CN108192989A - 用于检测结核分枝杆菌和结核病的成套试剂与试剂盒 - Google Patents

用于检测结核分枝杆菌和结核病的成套试剂与试剂盒 Download PDF

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CN108192989A CN201810262979.8A CN201810262979A CN108192989A CN 108192989 A CN108192989 A CN 108192989A CN 201810262979 A CN201810262979 A CN 201810262979A CN 108192989 A CN108192989 A CN 108192989A
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李自慧
张宗德
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Beijing Chest Hospital
Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
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Beijing Chest Hospital
Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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Abstract

本发明公开了用于检测结核分枝杆菌和结核病的成套试剂与试剂盒。本发明提供的用于检测结核分枝杆菌和结核病的成套试剂由成套试剂1和成套试剂2组成；成套试剂1由序列表的序列1和2所示的两条单链DNA和名称为X1‑P的探针组成；X1‑P的序列为序列表的序列3，5'端由Hex标记，3'端由BHQ‑2标记；成套试剂2由序列表的序列4和5所示的两条单链DNA和名称为X2‑P的探针组成；X2‑P的序列为序列表的序列6，5'端由FAM标记，3'端由BHQ‑1标记。本发明的成套试剂具有很高的特异度和灵敏度，能够用于肺结核患者临床分离株、痰和血浆样本的微量核酸检测，具有很高的实用性和应用价值。

Description

用于检测结核分枝杆菌和结核病的成套试剂与试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学领域，用于检测结核分枝杆菌和结核病的成套试剂与试剂盒。
背景技术
结核病(tuberculosis，TB)是严重威胁人类健康的传染性疾病之一。据世界卫生组织(world health organization,WHO)报告，2016年全球新发结核病1040万例。早期确诊对于结核病的治疗和防控意义重大，但目前仍有大量的菌阴肺结核患者和肺外结核病患者，由于缺乏病原学依据，临床诊断极为困难，存在漏诊和误诊，导致疾病广泛传播。
结核分枝杆菌抗酸染色镜检和培养是结核病病原学检测最常用的两种方法，但是检测的灵敏度较低。近年来基于核酸扩增的检测技术不断涌现，如常规聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、实时定量PCR、环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)等，这些技术包括WHO大力推荐的Xpert MTB/RIF检测，均具有快速、灵敏的特点，已经开始应用于临床，以确定样本中结核分枝杆菌的存在。然而，现有的这些技术需要有足够量的检测样本才能保证检测的准确性，在面对微量样本检测、无合适样本检测的情况(如儿童患者、无呼吸道损伤和症状的患者)时仍然无法解决。
微滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是一种新兴的PCR技术，其原理是把反应体系均匀分配到大量的反应单元中，实现理论上的单分子扩增，最终根据泊松分布计算目的核酸序列的拷贝数。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测结核分枝杆菌及如何诊断结核病。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种用于检测结核分枝杆菌或用于诊断结核病的成套试剂，所述成套试剂由成套试剂1和成套试剂2组成；
所述成套试剂1由名称分别为X1的引物对和名称为X1-P的探针组成；
所述X1由名称分别为X1-F和X1-R的单链DNA组成；
所述X1-F为(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述X1-R为(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
所述X1-P的序列为(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列3；
(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的序列；
所述成套试剂2由名称分别为X2的引物对和名称为X2-P的探针组成；
所述X2由名称分别为X2-F和X2-R的单链DNA组成；
所述X2-F为(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(d2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；
所述X2-R为(e1)或(e2)：
(e1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(e2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子；
所述X2-P的序列为(f1)或(f2)：
(f1)序列表的序列6；
(f2)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的序列。
上述成套试剂中，所述X1-P和所述X2-P的末端可被荧光染料标记。
上述成套试剂中，所述X1-P的5'端可由Hex标记，所述X1-P的3'端可由BHQ-2标记。
所述X2-P的5'端可由FAM标记，所述X1-P的3'端可由BHQ-1标记。
所述成套试剂1中的所述X1-F、所述X1-R和所述X1-P均可独立包装。所述成套试剂1中所述X1-F、所述X1-R和所述X1-P的摩尔比可为7.2:7.2:1。
所述成套试剂2中的所述X2-F、所述X2-R和所述X2-P均可独立包装。所述成套试剂2中所述X2-F、所述X2-R和所述X2-P的摩尔比可为7.2:7.2:1。
所述成套试剂中，所述X1-F、所述X1-R、所述X1-P、所述X2-F、所述X2-R和所述X2-P的摩尔比为7.2:7.2:1:7.2:7.2:1。
所述成套试剂1也属于本发明的保护范围。
将所述成套试剂1的靶标序列记为靶标序列1，将所述成套试剂2的靶标序列记为靶标序列2。
为解决上述技术问题，本发明还提供了用于检测结核分枝杆菌或诊断结核病的系统，所述系统包括所述成套试剂或所述成套试剂1。
上述系统由所述成套试剂或所述成套试剂1与M1组成，所述M1为进行数字PCR所需的试剂和/或仪器。所述进行数字PCR所需的试剂可为ddPCR supermix for probes(nodUTP)。ddPCR supermix for probes(no dUTP)可为Bio-rad产品。所述仪器可为微滴发生器和/或基因扩增仪和/或微滴读取仪。
所述系统可为仅包括试剂的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述X1)或X2)的方法：
X1)检测结核分枝杆菌的方法，包括：利用所述成套试剂1和所述成套试剂2分别对待测样品进行数字PCR，在阴性对照(所述阴性对照的体系中可无DNA)结果为阴性的前提下，根据靶标序列扩增的有无确定所述待测样品是否为结核分枝杆菌或是否含有结核分枝杆菌：如所述成套试剂1和所述成套试剂2中至少有一个成套试剂的体系中产生阳性扩增，所述待测样品为或候选为结核分枝杆菌或所述待测样品含有或候选含有结核分枝杆菌；如所述成套试剂1和所述成套试剂2的体系中均没有产生阳性扩增，所述待测样品不为或候选不为结核分枝杆菌或所述待测样品不含有或候选不含有结核分枝杆菌；
X2)诊断结核病的方法，包括：利用所述成套试剂1和所述成套试剂2分别对待测对象的基因组DNA进行数字PCR，得到所述待测对象的所述靶标序列1和所述靶标序列2的拷贝数，根据所述待测对象的所述靶标序列1和所述靶标序列2的拷贝数确定所述待测对象是否为结核病患者：如所述靶标序列1的拷贝数高于阈值1，所述靶标序列2的拷贝数高于阈值2，所述待测对象为或候选为结核病患者；如所述靶标序列1的拷贝数高于所述阈值1，所述靶标序列2的拷贝数不高于所述阈值2，所述待测对象为或候选为结核病患者；如所述靶标序列2的拷贝数高于所述阈值2，所述靶标序列1的拷贝数不高于所述阈值1，所述待测对象为或候选为结核病患者；如所述靶标序列2的拷贝数不高于所述阈值2，所述靶标序列1的拷贝数不高于所述阈值1，所述待测对象不为或候选不为结核病患者。
其中，所述阈值1和所述阈值2分别为利用所述靶标序列1的拷贝数和所述靶标序列2的拷贝数区分结核病患者与非结核病患者的阈值。
所述阈值1和所述阈值2可按照如下方法确定：
选取两组样本，一组为结核病患者基因组DNA(至少来自于4个涂片及罗氏培养结果均为阳性、临床明确诊断的菌阳肺结核患者，记为阳性样本组)，一组为非结核病患者基因组DNA(至少来自于4个涂片、培养、γ干扰素释放实验均阴性的人，记为阴性样本组)；利用数字PCR的方法采用所述成套试剂1和所述成套试剂2分别对各组的基因组DNA进行检测，得到各样本的所述靶标序列1和所述靶标序列2的拷贝数，依据下述方法确定阈值：
所述阈值1为所述阳性样本组各样本和所述阴性样本组各样本的所述靶标序列1的拷贝数的中间值，能够区分所述阳性样本组样本和所述阴性样本组样本。所述阳性样本组各样本的所述靶标序列1的拷贝数可均高于所述阈值1，所述阴性样本组各样本的所述靶标序列1的拷贝数可均不高于所述阈值1。
所述阈值2为所述阳性样本组各样本和所述阴性样本组各样本的所述靶标序列2的拷贝数的中间值，能够区分所述阳性样本组样本和所述阴性样本组样本。所述阳性样本组各样本的所述靶标序列2的拷贝数可均高于所述阈值2，所述阴性样本组各样本的所述靶标序列2的拷贝数可均不高于所述阈值2。
上述方法中，进行所述数字PCR的退火温度可为m1)或m2)：
m1)50-58℃；
m2)54℃。
所述成套试剂或所述成套试剂1，或，所述系统的下述Y1)-Y8)任一种中的应用，也属于本发明的保护范围：
Y1)在检测结核分枝杆菌中的应用；
Y2)在制备检测结核分枝杆菌产品中的应用；
Y3)在利用数字PCR检测结核分枝杆菌中的应用；
Y4)在制备利用数字PCR检测结核分枝杆菌产品中的应用；
Y5)在诊断或辅助诊断结核病中的应用；
Y6)在制备诊断或辅助诊断结核病产品中的应用；
Y7)在利用数字PCR诊断结核病中的应用；
Y8)在制备利用数字PCR诊断结核病产品中的应用。
本发明针对肺结核患者临床分离株、痰、血浆三种常见的临床样本，提供了一种用于检测结核分枝杆菌及诊断肺结核的成套试剂，并建立了微滴数字PCR检测结核分枝杆菌的特异性体系，并且本发明的成套试剂具有很高的特异度和灵敏度，能够用于肺结核患者临床分离株、痰和血浆样本的微量核酸检测，对于提高结核病的病原学诊断能力有重要意义，具有很高的实用性和应用价值。
附图说明
图1为结核分枝杆菌临床分离株DNA样本的微滴数字PCR扩增结果。
图2为痰DNA样本的微滴数字PCR扩增结果。其中，T1～T9为菌阳肺结核患者痰样本；C1～C4为非结核其他肺部疾病患者痰样本。A为成套试剂2的检测结果；B为成套试剂1的检测结果。
图3为血浆DNA样本的微滴数字PCR扩增结果。其中，P1～P12为菌阳肺结核患者血浆样本；H1～H7为健康者血浆样本。A为成套试剂2的检测结果；B为成套试剂1的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置生物学重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
灵敏度(真阳性率)：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100％。
特异度(真阴性率)：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异度越大越好，理想特异度为100％。
实施例1、用于检测结核分枝杆菌的成套试剂的制备
本实施例提供的用于检测结核分枝杆菌的成套试剂由成套试剂1和成套试剂2组成；
成套试剂1由名称分别为X1的引物对和名称为X1-P的探针组成；
X1由名称分别为X1-F和X1-R的单链DNA组成；
X1-F为序列表中序列1所示的单链DNA；
X1-R为序列表中序列2所示的单链DNA；
X1-P的序列为序列表中序列3，X1-P的5'端由Hex标记，3'端由BHQ-2标记；
成套试剂2由名称分别为X2的引物对和名称为X2-P的探针组成；
X2由名称分别为X2-F和X2-R的单链DNA组成；
X2-F为序列表中序列4所示的单链DNA；
X2-R为序列表中序列5所示的单链DNA；
X2-P的序列为序列表中序列6，X2-P的5'端由FAM标记，3'端由BHQ-1标记。
用于检测结核分枝杆菌的成套试剂中的成套试剂1和成套试剂2均独立包装，该成套试剂中X1-F、X1-R、X1-P、X2-F、X2-R和X2-P的摩尔比为7.2:7.2:1:7.2:7.2:1；成套试剂1中X1-F、X1-R和X1-P的摩尔比为7.2:7.2:1。
实施例2、结核分枝杆菌数字PCR检测方法的建立
1、实验材料
菌株或样本：结核分枝杆菌临床分离株13株，菌阳肺结核患者痰样本9例，非结核其他肺部疾病患者痰样本4例，菌阳肺结核患者血浆样本12例，健康者血浆样本7例。结核分枝杆菌临床分离株为将不同的肺结核患者痰菌罗氏培养得到的菌株；菌阳肺结核患者为涂片及罗氏培养结果均为阳性、临床明确诊断的肺结核患者；非结核其他肺部疾病患者为病原学或病理学确诊的其他肺部疾病、并且排除合并结核分枝杆菌感染(涂片、培养、γ干扰素释放实验均阴性)的患者；健康者为常规体检无异常(即不患有肺结核及其他疾病)、排除合并结核分枝杆菌感染(γ干扰素释放实验阴性)的人群。
试剂耗材：TE缓冲液、十二烷基硫酸钠(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，溶菌酶(Sigma)，蛋白酶K(Merck)，DNA小量提取试剂盒(Qiagen)，血浆/组织DNA提取试剂盒(Qiagen)，ddPCR supermix for probes(no dUTP)(Bio-rad)，油(Bio-rad)，96孔板(Eppendorf)，封膜(Eppendorf)，微滴发生卡(Bio-rad)。
仪器：微滴发生器和微滴读取仪(QX200，Bio-rad)，基因扩增仪(C1000Touch，Bio-rad)，封膜仪(PX1，Bio-rad)，生物安全柜(NU-425-300E，Nuaire)，核酸分析仪(Nanodrop2000，Thermo)。
2、基因组DNA的提取
结核分枝杆菌临床分离株DNA提取：细菌用TE缓冲液重悬，加入溶菌酶至5mg/ml，37℃过夜消化，加入蛋白酶K至1mg/ml，加入十二烷基硫酸钠至1％，37℃振荡1h。然后用DNA小量提取试剂盒(51304，Qiagen公司)按说明提取菌株DNA，无菌去离子水50μl溶解。
痰样本DNA提取：痰样本常规采用N-乙酰-L-半胱氨酸氢氧化钠液化，取500μl液体离心收集沉淀，用TE缓冲液洗一遍，加入玻璃珠，室温剧烈涡旋，热灭活后离心取上清，常规乙醇沉淀DNA，无菌去离子水50μl溶解。
血浆DNA提取：利用血浆/组织DNA提取试剂盒(69506，Qiagen公司)按操作说明提取400μl血浆DNA，最后溶于45μl无菌去离子水。
3、数字PCR扩增反应
利用实施例1的用于检测结核分枝杆菌的成套试剂检测各种DNA样本。
(1)数字PCR反应体系的配置，体系如表1所示。同时设置空白对照，空白对照中的模板用ddH2O替换。
表1、结核分枝杆菌数字PCR反应体系
(2)体系配置完成后，将反应体系转移至微滴发生卡的体系加样孔中，并在反应用油加样孔中加入70μL的数字PCR反应用油，在加样过程中，应避免在孔底产生气泡；
(3)加样完成后，将微滴生成卡转移至微滴发生器中，启动仪器；
(4)微滴生成结束后，将生成完成后的微滴体系转移至96孔板中，封膜；
(5)将96孔板置于基因扩增仪中，PCR扩增程序为：95℃10min，(94℃30s，54℃40s)×40个循环；98℃10min。
扩增结束后，将96孔板取出，置于微滴读取仪中进行微滴荧光读取；
(6)通过Hex单通道荧光收集成套试剂1的单个微滴荧光信号，通过FAM单通道荧光收集成套试剂2的单个微滴荧光信号，荧光采集后，通过分析热点图确定待测样本是否为或是否含结核分枝杆菌，或确定靶标序列的拷贝数阈值以确定待测对象是否为结核病患者：
X1)如成套试剂1和成套试剂2中至少有一个成套试剂的体系中产生阳性扩增，待测样品为结核分枝杆菌或待测样品含有结核分枝杆菌；如成套试剂1和成套试剂2的体系中均没有产生阳性扩增，待测样品不为结核分枝杆菌或待测样品不含有结核分枝杆菌；
X2)将成套试剂1的靶标序列记为靶标序列1，将成套试剂2的靶标序列记为靶标序列2，阈值1和阈值2分别为利用靶标序列1的拷贝数和靶标序列2的拷贝数区分结核病患者与非结核病患者的阈值，如靶标序列1的拷贝数高于阈值1，靶标序列2的拷贝数高于阈值2，待测对象为结核病患者；如靶标序列1的拷贝数高于阈值1，靶标序列2的拷贝数不高于阈值2，待测对象为结核病患者；如靶标序列2的拷贝数高于阈值2，靶标序列1的拷贝数不高于阈值1，待测对象为结核病患者；如靶标序列2的拷贝数不高于所述阈值2，靶标序列1的拷贝数不高于阈值1，待测对象不为结核病患者。
阈值1和阈值2按照如下方法确定：
选取两组样本，一组为结核病患者基因组DNA(至少来自于4个涂片及罗氏培养结果均为阳性、临床明确诊断的菌阳肺结核患者，记为阳性样本组)，一组为非结核病患者基因组DNA(至少来自于4个涂片、培养、γ干扰素释放实验均阴性的人，记为阴性样本组)；利用数字PCR的方法采用成套试剂1和成套试剂2分别对各组的基因组DNA进行检测，得到各样本的靶标序列1和靶标序列2的拷贝数，依据下述方法确定阈值：
阈值1为阳性样本组各样本和阴性样本组各样本的靶标序列1的拷贝数的中间值，能够区分阳性样本组样本和阴性样本组样本；
阈值2为阳性样本组各样本和阴性样本组各样本的靶标序列2的拷贝数的中间值，能够区分阳性样本组样本和阴性样本组样本。
4、结果分析
(1)结核分枝杆菌临床分离株
将结核分枝杆菌临床分离株的基因组DNA进行103～106倍稀释后对结核分枝杆菌的基因组拷贝数进行定量，作为模板，按照步骤3的方法进行微滴数字PCR扩增反应进行检测。各菌株基因组DNA在稀释后基因组的拷贝数如表2所示。
表2、以稀释后的结核分枝杆菌临床分离株基因组DNA为模板检测到的每微升反应体系中靶标序列的平均拷贝数
结果显示，所有的菌株基因组DNA的不同稀释倍数下均得到阳性扩增，成套试剂2检测范围为2.05～6320拷贝/μl反应体系，成套试剂1检测范围为0.895～3550拷贝/μl反应体系。表明，实施例1的用于检测结核分枝杆菌的成套试剂具有很高的灵敏度。
(2)痰样本
将所有菌阳肺结核患者痰样本和非结核其他肺部疾病患者痰样本的基因组DNA进行100倍稀释，然后作为模板按照步骤3的方法进行微滴数字PCR扩增反应进行检测。结果如表3所示,T1～T9为菌阳肺结核患者痰样本；C1～C4为非结核其他肺部疾病患者痰样本。
表3、以菌阳肺结核患者痰样本和非结核其他肺部疾病患者痰样本DNA为模板检测到的每微升反应体系中靶标序列的平均拷贝数
结果显示，成套试剂1和成套试剂2检出的所有菌阳肺结核患者痰样本的结核分枝杆菌拷贝数均显著高于非结核其他肺部疾病患者痰样本(p均为0.0028)(图2中A和B)。
成套试剂1的荧光阈值为2.025拷贝/ul反应体系，根据该阈值可成功将菌阳肺结核患者和非结核其他肺部疾病患者区分开，特异度为100％，灵敏度为100％。
成套试剂2的荧光阈值为7.7拷贝/ul反应体系，根据该阈值可成功将菌阳肺结核患者痰样本和非结核其他肺部疾病患者区分开，特异度为100％，灵敏度为100％。
(3)血浆样本
将所有菌阳肺结核患者血浆样本和健康者血浆样本的基因组DNA作为模板按照步骤3的方法进行微滴数字PCR扩增反应进行检测。结果如表4所示,P1～P12为菌阳肺结核患者血浆样本；H1～H7为健康者血浆样本。
表4、以菌阳肺结核患者血浆样本和健康者血浆样本DNA为模板检测到的每微升反应体系中靶标序列的平均拷贝数
结果显示，成套试剂1和成套试剂2检出的菌阳肺结核患者血浆样本的结核分枝杆菌拷贝数均显著高于健康者血浆样本(分别p＝0.0184，p＜0.0001)(图3)。
成套试剂1的荧光阈值为0.23拷贝/ul反应体系，该阈值条件下区分菌阳肺结核患者和健康者的特异度为100％，灵敏度为67％。
成套试剂2的荧光阈值为0.095拷贝/ul反应体系，该阈值可成功将菌阳肺结核患者和健康者区分开，即特异度为100％，灵敏度为100％。
对比例、其他试剂的检测
利用成套试剂甲按照实施例2中步骤3的方法对部分菌阳肺结核患者的血清样本进行检测，菌阳肺结核患者为涂片及罗氏培养结果均为阳性、临床明确诊断的肺结核患者。成套试剂甲为由甲-F和甲-R组成的引物对以及探针甲-P组成：
甲-F:AAGGACCGCAAGCTACTGAA；
甲-R:GTGTTGCCCAACTTGGTCTT；
甲-P：ACCTCACCGGTGACGATATC(5'端由Hex标记，3'端由BHQ-2标记)。
成套试剂甲的检测结果如表5所示。结果表明，成套试剂甲靶序列拷贝数很低(多数为0拷贝/ul反应体系)不能用于检测结核分枝杆菌及菌阳肺结核患者。
表5、成套试剂甲的检测结果
<110> 首都医科大学附属北京胸科医院、北京市结核病胸部肿瘤研究所
<120> 用于检测结核分枝杆菌和结核病的成套试剂与试剂盒
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
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<400> 2
cgtcgagtac ccgatcatat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
cccgacgccg aatcagttgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
ggcgtactcg acctgaaaga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
ctgaaccgga tcgatgtgta 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
ccaccatacg gataggggat 20

Claims (10)

1.成套试剂，由成套试剂1和成套试剂2组成；
所述成套试剂1由名称分别为X1的引物对和名称为X1-P的探针组成；
所述X1由名称分别为X1-F和X1-R的单链DNA组成；
所述X1-F为(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述X1-R为(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
所述X1-P的序列为(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列3；
(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的序列；
所述成套试剂2由名称分别为X2的引物对和名称为X2-P的探针组成；
所述X2由名称分别为X2-F和X2-R的单链DNA组成；
所述X2-F为(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(d2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；
所述X2-R为(e1)或(e2)：
(e1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(e2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子；
所述X2-P的序列为(f1)或(f2)：
(f1)序列表的序列6；
(f2)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的序列。
2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述X1-P和所述X2-P的末端均被荧光染料标记。
3.根据权利要求1或2所述的成套试剂，其特征在于：所述X1-P的5'端由Hex标记，所述X1-P的3'端由BHQ-2标记；
所述X2-P的5'端由FAM标记，所述X1-P的3'端由BHQ-1标记。
4.权利要求1-3中任一所述的成套试剂1。
5.用于检测结核分枝杆菌或诊断结核病的系统，包括权利要求1-3中任一所述成套试剂或所述成套试剂1。
6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于：所述系统由权利要求1-3中任一所述成套试剂或所述成套试剂1与M1组成，所述M1为进行数字PCR所需的试剂和/或仪器。
7.根据权利要求5或6所述的系统，其特征在于：所述系统为试剂盒。
8.下述X1)或X2)的方法：
X1)检测结核分枝杆菌的方法，包括：利用权利要求1-3中任一所述成套试剂1和所述成套试剂2分别对待测样品进行数字PCR，根据靶标序列扩增的有无确定所述待测样品是否为结核分枝杆菌或是否含有结核分枝杆菌：如所述成套试剂1和所述成套试剂2中至少有一个成套试剂的体系中产生阳性扩增，所述待测样品为或候选为结核分枝杆菌或所述待测样品含有或候选含有结核分枝杆菌；如所述成套试剂1和所述成套试剂2的体系中均没有产生阳性扩增，所述待测样品不为或候选不为结核分枝杆菌或所述待测样品不含有或候选不含有结核分枝杆菌；
X2)诊断结核病的方法，将所述成套试剂1的靶标序列记为靶标序列1，将所述成套试剂2的靶标序列记为靶标序列2，所述方法包括：利用权利要求1-3中任一所述成套试剂1和所述成套试剂2分别对待测对象的基因组DNA进行数字PCR，得到所述待测对象的所述靶标序列1和所述靶标序列2的拷贝数，根据所述待测对象的所述靶标序列1和所述靶标序列2的拷贝数确定所述待测对象是否为结核病患者：如所述靶标序列1的拷贝数高于阈值1，所述靶标序列2的拷贝数高于阈值2，所述待测对象为或候选为结核病患者；如所述靶标序列1的拷贝数高于所述阈值1，所述靶标序列2的拷贝数不高于所述阈值2，所述待测对象为或候选为结核病患者；如所述靶标序列2的拷贝数高于所述阈值2，所述靶标序列1的拷贝数不高于所述阈值1，所述待测对象为或候选为结核病患者；如所述靶标序列2的拷贝数不高于所述阈值2，所述靶标序列1的拷贝数不高于所述阈值1，所述待测对象不为或候选不为结核病患者；
所述阈值1和所述阈值2分别为利用所述靶标序列1的拷贝数和所述靶标序列2的拷贝数区分结核病患者与非结核病患者的阈值。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：进行所述数字PCR的退火温度为m1)或m2)：
m1)50-58℃；
m2)54℃。
10.权利要求1-3中任一所述成套试剂或所述成套试剂1，或，权利要求5-7中任一所述系统的下述Y1)-Y8)任一种中的应用：
Y1)在检测结核分枝杆菌中的应用；
Y2)在制备检测结核分枝杆菌产品中的应用；
Y3)在利用数字PCR检测结核分枝杆菌中的应用；
Y4)在制备利用数字PCR检测结核分枝杆菌产品中的应用；
Y5)在诊断或辅助诊断结核病中的应用；
Y6)在制备诊断或辅助诊断结核病产品中的应用；
Y7)在利用数字PCR诊断结核病中的应用；
Y8)在制备利用数字PCR诊断结核病产品中的应用。
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RYOTA USHIO等: "Digital PCR assay detection of circulating Mycobacterium tuberculosis DNA in pulmonary tuberculosis patient plasma", 《TUBERCULOSIS》 *

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