CN107937524A - 人类kras基因突变检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

人类kras基因突变检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人类KRAS基因突变检测试剂盒及检测方法，具有较高的灵敏度和准确性，克服传统PCR荧光探针法特异性不足、存在假阳性的缺点。该试剂盒通过使用肽核酸(PNA)技术，能够大大降低野生型背景信号，从而提高检测结果的特异性，能检出含10ng基因组中低至0.1％的KRAS突变。此外本试剂盒中的PCR反应液中包括酶溶液等，可直接加入样本检测，简化了操作步骤，使得检测过程更加快捷方便。

Description

人类KRAS基因突变检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类KRAS基因突变检测试剂盒及检测方法。
背景技术
RAS基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种一一Hras、Kras和Nras,分别定位在11、 12和1号染色体上。Kras因编码21kD的RAS蛋白又名p21基因。在RAS基因中,Kras 对人类癌症影响最大。Kras基因就像体内一个“开关”当正常时能控制调控细胞生长的 路径；发生异常时,则导致细胞持续生长,并阻止细胞自我毁灭。因此,基因在肿瘤细胞生 长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用,正常的Kras基因可抑制肿 瘤细胞生长,而一旦Kras基因发生突变,它就会持续刺激细胞生长,使细胞内信号传导紊 乱,打乱生长规律,细胞增殖失控而癌变,从而导致肿瘤的发生。
在不同的癌症当中存在不同的Kras基因突变的比例胰腺癌90％、结肠癌50％、肺癌 30％、卵巢癌15％、甲状腺癌50％、膀肌癌6％左右另外,红斑性狼疮、乳腺癌、肝癌、皮肤癌、类风湿性关节炎、肾癌及某些的白血病等都有较高的Kras基因突变水平。肿瘤患者KRAS突变与否显著影响EGFR靶向治疗药物的疗效。最新的临床研究表明：当患者本身不 存在KRAS基因突变，服用有关靶向治疗药物，能获得明显的治疗效果。美国癌症综合网 络NCCN提出肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行KRAS基因突变检测。根据 检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。KRAS基因突变检测已被NCCN 列为《结肠癌临床治疗指南》与《直肠癌临床治疗指南》临床用药必检项目。
KRAS基因突变包括以下七种常见的突变类型：G12D，G12A，G12V，G12S，G12R，G12C，G13D。KRAS基因突变为体细胞突变，因此检测方法也不同于一般性遗传突变检测。所以 对检测方法的要求主要有两点:由于样本模板中的突变比例未知，可能突变含量只有1％ 甚至更低，所以需要高灵敏度的检测方法来检出这些稀有细胞；另一方面由于样本中可 能绝大多数是野生型，所以要在绝大多数野生型背景中准确检出突变细胞就需要较高的 特异性。
检测KRAS基因突变的方法有很多，比如双脱氧测序技术，高分辨溶解曲线，变性高效液相色谱分析，焦磷酸测序法，TaqMan技术，荧光定量PCR技术，直接测序法等。其 中各检测法各有其优缺点，因此在该领域需要一种可以高效快速准确全面地检出KRAS基 因全部七种突变的产品及方法，以便及时准确地获得KRAS基因突变的信息。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人类KRAS基因突变检测试剂盒及检测方法，该试剂盒特 异性强、灵敏度高且周期短。
为实现上述发明的目的，本发明提供如下的技术解决方案：一种人类KRAS基因突变 检测试剂盒，含有针对KRAS基因突变位置的PNA肽核酸修饰的特异探针。
所述肽核酸修饰的探针核苷酸序列为5'-GAGCTGGTGGCGTAG-3'SEQ ID NO.1。
所述试剂盒还包括检测KRAS基因7种突变的7对特异性引物和1种特异性探针，7对特异性引物是由7种ARMS引物及1种通用下游引物组成；所述引物探针序列如下：
ARMS引物1：5'-ACTCTTGCCTACGCCAT-3'SEQ ID NO.2
ARMS引物2：5'-ACTCTTGCCTACGCCAG-3'SEQ ID NO.3
ARMS引物3：5'-CACTCTTGCCTACGCCAA-3'SEQ ID NO.4
ARMS引物4：5'-CTCTTGCCTACGCCACT-3'SEQ ID NO.5
ARMS引物5：5'-ACTCTTGCCTACGCCACG-3'SEQ ID NO.6
ARMS引物6：5'-ACTCTTGCCTACGCCACA-3'SEQ ID NO.7
ARMS引物7：5'-GTAGTTGGAGCTGGTGA-3'SEQ ID NO.8
通用下游引物：5'-CTATTGTTGGATCATATTCGTC-3'SEQ ID NO.9
特异性探针：FAM-5'-GAGTGCCTTGACGATACA-3'-NFQ-MGB SEQ ID NO.10。
所述试剂盒还包括外控系统及内控系统，所述外控系统为一对外控引物和相应的外 控探针，所述内控系统为一对内控引物和相应的内控探针，具体序列如下：
外控引物：
正向引物F：5'-TCCTGATTTCTGGAAAAGA-3'SEQ ID NO.11
反向引物R：5'-GAAGAGGGGAAGCTGTA-3'SEQ ID NO.12
外控探针：FAM-5'-GAAGGACAGGCAACTTG-3'-NFQ-MGB SEQ ID NO.13
内控引物：
正向引物F：5'-AGAGGCGTACAGGGATAG-3'SEQ ID NO.14
反向引物R：5'-CAGACTCCCCATCCCAAG-3'SEQ ID NO.15
内控探针：VIC-5'-AGCCTGGATAGCAACGTACATG-3'-NFQ-MGB SEQ ID NO.16。
所述试剂盒还包括阳性质控品及空白对照，所述阳性质控品为含有9种重组质粒的 混合液，9种重组质粒混合液包括7种突变重组质粒、内参重组质粒及外控重组质粒；所述空白对照为TE缓冲液。
所述试剂盒中包括酶溶液。
所述试剂盒中的酶溶液中含有UNG酶。
上述人类KRAS基因突变检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)设计KRAS基因突变引物探针及针对KRAS基因突变位置的PNA肽核酸修饰的特异探针，制备试剂盒；
(2)取7支突变检测管及1支质控管，分别加入步骤(1)中的PCR反应液；
(3)提取待测样本中的DNA模板，分别加入步骤(2)中所述的突变检测管及质控 管中，进行荧光定量PCR扩增反应；
(4)根据扩增曲线判读Ct值并计算ΔCt，依据参考范围，判定该检测区域是否发生突变。
所述荧光定量PCR条件为：50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃60s，40个循环； 37℃2min。
本发明KRAS基因突变检测试剂盒基于Taqman荧光PCR平台，结合等位基因特异性扩增(ARMS)技术检测KRAS基因2号外显子的12和13密码子上7种常见突变。另外， 本发明KRAS基因突变检测试剂盒中采用肽核酸技术用于封闭野生型模板，能够大大降低 野生型背景信号，提高检测结果的特异性。该试剂盒及检测方法具有以下优点：1.特异 性强，针对7种不同突变位点设计相应特异性引物，同时利用肽核酸技术封闭了野生型 模板，降低了背景；2.灵敏度高，在20ng野生型基因组DNA背景下，检测出突变含量为 1％的DNA；3.一步加样法，操作简洁快速，整个PCR反应能在90分钟内完成；4.加入UNG 酶防污染系统，检测过程为闭管操作，显著降低污染。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实 施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明的人类KRAS基因突变检测试剂盒，含有针对KRAS基因突变位置的PNA肽核酸修饰的特异探针。所述肽核酸修饰的探针核苷酸序列为5'-GAGCTGGTGGCGTAG-3'SEQ IDNO.1。
所述试剂盒还包括检测KRAS基因7种突变的7对特异性引物和1种特异性探针，7对特异性引物是由7种ARMS引物及1种通用下游引物组成。所述引物探针序列如下：
ARMS引物1：5'-ACTCTTGCCTACGCCAT-3'SEQ ID NO.2
ARMS引物2：5'-ACTCTTGCCTACGCCAG-3'SEQ ID NO.3
ARMS引物3：5'-CACTCTTGCCTACGCCAA-3'SEQ ID NO.4
ARMS引物4：5'-CTCTTGCCTACGCCACT-3'SEQ ID NO.5
ARMS引物5：5'-ACTCTTGCCTACGCCACG-3'SEQ ID NO.6
ARMS引物6：5'-ACTCTTGCCTACGCCACA-3'SEQ ID NO.7
ARMS引物7：5'-GTAGTTGGAGCTGGTGA-3'SEQ ID NO.8
通用下游引物：5'-CTATTGTTGGATCATATTCGTC-3'SEQ ID NO.9
特异性探针：FAM-5'-GAGTGCCTTGACGATACA-3'-NFQ-MGB。SEQ ID NO.10
该探针上连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降 低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。
所述试剂盒还包括外控系统及内控系统，作为对试剂、DNA质量以及操作本身的质控， 所述外控系统为一对外控引物和相应的外控探针，所述内控系统为一对内控引物和相应 的内控探针，具体序列如下：
外控引物：
正向引物F：5'-TCCTGATTTCTGGAAAAGA-3'SEQ ID NO.11
反向引物R：5'-GAAGAGGGGAAGCTGTA-3'SEQ ID NO.12
外控探针：FAM-5'-GAAGGACAGGCAACTTG-3'-NFQ-MGB SEQ ID NO.13
内控引物：
正向引物F：5'-AGAGGCGTACAGGGATAG-3'SEQ ID NO.14
反向引物R：5'-CAGACTCCCCATCCCAAG-3'SEQ ID NO.15
内控探针：VIC-5'-AGCCTGGATAGCAACGTACATG-3'-NFQ-MGB NO.16
本发明实施例中使用的封闭探针为肽核酸探针，该探针序列为SEQ ID NO.1，具体序 列为：
5'-GAGCTGGTGGCGTAG-3'
PNA(peptide nucleic acids，PNA)肽核酸技术，一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯 键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA 或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在 静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的杂交， PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远 优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核 酸酶和蛋白酶水解。本发明根据PNA这一特性，设计与野生型模板相匹配的PNA探针， 能够大大降低野生型背景信号，从而提高检测结果的特异性。
本发明实施例中，使用内控系统可以分析待检DNA能否被正常扩增，排除可能造成PCR失败的原因，保证实验的可靠性和可追溯性。该内控系统包括了内参引物、内参探针 及内参模板。
优选地，本发明使用管家基因β-actin作为内参，设计的相关引物序列为：
正向引物F：5'-AGAGGCGTACAGGGATAG-3'SEQ ID NO.16
反向引物R：5'-CAGACTCCCCATCCCAAG-3'SEQ ID NO.17
本发明实施例中的阳性参考品为含有KRAS基因G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、 G13D突变序列的质粒。
根据设计的探针引物，对各组分进行如下条件的优化：1-10×Master Mix、0.1-1μMKRAS正向引物、0.1-1μMKRAS反向引物、0.1-1μMKRAS探针、0.1-2μM PNA、0.02-3ng/ μLDNA模板。反应程序为50℃孵育1-5min；92-97℃预变性10-15min；92-97℃变性 10-30s，55-65℃退火1-2min，进行35-45个循环，采集荧光；最后37℃保存。
PCR程序运行结束后，观察扩增曲线，根据曲线设置合适的荧光信号噪带值(NoiseBand)，计算Ct值进行结果判定，具体如下：
1.弱阳性对照，Ct值应≤32，扩增曲线有明显指数增长期。
2.空白对照，FAM通道无扩增曲线，或者扩增曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增 长期，Ct值应≥37，或者软件直接判断为阴性。
3.内标检测样本反应孔中，若FAM通道无信号，则VIC通道应有信号；若FAM通道 有信号，则VIC通道即使无信号也属于正常现象。
4.外控反应孔中，Ct值应<27。
5.计算样本突变反应体系Ct值(Ct突变)与外控反应体系Ct值(Ct外控)的差值，即 ΔCt＝Ct突变-Ct外控。根据参考区间进行样本基因型判断。
利用本发明中的阴性参考品及阳性参考品(包括灵敏度参考品)进行各反应体系及 反应条件的优化，最终优化的反应体系如表2所示：
组分名称 体系(终浓度)
突变上游引物 0.5μM
突变下游引物 0.5μM
突变探针 0.2μM
内参上游引物 0.25μM
内参下游引物 0.25μM
内参探针 0.2μM
2×Master Mix 1×
PNA 0.5μM
DNA模板 2-25ng
总体积 20μL
最终最佳反应条件为：50℃孵育2min；95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火60s，40个循环；37℃孵育2min。
实施例2
在本试剂盒优化好的检测条件及扩增体系下，研究KRAS基因7种突变的最低检测限。 最低检测限的研究中，主要考虑原始模板中突变基因的百分率和扩增终体系中核酸浓度 两个因素。
(1)原始模板中突变百分率的研究
固定核酸浓度为人类基因组5ng/μL，按相应的拷贝数换算出质粒稀释至浓度为0.005pg/μL，用野生型质粒模板与突变型模板按体积分别配制突变百分率为2.5％、0.5％、0.1％和0.02％的混合模板，按优化好的检测体系及检测条件进行最低突变百分率的研究，用阴性参考品进行对比分析。最低突变百分率的检测结果如表3所示：
由表3看出，本试剂盒能够检测的原始模板中最低突变百分率为0.1％。
(2)扩增终体系核酸浓度研究
固定原始模板中突变百分率为0.1％，标准品质粒分别按基因组DNA浓度为1ng/μL、 5ng/μL、10ng/μL体积为2μL所含拷贝数稀释，用野生型质粒模板与突变型模板按体 积配制突变百分率为0.1％的混合模板，按优化好的检测体系及检测条件进行最低核酸浓 度的研究，用阴性参考品进行对比分析。最低核酸浓度的检测结果如表4所示：
由表4看出，本试剂盒能够检测的原始模板中最低核酸浓度为5ng/μL。
实施例3
用本发明的试剂盒进行真实样本的检测，收集20例临床病例诊断为结直肠癌的患者 的FFPE样本。组织样本中的DNA采用基因科技(上海)股份有限公司的试剂盒进行抽提，并对提取的DNA样本进行琼脂糖凝胶电泳检测，使用Qubit对样本浓度进行测定。
使用实施例1中的试剂盒及检测方法对该20例组织样本进行KRAS基因突变检测，同时对这些样本用二代测序(NGS)的方法进行检测，结果如表5所示。
本次样本均稀释至5ng/μL左右进行，结果显示本发明的KRAS突变基因检测方法与二代测序方法结果一致，符合率为100％。说明本试剂盒准确性较好，可用于检测组织样 本中的KRAS突变。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以 在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发 明的范围之内。
序列表
<110> 中源协和基因科技有限公司
<120> 人类KRAS基因突变检测试剂盒及检测方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
gagctggtgg cgtag 15
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 2
actcttgcct acgccat 17
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 3
actcttgcct acgccag 17
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 4
cactcttgcc tacgccaa 18
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcttgccta cgccact 17
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 6
actcttgcct acgccacg 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 7
actcttgcct acgccaca 18
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 8
gtagttggag ctggtga 17
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 9
ctattgttgg atcatattcg tc 22
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 10
gagtgccttg acgataca 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 11
tcctgatttc tggaaaaga 19
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 12
gaagagggga agctgta 17
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 13
gaaggacagg caacttg 17
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 14
agaggcgtac agggatag 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 15
cagactcccc atcccaag 18
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 16
agcctggata gcaacgtaca tg 22

Claims (9)

1.一种人类KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，含有针对KRAS基因突变位置的PNA肽核酸修饰的特异探针。
2.根据权利要求1所述人类KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述肽核酸修饰的探针核苷酸序列为5'-GAGCTGGTGGCGTAG-3'SEQ ID NO.1。
3.根据权利要求1所述人类KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测KRAS基因7种突变的7对特异性引物和1种特异性探针，7对特异性引物是由7种ARMS引物及1种通用下游引物组成；所述引物探针序列如下：
ARMS引物1：5'-ACTCTTGCCTACGCCAT-3'SEQ ID NO.2
ARMS引物2：5'-ACTCTTGCCTACGCCAG-3'SEQ ID NO.3
ARMS引物3：5'-CACTCTTGCCTACGCCAA-3'SEQ ID NO.4
ARMS引物4：5'-CTCTTGCCTACGCCACT-3'SEQ ID NO.5
ARMS引物5：5'-ACTCTTGCCTACGCCACG-3'SEQ ID NO.6
ARMS引物6：5'-ACTCTTGCCTACGCCACA-3'SEQ ID NO.7
ARMS引物7：5'-GTAGTTGGAGCTGGTGA-3'SEQ ID NO.8
通用下游引物：5'-CTATTGTTGGATCATATTCGTC-3'SEQ ID NO.9
特异性探针：FAM-5'-GAGTGCCTTGACGATACA-3'-NFQ-MGB SEQ ID NO.10。
4.根据权利要求1所述人类KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括外控系统及内控系统，所述外控系统为一对外控引物和相应的外控探针，所述内控系统为一对内控引物和相应的内控探针，具体序列如下：
外控引物：
正向引物F：5'-TCCTGATTTCTGGAAAAGA-3'SEQ ID NO.11
反向引物R：5'-GAAGAGGGGAAGCTGTA-3'SEQ ID NO.12
外控探针：FAM-5'-GAAGGACAGGCAACTTG-3'-NFQ-MGB SEQ ID NO.13
内控引物：
正向引物F：5'-AGAGGCGTACAGGGATAG-3'SEQ ID NO.14
反向引物R：5'-CAGACTCCCCATCCCAAG-3'SEQ ID NO.15
内控探针：VIC-5'-AGCCTGGATAGCAACGTACATG-3'-NFQ-MGB SEQ ID NO.16。
5.根据权利要求1所述人类KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品及空白对照，所述阳性质控品为含有KRAS基因G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、G13D突变序列的质粒；所述空白对照为TE缓冲液。
6.根据权利要求1所述人类KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括酶溶液。
7.根据权利要求1所述人类KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的酶溶液中含有UNG酶。
8.权利要求1-7任一项所述人类KRAS基因突变检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)设计KRAS基因突变引物探针及针对KRAS基因突变位置的PNA肽核酸修饰的特异探针，制备试剂盒；
(2)取7支突变检测管及1支质控管，分别加入步骤(1)中的PCR反应液；
(3)提取待测样本中的DNA模板，分别加入步骤(2)中所述的突变检测管及质控管中，进行荧光定量PCR扩增反应；
(4)根据扩增曲线判读Ct值并计算ΔCt，依据参考范围，判定该检测区域是否发生突变。
9.根据权利要求8所述人类KRAS基因突变检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR条件为：50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃60s，40个循环；37℃2min。
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