CN112626206A - 一种rna融合基因检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种RNA融合基因检测方法和试剂盒，其中该方法包括：提供待检测RNA样本反转录成的cDNA以及融合基因断点区域的扩增引物和内参基因的扩增引物；使用融合基因断点区域的扩增引物和内参基因的扩增引物分别对cDNA的融合基因断点区域和内参基因进行PCR扩增，以得到融合基因断点区域和内参基因扩增子；对融合基因断点区域和内参基因扩增子进行测序，并统计测序结果中覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数；计算覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数之间的比例；根据该比例确定基因融合的发生。本发明具有对样本质量和投入量要求低、操作简便、建库速度快、成本低等优势，可以快速对组织样本的多个融合基因进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种RNA融合基因检测方法和试剂盒。
背景技术
融合基因是由染色体的易位、插入、颠倒、缺失等重排导致的。融合基因引发癌症的机制主要有两种：一部分发生在肿瘤驱动基因上的基因融合使这些基因拥有强的启动子或增强子，或激活转录因子，使其异常表达；另一部分融合基因会产生有生物学作用(如激酶活性等)的嵌合体蛋白，使生物体紊乱。可用药的激酶融合在检测的单个癌症类型中检测到的频率为1％-9％，包括ALK、ROS1、RET、NTRKs和FGFR等。目前针对融合基因的肿瘤靶向药物已有多种获得FDA/CFDA批准，如针对ALK、ROS1基因融合的克唑替尼，以及针对NTRKs基因融合的Larotrectinib等。美国国家综合癌症网络(NCCN)指出，含有融合基因的患者可接受相应的靶向药物治疗，推荐的检测手段有高通量测序(NGS)、实时荧光定量PCR(RT-PCR)、荧光原位杂交(FISH)，以及免疫组化(IHC)等。
由于FISH和IHC等方法具有通量低、检测周期长、费用昂贵等缺点，而RT-PCR只能用来检测已知融合变异，NGS技术被越来越多用在肿瘤基因融合的检测上。在目前已报道的近10000个基因融合中，有90％是通过NGS方法鉴定的。由于融合多发生在内含子区域且断点位置不固定，RNA测序也被广泛用来进行融合基因的检测。RNA测序有基于PCR和杂交捕获(RNA-Capseq)两种靶向测序方法。由于RNA-Capseq具有操作复杂、成本高、需要的样本投入量大等缺点，基于多重PCR的RNA融合基因检测方法也被多家公司采用进行相应的检测。
发明内容
本发明提供一种RNA融合基因检测方法和试剂盒，具有对样本质量和投入量要求低、操作简便、建库速度快、成本低等优势，可以快速对组织样本的多个融合基因进行检测。
根据第一方面，一种实施例中提供一种RNA融合基因检测方法，包括：
提供待检测RNA样本反转录成的cDNA以及融合基因断点区域的扩增引物和内参基因的扩增引物，其中融合基因断点区域的扩增引物中的上、下游引物分别设计在融合断点两侧的驱动基因和与上述驱动基因融合的另一基因的转录区域中，使得融合发生时能够扩增出上述融合基因断点区域而融合未发生时不能扩增出上述融合基因断点区域；
使用上述融合基因断点区域的扩增引物和内参基因的扩增引物分别对上述cDNA的融合基因断点区域和内参基因进行PCR扩增，以得到融合基因断点区域扩增子和内参基因扩增子；
对上述融合基因断点区域扩增子和内参基因扩增子进行测序，并统计测序结果中覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数；
计算上述覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数之间的比例或对上述扩增子读长数进行均一化处理得到均一化结果；
根据上述比例或上述均一化结果，确定上述RNA样本是否在上述驱动基因和上述另一基因间发生融合。
在优选实施例中，上述PCR扩增为包括第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的多重PCR扩增；相应地，上述扩增引物包括第一轮PCR扩增引物和第二轮PCR扩增引物。
在优选实施例中，上述内参基因为管家基因。
在优选实施例中，上述管家基因选自RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP基因中的一种或多种。
在优选实施例中，上述内参基因的扩增引物为RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP基因的引物的混合物；相应地，上述测序结果中内参基因的扩增子读长数为RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP基因的扩增子读长数的平均值。
在优选实施例中，上述内参基因可能包含RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP以外的其他管家基因。
在优选实施例中，上述驱动基因选自ALK、ROS1、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、NTRK1、NTRK2、NTRK3、BRAF、FLI1、MET、ERG和NRG1基因中的一种或多种。
在优选实施例中，上述方法还包括：
在上述驱动基因的远离融合基因断点位置的5’端和3’端各设计一对引物，并使用该对引物对上述cDNA进行PCR扩增，以得到上述5’端和3’端的读长数，并根据该读长数的相对变化对融合基因的判定结果进行进一步确认。
在优选实施例中，上述方法还包括：将待检测RNA样本反转录成cDNA，以用作上述PCR扩增的模板。
在优选实施例中，上述方法还包括：在上述扩增子的两端加上测序接头，以适配后续测序中的高通量测序平台。
在优选实施例中，上述方法还包括：对上述扩增子进行单链环化，以适应后续的MGI测序平台的高通量测序。
根据第二方面，一种实施例中提供一种RNA融合基因检测试剂盒，包括：
融合基因断点区域的扩增引物，其包括上、下游引物，分别设计在融合断点两侧的驱动基因和与上述驱动基因融合的另一基因的转录区域中，使得融合发生时能够扩增出上述融合基因断点区域而融合未发生时不能扩增出上述融合基因断点区域；
内参基因的扩增引物，其包括扩增内参基因上的序列片段的引物对；
上述融合基因断点区域的扩增引物和上述内参基因的扩增引物，用于分别对cDNA的融合基因断点区域和内参基因进行PCR扩增，以得到融合基因断点区域扩增子和内参基因扩增子，并进一步测序得到测序结果中覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数，以用于计算上述覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数之间的比例或对上述扩增子读长数进行均一化处理得到均一化结果，并根据上述比例或上述均一化结果，确定上述RNA样本是否在上述驱动基因和上述另一基因间发生融合。
本发明通过PCR扩增融合基因断点区域和内参基因获得相应的扩增子，通过测序得到扩增子读长数，并通过对扩增子读长数的统计和分析得到基因融合的发生情况。本发明可快速制备用于检测RNA样本中多个融合基因的高通量测序文库。从得到RNA样本到建库完成一共只需要6个小时，其中手工操作的时间约为2个小时。下机数据基于序列比对，简便快速，可自动化程度高。相比锚定PCR和RNA-Capseq，本发明需要更短的建库和信息分析时间，需要的测序数据量小于0.5M/样本。由于步骤简单、操作方便、时间缩短、测序数据需求量小，相应的成本也会降低。
附图说明
图1为本发明实施例中融合基因检测的设计原理示意图，融合扩增子的引物设计在融合断点的两侧，驱动基因的5’端和3’端也设计有引物；
图2为本发明实施例中所建文库的电泳结果图，其中最左侧为DNA marker，文库主峰在250-300bp之间。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
如图1所示，本发明一个实施例中融合基因检测的原理是：在基因1和基因2(驱动基因)上分别设计上、下游引物，作为融合基因断点区域的扩增引物，融合断点位于上、下游引物之间。未发生基因融合时，上、下游引物距离太远，不能进行PCR扩增得到扩增子；发生基因融合时，上、下游引物靠近在一起，能进行PCR扩增得到扩增子。也就是说，融合发生时能够扩增出融合基因断点区域而融合未发生时不能扩增出融合基因断点区域。
类似地，作为参考标准，在内参基因上设计上、下游引物，作为内参基因的扩增引物。其扩增产物的高通量测序和定量统计数据作为计算融合基因发生情况的依据。
因此，在本发明的一个实施例中，一种RNA融合基因检测方法，包括：
提供待检测RNA样本反转录成的cDNA以及融合基因断点区域的扩增引物和内参基因的扩增引物，其中融合基因断点区域的扩增引物中的上、下游引物分别设计在融合断点两侧的驱动基因和与驱动基因融合的另一基因的转录区域中，使得融合发生时能够扩增出融合基因断点区域而融合未发生时不能扩增出融合基因断点区域；
使用融合基因断点区域的扩增引物和内参基因的扩增引物分别对cDNA的融合基因断点区域和内参基因进行PCR扩增，以得到融合基因断点区域扩增子和内参基因扩增子；
对融合基因断点区域扩增子和内参基因扩增子进行测序，并统计测序结果中覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数；
计算覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数之间的比例或对扩增子读长数进行均一化处理得到均一化结果；
根据比例或均一化结果，确定RNA样本是否在驱动基因和另一基因间发生融合。
在本发明的一个实施例中，内参基因是细胞内的管家基因，例如选自RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP基因中的一种或多种的管家基因。在优选实施例中，内参基因选择RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP基因共五种基因，相应地，内参基因的扩增引物为RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP基因的引物的混合物。相应地，测序结果中内参基因的扩增子读长数为RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP基因的扩增子读长数的平均值。
应当理解，在本发明的其他实施例中，内参基因不限于RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP五种基因。也可以是其他任何合适的基因，特别是细胞内的其他管家基因。
在本发明的一个实施例中，驱动基因选自ALK、ROS1、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、NTRK1、NTRK2、NTRK3、BRAF、FLI1、MET、ERG和NRG1基因中的一种或多种。具体而言，根据欲检测的融合基因选择相应的驱动基因，例如，在本发明一个实施例中，欲检测的融合基因是EML4-ALK融合基因，该融合基因是EML4基因与ALK驱动基因融合形成的。
应当理解，在本发明的其他实施例中，驱动基因不限于ALK、ROS1、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、NTRK1、NTRK2、NTRK3、BRAF、FLI1、MET、ERG和NRG1，也可以是其他任何合适的驱动基因，包括将来新发现的驱动基因。
需要说明的是，本发明的方法适合通过一轮PCR直接扩增融合基因断点区域。然而，在本发明的优选实施例中，为了提高融合基因检测的特异性，采用多重PCR的扩增策略，例如，在本发明一个实施例中，包括第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增。相应地，扩增引物包括第一轮PCR扩增引物和第二轮PCR扩增引物。
在本发明的优选实施例中，采用多重PCR的扩增策略，对RNA样本中的融合基因进行检测，解决了锚定PCR和RNA-Capseq面临的实验操作复杂和建库周期长的问题。在本发明的优选实施例中，mRNA先反转录成cDNA，然后通过两轮PCR扩增，对包含融合基因断点位置和内参基因相关目标区域进行富集，再通过相关的信息分析，判定样本是否存在基因融合。
如图1所示，为了进一步确认样本中的基因融合，在本发明的优选实施例中，本发明的方法还包括：
在驱动基因(图中基因2)的远离融合基因断点位置的5’端和3’端各设计一对引物，并使用该对引物对cDNA进行PCR扩增。当驱动基因(图中基因2)未发生融合时，5’端和3’端的引物都能进行PCR扩增，且表达量相近；当发生融合时，5’端不能进行PCR扩增，而3’端能进行PCR扩增，3’端表达量显著增加。通过上述PCR扩增，得到5’端和3’端的读长数，并根据该读长数的相对变化对融合基因的判定结果进行进一步确认。
需要说明的是，本发明的上述方法是以cDNA作为起始样本。RNA样本反转录成cDNA的步骤并非本发明的方法的必须步骤。然而，在其他实施例中，在起始样本为RNA样本的情况下，本发明的融合基因检测方法还包括：将待检测RNA样本反转录成cDNA，以用作PCR扩增的模板。
在本发明实施例中，通过上述PCR扩增得到的扩增子，可能需要在两端加上测序接头，以适配后续测序中的高通量测序平台。其中，高通量测序平台可以是华大基因的MGI测序平台，或其他高通量测序平台，如Illumina测序平台或Ion Torrent测序平台等。相应地，测序接头可以使用各平台特别配套的测序接头。
在本发明的其他实施例中，本发明的融合基因检测方法还包括：对扩增子进行单链环化，以适应后续的高通量测序，特别是在MGI测序平台上进行的高通量测序。
对应于本发明实施例中的RNA融合基因检测方法，本发明的一个实施例中提供一种RNA融合基因检测试剂盒，包括：
融合基因断点区域的扩增引物，其包括上、下游引物，分别设计在融合断点两侧的驱动基因和与上述驱动基因融合的另一基因的转录区域中，使得融合发生时能够扩增出上述融合基因断点区域而融合未发生时不能扩增出上述融合基因断点区域；
内参基因的扩增引物，其包括扩增内参基因上的序列片段的引物对；
上述融合基因断点区域的扩增引物和上述内参基因的扩增引物，用于分别对cDNA的融合基因断点区域和内参基因进行PCR扩增，以得到融合基因断点区域扩增子和内参基因扩增子，并进一步测序得到测序结果中覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数，以用于计算上述覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数之间的比例或对上述扩增子读长数进行均一化处理得到均一化结果，并根据上述比例或上述均一化结果，确定上述RNA样本是否在上述驱动基因和上述另一基因间发生融合。
以下通过实施例详细说明本发明的技术方案和效果，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1
本实施例提供了对EML4-ALK融合基因检测的具体应用的例子。样本为融合阳性标准品(HD796)和融合阴性标准品(HD783)。
拿到的样本为FFPE样本，应先进行RNA提取，可选用天根生化科技(北京)有限公司的DNA/RNA共提取试剂盒进行提取。
1.提取的RNA需要进行反转录，形成cDNA。在正式反转录之前，加入N6引物进行变性，反应液的配制如下表1所示：
表1
| 组分 | 体积 |
| RNA(50ng) | 2.2μL |
| N6引物 | 1μL |
| H<sub>2</sub>O | 2.8μL |
| 总量 | 6μL |
反应条件如下表2所示：
表2
| 温度 | 时间 |
| 90℃ | 10min |
| 立即冰浴 | 2min |
2.用反转录酶对RNA进行反转录，具体反应液的配制如下表3所示：
表3
反应条件如下表4所示：
表4
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 25℃ | 10min | 1 |
| 42℃ | 60min | 1 |
| 85℃ | 10min | 1 |
| 4℃ | Hold | - |
3.第一轮PCR扩增。第一轮PCR扩增用到的引物为末端带有18bp测序接头序列的T引物池，和与基因组特异性结合的U引物池，T引物池和U引物池按照1:1的比例进行混合，组成多重PCR引物池1，引物序列如表5所示。反应液的配制如下表6所示：
表5
表6
| 组分 | 体积 |
| 2XKAPA 2G multiplex Master mix | 12.5μL |
| 多重PCR引物池1 | 2μL |
| 上一步反应产物 | 10μL |
| H<sub>2</sub>O | 0.5μL |
| 总量 | 20μL |
PCR反应程序如下表7所示：
表7
4.第一轮PCR产物用1.5倍体积的Ampure XP磁珠(37.5μL)进行纯化，纯化产物最终溶解在10.5μL TE缓冲液中。
5.第二轮PCR扩增。第二轮PCR扩增加上区分每个样本的条形码(barcode)序列，其中多重PCR引物池2的序列如表8所示，PCR反应液配制如下表9所示：
表8
表9
| 组分 | 体积 |
| 2XKAPA 2G multiplex Master mix | 12.5μL |
| 多重PCR引物池2 | 1μL |
| 条形码(barcode)序列 | 1μL |
| 上一步反应产物 | 10.5μL |
| 总量 | 25μL |
PCR反应程序如下表10所示：
表10
6.第二轮PCR扩增产物加入25μL Ampure XP磁珠进行纯化，纯化产物最终用20μLTE缓冲液进行回溶。产物主片段大小在250-300bp，电泳结果如图2所示。
7.所建好的文库进行环化、上机得到分析数据。
8.下机数据进行QC分析，测序序列与靶区域的序列进行比对，计算比对率(mapping rate)等。阳性标准品和阴性标准品不同靶区域的读长(reads)数如下表11所示。
表11
由结果可见，阳性样本融合基因的读长(reads)数占内参基因的比例远远高于阴性样本，可据此比例区分样本是否发生了融合。此外，由于EML4-ALK融合基因的发生，ALK启动子增强，进而导致ALK基因3’端表达量大幅增加，ALK基因5’端的读长数远小于ALK基因3’端的读长数，进一步确认了检测结果。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大智造科技有限公司
<120> 一种RNA融合基因检测方法和试剂盒
<130> 19I28900
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acatggctac gatccgactt attaagggtg tgggccgaag 40
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acatggctac gatccgactt tcctcgtgga aggcccg 37
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acatggctac gatccgactt gccagctcac catggatg 38
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acatggctac gatccgactt cggagtcaac ggatttggtc 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acatggctac gatccgactt gcagtgaccc agcatcactg 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acatggctac gatccgactt gccgatatgg tctggagtgc 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acatggctac gatccgactt tcaccctcat tcggggtctg 40
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atagcctttg ccatcactgc 20
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aggcccttct ctcgcca 17
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctcgcctttg ccgatccgc 19
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gacaccatgg ggaaggtgaa g 21
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgctggccca tagtgatc 18
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gactccttcc ctttcctgtc tc 22
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aggtgccgcg gaaaaaca 18
<210> 15
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgtgagccaa ggagttgatc ggacctattg tcttcctaag accgcttggc ctccgactt 59
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccgcttggcc tccgacttac atccttctgt ctgttcaaga 40
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ccgcttggcc tccgacttta gttggacttc caggtcgc 38
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ccgcttggcc tccgacttga gaccaaatcc catatcctcg 40
<210> 19
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ccgcttggcc tccgactttt cccgttctca gccttgac 38
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ccgcttggcc tccgacttgg caggctgttg ttctga 36
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ccgcttggcc tccgacttgg gcatctcctt agaacgct 38
<210> 22
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ccgcttggcc tccgacttat gatcagggct tccatgagg 39
Claims (10)
1.一种RNA融合基因检测方法，其特征在于，所述方法包括：
提供待检测RNA样本反转录成的cDNA以及融合基因断点区域的扩增引物和内参基因的扩增引物，其中融合基因断点区域的扩增引物中的上、下游引物分别设计在融合断点两侧的驱动基因和与所述驱动基因融合的另一基因的转录区域中，使得融合发生时能够扩增出所述融合基因断点区域而融合未发生时不能扩增出所述融合基因断点区域；
使用所述融合基因断点区域的扩增引物和内参基因的扩增引物分别对所述cDNA的融合基因断点区域和内参基因进行PCR扩增，以得到融合基因断点区域扩增子和内参基因扩增子；
对所述融合基因断点区域扩增子和内参基因扩增子进行测序，并统计测序结果中覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数；
计算所述覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数之间的比例或对所述扩增子读长数进行均一化处理得到均一化结果；
根据所述比例或所述均一化结果，确定所述RNA样本是否在所述驱动基因和所述另一基因间发生融合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增为包括第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的多重PCR扩增；相应地，所述扩增引物包括第一轮PCR扩增引物和第二轮PCR扩增引物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内参基因为管家基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述管家基因选自RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP基因中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述内参基因的扩增引物为RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP基因的引物的混合物；相应地，所述测序结果中内参基因的扩增子读长数为RPS18、RPLP0、ACTB、GAPDH和TBP基因的扩增子读长数的平均值。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述驱动基因选自ALK、ROS1、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、NTRK1、NTRK2、NTRK3、BRAF、FLI1、MET、ERG和NRG1基因中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
在所述驱动基因的远离融合基因断点位置的5’端和3’端各设计一对引物，并使用该对引物对所述cDNA进行PCR扩增，以得到所述5’端和3’端的读长数，并根据该读长数的相对变化对融合基因的判定结果进行进一步确认。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将待检测RNA样本反转录成cDNA，以用作所述PCR扩增的模板。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在所述扩增子的两端加上测序接头，以适配后续测序中的高通量测序平台；
优选地，所述方法还包括：对所述扩增子进行单链环化，以适应后续的MGI测序平台的高通量测序。
10.一种RNA融合基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
融合基因断点区域的扩增引物，其包括上、下游引物，分别设计在融合断点两侧的驱动基因和与所述驱动基因融合的另一基因的转录区域中，使得融合发生时能够扩增出所述融合基因断点区域而融合未发生时不能扩增出所述融合基因断点区域；
内参基因的扩增引物，其包括扩增内参基因上的序列片段的引物对；
所述融合基因断点区域的扩增引物和所述内参基因的扩增引物，用于分别对cDNA的融合基因断点区域和内参基因进行PCR扩增，以得到融合基因断点区域扩增子和内参基因扩增子，并进一步测序得到测序结果中覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数，以用于计算所述覆盖融合断点的扩增子读长数与内参基因的扩增子读长数之间的比例或对所述扩增子读长数进行均一化处理得到均一化结果，并根据所述比例或所述均一化结果，确定所述RNA样本是否在所述驱动基因和所述另一基因间发生融合。
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