CN107267663A - Hpv检测方法和试剂盒 - Google Patents

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CN107267663A CN201710318670.1A CN201710318670A CN107267663A CN 107267663 A CN107267663 A CN 107267663A CN 201710318670 A CN201710318670 A CN 201710318670A CN 107267663 A CN107267663 A CN 107267663A
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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Abstract

本发明提供了对生物样品中的HPV核酸进行检测的方法,所述方法包含下述步骤：(i)分别用14种HPV型别的特异性引物对和探针组中的引物来扩增样品中的核苷酸片段。(ii)使来自步骤(i)的扩增的片段分别接触上述14种HPV型别基因的特异性引物对和探针组中的探针，(iii)检测探针释放的信号，判断生物样品中是否存在HPV以及HPV的类型。本发明还提供了用于所述对生物样品中的HPV核酸进行检测的方法的试剂盒。

Description

HPV检测方法和试剂盒
发明领域
本发明涉及分子生物学和病毒检测领域。具体的，本发明涉及人乳头状瘤病毒(HPV)感染的检测领域。
发明背景
HPV是与子宫颈癌密切相关的病毒。本领域已经发现超过100种 HPV类型。HPV一般感染皮肤(皮肤类型)或呼吸道和肛门生殖道的粘膜(粘膜类型)。已知超过40种HPV类型会感染子宫颈。基于诱导的良性的、恶化前的或恶性的病变，将HPV分别分成低危(例如，HPV类型6，11，42，43和44)和高危类型(例如，类型16，18，31，33和45)。高危类型占所有侵入性子宫颈癌的超过99％。因此，HPV类型的检测和鉴别是非常重要的。高危类型定义为总是发现在高度SIL(鳞状上皮内的病变)和原位癌中，而低危类型主要发现在低度SIL中。
现在临床上通常通过细胞形态学的方法测量HPV感染的可能结果，例如采用光学显微镜术检查子宫颈涂片，筛选子宫颈的恶性的和恶化前的病症。需要研究和发展HPV分子生物学的检测和分型方法，以便选择进行监视(随访)和治疗的患者。
现有的DNA检测和分型方式很多是通过培养来诊断HPV，存在不少问题。通过检测HPV抗体进行诊断，也受到不充分的灵敏度和特异性的阻碍。诊断HPV感染的直接方法主要是基于病毒DNA基因组的检测，其中使用不同形式的DNA/DNA或RNA/DNA杂交，进行或不进行HPV DNA的事先扩增。聚合酶链反应(PCR)是能非常有效地扩增微量靶DNA的方法。
本领域已存在不同的鉴别HPV类型的方法。
通过仅识别一种特定类型的PCR引物，可以对HPV DNA进行分型。该方法称作类型特异性的PCR。已经对HPV类型6，11，16，18，31 和33描述了这样的方法(Claas等，1989；Cornelissen等，1989； Falcinelli等，1992；Van den Brule等，1990；Young等，1989)。该引物分别是针对类型6，11，16，18，31和33的HPV基因组的E5，L1，E6，L1，E2 和E1区域(Baay等，1996)。
另一种方法是，通用扩增来自所有HPV类型的基因组部分，然后分别与区分致癌组和非致癌组的类型特异性探针的两种混合物杂交。已经描述了一种类似的分型方法，不需要事先扩增HPV DNA。在杂交体捕获测定中(Hybrid Capture Sharp Assay；Digene，SilverSprings， MD)，测试每个样品的″高危″HPV类型组(例如16，18，31，33，35，39， 45，51，52，56，58，59和68)和另一个″低危″HPV类型组(例如6，11，42， 43和44)(Cox等，1995)。
在CN200910156982中公开了一种HPV检测及分型方法，其采用特异性引物扩增HPVL1核酸片段；对获得的HPVL1核酸片段进行焦磷酸测序反应，将焦磷酸测序读出的序列与HPV型别序列进行比对，判断HPV分型结果。这种方法虽然特异性好、灵敏度高，但效率比较低，成本也很高。
CN201410154175提供了一种采用等温扩增和芯片毛细管检测 HPV型的方法。同时，CN201410154175还提供了一种用于检测HPV16 型的引物对。该方法基于核酸序列的等温扩增法结合芯片毛细管技术检测HPV时，扩增的特异性较高。但同样存在效率比较低，成本也很高的缺陷。另外，该发明也没有提供对多种HPV类型进行检测的方法。
在本领域仍然需要效率更高，假阳性和假阴性更低，并且能同时对多种HPV类型进行检测和分型的系统。
发明内容
本发明涉及对样品中的各种类型的HPV核酸进行检测的方法。具体的，本发明提供了基于荧光定量PCR技术的14种型别HPV病毒的核酸检测引物和探针，实现了快速和准确检测HPV病毒型别，用于HPV病毒高危型的检测，HPV病毒相关性疾病的预测及治疗监测。
具体的，本发明提供了(i)分别用以下14种HPV型别的特异性引物对和探针组合中的引物来扩增生物样品中的核苷酸片段，各型别特异性引物及探针序列如下：
HPV 16型：
上游引物16E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：1，
下游引物16E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：2，
探针16E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：3；
HPV18型：
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探针18E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：6；
HPV31型：
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探针31E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：9；
HPV35型：
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探针35E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：12；
HPV45型：
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探针45E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：15；
HPV52型：
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探针52E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：18；
HPV56型：
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HPV59型：
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探针59E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：24；
HPV66型：
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探针66E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：27；
HPV68型：
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探针68E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：30；
HPV33型：
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探针33E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：33；
HPV39型：
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HPV51型：
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探针51E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：39；
HPV58型：
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下游引物58E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：41，
探针58E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：42；
(ii)使来自步骤(i)的扩增的片段接触上述14种HPV型别基因的特异性引物对和探针组合中的探针，所述探针可识别和结合扩增产物中对应所述探针序列的片段；
(iii)检测探针与扩增产物结合的情况，判断生物样品中是否存在 HPV以及存在的HPV的型别。
在本发明的其中一个方面，其中所述探针进行了标记，可以被各种测试手段检出。例如采用同位素或荧光标记。在本发明的其中一个方面，其中所述探针为荧光探针，例如为Taqman荧光探针，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。所述方法中步骤(iii) 为检测探针释放的荧光信号，判断生物样品中是否存在HPV以及存在的HPV的型别。
在本发明的其中一个方面，所述方法可用于对生物样品进行HPV 筛查。HPV筛查可用于病理样本是否感染HPV病毒的快速检测。在筛查中，将尽可能多分型的引物探针组合在一起，对样本进行检测，只要感染其中一种及以上就可以检测出来，确认病理样本感染了HPV病毒。好的筛查方法能通过尽量少的步骤分辨是否感染以及感染哪种高危的HPV分型。
在本发明的其中一个方面，其中将所述14种HPV型别的特异性引物对和探针组合分为两组，其中第一组包括16和18两种种HPV型别的特异性引物对和探针组合，第二组包括45型、31型、39型、51型、 52型、56型、58型、59型、33型、35型、66型、68型十二种HPV 型别的特异性引物对和探针组合，然后将生物样品分别与所述两组 HPV型别基因的特异性引物对和探针的组合进行扩增和检测。
在本发明的所述方法的其中一个实例中，其中所述14种HPV型别的特异性引物对和探针组合分为以下两组：
组(1)：16型、18型特异性引物对和探针；
组(2)：45型、31型、39型、51型、52型、56型、58型、59 型、33型、35型、66型、68型特异性引物对和探针；
其中各HPV型别基因的特异性引物对和探针的序列如前所定义。
在本发明的其中一个方面，其中组(2)中还包括β-肌动蛋白(β -actin)或球蛋白(β-globin)的特异性引物对和探针。
例如，所述β-actin特异性引物对和探针可具有序列如下：
上游引物Act517-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：43，
下游引物Act517-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：44，
探针Act517-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：45。
例如，所述β-globin特异性引物对和探针可具有序列如下：
上游引物GLO06-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：46，
下游引物GLO06-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：47，
探针GLO06-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO：48。
在本发明的上述方法中，还包括对阳性对照样品和阴性对照样品的测试。在本发明的上述方法中，还可以包括对内参物的测试。内参物是指目标测试物种，例如人类，的样品中固有表达的，丰度较高的基因。在本发明中，内参物可采用β-肌动蛋白(β-actin)或球蛋白(β -globin)。
本发明还提供了对应于上述方法的试剂盒。在本发明的其中一个方面，提供了用于对生物样品中的HPV核酸进行检测的试剂盒，其中包括以下14种HPV型别的特异性引物对和探针组合，各型别特异性引物及探针序列如下：
HPV16型：
上游引物16E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：1，
下游引物16E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：2，
探针16E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：3；
HPV18型：
上游引物18E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：4，
下游引物18E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：5，
探针18E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：6；
HPV31型：
上游引物31E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：7，
下游引物31E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：8，
Taqman荧光探针31E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：9；
HPV35型：
上游引物35E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：10，
下游引物35E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：11，
探针35E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：12；
HPV45型：
上游引物45E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：13，
下游引物45E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：14，
探针45E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：15；
HPV52型：
上游引物52E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：16，
下游引物52E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：17，
探针52E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：18；
HPV56型：
上游引物56E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：19，
下游引物56E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：20，
探针56E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：21；
HPV59型：
上游引物59E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：22，
下游引物59E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：23，
探针59E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：24；
HPV66型：
上游引物66E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：25，
下游引物66E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：26，
探针66E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：27；
HPV68型：
上游引物68E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：28，
下游引物68E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：29，
探针68E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：30；
HPV33型：
上游引物33E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：31，
下游引物33E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：32，
探针33E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：33；
HPV39型：
上游引物39E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：34，
下游引物39E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：35，
探针39E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：36；
HPV51型：
上游引物51E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：37，
下游引物51E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：38，
探针51E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：39；
HPV58型：
上游引物58E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：40，
下游引物58E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：41，
探针58E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：42。
优选的，所述的试剂盒中所述探针为Taqman荧光探针，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
在本发明的其中一个方面，其中将所述14种HPV型别的特异性引物对和探针组合分为两组，其中第一组和第二组分别包括16和18两种种HPV型别的特异性引物对和探针组合，第二组包括45型、31型、 39型、51型、52型、56型、58型、59型、33型、35型、66型、68 型这十二种HPV型别的特异性引物对和探针组合，然后将生物样品分别与所述两组HPV型别基因的特异性引物对和探针的组合进行扩增和检测。优选的，其中第二组中还包括β-actin或β-globin的特异性引物对和探针。
在本发明的其中一个实例中，所述试剂盒中所述14种HPV型别的特异性引物对和探针组合分为以下两组：
组(1)：16型、18型特异性引物对和探针；
组(2)：45型、31型、39型、51型、52型、56型、58型、59 型、33型、35型、66型、68型特异性引物对和探针；
其中各HPV型别基因的特异性引物对和探针的序列如前所定义。
在本发明的其中一个方面，本发明的试剂盒中还包括对阳性对照样品和阴性对照样品的试剂，例如阳性对照样品和阴性对照样品的核苷酸片段。在本发明的其中一个方面，本发明的试剂盒中还包括内参物的核苷酸片段。
在本发明的其中一个方面，本发明的试剂盒中还包括mRNA提取试剂。在本发明的其中一个方面，本发明的试剂盒中还包括反转录试剂。
在本发明的其中一个方面，本发明的试剂盒中还包含用于实施本发明的方法的说明书。
附图说明
图1a-图1m实时荧光定量PCR检测结果。
图2a-图2b实时荧光定量PCR检测结果。
发明详述
本发明涉及对可能存在于生物样品中的任意HPV核酸进行检测的方法，所述方法包含下述步骤：使可能含有目标核酸的样品与特异性引物混合并扩增，然后将扩增产物接触至可特异性杂交的探针，然后检测发生的特异性的杂交，以确定样品中是否存在HPV核酸，以及它可能属于何种HPV类型。
优选地，本发明采用以上提到的14种HPV型别基因的特异性引物对和探针组中的引物来扩增样品中的核苷酸片段。
本发明的方法通常包含，使来自样品的核酸(可能含有HPV核酸) 与引物接触并扩增，扩增产物与探针接触，在可以杂交的反应条件下，发生探针与靶核酸的杂交，提供辨别不同HPV型别的信息。例如鉴别个体是否具有特定种类的HPV类型：例如，高危癌症类型或低危癌症类型。高危类型(总是在高度SIL[鳞状上皮内的损害]和原位癌中发现的那些)的种类包括HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，和 68。低危类型(主要在低度SIL中发现)的种类包括类型HPV 6，11，34， 40，42，43，44，53，54，70，和74。
所述特异性引物(通常是引物对，包括上游引物和下游引物)。所述引物可以特异性地杂交于HPV的特定区域并在可扩增的条件下扩增所述HPV核酸片段。
所述特异性探针能特异性地杂交于HPV的特定区域，也就是说，所述探针可识别和结合HPV亚型特异性引物以目标靶核酸为模板得到的扩增产物中对应所述探针的片段。
优选的，本发明使用的探针为Taqman荧光探针。Taqman荧光探针法是一种实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)方法，发展成熟，已经有广泛的应用。Taqman荧光探针法的探针的两端分别具有荧光报告基团和荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。在本发明的其中一个方面，所述Taqman荧光探针序列的5’端标记有荧光报告基团， 3’端标记有荧光淬灭基团。
在本发明的其中一个方面，其中所述报告基团为荧光报告基团。在本发明的其中一个方面，所述报告基团选自荧光素染料(例如FAM、JOE 和HEX)，罗丹明染料(例如R6G、TAMRA、ROX)，和花青染料(例如 Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7)。
在本发明的其中一个方面，其中所述淬灭剂选自荧光素染料(例如 FAM、JOE和HEX)，罗丹明染料(例如R6G、TAMRA、ROX)，4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1(Black Hole Quencher 1， BHQ1)、黑洞淬灭剂2(Black Hole Quencher 2，BHQ2)或黑洞淬灭剂3 (Black Hole Quencher 3，BHQ3)。
本发明公开的引物和探针可以用于定量PCR方案或定量杂交。定量PCR允许定量DNA，cDNA，或RNA模板的起始量。定量PCR可以基于荧光报道分子的检测，所述荧光报道分子随着PCR产物在每个扩增循环中的积累而增加。
本发明的方法和试剂盒中提供的引物和探针可以在有固体支持物存在下，进行探针和靶之间的杂交。可以固定探针和靶核酸中的一种或多种，例如，固定到珠子、平板、载玻片、或微量滴定板上。
本发明的方法和试剂盒中提供的引物和探针也可以在引物、探针都不固定的情况下进行检测，例如杂交可以在液体介质背景下进行。
本发明的方法和试剂盒可用于基于磁珠的检测系统。用于本发明的磁珠，例如为适用于流式细胞术分析的珠子。珠子能偶联到探针上，以检测探针和靶之间的相互作用。在一个方面，用独特的荧光分子或分子的组合标记珠子。通过使用激光激发珠子内的一种或多种荧光染料，能鉴别出在珠子上或内部的标记。结合的检测也可以在微阵列的背景下进行。这样的技术是本领域技术人员众所周知的。
本发明也涉及试剂盒，其在本发明中用于检测和/或鉴别HPV类型。试剂盒可以包含前述多组引物和探针。试剂盒可以包含关于实现上述HPV鉴别和分型分析方法的说明书，以及上面指出的引物和/或探针。
下面的定义和解释有助于更好地理解本发明。
待分析的样品中的靶材料可以是DNA或RNA，例如基因组DNA，信使RNA，病毒RNA或其扩增形式。现在已有各种提取和纯化操作，可以用于从样品分离RNA或DNA(例如Sambrook等，1989)。RNA可通过逆转录变为DNA以进行引物和探针杂交反应。
根据本发明的术语“探针”通常指单链寡核苷酸，其设计用于特异性地杂交于HPV的核酸。
术语“引物”通常指能作为合成引物延伸产物的起始位点的单链寡核苷酸序列，其与要复制的核酸链互补。优选地，引物的长度是约 10-50个核苷酸。具体长度和序列取决于需要的DNA或RNA靶的复杂性，以及使用引物的条件，例如温度和离子强度。
表述“引物对”在本发明中指一对引物，其允许扩增HPV多核酸片段的一部分或全部，探针能与所述部分结合。
本发明的探针或引物的″靶″或″靶序列″是HPV核酸的序列，探针或引物与其完全互补或部分互补(其中部分互补允许一定程度的错配)。应当理解，在有些情况下，所述靶序列的互补序列也是合适的靶序列。本发明的探针适当地至少与它们的靶序列的中央部分互补。在大多数情况下，探针与它们的靶序列完全互补。
探针与HPV多核酸区域的″特异性地杂交″，指所述探针与该区域的一部分或整个区域在使用的实验条件下形成双链体，且在这些条件下，所述探针不与待分析样品中存在的多核酸的其它区域形成双链体。应当理解，设计用于特异性地杂交于HPV多核酸区域的探针，可以完全落入所述区域内，或可以在很大程度上与所述区域重叠(即与所述区域之外和之内的核苷酸形成双链体)。
适当地，探针与核酸靶区域的特异性的杂交，发生在严格杂交条件下，例如，3XSSC，0.1％SDS，50℃。
技术人员知道如何改变温度、探针长度和盐浓度等参数，以便实现特异性的杂交。杂交和洗涤条件是众所周知的，且示例在Sambrook，等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，尤其是其中的第II章。在需要时，可以轻微修改探针的长度或序列，以维持在给定环境下需要的特异性和灵敏度。优选的严格条件适当地是允许类型特异性的探针结合仅一种HPV类型的条件。
引物与HPV多核酸区域的″特异性杂交″指，在扩增步骤中，所述引物与该区域的一部分或整个区域在使用的实验条件下形成双链体，且在这些条件下，所述引物不与待分析样品中存在的多核酸的其它区域形成双链体。
用作引物或探针的寡核苷酸也可以包含核苷酸类似物，例如，硫代磷酸酯(Matsukura等，1987)，烷基硫代磷酸酯或肽核酸(Egholm M， Buchardt O，Christensen L，Behrens C，Freier SM，Driver DA，Berg RH， Kim SK，Norden B，Nielsen PE.PNAhybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crickhydrogen-bonding rules. Nature.1993 Oct7；365(6446)：566-8)，或可以含有嵌入剂(Asseline等， 1984)。例如为锁核酸修饰或小沟结合物修饰核苷酸。随着大多数其它变异或修饰导入本发明的原始DNA序列，这些变异将需要适应使用寡核苷酸的条件，以得到要求的特异性和灵敏度。但是，杂交的最终结果基本上与用未修饰的寡核苷酸得到的结果相同。这些修饰的导入可能是有利的，以便积极地影响特性，例如，杂交动力学，杂交体形成的可逆性，寡核苷酸分子的生物稳定性，等。
“样品”可以是可能含有HPV核酸的任意材料，例如，生物材料，例如直接取自人类(或动物)，或在培养(富集)后，或可以是在宿主细胞中表达的重组HPV核酸。生物材料可以是例如尿，或来自生殖泌尿道或人或动物体的任意部分的刮片/活检物。
具体实施方式
实施例1
14种HPV型别基因的引物对和探针特异性扩增和识别
设计和合成制备得到以下14种HPV型别(HPV16型、HPV18型、 HPV31型、HPV35型、HPV45型、HPV52型、HPV56型、HPV59型、 HPV66型、HPV68型、HPV33型、HPV39型、HPV51型或HPV58型) 的特异性引物对和探针组。分别以含有人工合成的对应HPV型别的E6E7基因序列片段的标准质粒为模板，测试各HPV型别引物对和探针组对对应HPV型别的特异性扩增效果。
表1.14种HPV型别基因的特异性引物对和探针组：
说明：
HPV16型：
上游引物16E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：1，
下游引物16E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：2，
Taqman荧光探针16E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：3；
HPV18型：
上游引物18E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：4，
下游引物18E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：5，
Taqman荧光探针18E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：6；
HPV31型：
上游引物31E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：7，
下游引物31E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：8，
Taqman荧光探针31E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：9；
HPV35型：
上游引物35E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：10，
下游引物35E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：11，
Taqman荧光探针35E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：12；
HPV45型：
上游引物45E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：13，
下游引物45E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：14，
Taqman荧光探针45E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：15；
HPV52型：
上游引物52E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：16，
下游引物52E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：17，
Taqman荧光探针52E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：18；
HPV56型：
上游引物56E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：19，
下游引物56E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：20，
Taqman荧光探针56E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：21；
HPV59型：
上游引物59E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：22，
下游引物59E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：23，
Taqman荧光探针59E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：24；
HPV66型：
上游引物66E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：25，
下游引物66E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：26，
Taqman荧光探针66E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：27；
HPV68型：
上游引物68E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：28，
下游引物68E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：29，
Taqman荧光探针68E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：30；
HPV33型：
上游引物33E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：31，
下游引物33E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：32，
Taqman荧光探针33E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：33；
HPV39型：
上游引物39E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：34，
下游引物39E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：35，
Taqman荧光探针39E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：36；
HPV51型：
上游引物51E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：37，
下游引物51E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：38，
Taqman荧光探针51E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：39；
HPV58型：
上游引物58E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：40，
下游引物58E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：41，
Taqman荧光探针58E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：42。
另外设计和合成用于识别和扩增β-actin基因的特异性引物对和探针：
上游引物Act517-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：43，
下游引物Act517-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：44，
Taqman荧光探针Act517-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：45。
引物/探针 序列(5′to3′)
Act517-S1： TCACCCACACTGTGCCCATCTACGAA SEQ ID NO：43
Act517-A1： CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGGA SEQ ID NO：44
Act517-P1： ATGCCCTCCCCCATGCCAA SEQ ID NO：45
另外设计和合成用于识别和扩增β-globin基因的特异性引物对和探针：
上游引物GLO06-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：46，
下游引物GLO06-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：47，
Taqman荧光探针GLO06-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO：48
其中探针为Taqman荧光探针，其5’端用HEX或FAM报告荧光标记；3’端用BHQ1淬灭荧光标记。
使用罗氏lightCycler 480II荧光定量PCR仪进行扩增和荧光检测。
PCR反应混合物：
PCR循环设置：
95℃，10分钟，1个循环；
95℃，15秒，然后60℃，60秒，40个循环。
根据仪器和使用的荧光标记进行自动检测。其中设定在每个60℃步骤期间采集数据。
结果如图1a-1m所示。其中，图1a-1m分别显示以表1中给出的14 种HPV型别，即HPV16型、HPV18型、HPV31型、HPV35型、HPV45 型、HPV52型、HPV56型、HPV59型、HPV66型、HPV68型、HPV33 型、HPV39型、HPV51型或HPV58型，的引物对和探针组，各自在PCR 反应中与全部以下35种含有对应HPV型别的基因片段的标准质粒分别进行扩增和信号检测的结果。所述HPV型别的基因的序列在国际标准生物资料网站如http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/进行核查和验证。
14种高危型和21种低危型标准HPV质粒分别为：11、45、2、44、 73、6、51、10、53、82、16、52、13、54、85、18、56、26、 61、31、58、34、67、33、59、40、69、35、66、42、70、39、 68、43和71型HPV亚型。质粒均稀释成1×107拷贝/ul。
实验结果如图1a-图1m所示。
例如图1a为表1中HPV16型引物16E-S1和16E-A1，探针16E-P1 分别以上述35种HPV型别的标准质粒为模板进行扩增和信号检测的结果。结果显示，该HPV16型引物对和探针组能够检测到低拷贝数的HPV16 型质粒，并且只在模板为HPV16型标准质粒的反应中有明显信号，在以 11、45、2、44、73、6、51、10、53、82、52、13、54、85、18、 56、26、61、31、58、34、67、33、59、40、69、35、66、 42、70、39、68、43和71型HPV标准质粒为模板的反应中都没有明显信号。
类似的，图1b至图1m分别为表1中给出的HPV18型、HPV31型、 HPV35型、HPV45型、HPV52型、HPV56型、HPV59型、HPV66型、 HPV68型、HPV33型、HPV39型、HPV51型或HPV58型的引物对和探针组分别以前述35种HPV型别的标准质粒为模板进行扩增和信号检测的结果。结果显示，表1中给出的HPV18型、HPV31型、HPV35型、HPV45 型、HPV52型、HPV56型、HPV59型、HPV66型、HPV68型、HPV33 型、HPV39型、HPV51型或HPV58型的引物对和探针组只分别在模板为对应的HPV标准质粒的反应中有明显信号，在以其它型别的HPV标准质粒为模板的反应中都没有明显信号。
实施例2
14种HPV型别基因的引物对和探针的灵敏度测试
测试实施例1的表1中14种HPV型别的特异性引物对和探针组的灵敏度，确定最低检测模板浓度。将已知浓度的模板DNA进行10 倍的梯度稀释，通过最低有效扩增模板样本确定引物和探针的灵敏度。
以实施例1的荧光PCR反应条件使用罗氏lightCycler 480II荧光定量PCR仪进行扩增和荧光检测，以已知浓度的对应的对应HPV型别的基因片段的标准质粒进行10倍的梯度稀释后为模板进行测试。结果如下：
HPV16型：3.547×10-8ng/ul(4copy/ul)
HPV18型：3.133×10-8ng/ul(4copy/ul)
HPV31型：1.78×10-7ng/ul(20copy/ul)
HPV35型：2.785×10-7ng/ul(30copy/ul)
HPV45型：4.764×10-7ng/ul(50copy/ul)
HPV52型：2.096×10-7ng/ul(24copy/ul)
HPV56型：5.366×10-7ng/ul(60copy/ul)
HPV59型：2.829×10-8ng/ul(4copy/ul)
HPV66型：2.342×10-7ng/ul(27copy/ul)
HPV68型：2.276×10-7ng/ul(26copy/ul)
HPV33型：2.191×10-7ng/ul(25copy/ul)
HPV39型：1.78×10-8ng/ul(4copy/ul)
HPV51型：4.40×10-7ng/ul(50copy/ul)
HPV58型：1.615×10-7ng/ul(19copy/ul)
可见，本发明提供的HPV亚型的引物对和探针组合具有极高的灵敏度。
实施例3
HPV筛查试剂盒的有效性和特异性
利用本发明的方法对生物样品进行HPV筛查，其中将所述生物样品分别用以下两组HPV型别基因的特异性引物对和探针的组合进行扩增：
组(1)：16型、18型特异性引物对和探针；
组(2)：45型、31型、39型、51型、52型、56型、58型、59 型、33型、35型、66型、68型特异性引物对和探针；以及β-actin特异性引物对和探针，其序列如下：
上游引物Act517-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：43，
下游引物Act517-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：44，
Taqman荧光探针Act517-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：45。
引物/探针 序列(5′to3′)
上游引物Act517-S1： TCACCCACACTGTGCCCATCTACGAA
下游引物Act517-A1： CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGGA
Taqman荧光探针Act517-P1： ATGCCCTCCCCCATGCCAA
使用罗氏lightCycler 480II荧光定量PCR仪进行扩增和荧光检测。
PCR反应混合物：
PCR循环设置：
95℃，10分钟，1个循环；
95℃，15秒，然后60℃，60秒，40个循环。
根据仪器和使用的荧光标记进行自动检测。其中设定在每个60℃步骤期间采集数据。
各组合实验方法和结果如下。
组1：HPV 16(FAM)+HPV 18(HEX)组合
将前述表1中所述HPV 16、18的引物对和探针组混合，其中HPV 16 的探针用FAM荧光标记，HPV18分型的探针用HEX荧光标记，分别以对应各型的含有其E6E7基因序列的标准质粒为模板进行扩增和信号检测。分别在不同荧光通道进行检测以减少相互间的干扰。实验结果见图 2a-2b。
例如，图2a图中，为HPV 16亚型扩增曲线(FAM荧光检测)，为HPV18亚型的扩增曲线(HEX荧光检测)。
由图2a可以看出，HPV16(FAM)+18(HEX)组合满足了预期要求，各分型扩增曲线良好，CT值变化范围满足分型检测的需要。
组2：HPV 45(FAM)+HPV 31/33/35/39/51/52/56/58/59/66/68(HEX) +Actin(HEX)组合
将前述表1中所述HPV 18、31、33、35、39、51、52、56、58、59、66、68和Actin的引物对和探针组混合，其中HPV 18的探针用FAM 荧光标记，其它分型的探针用HEX荧光标记，分别以对应各型的含有其 E6E7基因序列的标准质粒为模板进行扩增和信号检测。Actin的探针用 HEX荧光标记。分别在不同荧光通道进行检测以减少相互间的干扰。实验结果见图2b。
图2b图中，为HPV45亚型在HPV 45(FAM)+HPV 31/33/35/39/51/52/56/58/59/66/68(HEX)+Actin(HEX)组合中的扩增曲线(FAM荧光检测)。显示的是HPV31、33、35、39、51、52、56、58、59、66、68亚型在该组合中的扩增曲线(HEX荧光检测)的叠加。显示的Actin 是在该组合中的扩增曲线(HEX荧光检测)。
图中曲线显示该组合方式可以使得其中的HPV45分型、以及HPV31、 33、35、39、51、52、56、58、59、66、68亚型和Acting都可以特异性的扩增。
而且由图2b可以看出，HPV 45(FAM)+HPV 31/33/35/39/51/52/56/58/59/66/68(HEX)+Actin(HEX)组合，能够满足各分型扩增曲线良好，CT值变化范围满足分型检测的需要。
另外，在组(2)中用下述合成的β-globin特异性引物对和探针(即上游引物GLO06-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：46，下游引物GLO06-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：47，荧光探针GLO06-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO：48)代替β-actin特异性引物对和探针，实验结果与采用β-actin特异性引物对和探针结果相似，扩增曲线良好，CT值变化范围满足分型检测的需要。
引物/探针 序列(5′to3′)
上游引物GLO06-S1： CAGGTACGGCTGTCATCACTTAGAA
下游引物GLO06-A1： CATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCTAA
Taqman荧光探针GLO06-P2： GCCCTGACTTTTATGCCCAA
结论：
本发明意外地发现，通过在荧光PCR检测反应体系中，采用本发明的方法能够非常高效和方便地检测样品中的目标核酸。本发明提供的方法克服了现有技术的检测方法的许多缺陷，获得了更大的信号动力学、更好的准确度和更好的特异性。
本发明提供的14种HPV型别基因的特异性引物对和探针全部能够准确和高效地特异性扩增样品中对应的HPV亚型的核苷酸片段。更重要的是，本发明意外地发现，在荧光PCR检测反应体系中，本发明提供的14 种HPV型别基因的特异性引物对和探针在分型的组合中，各HPV型别基因的特异性引物对和探针组能够排除其它型别引物和探针的干扰，有效地特异性地扩增样品中对应的HPV亚型的核苷酸片段，克服了现有技术中最难解决的问题，即各型别基因的特异性引物对和探针的反应受到互相干扰，导致假阳性或假阴性结果。
除非另外指出，本发明的实践将使用生物技术、有机化学、无机化学等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。本文所提到的所有专利、专利申请与科技论文均据此通过引用结合到本文。
序列表
<110> 常州金麦格生物技术有限公司
<120> HPV检测方法和试剂盒
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctcagagga ggaggatga 19
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cttccaaagt acgaatgtct acga 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccgaagcgta gagtcacaca 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccagtgccat tcgtgctga 19
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgcttaattg ctcgtgacat agaa 24
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgactccaac gacgcaga 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
accgttgtgt ccagaagaaa 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtacgaggtc ttctccaaca a 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgtcctgtcc accttccta 19
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tccagttgaa aagcaaagac aa 22
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aggacataca ccgacctga 19
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccaccgtcca ccgatga 17
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caggtcaaca ggatctaatt cattca 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
accaggcacg gcaagaa 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gctcagatga ggaggataca ga 22
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<213> 人工序列
<400> 21
gtgggcacgt tactgttaac a 21
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tacaacacgc aggtcctcta 20
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<400> 22
gctagtagta gaaacctcgc aa 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gcacacaaag gacacacaaa 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
acggattgcg agccttacaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tcagcaatac acaggaacga 20
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tacctcgctc agatggtgca 20
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ggcactgcaa ctagtagtag aa 22
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<400> 32
ggtcagttgg ttcaggatat aaatca 26
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
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<400> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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agacgaccac tacagcaaa 19
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
cgtgaccagc taccagaaa 19
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
cctcatcctc tgtaccttca ca 22
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tccatcgccg ttgctaa 17
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
caggacgcag aggagaaa 18
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
caacgcattt caattcaatt tcatga 26
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tctccaacgc ctgacacaa 19
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
tcacccacac tgtgcccatc tacgaa 26
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
cagcggaacc gctcattgcc aatgga 26
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
atgccctccc ccatgccaa 19
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
caggtacggc tgtcatcact tagaa 25
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
catggtgtct gtttgaggtt gctaa 25
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gccctgactt ttatgcccaa 20

Claims (10)

1.对生物样品中的HPV核酸进行检测的方法,所述方法包含下述步骤：
(i)分别用以下14种HPV型别的特异性引物对和探针组合中的引物来扩增生物样品中的核苷酸片段，各型别特异性引物及探针序列如下:
HPV16型：
上游引物16E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:1，
下游引物16E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:2，
探针16E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:3；
HPV18型：
上游引物18E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:4，
下游引物18E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:5，
探针18E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:6；
HPV31型：
上游引物31E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:7，
下游引物31E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:8，
探针31E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:9；
HPV35型：
上游引物35E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:10，
下游引物35E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:11，
探针35E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:12；
HPV45型：
上游引物45E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:13，
下游引物45E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:14，
探针45E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:15；
HPV52型：
上游引物52E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:16，
下游引物52E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:17，
探针52E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:18；
HPV56型：
上游引物56E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:19，
下游引物56E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:20，
探针56E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:21；
HPV59型：
上游引物59E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:22，
下游引物59E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:23，
探针59E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:24；
HPV66型：
上游引物66E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:25，
下游引物66E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:26，
探针66E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:27；
HPV68型：
上游引物68E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:28，
下游引物68E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:29，
探针68E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:30；
HPV33型：
上游引物33E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:31，
下游引物33E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:32，
探针33E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:33；
HPV39型：
上游引物39E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:34，
下游引物39E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:35，
探针39E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:36；
HPV51型：
上游引物51E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:37，
下游引物51E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:38，
探针51E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:39；
HPV58型：
上游引物58E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:40，
下游引物58E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:41，
探针58E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:42；
(ii)使来自步骤(i)的扩增的片段分别接触上述14种HPV型别基因的特异性引物对和探针组合中的探针，所述探针可识别和结合扩增产物中对应所述探针序列的片段；
(iii)检测探针与扩增产物结合的情况，判断生物样品中是否存在HPV以及存在的HPV的型别。
2.权利要求1所述的方法，其中所述探针为Taqman荧光探针，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，所述方法中步骤(iii)为检测探针释放的荧光信号，判断生物样品中是否存在HPV以及存在的HPV的型别。
3.权利要求1或2所述的方法，其中将所述14种HPV型别的特异性引物对和探针组合分为两组，其中第一组包括2种HPV型别的特异性引物对和探针组合，第二组包括其余12种HPV型别的特异性引物对和探针组合，然后将生物样品分别与所述两组HPV型别基因的特异性引物对和探针的组合进行扩增和检测，优选的，其中第二组中还包括β-肌动蛋白或β-球蛋白的特异性引物对和探针。
4.权利要求3的方法，其中所述14种HPV型别的特异性引物对和探针组合分为以下两组：
组(1)：16型、18型特异性引物对和探针；
组(2)：45型、31型、39型、51型、52型、56型、58型、59型、33型、35型、66型、68型特异性引物对和探针；
其中各HPV型别基因的特异性引物对和探针的序列如权利要求1中所定义。
5.权利要求3的方法，其中组(2)还包括β-肌动蛋白或β-球蛋白的特异性引物对和探针，
优选的，所述β-肌动蛋白特异性引物对和探针的序列如下:
上游引物Act517-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:43，
下游引物Act517-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:44，
探针Act517-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:45；
以及，所述球蛋白特异性引物对和探针的序列如下:
上游引物GLO06-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:46，
下游引物GLO06-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:47，
探针GLO06-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO:48。
6.一种用于对生物样品中的HPV核酸进行检测的试剂盒,其中包括以下14种HPV型别的特异性引物对和探针组合，各型别特异性引物及探针序列如下:
HPV16型：
上游引物16E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:1，
下游引物16E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:2，
探针16E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:3；
HPV18型：
上游引物18E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:4，
下游引物18E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:5，
探针18E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:6；
HPV31型：
上游引物31E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:7，
下游引物31E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:8，
Taqman荧光探针31E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:9；
HPV35型：
上游引物35E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:10，
下游引物35E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:11，
探针35E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:12；
HPV45型：
上游引物45E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:13，
下游引物45E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:14，
探针45E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:15；
HPV52型：
上游引物52E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:16，
下游引物52E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:17，
探针52E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:18；
HPV56型：
上游引物56E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:19，
下游引物56E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:20，
探针56E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:21；
HPV59型：
上游引物59E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:22，
下游引物59E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:23，
探针59E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:24；
HPV66型：
上游引物66E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:25，
下游引物66E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:26，
探针66E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:27；
HPV68型：
上游引物68E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:28，
下游引物68E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:29，
探针68E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:30；
HPV33型：
上游引物33E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:31，
下游引物33E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:32，
探针33E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:33；
HPV39型：
上游引物39E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:34，
下游引物39E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:35，
探针39E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:36；
HPV51型：
上游引物51E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:37，
下游引物51E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:38，
探针51E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:39；
HPV58型：
上游引物58E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:40，
下游引物58E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:41，
探针58E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:42。
7.权利要求6所述的试剂盒，其中所述探针为Taqman荧光探针，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
8.权利要求7的试剂盒，其中所述14种HPV型别的特异性引物对和探针组合分为两组，其中第一组包括2种HPV型别的特异性引物对和探针组合，第二组包括其余12种HPV型别的特异性引物对和探针组合，然后将生物样品分别与所述两组HPV型别基因的特异性引物对和探针的组合进行扩增和检测，优选的，其中第二组中还包括β-肌动蛋白或β-球蛋白的特异性引物对和探针。
9.权利要求8的试剂盒，其中所述14种HPV型别的特异性引物对和探针组合分为以下两组：
组(1)：16型、18型特异性引物对和探针；
组(2)：45型、31型、39型、51型、52型、56型、58型、59型、33型、35型、66型、68型特异性引物对和探针；
其中各HPV型别基因的特异性引物对和探针的序列如权利要求1中所定义。
10.权利要求9的试剂盒，其中组(2)还包括β-肌动蛋白或β-球蛋白的特异性引物对和探针，
优选的，所述β-肌动蛋白特异性引物对和探针的序列如下:
上游引物Act517-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:43，
下游引物Act517-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:44，
探针Act517-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO:45；
以及，所述球蛋白特异性引物对和探针的序列如下:
上游引物GLO06-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO:46，
下游引物GLO06-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO:47，
探针GLO06-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO:48。
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