荡化痰处理15～30分钟，直至痰液完全液化。(注：如果痰样很浓呈干酪状，则加入两倍量的化痰试剂。)

a、转移1.2mL痰样消化液到1.5mL离心管中，12000转/分钟，离心5分钟，弃上清。

b、加入1mL M洗液，充分混匀，12000转/分钟，离心2分钟，弃上清。

c、加入50μL M裂解液，充分混匀，于沸水中煮10分钟。

d、12000转/分钟，离心2分钟，上清液即可作为PCR模板。

实施例2

鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的试剂盒，包括上游引物MF1和下游引物MR1，用于检测分枝杆菌属设计的探针M3，用于检测结核分枝杆菌设计的探针T3。

引物名称	引物序列
		MF1	tgttgggtcctgaggcaaca
MR1	atgctcgcaaccactaccca

分枝杆菌	探针名称	探针序列
			分枝杆菌属	M3	aacaccacaccccaccaccaagg
结核分枝杆菌	T3	ttgttccaggtgttgtcccaccgc

所述探针M3的5’端标记HEX，探针2的5’端标记荧光物质FAM，探针1和探针T3的3’端都是标记淬灭物质BHQ。

试剂盒如下：

PCR反应液 750ul×1管；

阳性标准品

1.0×10⁷copies/ml 50ul×1管；

1.0×10⁶copies/ml 50ul×1管；

1.0×10⁵copies/ml 50ul×1管；

1.0×10⁴copies/ml 50ul×1管；

阴性标准品 50ul×1管；

适用仪器：BIO-RAD iCycler荧光PCR检测仪、AB Gene Amp 7500荧光PCR检测仪等。

1、扩增试剂准备(PCR前准备区)从试剂盒中取出PCR反应液，室温融化并振荡混匀后，2,000rpm离心10sec。

2、加样(样本处理区)

向所设定的n个反应管中分别加入分枝杆菌提取试剂盒提取的样本DNA、阳性标准品、阴性标准品各4ul，盖紧PCR反应管管盖，将反应管排好置于荧光PCR检测仪上，记录样本摆放顺序。

3、PCR扩增(检测区)

3.1.循环条件设置

荧光PCR检测仪循环程序设置如下：

50℃：2min；95℃：10min；

95℃：10sec，60℃：45sec，10个循环；

95℃：10sec，60℃：35sec，35个循环。反应体系为25ul。

3.2.仪器检测通道选择

本产品属于两重荧光检测，荧光信号收集时设定两个荧光，分别为Fam荧光素和HEX荧光素。荧光信号收集设在60℃。

4、结果分析条件设定

基线(baseline)的确定取6-15个循环的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值＝40.0为准。

5、本试剂盒质控标准

阴性标准品的Ct值均应等于40.0或无数值。阳性标准品的R2≥0.97，slop值在0.342～0.38之间。

6、根据阳性标准品的设定值来检测样本定量结果。

7、检测结果

请参阅图1，以10倍梯度稀释结核分枝杆菌核酸和其他阴性样本为模板进行扩增，检测结果见图1，结核分枝杆菌检测样本的两个荧光探针都有信号，并且同步；结核分枝杆菌核酸检测的Ct值均小于40，其他阴性样本的Ct值均无结果，符合试剂盒的标准，检测有效。

实施例3

用实施例2所述试剂盒对10倍梯度稀释的结核分枝杆菌标准品和其它菌株样本进行检测，标准品的浓度依次为1.0×10⁷copies/mL、为1.0×10⁶copies/mL、为1.0×10⁵copies/mL、为1.0×10⁴copies/mL，PCR扩增体系与PCR扩增条件与实施例2相同，检测结果见图2，标准品中两个荧光探针FAM和HEX都有同步的信号，标准品的R2＝0.993788，斜率slope＝0.3596，Ct值均小于40，符合试剂盒质控标准：阴性标准品的Ct值均应等于40.0或无数值，阳性标准品的R2≥0.97，slop值在0.342～0.38之间。

Claims

1.一种鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒，包括对待测菌株进行PCR扩增的引物和荧光定量检测的探针，其特征在于，所述引物为上游引物MF1和下游引物MR1或上游引物MF2和下游引物MR2，所述引物能与分枝杆菌的特异片段结合，所述用于检测分枝杆菌设计的探针1其序列为M1、M2、M3中的任意一个，用于检测结核分枝杆菌设计的探针2序列为T1、T2、T3中的任意一个，所述探针1和探针2的3’端带有淬灭物质，所述探针1和探针2的5’端的荧光物质不同，