CN101191145B - 一种高效检测临床样品中结核分支杆菌复合体的方法 - Google Patents

Abstract

痰是结核临床检测的主要样品，但目前使用的痰处理方法在处理过程中不同程度地杀死分支杆菌，造成结核分支杆菌检出率严重下降。本发明首先提供一种快速、有效液化痰的方法，其特征在于操作步骤简单、液化效果好，其优势是液化过程对痰内分支杆菌无杀死作用。本发明并且提供一种灵敏度高、特异性强的结核分支杆菌复合体核酸的检测方法，根据结核分支杆菌复合体Ag85B基因序列设计特异性引物和Taqman荧光探针，通过荧光PCR扩增方法检测Ag85B基因的特异性扩增产物，从而检测结核分支杆菌复合体。本发明由上述两项相对独立又相互关联的发明所贯彻实施，提供一种高效、快速、灵敏度高、特异性强的检测临床样品中结核分支杆菌复合体的方法。

Description

一种高效检测临床样品中结核分支杆菌复合体的方法

技术领域

本发明涉及临床微生物核酸诊断技术领域，具体涉及一种灵敏度高、特异性强、高效检测临床样品中结核分支杆菌核酸的技术，该技术还包括一种快速、高效液化痰的方法，而且液化过程对痰内分支杆菌无杀死作用。

背景技术

分支杆菌科只包括分支杆菌一个属，按是否引起人和多种哺乳动物的结核病来区分，分支杆菌属又分为结核分支杆复合体(mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)和非结核分支杆菌(nontuberculosismycobacterium，NTM)；结核分支杆菌复合体包括结核分支杆菌(M.tuberculosis，MTB)、牛分支杆菌(M.bovis)、非洲分支杆菌(M.africanum)和田鼠分支杆菌(M.micoti)，结核分支杆菌和牛分支杆菌是引起人结核病的病原，非洲分支杆菌是引起非洲热带国家人结核病的病原。结核分支杆菌可存在于结核患者咳出的雾滴中，其大小为1～5μm，当易感人群吸入该颗粒并进入呼吸道末梢时可引起感染。在肺泡内结核分支杆菌可被巨噬细胞吞噬并向全身扩散，通常宿主细胞介导的免疫反应限制了结核分支杆菌的增殖与扩散。但有些结核分支杆菌在感染很多年内可保持休眠状态。隐性感染结核分支杆菌的患者(即潜伏期感染患者)，通常纯蛋白衍生物(PPD)皮肤试验阳性，但无症状和无传染性。通常隐性感染结核的患者有10％的可能转化为活动性结核。

据中国疾病预防控制中心统计，2005年全国报告肺结核发病1259308人，死亡6713人，发病数和死亡数均居全国法定报告甲、乙、丙类传染病发病数、死亡数第一位；而2004年肺结核发病970279人，死亡1435人，2005年与2004年相比，发病率增长29.03％。由以上统计数字看，我国肺结核病的防治工作仍然任重而道远。

从全球范围来看，世界上有三分之一的人口感染了潜伏性结核病，并面临发展为活动性结核病的危险。在许多国家，艾滋病毒加快了结核病流行，同时多药耐药性也日益成为一大威胁。每年有170万人死于结核病，其中许多死亡的原因是感染未能得到诊断或确诊太晚以至于无法治愈。每年患活动性结核病的估计有900万人，其中大多数仍未得到实验室确认的诊断。每年采用最普遍的检测方法——痰涂片显微镜检查诊断和报告的结核病病例仅为大约220万例。其它病例是通过一种往往效率低、有时还耗费资金的综合方法来诊断，即肺部X线影像、细菌培养和推测。

因此，2006年10月25日，在日内瓦由热带病研究与培训特别规划(TDR)和促进创新诊断方法基金会发布的新报告《结核病诊断方法：全球需求和市场潜力》，其主要结论为：“在改进结核病检测方面存在着一个相当大的尚未开发的全球市场，可供低收入和中等收入国家诊断结核病开展更为有效和更可负担得起的检测。今天大多数结核病例发生在这些国家。”

该报告认为，就目前所使用的诊断技术而言，在全世界结核病患者或生活在结核病高危地区的人当中，大多数人都很难获得迅速而准确的检测。这是因为：

第一，痰作为肺结核临床检测的主要标本，其液化方法至今没有很好解决，因而结核分支杆菌核酸扩增检测技术和分离培养难以诊断潜伏期感染患者。临床上普遍使用的NaOH、NaOH-NALC、油酸、硫酸等方法虽然可以有效液化痰，但都很大程度(20～90％)地杀死痰样品中的结核分支杆菌。临床上涂片检查要求每毫升痰液中杆菌的量至少为5×10³～1×10⁴，而分离培养要求10～100个杆菌，对于潜伏期结核分支杆菌感染患者每毫升痰液中杆菌的量一般在1×10³以下，涂片检查显然不适用，而痰经过液化之后损失大部分乃至全部的结核分支杆菌，造成核酸扩增和分离培养难以诊断潜伏期感染患者。而报告《结核病诊断方法：全球需求和市场潜力》指出，全球每年有2.04亿人次需要作潜伏期感染检测。

第二，痰涂片检查、X线影像、培养检测可能没有准确地查明活动性结核病，尤其是艾滋病毒阳性患者。呼吸道和消化道是分支杆菌传染人的主要途径，结核临床检测标本包括痰、支气管肺泡灌洗液和支气管冲洗液、胃冲洗液、血、尿、粪、体液、组织等标本，艾滋病毒阳性患者通过消化道、血液等途径感染分支杆菌之后显然不能通过上述方法检出杆菌。

第三，痰涂片检查、X线影像、培养检测可能无法严格区分潜伏性和活动性结核病，以及疾病对药物的敏感性和耐药性。

因此，以痰样品为例，准确、迅速诊断结核首先需要一种快速、有效液化痰而且液化过程对痰内分支杆菌无杀死作用的方法，再结合灵敏度高、特异性好、快速的检测技术以达到此目的。核酸扩增技术(NucleicAcid Amplification，NAA)就是这样一类检测技术，具体包括聚合酶链式反应(PCR)、核酸序列依赖性扩增(NucleicAcid Sequence-Based Amplification，NASBA)、连接酶链式反应(Ligase Chain Reaction，LCR)等，这类检测技术可以在临床标本中直接检测和鉴定分支杆菌，避免进行长时间的培养。

近年来，临床检测单位逐渐广泛的使用一种荧光PCR扩增检测病原体核酸的技术，尤其在乙肝病毒检测领域。基于Taqman技术的荧光PCR技术关键是在普通PCR的一对特异性引物基础上增加了一条特异性的荧光双标记探针，该探针同样与病原体核酸特异性结合，具体设计为与病原体核酸双链DNA的正义链或反义链互补结合，而且结合部位位于引物结合区域的中间，探针5’端常标记FAM荧光素，是荧光报告基团，3’端常标记TAMRA荧光素，是荧光淬灭基团；当PCR反应进行到延伸阶段时，耐热DNA聚合酶同时引导与模板DNA正义链和反义链互补结合的引物从5’→3’方向延伸，聚合酶具有的5→3外切酶活性切断已结合到正义链或反义链某一条链上的Taqman探针，消除3’端荧光淬灭基团对5’端荧光报告基团的淬灭作用从而发出荧光，检测系统通过检测荧光可推测PCR产物数量。因为理论上扩增反应的每次延伸阶段，结合到双链扩增产物一条单链上的探针数量与起始扩增产物数量相等，而探针断裂发光之后扩增产物数量已经扩增为原来的两倍，因此荧光信号强弱与PCR产物的数量呈正比。该方法的灵敏度和特异性已被广泛承认。

核酸扩增检测商业化产品英文名为CDAT(commercial direct amplification test)，目前通过美国FDA认证的结核CDAT产品只有Roche公司的AMPLICOR M.TUBERCULOSIS和Gen-Probe公司的AmplifiedM.tuberculosis Direct(AMTD2)，两个产品的检测靶序列分别是结核分支杆菌16s rRNA基因和16s rRNA。

AMPLICOR采用PCR核酸扩增检测技术，扩增分支杆菌种共有的16s rRNA基因584bp片段，扩增产物通过结核分支杆菌复合群特异性的探针鉴别；其检测灵敏度(在所有种类的呼吸道样本)与病人标本中结核分支杆菌的含量和分布呈强相关，在肺以外的样本和涂片阴性的样本检测灵敏度低。因此AMPLICOR被FDA认证为只可检测涂片阳性标本。而Gen-Probe AMTD2采用NASBA等温核酸扩增检测技术，是等温转录调节的扩增反应，RNA扩增产物通过吖啶酯标记的结核分支杆菌复合群特异性DNA探针的核酸保护实验鉴定。16s rRNA在细胞内的拷贝数约为1000～10000copies/cell，因此AMTD2检测灵敏度极高，被FDA认证为可检测涂片阳性和涂片阴性标本；其主要缺点是没有设置内标，不能进行扩增反应抑制的检测。同时上述两种产品价格昂贵，所使用的液化方法是NaOH-NALC方法，该方法在一定程度上杀死痰样品中的结核分支杆菌，因此难以检测潜伏期感染患者痰中的结核分支杆菌。

美国CDC2000年更新的开放性TB的诊断标准是：采集病人不同三天的痰样本用于AFB镜检和培养。如果AFB涂片阴性，CDAT(商业化核酸扩增检测)在第一次标本收集时即进行，否则用于检测涂片阳性的样本。如果涂片阳性而CDAT检测阴性，需要检测扩增反应抑制物。如果至少连续两次的涂片阳性，CDAT阴性而且不存在抑制物，则假设病人是非结核分支杆菌感染。如果样本检测结果是涂片阴性而CDAT阳性，而且第二份样本的检查结果也是如此，病人可假定为TB患者。最后，如果连续两次样本的检测结果，CDAT和涂片都是阴性，病人可假定为开放性TB排除，而最终的排除要依靠临床观察判断。

根据以上标准，潜伏期结核感染患者如果CDAT(商业化核酸扩增检测)两次检测结果阳性可假定为TB患者。痰是结核检测的主要样品，痰液化方法解决以后将极大地提高潜伏期结核感染患者的检出率，从而早期发现和早期治疗结核病，有利于结核病的防控工作。今天大多数结核病例发生在低收入和中等收入国家，诊断结核病要求更为有效和更可负担得起的检测，因此商业化核酸扩增检测要求价格适中；由于我国的基于Taqman技术的荧光PCR检测试剂产业已经发展到一定阶段，因此可以开发价格适中的检测试剂。

因此，本领域迫切需要开发一种有效液化痰且不杀死痰内分支杆菌的方法，结合灵敏度高、特异性好、价格适中的核酸扩增检测技术，用于快速、准确地检测临床样品中的结核分支杆菌。

发明内容

本发明目的就是提供一种快速准确检测临床样品中结核分支杆菌复合体的技术。

在本发明的第一方面提供了一种快速、高效液化痰的方法，根据该方法配制的液化试剂适用于结核病等呼吸道疾病的痰样品前处理，它包括步骤：在临床检测的痰样品中直接添加1～5倍体积的液化试剂，旋涡振荡器上振荡混匀30s～1min，室温静置15～20min，3000g～4000g离心15min，弃上清，沉淀用于下一步的核酸提取。

在另一优选例中，痰样品用所述的液化方法液化，在室温静置15～20min以后如果样品溶液中仍有粘稠的痰，则重复“旋涡振荡器上振荡混匀30s～1min，室温静置15～20min”的步骤，直到样品溶液呈现底部黄色碎片状沉淀而上部澄清，则继续进行离心步骤。

在另一优选例中，所述的液化方法提供一种液化试剂，其成分选自下组：0.5～1％的西吡氯铵，10～40％Na₃PO₄，0.1～5％的NALC，5～500mg/ml的溶菌酶，0.01～5％的DTT，5～500mg/ml的蛋白酶K，1～40％的NaCl，1～10％柠檬酸三钠，0.001～1％NaN₃以及它们的混合物。

在本发明的第二方面提供一种结核分支杆菌复合体核酸检测方法，该方法采用荧光PCR扩增检测方法，包括步骤：样品DNA提取和荧光PCR扩增检测。在特异性扩增条件下，在荧光PCR反应体系中进行PCR反应和实时荧光检测，检测的荧光信号强弱与PCR产物的数量呈正比，反应结束以后通过设定荧光阈值来判定扩增产物是否存在，所述的反应体系中含有特异性扩增结核分支杆菌复合体核酸的引物对，还含有结核分支杆菌复合体特异性荧光探针。

在另一优选例中，提供一种检测结核分支杆菌复合体的遗传标记物，它具有SEQ ID NO：1中连续的80～300个核苷酸。

在另一优选例中，所述的特异性扩增结核分支杆菌复合体的引物对，引物1序列与SEQ ID NO：1所示的序列相同，引物2与SEQ ID NO：1所示的序列互补，引物序列选自下组：

引物1：5’-CTA CGC AGC AGA TCC CCA-3’，SEQ ID NO：2

引物2：5’-GCA CCG CCC AAC TCG TT-3’SEQ ID NO：3

在另一优选例中，所述的结核分支杆菌复合体特异性荧光探针具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的结核分支杆菌复合体特异性荧光探针是Taqman探针，并且可发出不同波长荧光。

在另一优选例中，所述的结核分支杆菌复合体核酸检测方法灵敏度高，以中国药品与生物制品检定所提供的结核分支杆菌灵敏度标准品经过DNA提取之后检测，灵敏度达到10个菌/ml(图1)；特异性强，以中国药品与生物制品检定所提供的肺炎球菌、布氏杆菌及鸟分支杆菌等十三种非结核分支杆菌样品经过DNA提取之后检测，结果全部是阴性，无荧光扩增曲线(图2)。

在本发明的第三方面，将上述两项相对独立又相互关联的发明所贯彻实施，提供一种临床样品结核分支杆菌复合体核酸的检测方法，该方法包括步骤：

(1)痰样品液化；

(2)样品DNA提取；

(3)以抽提的DNA为模板，在荧光PCR扩增反应液中加入所述的特异性扩增结核分支杆菌复合体的引物对和所述的结核分支杆菌复合体特异性荧光探针，进行荧光PCR扩增反应；

(4)结果分析，反应结束以后通过设定荧光阈值来判定扩增产物是否存在，存在扩增产物就表示样品中存在结核分支杆菌复合体。

在另一优选例中，含相同数量卡介苗分支杆菌的两份卡介苗梯度稀释菌液，一份不经过痰液化步骤直接用所述临床样品结核分支杆菌复合体核酸的检测方法检测，一份添加到非结核病人的浓痰样品中作为模拟临床样品用所述临床样品结核分支杆菌复合体核酸的检测方法检测，荧光PCR扩增结果显示两份样品的C_t值相差小于1，表明虽然经过痰液化步骤但是痰样品中DNA没有损失(图3)

附图说明

图1所述结核分支杆菌复合体核酸检测方法灵敏度检测结果

图2所述结核分支杆菌复合体核酸检测方法特异性检测结果

图3所述临床样品结核分支杆菌复合体核酸的检测方法检测卡介苗菌液与卡介苗模拟临床样品，检测结果对照

实施方式

本发明人经过大量临床试验，发现临床普遍使用的NaOH、NaOH-NALC、油酸、硫酸等痰液化方法不同程度地引起痰中分支杆菌损失，以上方法都具有酸碱度过高的特点，因此本发明的液化方法思路从pH值中性而且可分解痰中粘蛋白的物质入手，选定西吡氯铵，NALC，Na₃PO₄，溶菌酶，DTT，蛋白酶K，NaCl，柠檬酸三钠，NaN₃作为液化试剂成分，经过广泛而深入的研究，摸索上述成分的最佳浓度及反应条件，最终建立快速、有效液化痰的方法，并且该方法操作步骤简单，与目前临床使用的NaOH-NALC方法一致，最关键的是经实验证明，该液化方法不会引起痰中分支杆菌损失。

分支杆菌分泌抗原Ag85B基因编码分支杆菌分泌抗原Ag85B，该蛋白参与分支菌酸的生物合成，在液体培养基生长的和巨噬细胞生长的结核分支杆菌细胞中都丰富表达，而且在体内也表达，主要是肺结核病人显示出对此蛋白极强的抗体反应。本发明人经过对结核分支杆菌和非结核分支杆菌的基因序列广泛而深入的研究，认为分支杆菌的Ag85B基因特别适合作为检测结核分支杆菌复合体的序列，针对该序列设计的探针只检测结核分支杆菌复合体。这样，在单管PCR反应中通过检测荧光扩增曲线可快速简便地鉴定结核分支杆菌复合体，而非结核分支杆菌及其他病原体无荧光扩增曲线。

本文所用术语“结核分支杆菌复合体特异性荧光探针”指能够结合于分支杆菌属结核分支杆菌复合体的扩增产物，但不结合于非结核分支杆菌等其它分支杆菌属细菌或其它属细菌的扩增产物的荧光探针。术语“结核分支杆菌复合体核酸检测方法”指能够检测各种细菌培养物等简单样品的结核分支杆菌复合体检测方法，该检测方法特征在于其步骤包括DNA提取和荧光PCR扩增检测。术语“临床样品结核分支杆菌复合体核酸的检测方法”指能够检测各种临床样品的结核分支杆菌复合体检测方法，临床样品包括痰、支气管肺泡灌洗液和支气管冲洗液、胃冲洗液、血、尿、粪、体液、组织等，该检测方法特征在于除DNA提取、荧光PCR扩增检测之外，还包括临床结核痰样品的前处理方法，以便于高效率收集、浓缩、保护分支杆菌核酸。由于除痰以外的其他临床样品其前处理可借鉴成熟方法，因此本发明的核酸扩增检测方法同样可以灵敏、特异地检测此类样品。

本发明方法能检测并鉴定分支杆菌属结核分支杆菌复合体，该复合体包括结核分支杆菌、牛分支杆菌、田鼠分支杆菌和非洲分支杆菌。

本发明优选的扩增区域为分支杆菌Ag85B基因序列，不同种的分支杆菌在该区域的核苷酸序列存在区别，可用于它们的分类。根据本发明指导，本领域技术人员能够配制痰液化试剂，并设计和合成引物及结核分支杆菌复合体特异性荧光探针，用于临床样品结核分支杆菌复合体核酸的实时荧光PCR扩增检测等检测技术。

在本发明中，除痰样品的处理方法及检测所针对的靶序列与现有技术不同之外，诸如从样品抽提DNA、引物的标记、荧光PCR扩增和检测等步骤的条件都与现有技术相同，本领域技术人员完全可以用常规条件进行上述各种步骤。

在本发明的优选实施例中，实时荧光PCR扩增结果表明，结核分支杆菌复合体特异性探针的荧光信号，仅在结核分支杆菌复合体标本表现阳性，而在非结核分支杆菌标本均表现为阴性，这表明该探针有效而特异。另一优选实施例中，临床样品结核分支杆菌复合体核酸的检测方法检测含相同数量卡介苗分支杆菌的两份卡介苗梯度稀释菌液，一份为卡介苗梯度稀释菌液不经过痰液化步骤直接检测，一份添加到非结核病人的浓痰样品中作为模拟临床样品检测，荧光PCR扩增结果显示两份样品的C_t值相差小于1，表明虽然经过痰液化步骤但是痰样品中结核分支杆菌DNA没有损失。

本发明主要特点在于：

可简便快速地检测和鉴定结核分支杆菌复合体。

所使用的痰样品液化方法对结核分支杆菌复合体DNA无破坏作用，操作简单、快速，易被临床接受。

基于分支杆菌Ag85B基因设计的引物对可有效地特异性扩增，而结核分支杆菌复合体特异性荧光探针则特异性检测结核分支杆菌。

有效的痰液化技术结合灵敏度高、特异性强的核酸检测技术，可高效、快速检测潜伏期结核感染病人，达到早期诊断的目的。

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1菌株来源

本研究中的涉及的非分支杆菌属细菌包括：肺炎球菌(pneumococcus)、布氏杆菌(brucella)，分支杆菌属细菌包括：戈登分支杆菌(M.gordonae)、瘰疬分支杆菌(M.marinum)、蟾蜍分支杆菌(M.xenopi)、堪萨斯分支杆菌(M.kansasii)、鸟分支杆菌(M.avium)、胞内分支杆菌(M.intracellulare)、偶发分支杆菌(M.fortuitum)、猿分支杆菌(M.simiae)、土分支杆菌(M.terrae)、草分支杆菌(M.phlei)、结核分支杆菌(M.tuberculosis)、脓肿分支杆菌(M.abscessus)、耻垢分支杆菌(M.smegmatis)、胃分支杆菌(M.gastri)，结核分支杆菌灵敏度标准品1、10、100、1000cfu/ml，以上菌株及标准品由中国药品生物制品检定所提供。卡介苗由上海生物制品所提供。

2样品前处理

模拟临床结核感染病人的痰样品中加入1～5倍体积的液化试剂，旋涡振荡器上振荡混匀30s～1min，室温静置15～20min，3000g～4000g离心15min，弃上清，沉淀用于核酸提取。

该模拟临床结核感染病人的痰样品为非结核病人的浓痰加梯度稀释的卡介苗菌液。卡介苗用1ml灭菌双蒸水溶解，依次作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释，10^-2、10^-3、10^-4稀释的卡介苗菌液100μl添加到1m浓痰中经上述方法液化以后作核酸提取和荧光PCR扩增检测，与100μl  10^-2、10^-3、10^-4稀释的卡介苗菌液的检测结果对照。

3核酸提取

核酸提取采用商品化柱抽提试剂，沉淀中加入裂解液400μl，蛋白酶K 100μl，用Tip头吸打混匀，70℃裂解10分钟；核酸提取柱套在2ml离心管内，将裂解好的样品溶液加到核酸提取柱上，10000rpm离心1min，弃收集液；在核酸提取柱内加入500μl洗涤液A，10000rpm离心1min，弃收集液；在核酸提取柱内加入500μl洗涤液B，10000rpm离心1min，弃收集液；14000rpm离心1min，弃离心管，换一新的2ml离心管；在核酸提取柱柱面中央小心加入50ul灭菌双蒸水，静置2min，10000rpm离心1min，收集液用于核酸扩增。

分支杆菌培养菌液分别取100μl加裂解液100μl，蛋白酶K 20μl，用Tip头吸打混匀，70℃裂解10分钟，以下步骤及反应液用量同上述核酸提取步骤。

结核分支杆菌灵敏度标准品1ml 10000rpm离心15分钟，弃上清，留取离心管底部100μl液体，加裂解液100μl，蛋白酶K 20μl，用Tip头吸打混匀，70℃裂解10分钟，以下步骤及反应液用量同上述核酸提取步骤。

4PCR扩增

引物序列分别为：

引物1：5’-CTA CGC AGC AGA TCC CCA-3’

引物2：5’-GCA CCG CCC AAC TCG TT-3’

结核分支杆菌复合体特异性荧光探针设计为：

5’-CCG TTC CCG CAA TAA ACC CAT AGC C-3’

两引物的终浓度0.5uM，探针终浓度0.3uM，Mg²⁺终浓度3.5mM，dNTP终浓度0.2mM，处理样15μl，Taq DNA聚合酶用量1U/30μl。以非结核病人的痰处理样品为阴性对照。

实时荧光分别在ABI PE7500、Roche Lightcycler上进行。为减少污染使用了UNG酶，并用dUTP代替dTTP。

ABI PE7500与Roche Lightcycler反应体积都为30μl，UNG酶用量0.2U，两引物的终浓度0.5uM，探针终浓度0.3uM，Mg²⁺终浓度3.5mM，dNTP终浓度0.2mM，处理样本15μl，Taq DNA聚合酶用量1U/30μl。反应程序不同，ABI PE7500为：50℃2min，94℃2min，94℃10s→65℃45s循环45次；Roche Lightcycler为：50℃2min，94℃2min，94℃3s→65℃45s循环45次。分别用两种仪器自配软件进行数据处理和分析。

5结果分析

在含结核分支杆菌复合体特异性荧光探针的反应管中，仅结核分支杆菌培养物和模拟临床结核样品呈现S型荧光扩增曲线，显示阳性结果；其他菌株培养物和阴性对照标本无荧光扩增曲线，显示阴性结果。

Lightcycler的检测结果见图。本发明所述的结核分支杆菌复合体核酸检测方法灵敏度高，中国药品生物制品检定所提供的结核分支杆菌灵敏度标准品浓度分别为1、10、100、1000cfu/ml，经过DNA提取之后检测，灵敏度达到10个cfu/ml(图1)，符合中国药品生物制品检定所对结核核酸扩增检测试剂灵敏度的要求；特异性强，以中国药品生物制品检定所提供的菌株培养物，经过DNA提取之后检测，仅两个结核分支杆菌样品显示阳性，其它分支杆菌以及肺炎球菌、布氏杆菌全部显示阴性(图2)。

为验证本发明的痰液化方法对分支杆菌无杀死作用，以含相同数量卡介苗分支杆菌的两份卡介苗菌液，一份不经过痰液化步骤直接用本发明所述的临床样品结核分支杆菌复合体核酸的检测方法检测，一份添加到非结核病人的浓痰中作为模拟临床样品，用所述临床样品结核分支杆菌复合体核酸的检测方法检测，荧光PCR扩增结果显示两份样品的C_t值相差小于1(见表1)，表明虽然经过痰液化步骤但是痰样品中分支杆菌DNA没有损失(图3)。

表1  卡介苗菌液与卡介苗模拟临床样品检测结果对照

	10<sup>-2</sup>稀释的卡介苗菌液	10<sup>-3</sup>稀释的卡介苗菌液	10<sup>-4</sup>稀释的卡介苗菌液
				卡介苗模拟临床样品4份  (含100μl卡介苗稀释菌液)	21.37，21.7121.62，21.70	25.47，25.31  24.43，24.82	29.88，29.6329.45，29.49
100μl卡介苗稀释菌液	22.17，21.7722.20，22.40	25.94，25.93  25.75，26.24	29.85，30.1429.48，29.44

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此处应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。

                     序列表

Claims (1)

1.一种用于检测结核分支杆菌的试剂盒，包括痰的液化试剂、PCR试剂、一对用于检测结核分支杆菌的特异性引物、一种用于检测结核分支杆菌的特异性荧光探针，

其中，用于检测结核分支杆菌的特异性引物，其核苷酸序列为：

引物1：5’-CTA CGC AGC AGA TCC CCA-3’SEQ ID NO：2

引物2：5’-GCA CCG CCC AAC TCG TT-3’SEQ ID NO：3

用于检测结核分支杆菌的特异性荧光探针，其核苷酸序列为：

荧光探针：5’-CCG TTC CCG CAA TAA ACC CAT AGC C-3’SEQ ID NO：4。

Images