CN103710460A - 定量检测egfr基因突变的试剂盒及其用途 - Google Patents

定量检测egfr基因突变的试剂盒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高灵敏度定量检测EGFR基因突变的试剂盒及其用途。针对待测基因模板，分别设计特异性扩增基因突变位点区域50-100bp长度序列的前引物和后引物，将突变位点设计于前引物相应位置，并在突变位点附近设计了竞争性抑制非突变扩增的Block寡聚核苷酸；利用特异性针对扩增产物的探针进行检测，通过检测探针上可检测标记，获得基因突变情况。本发明提供了一种结果稳定、灵敏度高、重复性好的基因突变分析方法。

Description

定量检测EGFR基因突变的试剂盒及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种高灵敏度定量检测EGFR基因突变的试剂盒及其用途。
背景技术
肺癌是常见的恶性肿瘤之一，因其五年的存活率只有15%。肺癌主要分两种类型：一类是非小细胞肺癌，另一类是小细胞肺癌。非小细胞肺癌(Non-smallcell lung cancer，NSCLC)占肺癌的75-80%。大部分中晚期NSCLC患者，采用全身化学药物治疗。而一些早期NSCLC患者可以采用手术或者局部放化疗进行治疗。然而传统的化疗方案在中晚期NSCLC治疗中的疗效并不令人满意，且化疗的不良反应大，患者难以耐受。因此新的治疗方法急需开展。随着生物技术的发展，靶向抗肿瘤药物倍受关注。这些药物针对性强，能特异性地杀伤肿瘤细胞。其中，表皮生长因子受体(EGFR)是目前肿瘤靶向治疗，尤其是NSCLC治疗的重要靶点。
临床上通常采用小分子EGFR细胞内酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growthfactor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)来选择性抑制细胞内酪氨酸激酶的活化，中断其下游的信号转导，从而阻止肿瘤进展。EGFR-TKI靶向治疗药物代表有吉非替尼(Gefitinib，商品名为Iressa)和埃罗替尼(Erlotinib，商品名为Tarceva)。然而，在Gefitinib和Erlotinib的临床试验和临床应用过程中，并不是所有的患者都受益，只有部分患者疗效显著。2004年，科学家发现了肺癌的EGFR基因突变，并且某些突变与Gefitinib和Erlotinib药物的疗效相关。香港中文大学的莫树锦领导的IPASS研究以及同济大学的周彩存教授牵头的OPTIMAL研究显示在EGFR敏感突变阳性的患者中，一线使用TKI药物比传统化疗的患者无进展生存期(Progression Free Survival，PFS)显著延长，表明在NSCLC患者的用药治疗选择上，EGFR基因是否发生突变是一个重要的预测因子。
EGFR基因突变常集中在细胞内的酪氨酸激酶区域，突变率最高的是19外显子的2种缺失突变(E746_A750del)和21外显子的点突变(L858R)，前期研究显示二者在所有EGFR基因突变中的比例占90%以上。这二者均属于敏感突变，意味着TKI药物的有效性。另外，临床上对于TKI药物有效的患者，在用药后期均会产生耐药性，研究显示，其中50%患者是在19外显子缺失或L858R等的敏感性突变的基础上，又发生了第20外显子790位密码子的突变(T790M)，因此在临床用药选择时，除敏感突变外，T790M耐药基因的检测也同样重要。
目前常用的EGFR基因突变检测方法有测序法和ARMS-PCR方法，这两种方法均为定性检测，存在一定的缺陷。测序法灵敏度较低约20%，且操作复杂，检测时间较长，假阴性率较高。ARMS-PCR方法能够达到1%的灵敏度，对于肿瘤组织样本能够满足检测需求，但是对于取样方便的血液样本，如血浆或者血液中的循环肿瘤细胞，肿瘤DNA含量往往低于1%，ARMS-PCR方法不足以对血液进行检测。另外，最新研究表明，EGFR基因敏感突变的比例与靶向药物疗效关系密切，对于EGFR敏感突变比例较低的患者服用靶向药，药物的有效率会显著降低，与未发生突变的人群类似。测序法和ARMS-PCR方法均为定性检测，无法给出患者肿瘤组织中EGFR基因突变的比例，不足以判断突变弱阳性患者是否能受益于TKI治疗。
传统的定性检测仅能给出基因有无突变的信息，而无法判断肿瘤的敏感突变比例，并且无法对血液样本进行有效的检测，局限了临床医生对靶向药物疗效的判断。此外，在临床用药过程中产生的耐药性突变，以前的方法由于灵敏度不够也无法进行检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高灵敏度定量检测EGFR基因突变的试剂盒及其用途。
在本发明的第一方面，提供一种检测(较佳地为定量检测)基因突变的试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)特异性扩增基因突变位点区域的前引物和后引物，所述的前引物和后引物扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50-100bp(较佳地60-80bp)；前引物与突变型基因位点及附近序列完全互补，长度为10-20bp(较佳地12-18bp；更佳地12-16bp)；和
(2)特异性针对扩增产物的探针，所述的探针携带可检测标记。
在一个优选例中，当EGFR基因突变为点突变时，所述的试剂盒中还包括：(3)靶向点基因突变位点对应的野生型位点的竞争性Block寡聚核苷酸，其与野生型基因完全互补，而与突变基因部分互补；较佳的，所述的Block寡聚核苷酸是硫代修饰的。
在另一优选例中，靶向基因突变位点对应的野生型位点的竞争性Block寡聚核苷酸中，突变位点位于中间。
在另一优选例中，所述的试剂盒定量检测EGFR基因突变，包括：
(a)组试剂：检测EGFR第21外显子的点突变(L858R，即第858位氨基酸由L突变为R)：前引物SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10，后引物SEQ ID NO:12，探针SEQ ID NO:13，Block寡聚核苷酸SEQ ID NO:15；
(b)组试剂：检测EGFR第20外显子790位的点突变(T790M，即第790位氨基酸由T突变为M)：前引物SEQ ID NO:23，后引物SEQ ID NO:24，探针SEQ ID NO:25，Block寡聚核苷酸SEQ ID NO:27；
(c)组试剂：检测EGFR第19外显子缺失突变(E746_A750del-1，即第746-750位氨基酸缺失)：前引物SEQ ID NO:30，后引物SEQ ID NO:31，探针SEQ IDNO:32；
(d)组试剂：检测EGFR第19外显子缺失突变(E746_A750del-2，即第746-750位氨基酸缺失)：前引物SEQ ID NO:33，后引物SEQ ID NO:34，探针SEQ ID NO:32；和
(e)组试剂：检测EGFR保守区域拷贝数：前引物SEQ ID NO:3，后引物SEQ ID NO:4，探针SEQ ID NO:5；
较佳地，所述的Block寡聚核苷酸是硫代修饰的。
在另一优选例中，(a)组试剂中，前引物浓度500±200nM，后引物浓度500±200nM(较佳地500±100nM)，探针浓度100±40nM(较佳地100±20nM)，Block寡聚核苷酸浓度1500±600nM(较佳地1500±300nM)；
(b)组试剂中，前引物浓度500±200nM(较佳地500±100nM)，后引物浓度500±200nM，探针浓度100±40nM(较佳地100±20nM)，Block寡聚核苷酸浓度1500±600nM(较佳地1500±300nM)；
(c)组试剂中，前引物浓度500±200nM(较佳地500±100nM)，后引物浓度500±200nM，探针浓度100±40nM(较佳地100±20nM)；
(d)组试剂中，前引物浓度500±200nM(较佳地500±100nM)，后引物浓度500±200nM，探针浓度100±40nM(较佳地100±20nM)；或
(e)组试剂中，前引物浓度500±200nM(较佳地500±100nM)，后引物浓度500±200nM，探针浓度100±40nM(较佳地100±20nM)。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括(但不限于)：Taq DNA聚合酶，镁离子，dNTP，扩增缓冲液，梯度校准品(标准品)。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有说明试剂盒使用方法的使用说明书和/或标准操作程序。
在另一优选例中，每一组所述前引物、后引物、探针、Block寡聚核苷酸分别与所述Taq DNA聚合酶，镁离子，dNTP混合于一个体系中；或
所述的梯度校准品与所述前引物、后引物、探针、Block寡聚核苷酸及TaqDNA聚合酶，镁离子，dNTP混合于一个体系中。
在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于检测(较佳地为非诊断目的的检测)基因突变。
在本发明的另一方面，提供一种检测(较佳地为定量检测)基因突变的方法(较佳地，所述方法是非诊断目的的方法)，所述方法包括：
(i)以待测基因为模板，以权利要求1-7任一所述的试剂盒中的试剂进行PCR扩增；
(ii)分析PCR扩增产物，确定待测样品中待测基因的突变类型。
在另一优选例中，所述的试剂盒定量检测EGFR基因突变；并且，步骤(ii)包括：
(S1)利用(a)、(b)、(c)和(d)组试剂分别检测第21外显子的点突变(L858R)拷贝数、第20外显子790位的点突变(T790M)拷贝数、第19外显子缺失突变(E746_A750del-1)和第19外显子缺失突变(E746_A750del-2)拷贝数；
(S2)利用(e)组试剂检测EGFR保守区域拷贝数：
(S3)将(S1)获得的各组突变拷贝数与(S2)中获得的保守区域拷贝数比较，获得EGFR基因各突变位点的突变比例。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、野生型克隆(T-exon4、T-exon19、T-exon20-21)以及突变型克隆(T-E746_A750del-1、T-E746_A750del-2、T-T790M、T-L858R)的构建方法。
图2、以EGFR基因保守区域4号外显子检测为例，考察不同扩增子长度对于临床检测的影响。
图3、以L858R检测为例，考察Block寡聚核苷酸的长度对于突变检测分辨能力的影响。
图4、针对各突变位点，定量PCR扩增检测，考察定量曲线的性能。
图5、针对各突变位点，应用本发明的PCR反应体系的最低检测限测定。
图6、以L858R突变检测为例，考察样本中DNA总量对于突变检测的影响。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，开发了一种测定基因突变的新方法。针对待测基因模板，分别设计特异性扩增基因突变位点区域50-100bp长度序列的前引物和后引物，将突变位点设计于前引物相应位置，利用特异性针对扩增产物的探针进行检测，通过检测探针上可检测标记，获得基因突变情况。本发明提供了一种结果稳定、灵敏度高、重复性好的基因突变分析方法。
如本文所用，所述的“前引物”与“正向引物”可互换使用，是指针对突变位点的引物，所述前引物3’末端碱基或距离3’末端碱基1-3个碱基位置对应于突变位点，所述前引物与突变型模板完全匹配。
如本文所用，所述的“后引物”与“反向引物”可互换使用。
如本文所用，碱基的“匹配”、“配对”或“完全互补”是指两条核苷酸序列中相应的碱基构成了键(如氢键)的连接，例如“A”与“T”之间可形成键。两条序列之间的“部分互补”是指两条序列存在至少一对碱基不匹配。
本发明人基于实时定量PCR平台，结合了高分辨引物，竞争性Block寡聚核苷酸和荧光特异探针三种技术，用于定量检测EGFR基因药物敏感突变。
所述的高分辨引物可对突变靶序列进行高保真扩增放大。血液样本也是一种比较理想的临床样本来源。然而，研究显示，从FFPE样本、血浆样本中抽提得到的基因组DNA都是片段化的，大部分小于300bp，片段化的DNA对于后续的基于PCR技术的检测带来一定的难度。经过深入的研究，本发明人发现扩增子越小检测越准确，结合考虑后续检测需要，本发明人优化了引物的设计方案，将前引物与后引物的扩增产物的长度控制在50-100bp；较佳地60-80bp。
同时，本发明人还考察了不同长度的前引物对于突变基因与野生基因的分辨能力，结果发现引物越长分辨能力越差，越短分辨能力越强；随着引物长度的缩短，扩增效率会降低。因此，本发明人优化了前引物的长度，长度为10-18bp；较佳地12-18bp；更佳地12-16bp。
针对EGFR基因的L858R、T790M突变位点，本发明人分别设计了竞争性Block寡聚核苷酸。所述的竞争性Block寡聚核苷酸可以有效地抑制野生型拷贝的扩增。Block寡聚核苷酸与野生型基因完全互补，而与突变基因部分互补，在有野生型基因存在的情况下，Block寡聚核苷酸能够封闭野生型基因，防止野生型基因的扩增造成假阳性，因此可以提高检测的的灵敏度。
所述的探针可对扩增产物进行特异性检测。较佳地，所述的探针是带有可检测标记的探针，如荧光探针。例如，所述的探针是Taqman MGB探针，从而便于实时荧光检测。TaqMan探针法的核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。TaqMan MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB(Minor GrooveBinder)修饰基团。
利用本发明的试剂盒或方法，对DNA样品中EGFR突变的检测灵敏度可达到0.01%，可以适用于绝大多数的复杂样本，包括血液标本，FFPE样本；并可用于血液样本耐药基因的跟踪检测，及时的做出用药调整。另外，该试剂盒使用校准曲线对四种最常见EGFR突变和EGFR基因的拷贝数进行绝对定量检测，并可计算突变基因所占比例，可以为医生提供更详细的信息，从而作出更准确的用药指导。
作为本发明的优选实施方式，所述的试剂盒用于EGFR突变检测，其内包含有待加入检测样品的5种预混PCR体系和对应的校准曲线PCR体系。校准曲线PCR体系无需混合，可直接上机运行。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料及仪器
定量PCR检测试剂Realtime PCR Master Mix购自日本TOYOBO公司。组织基因组抽提试剂盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit购自QIAGEN China(shanghai)Co.，Ltd.，血浆基因组抽提试剂盒High Pure PCR Template PreparetionKit购自罗氏诊断产品(上海)有限公司。定量PCR仪为Applied Biosystems的7300realtime PCR system。PCR所用引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司，Taqman MGB探针购自Life Technologies公司。H1650细胞株购自中科院上海细胞库，其余试剂均从Sigma Aldrich购买。
引物及质粒的构建
Oligo DNA序列见表1、表2、表3。
表1、野生型克隆构建引物列表
表2、突变型克隆构建引物列表
Figure BDA0000458220080000072
表3、PCR所用引物、Taqman MGB探针与Block寡聚核苷酸序列
Figure BDA0000458220080000073
Figure BDA0000458220080000081
注：引物名称中，首字母F表示正向引物，首字母R表示反向引物，首字母B表示Block寡聚核苷酸，首字母P表示MGB探针。
野生型质粒(T-exon4、T-exon19、T-exon20-21)以及突变型质粒(T-E746_A750del-1、T-E746_A750del-2、T-T790M、T-L858R)的构建方法见图1。
以EGFR基因21外显子的野生型质粒和突变型质粒构建为例，构建方法如下：取健康人抗凝血200微升，用全血基因组抽提试剂盒(QIAamp DNA bloodMini Kit)抽提得到基因组，用表1中对应的扩增引物(F-EX20-21和R-EX20-21)进行扩增，扩增产物与pMD18-T Vector连接，再将连接产物加入到100微升的DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟，加入500微升SOC培养基，37℃培养箱中，培养60分钟，培养结束后，将培养液涂布在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上过夜培养，形成单菌落。挑选白色菌落，进行测序验证，测序结果证明已成功构建包含野生型EGFR基因20、21外显子的质粒(称为野生型质粒)，并命名为T-exon20-21。
突变型质粒T-L858R构建方法如下：以野生型质粒T-exon20-21为模板，用表2中对应的扩增引物(F-L858R和R-L858R)进行扩增将扩增产物用Dpn I酶消化2小时后，胶回收酶切产物，再将回收产物加入到100微升的DH5α感受态细胞中，与pMD18-T Vector进行连接，后续方法同上，经测序验证，命名为T-L858R。
其他野生型质粒(T-exon4、T-exon19)及突变型质粒(T-E746_A750del-1、T-E746_A750del-2、T-T790M)的构建方法与T-exon20-21和T-L858R相同，不同点在于引物的不同，应用表1和表2中相应的引物。
实施例1、扩增片段长度的选择
甲醛固定、石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织样本，因其比较容易长期保存，往往作为研究的首选标本。除此之外，研究显示肿瘤患者血浆中DNA含量显著高于正常健康人血液样本，且血浆、血清等临床中较容易获得，对患者创伤小，因此血液样本也是一种比较理想的临床样本来源。然而，研究显示，从FFPE样本、血浆样本中抽提得到的基因组DNA都是片段化的，大部分小于200bp。片段化的DNA对于后续的基于PCR技术的检测带来一定的难度。
以EGFR基因4号外显子检测为例，为考察从FFPE样本、血浆样本中抽提的DNA片段化的影响，本发明人设计3套扩增体系(三种正向引物，反向引物和探针相同)，如表4所示。
表4
3套扩增体系扩增子长度分别为164bp、108bp和78bp，用3套扩增体系对以下样本进行定量检测：一份H1650细胞株DNA、2份临床血浆DNA、4份临床FFPE组织DNA样本。
扩增反应的条件如表5。
表5、扩增反应体系
组份 用量
Realtime PCR Master Mix 12.5ul
扩增引物 300nM
探针 100nM
扩增模板 2.5ul
反应程序如表6。
表6
步骤 循环数 温度 时间
1 1 95℃ 2min
2 50 95℃ 10sec
3 50 61℃ 30sec
检测扩增产物的拷贝数。结果如表7和图2。
表7
Figure BDA0000458220080000101
结果显示，采用3套检测体系，对于不同的样本类型，有不同的结果。H1650细胞株DNA的检测结果没有明显差异，是因为细胞株可以抽提到比较完整的、较长片段的基因组DNA。对于血浆和FFPE样本，78bp扩增体系的检测结果明显高于108bp和164bp的扩增体系，验证了血浆和FFPE样本中DNA片段化的问题。由此可见，扩增子越小检测越准确，由于探针法定量PCR除了两条引物外，还需设计一条探针，最短扩增子需要在50个碱基左右，因此针对血浆和FFPE样本的检测，最佳的扩增子长度在60至80个碱基之间。
实施例2、扩增引物长度的选择
本实施例中以EGFR基因的L858R突变检测为例，应用突变质粒T-L858R；野生质粒T-exon20-21作为模板。
本方法所涉及的扩增检测引物中，本发明人将检测位点设计于前引物上，因此前引物是区分突变型与野生型基因的关键。本发明人设计了不同长度的扩增检测前引物，并将前引物中的最后一个碱基设计在L858R的碱基突变位点，考察不同长度的前引物对于突变基因与野生基因的分辨能力。以EGFR基因的L858R突变检测为例，不同长度的前引物序列如表8，应用的后引物是R858，应用的探针是P858。分别对1.0×105拷贝的突变型质粒和野生型质粒进行实时荧光PCR检测，计算两者CT的差值，△CT=CT野生型–CT突变型。
表8
引物名称 引物序列(5’-3’) 长度
F-858-1 AAGATCACAGATTTTGGGCG 20
F-858-2 GATCACAGATTTTGGGCG 18
F-858-3 TCACAGATTTTGGGCG 16
F-858-4 ACAGATTTTGGGCG 14
F-858-5 AGATTTTGGGCG 12
F-858-6 ATTTTGGGCG 10
扩增反应体系和反应程序同实施例1。结果如表9。
表9
结果显示，当前引物长度大于10bp时，前引物越短，△CT越大，分辨能力越好。但是随着前引物长度的缩短，扩增效率也会降低，当引物长度小于等于10bp时，随着前引物长度的缩短，扩增效率也会降低，分辨能力变差。因此，合适的前引物长度在10～18bp之间，较佳的为12～16之间。
实施例3、竞争性Block寡聚核苷酸的作用
本实施例中应用模板：突变型质粒：T-T790M、T-L858R；野生型质粒：T-exon20-21。
本实施例中应用的引物是针对L858R的F-858-5及R-858，探针是P-858；针对T790M的引物F-790及R-790，探针P-790。
针对EGFR基因的L858R、T790M突变位点，本发明人分别设计了竞争性Block寡聚核苷酸B-858-1和B-790-1(表3)，Block寡聚核苷酸与野生型基因完全互补，而与突变基因部分互补，在有野生型基因存在的情况下，Block寡聚核苷酸能够封闭野生型基因，防止野生型基因的扩增造成假阳性，因此可以提高检测的特异性。选择突变质粒与野生型质粒进行对照，进行PCR扩增检测，其中试验组中加入竞争性Block寡聚核苷酸，对照组不加竞争性Block寡聚核苷酸，用以考察Block寡聚核苷酸的作用。反应体系如表9。
表9
Figure BDA0000458220080000121
反应程序如表10。
表10
步骤 循环数 温度 时间
1 1 95℃ 2min
2 50 95℃ 10sec
3 50 61℃ 30sec
在步骤3中61℃退火时检测荧光信号，检测荧光选择FAM与ROX。
结果如表11、表12。
表11、L858R位点Block效果
Figure BDA0000458220080000131
表12、T790M位点Block效果
Figure BDA0000458220080000132
结果表明，针对L858R的突变检测，在加入竞争性Block寡聚核苷酸后，△CT由12.6增加到14.9；针对T790M的突变检测，在加入竞争性Block寡聚核苷酸后，△CT由17.9增加到19.0，由此可见在有野生型背景存在的情况下，加入竞争性Block寡聚核苷酸能够提高突变检测的特异性。
实施例4、硫代修饰对Block寡聚核苷酸的影响
发明人比较了硫代修饰的Block寡聚核苷酸与未修饰的Block寡聚核苷酸对突变检测分辨能力的影响。
本实施例中应用模板、引物、探针、反应体系和反应条件都与实施例3相同；所用的Block寡聚核苷酸包括了Block寡聚核苷酸(B-858-1和B-790-1)和硫代修饰的Block寡聚核苷酸(B-858-2和B-790-2)。PCR扩增结果如表13-14。
表13、L858R位点Block效果
表14、T790M位点Block效果
结果表明，无论是针对L858R的突变检测，还是针对T790M的突变检测，硫代修饰的Block寡聚核苷酸的抑制效果都优于未修饰的Block寡聚核苷酸。因此在后续的实施例中使用硫代修饰的Block寡聚核苷酸。
实施例5、竞争性Block寡聚核苷酸位置的选择
本实施例中应用模板：突变型质粒：T-T790M、T-L858R；野生型质粒：T-exon20-21。
本实施例中应用引物是针对L858R的F858-5及R858；针对T790M的F790及R790。
设计相同长度的Block寡聚核苷酸，将突变位点所在位置对应碱基设计到靠近Block寡聚核苷酸的5’端、Block寡聚核苷酸的中间位置以及Block寡聚核苷酸的3’端(见表15、表16)，以考察Block寡聚核苷酸位置的效果。
表15、Block858寡聚核苷酸
Block858ID 序列(5’-3’) 位置
B-858-2 TTTTGGGCGGGCCAAAC 中间’
B-858-3 GGCGGGCCAAACTGCTG 5’端
B-858-4 ACAGATTTTGGGCGGGC 3’端
表16、Block790寡聚核苷酸
Block790ID 序列(5’-3’) 位置
B-790-2 GCTCATCACGCAGCTCA 中间’
B-790-3 ATCACGCAGCTCATGCC 5’端
B-790-4 TGCAGCTCATCACGCAG 3’端
Realtime PCR方法同实施例3。
结果如表17、表18。
表17、Block858序列位置效果比较
Figure BDA0000458220080000141
表18、Block790序列位置效果比较
两个突变检测结果均表明，将突变位点设计在Block寡聚核苷酸的中间位置能够最大限度的降低野生型基因的背景信号，从而提高了检测的特异性。
实施例6、竞争性Block寡聚核苷酸长度的选择
本实施例中应用模板：突变型质粒：T-L858R；野生型质粒：T-exon20-21。本实施例中应用引物是针对L858R的F-858-5及R-858。
设计不同长度的Block寡聚核苷酸，将突变位点均设计在中间位置，以考察Block寡聚核苷酸长度对于突变检测分辨能力的影响。以L858R检测为例，Block寡聚核苷酸设计如表19。
表19
Block名称 序列(5’-3’) 长度
B-858-2 TTTTGGGCGGGCCAAAC 17
B-858-5 TTGGGCGGGCCAA 13
B-858-6 TTTGGGCGGGCCAAA 15
B-858-7 ATTTTGGGCGGGCCAAACT 19
B-858-8 GATTTTGGGCGGGCCAAACTG 21
B-858-9 AGATTTTGGGCGGGCCAAACTGC 23
Realtime PCR方法同实施例3。
结果如图3。结果显示，Block寡聚核苷酸的长度对于突变检测分辨能力有一定的影响，以L858R检测为例，较佳的Block寡聚核苷酸长度为15-19nt。
实施例7、定量曲线
本实施例中应用模板质粒及与其对应的扩增引物、探针和Block寡聚核苷酸如表所示。Realtime PCR方法同实施例3。结果如表20。
表20
应用模板质粒 前引物 后引物 探针 Block寡聚核苷酸
T-exon4 F-ex4-3 R-ex4 P-ex4 /
T-L858R F-858-5 R-858 P-858 B-858-2
T-T790M F-790 R-790 P-790 B-790-2
T-E746_A750del-1 F-DEL1 R-DEL1 P-DEL1/2 /
T-E746_A750del-2 F-DEL2 R-DEL2 P-DEL1/2 /
将模板质粒转化大肠杆菌DH5α，构建EGFR基因4个突变位点(L858R、T790M、2235_2249del15、2236_2250del15)以及EGFR基因4号外显子的克隆，提取质粒，经紫外定量，分别稀释至1.0*105、1.0*104、1.0*103、1.0*102、1.0*101拷贝/ul，作为定量检测的校准品，向PCR反应体系中加入2ul校准品，按上述反应程序，进行定量PCR扩增检测，以考察定量曲线的性能。结果如图4。所有定量曲线的R2都大于0.99，显示了良好的定量线形关系，证明了定量范围在20-200000拷贝。
实施例8、最低检测限
本实施例中应用模板质粒及与其对应的扩增引物、探针和Block寡聚核苷酸同实施例7。Realtime PCR方法同实施例3
在PCR反应体系中加入梯度模板，拷贝数分别为20000、2000、200、100、40、10、5、2个拷贝，每个梯度作6个复孔，进行荧光PCR检测，计算其CT值变异系数，以评估最低检测限。
对应四种突变检测的结果如图5。在四个突变体系中，模板浓度低至2拷贝/反应，6个复孔均能被有效的检测到，且CT值的变异系数均小于5%，认定最低检测限为2拷贝。
实施例9、灵敏度
本实施例中应用模板质粒及与其对应的扩增引物、探针和Block寡聚核苷酸同实施例7。Realtime PCR方法同实施例3
将突变型质粒梯度掺入到2.0×106拷贝的野生型质粒中(掺入比例如表19)，进行荧光定量PCR检测，考察突变检测体系的灵敏度。
结果如表21-23。
表21
Figure BDA0000458220080000171
表22
Figure BDA0000458220080000172
表23
四个突变检测体系中，L858R和T790M位点突变比例在0.01%时与野生型质粒仍有较好的区分度，19号外显子的两个缺失突变E746-A750del-1(缺失2235-2249共15个碱基)和E746-A750(缺失2236-2250共15个碱基)的突变比例在0.001%时与野生型质粒也有较好的区分度。
实施例10、预混体系验证
以EGFR基因EXON4位点和突变位点L858R为例，本实施例中应用模板、引物、探针和Block寡聚核苷酸如下表24所示。Realtime PCR方法同实施例3。
表24
应用模板质粒 前引物 后引物 探针 Block寡聚核苷酸
T-exon4 F-ex4-3 R-ex4 P-ex4 /
T-L858R F-858-5 R-858 P-858 B-858-2
为了增加PCR检测的便利性，本发明人将反应体系中所需的各种试剂，如Taq酶，镁离子，dNTP、PCR扩增引物、TaqMan MGB探针以及Block寡聚核苷酸提前预混并分装到PCR反应条中，放置于-20℃冰箱保存，3个月和6个月后取出，加入模板与新配制的反应液作对比检测，考察反应液预混方式的可行性。结果如表25、26所示。
表25：EXON4预混体系稳定性检测
Figure BDA0000458220080000181
表26：L858R突变检测预混体系稳定性检测
Figure BDA0000458220080000182
实验结果表明，采用预混分装PCR反应体系与新配制反应体系在检测时没有明显差别，增加了检测操作的便利性。
实施例11、PCR体系中无关DNA对突变检测的影响
以L858R突变检测为例，本实施例中应用模板：突变型质粒：T-L858R；野生型质粒：T-exon20-21。
本实施例中应用引物是针对L858R突变的F-858-5和R-858，检测用探针是P-858，Block寡聚核苷酸是B-858-2。
将100拷贝的突变质粒掺入到0、5000、10000、20000、50000、100000拷贝的野生型质粒中，进行PCR检测，以考察PCR上样量对于突变检测的影响。
以L858R突变检测为例，结果如图6。实验结果显示，在检测体系中野生型基因超过50000拷贝时，对定量检测有较大的影响，因此上样量不宜超过50000拷贝，以基因组3.3pg/拷贝计算，即基因组DNA上样量不宜超过165ng。
实施例12、配对组织与血浆样本的检测
本试剂盒针对EGFR基因19外显子的两个重要缺失突变(2235_2249del15和2236_2250del15)、20外显子的T790M突变(2369>T)、21外显子的L858R(2573T>G)进行检测，同时对第4外显子的保守区域进行检测，用第4外显子的保守区域的拷贝数来代表EGFR总基因拷贝，从而计算突变基因所占比例。本实施例中应用模板质粒及与其对应的扩增引物、探针和Block寡聚核苷酸同实施例7。Realtime PCR方法同实施例3。
制备试剂盒，其中包括：10条已预先灌注过反应液的八联PCR管，其中5条是校准品反应管，校准品反应管中已加入反应所需的所有试剂，包括热启动Taq酶、dNTP、镁离子、扩增引物、检测探针、以及梯度校准品，反应时直接上机，无需开盖。另外5条为样品检测管，样品检测管中已加入反应所需的所有试剂，包括热启动Taq酶、dNTP、镁离子、扩增引物、检测探针、封闭序列(如有)，体积为23微升，检测时只需向其中加入2微升待测模板即可。试剂盒中引物、封闭序列、探针的浓度见表27。
表27、各检测体系组成成份浓度列表
Figure BDA0000458220080000191
Figure BDA0000458220080000201
17例FFPE组织及血浆样本收集于上海市肺科医院2012年9月至2013年8月期间的住院肺癌患者，FFPE组织样本和血浆样本分别用QIAamp DNAFFPE Tissue Kit和High Pure PCR Template Preparetion Kit进行基因组抽提，组织样本DNA用紫外定量并稀释至试剂盒要求的浓度范围内，血浆样本DNA无需稀释，将二种样本的DNA用本发明的试剂盒进行定量检测，并计算其符合率。结果如表23。
表23
Figure BDA0000458220080000202
试剂盒在配对样本中检测的符合率为88.2%(15/17)，经配对卡方检验，P>0.05，说明本发明的试剂盒在组织与配对血浆样本检测中有较好的符合率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure IDA0000458220140000011
Figure IDA0000458220140000021
Figure IDA0000458220140000031
Figure IDA0000458220140000041
Figure IDA0000458220140000061
Figure IDA0000458220140000071

Claims (10)

1.一种检测基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
(1)特异性扩增基因突变位点区域的前引物和后引物，所述的前引物和后引物扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50-100bp；前引物与突变型基因位点及附近序列完全互补，长度为10-20bp；和
(2)特异性针对扩增产物的探针，所述的探针携带可检测标记。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，当EGFR基因突变为点突变时，所述的试剂盒中还包括：
(3)靶向点基因突变位点对应的野生型位点的竞争性Block寡聚核苷酸，其与野生型基因完全互补，而与突变基因部分互补；较佳的，所述的Block寡聚核苷酸是硫代修饰的。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，靶向基因突变位点对应的野生型位点的竞争性Block寡聚核苷酸中，突变位点位于中间。
4.如权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒定量检测EGFR基因突变，包括：
(a)组试剂：检测EGFR第21外显子的点突变：前引物SEQ ID NO:9或SEQID NO:10，后引物SEQ ID NO:12，探针SEQ ID NO:13，Block寡聚核苷酸SEQ ID NO:15；
(b)组试剂：检测EGFR第20外显子790位的点突变：前引物SEQ ID NO:23，后引物SEQ ID NO:24，探针SEQ ID NO:25，Block寡聚核苷酸SEQ ID NO:27；
(c)组试剂：检测EGFR第19外显子缺失突变：前引物SEQ ID NO:30，后引物SEQ ID NO:31，探针SEQ ID NO:32；
(d)组试剂：检测EGFR第19外显子缺失突变：前引物SEQ ID NO:33，后引物SEQ ID NO:34，探针SEQ ID NO:32；和
(e)组试剂：检测EGFR保守区域拷贝数：前引物SEQ ID NO:3，后引物SEQ ID NO:4，探针SEQ ID NO:5；
较佳地，所述的Block寡聚核苷酸是硫代修饰的。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，(a)组试剂中，前引物浓度500±200nM，后引物浓度500±200nM，探针浓度100±40nM，Block寡聚核苷酸浓度1500±600nM；
(b)组试剂中，前引物浓度500±200nM，后引物浓度500±200nM，探针浓度100±40nM，Block寡聚核苷酸浓度1500±600nM；
(c)组试剂中，前引物浓度500±200nM，后引物浓度500±200nM，探针浓度100±40nM；
(d)组试剂中，前引物浓度500±200nM，后引物浓度500±200nM，探针浓度100±40nM；或
(e)组试剂中，前引物浓度500±200nM，后引物浓度500±200nM，探针浓度100±40nM。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：TaqDNA聚合酶，镁离子，dNTP，扩增缓冲液，梯度校准品。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，每一组所述前引物、后引物、探针、Block寡聚核苷酸分别与所述Taq DNA聚合酶，镁离子，dNTP混合于一个体系中；或
所述的梯度校准品与所述前引物、后引物、探针、Block寡聚核苷酸及TaqDNA聚合酶，镁离子，dNTP混合于一个体系中。
8.权利要求1-7任一所述的试剂盒的用途，用于检测基因突变。
9.一种检测基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括：
(i)以待测基因为模板，以权利要求1-7任一所述的试剂盒中的试剂进行PCR扩增；
(ii)分析PCR扩增产物，确定待测样品中待测基因的突变类型。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的试剂盒定量检测EGFR基因突变；并且，步骤(ii)包括：
(S1)利用(a)、(b)、(c)和(d)组试剂分别检测第21外显子的点突变拷贝数、第20外显子790位的点突变拷贝数、第19外显子缺失突变拷贝数；
(S2)利用(e)组试剂检测EGFR保守区域拷贝数：
(S3)将(S1)获得的各组突变拷贝数与(S2)中获得的保守区域拷贝数比较，获得EGFR基因各突变位点的突变比例。
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