CN109295177A - 一种人类egfr基因微量突变富集预处理的引物、方法及试剂盒 - Google Patents

一种人类egfr基因微量突变富集预处理的引物、方法及试剂盒 Download PDF

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CN109295177A CN201811044197.3A CN201811044197A CN109295177A CN 109295177 A CN109295177 A CN 109295177A CN 201811044197 A CN201811044197 A CN 201811044197A CN 109295177 A CN109295177 A CN 109295177A
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Abstract

本发明提供一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物、方法和试剂盒，用于从野生型基因与突变型基因的混合核酸样品中富集包含至少一种突变型基因的核酸。所述方法采用竞争性等位基因特异性PCR扩增技术，利用竞争性等位基因特异性引物与目标突变基因的特异序列结合，扩增突变序列，同时利用阻断剂与突变位点对应的野生型序列特异结合，抑制野生型非特异性扩增，选择性扩增含EGFR突变型基因的核酸，达到富集含EGFR突变型基因的核酸片段的目的。

Description

一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物、方法及试 剂盒
本申请要求了2017年09月08日提交中国专利局的，申请号为201710824536.9，发明名称为“一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物、方法及试剂盒”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物、方法及试剂盒。
背景技术
人类表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种蛋白酪氨酸激酶受体，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，具有酪氨酸激酶活性。它是HER/ErbB家族成员之一，因此又名HER1或ErbB1。EGFR与其配体结合后在细胞表面形成二聚体，通过酪氨酸激酶的活性，激活受体自磷酸化，在细胞内发出信号，经过细胞质中衔接蛋白和酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。当EGFR发生突变时，EGFR自身或其配体过表达，从而通过自分泌或旁分泌方式刺激细胞形成失控性增殖。此外，EGFR过度活化还可以启动多种蛋白水解酶和促血管生成因子的表达，从而加速癌细胞的转移。因此，EGFR过表达者通常预后较差。
美国食品药品监督管理局于2003年5月批准了美国阿斯利康公司生产的小分子基因靶点药物吉非替尼(Gefitinib，也称为易瑞沙/Iressa)用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)，我国也与2005年2月批准了吉非替尼进入临床。吉非替尼是一种口服的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，它可以特异性地竞争结合癌细胞EGFR激酶功能区的ATP结合位点，通过抑制该酶的活性来抑制肿瘤的增长、增殖，却无明显的化疗副作用。美国哈佛医学院的研究人员Lynch等率先报道，肺癌细胞中有EGFR酪氨酸激酶基因编码区18～21外显子突变的患者，靶向药物吉非替尼的有效率高达80％以上。这种现象可能是由于EGFR突变使EGFR酪氨酸激酶ATP结合位点的某些基团发生重构，增强了与ATP或其竞争性抑制剂吉非替尼的相互作用。因此，有EGFR基因突变的患者表现出对吉非替尼更好的治疗反应。研究表明，美国非小细胞肺癌患者中只有约10％有EGFR基因突变，然而在亚洲人中，约30％的非小细胞肺癌患者有EGFR基因突变。临床运用的结果表明，EGFR基因外显子18～21的突变(体细胞突变)是患者对此类靶向药物有效的必要前提，如果病人不携带有EGFR基因突变而服用此类药物，不仅耽误病情还造成巨额药费的浪费。因此，在用药前筛查检测病人是否携带有EGFR基因突变显得尤为重要，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。
然而由于癌症样品中突变往往与野生型混杂在一起，如何从大量野生型DNA中检测出突变型DNA是不得不面对的挑战，癌症基因突变检测尤其是癌症基因的早期检测需要较高的灵敏度和特异性。目前，针对EGFR基因突变的检测方法主要有直接测序法、传统的荧光定量PCR法和高分辨率熔解曲线法。直接测序法耗时长且灵敏度低，通常只用于科研，难以用于临床的检测。传统的荧光定量PCR法难以使突变型基因在大量的野生型基因中得到专一性的扩增，容易产生假阳性的检测结果。高分辨率熔解曲线法所使用的仪器较特殊，难以在医院进行普及，而且此方法在检测缺失突变时，效果较差。因此，如何快速准确的检测这些与药物反应性有关的EGFR基因突变，就成为人们亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物、方法，本发明还提供了含有该引物和方法的试剂盒，可以实现从大量野生型DNA中获取突变型DNA，并通过PCR扩增，实现人类EGFR微量突变基因的富集，结合相应的检测试剂可有助于实现对EGFR基因突变的灵敏检测。
为达到上述目的，本发明第一方面提供一种人类EGFR突变基因微量突变的富集预处理方法，包括以下步骤：将人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物、阻断剂、待测基因样品混合，PCR扩增，获得EGFR突变基因微量突变的富集产物；
其中，人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物包括突变上游引物和突变下游引物，所述突变上游引物包括1-10条针对不同突变位点的引物，其长度为15-40个碱基，靠近3’末端的第1、2、3、4或5位的碱基为突变位点，与待测EGFR突变型基因的一条链互补；所述突变下游引物，其长度为15-40个碱基，与待测EGFR突变型基因的另一条链互补。
所述阻断剂能与EGFR基因野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
在本发明一实施例中，所述突变上游引物，包括2条针对突变位点的引物，其长度均为25个碱基，其中3’末端的第3位碱基为突变位点，与待测EGFR突变型基因的一条链互补。
在本发明一实施例中，所述突变下游引物为一条共用的下游引物，其长度为19个碱基，与待测EGFR突变型基因的另一条链互补。
在本发明一优选实施例中，本发明中的一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物，其序列如下1)和2)中的至少一组：
1)突变位点EGFR-L858R(c.2573T>G)
突变上游引物1：
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGG(SEQ ID NO.1)
突变下游引物1：
AGCCTGGTCCCTGGTGTCA(SEQ ID NO.2)
2)突变位点EGFR-L861Q(c.2582T>A)
突变上游引物2：
ACAGATTTTGGGCTGGCCAAACAGC(SEQ ID NO.3)
突变下游引物1：
AGCCTGGTCCCTGGTGTCA(SEQ ID NO.2)。
在本发明一实施例中，所述阻断剂包括匹配EGFR野生型基因的核酸序列，所述核酸序列修饰有化学基团；
在本发明一优选实施例中，所述阻断剂匹配EGFR野生型基因的核酸序列包括1)和2)中的至少一种：
1)匹配EGFR-2573野生型基因的核酸序列：TTGGGCTGGCCAAACTGCTGG(SEQ IDNO.4)；
2)匹配EGFR-2582野生型基因的核酸序列：TGGCCAAACTGCTGGGT(SEQ ID NO.5)。
在本发明一优选实施例中，所述化学基团包括：胺基、磷酸基团、生物素、生物素-TEG及C3-spacer中的一种或多种。
本发明第二方面提供一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物，包括突变上游引物和突变下游引物，所述突变上游引物包括1-10条针对不同突变位点的引物，其长度为15-40个碱基，靠近3’末端的第1、2、3、4或5位的碱基为突变位点，与待测EGFR突变型基因的一条链互补；所述突变下游引物，其长度为15-40个碱基，与待测EGFR突变型基因的另一条链互补。
在本发明一实施例中，所述突变上游引物，包括2条针对突变位点的引物，其长度为25个碱基，其中3’末端的第3位碱基为突变位点，与待测EGFR突变型基因的一条链互补。
所述突变下游引物为一条通用的下游引物，其长度为19个碱基，与待测EGFR突变型基因的另一条链互补。
在本发明一优选实施例中，本发明中的一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物，其序列如下1)和2)中的至少一组：
1)突变位点EGFR-L858R(c.2573T>G)
突变上游引物1：
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGG(SEQ ID NO.1)
突变下游引物1：
AGCCTGGTCCCTGGTGTCA(SEQ ID NO.2)
2)突变位点EGFR-L861Q(c.2582T>A)
突变上游引物2：
ACAGATTTTGGGCTGGCCAAACAGC(SEQ ID NO.3)
突变下游引物1：
AGCCTGGTCCCTGGTGTCA(SEQ ID NO.2)。
本发明第三方面提供一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的试剂盒，包括本发明第二方面所述的一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物，还包括阻断剂。
在本发明一实施例中，所述阻断剂匹配EGFR野生型基因的核酸序列包括如SEQ IDNO.4和/或SEQ ID NO.5所示的序列，所述核酸序列修饰有化学基团，所述化学基团包括：胺基、磷酸基团、生物素、生物素-TEG及C3-spacer中的一种或多种。
本发明第四方面提供如本发明第一方面所述的一种人类EGFR基因微量突变富集预处理方法、如本发明第二方面所述的一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物、如本发明第三方面所述的一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的试剂盒在富集人类EGFR基因突变中的应用。
本发明第四方面提供如本发明第一方面所述的一种人类EGFR基因微量突变富集预处理方法、如本发明第二方面所述的一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物、如本发明第三方面所述的一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的试剂盒在富集样品中微量人类EGFR基因突变中的应用。
进一步地，所述应用为在EGFR突变型基因浓度不低于1％、0.1％、0.01％或0.001％的样品中富集人类EGFR突变基因。
进一步地，所述突变型基因浓度为突变型基因占野生型基因数量或摩尔浓度的比例。
进一步地，所述突变型基因浓度为突变型基因占样品总基因数量或摩尔浓度的比例。
进一步地，所述EGFR突变型基因包括EGFR-L858R(c.2573T>G)、EGFR-L861Q(c.2582T>A)中的至少一种。
本发明提供一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的方法，可以实现从大量野生型DNA中获取突变型DNA，并通过PCR扩增，实现人类EGFR突变基因微量突变的富集预处理，结合相应的检测试剂可实现对癌症基因突变的诊断。
附图说明
图1为本发明实施例提供的原理示意图；
图2为本发明实施例提供的加阻断剂体系与不加阻断剂体系扩增效果对比图，其中，图2-1为EGFR-L858R(c.2573T>G)检测，图2-2为EGFR-L861Q(c.2582T>A)检测，A1为不加阻断剂体系扩增突变型基因的扩增曲线、B1为不加阻断剂体系扩增野生型基因的扩增曲线、A2为加阻断剂体系扩增突变型基因的扩增曲线、B2为加阻断剂体系扩增野生型基因的扩增曲线；
图3为本发明实施例提供的试剂盒的灵敏度检测，其中，图3-1为EGFR-L858R(c.2573T>G)检测，图3-2为EGFR-L861Q(c.2582T>A)检测，A、B、C、D分别为突变基因浓度为1％、0.1％、0.01％、0.001％的扩增曲线；
图4为本发明实施例提供的试剂盒的特异性检测，其中，A为对突变异常基因2573T>G扩增，B为对突变异常基因2582T>A扩增，C为对PIK3CA基因扩增，D为KIT基因扩增，E为TP53基因扩增，F为对非目标基因混合物扩增。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
下面将结合图1，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。
实施例1
1、一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物及阻断剂：
根据NCBI数据库公布的EGFR基因野生型序列，以EGFR突变位点为参考，设计特异性EGFR突变引物。以基因工程构建的突变质粒和野生型质粒为模板，建立了PCR突变(Mutation)检测体系，实现对人类EGFR突变基因进行富集预处理。
一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物，其序列如下：
1)突变位点EGFR-L858R(c.2573T>G)
突变上游引物1：
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGG(SEQ ID NO.1)
突变下游引物1：
AGCCTGGTCCCTGGTGTCA(SEQ ID NO.2)
其中，突变上游引物1，与EGFR(c.2573T>G)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；突变下游引物1，与EGFR基因保守序列结合；
为了进一步区分野生型序列与突变型序列，本发明添加了阻断剂，包括匹配EGFR野生型基因的核酸序列及化学修饰基团；
其中，所述阻断剂中匹配EGFR-2573野生型基因的核酸序列：
TTGGGCTGGCCAAACTGCTGG(SEQ ID NO.4)
2)突变位点EGFR-L861Q(c.2582T>A)
突变上游引物2：
ACAGATTTTGGGCTGGCCAAACAGC(SEQ ID NO.3)
突变下游引物1：
AGCCTGGTCCCTGGTGTCA(SEQ ID NO.2)。
其中，突变上游引物2，与EGFR(c.2582T>A)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；突变下游引物1，与EGFR基因保守序列结合；
为了进一步区分野生型序列与突变型序列，本发明添加了阻断剂，包括匹配EGFR野生型基因的核酸序列及化学修饰基团；
其中，所述阻断剂中匹配EGFR-2582野生型基因的核酸序列：
TGGCCAAACTGCTGGGT(SEQ ID NO.5)。
2、本发明的一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的试剂盒，操作步骤如下：
1)提取血液DNA样本，备用：
2)配制qRT-PCR反应体系：
试剂 用量
SYBR MIX 10μl
突变上游引物(4μM) 1.0μl
突变下游引物(4μM) 1.0μl
ddH2O 4.0μl
阻断剂(1μM) 2.0μl
DNA 2.0μl
3)qRT-PCR反应条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃延伸1min(收集荧光)，进行40个循环。
3、试剂盒的性能验证
1)检测模板的制备：
分别取含有EGFR(c.2573T>G)位点突变、EGFR(c.2582T>A)位点突变的质粒的基因工程菌以及对应的野生型质粒基因工程菌分别培养，使用质粒纯化试剂盒(Plasmid MiniKit I,购自OMEGA公司)制备纯化的质粒作为检测模板。
2)阻断剂的作用：
由于本试剂检测的目标基因片段EGFR位点突变只有一个碱基的点突变，本发明提供的检测引物在不加阻断剂的体系中在检测野生型基因时可能会出现假阳性，如图2-1中(横坐标为qPCR的CT值，纵坐标为所检测到的萤光增量)中扩增曲线B1(CT为34)所示，而在加入阻断剂的体系中由于阻断剂的存在，抑制了野生型基因的扩增，如图2-1扩增曲线B2(不扩增)所示，结果表明加入阻断剂可抑制野生型基因的扩增；而加入阻断剂的体系与不加阻断剂的体系，两者对检测突变型基因的灵敏性相近，扩增曲线A1(不加阻断剂)与扩增曲线A2(加阻断剂)两者相差不大，结果表明扩增突变基因时，加与不加阻断剂对突变基因的扩增影响很小，但加阻断剂可以明显抑制野生型基因的扩增，大大减少大量野生型基因对突变型基因富集的干扰，更利于突变型基因有效的富集，有助于进一步对突变目标基因的灵敏检测，类似的实验结果也出现在图2-2里，进一步证明阻断剂的加入对突变型基因的富集影响不大，但阻断剂可明显抑制野生型基因的扩增，有助于选择性扩增含EGFR突变型基因的核酸，达到富集含EGFR突变型基因的核酸片段的目的。
3)试剂盒的灵敏度
制备纯化的质粒并进行核酸定量，计算出拷贝数，10倍梯度稀释，取108拷贝/μL、107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL的突变型质粒加入1010拷贝/μL的野生型质粒中得到突变型基因占野生型基因的比例为1％、0.1％、0.01％、0.001％的样品，分别取2μL各稀释度的质粒DNA作为模板，对试剂盒的灵敏度进行检测，结果如图3所示，本发明提供的用于检测EGFR位点突变的试剂盒在突变基因浓度为1％、0.1％、0.01％、0.001％时均能有效扩增，检测灵敏度可达到0.001％，即该富集预处理试剂盒可从突变基因浓度低至0.001％的样品中富集得到EGFR突变型基因。
4)试剂盒的特异性
通过对对EGFR突变型基因、EGFR野生型基因、其他较为常见序列相似的突变非目标基因进行检测来验证其特异性，结果如图4所示，图4中A为对突变异常基因2573T>G扩增、B为对突变异常基因2582T>A扩增、C为对PIK3CA基因扩增、D为KIT基因扩增、D为TP53基因扩增、F为对非目标基因混合物扩增，图4表明试剂盒特异识别并检测出EGFR突变型基因而对其它非目标基因不检出。
综上所述，本发明提供的一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的试剂盒可以实现从大量野生型DNA中获取微量的突变型DNA，并通过PCR扩增，实现人类EGFR突变基因微量突变的富集预处理，结合相应的检测试剂可实现对癌症基因突变的诊断。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 广州健天基因技术有限公司
<120> 一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物、方法和试剂盒
<150> 2017108245369
<151> 2017-09-08
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcaagatca cagattttgg gcggg 25
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcctggtcc ctggtgtca 19
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acagattttg ggctggccaa acagc 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgggctggc caaactgctg g 21
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggccaaact gctgggt 17

Claims (10)

1.一种人类EGFR突变基因微量突变的富集预处理方法，包括以下步骤：将人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物、阻断剂、待测基因样品混合，PCR扩增，获得EGFR突变基因微量突变的富集产物；
其中，人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物包括突变上游引物和突变下游引物，所述突变上游引物包括1-10条针对不同突变位点的引物，其长度为15-40个碱基，靠近3’末端的第1、2、3、4或5位的碱基为突变位点，与待测EGFR突变型基因的一条链互补；所述突变下游引物，其长度为15-40个碱基，与待测EGFR突变型基因的另一条链互补；
所述阻断剂能与EGFR基因野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。
2.如权利要求1所述的一种人类EGFR基因微量突变富集预处理方法，其特征在于，所述突变上游引物，包括2条针对突变位点的引物，其长度为25个碱基，其中3’末端的第3位碱基为突变位点，与待测EGFR突变型基因的一条链互补。
3.如权利要求1所述的一种人类EGFR基因微量突变富集预处理方法，其特征在于，所述突变下游引物为一条共用的下游引物，其长度为19个碱基，与待测EGFR突变型基因的另一条链互补。
4.如权利要求1所述的一种人类EGFR基因微量突变富集预处理方法，其特征在于，所述引物序列包括1)和2)中的至少一组：
1)突变位点EGFR-L858R(c.2573T>G)
突变上游引物1：
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGG(SEQ ID NO.1)，
突变下游引物1：
AGCCTGGTCCCTGGTGTCA(SEQ ID NO.2)；
2)突变位点EGFR-L861Q(c.2582T>A)
突变上游引物2：
ACAGATTTTGGGCTGGCCAAACAGC(SEQ ID NO.3)，
突变下游引物1：
AGCCTGGTCCCTGGTGTCA(SEQ ID NO.2)。
5.如权利要求1所述的一种人类EGFR基因微量突变富集预处理方法，其特征在于，所述阻断剂包括匹配EGFR野生型基因的核酸序列，所述核酸序列修饰有化学基团；
其中，所述匹配EGFR野生型基因的核酸序列包括1)和2)中的至少一种：
1)匹配EGFR-2573野生型基因的核酸序列：TTGGGCTGGCCAAACTGCTGG(SEQ ID NO.4)，
2)匹配EGFR-2582野生型基因的核酸序列：TGGCCAAACTGCTGGGT(SEQ ID NO.5)；所述化学基团包括：胺基、磷酸基团、生物素、生物素-TEG及C3-spacer中的一种或多种。
6.一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物，其特征在于，包括突变上游引物和突变下游引物，所述突变上游引物包括1-10条针对不同突变位点的引物，其长度为15-40个碱基，靠近3’末端的第1、2、3、4或5位的碱基为突变位点，与待测EGFR突变型基因的一条链互补；所述突变下游引物，其长度为15-40个碱基，与待测EGFR突变型基因的另一条链互补。
7.如权利要求6所述的人类EGFR基因微量突变富集预处理的引物，其特征在于，所述引物序列包括1)和2)中的至少一组：
1)突变位点EGFR-L858R(c.2573T>G)
突变上游引物1：
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGG(SEQ ID NO.1)，
突变下游引物1：
AGCCTGGTCCCTGGTGTCA(SEQ ID NO.2)；
2)突变位点EGFR-L861Q(c.2582T>A)
突变上游引物2：
ACAGATTTTGGGCTGGCCAAACAGC(SEQ ID NO.3)，
突变下游引物1：
AGCCTGGTCCCTGGTGTCA(SEQ ID NO.2)。
8.一种人类EGFR基因微量突变富集预处理的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求6所述的引物，还包括阻断剂。
9.如权利要求1所述的方法、权利要求6所述的引物、和/或权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述权利要求1所述的方法、权利要求6所述的引物、和/或权利要求7所述的试剂盒在富集人EGFR基因突变中的应用。
10.如权利要求1所述的方法、权利要求6所述的引物、和/或权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述权利要求1所述的方法、权利要求6所述的引物、和/或权利要求7所述的试剂盒在富集人EGFR基因突变中的应用，所述应用为在突变型基因浓度不低于1％、0.1％、0.01％或0.001％的样品中富集人类EGFR突变基因的应用。
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