CN105969857A

CN105969857A - 非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法

Info

Publication number: CN105969857A
Application number: CN201610319838.6A
Authority: CN
Inventors: 林文楚; 王伟; 洪波; 李红; 高小平; 王伙刚
Original assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Current assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Priority date: 2016-05-12
Filing date: 2016-05-12
Publication date: 2016-09-28

Abstract

本发明公开了一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，属于基因检测领域。本发明基于多重PCR和高通量测序技术开发出一种用于检测12个致癌基因的466个突变的方法，所述的致癌基因为AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA和PTEN，所述突变可以是一个或多个碱基的置换、插入和/或缺失。本发明的检测方法灵敏度高，检测灵敏度高达0.01％，检测结果明确客观，可以直接反应相关基因的具体突变位点，可以直接用于指导临床非小细胞肺癌靶向用药以及用于癌症早期诊断或辅助诊断及筛查和癌症愈后监测。

Description

非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法

技术领域

本发明属于基因检测领域，更具体地说，涉及一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法。

背景技术

全国第三次人口死亡病因调查显示，过去三十年来，我国肺癌的死亡率上升了465％，超过肝癌成为死亡率最高的癌症。据估计，2015年我国肺癌的新发病例为733300例(男性509300例、女性224000例)，死亡610200例(男性432400例、女性177800例)，其发病率和死亡率均居所有恶性肿瘤的首位。因此，肺癌在我国已成为一个非常重要的公共卫生问题。

肺癌根据组织学可分为小细胞肺癌(small cell lung carcinoma,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)，非小细胞肺癌约占肺癌总数的80％左右，主要分为腺癌(～50％)和鳞癌(～40％)两个亚型。通常腺癌发生在肺段支气管以下的细支气管或肺泡壁。鳞癌则多发生在肺中央的主支气管和支气管的管腔并伴随着慢性炎症。

目前，临床上非小细胞肺癌仍以组织病理学诊断为确诊和治疗的依据，使用的治疗方法是根据其分期采取手术或手术结合放化疗进行治疗。但由于非小细胞肺癌缺乏有效的早期诊断手段，70％以上的患者在确诊时已是中晚期，错过了最佳手术时期。而非小细胞肺癌各种化疗方案的总体有效性仅为30％左右，同时有些患者无法耐受化疗和放疗以及化疗后很快耐药，从而导致非小细胞肺癌患者确诊后5年生存率很低，晚期患者五年生存期只有15％左右。

近年来，分子靶向治疗逐渐受到人们的关注并广泛应用于临床。分子靶向治疗是使用药物针对已经明确的致癌基因，特异地杀死肿瘤细胞，因此分子靶向治疗的副作用更小和特异性更高，也为晚期非小细胞肺癌患者提供了新的有效治疗手段。这其中最典型的例子是肺腺癌的EGFR突变靶向治疗。在我国，约30％非小细胞肺癌患者存在EGFR突变。对这类患者采用EGFR激酶抑制剂-吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼，有效率可以达到70％～80％。过去十年针对非小细胞肺癌的特定基因突变开展的靶向治疗就已让晚期肺癌患者中位生存期显著增加2.4倍，从此前的14.1个月延长至33.5个月，相较于传统的治疗方法优势明显。目前，临床上关于非小细胞肺癌的靶向药物，然而除激酶抑制剂-吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼以外，还有作用于AKT的抑制剂普喹替尼和MK-2206 2HCL等，ALK突变靶向药物克唑替尼、色瑞替尼、Crizotinib、Ceritinib、氟卓替尼、Ganetespib和PF-06463922等，可靶向作用于BRAF突变的维罗非尼、索拉菲尼、曲美替尼、达拉替尼极易西妥昔单抗和帕尼单抗等，作用于EGFR突变的还有埃克替尼、AZD9291、艾力替尼、西帕替尼、易吡替尼、西莫替尼、席栗替尼、吡咯替尼、麦他替尼、帕尼单抗、西妥昔单抗、尼妥珠单抗、Hemay020、Rociletinib、HM61713、WZ4002和AZD3759等，ERBB抑制剂达可替尼、Neratibib、Tovok-afatinib-BIBW2992和PF-00299804等，FGFR1/2/3抑制剂Nintedanib、索凡替尼、德立替尼、丙氨酸布立尼布、AZD4547等，KRAS的抑制剂瑞格菲尼、Deltarasin及西妥昔单抗，抑制MET的小分子化合物Ficlatuzumab、INC280、赛尔非尼、沃利替尼、宁格替尼、Tivantinib、Foretinib和Golvatinib等，可靶向作用于PIK3CA突变的吉非替尼、厄洛替尼、帕尼单抗、西妥昔单抗和尼妥珠单抗等，作用于PTEN突变的西妥昔单抗和尼妥珠单抗等。然而，并非所有的非小细胞肺癌患者对分子靶向治疗均表现出较好的疗效，比如现有资料表明EGFR基因突变与EGFR激酶抑制剂敏感性相关，EGFR基因突变患者对EGFR激酶抑制剂吉非替尼的有效率达60％以上，而EGFR基因野生型(即未突变型)患者的有效率仅为10％－15％。因此，明确肺癌组织的突变状况对靶向药物的临床使用和疗效预测有重要的指导意义。而分子靶向药物的使用需要明确肿瘤患者存在可靶向治疗的基因突变，所以基因突变的检测是确定治疗方案的关键。

临床中非小细胞肺癌的诊断样品70％是小的活检样品，其首先被用于临床病理学诊断，剩下的有限组织若要用作分子诊断，则对其核酸含量及提取方法都有较高的技术操作要求。且病理形态相同的非小细胞肺癌，由于分子遗传学改变，在分子水平上呈现高度异质，这种组织的异质性使得一些活检样本无法反应肿瘤基因突变的全貌，从而导致对靶向治疗的反应差别很大。同时，肿瘤异质性也是不断变化的，无法通过一两次的活检或组织样本来检测患者的病情。

高通量测序技术是一项国际先进的新型测序技术，它通过多基因、多位点的集成式检测，可一次性检测与肿瘤靶向治疗密切相关的基因位点。它所需的核酸要求不高，是应用于肿瘤基因检测的一个很好的选择。此外，肿瘤是基因组疾病，单一基因的检测难以满足指导个体化治疗的需要。而以高通量测序和大数据分析为基础，对非小细胞肺癌进行多基因突变检测，能够精确的地给出患者癌组织的基因突变信息，从而指导医生为病人制定针对性的个性化靶向治疗方案。同时，也可用于非小细胞肺癌病人的早期诊断和筛查。

目前，市场上对于非小细胞肺癌的检测主要停留在单个或几个位点的检测水平，检测方法一般使用荧光PCR、芯片分析等方法，例如，中国专利申请号为201310200169.7，申请公布日为2013年9月11日的专利文件公开了一种用于检测ALK基因表达的探针、引物及试剂盒，包括以下序列：SEQ ID NO1-SEQ ID NO12，该发明的引物和探针可以特异检测ALK基因表达差异，以确定是否存在ALK基因融合，该发明建立的用于检测ALK基因表达差异的实时荧光PCR体系，通过检测5’端和3’端基因表达量的差异，提供ALK基因表达差异外显子的定性评估，适用于非小细胞肺癌患者在进入个性化靶向治疗之前。中国专利申请号为201310068052.8，申请公布日为2013年6月5日的专利文件公开了一种早期非小细胞肺癌多位点关联基因的引物、探针、试剂盒及其制备方法和检测方法。该发明针对非小细胞肺癌的早期检测与之相关联的EGFR，CHRNA3，CHRNA5及ERCC1基因内部的rs2239680，rs16969968，rs12910984及rs2298881位点的基因型进行分型，利用以上4个位点联合作为非小细胞肺癌早期诊断的标志物，提高了检测的真实性和准确性。然而，由于癌症是基因组疾病，单一或几个基因突变位点的检测难以满足指导个体化治疗的需要。已经报道的几种检测非小细胞肺癌的方法只包含了极少的几个基因突变位点，不能有效的反应患者癌症突变的全貌，难以用于临床指导，且临床发现单一基因的靶向用药多数存在治疗无效或很快产生药物抗性等不利反应，因此，我们需要一种更加全面有效的检测手段。同时，对癌症进行全基因组或全外显子测序可以获得海量的基因突变数据。然而，这些测序费用极其昂贵，后期数据分析要求极高、耗时长达数月，且由于我们对绝大多数基因突变在癌症中的功能认识有限，目前仅针对极少的一部分基因研发出了靶向药物。因此，全基因组或全外显子测序检测肺癌的方法无法应用于临床需求。根据前期研究表明，非小细胞肺癌存在多种基因突变，其中最常见的突变包括致癌基因AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA和PTEN，更重要的是这些突变临床上均已开发或正在测试靶向药物，对于这些基因突变的检测将更好的指导医生为病人制定针对性的个性化靶向治疗方案。

综上所述，现有的非小细胞肺癌的检测方法都存在一定的缺陷，例如结果不易判读、重复性差、假阳性和假阴性多、检测基因少、通量低等问题。而现在市场上存在的一些基于高通量测序技术检测肺癌的方法，存在对样品的要求较高、目的性不强、操作繁琐、引物或探针设计复杂、检测费用高等缺点，特别是不能指导靶向用药，因此急需一种新型的检测方法以满足市场和医疗的需求。

发明内容

1.要解决的问题

针对现有的非小细胞肺癌检测方法存在结果不易判读、重复性差、假阳性和假阴性多、通量低等问题，本发明提供一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，是一种基于多重PCR和高通量测序技术开发出一种用于检测12个致癌基因的466个突变的方法，所述的致癌基因为AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA和PTEN，所述突变可以是一个或多个碱基的置换、插入和/或缺失。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其步骤包括：

A.从待测样品中提取基因组DNA；

B.使用非小细胞肺癌靶向治疗基因特异性引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.96，对步骤A中提取的基因组DNA上的目的片段进行多重PCR扩增；

C.对步骤B中得到的多重PCR扩增产物进行酶切后连接测序接头，构建测序文库；

D.对步骤C中构建的测序文库进行高通量测序，获得目的基因片段的序列信息。

优选地，检测的基因为AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA或PTEN；本发明的特异性引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.96(见表1)是针对上述的非小细胞肺癌12个致癌基因的466个突变位点的特定序列设计的，可以扩增致癌基因AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA和PTEN的突变位点区域，扩增产物经高通量测序获得其序列信息，从而检测出样品中这些基因的突变状况。本发明所用引物(SEQ ID No.1～SEQ ID No.96)，可使用多重PCR扩增技术在一管中同时有效的扩增目标序列，所得PCR产物经限制性内切酶酶切和连接测序接头后，用于制备测序文库和上机进行高通量测序，所构建的测序文库经NanoDrop 2000、Agilent Bioanalyzer 2100、LabChip GX Touch和Qubit 3.0检测合格后适用于多种高通量测序平台，包括IlluminaNextSeq 500/550测序仪、Illumina MiSeq测序仪、Illumina MiniSeq测序仪、IlluminaHiSeq 2500/3000/4000测序仪、Ion Proton测序仪和Ion PGM等测序仪。

表1 非小细胞肺癌12个靶向治疗基因突变位点检测SEQ No.1～SEQ No.96引物序列

备注：序列号代表引物序列的编号，Forward Primer表示正向引物序列，ReversePrimer代表反向引物序列。

优选地，步骤A中的待测样品包括但不限于新鲜肿瘤组织、新鲜活检组织、石蜡包埋组织、全血、血清、血浆、唾液和尿液；提取基因组DNA时，使用但不限于组织DNA提取试剂盒、石蜡包埋组织DNA提取试剂盒、全血DNA提取试剂盒、血清DNA提取试剂盒或血浆基因组DNA提取试剂盒。

优选地，步骤A中提取基因组DNA后对DNA进行质量检测，用于质量检测的仪器优选为NanoDrop2000、Agilent Bioanalyzer 2100、LabChip GX Touch和Qubit 3.0，对DNA的质量要求为：DNA浓度大于20ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0；步骤B中的特异性引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.96进行多重PCR扩增时同时加入。

优选地，步骤B中多重PCR扩增的反应体系为：5X PCR Buffer 10μL、MgCl₂(25mM)3μL、dNTPs(10mM each)2μL、Primers Mix(100nM each)10μL、DNA template 10～20ng、Taqpolymerase(5U/μL)1μL，用ddH₂O加至50μL；步骤B中多重PCR扩增的反应条件为：

可以使用Phusion U Green Multiplex PCR Master Mix、QIAGEN Multiplex PCRKit、NEB Multiplex PCR 5X Master Mix和MagniTaq Multiplex PCR Master Mix等试剂盒进行扩增；多重PCR扩增后所得产物，还可以使用但不限于：QIAquick PCR PurificationKit、GeneJET PCR Purification Kit、PureLink PCR Purification Kit、GenElute PCRClean-Up Kit和NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit等试剂盒进行纯化。步骤B所述多重PCR扩增同时包含对阴性对照的扩增，所用阴性对照的样本为正常人基因组DNA。

步骤B中所述的基因组DNA上的目的片段是指分别包含非小细胞肺癌12个靶向治疗基因(AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、-MET、PIK3CA和PTEN)的466个突变位点的基因片段，12个靶向治疗基因的466个突变位点如表2所示。

表2 12个靶向治疗基因的466个突变位点信息

备注：Gene表示基因名称，如AKT1代表AKT1基因；Accession Number是指基因在数据库里的登记号，如AKT1基因在GenBank中的登记号是ENST00000349310；COSMIC ID是指基因突变在癌症基因组突变数据库中的编号，如非小细胞肺癌中AKT1基因一个最常见的突变在癌症基因组突变数据库中的编号为COSM33765；CDS Mutation代表编码序列的突变，如c.49G>A表示编码区第49位鸟苷酸突变成为腺苷酸；AA Mutation表示氨基酸序列的突变，如p.E17K表示蛋白序列中第17位的谷氨酸突变为赖氨酸；Position则指该突变在染色体上的位置，如14:105246551-105246551表示突变发生在14号染色体105246551位点。此外，ins代表插入，del代表缺失，*表示终止子，？代表对编码蛋白影响未知。

步骤B中使用非小细胞肺癌靶向治疗基因特异性引物SEQ ID No.1～SEQ IDNo.96，对步骤A中提取的基因组DNA上的目的片段进行多重PCR扩增，扩增产物经处理后进行高通量测序，用以检测表2中的基因突变状况。检测每个突变位点的引物对分别为：SEQNo.1和SEQ No.2检测AKT1基因COSM33765突变，SEQ No.3和SEQ No.4检测ALK基因COSM28054、COSM28055、COSM28057、COSM28059、COSM28061、COSM28491、COSM99137、COSM144250和COSM144251突变，SEQ No.5和SEQ No.6检测ALK基因COSM98478突变，SEQNo.7和SEQ No.8检测BRAF基因COSM447、COSM449、COSM450、COSM451、COSM453、COSM457、COSM458、COSM459、COSM460、COSM461、COSM1112、COSM6262和COSM21492突变，SEQ No.9和SEQ No.10检测BRAF基因COSM462、COSM463、COSM466、COSM467、COSM468、COSM469、COSM470、COSM471、COSM472、COSM473、COSM474、COSM475、COSM476、COSM477、COSM478、COSM1115、COSM1116、COSM1117、COSM1118、COSM1119、COSM1120、COSM1123、COSM1124、COSM1125、COSM1126、COSM1128、COSM1130、COSM1132、COSM1133、COSM1134、COSM1135、COSM1136、COSM1137、COSM1138、COSM6137、COSM6265、COSM6267、COSM18443、COSM21542、COSM21549、COSM26506、COSM26625、COSM27639、COSM28010、COSM30730、COSM33729、COSM33808、COSM144982、COSM219798和COSM249889突变，SEQ No.11和SEQ No.12检测EGFR基因COSM6210、COSM6218、COSM6220、COSM6223、COSM6225、COSM6254、COSM6255、COSM6256、COSM6268、COSM12367、COSM12369、COSM12370、COSM12382、COSM12383、COSM12384、COSM12386、COSM12678、COSM12728、COSM13181、COSM13182、COSM13184、COSM13185、COSM13432、COSM13556、COSM17570、COSM21984、COSM23571、COSM24267、COSM26038、COSM26509、COSM26704、COSM27041、COSM27042、COSM28517、COSM29274、COSM53194、COSM85993、COSM96856、COSM133189、COSM133197和COSM133207突变，SEQ No.13和SEQNo.14检测EGFR基因COSM6213、COSM6224、COSM12366、COSM12374、COSM12429、COSM12675、COSM13008、COSM13197、COSM13199、COSM14070、COSM26129、COSM26438、COSM28605、COSM28607、COSM33725和COSM53292突变，SEQ No.15和SEQ No.16检测EGFR基因COSM6226、COSM6240、COSM6241、COSM6242、COSM12377、COSM12378、COSM12427、COSM13005、COSM13006、COSM13007、COSM13189、COSM13190、COSM13433、COSM14068、COSM20891、COSM22940、COSM22951、COSM22954、COSM26445、COSM27110、COSM27568、COSM28513、COSM28603、COSM48922和COSM133565突变，SEQ No.17和SEQ No.18检测EGFR基因COSM6239、COSM6252、COSM6253、COSM12371、COSM12373、COSM12988、COSM13009、COSM13427、COSM13979、COSM18425、COSM18441、COSM22992、COSM28508、COSM28510、COSM28511、COSM28601、COSM41603和COSM41905突变，SEQ No.19和SEQ No.20检测EGFR基因COSM236670突变，SEQNo.21和SEQ No.22检测ERBB4基因COSM12833、COSM48366、COSM131764、COSM131765和COSM160825突变，SEQ No.23和SEQ No.24检测ERBB4基因COSM20392和COSM95705突变，SEQNo.25和SEQ No.26检测ERBB4基因COSM48363、COSM48364、COSM96313、COSM131772、COSM138342、COSM170797和COSM232263突变，SEQ No.27和SEQ No.28检测ERBB4基因COSM48367和COSM209862突变，SEQ No.29和SEQ No.30检测ERBB4基因COSM48368突变，SEQNo.31和SEQ No.32检测ERBB4基因COSM48369突变，SEQ No.33和SEQ No.34检测ERBB4基因COSM108015突变，SEQ No.35和SEQ No.36检测ERBB4基因COSM110095突变，SEQ No.37和SEQNo.38检测FGFR1基因COSM601、COSM48380、COSM98900和COSM187237突变，SEQ No.39和SEQNo.40检测FGFR1基因COSM12834突变，SEQ No.41和SEQ No.42检测FGFR2基因COSM36901突变，SEQ No.43和SEQ No.44检测FGFR2基因COSM36902和COSM36912突变，SEQ No.45和SEQNo.46检测FGFR2基因COSM36903和COSM49170突变，SEQ No.47和SEQ No.48检测FGFR2基因COSM36904和COSM36906突变，SEQ No.49和SEQ No.50检测FGFR3基因COSM714、COSM715和COSM29446突变，SEQ No.51和SEQ No.52检测FGFR3基因COSM716、COSM718、COSM721、COSM722、COSM724、COSM17461和COSM24842突变，SEQ No.53和SEQ No.54检测FGFR3基因COSM719、COSM720、COSM726、COSM731和COSM29438突变，SEQ No.55和SEQ No.56检测FGFR3基因COSM725、COSM729和COSM27139突变，SEQ No.57和SEQ No.58检测FGFR3基因COSM24802突变，SEQ No.59和SEQ No.60检测KRAS基因COSM507、COSM510、COSM511、COSM512、COSM514、COSM515、COSM516、COSM517、COSM518、COSM519、COSM520、COSM521、COSM522、COSM523、COSM524、COSM527、COSM528、COSM529、COSM531、COSM532、COSM533、COSM534、COSM535、COSM536、COSM537、COSM538、COSM542、COSM543、COSM12654、COSM12655、COSM12703、COSM12721、COSM12722、COSM14209、COSM20818、COSM25081、COSM34144、COSM87280、COSM87301和COSM219781突变，SEQ No.61和SEQ No.62检测KRAS基因COSM546、COSM547、COSM549、COSM550、COSM551、COSM552、COSM553、COSM554、COSM555、COSM28518、COSM87288和COSM87298突变，SEQ No.63和SEQ No.64检测KRAS基因COSM19404、COSM19900、COSM19905、COSM19940和COSM28519突变，SEQ No.65和SEQ No.66检测MET基因COSM691、COSM699和COSM700突变，SEQ No.67和SEQ No.68检测MET基因COSM696、COSM697、COSM698、COSM701、COSM702、COSM703和COSM201908突变，SEQ No.69和SEQ No.70检测MET基因COSM706突变，SEQ No.71和SEQ No.72检测MET基因COSM707突变，SEQ No.73和SEQ No.74检测MET基因COSM710突变，SEQ No.75和SEQ No.76检测PIK3CA基因COSM759、COSM760、COSM762、COSM764、COSM765、COSM766、COSM767、COSM6147、COSM12458、COSM12459、COSM17442、COSM24712、COSM25041、COSM27133、COSM27155、COSM27374、COSM125370和COSM249872突变，SEQ No.77和SEQ No.78检测PIK3CA基因COSM771、COSM772、COSM773、COSM774、COSM775、COSM776、COSM777、COSM12461、COSM12463、COSM12590、COSM12591、COSM12592、COSM12597、COSM13594、COSM17444、COSM17445、COSM21451、COSM24714、COSM25085、COSM25086、COSM27134、COSM27156、COSM27158、COSM27273、COSM28938、COSM29110、COSM29313、COSM36285、COSM36286、COSM36289和COSM94984突变，SEQ No.79和SEQ No.80检测PIK3CA基因COSM778突变，SEQ No.81和SEQ No.82检测PIK3CA基因COSM17449和COSM249908突变，SEQNo.83和SEQ No.84检测PTEN基因COSM4885、COSM4894、COSM4896、COSM4899、COSM4903、COSM4916、COSM4932、COSM4943、COSM4958、COSM4982、COSM4990、COSM4994、COSM5008、COSM5093、COSM5151、COSM5255、COSM5290、COSM5775、COSM5801、COSM5814、COSM5823、COSM5869、COSM19564、COSM23626、COSM23657和COSM39615突变，SEQ No.85和SEQ No.86检测PTEN基因COSM4889、COSM4942、COSM5000、COSM5036、COSM5042、COSM5048、COSM5127、COSM5191、COSM5253、COSM5257、COSM5296、COSM5313、COSM5317、COSM5811、COSM5916、COSM5958、COSM5959、COSM5960、COSM5974、COSM5975、COSM5976、COSM5979、COSM14087、COSM41768和COSM43077突变，SEQ No.87和SEQ No.88检测PTEN基因COSM4908、COSM4912、COSM4986、COSM5111、COSM5125、COSM5159、COSM5160、COSM5220、COSM5230、COSM5246、COSM5292、COSM5822、COSM5887、COSM5888、COSM13981、COSM17564、COSM23644、COSM26404、COSM43075、COSM88109和COSM133713突变，SEQ No.89和SEQ No.90检测PTEN基因COSM4929、COSM4937、COSM4976、COSM5037、COSM5049、COSM5101、COSM5133、COSM5153、COSM5232、COSM5270、COSM5298、COSM5878和COSM5915突变，SEQ No.91和SEQ No.92检测PTEN基因COSM4931、COSM5156、COSM5314、COSM5816、COSM13452、COSM28906和COSM28914突变，SEQNo.93和SEQ No.94检测PTEN基因COSM4969、COSM5039、COSM5045、COSM5052、COSM5089、COSM5091、COSM5114、COSM5149、COSM5200、COSM5218、COSM5244、COSM5825、COSM5907、COSM5961、COSM28897和COSM33702突变，SEQ No.95和SEQ No.96检测PTEN基因COSM5932、COSM5950、COSM5951、COSM5971、COSM17561、COSM27365、COSM28920、COSM30729、COSM241294和COSM249834突变。

优选地，步骤C中进行酶切的酶为限制性内切酶FseI和PacI，酶切反应体系为：纯化的多重PCR产物30μL、NEB CutSmart Buffer 5μL、NEB FseI内切酶10U、NEB PacI内切酶10U，用ddH₂O加至50μL；酶切条件为37℃酶切1～1.5小时。

优选地，步骤B中多重PCR扩增产物或步骤C中的酶切产物均使用AgencourtAMPure XP磁珠进行纯化，50μL PCR反应体系或50μL酶切反应体系中加入70μL AgencourtAMPure XP磁珠。

优选地，步骤C中连接测序接头的连接体系为：纯化的酶切产物30μL、测序接头(10μM)1μL、T4连接酶Buffer 5μL、T4DNA连接酶5U，用ddH₂O加至50μL；连接反应条件为16℃连接1～2小时。本发明中的测序接头如表3(适用于Illuminate测序仪)和表4(适用于IonTorrent测序仪)所示。

表3 用于Illuminate测序仪测序文库构建的接头引物序列(SEQ ID No.97～SEQID No.147)

备注：Adapter Name代表接头的名称，Sequence表示接头的核苷酸序列信息，所有接头的5’端都经过磷酸化修饰，*代表修饰引物中的磷酸酯键。

表4 用于Ion Torrent测序仪测序文库构建的接头引物序列(SEQ ID No.148～SEQ ID No.165)

备注：Adapter Name代表接头的名称，Top Adapter和Bottom Adapter分别代表组成接头的两条寡核苷酸序列信息，所有接头的5’端都经过磷酸化修饰。

优选地，步骤C中的连接产物使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，50μL连接反应体系中加入70μL Agencourt AMPure XP磁珠，纯化的连接产物即为测序文库，测序文库的DNA浓度大于20ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0(使用NanoDrop2000、AgilentBioanalyzer 2100、LabChip GX Touch或Qubit 3.0对测序文库的DNA进行质量检测)。

步骤C中纯化的连接产物按照不同测序方法的要求进行测序文库的缓冲液平衡，使得上样量相当的、不同接头标记的测序文库处于测序方法需要的缓冲液体系中，能够直接用于上机测序。

优选地，步骤D中获得目的基因片段的序列信息后，与正常的基因序列进行比对分析，得到目的基因片段的突变信息。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明针对非小细胞肺癌12个临床已发现靶向药物的致癌基因的466个突变位点的特定序列设计的引物，具有特异性强、非特异性扩增程度低、各引物间相互干扰小、扩增效果好等优点，在进行多重PCR扩增时，这些引物混合溶解于同一管中同时加入；

(2)本发明的非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，样品要求低，起始样品DNA的量可以低至1ng，可以使用各种来源的样品进行DNA的提取，包括且不限于新鲜肿瘤组织、新鲜活检组织、石蜡包埋组织、全血、血清、血浆、唾液和尿液等，而且可以使用已发生降解的DNA样品；

(3)本发明的检测通量高，一次可以检测十几个到几百个样品的12个基因的466个突变位点状况；

(4)本发明的检测方法，灵敏度高，检测灵敏度高达0.01％，检测结果明确客观，可以直接反应相关基因的具体突变位点，可以直接用于指导临床非小细胞肺癌靶向用药以及用于癌症早期诊断或辅助诊断及筛查和癌症愈后监测；

(5)本发明的检测方法安全快速，不含有毒有害物质，对实验人员和环境都无危害，检测速度快，仅需一到数天就可以获得检测结果；

(6)本发明的检测方法基于多重PCR技术和高通量测序技术，可以同时检测12个临床已有或正在测试靶向药物的基因的466个突变位点，使用的特异性引物和接头及优化的实验体系，使得检测方法简单易行、特异性高、重复性好、准确度高，对非小细胞肺癌靶向治疗基因的突变位点具有检测通量高、检测速度快、准确性和重复性好、安全性高等众多优点，为指导非小细胞肺癌患者的个性化治疗，辅助非小细胞肺癌的早期诊断及癌症愈后检测提供一种高效的方法。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知技术的描述，以避免不必要的混淆本发明的概念。在阅读了本发明的内容后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动，这些等价形式同样落入本发明所限定的范围。

实施例1

所用样本为非小细胞肺癌新鲜活检组织，采用DNA提取试剂盒提取肺癌新鲜活检组织中的基因组DNA，应用SEQ No.1～SEQ No.96对提取得到的基因组DNA进行多重PCR扩增后，采用Illumina NextSeq 500测序仪进行测序分析，具体实施方法如下：

A.基因组DNA提取：使用Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit，参照试剂盒说明书进行基因组DNA的提取。获得的基因组DNA进行凝胶电泳和使用NanoDrop 2000进行质量检测，要求基因组DNA没有明显的降解，浓度大于20ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0，并使用Agilent Bioanalyzer 2100进行精确定量。

B.多重PCR扩增：使用SEQ No.1～SEQ No.96对10ng基因组DNA进行多重PCR扩增，获得AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA和PTEN这12个目的基因的466个突变位点区域的目标扩增片段。

所用的多重PCR反应体系为：

所用的多重PCR反应条件为：

多重PCR完成后，每个样品管中加入70μL Agencourt AMPure XP磁珠，用来对扩增产物进行纯化，具体操作参照生产商提供的方法，纯化产物最终溶于30μL TE Buffer中。

C.测序文库构建：首先，对纯化的多重PCR产物进行酶切，使用限制性内切酶FseI和PacI，所用的酶切反应体系为：

酶切反应条件为：37℃酶切处理1小时。酶切完成后在每管中加入70μL AgencourtAMPure XP磁珠，用来对酶切产物进行纯化，纯化产物最终溶于30μL TE Buffer中。接下来对纯化的酶切产物进行接头连接，分别将5μL 20μM的对应上下游接头引物在95℃处理2min，然后缓慢冷却到室温用于接头连接反应。96孔板中1～12分别使用Universal Adaper(P5)+Index 1(P5)～Index 12(P5)接头，A～H则分别加入Universal Adaper(P7)+Index 1(P7)～Index 8(P7)接头(表3中所示)，使用的连接反应体系为：

连接反应条件为：16℃连接1小时。连接完成后在每个连接体系中加入70μLAgencourt AMPure XP磁珠，用来对连接产物进行纯化，纯化产物最终溶于30μl TE Buffer中。纯化所得的连接产物即为测序文库，文库制备完成后使用Agilent Bioanalyzer 2100进行精确定量，要求DNA浓度大于5ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0。

D.高通量测序：等量的DNA测序文库使用Illuminate Library NormalizationSolutions进行平衡后按照Illuminate NextSeq 500测序仪操作进行上样测序，测序结束后，对获得的序列进行拼接后使用软件进行比对分析，筛选出发生突变的基因位点。根据收集的样本检测发现，正常人组织中未检测出任何突变位点，非小细胞肺癌样本中检测出多个突变，特别是检测的EGFR突变结果与临床检测结果一致，临床上使用EGFR靶向药物对该类患者产生较为理想的治疗效果。这表明本发明可以较好的作为非小细胞肺癌早期诊断或辅助诊断及筛查、指导医生为患者选取靶向治疗药物，制定个性化的治疗方案的手段。

实施例2

使用SEQ No.1～SEQ No.96引物，对从石蜡包埋的非小细胞肺癌组织中提取的基因组DNA进行多重PCR扩增，扩增产物经连接接头等处理后，使用Ion PGM测序仪进行测序分析，具体实施方法如下：

A.基因组DNA提取：使用Invitrogen MagMAX FFPE DNA Isolation Kit，按照生产商建议的操作步骤，进行石蜡包埋组织基因组DNA的提取。所得的基因组DNA使用Qubit 3.0荧光计进行质量检测，要求其浓度大于20ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0。基因组DNA上包括本发明所需的。

B.多重PCR扩增：对步骤A基因组DNA上AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA和PTEN这12个目的基因上含有的466个突变位点的区域进行多重PCR扩增，使用引物SEQ No.1～SEQ No.96。

具体的反应体系为：

多重PCR反应条件为：

多重PCR完成后，按照生产商提供的PCR产物纯化方法，在每个样品管中加入70μLAgencourt AMPure XP磁珠，对扩增产物进行纯化，纯化产物溶于30μL TE Buffer中。

C.测序文库构建：使用限制性内切酶FseI和PacI对纯化的多重PCR产物进行酶切处理，使用的酶切反应体系为：

酶切反应条件为：37℃酶切处理1.5小时。酶切完成后每个样品使用70μLAgencourt AMPure XP磁珠进行纯化，最终获得30μL溶于TE Buffer中的纯化产物。然后在95℃处理5μL 20μM的对应上下游接头引物2min，并使其缓慢冷却到室温后，加入到纯化后的酶切产物中，使用T4连接酶进行接头的连接。每管中均加入P1Adapter用于连接到FseI酶切端，A1Adapter～A8Adapter分别加入到不同管中，以连接到PacI酶切端。所用的连接反应体系为：

连接反应条件为：16℃连接2小时。连接完成后需对连接产物进行纯化，在每个连接体系中加入70μL Agencourt AMPure XP磁珠，纯化产物最终溶于30μl TE Buffer中，此即为测序文库。文库制备完成后使用Qubit 3.0荧光计进行精确定量，要求A260/A280>1.8，A260/A230>2.0，DNA浓度大于5ng/μL。

D.高通量测序：测序文库构建好后，在Ion One Touch 2系统上进行模板制备，具体实验步骤遵循试剂盒说明书。经乳液PCR、乳液打破、富集珠子等过程后，将富集好的珠子使用Qubit 3.0荧光计进行定量，要求浓度达到10％～30％。然后使用Ion OneTouch 2富集系统将珠子上的双链变成单链并进一步富集珠子，使其浓度达到50％以上。最后将制备好的模板上Ion PGM测序仪进行测序，配套使用Ion PGM Hi-Q Sequencing Kit试剂盒。

测序结束后，对获得的序列进行拼接后使用软件进行比对分析，筛选出发生突变的基因位点。根据收集的样本检测发现，正常人组织中未检测出任何突变位点，非小细胞肺癌样本中检测出多个突变，特别是检测的EGFR突变结果与临床检测结果一致，临床上使用EGFR靶向药物对该类患者产生较为理想的治疗效果。这表明本发明可以较好的作为非小细胞肺癌早期诊断或辅助诊断及筛查、指导医生为患者选取靶向治疗药物，制定个性化的治疗方案的手段。

本发明还可以利用新鲜肿瘤组织、全血、血清、血浆、唾液和尿液进行基因组DNA的提取，按照实施例2中的方法对基因组DNA上的目的片段进行多重PCR扩增，用到的引物为SEQ ID No.1～SEQ ID No.96，然后对多重PCR扩增产物进行酶切后连接测序接头，构建测序文库，利用高通量测序手段获得目的基因片段的序列信息，最后进行比对分析，筛选出发生突变的基因位点，这其中用到的方法基本同实施例中所述。本发明的方法对非小细胞肺癌12个临床已有或正在测试靶向药物的基因的466个突变位点具有检测通量高、特异性强、样本来源广泛、不易发生污染且安全性高等众多优点，检测结果具有很好的重复性和准确性，对非小细胞肺癌具有较好的辅助诊断和指导治疗作用。

Claims

1.一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其步骤包括：

A.从待测样品中提取基因组DNA；

2.根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其特征在于：检测的基因为AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA和PTEN。

3.根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其特征在于：步骤A中的待测样品包括但不限于新鲜肿瘤组织、新鲜活检组织、石蜡包埋组织、全血、血清、血浆、唾液和尿液；提取基因组DNA时，使用但不限于组织DNA提取试剂盒、石蜡包埋组织DNA提取试剂盒、全血DNA提取试剂盒、血清DNA提取试剂盒或血浆基因组DNA提取试剂盒。

4.根据权利要求3所述的一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其特征在于：步骤A中提取基因组DNA后对DNA进行质量检测，DNA浓度大于20ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0；步骤B中的特异性引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.96进行多重PCR扩增时同时加入。

5.根据权利要求4所述的一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其特征在于：步骤B中多重PCR扩增的反应体系为：5X PCR Buffer 10μL、25mM的MgCl₂ 3μL、10mM的dNTPs 2μL、100nM的Primers Mix 10μL、DNA template 10～20ng、5U/μL的Taq polymerase 1μL，用ddH₂O加至50μL；步骤B中多重PCR扩增的反应条件为：

6.根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其特征在于：步骤C中进行酶切的酶为限制性内切酶FseI和PacI，酶切反应体系为：纯化的多重PCR产物30μL、NEB CutSmart Buffer 5μL、NEB FseI内切酶10U、NEB PacI内切酶10U，用ddH₂O加至50μL；酶切条件为37℃酶切1～1.5小时。

7.根据权利要求5或6所述的一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其特征在于：步骤B中多重PCR扩增产物或步骤C中的酶切产物均使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，50μL PCR反应体系或50μL酶切反应体系中加入70μL Agencourt AMPure XP磁珠。

8.根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其特征在于：步骤C中连接测序接头的连接体系为：纯化的酶切产物30μL、10μM的测序接头1μL、T4连接酶Buffer 5μL、T4DNA连接酶5U，用ddH₂O加至50μL；连接反应条件为16℃连接1～2小时。

9.根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其特征在于：步骤C中的连接产物使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，50μL连接反应体系中加入70μLAgencourt AMPure XP磁珠，纯化的连接产物即为测序文库，测序文库的DNA浓度大于20ng/μL，A260/A280>1.8，A260/A230>2.0。

10.根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，其特征在于：步骤D中获得目的基因片段的序列信息后，与正常的基因序列进行比对分析，得到目的基因片段的突变信息。