CN102776275B - 一种用于结核杆菌目视检测引物组及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于结核杆菌目视检测引物组及其试剂盒，本发明的结核杆菌引物组及其试剂盒可直接目视检测结核杆菌基因组结果，可以用于从痰样中鉴别诊断结核分支杆菌。适应于临床结核样本的检测，为临床结核病患者的诊断提供辅助。

Description

一种用于结核杆菌目视检测引物组及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种生物检测试剂的研发，更具体涉及一种用于结核杆菌目视检测引物组及其试剂盒，属于分子生物学技术领域。。 

背景技术

结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一种慢性人畜共患病，能够感染人和多种哺乳动物以及禽类。其中导致人类感染的结核菌大多数是人结核分枝杆菌，也有10％以上是由牛分枝杆菌引起的。各个器官都可被侵犯，但以肺器官被侵染为多见。其病理特征是在多种组织器官中形成肉芽肿和干酪样、钙化结节病变。 

据世界卫生组织(WHO)报告，目前全球已有20亿人感染结核菌，现有活动性肺结核患者约2000万，每年新发病800-1000万，每年约有300万人死于结核病，每年死于结核病的成年人多于艾滋病，疟疾和热带病死亡人数的总和。据WHO估算，到2005年全球结核病新病例将达1020万例。全球90％的结核病在发展中国家，中国结核病患者数居世界第二，仅次于印度。结核杆菌不仅感染人，也感染许多动物(见表1)尤其是奶牛。这对以奶牛业为主的发达国家造成严重经济损失。尽管一些国家已有效地控制或消灭了此病，但在有些国家和地区仍呈地区性散发和流行。我国结核病疫情严重，且分布较广。 

表1各种不同结核杆菌对人和动物的致病性 

结核病既是一个公共卫生问题，也是一个社会经济问题，对人类的公共健康构成很大威胁。因此对其快速诊断检测就至关重要。目前结核病的诊断方法主要有细菌学检测法、X射线检测法、免疫学检测法、分子生物学检测法等。目前同类技术的状况如下： 

(1)结核杆菌的细菌学检测法又分为痰涂片检测和痰结核菌培养检测。 

①痰涂片检测。优点：检查简便易行，准确性较高，痰中查出结核菌，就能确诊患了结核病。缺点：阳性率低。 

②痰结核菌培养检测。优点：结果可信度高，并能做结核菌药敏试验。缺点：耗时长，一般需耗时6-8周，应用受到限制。 

(2)X线检测法 

X线检测法的优点：可以早期发现结核病并确定病灶的部位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受。缺点是较小的或隐蔽部位的病变较难发现，需要做胸部CT，弥补一般 X线检查的不足。 

(3)结核杆菌的免疫学检测法 

①结核菌素皮内检测法(Tuberculin skin test，TST)。TST是世界动物卫生组织(OIE)迄今为止唯一推荐的牛结核病的检测方法。该方法主要是用结核菌素、纯化蛋白衍生物(Purified Protein derivatives，PPD)对牛进行皮内接种，于72h-96h后观察接种部位皮肤的肿胀程度，以确诊牛结核病。该方法曾经在牛结核病的诊断与防治过程中发挥了重要作用，英国和欧共体的诸多国家就是利用该方法消灭和控制了牛结核病。该方法存在很多不足：由于纯化蛋白衍生物(PPD)皮肤试验个体差异较大，注射剂量和纯化蛋白衍生物(PPD)批号对牛个体反应均有差异，会呈现不同的皮肤反应，其结果以皮肤厚度的增加数为准，易造成人为误差，操作烦琐，费时费力，缺乏严格性。结核菌素试验阳性仅能表明在过去某一时间曾经发生过的一次结核菌感染，它无法证明目前的结核菌感染是否为活动的，或仅为在机体的某处有活的结核菌存在。当动物发生某些细菌或病毒的感染时，或者使用某些药物治疗及一些不明原因，也可能造成假阳性或假阴性结果。部分研究者还发现，该法存在着极强的非特异性，即在相当数量的结核菌素试验阳性牛中，既找不出特征病变，又不能分离出结核菌，或仅仅分离出非典型的分枝杆菌，重复检疫时阳性率下降，而且妊娠母牛和细胞免疫反应低下的重症患牛检出率均很低，使得该方法已成为基层检疫中捕杀政策难以执行及奶牛场难以净化的直接原因。鉴于以上不足，因此有必要开展其他的辅助诊断，以更准确地判断结核病的感染情况。 

②血清学检测方法。主要是检测血清内的结核菌抗体。目前，报道最多的血清学检测方法主要有胶体金法、γ干扰素(gammainierferon-γ，IFN-γ)法、ELISA法等。(I).胶体金法。该技术的优点是简便快速、特异性强、敏感性高、肉眼判读、实验结果易保存、无需特殊仪器设备和试剂等，被广泛应用在兽医临床疾病诊断和检验检疫中。缺点是该技术在 动物医学临床诊断方面的应用起步较晚，最近几年才有报道，作为临床诊断试剂盒开发应用的还很少。(II).IFN-γ检测法。该方法的优点是敏感性和特异性较高，能鉴别出早期感染牛分枝杆菌的牛，降低了传染的风险。IFN-γ检测法的不足是成本高，采血后8h内必须进行检测，检测过程复杂，且对样品的要求也高，不适于基层使用。另外，IFN-γ方法在健康牛场中的低特异性限制了该方法在这些区域的应用。(III).酶联免疫吸附试验(ELISA)法。该法检测牛结核病，目前在许多国家己得到应用。该方法优点是简单、方便、特异性敏感性较高。该方法存在的不足之处是结核杆菌的抗原性较弱，且属间和种间共同抗原决定簇的存在及体液免疫与结核病的相关性未得到充分的阐明，致使ELISA这一血清学检测技术难以取得实质性的进展。 

(4)结核杆菌的分子生物学检测法 

①生物芯片检测技术。该技术又称DNA芯片、基因芯片，指将大量序列已知的寡聚核苷酸探针分子固定于玻璃片、硅片、硝酸纤维素膜等支持物后，与待检标本中标记的DNA或RNA进行分子杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和序列信息。基因芯片技术的优点是信息量大、高通量及快速、准确地分析基因，在结核分枝杆菌菌种鉴定、耐药性监测、基因组比较分析等方面发挥着重要的作用，该技术缺点是由于仪器昂贵和制备芯片成本偏高等因素限制了其在临床诊断中的广泛应用。②DNA探针技术。由于DNA探针的灵敏度低，当标本中细菌数较少时难以检出，限制了其临床应用。因此，将灵敏度高的PCR技术与特异性强的DNA探针技术有机结合，将成为结核病诊断的发展趋势。 

③结核杆菌DNA扩增法(PCR法)。PCR技术的优点是它一种快速、灵敏、特异的基因检测方法，特别适用于因排菌量少或因结核杆菌发生L型变异，常规细菌学方法不易诊断的患者、鉴别诊断及化疗后排菌情况的观察，标本不需要预培养，有很高的临床诊断价值。常规PCR的不足之处 是扩增的产物电泳时，易引起交叉污染，再加上非特异性扩增、引物二聚体形成等，易使检测结果出现假阳性。虽然PCR技术有很多好处，但是目前该方法仍缺少权威性的诊断试剂盒，存在的主要问题是扩增时气溶胶污染导致的假阳性、标本中PCR抑制物导致的假阴性，因而此技术还有待进一步完善、优化。 

④实时荧光定量PCR技术。与传统PCR相比较，实时荧光定量PCR技术的优点是具有引物和探针的双重特异性，因此在检测结核分枝杆菌的特异性方面有很大的提高。由于荧光探针的使用相当于在PCR过程中自动完成了Southern印迹杂交，因此进一步提高了目的基因检测的特异性。该技术的缺点是由于其灵敏性高、实验操作易受污染等而容易出现假阳性。且只要有微量病原体存在，PCR扩增即可为阳性结果，故并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义。 

⑤环介导等温扩增技术(LAMP)。是一种新的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术，与其他分子生物学技术相比，LAMP技术具有以下优点：(1)灵敏性高，能从微量的拷贝中扩增出目的基因，比传统PCR高出10-1000倍，具有与实时荧光Taqman探针PCR同样的敏感性。(2)特异性好，由于LAMP通过2对引物与靶序列上的6个特异部位准确结合来产生扩增效应，因此能获得比PCR更高的特异性，这对特异性要求高的样品检测来说非常重要。(3)简便，由于LAMP是在等温条件下进行的扩增，因此其在进行病原体检测时只需要维持等温的水浴锅或者是其他等温设备即可，不需要PCR仪等昂贵的仪器设备。(4)快速，检测通常只需要30-60min就可以判定结果。(5)结果易于判定，不需要对产物进行电泳，而直接用肉眼观察扩增管浊度或通过向其扩增产物中添加荧光染料通过颜色变化来判定结果。(6)与反转录结合可以对RNA分子进行有效的扩增。缺点：该方法最大的缺点就是容易出现假阳性，由于LAMP采用了多条引物，而且是在同一温度条件下扩增，引物之间有可能互补而扩增出非特异性的条带，造成假阳 性。 

总之，LAMP和RT-LAMP以其灵敏度高、特异性强、速度快和操作简单等特点而倍受人们青睐，已日益广泛地应用于各种样品中DNA和RNA的检测以及转基因植物的检测。LAMP技术凭借其操作简单、所需模板量少、特异性强以及可以快速获得大量特异性扩增产物等优点将成为核酸研究的重要工具，在卫生防疫检验和食品检测方面有广阔的应用前景。 

发明内容

本发明针对现有环介导等温扩增(LAMP)法对痰样本中的结核分枝杆菌进行检测时遇到的污染、假阳性等不足之处，为了克服不足之处，本发明采用如下的技术方案： 

本发明一方面涉及用于结核杆菌目视检测引物组，序列包括： 

本发明还涉及将上述用于结核杆菌目视检测引物组制成试剂盒，引物组，dNTPs，Bst DNA聚合酶，SYBR Green I染料等。 

采用结核杆菌目视检测试剂盒进行样本检测。本发明的结核菌引物组及其检测试剂盒可直接目视检测结核杆菌基因组结果，可以用于从痰样中鉴别诊断结核分支杆菌。适应于临床结核样本的检测，为临床结核病患者的诊断提供辅助。 

附图说明

图1：fadB4特异性检测琼脂糖凝胶电泳结果：A为LAMP扩增结果，B为常规PCR扩增结果。1：人结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；2：牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)；3：禽分枝杆菌(Mycobacterium anvim)；4：大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)，大肠杆菌(Escherichia coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)混合物；5：根瘤菌(Rhizobium meliloti)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，单核细胞李斯特(氏)菌(Listera monocytogenes)混合物；6：布鲁氏菌S2308(Brucella abortus S2308)，布鲁氏菌S19(Brucella abortus S19)，布鲁氏菌RB51(Brucella abortus RB51)，布鲁氏菌M5(Brucella melitensis M5)，布鲁氏菌(Brucella ovis)，布鲁氏菌S2(Brucella suis S2)混合物；7：龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)，类结核杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)，鸡瘟沙门(氏)菌(Salmonella pullorum)，肠炎沙门(氏)菌(Salmonella enteritidis)混合物；8：空白对照；M：DL 1000 DNA Marker； 

图2：fadB4特异性检测SYRB-GreenI染色肉眼目视观察结果：1：人结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；2：牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)；3：禽分枝杆菌(Mycobacterium anvim)；4：大肠杆菌O157:H7(Escherichia coliO157:H7)，大肠杆菌(Escherichia coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)混合物；5：根瘤菌(Rhizobium meliloti)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，单核细胞李斯特(氏)菌(Listera monocytogenes)混合物；6：布鲁氏菌S2308(Brucella abortus S2308)，布鲁氏菌S19(Brucella abortus S19)，布鲁氏菌RB51(Brucella abortus RB51)，布鲁氏菌M5(Brucella melitensis M5)，布鲁氏菌(Brucella ovis)，布鲁氏菌S2(Brucella suisS2)混合物；7：龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)，类结核杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)，，鸡瘟沙门(氏)菌(Salmonella pullorum)，肠炎沙门(氏)菌(Salmonella enteritidis)混合物；8：空白；M：DL 1000 DNA Marker； 

图3：LAMP(A)和常规PCR(B)灵敏性的检测：1-11：模板10⁰-10¹⁰稀释；12：空白；M：100bp DNA Ladder； 

图4：LAMP引物F3/B3扩增产物用限制性内切酶AccIII消化结果：M：DL1000 DNA Marker；1：阳性对照(F3/B3扩增产物)；2：AccIII酶切结果。 

具体实施方式

本发明经过深入而广泛的研究，研发了一种结核杆菌检测试剂盒，此试剂盒在LAMP原理的基础上克服了污染、假阳性等问题。采用上述检测试剂盒时，可以用于鉴别诊断结核分支杆菌。适应于临床结核样本的检测，为临床结核病患者的诊断提供辅助。在此基础上完成本发明。 

本发明所使用的材料有：人结核分枝杆菌，牛分枝杆菌，禽分枝杆菌，大肠杆菌O157:H7，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，根瘤菌，枯草芽孢杆菌，单核细胞李斯特(氏)菌，布鲁氏菌S2308，布鲁氏菌S19，布鲁氏菌RB51，布鲁氏菌M5，羊种布鲁氏菌，布鲁氏菌S2，龟分枝杆菌，类结核杆菌，鸡瘟沙门(氏)菌，肠炎沙门(氏)菌；75份结核病人的痰样。 

本发明所使用的主要仪器和试剂有：HW-8C型微量恒温器，Bst DNA聚合酶，SYRB-Green I，100bpDNA Ladder，Taq DNA酶，呼吸道样本DNA提取试剂盒。限制性内切酶Acc III。 

上述两项为本发明的发展提供了实验材料和实验器材。 

本发明选用的结核杆菌特征性基因为fadB4，并使用PrimerExplorerIV软件设计特征性引物，引物由上海生工合成。 

实施例1结核杆菌基因及其引物(表2)，引物的特异性检测结果见表3。 

表2 LAMP扩增所需引物和序列位置 

表3 fadB4引物特异性的检测 

实施例2LAMP检测方法的建立。 

LAMP反应体系(25μL体系)：FIP和BIP各0.8μmol/L，F3和B3各0.2μmol/L，dNTPs 1.6mmol/L、10×Bst DNA Polymerase Buffer 2.5μL、Bst DNA Polymerase 8U，最后加双蒸水(ddH₂O)至25μL。盖好管盖，弹击管壁混匀，移至制备好的模板中，混匀；将混匀后的离心管放入HW-8C型微量恒温器中，反应条件设为：反应温度为63.5℃(优化值)，反应时间为50分钟(优化值)，上述步骤结束后，取出离心管放入另一温度为85℃条件加热2分钟终止反应。每个离心管中加入100×稀释的SYBR Green I染料0.5-1μL，变绿为阳性，棕色为阴性；取5μL LAMP扩增产物经浓度为2.0％琼脂糖凝胶电泳，LAMP产物的电泳图谱呈特征性梯状条带。阳性扩增反应产物经琼脂糖电泳，均出现了预期的阶梯式条带效果(图1)。 

实施例3LAMP扩增反应的特异性检测。 

以人结核分枝杆菌，牛分枝杆菌，禽分枝杆菌，大肠杆菌O157:H7，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，根瘤菌，枯草芽孢杆菌，单核细胞李斯特(氏)菌，布鲁氏菌S2308，布鲁氏菌S19，布鲁氏菌RB51，布鲁氏菌M5，羊种布鲁氏菌，布鲁氏菌S2，龟分枝杆菌，类结核杆菌，鸡瘟沙门(氏)菌，肠炎沙门(氏)菌为模板，对已建立的LAMP方法的特异性进行检测。结果人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌基因组为阳性，其他菌株为阴性结果。对LAMP扩增产物进行了SYBR-GreenI染色，阳性扩增反应产物均由橙色变为绿色，阴性反应产物均仍为橙色效果(图2)。 

实施例4LAMP扩增反应的敏感性检测。 

以本室构建好的fadB4重组质粒为模板，并对该模板进行10倍梯度稀释：10⁰-10¹⁰，测出相应的OD值，换算各浓度稀释液中质粒的个数，然后进行LAMP方法检测，确定该检测方法能检测到的最低浓度，以检测该方法的敏感度。进行3次重复试验。采用LAMP进行检测时，质粒浓度稀释倍数为10⁷的模板仍可以扩增得到阶梯式的目标条带，而常规PCR在质粒稀释倍数为10⁵可隐约看见条带，比LAMP低了两个数量级。根据不同浓度的质粒的OD值换算质粒数，对不同稀释浓度的质粒数取平均值，结果发现3个重复实验的最大数值是7拷贝/反应，因此可以估算本实验建立的检测痰样本结核分枝杆菌LAMP方法可以检测到7拷贝/反应的效果(图3)。 

实施例5LAMP的扩增产物的酶切鉴定及目标序列测序。 

选用AccIII限制性内切酶，分别对fadB4基因的LAMP扩增产物进行酶切鉴定。10μL的酶切体系包括：8μL的LAMP扩增产物、1μL的限制性内切酶、1μL的10×Buffer。酶切后取kμL用2％琼脂糖凝胶电泳检测。LAMP引物F3/B3扩增产物用限制性内切酶酶切效果(图4)，AccIII可消化fad B4，得到118bp和72bp的片段)。 

实施例6LAMP扩增反应的临床样本符合率(即准确率)检测。 

制作试剂盒，从某医院传染科收集75份痰液样本(含非结核病患者痰液及结核病患者痰液，使用酸性罗氏培养法进行鉴定)，痰标本中加入3～5倍体积分数为2.0％N-acety-L-cysteine-NaOH，振荡混匀孵育15分钟，之后加入0.067mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)至总体积40mL，以3000转/分钟离心15分钟，弃掉上清液，留下沉淀。使用呼吸道样本DNA提取试剂盒提取痰液中的DNA。DNA提取物用本试剂盒中引物组进行LAMP法检测；同时DNA提取物也用F3/B3引物进行常规PCR实验。另外，将痰样接种酸性罗氏鉴别培养基进行细菌培养。经分析，LAMP检测方法与细菌培养的符合率为94.44％，与常规PCR检测结果的符合率为100％(表4)。 

表4.LAMP扩增反应临床样本符合车的检测结果 

应当理解的是，上述具体实施方式仅是例举性说明，而不是对本发明的限制，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 

Claims (3)

1.用于结核杆菌目视检测引物组，引物针对结核分支杆菌的FadB4基因设计，共包括4条，引物序列如下： 

。

2.包含权利要求1所述的用于结核杆菌目视检测引物组的试剂盒，所述试剂盒中任选包括，dNTPs，Bst DNA聚合酶，SYBR Green I染料。 

3.权利要求2所述的试剂盒在食品检测中的应用。