CN114350812A - 与奥西替尼耐药性相关的NSCLC-free RNA-3及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药性相关的NSCLC‑free RNA‑3及其应用，通过检测被试者血清中NSCLC‑free RNA‑3的表达，与健康对照组相比较特异性降低，以此来判断被试者有EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药性。NSCLC‑free RNA‑3不仅具备目前核酸分子用于临床诊断的技术优势，而且稳定性高、显著提高诊断的准确率，提示NSCLC‑free RNA‑3极有可能成为临床肿瘤靶向药物耐药早期诊断划时代的新指标，NSCLC‑free RNA‑3的诸多优点可能为临床疾病的新药研制提供依据。
Description
技术领域
本发明属于小分子RNA领域，特别涉及一种小分子RNA片段(NSCLC-free RNA-3)，在制备EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药诊断试剂盒中的应用。
背景技术
我国肺癌的发病率和死亡率一直高居首位，而肺癌患者中约有85％为非小细胞肺癌(NSCLC)，其中半数以上就诊时已属晚期，失去手术机会。传统化疗疗效有限，5年生存率低于15％。随着医疗的进步，针对肿瘤驱动基因分子的靶向药物因疗效好、安全性高等特点，逐渐成为了晚期NSCLC的标准治疗方法，尤其是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibition，EGFR-TKI)。奥西替尼(AZD9291)作为第三代EGFR-TKI代表药物，对比第一、二代TKI药物疗效显著，是目前广泛应用于临床一线的NSCLC靶向药物。然而奥西替尼用药18个月左右不可避免出现耐药。由于个体差异，奥西替尼耐药发生的具体时间并不相同，目前临床上只能依靠肿瘤是否进展来判断有无发生耐药，耗时长且缺乏灵敏性，严重影响了NSCLC患者的后续治疗和生存时间，大大增加了患者的经济负担。因此，制备EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药的分子标志物，并开发成早期诊断试剂盒，对于在耐药早期、通过液态活检即可精准地诊断EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药，对患者早期更改治疗方案、延长生命周期无疑具有重要的临床意义和社会应用价值。
在过去近20年的时间里，非编码RNA组学，如微小RNA(miRNA)及长链非编码(longnoncoding RNA,lncRNA)组学研究的飞速发展，逐渐证实既往被认为是转录噪音的非编码RNA，在非小细胞肺癌的发生发展中也发挥着极为重要的调控作用，也帮助人们对非小细胞肺癌发生发展理论的认知取得了长足的进步。多项研究表明，非编码RNA不仅在肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭转移等多个生物学过程均发挥重要的调控作用，同样与肿瘤耐药密切相关，是一类肿瘤诊断、预后的新型生物标志物和潜在的治疗靶点。大量研究证实，体液中存在大量的核酸片段，包括双链游离cfDNA、小非编码RNA(small non-coding RNA，sncRNA)等，由于小非编码RNA在多种疾病及肿瘤组织/体液中具有显著差异表达、高稳定性的特征，其极有可能成为疾病诊断的新指标。
与此同时，近两年随着新冠核酸检测试剂盒及ctDNA检测在临床上的广泛应用，与传统的蛋白或代谢物检测相比较，核酸检测(包括DNA和RNA)在疾病诊断中已经体现出尤为卓越的优势：组织特异性强、灵敏度高、检测方法成熟简便、假阳性率低、可重复性强、普及率高等特点。由于新冠疫情，核酸检测设备和使用已非常成熟，在各地级二甲及以上医院或第三方检测机构均可开展基于核酸检测技术的检验项目。因此，我们希望借此机会能够将核酸检测技术用于此类疾病的早期诊断，无疑对提升地区人口质量、减缓社会负担、增加社会效益、发展地区经济具有重要的帮助。
发明内容
本发明的目的是提供小分子RNA片段(NSCLC-free RNA-3)，检测NSCLC-free RNA-3表达水平的试剂在制备EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药诊断试剂或试剂盒中的应用，为临床诊断EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药提供参考。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：与EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药性相关的NSCLC-free RNA-3，所述NSCLC-free RNA-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
检测根据权利要求1所述的NSCLC-free RNA-3表达水平的试剂在制备检测EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药性的试剂或试剂盒中的应用。
进一步的，诊断试剂通过检测被试者血清中NSCLC-free RNA-3的表达，与健康对照组相比较特异性降低，以此来判断被试者有EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药性。
一种用于诊断EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药性的试剂盒包含检测血清中NSCLC-free RNA-3表达水平的检测试剂，所述小分子RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，检测试剂包括：
A、RNA抽提系统，包括TRizol、异丙醇、氯仿、无水乙醇；
B、逆转录系统，包括逆转录引物、逆转录酶混合物；
C、引物系统，包括前、后引物，氨基酸序列如SEQ ID NO.2和3所示；
D、扩增系统，包括DNA聚合酶、扩增buffer。
本发明的小分子RNA片段来源于EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药肿瘤组织，并且以旁分泌的方式释放到病灶微环境中。在前期研究中，我们根据RECIST实体瘤疗效评价标准1.1，分离提取EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼肿瘤敏感/耐药肿瘤组织中的EM-free RNA并进行去修饰预处理后，通过高通量测序技术，我们发现：
①EGFR阳性非小细胞肺癌患者的肿瘤组织(奥西替尼肿瘤敏感vs奥西替尼肿瘤耐药，各50例)具有独特的RNA表达谱。
②通过qRT-PCR实验验证发现，NSCLC-free RNA-3在奥西替尼肿瘤耐药患者血液中的表达水平与奥西替尼肿瘤敏感患者相比均显著低表达，与组织中的趋势高度一致。
③技术改进：分离纯化小RNA后，通过高温处理打开RNA二级结构并去修饰后，NSCLC-free RNA-3检测灵敏度提高了64倍；
④同时，通过小RNA富集纯化联合核酸质谱检测发现血清中的NSCLC-free RNA-3修饰图谱和组织中的修饰图谱一致，高度提示血清中NSCLC-free RNA-3可能来源于EGFR阳性非小细胞肺癌肿瘤组织。
⑤在相同纳排标准下，我们分别检测NSCLC-free RNA-3在对其他非小细胞肺癌靶向药物，如伊马替尼、阿法替尼耐药的患者血清中的表达水平。结果显示NSCLC-free RNA-3在EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药患者血清中特异性降低。
因此我们有充分的理由相信：NSCLC-free RNA-3极有可能是EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药组织分泌到体液中、并且是液态活检的分子标志物。
基于本发明所述的新用途：可基于NSCLC-free RNA-3为靶点，制备诊断EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药的试剂盒。
有益效果：NSCLC-free RNA-3不仅具备目前核酸分子用于临床诊断的技术优势，而且稳定性高、显著提高诊断的准确率，提示NSCLC-free RNA-3极有可能成为临床肿瘤靶向药物耐药早期诊断划时代的新指标，NSCLC-free RNA-3的诸多优点可能为临床疾病的新药研制提供依据。
附图说明
图1.差异性分泌tRFs在奥西替尼耐药/敏感组织中的表达水平验证结果。
图2.差异tRFs在EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药/亲本细胞株内的表达验证。(图2A为EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药细胞株耐药性鉴定，图2B为NSCLC-freeRNA-3在耐药细胞/亲本细胞中的表达情况)。
图3.NSCLC-free RNA-3在奥西替尼耐药/敏感患者组织及血液中表达验证情况。
图4.线性化及去修饰化的NSCLC-free RNA-3在奥西替尼耐药/敏感患者组织及血液中表达验证情况。
图5.NSCLC-free RNA-3在对其他靶向药物耐药/敏感患者血液中的表达。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
实施例1
在组织样本库中，选取6例EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼肿瘤敏感组织和6例EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼肿瘤耐药组织(根据RECIST实体瘤疗效评价标准1.1)。
表1：临床样本基本信息
| 肿瘤敏感组织(n＝6) | 肿瘤耐药组织(n＝6) | ||
| 年龄 | 45.5±6.5 | 47.5±4.5 | p>0.05 |
| BMI | 23.4±1.2 | 23.1±4.1 | p>0.05 |
表1：两组患者的年龄和BMI指数均无统计学差异(p>0.05)
采用高通量测序技术，开展敏感与耐药EGFR阳性非小细胞肺癌组织中差异tRFs的筛选工作。测序结果显示：与EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼敏感组织相比，耐药组织中差异高表达的tRFs有27条、低表达的tRFs有32条(变化倍数>2，p<0.05,FDR<0.05)(表2)。
表2.差异性游离RNA(变化倍数>2，p<0.05，FDR<0.05)
实施例2
针对测序结果，我们依据组间差异倍数较大、组内差异较小的筛选原则，首先挑选出12条差异表达的tRFs，其中3条差异高表达、9条差异低表达于奥西替尼肿瘤耐药组织中。
通过RNA抽提系统(包括TRizol、异丙醇、氯仿、无水乙醇等)提取样本中的RNA，然后通过逆转录引物等进行逆转录，以特异性引物进行Real time PCR可以有效验证样本中的小分子RNA含量。
因此，我们在在奥西替尼治疗敏感(20例)和奥西替尼治疗耐药(20例)组织中，运用Real time PCR技术进行了验证，结果显示tRFs的表达趋势与测序结果基本一致，提示测序数据重复性良好(图1)。
为进一步缩小研究范围，我们挑选差异倍数最大的3条tRFs：NSCLC-free RNA-3、NSCLC-free RNA-311、NSCLC-free RNA-38，在我们前期构建的EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药细胞株(PC-9/AR,H1975/AR,HCC827/AR)(图2A)和亲本细胞株(PC-9(EGFR19外显子缺失),H1975(EGFR L858R/T790M错义突变)，HCC827(EGFR19外显子缺失和MET扩增)中检测这3条tRFs的表达水平。结果显示，其中仅一条NSCLC-free RNA-3呈现出在所有的EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼腺癌耐药细胞中均显著低表达、在亲本细胞株中高表达(图2B)的特殊性，引起了我们极大的关注。
实施例3
扩大临床样本，分别收集EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药/敏感患者的肿瘤组织及血液样本各50例(如表3)。明确NSCLC-free RNA-3在正常人群中的检测基线。
表3：扩大临床样本的基本信息
BMI：身体质量指数，AFS：美国生育协会腹腔镜诊断内异症评分系统
实施例4
通过qRT-PCR实验验证发现，NSCLC-free RNA-3在奥西替尼耐药患者血液中的表达水平与奥西替尼敏感患者组织相比均显著低表达，与组织中的趋势高度一致(图3)。检测前处理样本：使用实例2中步骤分离纯化小RNA后，根据NSCLC-free RNA-3二级结构及碱基序列，使用52℃-58℃处理捕获的NSCLC-free RNA-3，使NSCLC-free RNA-3线性化；加入去甲基化酶(ALKBH5或FTO)后反应时间60min后，所得产物用于qRT-PCR检测样本内NSCLC-free RNA-3的相对表达水平。结果显示：线性化及去修饰的NSCLC-free RNA-3在EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药/敏感患者的肿瘤组织及血液样本中(各50例)，定量PCR与前期测序结果基本一致(图4)。
实施例5
利用定量PCR在血清中检测NSCLC-free RNA-3的表达情况,结果提示：NSCLC-freeRNA-3在EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药患者中较敏感患者明显降低(图4)。在相同纳排标准下，我们分别检测NSCLC-free RNA-3在对其他非小细胞肺癌靶向药物，如吉非替尼、吉非替尼、克唑替尼等耐药的患者血清中的表达水平。结果显示：NSCLC-free RNA-3在EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药患者血清中特异性降低(图5)。
结论：NSCLC-free RNA-3可稳定且特异性表达于EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药患者的血液中，可能为EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药的早期诊断提供新的思路和有效的检测方法。
序列表
<120>与奥西替尼耐药性相关的NSCLC-free RNA-3及其应用
<141> 2022-01-24
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
tagccgtaag gcggctgttt ttgcttt 27
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
gccgagacag caacaacag 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3
ctcaactggt gtcgtgga 18
Claims (5)
1.与奥西替尼耐药性相关的NSCLC-free RNA-3，其特征在于：所述NSCLC-free RNA-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.检测根据权利要求1所述的NSCLC-free RNA-3表达水平的试剂在制备检测EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药性的试剂或试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述诊断试剂通过检测被试者血清中NSCLC-free RNA-3的表达，与健康对照组相比较特异性降低，以此来判断被试者有EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药性。
4.一种用于诊断EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药性的试剂盒，其特征在于：包含检测血清中NSCLC-free RNA-3表达水平的检测试剂，所述小分子RNA的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
5.根据权利要求4所述的用于诊断EGFR阳性非小细胞肺癌奥西替尼耐药性的试剂盒，其特征在于：所述检测试剂包括：
A、RNA抽提系统，包括TRizol、异丙醇、氯仿、无水乙醇；
B、逆转录系统，包括逆转录引物、逆转录酶混合物；
C、引物系统，包括前、后引物，氨基酸序列如SEQ ID NO.2和3所示；
D、扩增系统，包括DNA聚合酶、扩增buffer。
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|---|---|---|---|
| CN202210087881.XA CN114350812A (zh) | 2022-01-25 | 2022-01-25 | 与奥西替尼耐药性相关的NSCLC-free RNA-3及其应用 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN116121245A (zh) * | 2022-08-22 | 2023-05-16 | 南京市妇幼保健院 | 小分子rna及其在子宫内膜异位症早期诊断中的应用 |
-
2022
- 2022-01-25 CN CN202210087881.XA patent/CN114350812A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN116121245A (zh) * | 2022-08-22 | 2023-05-16 | 南京市妇幼保健院 | 小分子rna及其在子宫内膜异位症早期诊断中的应用 |
| CN116121245B (zh) * | 2022-08-22 | 2023-08-01 | 南京市妇幼保健院 | 小分子rna及其在子宫内膜异位症早期诊断中的应用 |
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