CN110229874A - 从肿瘤组织检测alk基因酪氨酸区高表达的方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从肿瘤组织检测ALK基因酪氨酸区高表达的方法及其从肿瘤组织检测ALK基因酪氨酸区高表达的试剂盒。该方法中ALK基因上游引物和下游引物分别位于待扩增测靶标区域的两端,所述上游引物、下游引物和/或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域,使上下游引物之间的待扩增测靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域;所述ALK基因的探针和所述参照基因的探针分别用不同的荧光基团进行标记。本发明的方法可以简便快速检测ALK基因酪氨酸激酶区的高表达,无论是由哪种伴侣融合造成的ALK融合,均可以进行准确检测,为靶向药物ALK抑制剂的临床治疗应用提供指导。
Description
技术领域
本发明涉及数字PCR技术领域,具体涉及一种从肿瘤组织检测ALK基因酪氨酸区高表达的方法及其试剂盒。
背景技术
间变淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)融合基因是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中第二常见的驱动基因,在中国NSCLC患者中的突变率为5.3%左右。ALK激酶域共有10个外显子(EXON20-29),最常见的EML4融合发生在EXON20外显子上。目前发现EML4-ALK有30多种融合形式,其他的融合伴侣基因还有KIF5B、TFG、KLC1和PTN3等,目前已报道有30多种。目前ALK基因融合常见的方法主要有荧光原位杂交(FISH)、免疫组化(ICH)、逆转录荧光PCR(RT-PCR)和二代测序(NGS)等方法,这些方法都有不同程度的漏检,有些方法检测流程复杂。除了脑组织之外,ALK基因表达量自出生后下降至低水平,在正常的肺组织中并不表达,其3'端酪氨酸激酶区可与多种伴侣发生融合,使ALK基因的3'端实现了高表达。正是基于ALK基因融合后这一高表达特点,本发明设计了通过检测ALK基因mRNA的3’端表达量与参照基因mRNA表达量的定量差异来检测ALK基因酪氨酸区的高表达。
发明内容
为了解决上述关键问题,本发明提供一种从肿瘤组织检测ALK基因酪氨酸区高表达的方法,所述方法包括以下步骤:步骤1:从肿瘤组织获得RNA样本;步骤2:在ALK基因mRNA断裂位置3'端之后的至少二个相邻外显子区域和参照基因mRNA中分别筛选待测靶标区域;步骤3:对步骤2中筛选的靶标区域分别设计相应的引物对和探针,其中ALK基因上游引物和下游引物分别位于待扩增测靶标区域的两端,所述上游引物、下游引物和/或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域,使上下游引物之间的待扩增测靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域;所述ALK基因的探针和所述参照基因的探针分别用不同的荧光基团进行标记;步骤4:对步骤2中所述筛选的待测靶标区域进行微滴式数字PCR扩增;和步骤5:根据所述ALK基因和所述参照基因的不同荧光染料标记的阳性PCR产物液滴数的比例,来判断肿瘤组织是否存在ALK基因酪氨酸区高表达。
在一种实施方式中,所述步骤2中的待测靶标区域不含有SNP位点、无重复序列和GC含量为40-60%。
在一种实施方式中,所述引物对和探针的长度范围为10-30bp,优选地为13-20bp,使引物Tm为40-70℃,探针Tm达到60-75℃。这样可以进行有效PCR扩增。
在一种实施方式中,步骤3中设计ALK基因mRNA的引物对和探针时,其中ALK基因上游引物位于ALK基因外显子23,下游引物位于ALK基因外显子24,所述探针位于ALK基因外显子23-24拼接区域。
在一种实施方式中,所述ALK基因上游引物为SEQ ID NO:1:TCTGAACAGGACGAACTGGA;所述ALK基因下游引物为SEQ ID NO:2:TGGTGGTTGAATTTGCTGA;和所述ALK基因探针为SEQ ID NO:3:CTCATGGAAGCCC。
在一种实施方式中,步骤3中设计参照基因mRNA的引物对和探针时,其中参照基因上游引物和下游引物分别位于待扩增测靶标区域的两端,所述上游引物、下游引物和/或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域,使上下游引物之间的待扩增测靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域。
在一种实施方式中,所述参照基因是人管家基因,优选地为GAPDH、β-action或ABL1基因。
在一种实施方式中,所述参照基因是GAPDH基因,扩增其的待测靶标区域上游引物包括其外显子3和4的拼接区域,下游引物位于其外显子5区域,和探针位于外显子4区域。
在一种实施方式中,所述上游引物是SEQ ID NO:5:CATCTTCCAGGAGCGAGATC;所述下游引物是SEQ ID NO:6:ATGGTTCACACCCATGACGA;和所述探针是SEQ ID NO:4:GTACGTCGTGGAGTC。
在一种实施方式中,本发明提供一种从肿瘤组织检测ALK基因酪氨酸区高表达的试剂盒,所述试剂盒包括上述方法中所使用的引物对和探针。
在本发明中,ALK基因上游引物和下游引物分别位于待扩增靶标区域的两端,所述待扩增靶标区域为ALK基因断裂位置(通常在20外显子处)的3’端后面的RNA区域。除了脑组织之外,ALK基因表达量自出生后下降至低水平,在正常的肺组织中并不表达,因此,在正常情况下,ALK基因的RNA在肺组织中含量很低,但当其3'端(即酪氨酸激酶区)发生断裂(通常在20外显子处)后,可与多种伴侣发生融合,这些伴侣基因的强启动子使ALK基因的3'端实现了高表达。而且只有ALK基因的酪氨酸激酶区发生高表达后,则靶向药物ALK抑制剂对其产生作用,具有较好的治疗效果。因此,通过检测ALK基因断裂位点之后的外显子的表达量,将其与内对照基因的表达量做比较,则可以判断ALK基因是否发生融合。即:当ALK基因发生融合时,则断裂点3'端之后的外显子(包括酪氨酸激酶区)发生高表达;而ALK基因未发生融合时,则断裂点3'端之后的外显子(包括酪氨酸激酶区)不发生高表达。以对照基因的表达量作为归一化的标准,可以判断ALK基因是否发生融合。所述上游引物、下游引物和/或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域,使上下游引物之间的待扩增测靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域;这样将更特异性检测RNA分子,因为在DNA分子中,上述上下游引物之间的待扩增测靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域的设计方案,将使扩增产物至少包括一个内含子区域(即两个相邻外显子之间就是内含子区域,在RNA转录时该内含子被剪切掉),这样由于内含子一般都较长(大于1kb),因此,其扩增产物很难被扩增出来,这样就可以排除DNA对检测干扰,提高检测的特异性。
本发明的方法可以简便快速检测ALK基因酪氨酸激酶区的高表达,无论是由哪种伴侣融合造成的ALK融合,均可以进行准确检测,为靶向药物ALK抑制剂的临床治疗应用提供指导。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都应当属于本申请保护的范围。下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1肿瘤组织RNA提取
将肿瘤组织石蜡样本切成5-10μm厚的切片,取2-8张迅速置于1.5mlRNase-free的离心管中,加入1ml二甲苯,振荡,离心,弃上清,然后加入1ml无水乙醇,同样离心后去上清,沉淀用组织RNA提取试剂盒(天根)按说明书操作进行RNA提取,最终得到的RNA洗脱液保存于-80℃,备用。
实施例2引物探针的设计、合成
引物探针序列如下表。其中待检测基因(ALK基因)的扩增区域(扩增子)在ALK基因mRNA断裂位点(20外显子区)之后的3’端酪氨酸激酶区域,该扩增区域至少包括二个外显子区域。内对照基因(本例中为GAPDH基因)的扩增区域至少包括一个外显子拼接区域。如表1中所示,ALK上下游引物均位于其断裂位点(20外显子区)之后的酪氨酸激酶区,其中上游引物在外显子23上,下游引物在外显子24上,探针位于外显子23-24上,扩增子包括外显子23-24的拼接区域;对照基因GAPDH的上游引物在外显子3-4上,下游引物在外显子5上,探针在外显子4上,扩增子包括外显子3-4和外显子4-5两个外显子拼接区域。
表1引物探针序列
实施例3数字PCR检测ALK融合基因型
1.数字PCR检测ALK融合基因型过程
用于检测的微液滴数字PCR反应条件如下:配制反转录ddPCR(RT-ddPCR)扩增体系,所用引物探针序列见表1。
RT-ddPCR扩增反应混合物包括:1×逆转录酶mix(新羿制造)、1×MasterMix预混液(新羿制造)、1×稳定剂(新羿制造)、引物为200-1000nM(ALK-F1,ALK-R1,GAPDH-F,GAPDH-R、检测探针各100-800nM(ALK-Pb1,GAPDH-Pb)、模板RNA 1-100ng,补水到30ul,将试剂混匀。用样本制备仪(新羿制造科技(北京)有限公司)根据说明书进行微液滴制备。然后将含有微液滴的8联排管放到PCR仪上进行扩增,扩增条件设定如下表2。
表2扩增步骤
PCR扩增后,用芯片阅读仪(新羿制造科技(北京)有限公司)参照仪器使用说明书进行液滴检测和数据分析。通过FAM通道和VIC通道拷贝数比值来检测ALK基因酪氨酸激酶区的高表达。
2.结果分析
表3是确定为ALK阴性的临床样本的检测结果,通过这些样本计算FAM/VIC比值的平均值和标准方差,用于计算统计值Z值的标准量。本例中FAM/VIC比值(x 1000)平均值是0.78,标准方差为0.62。在实际检测应用中,可以通过不断扩大临床样本的检测量,可进一步修正FAM/VIC比值的标准量,从而达到更加精确检测未知样本的目的。在对未知样本进行检测时,通过测定FAM/VIC比值是否偏离标准量,即可以推断出待测样本是否为ALK基因融合阳性。设定3倍的标准差作为阳性的临界值,通过Z检验来计算测定出的FAM/VIC比值的偏移量,即Z的临界值为3,Z大于3即表示在统计意义上有99.9%的概率可以确定为ALK基因酪氨酸激酶区的高表达阳性样本。Z值计算公式如下:Z值=ABS(FAM/VIC比值测定值-FAM/VIC比值平均值)/FAM/VIC比值的标准方差。
表4为临床样本检测结果,其中ALK基因酪氨酸激酶区的高表达阳性样本(临床样本2)Z值大于3,而ALK基因酪氨酸激酶区的高表达阴性样本(临床样本1)Z值小于3,可以显著进行区分。
表3 ALK阴性样本确定FAM/VIC比值的标准量
表4 ALK检测结果
样本名称 | FAM拷贝数 | VIC拷贝数 | FAM/VIC(X1000) | Z值 |
临床样本1 | 15.8 | 26391.6 | 0.60 | 0.29 |
临床样本2 | 8573.6 | 69947.7 | 122.57 | 196.68 |
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质,因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的,而不是意欲限制本发明的范围,本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到,或者能够确认使用不超过常规实验,在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 新羿制造科技(北京)有限公司
<120> 从肿瘤组织检测ALK基因酪氨酸区高表达的方法及其试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctgaacagg acgaactgga 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggtggttga atttgctga 19
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcatggaag ccc 13
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtacgtcgtg gagtc 15
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catcttccag gagcgagatc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggttcaca cccatgacga 20
Claims (10)
1.一种从肿瘤组织检测ALK基因酪氨酸区高表达的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
步骤1:从肿瘤组织获得RNA样本;
步骤2:在ALK基因mRNA断裂位置3'端之后的至少二个相邻外显子区域和参照基因mRNA中分别筛选待测靶标区域;
步骤3:对步骤2中筛选的靶标区域分别设计相应的引物对和探针,其中ALK基因上游引物和下游引物分别位于待扩增测靶标区域的两端,所述上游引物、下游引物和/或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域,使上下游引物之间的待扩增测靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域;所述ALK基因的探针和所述参照基因的探针分别用不同的荧光基团进行标记;
步骤4:对步骤2中所述筛选的待测靶标区域进行微滴式数字PCR扩增;和
步骤5:根据所述ALK基因和所述参照基因的不同荧光染料标记的阳性PCR产物液滴数的比例,来判断肿瘤组织是否存在ALK基因酪氨酸区高表达。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤2中的待测靶标区域不含有SNP位点、无重复序列和GC含量为40-60%。
3.根据权利要求1所述的的方法,其特征在于,所述引物对和探针的长度范围为10-30bp,优选地为13-20bp。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3中设计ALK基因mRNA的引物对和探针时,其中ALK基因上游引物位于ALK基因外显子23,下游引物位于ALK基因外显子24,所述探针位于ALK基因外显子23-24拼接区域。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述ALK基因上游引物为SEQ ID NO:1:TCTGAACAGGACGAACTGGA;所述ALK基因下游引物为SEQ ID NO:2:TGGTGGTTGAATTTGCTGA;和所述ALK基因探针为SEQ ID NO:3:CTCATGGAAGCCC。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3中设计参照基因mRNA的引物对和探针时,其中参照基因上游引物和下游引物分别位于待扩增测靶标区域的两端,所述上游引物、下游引物和/或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域,使上下游引物之间的待扩增测靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述参照基因是人管家基因,优选地为GAPDH、β-action或ABL1基因。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述参照基因是GAPDH基因,扩增其的待测靶标区域上游引物包括其外显子3和4的拼接区域,下游引物位于其外显子5区域,和探针位于外显子4区域。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述上游引物是SEQ ID NO:5:CATCTTCCAGGAGCGAGATC;所述下游引物是SEQ ID NO:6:ATGGTTCACACCCATGACGA;和所述探针是SEQ ID NO:4:GTACGTCGTGGAGTC。
10.一种从肿瘤组织检测ALK基因酪氨酸区高表达的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1-9任一所述方法中所使用的引物对和探针。
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CN112626206A (zh) * | 2019-09-24 | 2021-04-09 | 深圳华大智造科技有限公司 | 一种rna融合基因检测方法和试剂盒 |
Citations (1)
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CN104073563A (zh) * | 2014-07-10 | 2014-10-01 | 宁波大学 | 一种用于检测alk融合基因的荧光定量pcr方法及检测试剂盒 |
-
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