CN103773872B - 用于检测结核分枝杆菌mRNA的引物和探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测结核分枝杆菌的引物和探针及其应用。本发明提供了用于检测结核分枝杆菌的组合物，所述组合物由一个引物对和一个探针组成；所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成；所述探针的序列为序列表中序列3。实验证明，采用该方法对结核分枝杆菌mRNA基因进行检测，检测结果显示良好的敏感性、特异性和重复性，对痰涂片阴性的肺结核患者亦有诊断价值。

Description

用于检测结核分枝杆菌mRNA的引物和探针及其应用
技术领域
本发明属于病原体检测领域，涉及一种用于检测结核分枝杆菌的引物和探针及其应用。
背景技术
结核病是一种严重危害人类健康的慢性传染病，2010年新修订的《中华人民共和国国境卫生检疫法实施细则》中，明确规定卫生检疫机关应当阻止患有传染性肺结核病的外国人入境，而准确检测到具有传染性的结核分枝杆菌活菌是国境口岸拦截传染性肺结核的关键。灵敏度高，特异性强、检测时间短的PCR检测技术在防控结核工作中起着越来越重要的作用。针对结核分枝杆菌DNA和16S rRNA进行检测的PCR方法不能判断细菌在体内的活性，往往出现PCR扩增阳性而培养阴性的情况（陆宇，朱莉贞，段连山，等.mRNA作为结核分支杆菌活菌检测标志的可行性研究[J].中华结核和呼吸杂志,2003,26(7):419-423.）。
结核分枝杆菌信使RNA（mRNA），由于半衰期很短，仅存在于活的、有代谢活性的菌体中，因此是活动性结核的重要标志（Hellyer T J,Desjardin L E,Teixeira L,et al.Detection of viable Mycobacterium tuberculosis by reverse transcriptase-stranddisplacement amplification of mRNA[J].J Clin Microbiol,1999,37(3):518-523.DesjardinL E,Perkins M D,Wolski K,et al.Measurement of sputum Mycobacterium tuberculosismessenger RNA as a surrogate for response to chemotherapy[J].Am J Respir Crit CareMed,1999,160(1):203-210.）。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测结核分枝杆菌的引物和探针及其应用。
本发明所提供的用于检测或辅助检测结核分枝杆菌的组合物，由一个引物对和一个探针组成的组合物；所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成；所述探针的序列为序列表中序列3。
其中，序列1有19个核苷酸组成；序列2由18个核苷酸组成；序列3由22个核苷酸组成。
所述组合物中，组成所述引物对的两条单链DNA分子，以及所述探针，三者使用时的摩尔比为1:1:4；
TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光报告基团连接在探针的5’末端，荧光淬灭基团连接在探针的3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
所述荧光报告基团可为Joe(JOE)、Fam（FAM）、Hex(HEX)、Tet(TET)、Vic(VIC)、Fite(FITE)、Cy3(CY3)或Cy5(CY5)。所述荧光淬灭基团可为Bhq1(BHQ1)、Tamra（TAMRA）、Rox(ROX)、Dabcy(DABCY)或Bhq2(BHQ2)。在本发明中，所述探针5’端标记的荧光报告基团具体为JOE，3’端标记的淬灭荧光基团具体为BHQ1。
检测或辅助检测结核分枝杆菌的引物对或探针也属于本发明的保护范围。
所述引物对具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。所述探针可为TaqMan荧光探针，其核苷酸序列具体为序列表中序列3。在本发明中，所述探针5’端标记的荧光报告基团具体为JOE，3’端标记的荧光淬灭基团具体为BHQ1。
所述引物对中，所述两条单链DNA分子使用时的摩尔比为1:1。
上述组合物或引物对或探针在制备用于检测或辅助检测待测样品中是否含有结核分枝杆菌的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
含有上述组合物或引物对或探针的试剂盒也属于本发明的保护范围。
进一步，所述试剂盒中还可含有反转录酶和/或DNA聚合酶。
更加具体的，所述试剂盒中除上述组合物或引物对或探针外，还含有如下：2×OneStep RT-PCR Buffer、TaKaRa ExHS、RT Enzyme MixⅡ、ROXReference Dye II，以及无RNA酶水。
所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
所述试剂盒的制备方法具体可包括将所述试剂盒中的各成分分别单独包装的步骤。
本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中是否含有结核分枝杆菌的方法。
本发明所提供的检测或辅助检测待测样品中是否含有结核分枝杆菌的方法为非疾病诊断或治疗方法，具体可包括如下步骤：以分离自所述待测样品的mRNA为模板，利所述组合物，或所述引物对，或所述探针，或所述试剂盒进行RT-PCR检测，从而确定所述待测样品中是否含有结核分枝杆菌。
在本发明中所述RT-PCR具体为实时荧光RT-PCR。
所述RT-PCR的体系中，所述引物对中的两条引物以及所述探针的摩尔比可为1:1:4。
在本发明的一个实施例中，反应起始时，所述引物对中的两条引物的工作浓度均为10μmol/L；所述探针的工作浓度为40μmol/L。
所述RT-PCR的退火温度可为55℃。
在本发明的一个实施例中，所述实时荧光RT-PCR的反应参数具体如下：42℃逆转录8min，95℃预变性1min；95℃5S，55℃34S，40个循环。
本发明根据结核分支杆菌基因保守区序列，设计用于实时荧光RT-PCR检测的引物对（序列1和序列2）及探针（序列3），优化建立了结核分支杆菌的实时荧光RT-PCR检测方法。实验证明，采用该方法对结核分枝杆菌mRNA基因进行检测，检测结果显示良好的敏感性、特异性和重复性，对痰涂片阴性的肺结核患者亦有诊断价值。
附图说明
图1为0.5麦氏比浊浓度的标准结核分支杆菌菌株H37RV（ATCC27294）mRNA倍比稀释扩增TB基因的扩增曲线。其中，0表示原倍样本；1表示10-1稀释样本；2表示10-2稀释样本；3表示10-3稀释样本；4表示10-4稀释样本。
图2为1份痰涂片抗酸染色镜检结果为“4+”的样本的mRNA经倍比稀释后，重复检测TB基因的扩增曲线。其中，0表示原倍样本重复检测三次结果；1表示10-1稀释样本重复检测三次结果；2表示10-2稀释样本重复检测三次结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、用于RT-PCR检测结核分枝杆菌的引物和探针的设计与合成
应用ClustalW软件对比NCBI数据库中的结核分枝杆菌TB基因序列，找出保守序列，并经NCBI-Blast分析与其他细菌和微生物间的基因无同源性序列，在此区域应用Primer5.0和Primer express软件设计引物与探针，探针5’端标以荧光报告集团JOE（荧光发射峰值在520nm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团BHQ1。
正向引物（TB Forward）：5'-TGCAATGATGCTCGTGCAA-3'（序列1）
反向引物（TB Reverse）：5'-TCTACGCCGGGAATTTCG-3'（序列2）
探针（TB Probe）：5'-CTGCTCGACCGCGACCTTCGTG-3'（序列3）
探针ToSLCVP的5’端用报告荧光基团JOE标记，3’端用淬灭荧光基团BHQ1标记。
实施例2、实时荧光RT-PCR检测方法的建立
待测样本：22份肺结核病人痰液，痰涂片抗酸染色镜检结果为4+、3+、2+、1+样本各5例，痰涂片抗酸染色阴性（-）样本2例。肺结核病例诊断标准和痰涂片染色镜检方法均符合卫生部WS288-2008《肺结核诊断标准》。
痰液样本前处理：提取RNA前用sputosol痰稀释剂（Oxoid公司，产品目录号为：SR0233A）进行消化处理，37℃水浴震荡使痰液均质化，其中sputosol痰稀释剂和痰液的体积配比为1：1。
一、样品mRNA的提取
采用北京天恩泽基因科技有限公司生产的柱式mRNA提取试剂盒（产品目录号为71201-50），0.5ml样本（处理后痰液样本）中加入0.5ml溶液A（Trizol，试剂盒随附）和0.1g酸化玻璃珠（北京天恩泽基因科技有限公司，产品目录号为100307B10），充分震荡混匀后，用加热振荡器1200rpm60℃震荡加热5分钟。依据试剂盒说明书提取mRNA。
二、实时荧光RT-PCR
采用TAKARA实时荧光定量PCR试剂盒（DRR064A）对步骤一所提取的mRNA样本进行检测，经对反应条件和反应参数进行反复实验，优化结核分枝杆菌mRNART-PCR方法。最后确定最佳反应条件如下：
反应体系（25μL）：2×One Step RT-PCR Buffer12.5μL，TaKaRa ExHS（5U/μl）0.5μl，RT Enzyme MixⅡ0.5μl，ROX Reference Dye II0.5μl，RNaseFree dH2O4μl，TB上游引物、下游引物各0.5μL，探针1.0μL；RNA模板5μL。在反应体系中，TB上游引物、下游引物的初始浓度均为10μmol/L；所述探针的初始浓度为40μmol/L。
反应参数：42℃逆转录8min，95℃预变性1min；95℃5S，55℃34S，40个循环。通道设置：JOE为荧光报告基团，荧光猝灭基团为none；选ROX进行荧光校正。采用ABI7500荧光定量PCR仪进行检测，并用配备的分析软件进行数据分析与处理。
在上述优化条件下，22份肺结核患者痰标本RNA检测均出现了典型的S型扩展曲线，所有样本检测CT均值为31.35，标准差4.31。痰涂片抗酸染色结果不同样本检测CT值和标准差结果见表1。
表1 肺结核患者痰标本荧光PCR反应检测结果
样本数 抗酸染色 CT均值 标准差
5 + 35.22 0.74
5 ++ 33.03 1.10
5 +++ 27.45 0.64
5 ++++ 25.41 0.74
2 （-） 35.64 0.62
由表1可见，在本发明方法中，CT值与痰液中结核分枝杆菌的数量显示出了较好的相关性，痰涂片抗酸染色为“-”的两份样本CT值均在35以上，随着痰涂片结核分枝杆菌数目的增多，染色为“++++”的五份样本CT值在26以下。这说明本方法不仅可用于涂片阴性肺结核的辅助诊断，而且还可用于痰液中结核分枝杆菌浓度检测的指标。
实施例3、实施例2方法的特异性实验
待测样本：经临床检测健康无结核症状人群痰标本10份及偶然分枝杆菌（ATCC6841）。
一、样品mRNA的提取
痰液样本前处理：提取RNA前用sputosol痰稀释剂（Oxoid公司，产品目录号为：SR0233A）进行消化处理，37℃水浴震荡使痰液均质化，其中sputosol痰稀释剂和痰液的体积配比为1：1。
采用北京天恩泽基因科技有限公司生产的柱式mRNA提取试剂盒（产品目录号为71201-50），0.5ml样本（处理后痰液样本）中加入0.5ml溶液A（Trizol，试剂盒随附）和0.1g酸化玻璃珠（北京天恩泽基因科技有限公司，产品目录号为100307B10），充分震荡混匀后，用加热振荡器1200rpm60℃震荡加热5分钟。依据试剂盒说明书提取mRNA。
二、实时荧光RT-PCR
分别以步骤一获得的各样品的mRNA为模板进行实时荧光RT-PCR。采用实施例2中确定的最佳反应条件进行操作。
反应结束后根据扩增曲线判定结果，并计算特异性，特异性=一种方法检测的阴性样本数/实际阴性样本数×100%。
结果显示，作为待测样本的经临床检测健康无结核症状人群痰标本10份及偶然分枝杆菌（ATCC6841）的荧光信号未出现典型的S型扩增曲线，表明实施例2所建立的方法对结核分支杆菌具有良好的特异性，其特异性为100％。
实施例4、实施例2方法的最低检测限及CUT OFF值的确定
将标准结核分支杆菌菌株H37RV（ATCC27294）在改良罗氏培养基（珠海贝索生物技术有限公司，产品目录号：BA7005D-2）上生长4周至对数期后，取菌落用生理盐水配成0.5麦氏比浊浓度（相当于1.5×108细菌数/mL），-70℃保存备用。
用以上所得0.5麦氏比浊浓度的标准结核分支杆菌菌株H37RV（ATCC27294），以10倍梯度用DEPC处理水进行稀释，最大稀释倍数10-5，然后采用北京天恩泽生物技术有限公司生产的柱式mRNA提取试剂盒（产品目录号为71201-50），按照试剂盒说明书从各稀释液中提取mRNA。
分别以从各稀释液中提取的mRNA为模板进行实时荧光RT-PCR。采用实施例2中确定的最佳反应条件进行操作。并对最低检测限稀释度的mRNA样本重复测定四次，统计每个最低检测限稀释度的样本检测CT平均值以确定CUT OFF值（CUT OFF值为最低检测限稀释度样本的CT均值，该值是判断阴阳性的分界线）。
结果显示，0.5麦氏比浊浓度的标准结核分支杆菌菌株H37RV（ATCC27294）mRNA随着稀释倍数的增大，检测CT值增大，稀释至10-5未见扩增曲线（如图1所示）。其最低检测限的稀释度为10-4，折合为1.5×104细菌数/mL。进一步，对最低检测限稀释度（10-4）重复检测三次，CT平均值（CUT OFF值）为35.31，标准差0.71（表2）。
表2  对最低检测限稀释度（10-4）样本CT值的三次重复检测结果
重复1 重复2 重复3 平均值±标准差
34.57 35.37 35.98 35.31±0.71
实施例5、实施例2方法的重复性实验
待测样本：实施例2中1份痰涂片抗酸染色镜检结果为“4+”的样本。
按照实施例2中的方法提取样品mRNA，并对其进行10-1、10-2稀释。分别以原倍、10-1、10-2稀释的mRNA为模板进行实时荧光RT-PCR。采用实施例2中确定的最佳反应条件进行操作。每个样本重复检测三次。统计不同稀释度的CT平均值和变异系数。其中，变异系数为标准差与平均值的比值。
结果显示，原倍、10-1、10-2稀释样本CT均值依次为25.37、28.38、30.38，变异系数依次为0.92%、0.53%、2.54%（表3）。各样本的扩增曲线结果如图2所示。
表3 实施例2方法的重复性检测结果
重复1 重复2 重复3 平均值±标准差 变异系数
原倍 25.24 25.23 25.64 25.37±0.23 0.92%
10-1 28.23 28.53 28.38 28.38±0.15 0.53%
10-2 31.11 29.57 30.45 30.38±0.77 2.54%
表3中重复性检测变异系数控制在2.54%以下的范围内，可见本发明方法的可重复性好，可广泛应用于结核分枝杆菌的检测和药物敏感性监测。

Claims (8)

1.检测或辅助检测结核分枝杆菌的组合物，为由一个引物对和一个探针组成的组合物；所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成；所述探针的序列为序列表中序列3。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述荧光报告基团为JOE，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
4.根据权利要求1-3中任一所述的组合物，其特征在于：所述组合物中，组成所述引物对的两条单链DNA分子，以及所述探针，三者使用时的摩尔比为1:1:4。
5.权利要求1-4中任一所述的组合物在制备用于检测或辅助检测待测样品中是否含有结核分枝杆菌的试剂盒中的应用。
6.含有权利要求1-4中任一所述的组合物的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有反转录酶和/或DNA聚合酶。
8.权利要求6或7所述试剂盒的制备方法，包括将所述试剂盒中的各成分分别单独包装的步骤。
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