CN103865993A - 肿瘤靶向药物有效性检测、突变富集方法、引物对及试剂 - Google Patents

肿瘤靶向药物有效性检测、突变富集方法、引物对及试剂 Download PDF

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Abstract

本申请涉及肿瘤基因领域，公开了肿瘤靶向药物有效性检测、富集突变方法、引物对及试剂。本申请的方法，包括检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况，其关联基因包括EGFR、KRAS和BRAF中的至少一个，具体可采用包括COLD-PCR扩增步骤及测序步骤的方法。本申请还公开了一组引物对，一种包括该引物对的试剂和试剂盒。本申请通过对EGFR，KRAS和BRAF三个基因的突变情况进行检测，可为肿瘤靶向药物有效性提供指导。通过以本申请公开的引物对进行COLD-PCR扩增可富集突变，将扩增结果测序可使常规PCR/sanger测序法检测突变率的灵敏度从原来的20%提高到1%，大大的降低了检测的假阴性率。

Description

肿瘤靶向药物有效性检测、突变富集方法、引物对及试剂
技术领域
本申请涉及肿瘤基因领域，尤其涉及一种肿瘤靶向药物有效性的检测方法，一种富集肿瘤靶向药物关联基因的突变的方法、一组引物对以及一种试剂及试剂盒。
背景技术
肿瘤是当今威胁人类健康的最大疾病，人们一直在寻找针对肿瘤的治疗药物。随着当代分子生物学、细胞生物学的发展，靶向药物作为一种新兴的高科技药物逐渐进入肿瘤治疗领域，且快速发展成为治疗肿瘤的有效措施。靶向药物治疗就是使药物瞄准肿瘤部位，在局部保存相对高的浓度，延长药物的时间，提高对肿瘤的杀伤力，而对正常组织细胞作用较小。
靶向药物与一般常规化疗药物不同，靶向药物通过与肿瘤细胞的特征性位点结合，干预控制肿瘤细胞生长增殖的基因信号传导通路。而肿瘤细胞具有有多样性，肿瘤细胞的特征性位点也因人而异。因此在使用肿瘤靶向药物之前，对患者体内的基因进行检测，以判断其体内是否有符合条件的基因，一定程度上预知药物是否会奏效。因此有必要设计肿瘤靶向药物有效性的检测方法。
发明内容
针对上述现状，本申请的目的在于提供一种肿瘤靶向药物有效性的检测方法、一种富集肿瘤靶向药物关联基因的突变的方法、一组引物对和一种试剂及试剂盒。
为实现上述目的，本申请提供了一种肿瘤靶向药物有效性的检测方法，包括检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况，所述肿瘤靶向药物关联基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一种。
进一步的，上述检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况包括检测受体内以下a-h中至少一组突变位点的突变情况：
a、EGFR基因第709和/或719号密码子；
b、EGFR基因第746-750号密码子；
c、EGFR基因第790号密码子；
d、EGFR基因第858号密码子；
e、KRAS基因第12和/或第13号密码子；
f、KRAS基因第61号密码子；
g、KRAS基因第146号密码子；
h、BRAF基因第600号密码子。
本申请中检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况是采用包括COLD-PCR扩增步骤及测序步骤的方法进行。
进一步的，在所述测序步骤后，包括分析测序结果，即根据所述测序结果判断肿瘤靶向药物的有效性。
具体的，上述COLD-PCR扩增步骤包括利用引物对对核酸样品进行第一扩增步骤和第二扩增步骤，第一扩增步骤结束后进入第二扩增步骤。
进一步的，所述突变位点a-h各自对应的COLD-PCR的引物对依次为：
a：引物对A：上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列；
b：引物对B：上游引物为Seq ID No.3所示序列，下游引物为Seq ID No.4所示序列；
c：引物对C：上游引物为Seq ID No.5所示序列，下游引物为Seq ID No.6所示序列；
d：引物对D：上游引物为Seq ID No.7所示序列，下游引物为Seq ID No.8所示序列；
e：引物对E：上游引物为Seq ID No.9所示序列，下游引物为Seq ID No.10所示序列；
f：引物对F：上游引物为Seq ID No.11所示序列，下游引物为Seq ID No.12所示序列；
g：引物对G：上游引物为Seq ID No.13所示序列，下游引物为Seq ID No.14所示序列；
h：引物对H：上游引物为Seq ID No.15所示序列，下游引物为Seq ID No.16所示序列。
上述第一扩增步骤可为常规PCR扩增，依次包括预变性、第一循环和终延伸，该第一循环依次包括变性、退火和延伸。上述第二扩增依次包括预变性、第二循环和终延伸，该第二循环依次包括变性、杂交温度处理、临界温度（Tc温度）处理、退火和延伸。
优选的，上述第一扩增步骤中，常规PCR可采用荧光PCR。
上述第一循环和第二循环的退火中，其引物退火温度的确定可包括以下步骤：利用上述关联基因的参考序列设计引物，获得引物对及引物退火温度预定值。利用该引物对，以该引物退火温度预定值-5℃所得温度值的±4℃范围内的不同温度作为实验引物退火温度对核酸样品进行常规PCR，得到不同温度下的常规PCR扩增产物。在上述扩增产物中选择出最优扩增产物，以该最优扩增产物的实验引物退火温度作为引物退火温度。
优选的，最优扩增产物通过扩增产物的电泳结果确定。
优选的，引物的退火温度，对应上述A-H引物对，依次为：
引物对A：56-64℃，优选62℃，
引物对B：56-64℃，优选62℃，
引物对C：56-64℃，优选59℃，
引物对D：56-64℃，优选61℃，
引物对E：54-60℃，优选58℃，
引物对F：56-64℃，优选62℃，
引物对G：54-60℃，优选57℃，
引物对H：54-60℃，优选58℃。
上述第二循环的Tc温度处理中，其Tc温度的确定包括以下步骤：以上述引物对和上述引物退火温度，对核酸样品进行常规PCR，确定常规PCR扩增得到的样品片段的Tm值。以上述引物对、上述引物退火温度以及上述Tm值±2℃范围内的不同温度作为实验Tc温度，对突变型样品进行COLD-PCR，根据不同实验Tc温度下的COLD-PCR扩增结果确定Tc温度。
优选的，上述常规PCR可采用荧光PCR，根据荧光PCR扩增产物的溶解曲线确定Tm值。
上述突变型样品包括突变序列。
上述突变型样品可选自真实样品和模拟样品中的至少一种。
上述突变型样品所含突变大于或等于1%。
优选的，临界温度，对应上述A-H引物对，依次为：
引物对A：83.5-85.5℃，优选85℃，
引物对B：81.5-83.5℃，优选83.1℃，
引物对C：91.5-93.5℃，优选92.5℃，
引物对D：86.5-88.5℃，优选87.3℃，
引物对E：81.5-84.5℃，优选83.2℃，
引物对F：81.5-82.8℃，优选81.9℃，
引物对G：76.5-79.5℃，优选78.3℃，
引物对H：79-81℃，优选80.4℃。
另一方面，本申请还公开了一种富集肿瘤靶向药物关联基因的突变的方法，该富集突变的方法包括COLD-PCR扩增步骤。肿瘤靶向药物关联基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一种。
优选的，富集肿瘤靶向药物关联基因的突变包括富集上述突变位点a-h中的至少一类突变。
进一步优选的，COLD-PCR扩增步骤中采用的引物对选自上述引物对A、B、C、D、E、F、G和H中的至少一对，该引物对A-H与突变位点a-h依次对应。具体的，该富集突变的方法中，COLD-PCR扩增步骤包括利用引物对对核酸样品进行第一扩增步骤和第二扩增步骤，第一扩增步骤结束后进入第二扩增步骤。
上述第一扩增步骤可为常规PCR扩增，依次包括预变性、第一循环和终延伸，该第一循环依次包括变性、退火和延伸。上述第二扩增依次包括预变性、第二循环和终延伸，该第二循环依次包括变性、杂交温度处理、临界温度（Tc温度）处理、退火和延伸。优选的，上述第一扩增步骤中，常规PCR可采用荧光PCR。
上述第一循环和第二循环的退火中，其引物退火温度的确定可包括以下步骤：利用上述关联基因的参考序列设计引物，获得引物对及引物退火温度预定值。利用该引物对，以该引物退火温度预定值-5℃所得温度值的±4℃范围内的不同温度作为实验引物退火温度对核酸样品进行常规PCR，得到不同温度下的常规PCR扩增产物。在上述扩增产物中选择出最优扩增产物，以该最优扩增产物的实验引物退火温度作为引物退火温度。
优选的，最优扩增产物通过扩增产物的电泳结果确定。
优选的，引物的退火温度，对应上述A-H引物对，依次为：
引物对A：56-64℃，优选62℃，
引物对B：56-64℃，优选62℃，
引物对C：56-64℃，优选59℃，
引物对D：56-64℃，优选61℃，
引物对E：54-60℃，优选58℃，
引物对F：56-64℃，优选62℃，
引物对G：54-60℃，优选57℃，
引物对H：54-60℃，优选58℃。
上述第二循环的Tc温度处理中，其Tc温度的确定包括以下步骤：以上述引物对和上述引物退火温度，对核酸样品进行常规PCR，确定常规PCR扩增得到的样品片段的Tm值。以上述引物对、上述引物退火温度以及上述Tm值±2℃范围内的不同温度作为实验Tc温度，对突变型样品进行COLD-PCR，根据不同实验Tc温度下的COLD-PCR扩增结果确定Tc温度。
优选的，上述常规PCR可采用荧光PCR，根据荧光PCR扩增产物的溶解曲线确定Tm值。
上述突变型样品包括突变序列。
上述突变型样品可选自真实样品和模拟样品中的至少一种。
上述突变型样品所含突变大于或等于1%。
优选的，临界温度，对应上述A-H引物对，依次为：
引物对A：83.5-85.5℃，优选85℃，
引物对B：81.5-83.5℃，优选83.1℃，
引物对C：91.5-93.5℃，优选92.5℃，
引物对D：86.5-88.5℃，优选87.3℃，
引物对E：81.5-84.5℃，优选83.2℃，
引物对F：81.5-82.8℃，优选81.9℃，
引物对G：76.5-79.5℃，优选78.3℃，
引物对H：79-81℃，优选80.4℃。
同时，本申请提供了一组引物对，该引物对选自以上引物对A、B、C、D、E、F、G和H中的至少一对。
该引物对可用于肿瘤靶向药物关联基因、富集肿瘤靶向药物基因的突变或肿瘤靶向药物有效性的检测，该肿瘤靶向药物关联基因为EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一种。
具体的，该引物对可用于COLD-PCR扩增，且进行COLD-PCR扩增时的引物退火温度，对应上述A-H引物对，依次为：
引物对A：56-64℃，优选62℃，
引物对B：56-64℃，优选62℃，
引物对C：56-64℃，优选59℃，
引物对D：56-64℃，优选61℃，
引物对E：54-60℃，优选58℃，
引物对F：56-64℃，优选62℃，
引物对G：54-60℃，优选57℃，
引物对H：54-60℃，优选58℃。
该引物对可用于COLD-PCR扩增，且进行COLD-PCR扩增时的Tc温度，对应上述A-H引物对，依次为：
引物对A：83.5-85.5℃，优选85℃，
引物对B：81.5-83.5℃，优选83.1℃，
引物对C：91.5-93.5℃，优选92.5℃，
引物对D：86.5-88.5℃，优选87.3℃，
引物对E：81.5-84.5℃，优选83.2℃，
引物对F：81.5-82.8℃，优选81.9℃，
引物对G：76.5-79.5℃，优选78.3℃，
引物对H：79-81℃，优选80.4℃。
本申请还提供了一种试剂，该试剂包括上述引物对。
本申请同时还提供了一种包括上述引物对或试剂的试剂盒。
本申请的有益效果是：通过对EGFR，KRAS和BRAF三个基因的突变情况进行检测，可以为肿瘤靶向药物有效性提供指导。
进一步的，本申请针对EGFR，KRAS和BRAF三个基因的8类突变位点，通过采用以本申请公开的引物对进行COLD-PCR扩增后测序的方法，可使得常规的PCR/sanger测序法检测突变率的灵敏度从原来的20%提高到1%，从而大大的降低了检测的假阴性率。
附图说明
图1为本申请的一种具体实施方式中,采用引物对A对样品进行COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图以及对扩增产物进行sanger测序的测序结果图;
图2为本申请的一种具体实施方式中,采用引物对B对样品进行COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图以及对扩增产物进行sanger测序的测序结果图;
图3为本申请的一种具体实施方式中,采用引物对C对样品进行COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图以及对扩增产物进行sanger测序的测序结果图;
图4为本申请的一种具体实施方式中,采用引物对D对样品进行COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图以及对扩增产物进行sanger测序的测序结果图;
图5为本申请的一种具体实施方式中,采用引物对E对样品进行COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图以及对扩增产物进行sanger测序的测序结果图;
图6为本申请的一种具体实施方式中,采用引物对F对样品进行COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图以及对扩增产物进行sanger测序的测序结果图;
图7为本申请的一种具体实施方式中,采用引物对G对样品进行COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图以及对扩增产物进行sanger测序的测序结果图;
图8为本申请的一种具体实施方式中,采用引物对H对样品进行COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图以及对扩增产物进行sanger测序的测序结果图。
具体实施方式
目前，市场上已有的一些肿瘤靶向药物主要是单克隆抗体药物、小分子药物和细胞凋亡诱导药物。例如，易瑞沙和特罗凯作为表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKI）是用于非小细胞肺癌（NSCLC）靶向治疗的主要药物。EGFR基因突变是癌症患者是否对TKI敏感的强预测因子。研究发现KRAS基因、BRAF基因处于EGFR信号通路的下游，KRAS、BRAF基因突变时，可以导致EGRF信号通路持续激活。研究还表明，抗EGFR单克隆抗体类药物疗效与结直肠癌患者KRAS基因突变有明显相关，只有KRAS基因野生型患者才可能对药物治疗有效，而突变型患者对药物治疗无效。BRAF基因突变的肿瘤患者对EGFR-TKI及EGFR单抗药物治疗不敏感，更易发生肿瘤恶化，总生存率低。由于瘤细胞生长增殖的基因信号传导通路十分复杂涉及上游、下游的多个基因，因此有必要设计更有针对性的肿瘤靶向药物有效性检测方法。因此，本申请中对受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况进行检测，该关联基因包括EGFR基因，KRAS基因和BRAF基因中的至少一种。本申请中受体是指靶向药物的被施予者，该受体可以是人体或动物体等，具体可根据基因检测的常规技术手段采用受体的离体样品例如血液或毛发等提取出核酸样品作为具体的检测对象。通过对上述基因的检测可为肿瘤靶向药物有效性提供指导。
本申请主要是检测EGFR，KRAS和BRAF三个基因中的8类突变位点的突变情况，涉及EGFR基因的第18、19、20、21外显子，KRAS基因的第2、3外显子，BRAF基因的第15号外显子。本申请中检测的突变位点具体为：
a、EGFR基因第709和/或719号密码子，均位于EGFR基因第18外显子上；
b、EGFR基因第746-750号密码子，位于EGFR基因第19外显子上，本申请中主要检测该段基因是否缺失；
c、EGFR基因第790号密码子，位于EGFR基因第20外显子上；
d、EGFR基因第858号密码子，位于EGFR基因第21外显子上；
e、KRAS基因第12和/或第13号密码子，位于KRAS基因第2外显子；
f、KRAS基因第61号密码子，位于KRAS基因第3外显子；
g、KRAS基因第146号密码子，位于KRAS基因第3外显子；
h、BRAF基因第600号密码子，位于EGFR基因第15外显子上。
检测位点的详细信息可参见下表1：
表1、关联基因突变位点的详细信息表点
Figure BDA00002610170500071
在本申请中，可对以上8类突变位点的任意一个进行检测，也可对以上多个位点进行检测。其中，优选对以上8类突变位点均进行检测，使得检测结果更为全面。
在临床基因检测中聚合酶链反应结合桑格测序法（PCR/Sanger测序法）是所有检测的金标准，但是采用该法的灵敏度目前只有10-20%左右，对于低频突变或组织中含有极少癌细胞的样品，很容易造成遗漏，出现假阴性，从而误导医生用药，影响个体化用药理念的推广。因此提高Sanger测序的灵敏度，提高其检测的准确性，具有非常重要的临床现实意义。
为提高检测的灵敏度，本申请采用COLD-PCR技术对上述8类突变位点中的至少一类进行检测。上述位点5%的突变率即可通过COLD-PCR后切胶纯化再进行sanger测序准确判断出该位点是一个突变位点。
COLD-PCR(co-amplification at lower denaturation temperature-PCR)技术是一种可提高Sanger测序法灵敏度的PCR方法，于2008年最先由Li等报道，是基于存在错配碱基的双链DNA熔解温度会发生改变的原理而建立的。COLD-PCR中以临界温度（Tc温度）使大部的有错配的双链解链进行扩增，而大部的完全匹配的双链不能打开，不能进行扩增，从而起到富集突变的目的，一定程度上解决了低含量基因突变检测的局限性。通过COLD-PCR技术的突变富集，可以将Sanger测序的灵敏度有原先的10-20%提高到1%-5%左右，从而大大的降低了检测的假阴性率。具体的，COLD-PCR首先是经过一个高的变性温度的PCR扩增，此时扩增对象中的野生型和突变型序列都得到了扩增，然后把扩增后的产物再以高的变性温度变性成单链，然后杂交在一起，由于突变的序列占的比例比较小，杂交的时候就会出现一定概率的异源错配，此后以临界温度（Tc温度）使大部的有错配的双链解链进行扩增，而大部的完全匹配的双链在此临界温度下不能打开因而不能进行扩增。以此方式经过多个循环扩增后，突变型的序列就可以得到富集。此时，将经过COLD-PCR后的产物进行电泳检测，选择扩增比较好的条带进行切胶回收，送去做sanger测序，即可验证突变位点是否得到富集。结果表明1%或以上的突变率通过上述的COLD-PCR条件可以用sanger测序明显的检测出来突变。采用该技术需要选择合适引物并对PCR反应条件的进行修改，选择合适的低变性温度即临界温度（Tc温度）。但该方法不需要增加其他特殊试剂和仪器，不会引起成本的增加，有利于临床上的大规模的应用和推广。
具体的，上述COLD-PCR扩增步骤包括第一扩增步骤和第二扩增步骤，第一扩增步骤结束后进入第二扩增步骤。第一扩增步骤可为常规PCR扩增，依次包括预变性、第一循环和终延伸，该第一循环依次包括变性、退火和延伸。第二扩增依次包括预变性、第二循环和终延伸，该第二循环依次包括变性、杂交温度处理、临界温度（Tc温度）处理、退火和延伸。第一循环和第二循环的次数可依据实际情况而定，其并不构成对本申请的限定。在本申请的一个具体实施方式中，第一扩增步骤中的常规PCR采用荧光PCR。
上述第一循环和第二循环的退火中，其引物退火温度的确定具体可采用如下方法。设计引物，设计好的引物由Invitrogen公司合成。合成后的引物用水溶解，浓度为10uM。对核酸样品，优选野生型样品即野生型基因组DNA进行引物退火温度的优化，野生型基因组DNA电泳检测主带完整，无降解无RNA污染，浓度用Qubit检测，用水稀释到100ng/ul。一般引物退火温度以引物合成单上的Tm值-5℃后的值上下浮动4℃范围内的温度进行试验来优化，每个温度做2管重复，上、下游引物的终浓度可为0.5μM，模板DNA的终浓度可为100ng，优选经过35个cycle的常规PCR扩增后，将PCR产物取2ul电泳检测，可以扩增出单一的目的条带且条带清晰可见，没有非特异性扩增条带。PCR反应中优选用高保真的NEB生产的HF Phusion酶，以减少PCR扩增过程中引入的碱基错配，反应体系可为25ul，从筛选出引物的最优引物退火温度。
上述第二循环的Tc温度处理中，其Tc温度的确定包括以下步骤：在确定引物和引物退火温度后，采用该引物对和该引物退火温度，对核酸样品进行常规PCR扩增得到样品片段，确定该样品片段的Tm值。Tm值是指扩增出来的PCR产物即样品片段的熔解温度，具体是指把该段样品片段的DNA双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA，其Tm值不同。DNA中GC含量越高，Tm值越高，成正比关系。Tm值的确定可通过实验或软件预测可以有多种方法确定，本申请优选采用荧光PCR扩增来确定Tm值，具体是在PCR过程中加入染料，然后做溶解曲线来确定引物对扩增得到的样品片段的Tm值。具体的，PCR扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征峰，这一特征峰的温度就是Tm值。本申请中优选使用的是荧光染料Eva-green，由北京海德创美技术有限公司生产，选用Eva-green是因为它对PCR的抵制性小，且有极高的灵敏性和超强的热稳定性，酸碱稳定性，光稳定性。最优的溶解曲线必须是一个单一的峰，不出现小峰和杂峰影响，如果出现杂峰的影响就需要调整引物的退火温度，以便确定引物的可行性及Tm值的可靠性。每个位点优选做2管重复以使得确定结果更加准确。确定了引物对扩增的样品片段的Tm值后，以该Tm值±2℃的浮动范围内的不同温度作为实验Tc温度，对突变型样品进行COLD-PCR，根据不同实验Tc温度下的COLD-PCR扩增结果确定Tc温度。本申请中的突变型样品中包括突变序列，具体可选自真实样品和模拟样品中的至少一种。该突变型样品所含突变大于或等于1%。
本申请中根据EGFR，KRAS和BRAF这三个基因的参考序列，具体的参考序列如下所示：
EGFR:
Location:7p12
Sequence:Chromosome:7;NC_000007.13(55086725..55275031)
KRAS:
Location:12p12.1
Sequence:
Chromosome:12;NC_000012.11(25358180..25403854,complement)
BRAF:
Location:7q34
Sequence:
Chromosome:7;NC_000007.13(140433812..140624564,complement)
根据上述三个基因的参考序列设计可以扩增这八类突变位点的引物，其PCR产物长度最优是在100-200bp之间，退火温度不高于70度，GC含量在40-60%之间，符合一般引物设计软件的要求。本申请的一种具体实施方法中，优选采用与上述突变位点依次对应的以下8对适用于COLD-PCR的引物对：
引物对A：上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列；
引物对B：上游引物为Seq ID No.3所示序列，下游引物为Seq ID No.4所示序列；
引物对C：上游引物为Seq ID No.5所示序列，下游引物为Seq ID No.6所示序列；
引物对D：上游引物为Seq ID No.7所示序列，下游引物为Seq ID No.8所示序列；
引物对E：上游引物为Seq ID No.9所示序列，下游引物为Seq ID No.10所示序列；
引物对F：上游引物为Seq ID No.11所示序列，下游引物为Seq ID No.12所示序列；
引物对G：上游引物为Seq ID No.13所示序列，下游引物为Seq ID No.14所示序列；
引物对H：上游引物为Seq ID No.15所示序列，下游引物为Seq ID No.16所示序列。
上述引物对A-H依次分别与上述a-h突变位点对应，其具体序列可见下表2：
表2、引物的具体信息以及与引物对应的突变位点表
引物对 突变位点 上游引物 下游引物
A a GCTTGTGGAGCCTCTTACA GCCAGGGACCTTACCTTAT
B b CTGTCATAGGGACTCTGG CACAGCAAAGCAGAAACT
C c ATGCGAAGCCACACTGAC CTTTGTGTTCCCGGACATAG
D d GCAGGGTCTTCTCTGTTTCA TACTTTGCCTCCTTCTGCAT
E e GTCCTGCACCAGTAATATGC AACCTTATGTGTGACATGTTCTAAT
F f TGTGTTTCTCCCTTCTCAGG GTACTGGTCCCTCATTGCAC
G g AAACAGGCTCAGGACTTA GATTTTGCAGAAAACAGA
H h GCTCTGATAGGAAAATGA ACTGTTCAAACTGATGGG
根据EGFR，KRAS和BRAF这三个基因的参考序列以及上述引物对，以及上述引物退火温度的确定和Tc温度的确定方法，在本申请的一个具体实施方式中，优选COLD-PCR的Tc温度为：
采用引物对A进行COLD-PCR的Tc温度为83.5-85.5℃，优选85℃;
采用引物对B进行COLD-PCR的Tc温度为81.5-83.5℃，优选83.1℃;
采用引物对C进行COLD-PCR的Tc温度为91.5-93.5℃，优选92.5℃;
采用引物对D进行COLD-PCR的Tc温度为86.5-88.5℃，优选87.3℃;
采用引物对E进行COLD-PCR的Tc温度为81.5-84.5℃，优选83.2℃;
采用引物对F进行COLD-PCR的Tc温度为81.5-82.8℃，优选81.9℃;
采用引物对G进行COLD-PCR的Tc温度为76.5-79.5℃，优选78.3℃；
采用引物对H进行COLD-PCR的Tc温度为79-81℃，优选80.4℃。
优选COLD-PCR的引物退火温度分别为：
采用引物对A进行COLD-PCR的引物退火温度为56-64℃，优选62℃;
采用引物对B进行COLD-PCR的引物退火温度为56-64℃，优选62℃;
采用引物对C进行COLD-PCR的引物退火温度为56-64℃，优选59℃;
采用引物对D进行COLD-PCR的引物退火温度为56-64℃，优选61℃;
采用引物对E进行COLD-PCR的引物退火温度为54-60℃，优选58℃;
采用引物对F进行COLD-PCR的引物退火温度为56-64℃，优选62℃;
采用引物对G进行COLD-PCR的引物退火温度为54-60℃，优选57℃；
采用引物对H进行COLD-PCR的引物退火温度为54-60℃，优选58℃。
利用上述引物对对受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况进行检测，具体通过COLD-PCR的扩增步骤和测序步骤进行检测。关于COLD-PCR的扩增步骤，除Tc温度及引物退火温度外，其余参数和步骤可按照本领域中进行COLD-PCR时所常规采用的参数和步骤进行，比如本领域技术人员可详细参考以下实施例中的具体记载。测序步骤在本申请中优选采用sanger测序法，但并不仅限于sanger测序法，本领域技术人员可根据实际情况选择其他测序方法进行测序。进一步的，在所述测序步骤后，包括分析测序结果，即根据所述测序结果判断肿瘤靶向药物的有效性。另一方面，该检测方法也可用于肿瘤靶向药物的给药指导，具体可依据检测结果指导用药。
本申请还公开一种富集上述肿瘤靶向药物关联基因的突变的方法，该方法包括采用上述COLD-PCR扩增方法。该肿瘤靶向药物关联基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一种。利用上述引物进行COLD-PCR扩增可有效富集扩增对象中肿瘤靶向药物关联基因的突变型。该COLD-PCR扩增中采用上述引物对A、B、C、D、E、F、G和H中的至少一对。具体的，同上，该富集突变的方法中，COLD-PCR扩增步骤，包括其引物退火温度及其确定和Tc温度及其确定均可参考本申请的上述描述和以下实施例中的具体记载。
上述引物对可采用常规技术手段制备成试剂或试剂盒，用于肿瘤靶向药物关联基因的检测、富集肿瘤靶向药物关联基因的突变或肿瘤靶向药物有效性的检测。上述试剂或试剂盒中可包含上述引物对A、B、C、D、E、F、G和H这八对引物对中的至少一对，具体的，可包含引物对A-H中的任一对、任两对、任三对、任四对、任五对、任六对、任七对或全部八对。本领域技术人员可根据需要在相关试剂或试剂盒中使用上述引物对。
下面通过具体检测试验结合附图对本申请作进一步详细说明。
实施例肿瘤靶向药物关联基因的检测
分别采用引物对A-H这8组引物对对检测对象进行检测。为更好的检验和说明本申请中的检测方法对突变型序列的富集效果，在本例中，采用与各引物对对应的已知突变率为5%的阳性样品作为检测对象，并同时以COLD-PCR和常规PCR的方法进行对照检测。
1、PCR扩增
采用上述8组引物对对上述样品进行COLD-PCR扩增和常规PCR扩增，其中常规PCR作为对比例。
其COLD-PCR和常规PCR的扩增体系如表3所示。
表3PCR反应体系
Figure BDA00002610170500111
Figure BDA00002610170500121
按照上述反应体系，将各引物对（上、下游引物）、相关试剂和各引物对对应的样品混匀后，在Bio-Rad S1000TM Thermal Cycler的PCR仪上按照表4所示的反应程序进行COLD-PCR反应，具体的采用引物对A-H对应的引物退火温度、杂交温度和Tc温度如表5所示。
表4、COLD-PCR反应程序
Figure BDA00002610170500122
表5、采用引物对A-H进行COLD-PCR反应的引物退火温度、杂交温度和Tc温度
Figure BDA00002610170500123
Figure BDA00002610170500131
作为对比例，按照上述表3中的反应体系，将各引物对（上、下游引物）、相关试剂和各引物对对应的样品混匀后，在AB9700的PCR仪上按照以下表6所示的反应程序进行常规PCR反应。具体的引物对A-H进行常规PCR对应的引物退火温度同上述COLD-PCR反应（参见表5中的引物退火温度）,在此不再累述。
表6、常规PCR反应程序。
Figure BDA00002610170500132
2、对上述PCR扩增产物进行电泳并进行sanger测序
将上述COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物分别进行电泳检测。配制2％的琼脂糖凝胶，选择50bp DNALadder，100v电泳120min，得到相关电泳图。
再分别将电泳结果中的主带切胶回收。切下的胶块用QIAquick Gel Extraction Kit回收，最后溶于20μl EB buffer，并送sanger测序，得到测序结果。
3、检测结果分析
（1）引物对A的检测对象为突变率为5%的阳性样品，该阳性样品的突变位点具体为EGFR第719号密码子，检测将结果如图1所示。
图1-a为采用引物对A对样品COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图，图1-a中，条带4为COLD-PCR扩增产物，条带8为常规PCR扩增产物，如图1-a所示，两种PCR方法均能得到扩增产物。
图1-b为对其COLD-PCR扩增产物进行sanger测序的测序结果图，图1-c为对其常规PCR扩增产物进行sanger测序的测序结果图。对比图1-b和图1-c可知，以Tc温度为85℃进行COLD-PCR的扩增产物sanger测序图中可明显看到突变型富集，即得到该样品为阳性样品的判断结果。而常规PCR扩增产物sanger测序图中该突变型富集的情况则并不明显。
（2）引物对B的检测对象为突变率为5%的阳性样品，该阳性样品的突变位点具体为EGFR第746-750号密码子缺失，检测将结果如图2所示。
图2-a为采用引物对B对样品COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图，图2-a中，条带5为COLD-PCR扩增产物，条带11为常规PCR扩增产物，如图2-a所示，两种PCR方法均能得到扩增产物。
图2-b为对其COLD-PCR扩增产物进行sanger测序的测序结果图，图2-c为对其常规PCR扩增产物进行sanger测序的测序结果图。对比图2-b和图2-c可知，以Tc温度为83.1℃进行COLD-PCR的扩增产物sanger测序图中可明显看到突变型富集，即得到该样品为阳性样品的判断结果。而常规PCR扩增产物sanger测序图中该突变型富集的情况则并不明显。
（3）引物对C的检测对象为突变率为5%的阳性样品，该阳性样品的突变位点具体为EGFR第790号密码子，检测将结果如图3所示。
图3-a为采用引物对C对样品COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图，图3-a中，条带5为COLD-PCR扩增产物，条带8为常规PCR扩增产物，如图3-a所示，两种PCR方法均能得到扩增产物。
图3-b为对其COLD-PCR扩增产物进行sanger测序的测序结果图，图3-c为对其常规PCR扩增产物进行sanger测序的测序结果图。对比图3-b和图3-c可知，以Tc温度为92.5℃进行COLD-PCR的扩增产物sanger测序图中可明显看到突变型富集，即得到该样品为阳性样品的判断结果。而常规PCR扩增产物sanger测序图中该突变型富集的情况则并不明显。
（4）引物对D的检测对象为突变率为5%的阳性样品，该阳性样品的突变位点具体为EGFR第858号密码子，检测将结果如图4所示。
图4-a为采用引物对C对样品COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图，图4-a中，条带5和6为COLD-PCR扩增产物，条带8和9为常规PCR扩增产物，如图4-a所示，两种PCR方法均能得到扩增产物。
图4-b为对其COLD-PCR扩增产物进行sanger测序的测序结果图，图4-c为对其常规PCR扩增产物进行sanger测序的测序结果图。对比图4-b和图4-c可知，以Tc温度为87.3℃进行COLD-PCR的扩增产物sanger测序图中可明显看到突变型富集，即得到该样品为阳性样品的判断结果。而常规PCR扩增产物sanger测序图中该突变型富集的情况则并不明显。
（5）引物对E的检测对象为突变率为5%的阳性样品，该阳性样品的突变位点具体为KRAS第13号密码子，检测将结果如图5所示。
图5-a为采用引物对C对样品COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图，图5-a中，条带3和4为COLD-PCR扩增产物，条带10和12为常规PCR扩增产物，如图5-a所示，两种PCR方法均能得到扩增产物。
图5-b为对其COLD-PCR扩增产物进行sanger测序的测序结果图，图5-c为对其常规PCR扩增产物进行sanger测序的测序结果图。对比图5-b和图5-c可知，以Tc温度为83.2℃进行COLD-PCR的扩增产物sanger测序图中可明显看到突变型富集，即得到该样品为阳性样品的判断结果。而常规PCR扩增产物sanger测序图中该突变型富集的情况则并不明显。
（6）引物对F的检测对象为突变率为5%的阳性样品，该阳性样品的突变位点具体为KRAS第61号密码子，检测将结果如图6所示。
图6-a为采用引物对C对样品COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图，图6-a中，条带2为COLD-PCR扩增产物，条带11为常规PCR扩增产物，如图6-a所示，两种PCR方法均能得到扩增产物。
图6-b为对其COLD-PCR扩增产物进行sanger测序的测序结果图，图6-c为对其常规PCR扩增产物进行sanger测序的测序结果图。对比图6-b和图6-c可知，以Tc温度为81.9℃进行COLD-PCR的扩增产物sanger测序图中可明显看到突变型富集，即得到该样品为阳性样品的判断结果。而常规PCR扩增产物sanger测序图中该突变型富集的情况则并不明显。
（7）引物对G的检测对象为突变率为5%的阳性样品，该阳性样品的突变位点具体为KRAS第146号密码子，检测将结果如图7所示。
图7-a为采用引物对C对样品COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图，图7-a中，条带2为COLD-PCR扩增产物，条带11为常规PCR扩增产物，如图7-a所示，两种PCR方法均能得到扩增产物。
图7-b为对其COLD-PCR扩增产物进行sanger测序的测序结果图，图7-c为对其常规PCR扩增产物进行sanger测序的测序结果图。对比图7-b和图7-c可知，以Tc温度为78.3℃进行COLD-PCR的扩增产物sanger测序图中可明显看到突变型富集，即得到该样品为阳性样品的判断结果。而常规PCR扩增产物sanger测序图中该突变型富集的情况则并不明显。
（8）引物对H的检测对象为突变率为5%的阳性样品，该阳性样品的突变位点具体为BRAF第600号密码子，检测将结果如图8所示。
图8-a为采用引物对C对样品COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图，图8-a中，条带6为COLD-PCR扩增产物，条带8为常规PCR扩增产物，如图8-a所示，两种PCR方法均能得到扩增产物。
图8-b为对其COLD-PCR扩增产物进行sanger测序的测序结果图，图8-c为对其常规PCR扩增产物进行sanger测序的测序结果图。对比图8-b和图8-c可知，以Tc温度为80.4℃进行COLD-PCR的扩增产物sanger测序图中可明显看到突变型富集，即得到该样品为阳性样品的判断结果。而常规PCR扩增产物sanger测序图中该突变型富集的情况则并不明显。
通过上述结果可知，当阳性样品的突变率为5%时，采用本申请中的引物对A-H通过COLD-PCR扩增的方法可使样品中的突变型富集，进而可有效检出阳性样品。利用本申请的引物对及方法检测含有突变的样品，当样品中含有1%的突变时，与上述结果类似，也能够使样品中的少量突变得到富集，使其易被检出。本发明方法能够降低突变检出限。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
Figure IDA00002610171200011
Figure IDA00002610171200021
Figure IDA00002610171200031
Figure IDA00002610171200041

Claims (9)

1.一种肿瘤靶向药物有效性的检测方法，包括检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况，其特征在于，所述肿瘤靶向药物关联基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一种；优选的，所述检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况包括检测受体内以下a-h中至少一类突变位点中的突变情况：
a、EGFR基因第709和/或719号密码子；
b、EGFR基因第746-750号密码子；
c、EGFR基因第790号密码子；
d、EGFR基因第858号密码子；
e、KRAS基因第12和/或第13号密码子；
f、KRAS基因第61号密码子；
g、KRAS基因第146号密码子；
h、BRAF基因第600号密码子。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况是采用包括COLD-PCR扩增步骤及测序步骤的方法进行；
其中，所述COLD-PCR扩增步骤包括利用引物对进行第一扩增步骤和第二扩增步骤：
所述第一扩增步骤为常规PCR扩增，包括预变性、第一循环和终延伸，所述第一循环包括变性、退火和延伸；
所述第二扩增包括预变性、第二循环和终延伸，所述第二循环包括变性、杂交温度处理、临界温度处理、退火和延伸；
优选的，所述引物对，对应所述a-h突变位点，依次为：
a：引物对A：上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，
b：引物对B：上游引物为Seq ID No.3所示序列，下游引物为Seq ID No.4所示序列，
c：引物对C：上游引物为Seq ID No.5所示序列，下游引物为Seq ID No.6所示序列，
d：引物对D：上游引物为Seq ID No.7所示序列，下游引物为Seq ID No.8所示序列，
e：引物对E：上游引物为Seq ID No.9所示序列，下游引物为Seq ID No.10所示序列，
f：引物对F：上游引物为Seq ID No.11所示序列，下游引物为Seq ID No.12所示序列，
g：引物对G：上游引物为Seq ID No.13所示序列，下游引物为Seq ID No.14所示序列，
h：引物对H：上游引物为Seq ID No.15所示序列，下游引物为Seq ID No.16所示序列；
优选的，所述常规PCR为荧光PC R;
优选的，所述退火中，其引物退火温度的确定包括：
利用所述关联基因的参考序列设计引物，获得引物对及引物退火温度预定值；
利用所述引物对，以所述引物退火温度预定值-5度所得温度值的±4度范围内的温度作为实验引物退火温度对核酸样品进行常规PCR，得到扩增产物；
选择扩增产物中的最优扩增产物，以所述最优扩增产物的实验引物退火温度作为所述引物退火温度；
优选的，所述引物的退火温度，对应所述A-H引物对，依次为：
引物对A：56-64℃，优选62℃，
引物对B：56-64℃，优选62℃，
引物对C：56-64℃，优选59℃，
引物对D：56-64℃，优选61℃，
引物对E：54-60℃，优选58℃，
引物对F：56-64℃，优选62℃，
引物对G：54-60℃，优选57℃，
引物对H：54-60℃，优选58℃；
优选的，所述最优扩增产物通过扩增产物的电泳结果确定；
优选的，所述第二循环中，其临界温度的确定包括：
以引物对和引物退火温度，对核酸样品进行常规PCR，确定常规PCR扩增得到的样品扩增产物的Tm值；
以所述引物对、所述引物退火温度以及所述Tm值±2度范围内的温度作为实验临界温度，对突变型样品进行COLD-PCR，根据COLD-PCR扩增结果确定临界温度；
优选的，所述临界温度，对应所述A-H引物对，依次为：
引物对A：83.5-85.5℃，优选85℃，
引物对B：81.5-83.5℃，优选83.1℃，
引物对C：91.5-93.5℃，优选92.5℃，
引物对D：86.5-88.5℃，优选87.3℃，
引物对E：81.5-84.5℃，优选83.2℃，
引物对F：81.5-82.8℃，优选81.9℃，
引物对G：76.5-79.5℃，优选78.3℃，
引物对H：79-81℃，优选80.4℃；
优选的，所述常规PCR采用荧光PCR，根据荧光PCR扩增产物的溶解曲线确定Tm值；
优选的，所述突变型样品包括突变序列；
优选的，所述突变型样品选自真实样品和模拟样品中的至少一种；
优选的，所述突变型样品所含突变大于或等于1%。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，在所述测序步骤后，进一步包括分析测序结果，根据所述测序结果判断肿瘤靶向药物有效性。
4.一种富集肿瘤靶向药物关联基因的突变的方法，其特征在于，所述富集突变的方法包括COLD-PCR扩增步骤；
所述肿瘤靶向药物关联基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一种；
优选的，所述富集肿瘤靶向药物关联基因的突变包括富集以下a-h中的至少一类突变：
a、EGFR基因第709和/或719号密码子，
b、EGFR基因第746-750号密码子，
c、EGFR基因第790号密码子，
d、EGFR基因第858号密码子，
e、KRAS基因第12和/或第13号密码子，
f、KRAS基因第61号密码子，
g、KRAS基因第146号密码子，
h、BRAF基因第600号密码子；
优选的，所述COLD-PCR扩增步骤包括利用引物对进行第一扩增步骤和第二扩增步骤：
所述第一扩增步骤为常规PCR扩增，包括预变性、第一循环和终延伸，所述第一循环包括变性、退火和延伸；
所述第二扩增包括预变性、第二循环和终延伸，所述第二循环包括变性、杂交温度处理、临界温度处理、退火和延伸；
优选的，所述引物对，对应所述a-h突变位点，依次为；
a：引物对A：上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，
b：引物对B：上游引物为Seq ID No.3所示序列，下游引物为Seq ID No.4所示序列，
c：引物对C：上游引物为Seq ID No.5所示序列，下游引物为Seq ID No.6所示序列，
d：引物对D：上游引物为Seq ID No.7所示序列，下游引物为Seq ID No.8所示序列，
e：引物对E：上游引物为Seq ID No.9所示序列，下游引物为Seq ID No.10所示序列，
f：引物对F：上游引物为Seq ID No.11所示序列，下游引物为Seq ID No.12所示序列，
g：引物对G：上游引物为Seq ID No.13所示序列，下游引物为Seq ID No.14所示序列，
h：引物对H：上游引物为Seq ID No.15所示序列，下游引物为Seq ID No.16所示序列；
优选的，所述常规PCR为荧光PCR;
优选的，所述退火中，其引物退火温度的确定包括：
利用所述关联基因的参考序列设计引物，获得引物对及引物退火温度预定值；
利用所述引物对，以所述引物退火温度预定值-5度所得温度值的±4度范围内的温度作为实验引物退火温度对核酸样品进行常规PCR，得到扩增产物；
选择扩增产物中的最优扩增产物，以所述最优扩增产物的实验引物退火温度作为所述引物退火温度；
优选的，所述引物的退火温度，对应所述A-H引物对，依次为：
引物对A：56-64℃，优选62℃，
引物对B：56-64℃，优选62℃，
引物对C：56-64℃，优选59℃，
引物对D：56-64℃，优选61℃，
引物对E：54-60℃，优选58℃，
引物对F：56-64℃，优选62℃，
引物对G：54-60℃，优选57℃，
引物对H：54-60℃，优选58℃；
优选的，所述最优扩增产物通过扩增产物的电泳结果确定；
优选的，所述第二循环中，其临界温度的确定包括：
以引物对和引物退火温度，对核酸样品进行常规PCR，确定常规PCR扩增得到的样品扩增产物的Tm值；
以所述引物对、所述引物退火温度以及所述Tm值±2度范围内的温度作为实验临界温度，对突变型样品进行COLD-PCR，根据COLD-PCR扩增结果确定临界温度；
优选的，所述临界温度，对应所述A-H引物对，依次为：
引物对A：83.5-85.5℃，优选85℃，
引物对B：81.5-83.5℃，优选83.1℃，
引物对C：91.5-93.5℃，优选92.5℃，
引物对D：86.5-88.5℃，优选87.3℃，
引物对E：81.5-84.5℃，优选83.2℃，
引物对F：81.5-82.8℃，优选81.9℃，
引物对G：76.5-79.5℃，优选78.3℃，
引物对H：79-81℃，优选80.4℃；
优选的，所述常规PCR采用荧光PCR，根据荧光PCR扩增产物的溶解曲线确定Tm值；
优选的，所述突变型样品包括突变序列；
优选的，所述突变型样品选自真实样品和模拟样品中的至少一种；
优选的，所述突变型样品所含突变大于或等于1%。
5.一组引物对，其特征在于，所述引物对选自以下引物对A、B、C、D、E、F、G和H中的至少一对：
引物对A：上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列；
引物对B：上游引物为Seq ID No.3所示序列，下游引物为Seq ID No.4所示序列；
引物对C：上游引物为Seq ID No.5所示序列，下游引物为Seq ID No.6所示序列；
引物对D：上游引物为Seq ID No.7所示序列，下游引物为Seq ID No.8所示序列；
引物对E：上游引物为Seq ID No.9所示序列，下游引物为Seq ID No.10所示序列；
引物对F：上游引物为Seq ID No.11所示序列，下游引物为Seq ID No.12所示序列；
引物对G：上游引物为Seq ID No.13所示序列，下游引物为Seq ID No.14所示序列；
引物对H：上游引物为Seq ID No.15所示序列，下游引物为Seq ID No.16所示序列。
6.根据权利要求5所述的引物对，其特征在于，所述引物对用于肿瘤靶向药物关联基因的检测、富集肿瘤靶向药物关联基因的突变或肿瘤靶向药物有效性的检测，所述肿瘤靶向药物关联基因为EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的引物对，其特征在于：所述引物对用于COLD-PCR扩增，且进行COLD-PCR扩增时的临界温度分别为：
引物对A：83.5-85.5℃，优选85℃;
引物对B：81.5-83.5℃，优选83.1℃;
引物对C：91.5-93.5℃，优选92.5℃;
引物对D：86.5-88.5℃，优选87.3℃;
引物对E：81.5-84.5℃，优选83.2℃;
引物对F：81.5-82.8℃，优选81.9℃;
引物对G：76.5-79.5℃，优选78.3℃；
引物对H：79-81℃，优选80.4℃。
8.根据权利要求5所述的引物对，其特征在于：所述引物对用于COLD-PCR扩增，且进行COLD-PCR扩增时的退火温度分别为：
引物对A：56-64℃，优选62℃，
引物对B：56-64℃，优选62℃，
引物对C：56-64℃，优选59℃，
引物对D：56-64℃，优选61℃，
引物对E：54-60℃，优选58℃，
引物对F：56-64℃，优选62℃，
引物对G：54-60℃，优选57℃，
引物对H：54-60℃，优选58℃。
9.一种试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂包括如权利要求5-8任一项所述的引物对，所述试剂盒包括所述试剂或权利要求5-8任一项所述的引物对。
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