CN104498606B

CN104498606B - microRNAs在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN104498606B
Application number: CN201410784315.XA
Authority: CN
Inventors: 陈素; 矫健; 姜东杰; 周振华; 肖建如
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2014-12-16
Filing date: 2014-12-16
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2034-12-16
Also published as: CN104498606A

Abstract

本发明涉及医学生物检测技术领域，本发明应用microRNA芯片技术筛选出被Brachyury调控后发生显著上调的若干microRNAs，并对这一系列microRNAs进行了Real‑Time PCR验证。本发明提供了Brachyury阳性肿瘤的分子标记物，该分子标记物hsa‑miR‑4286、hsa‑miR‑449c在肺癌患者中呈现显著高表达，而在其它肺部实质性病变患者和正常人群中则未见表达水平异常。本发明还提供了microRNAs在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用。本发明的microRNAs可以在肿瘤发生的早期进行筛查或诊断，对于肿瘤的早期治疗和医疗成本的节约都具有重要意义。

Description

microRNAs在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体是microRNAs在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用。

背景技术

随着肿瘤发病率的日益增高，人类的健康和生命面临巨大挑战，对肿瘤的防治成为医学界刻不容缓的责任。如何早期发现并及时治疗成为降低肿瘤死亡率最有效的途径。随着在肿瘤分子和细胞层面研究的不断深入和现有治疗方法如放疗化疗严重的副作用，“肿瘤靶标”这一概念被广泛认可并进行了大量的研究，这一概念的核心是找到仅在肿瘤中特异性表达而在正常组织中不表达或局限性表达的分子，通过“生物导弹”直击肿瘤，并对正常组织造成最小化的破坏。这一概念的出现和随之而进行的大量研究正逐渐使肿瘤独有的特征具现化，并有可能最终“无所遁形”，也使得人类在与肿瘤的斗争中掌握了一定的主动权。对肿瘤的早期发现和有效治疗都有重大意义。

TATA-box转录因子Brachyury是T-box转录因子家族的成员之一，其同源体在诸多多细胞生物体内表达，如秀丽线虫、非洲爪蛙、老鼠、人类等胚胎中表达(参见文献Papaioannou VE,Silver LM,et al.The T-box gene family.Bioessays 1998；20:9-19.Kispert A,Herrmann BG,et al.Homologs of the mouse Brachyury gene areinvolved in the specification of posterior terminal structures in Drosophila,Tribolium,and Locusta.Genes Dev 1994；8:2137-50.Herrmann BG,Labeit S,etal.Cloning of the Tgene required in mesoderm formation in the mouse.Nature1990；343:617-22)。T-box蛋白主要在中胚层的形成和分化中具有重要作用，在胚胎发育晚期则在大部分组织中关闭表达仅集中于脊索区表达，并在脊柱形成后随着脊索的退化消失而在大多数正常成人组织中不表达，仅在睾丸中有表达、脾和小肠中有低水平表达的限制性表达方式(参见文献Duane H.Hamilton,Ph.D.,Postdoctoral Fellow,et al.Cancervaccines targeting the epithelial-mesenchymal transition:tissue distributionof Brachyury and other drivers of the mesenchymal-like phenotype ofcarcinomas.Semin Oncol.2012Jun；39(3):358-66.)。然而，在已知的人类多种肿瘤组织和细胞系中，Brachyury却呈现出高水平的表达，这些肿瘤组织和肿瘤细胞系是：小肠、胃、肾、膀胱、子宫、卵巢、睾丸、脑和淋巴组织，肺组织、结肠组织和前列腺组织来源的细胞系(参见文献Palena C,Polev DE,et al.The human T-box mesodermal transcription factorBrachyury is a candidate target for T-cell-mediated cancer immunotherapy.ClinCancer Res.2007Apr 15；13(8):2471-8.Park JC,Chae YK,et al.Epigenetic silencingof human T(brachyury homologue)gene in non-small-cell lung cancer.BiochemBiophys Res Commun.2008Jan 11；365(2):221-6.)。以上研究结果都提示了Brachyury可以应用于多种来源的肿瘤诊断和治疗中。然而，如何应用肿瘤组织中高表达的Brachyury对人群进行早期的肿瘤筛查诊断却没有具体有效的方法和研究。作为转录因子，Brachyury具有强大的启动或抑制下游基因转录的作用，因此，通过检测其下游被调控的某些外分泌蛋白质或miRNA的表达量便可以作为Brachyury表达水平的指标。

microRNA作为仅有20-24bp的非编码短链核苷酸片段，被证明在外周血中具有稳定的表达谱，且无性别差异，而肿瘤患者的microRNAs表达谱则发生显著变化(参见文献Chen X,Ba Y,et al.Characterization of microRNAs in serum:a novel class ofbiomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.Cell Res.2008Oct；18(10):997-1006.)由于microRNAs出细胞时被脂质微泡(Micro vesicle)保护，因此能够保持稳定，易于检测，在冰冻组织、福尔马林固定组织、石蜡组织，体液如外周血、痰液、唾液、胸膜积液中都能够进行检测，且由于microRNA片段较短，大大降低了检测成本，因此，其作为无创性肿瘤早期诊断标记物的研究日益增多(参见文献Du M,Liu S et al.Clinicalpotential role of circulating microRNAs in early diagnosis of colorectalcancer patients.Carcinogenesis.2014Sep 19.Jeong HC.Clinical Aspect ofMicroRNA in Lung Cancer.Tuberc Respir Dis(Seoul).2014Aug；77(2):60-4.)

目前的研究尚未见以肿瘤特异性靶标所关联的microRNAs作为肿瘤(包括肺癌等)早期诊断的标记物，也尚未有用于检测这一系列microRNAs在血清中含量的试剂盒来针对部分存在Brachyury过表达的肿瘤(包括肺癌等)患者进行筛查。

发明内容

本发明的目的在于寻找到与Brachyury高表达相关的肿瘤的分子标记物(肿瘤靶标、靶标)，本发明的另一目的在于提供microRNAs在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用。

本发明的主要技术方案：为了寻找被Brachyury调控的microRNAs，本发明人在肺癌细胞H1299和作为正常人体对照细胞293T中利用慢病毒感染转入外源性Brachyury的cds序列使之过表达后再应用microRNA芯片技术筛选出被Brachyury调控后发生显著上调的若干microRNAs。并对这一系列microRNAs进行了Real-Time PCR验证。随后在对临床上肺癌患者、慢性阻塞性肺炎患者、肺纤维化病变患者以及正常人群的血浆采集和检测中发现，microRNAs组中hsa-miR-4286、hsa-miR-449c在肺癌患者中呈现显著高表达，而在其它肺部实质性病变患者和正常人群中则未见表达水平异常。

在前期的microRNA芯片实验中同样发生显著上调的has-miR-22被报道在肺癌患者外周血中发生上调，可能为肺癌特异性诊断标记物(Franchina T,Amodeo V,Circulating miR-22,miR-24and miR-34a as novel predictive biomarkers topemetrexed-based chemotherapy in advanced non-small cell lung cancer.J CellPhysiol.2014Jan；229(1):97-9.)。以上研究结果显示，被Brachyury所调控的microRNA能够作为潜在的肺癌诊断标记物，本发明中的一系列microRNAs经过分子水平的实验与临床患者标本的验证，在肺癌的诊断中具有很强的特异性，并且以反转录联合聚合酶链式反应(RT-PCR)作为检测基础，通过对高危人群少量外周血的检测来早期筛查预测肿瘤的发生，是完全可行的。

本发明的第一个方面，是提供了与Brachyury高表达相关的肿瘤的分子标记物，所述的分子标记物为hsa-miR-4286或hsa-miR-449c。

进一步地，本发明提供了microRNAs在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用，所述的microRNAs选自hsa-miR-4286、hsa-miR-449c中的任一或两者的组合。

本发明所述的microRNAs的具体序列如表1所示：

所述的“与Brachyury高表达相关的肿瘤”即“Brachyury阳性肿瘤”，是指该肿瘤中Brachyury呈现出高水平的表达，包括但不限于肺癌、小肠癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、脑癌、淋巴癌、结肠癌、前列腺癌等。

在本发明的一个优选实施例中，提供了所述的micoRNAs在制备肺癌早期筛查或诊断试剂盒中的应用。

本发明可用于对肺癌高危人群进行早期筛查和诊断，本发明通过检测上述micoRNAs对相应人群外周血中一系列microRNAs含量的检测，早期筛查或诊断Brachyury阳性肺癌患者，以期及早进行干预或治疗，预防转移，最大限度地延长患者生存期降低死亡率。

本发明通过体外基因表达水平调控技术在肺癌细胞模型中筛选出一系列microRNAs并进行了临床标本的采集和验证，并发现microRNA：hsa-miR-4286、hsa-miR-449c在肺癌患者外周血中的含量相对其它肺实质病变和正常人群是发生显著升高的，且具有明显的统计学意义。说明这一系列microRNAs在外周血中含量的改变，可以作为肺癌诊断的分子标记。

本发明所述的microRNAs可以单一、或者组合地作为Brachyury阳性肿瘤的分子标志物。

本发明的第二方面，本发明提供了microRNAs在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用，所述的试剂具体是指检测上述microRNAs表达量的寡聚核苷酸；所述的试剂盒具体是指包含检测上述microRNAs表达量的寡聚核苷酸。

本发明提供了用于检测上述microRNAs的寡聚核苷酸，所述的寡聚核苷酸包括：反转录引物、PCR上游引物、PCR下游引物。

在本发明的一个优选实施例中，检测上述microRNAs表达量的寡聚核苷酸的具体序列如表2所示：

本发明反转录引物、PCR上游引物、PCR下游引物是根据已知的microRNAs库(http://www.mirbase.org/)检索到的成熟体序列进行引物设计的。

进一步地，本发明还提供了检测microRNAs表达量的试剂盒，所述试剂盒包含上述寡聚核苷酸的一组或多组，优选地，包含如下A组、B组，或AB两组的组合：

A组：SEQ ID NO:3～5；

B组：SEQ ID NO:5～7；

本发明的检测microRNAs表达量的试剂盒，所述的试剂盒还包含：

正常标准品：所述的正常标准品由符合平均值含量的microRNAs混合物组成；

在本发明的一个优选实施例中，本发明的试剂盒，包括以下组分：

A.反转录引物，1管 10uM浓度，100uL；

B.Real-Time PCR扩增上游引物，1管10uM浓度，100uL/管；

C.Real-Time PCR扩增下游引物，1管10uM浓度，100uL/管；

D.正常标准品，1管，10uM浓度，100uL。

本发明的第三方面，提供了利用上述寡聚核苷酸检测所述microRNAs表达量的方法，也即microRNAs在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用的具体检测方法，包括如下步骤：

取样本中的总RNA，加入特异性反转录引物、5×PrimeScript Buffer(for RealTime)、PrimeScript RT Enzyme Mix I、RNase Free dH2O(TAKARA公司)反转录成cDNA，应用EASY Dilution稀释试剂盒中的正常标准品，以所反转录的cDNA为模板向反应体系中加入PCR上游引物、PCR下游引物，通过反转录联合聚合酶链式反应(RT-PCR)检测上述的microRNAs的表达量。

所述样本，优选人的血液样本(不排除体液样本)，即血清样本或血浆样本。

使用本发明的试剂或试剂盒可以监测或于尚未发生明显影像学改变的早期高危人群中的Brachyury阳性肿瘤(肺癌)。

利用试剂盒中的标准品作为正常对照，取任意受试人群的外周血进行总microRNAs抽提、反转录和PCR扩增，与标准品结果进行比对，确认受试者外周血的该组microRNAs是否发生上调，若发生上调，即可初步确定该受试者为Brachyury阳性肿瘤(肺癌)患者，进一步可通过影像学进行监测，便于对受试者进行早期治疗。

本发明的试剂盒进行早期Brachyury阳性肿瘤(肺癌)检测方法，具体步骤为：

取受试者外周抗凝血4-5ml，离心两次收集血浆，取200ul血浆以Blood miRNA kit抽提总microRNAs，利用试剂盒中的反转录引物反转录后，与试剂盒中的标准品共同进行Real-Time PCR扩增，测定受试者外周血中该组microRNAs的含量，并与标准品的检测数据进行比对，鉴定是否发生上调。

本发明中的miRNAs组合针对正常成人体内限制表达的特异性肿瘤靶点Brachyury阳性的肿瘤患者进行肿瘤的早期筛查和诊断，其特异性和灵敏度显著高于目前临床上使用的各相关肿瘤诊断标记物，可以在肿瘤发生的早期进行诊断，不仅提高了诊断的准确性，而且为肿瘤的临床前发现提供了依据，对于肿瘤的早期治疗和医疗成本的节约都具有重要意义。该miRNA组合物可在制备检测Brachyury阳性肿瘤的试剂或工具中应用。可对于正常人群进行肿瘤早期筛查和诊断。

附图说明

图1：在肺癌细胞系H1299中利用慢病毒转入外源性转录因子Brachyury后，对对照组细胞与过表达Brachyury组细胞进行microRNAs芯片分析(三次生物学重复)，热图红色部分提示即为过表达Brachyury后发生上调的microRNAs；

图2：在作为正常体细胞对照的293T细胞中利用慢病毒转入外源性转录因子Brachyury后，对对照组细胞与过表达Brachyury组细胞进行microRNAs芯片分析(三次生物学重复)，热图红色部分提示即为过表达Brachyury后发生上调的microRNAs；

图3：试剂盒扩增引物检测Brachyury阳性的肺癌患者、健康志愿者与慢性阻塞性肺炎(COPD)患者外周血中已知一组microRNAs的含量检测CT值趋势；

图4：试剂盒扩增引物检测3个Brachyury阳性的肺癌患者、3个健康志愿者与3个COPD患者外周血的表达水平数值；

图5：试剂盒扩增检测hsa-miR-4286在Brachyury阳性的肺癌患者、Brachyury阴性肺癌患者，并以试剂盒中标准品做为正常对照测定外周血的表达水平，通过外参基因进行校正，；

图6：使用该试剂盒检测hsa-miR-4286在6个随机慢阻肺患者外周血的表达水平，并以试剂盒中标准品做为正常对照，以外参基因做校正。

图7：试剂盒扩增外周血总microRNAs中hsa-miR-449c在Brachyury阳性的肺癌患者、Brachyury阴性肺癌患者中的表达水平，以试剂盒中标准品做为正常对照，通过外参基因进行校正；

图8：使用该试剂盒检测hsa-miR-449c在6个随机慢阻肺患者外周血的表达水平，并以试剂盒中标准品做为正常对照，以外参基因做校正。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

实施例1：被肿瘤特异性转录因子Brachyury调控的microRNAs

为寻找被肿瘤特异性转录因子Brachyury调控的microRNAs，本发明人在一株肺癌细胞系H1299和作为正常人体对照细胞的293T中利用慢病毒感染转入外源性Brachyury的cds序列使之过表达后再应用microRNA芯片技术筛选出被Brachyury调控后发生显著上调的若干microRNAs(见图1、图2)。

经过Real-Time PCR验证这些microRNAs的表达改变与芯片结果一致。随后在对临床上肺癌患者、慢性阻塞性肺炎患者以及正常人群的血浆采集和检测中发现，microRNAs组中hsa-miR-4286、hsa-miR-449c、在肺癌患者中呈现显著高表达，而在其它肺部实质性病变患者和正常人群中则未见表达水平的显著异常(见图3，图4)。

实施例2：本发明试剂盒的制备

本发明试剂盒组成成分为：

A.特异性反转录引物2管10uM浓度，200uL；

B.Real-Time PCR扩增上游引物(见表格2)2管(A1、A2)10uM浓度，200uL/管；Real-Time PCR扩增下游引物(见表格2)1管10uM浓度2mL/管；

C.含定量microRNAs的标准品1管；

该组microRNAs特异性反转录引物为根据成熟microRNAs序列添加固定Loop(环结构)片段，再由美国invitrogen公司进行合成，纯度为PAGE级，合成后的引物用DEPC H₂O溶解，终浓度为10μM。

特异性的microRNAs上下游引物：根据成熟microRNAs特异性序列添加经验序列并通过软件调节GC含量使Tm值与下游引物一致。下游引物为反转录引物上的固定序列，引物全部由美国invitrogen公司合成，纯度为PAGE级，合成后的引物用DEPC H₂O溶解，终浓度为10μM。

标准品为经检测验证过的符合健康正常人外周血该组microRNAs表达水平的反转录样品混合而成，其中10个microRNAs的含量固定在健康人群平均水平。进行每一批次的受试人群检测时，均需同时PCR扩增该标准品以进行结果比对。

实施例3：本试剂盒的检测方法

(一)、采集血浆样本、抽提microRNAs与反转录：

采集外周血进行检测具有无创伤、采集方便等优点，因此，通过采集和检测外周血中的一系列microRNAs分子标记物来进行肺癌早期的筛查不但容易普及，而且具有准确性高的优点，能够及时发现早期的Brachyury阳性肺癌，从而达到早发现早治疗、提高患者生存率的目的。

验证用血浆样品从上海长征医院住院部与门诊采集，30例原发性肺癌或肺癌骨转移标本(选取其中经免疫组化验证为Brachyury阳性的患者3例)，30例健康志愿者标本(随机选取其中3例)以及30例慢性肺实质性炎症(COPD)患者标本(随机选取其中3例)作对照。提取患者外周血总microRNAs后检测一系列芯片结果中提示上调的microRNAs，其中，hsa-miR-4286与hsa-miR-449c显示出明显肺癌特异性趋势，即在肺癌中的表达水平较正常人群明显增高，表现为肺癌患者中的CT值低于正常对照人群，且在慢性阻塞性肺炎患者中较正常人群却未见显著表达水平变化(图3)。分别将每组三个患者的CT值分别呈现时，可以看出三组人群的表达分布一致性非常高，均表现为正常人的CT值最高、肺癌患者的CT值最低、慢阻肺患者表达水平介于两者之间并更接近正常人群。没有出现假阳性或者假阴性的表达情况(图4)。提示这两个microRNAs作为肺癌特异性标记物具有进一步验证的价值。

纳入标准：

1、2012年5月到2014年10月在上海长征医院诊断为原发性肺癌以及肺癌骨转移的患者，前提是从医疗记录中，可获得所有与肿瘤相关的历史数据以及肿瘤组织免疫组化检测为Brachyury阳性表达；

2、在上海长征医院新诊断为原发性肺癌或肺癌骨转移的患者以及肿瘤组织免疫组化检测为Brachyury阳性表达；

3、在上海长征医院或其它医疗机构诊断为原发性或转移性肺癌以及免疫组化检测为Brachyury阴性表达作为对照组；

4、在上海长征医院或其它医疗机构新诊断的慢性阻塞性肺炎、肺纤维化的肺实质性病变的患者作为对照组；

5、正常人群作为对照组；

排除标准：

1、排除其它组织系统肿瘤患者；

2、排除睾丸与结肠部位肿瘤或慢性疾病患者；

3、排除其它非肺实质性病变的肺部疾病患者。

对符合上述标准的患者进行血样采集，抽取外周血4-5mL，置于EDTA抗凝管中，两次离心后取上清，取400uL进行总microRNAs抽提。

应用QIAGEN的Blood microRNA kit提供的标准实验步骤提取血浆中的总小片段RNA。

将抽提出的小片段RNA反转成cDNA：10×PrimeScript^TM Buffer(for Real Time)1.5μL、PrimeScript^TM RT Enzyme Mix 0.5μL(TaKaRa)、反转录引物A/B2μL、前述步骤中富集的总小片段RNA 10uL、DEPC H2O 1μL补足总体积达到15μL。反转录步骤：37℃ 20min，85℃ 5min。

(二)、目的基因的Real-Time PCR扩增：

采用TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq^TM试剂和Applied Biosystems的：实时定量PCR仪，进行PCR反应：

主要实验条件为：退火温度56℃，40个cycles(循环)

本试剂盒采用正常人群中此两个microRNAs表达水平位于中位值的人群的总microRNAs以hsa-miR-4286与hsa-miR-449c的特异性反转录引物扩增反转成的cDNA作为标准品，每一个反应进行时均同时对标准品进行PCR扩增，并根据标准品的扩增CT值对检测样品进行比较，每一个样品均进行3复孔重复，以内参5S或外参ce-miR-39进行校对，通过2^-△△Ct法计算出检测样品中已知一组microRNAs表达水平的相对定量值。并通过T检验的方法计算该检测样品中的一组microRNAs是否存在异常表达。

实施例4：原发性肺癌或转移性肺癌患者外周血该组microRNAs表达水平检测

根据前述实验方法，选取6例原发性/转移性肺癌患者(经免疫组化检测明确出3个Brachyury阳性患者和3个Brachyury阴性患者)外周血血浆标本进行qPCR扩增，与标准品(设为1)进行比较后发现在Brachyury阳性的肺癌患者外周血中hsa-miR-4286与hsa-miR-449c的表达水平发生了有统计学意义的上调，P<0.05。

Brachyury阳性患者hsa-miR-4286分别平均上调了64倍、48.93倍、81.7倍。

而Brachyury阴性肺癌患者的hsa-miR-4286则分别平均上调了5.6倍、7.06倍、4.3倍(图5)。

同样，hsa-miR-449c也呈现出相同的表达趋势，即在Brachyury阳性肺癌患者外周血中hsa-miR-449c分别平均上调了24.1倍、6.86倍、31倍，而Brachyury阴性肺癌患者与正常对照组比则并没有出现明显差异，反而发生了一定程度的下调(图6)。

实施例5：其它肺部慢性炎症患者外周血该组microRNAs表达水平检测

同样根据前述实验方法，选取6例慢性阻塞性肺炎(COPD)患者外周血血浆标本进行qPCR扩增，与标准品(设为1)进行比较后发现hsa-miR-4286与hsa-miR-449c在COPD患者外周血中的表达水平并未发生有统计学意义的上调。

在这些随机选取慢阻肺患者的外周血中hsa-miR-4286的上调倍数最多的一例6.8倍的上调(图7)。

在随机抽取的这6例慢阻肺患者的血浆中hsa-miR-449c的表达较正常对照也未见显著差异，最大的上调倍数为2.37倍，较Brachyury阳性肺癌患者中上调倍数最低值降低近3倍(图8)。

据此推断，hsa-miR-4286与hsa-miR-449c作为肺癌特异性诊断标记以本试剂盒检测，通过以试剂盒中的正常对照样品，即标准品最比较，可以明确区分出Brachyury阳性的肺癌患者，并以此为临床提供诊断线索。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims

1.检测microRNAs表达量的试剂在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂盒中的应用，其特征在于，所述的microRNAs选自hsa-miR-4286、hsa-miR-449c中的任一或两者的组合；所述的Brachyury阳性肿瘤为肺癌。

2.根据权利要求1所述的检测microRNAs表达量的试剂在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂盒中的应用，其特征在于，所述的Brachyury阳性肿瘤是指该肿瘤中Brachyury呈现出高水平的表达。

3.根据权利要求1或2所述的检测microRNAs表达量的试剂在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测microRNAs表达量的试剂是寡聚核苷酸。

4.根据权利要求3所述的检测microRNAs表达量的试剂在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂盒中的应用，其特征在于，所述的寡聚核苷酸包括反转录引物、PCR上游引物，或PCR下游引物。

5.根据权利要求3所述的检测microRNAs表达量的试剂在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂盒中的应用，其特征在于，所述的寡聚核苷酸序列为如下A组、B组，或AB两组的组合：

A组：反转录引物如SEQ ID NO:3所示；PCR上游引物如SEQ ID NO:4所示；PCR下游引物如SEQ ID NO:5所示；

B组：反转录引物如SEQ ID NO:6所示；PCR上游引物如SEQ ID NO:7所示；PCR下游引物如SEQ ID NO:5所示。

6.根据权利要求4或5所述的检测microRNAs表达量的试剂在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂盒包括以下组分：

A.反转录引物，1管10uM浓度，100uL；

B.PCR上游引物，1管10uM浓度，100uL/管；

C.PCR下游引物，1管10uM浓度，100uL/管；

D.正常标准品，1管，10uM浓度，100uL。

7.根据权利要求6所述的检测microRNAs表达量的试剂在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂盒中的应用，其特征在于，利用所述的寡聚核苷酸检测hsa-miR-4286或hsa-miR-449c表达量的方法包括如下步骤：

取样本中的总RNA，加入反转录引物、5×PrimeScript Buffer、PrimeScript RTEnzyme Mix I、RNase Free dH₂O反转录成cDNA，应用EASY Dilution稀释试剂盒中的正常标准品，以所反转录的cDNA为模板向反应体系中加入PCR上游引物、PCR下游引物，通过反转录联合聚合酶链式反应检测hsa-miR-4286或hsa-miR-449c的表达量。