CN106148323A - 一种用于构建alk基因融合突变检测文库的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于构建检测ALK基因融突变文库的方法包括以下步骤：1)提取DNA并使其片段化；2)构建DNA预文库；3)环化DNA；4)用ALK的特异性引物进行PCR扩增，富集目标区域生成终文库。本发明还提供用于构建检测ALK基因融突变文库的试剂盒以及检测ALK基因融突变的方法。本发明提供的靶向于ALK重组热点区域的建库方法结合第二代高通量测序技术具有卓越的灵敏度，能够以血浆DNA或组织DNA为起始材料准确检测出ALK基因融合突变的信息。此外，当使用血浆DNA作为起始材料时，本发明还实现了对ALK基因融合突变以及克唑替尼耐药突变的无创检测。

Description

一种用于构建ALK基因融合突变检测文库的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及构建ALK融合基因突变检测文库的方法和试剂盒。本发明还涉及通过对ALK融合基因突变检测文库进行高通量测序实现高灵敏度准确检测ALK基因融合突变的方法。

背景技术

间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)是一个由胞外区、跨膜区以及胞内的激酶结构域组成的酪氨酸受体激酶。在1％-7％的非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)患者中发现了突变的ALK基因与其他基因的融合，从而造成胞内酪氨酸激酶的高表达活性。目前已经发现的与ALK基因融合的基因有EML4、KIF5B、TGF、KLC1、PTPN3、STRN等，并且融合位点具有多样性。目前已知的EML4与ALK的融合位点就多达20余种。随着研究的深入与发展，新的融合基因与新的融合位点还在被不断地发现。现在的研究普遍认为ALK的融合断裂点集中在19号外显子和20号外显子之间，且该融合基因的断裂点没有固定的模式。

对于ALK阳性非小细胞肺癌患者来说，小分子靶向药克唑替尼(crizotinib)作为一线治疗药物与标准化疗药物相比，具有更好的治疗效果，能更显著地延长患者的无进展生存期和中位生存期，提高患者的客观缓解率，帮助患者降低痛苦，提高生活质量，并于2011年获得美国食品药品管理局(FDA)批准。因此如何有效地筛选出ALK阳性患者，成为临床上克唑替尼靶向治疗的重要前提。然而，目前由于检测方法灵敏度的限制，临床上常用的ALK基因融合的检测方法都是适用于组织材料。临床常见的组织检测方法有：免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)检测法、荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)检测法和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测法。

IHC检测法实验操作简单易行，敏感性高(假阴性率低)，适用于临床筛查。但是IHC特异性低(假阳性高)。因此，常规IHC阳性患者还需要FISH、RT-PCR等其他方式的确诊。

FISH检测法的原理是在ALK的端粒端和着丝粒端分别设计红绿探针，一旦ALK基因发生断裂重排，红绿信号就会分离，从而检测到荧光信号的变化。由于ALK基因融合结果的判读涉及到对荧光信号的观察和检测技术，因此必须要由经验丰富的病理科医师来完成。同时，15％的阈值(100个细胞中要有15个细胞出现红绿信号分离)，使得该检测法灵敏度受到限制。对于晚期患者的小活检标本而言，很难保证每个视野存在50个以上的癌细胞。总的来说，FISH的价格昂贵，操作严格，对观察视野要求严苛，需要非常专业的实验人员来判读结果，自动化程度低，成本高，不适合大规模临床检测筛选。而且，FISH不能区分ALK融合变体的类型。

RT-PCR法需要高质量的RNA样本来保证检测结果的准确性。但是，由于临床样本大多数为石蜡组织，RNA降解比较严重，因此逆转录的效率受到影响，从而导致最终检测结果不准确，即会产生ALK基因融合的假阴性结果。如何获得更高比例的合格RNA样品是RT-PCR检测技术的一个壁垒。此外，尽管在NSCLC患者中已陆续发现了20多种不同的ALK基因融合变体，但仍不能排除有未知变体的存在。由于RT-PCR的引物设计都是基于已知的融合基因和融合方式，导致该方法不能够检测新的融合基因以及新的融合方式。

以上3种方法都不能获得详细的基因融合突变信息，即与ALK融合的具体基因以及融合的位点。因此，急需一种能高灵敏度准确检测ALK基因融合突变并获得其详细突变信息的方法。

此外，以上3种检测方法由于其设计的限制以及灵敏度不高的原因，只能用于临床组织样本的检测。目前临床上癌症组织样本主要通过手术或者活体穿刺获得。这种创伤型的检测方式伴随着无谓的病患的痛苦以及癌细胞转移的风险。并且活体穿刺由于取样部位的异质性，可能会带来假阴性的结果。创伤性的组织取样还具有不可重复性，对患者的病情 进展无法进行跟踪。而在无创检测ALK基因融合突变方面，现状依然是空白。因此也迫切需要一种无创的、能准确检测ALK基因融合突变的方法。

本发明提供了一种以血浆DNA或组织DNA为起始材料的适用于第二代高通量测序平台的ALK融合基因突变文库的构建方法和试剂盒，以及通过对所述文库进行测序实现ALK基因融合突变的高灵敏度检测的方法。

发明内容

本发明提供一种高灵敏度的检测ALK融合基因突变的方法，实现了ALK基因融合突变的准确检测。本发明基于以下事实：血浆DNA或组织DNA在连接接头之后经过PCR扩增后，DNA分子被放大，形成预文库；单个DNA分子在环化酶的作用下独立地形成了单链环，每个环都含有一个DNA分子的信息；再通过特异性的背向延伸的引物选择性地扩增靶区域，最后通过通用引物扩增测序所需的序列，并在第二代测序平台上进行测序。根据本发明，可以有效选择扩增含有靶向区域的血浆DNA或组织DNA分子，并通过第二代测序平台进行序列信息分析。

因此，本发明的一个方面是提供一种用于构建检测ALK基因融合突变文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取DNA；

2)构建DNA预文库；

3)环化DNA；

4)以环化产物为模板用ALK特异性引物进行PCR扩增，富集靶区域，获得终文库。

根据本发明的方法，起始材料的DNA可以来自于血浆DNA或组织DNA，优选血浆DNA。值得注意的是，当采用血浆DNA作为起始材料用于构建检测ALK基因融合突变的文库时，可以实现对ALK基因融合突变的准确的无创检测。

根据本发明的方法，可以用市售的各种DNA抽提的试剂盒提取DNA。同时，通过打断提取出来的DNA获得的合适大小的DNA片段也适用于接下来的步骤。

根据本发明的方法，所述DNA预文库的构建，需要将DNA分子与接头连接，再使用与接头序列相匹配的引物，通过PCR预扩增将DNA分子数目放大，形成预文库。

根据本发明的方法，所述与DNA分子连接的接头为双链接头，并通过选自以下的一种或两种酶来进行连接：T4DNA连接酶和T7DNA连接酶。

根据本发明的方法，所述与DNA分子连接的接头含有标签序列。

根据本发明的方法，所述双链接头由互补配对部分和不互补配对部分组成。所述双链接头的组成，根据与DNA分子连接位点由远及近，是：不配对通用序列，配对通用序列。优选的，不配对通用序列为5-15nt，配对通用序列为10-20nt。

本发明中所用接头序列示例如下：

上链(top strand)：5’-GTCTCATCCCTGCGTGT-3’(SEQ ID NO：1)

下链(bottom strand)：5’-CACGCAGGGTACGTGT-3’(SEQ ID NO：2)

根据本发明的方法，在DNA分子连上接头后，进行PCR预扩增，以放大DNA分子的数目，从而形成预文库。所述预扩增的酶为一种或多种热稳定性DNA聚合酶，选自LA-Taq、rTaq、Phusion、Deep Vent、Deep Vent(exo-)、Gold 360、Platinum Taq和KAPA 2G Robust。

本发明中所用的预扩增引物序列示例如下：

FP：5’-GTCTCATCCCTGCGTG-3’(SEQ ID NO：3)

RP：5’-ACACGTACCCTGCGTG-3’(SEQ ID NO：4)

根据本发明的方法，所述步骤3)是将放大后的连有接头的DNA分子进行环化。环化过程为夹板介导的单链DNA环化。其中使用的单链DNA环化酶选自T4DNA连接酶、Taq DNA连接酶、E.coli DNA连接酶、9°N DNA连接酶，以及它们的组合。

根据本发明的方法，所述单链DNA环化所需的夹板与成环后的预文库接头序列互补，可以根据接头序列的变化而变化。

本发明中所用夹板序列示例如下：

5’-CACGCAGGGTACGTGTGTCTCATCCCTGCGTG-3’(SEQ ID NO：5)

根据本发明的方法，在将环化的DNA分子作为模板用特异性引物进行扩增前，需要将未环化的线性DNA消化掉。所述线性DNA包括单链DNA和双链DNA。用到的消化酶为核酸外切酶，包含但不限于，核酸外切酶I、核酸外切酶III、Lamda核酸外切酶和T7核酸外切酶，以及它们的组合。

根据本发明的方法，所述检测ALK基因融合突变的特异性引物是20对相邻且背向延伸的引物对。所述20对背向延伸的引物对之间的间隔为50-300nt，优选地针对DNA的长度设计为70-90nt。引物对之内的2条引物可以间隔0-10nt，或者重叠0-10nt。所述20对背向延伸的引物对以覆瓦的方式，覆盖了ALK基因融合突变热点区域，例如ALK基因的19号内含子、19号外显子的3’端以及20号外显子的5’端。所述20对特异性引物对的具体序列如表1所示：

表1.用于检测ALK基因融合突变的20对特异性引物对的序列

此外，用于检测对克唑替尼耐药的ALK基因融合突变的特异性引物是6对背向延伸的引物对，其分别针对ALK外显子22、23和25上的耐药性突变，如点突变和插入突变。所述6对背向延伸的引物对的具体序列如表2所示：

表2.用于检测对克唑替尼耐药的ALK基因融合突变的6对特异性引物对的序列

序列号	名称	核酸序列
			SEQ ID NO：46	ALKE22P1F3	ATCCAGTTCGTCCTGTTCAGAG
SEQ ID NO：47	ALKE22P1R3	TCCTCATGGAAGCCCTGATC
			SEQ ID NO：48	ALKE22P2F	GTGTCTCTCTGTGGCTTTACCTG
SEQ ID NO：49	ALKE22P2R	CTCACCCCAACTCCCCTCT

[0041] [0041]

SEQ ID NO：50	ALKE23P1F	AGCCTGCAATCCCTGCC
			SEQ ID NO：51	ALKE23P1R	CACCCCAATGCAGCGAAC
SEQ ID NO：52	ALKE23P2F	GCGGGTCTCTCGGAGGAAG
			SEQ ID NO：53	ALKE23P2R	CGCCCGGTGAGTGAGAAC
SEQ ID NO：54	ALKE25P 1F	CTGGAAGAGTGGCCAAGATTG
			SEQ ID NO：55	ALKE25P1R	GGCCTGGACAGGTCAAGAG
SEQ ID NO：56	ALKE25P2F	GATGTCTCGGGCCATCCC
			SEQ ID NO：57	ALKE25P2R	TGAGTAAAGACTGCCTCACCCC

根据本发明的方法，所述检测ALK基因融合突变的特异性引物的5’端都含有用于高通量测序的接头序列。此高通量测序接头适用于Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq和Life Technologies/SOLID system、PGM、Proton等测序平台。

根据本发明的方法，所述检测ALK基因融合突变的方法适用于检测发生在ALK 19号内含子的融合突变，包括已知突变和新突变。在一个实施方案中，本发明的方法准确检测到了新的融合突变，如EML4、EXOC6B和ALK这3个基因的融合突变以及EML4与ALK融合的新位点。

本发明的另一个方面提供一种用于构建检测ALK基因融合突变文库的试剂盒，该试剂盒包含：1.用于提取DNA的试剂；2.用于构建DNA预文库的试剂，如酶、缓冲液、接头和dNTP等；3.用于纯化预文库DNA的设备和试剂，如磁珠、洗涤液和洗脱液；4.用于环化DNA的试剂，包括酶、缓冲液和夹板以及用于消化线性DNA的试剂，如酶和缓冲液；5.用于特异性扩增的试剂，如扩增酶、缓冲液、特异性引物和dNTP；6.用于纯化终文库的设备和试剂，如磁珠、洗涤液和洗脱液。

根据本发明的试剂盒，所述DNA来自于血浆DNA或组织DNA，优选血浆DNA，所述用于提取DNA的试剂可以来自各种市售的DNA抽提的试剂盒。同时，通过打断抽提出来的DNA获得的合适大小的DNA片段也适用于接下来的步骤。

根据本发明的试剂盒，所述用于构建预文库的酶包括用于对DNA末端进行补平修复的酶；用于为DNA的3’端加上腺嘌呤和鸟嘌呤的酶，包括T4DNA聚合酶、Klenow酶、DNA聚合酶、Taq酶和klenow ex- (3’-5’外切活性缺失)；和用于接头连接的酶，包括T4DNA连接酶、T7DNA连接酶、或它们的组合。

根据本发明的试剂盒，所述接头为双链接头。

根据本发明的试剂盒，所述接头包含标签序列。

根据本发明的试剂盒，所述双链接头由互补配对部分和不互补配对部分组成。双链接头的组成，按照与DNA分子连接位点由远及近，是：不配对通用序列，配对通用序列。优选的，不配对通用序列为5-15nt，配对通用序列为10-20nt。

本发明试剂盒中所用接头序列示例如下：

上链(top strand)：5’-GTCTCATCCCTGCGTGT-3’(SEQ ID NO：1)

下链(bottom strand)：5’-CACGCAGGGTACGTGT-3’(SEQ ID NO：2)

根据本发明的试剂盒，用于预扩增与接头连接的DNA分子的酶为一种或多种热稳定性的DNA聚合酶，选自LA-Taq、rTaq、Phusion、Deep Vent、Deep Vent(exo-)、Gold 360、Platinum Taq和KAPA 2G Robust。

本发明中所用的预扩增引物序列示例如下：

FP：5’-GTCTCATCCCTGCGTG-3’(SEQ ID NO：3)

RP：5’-ACACGTACCCTGCGTG-3’(SEQ ID NO：4)

根据本发明的试剂盒，在DNA环化过程中所用的单链DNA环化酶包括T4DNA连接酶、Taq DNA连接酶、E.coli DNA连接酶和9°N DNA连接酶，以及它们的组合。

根据本发明的试剂盒，所述单链DNA的环化所需的夹板与成环后的预文库接头序列互补，可以根据接头序列的变化而变化。

本发明试剂盒中所用夹板序列示例如下：

5’-CACGCAGGGTACGTGTGTCTCATCCCTGCGTG-3’(SEQ ID NO：5)

根据本发明的试剂盒，用于消化未环化线性DNA的消化酶为核酸外切酶，包含但不限于，核酸外切酶I、核酸外切酶III、Lamda核酸外切酶和T7核酸外切酶，或者它们的组合。所述的线性DNA包括单链DNA和双链DNA。

根据本发明的试剂盒，所述检测ALK基因融合突变的特异性引物是20对相邻且背向延伸的引物对。所述20对背向延伸的引物对之间的间隔为50-300nt，优选地针对血浆DNA或组织DNA的长度设计为70-90nt。引物对之内的2条引物可以间隔0-10nt，或者重叠0-10nt。所述20对背向引物对以覆瓦的方式，覆盖了ALK基因融合突变的热点区域，例如ALK基因的19号内含子，以及19号外显子的3’端以及20号外显子的5’端，其具体序列如表1所示。此外，用于检测对克唑替尼耐药的ALK基因融合突变的特异性引物是6对背向延伸的引物对，其分别针对ALK外显子22、23和25上的耐药性的突变，如点突变和插入突变。所述6对背向延伸的引物对的具体序列如表2所示。

根据本发明的试剂盒，所述用于检测ALK基因融合突变的特异性引物的5’端都含有用于高通量测序的接头的序列。此高通量测序接头适用于Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq和Life Technologies/SOLID system、PGM、Proton等测序平台。

根据本发明的试剂盒适用于检测发生在ALK19号内含子的融合突变，包括已知突变和新突变。在一个实施方案中，本发明的试剂盒检测到了新的融合突变，如EML4、EXOC6B和ALK这3个基因的融合突变以及EML4与ALK融合的新位点。

本发明的另一个方面还提供一种检测ALK基因融合突变的方法，包括以下步骤：

(1)提供血浆DNA或组织DNA样品，

(2)根据本发明所述的方法或试剂盒制备终文库

(3)对所述终文库进行高通量测序，

(4)对测序结果进行序列分析，并判断是否存在ALK基因融合突变以及当存在ALK基因融合突变时，识别与ALK基因融合的配对基因和融合位点。

本发明的方法适用于多种第二代测序平台，包括但不限于，如Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq和Life Technologies/SOLID system、PGM、Proton等测序平台。

本发明的另一个方面还提供ALK特异性引物在制备用于检测受试者中ALK基因融合突变的诊断试剂或试剂盒中的用途，其特征在于，所述诊断试剂或试剂盒适用于本发明的检测ALK基因融合突变的方法。所述ALK特异性引物的具体序列如表1和表2所示。

本发明基于第二代测序平台，具有优异的灵敏度，可以以血浆DNA或组织DNA为起始材料检测ALK基因融合突变以及对克唑替尼的耐药突变。本发明可以高灵敏度地检测出与ALK发生融合的配对基因，并且准确地获得基因融合位点信息。本发明的方法还可以同时检测出血浆DNA或组织DNA中野生型分子和突变型分子的数目，从而计算突变的比例，并用来跟踪和评估对患者的治疗效果和病情进展。

此外，当在本发明的方法和试剂盒中使用血浆DNA作为起始材料时，本发明可以实现ALK基因融合突变以及克唑替尼耐药突变的无创检测，从而及时有效地指导患者的用药，减轻病患的痛苦，同时还填补了ALK无创检测的空白，提供了一种全新的ALK基因融合突变检测的方法。

附图说明

图1示出了根据本发明的无创检测ALK基因融合突变文库的构建方法，起始材料是血浆DNA或组织DNA片段。该方法包括以下步骤：提取DNA(步骤101)→制备DNA预文库(步骤102)→环化预文库DNA，并消化线性DNA(步骤103)→用ALK基因特异性引物进行PCR扩增，获得终文库(步骤104)。

图2示出了根据本发明的无创检测ALK基因融合突变文库构建方法的原理。其中虚线代表ALK基因，实线代表与ALK融合的基因。实心圆圈代表融合位点，空心圆圈代表融合位点在ALK上的位置。矩形代表接头。折线箭头代表ALK特异性的背向延伸的引物。直线箭头代表测序引物。DNA片段连上接头后通过PCR预扩增获得预文库，然后用ALK特异性引物以预文库的环化产物为模板扩增得到终文库。经过 双端测序，将测序结果还原成片段化DNA的初始状态，从而分析ALK基因的融合突变情况。

图3示出了用于检测ALK基因融合突变的引物的位置和检测位点的序列信息。其中一对背向延伸的引物对由黑色下划线的引物和方框中的引物组成，内含子序列用小写表示，外显子序列用大写表示。

图4示出了根据本发明检测出来的ALK基因融合突变。

图5示出了根据本发明检测出来的ALK基因融合突变用第一代测序技术验证的结果。

具体实施方式

需要说明的是，本领域的技术人员应该理解，本发明的附图及其实施例仅仅是为了示范的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。本领域技术人员也应当理解，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1

用血浆DNA作为起始材料构建ALK融合基因突变检测文库的方法主要包括以下步骤：

(1)抽提血浆DNA：可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于抽提血浆DNA的方法和试剂进行此步骤。

(2)末端补平，之后对产物进行清洁纯化：可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于末端补平以及随后清洁纯化的方法和试剂进行此步骤。例如，可利用T4DNA聚合酶、Klenow酶补平末端。

(3)末端悬A，之后对产物进行清洁纯化：可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于末端悬A以及随后对产物进行清洁纯化的方法和试剂进行此步骤。例如，可以使上步产物在klenow ex-(New England Biolabs)(是一种改进的Klenow酶，其3’-5’外切活性缺失)的作用下将双链末端悬出A碱基。

(4)与预文库接头连接，之后对产物进行清洁纯化：可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于连接接头以及随后对产物进行清洁纯化的方法和试剂进行此步骤。例如，可在T4DNA连接酶、T7DNA连接酶或两种酶的组合的作用下，使末端悬A产物与双链预文库接头连接。其中，预文库接头可商购或自行合成而获得。

本发明中所用接头序列示例如下：

上链(top strand)：5’-GTCTCATCCCTGCGTGT-3’(SEQ ID NO：1)

下链(bottom strand)：5’-CACGCAGGGTACGTGT-3’(SEQ ID NO：2)

(5)对连接的产物进行PCR预扩增，之后对产物进行清洁纯化：可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于PCR扩增以及随后对产物进行清洁纯化的方法和试剂进行此步骤。例如，可在热稳定性的DNA聚合酶Phusion的作用下放大血浆DNA分子的数目。

本发明中所用预扩增引物序列示例如下：

FP：5’-GTCTCATCCCTGCGTG-3’(SEQ ID NO：3)

RP：5’-ACACGTACCCTGCGTG-3’(SEQ ID NO：4)

(6)扩增产物环化，之后对环化产物进行清洁纯化，即可使每个DNA分子独立成环：可利用本领域技术人员所熟知的单链DNA环化酶以及随后对产物进行清洁纯化的方法和试剂进行此步骤。

本发明中所用夹板序列示例如下：

5’-CACGCAGGGTACGTGTGTCTCATCCCTGCGTG-3’(SEQ ID NO：5)

(7)对纯化后的环化体系中剩余的线性DNA进行消化，之后对环化产物进行清洁纯化：可利用本领域技术人员所熟知的DNA外切酶以及随后对产物进行清洁纯化的方法和试剂进行此步骤。例如，可在Exonuclease I(E.coli)以及ExonucleaseIII(E.coli)的作用下完成消化。

(8)以环化DNA为模板，用ALK特异性的背向延伸的引物对进行PCR扩增，引物的5’端含有测序所需要的接头序列，之后对扩增产物进行清洁纯化：可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于PCR扩增以及随后对产物进行清洁纯化的方法和试剂进行此步骤。例如，可在热稳 定性的DNA聚合酶Phusion的作用下进行特异性扩增。所述ALK特异性引物序列如表1和表2所示。

以下示出利用根据本发明实施例1的方法构建ALK基因融合突变检测文库的一个具体实例。

步骤1：抽提血浆DNA约20ng。

步骤2：制备如表3所示的末端补平反应混合液，在20℃温浴30分钟；在纯化柱上纯化DNA样品，并在32μl的无菌dH₂O或洗脱缓冲液中洗脱。其中，本专利中所使用的洗脱缓冲液为10mM Tris-Cl，pH 8.0，但适用于本发明的洗脱缓冲液并不局限于此。

表3

步骤3：制备如表4所示的用于在3’端加腺嘌呤尾的反应混合液，在37℃温浴30分钟；在纯化柱上纯化DNA样品，并在37μl的无菌dH₂O或洗脱缓冲液中洗脱。

表4

步骤4：制备如表5所示的含DNA片段与预文库接头的连接反应混合液，在20℃温浴15分钟，65℃温浴10分钟，保持在4℃；用Beckman Ampure XP beads回收连接后的血浆DNA样本，并用48μl的无菌dH₂O或洗脱缓冲液中洗脱。

表5

步骤5：制备如表6所示的预扩增体系混合液，用Beckman Ampure XP beads回收扩增得到的预文库，并用39μl的无菌dH₂O或洗脱缓冲液中洗脱。

PCR方案为：98℃预变性30秒，98℃变性10秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共14个循环，最后72℃延伸3分钟。

表6

步骤6：制备如表7所示的环化体系，在PCR仪上进行环化反应：95℃30秒，50℃2分钟，30个循环。用Beckman Ampure XP beads回收环化产物，并用43μl的无菌dH₂O或洗脱缓冲液中洗脱。

表7

步骤7：制备如表8所示的线性DNA消化体系，在PCR仪上进行消化反应：37℃30分钟。用Beckman Ampure XP beads回收环化消化产物，并用20μl的无菌dH₂O或洗脱缓冲液中洗脱。

表8

步骤8：制备如表9所示的DNA扩增体系，用Beckman Ampure XP beads回收扩增得到的上机文库，并用20μl的无菌dH₂O或洗脱缓冲液中洗脱。PCR方案为：98℃预变性30秒，98℃变性10秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃延伸3分钟。

表9

结果：经上机测序验证后表明，根据本发明实施例1构建的用于检测ALK基因融合突变的文库符合第二代高通量测序的设计要求。

实施例2

实施例2的构建血浆DNA检测ALK基因融合突变文库的方法基本上类似于实施例1，不同之处在于：在实施例2中，末端补平和末端悬A在一个反应体系中进行，省却了中间纯化的步骤。以下示出利用根据本发明实施例2的方法构建ALK基因融合突变检测文库的一个具体实例。

步骤1：抽提血浆DNA约20ng。

步骤2：制备如表10所示的末端补平以及3’端悬A的反应混合液，在37℃温浴20分钟，并在72℃温浴20分钟，从而在一个反应体系中进行末端补平和末端悬A；在纯化柱上纯化DNA样品，并在37μl的无菌dH₂O或洗脱缓冲液中洗脱。根据适用于不同设计需要的不同的反应混合液的组成，末端补平和末端悬A的温度和时间可以有所不同。

表10

之后的步骤3-7分别与实施例1中步骤4-8相同。

结果：经上机测序验证后表明，根据本发明实施例2构建的用于检测ALK基因融合突变的文库符合第二代高通量测序的设计要求。

实施例3

以下示出利用根据本发明方法进行组织基因组DNA样品测序的一个具体实例。

步骤1：抽提组织DNA约200ng，溶于25μl EB中。

步骤2：制备如表11所示的反应混合液，用片段化酶将组织DNA打断到200bp左右，在37℃反应20分钟，反应完成后加入5μl 0.5M EDTA终止反应。用Beckman Ampure XP beads打断后的DNA片段，并用41.5μl的无菌dH₂O或洗脱缓冲液中洗脱。

表11

步骤3：制备如表12所示的末端补平以及3’悬A的反应混合液，在37℃温浴20分钟，并在72℃温浴20分钟，从而在一个反应体系中进行末端补平和末端悬出；在纯化柱上纯化DNA样品，并在37μl的无菌dH₂O或洗脱缓冲液中洗脱。根据适用于不同设计需要的不同的反应混合液的组成，末端补平和末端悬A的温度和时间可以有所不同。

表12

之后的步骤4-8分别与实施例1中步骤4-8相同。

结果：经上机测序验证后表明，根据本发明实施例3构建的用于检测ALK基因融合突变的文库符合第二代高通量测序的设计要求。

实施例4：

通过高通量测序平台对实施例1-3中构建的用于检测ALK基因融合突变的文库进行测序，并对测序结果进行数据分析，获得ALK基因融合突变的3个阳性结果，如图4所示。图4中，基因1代表了转录本5’的基因，基因2代表了转录本3’的基因。所示3个样品中基因的融合均为EML4基因的启动子及其部分外显子与ALK基因19号外显子的融合，但融合位点有差异。图4还示出了根据本发明的方法检测到的基因融合位点在各个基因上的精确坐标，以及融合位点之间存在的碱基重叠和碱基插入情况。例如，对于1号和2号样品，我们都检测到了EML4与ALK基因的融合和新的融合位点。此外，我们还分别在两个样品的基因融合位点检测到了一个碱基(c)的重叠和一个碱基(t)的插入。我们还首次在3号样品中检测到了3个基因片段的融合，即EML4、EXOC6B和ALK的融合。同时，我们发现，在EML4与EXOC6B的融 合位点没有碱基重叠或插入情况，而在EXOC6B与ALK的融合位点则发生了两个碱基(ac)的重叠。

此外，除了获得与ALK基因融合的配对基因以及具体的融合位点这些信息外，我们还计算了具有基因融合突变的DNA分子数占总DNA分子数的比例，得到图4所示的“突变比例”。该比例可以用来动态反应血液或组织中具有基因融合突变的DNA分子(如肿瘤DNA)的含量，从而用来追踪治疗的效果以及病情的进展。

发明人还用第一代测序技术(Sanger链终止法)直接对上述相同的3个样品进行了测序，以验证本发明的无创检测ALK基因融合突变方法的准确度。结果如图5所示。第一代测序的验证结果与图4所示ALK的基因融合突变检测结果完全相符，证实了本发明的检测方法的准确度。

参考文献：

1.Soda M，Choi YL，Enomoto M，Takada S，Yamashita Y，et al.(2007)Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer.Nature 448：561-566

2.Seto T，Kiura K，Nishio M，Nakagawa K，Maemondo M，et al.(2013)CH5424802(RO5424802)for patients with ALK-rearranged advanced non-small-cell lung cancer(AF-001JP study)：a single-arm，open-label，phase 1-2study.Lancet Oncol 14：590-5988.Gandhi L，Janne PA(2012)Crizotinib for ALK-rearranged non-small cell lung cancer：a new targeted therapy for a new target.Clin Cancer Res 18：3737-3742

3.Yi ES，Boland JM，Maleszewski JJ，Roden AC，Oliveira AM，et al.(2011)Correlation ofIHC and FISH for ALK gene rearrangement in non-small cell lung carcinoma：IHC score algorithm for FISH.J Thorac Oncol 6：459-465

4.Park HS，Lee JK，Kim DW，Kulig K，Kim TM，et al.(2012)Immunohistochemical screening for anaplastic lymphoma kinase(ALK)rearrangement in advanced non-small cell lung cancer patients.Lung Cancer 77：288-292

5.Koivunen JP，Mermel C，Zejnullahu K，Murphy C，Lifshits E，et al.(2008)EML4-ALK fusion gene and efficacy of an ALK kinase inhibitor in lung cancer.Clin Cancer Res 14：4275-4283。

Claims (23)

1.一种用于构建检测ALK基因融突变文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取DNA并使其片段化；

2)构建DNA预文库；

3)环化DNA；

4)用ALK的特异性引物进行PCR扩增，富集目标区域生成终文库。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA是血浆DNA或组织DNA，优选血浆DNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的特异性引物是相邻且背向延伸的引物对的集合。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异性引物覆盖了ALK基因融合突变热点区域以及克唑替尼的耐药突变点。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异性引物覆盖了ALK基因完整的19号内含子、19号外显子的3’端和20号外显子的5’端，并且覆盖了外显子22、23和25上克唑替尼的耐药突变点。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异性引物序列为：

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物含有用于高通量测序文库的接头序列。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的构建DNA预文库包括连接DNA分子与接头，并使用与接头序列相匹配的引物进行PCR预扩增以形成预文库。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述接头包含标签序列。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的环化是夹板介导的单链DNA环化。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，夹板介导的单链DNA环化酶包括T4DNA连接酶、Taq DNA连接酶、E.coli DNA连接酶和9°N DNA连接酶，以及它们的组合。

12.一种用于构建无创检测ALK基因融合突变文库的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

1)用于DNA并使其片段化的试剂；

2)用于构建DNA预文库的试剂；

3)用于纯化预文库的设备和试剂；

4)用于环化DNA和消化线性DNA的试剂；

5)用ALK特异性引物进行PCR扩增以获得终文库的试剂；和

6)用于纯化终文库的设备和试剂。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA是血浆DNA或组织DNA，优选血浆DNA。

14.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物是相邻且背向延伸的引物对的集合。

15.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物覆盖了ALK基因融合突变热点区域以及克唑替尼的耐药突变点。

16.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物覆盖了ALK基因完整的19号内含子、19号外显子的3’端和20号外显子的5’端，并且覆盖了外显子22、23和25上克唑替尼的耐药突变点。

17.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物序列为：

18.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述背向延伸的引物含有用于高通量测序文库的接头序列。

19.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述用于环化DNA的试剂是单链DNA环化酶。

20.根据权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，所述单链DNA环化酶包括T4DNA连接酶、Taq DNA连接酶、E.coli DNA连接酶和9°N DNA连接酶，以及它们的组合。

21.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述用于构建预文库的酶包括用于对DNA末端进行补平修复的酶；用于为DNA的3’端加上腺嘌呤和鸟嘌呤的酶，包括T4DNA聚合酶、Klenow酶、DNA聚合酶、Taq酶和klenow ex-；和用于接头连接的酶，包括T4DNA连接酶、T7DNA连接酶、或它们的组合。

22.一种用于检测ALK基因融合突变的方法，包括以下步骤：

(1)提供血浆DNA或组织DNA样品，

(2)根据权利要求1-12任一项所述的方法或用权利要求13-22任一项所述的试剂盒制备终文库，

(3)对所述终文库用第二代测序平台进行高通量测序，

(4)对测序结果进行序列分析，并判断是否存在ALK基因融合突变以及当存在ALK基因融合突变时，与ALK基因融合的配对基因和融合位点。

23.ALK特异性引物在制备用于检测受试者中ALK基因融合突变的诊断试剂或试剂盒中的用途，其中所述ALK特异性引物的序列如下：