CN106520931B - Egfr基因突变检测引物探针及其试剂盒 - Google Patents

Egfr基因突变检测引物探针及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种EGFR基因突变检测引物探针及其试剂盒，试剂盒包括用于配制数字PCR反应液的数字PCR预混液、液滴稳定剂和引物探针混合液；引物探针混合液中包括用于检测19外显子E19‑Dels位点的上游引物a、下游引物a、缺失探针a和检测探针a，用于检测20外显子T790M位点的突变上游引物b、突变探针b、野生上游引物b、野生探针b、通用下游引物b，以及用于检测21外显子L858R位点的突变上游引物c、突变探针c、野生上游引物c、野生探针c、通用下游引物c。本发明的EGFR基因突变检测试剂盒可以快速、便捷、准确地检测非小细胞肺癌患者EGFR基因突变情况。

Description

EGFR基因突变检测引物探针及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测EGFR基因突变的引物、探针和检测产品，属于生物技术领域。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制物(TKIs)吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼等证明对具有EGFR激活突变的晚期非小细胞肺癌患者具有显著疗效，EGFR-TKI成为非小细胞肺癌治疗的里程碑。但是几乎所有初始对EGFR-TKI反应良好的患者会在6-12个月内出现耐药、疾病进展，称为“获得性耐药”。许多研究已经证实EGFR的突变状态决定了肿瘤对EGFR-TKI的反应。因此治疗前进行EGFR突变检测筛选具备EGFR-TKIs治疗指征的患者，治疗中持续检测突变状态的变化，及时发现耐药突变改变治疗策略，对于EGFR-TKI的个体化治疗及预测预后有重要意义。
表皮生长因子受体(EGFR)是一种对肿瘤细胞的繁殖、生长、修复和存活等起重要作用的膜蛋白。目前临床使用最为成功的晚期肺癌靶向治疗药物是吉非替尼，主要通过抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，从而抑制肿瘤细胞的生长。EGFR的突变不同，病人对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的敏感程度不同，19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R最为敏感。
目前，EGFR基因突变最常见的来源是肿瘤的病例组织或细胞学标本，但是组织取材是有创伤的操作，有时难以实施，且这些操作受肿瘤大小、部位、患者等一般情况对的影响，有时不能取得满意的组织或者组织太少不能进行基因检测。随着疾病的研究进展，EGFR-TKIs耐药的出现，常常需要再次进行生物学检测，而组织取材为有创操作不能便捷、反复进行。近些年血浆游离DNA(cfDNA)被认为是一种可能代替肿瘤组织用来检测肿瘤特异性改变的样本。肿瘤组织、肿瘤细胞坏死及脱落的肿瘤细胞进入血液后凋亡释放游离DNA进入外周血。目前研究表明血清/血浆/血浆中的游离DNA可以用于EGFR基因的检测，cfDNA用于肿瘤突变检测的优势在于：操作无创；在疾病的任一进程中均可获取；可以作为一种肿瘤标志物，实现实时监测和动态检测；克服肿瘤组织的特异性。
探索患者EGFR-TKI耐药机制及预测预后成为一条可行的途径，但是由于大多数人血清/血浆中cfDNA含量低，且cfDNA片段相对小等原因，目前对EGFR的临床检测主要是测序法和ARMS法，并不适用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以快速、便捷、准确地检测EGFR基因突变的EGFR基因突变检测引物探针及其试剂盒。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种EGFR基因突变检测引物探针，：包括用于检测19外显子E19-Dels位点的上游引物a、下游引物a、缺失探针a和检测探针a,用于检测20外显子T790M位点的突变上游引物b、突变探针b、野生上游引物b、野生探针b、通用下游引物b，以及用于检测21外显子L858R位点的突变上游引物c、突变探针c、野生上游引物c、野生探针c、通用下游引物c；
所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述缺失探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述检测探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述突变上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述突变探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述野生上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述野生探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述通用下游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
所述突变上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，所述突变探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，所述野生上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，所述野生探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，所述通用下游引物c的核苷酸序列如SEQ IDNo.14所示；
所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端设有一种报告荧光基团，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端设有另一种报告荧光基团，所述缺失探针a、检测探针a、突变探针b、野生探针b、突变探针c和野生探针c的3’端设有淬灭荧光基团；
所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～1.5μM/L，所述通用下游引物在反应体系中的终浓度为1μM/L～3μM/L；
所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～0.19μM/L，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c在反应体系中的终浓度为0.2μM/L～0.5μM/L。
上述缺失探针a在反应体系中的终浓度为0.14μM/L，所述突变探针b在反应体系中的终浓度为0.16μM/L，所述突变探针c在反应体系中的终浓度为0.19μM/L；所述检测探针a在反应体系中的终浓度为0.2μM/L，所述野生探针b在反应体系中的终浓度为0.2μM/L，所述野生探针c在反应体系中的终浓度为0.22μM/L。
上述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.9μM/L～1.5μM/L，所述下游引物a在反应体系中的终浓度为0.9μM/L～1μM/L，所述通用下游引物b和通用下游引物c在反应体系中的终浓度为1.9μM/L～2μM/L。
上述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端的报告荧光基团是FAM，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端的报告荧光基团是HEX、VIC、TET或Cy3，所述淬灭荧光基团是BHQ1或MGB。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述的引物探针的EGFR基因突变检测产品。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种EGFR基因突变检测试剂盒，包括用于配制数字PCR反应液的数字PCR预混液、液滴稳定剂和引物探针混合液；
所述引物探针混合液中包括用于检测19外显子E19-Dels位点的上游引物a、下游引物a、缺失探针a和检测探针a,用于检测20外显子T790M位点的突变上游引物b、突变探针b、野生上游引物b、野生探针b、通用下游引物b，以及用于检测21外显子L858R位点的突变上游引物c、突变探针c、野生上游引物c、野生探针c、通用下游引物c；
所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述缺失探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述检测探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述突变上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述突变探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述野生上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述野生探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述通用下游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
所述突变上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，所述突变探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，所述野生上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，所述野生探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，所述通用下游引物c的核苷酸序列如SEQ IDNo.14所示；
所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端设有一种报告荧光基团，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端设有另一种报告荧光基团，所述缺失探针a、检测探针a、突变探针b、野生探针b、突变探针c和野生探针的3’端设有淬灭荧光基团；
所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～1.5μM/L，所述通用下游引物在反应体系中的终浓度为1μM/L～3μM/L；
所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～0.19μM/L，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c在反应体系中的终浓度为0.2μM/L～0.5μM/L。
上述缺失探针a在反应体系中的终浓度为0.14μM/L，所述突变探针b在反应体系中的终浓度为0.16μM/L，所述突变探针c在反应体系中的终浓度为0.19μM/L；所述检测探针a在反应体系中的终浓度为0.2μM/L，所述野生探针b在反应体系中的终浓度为0.2μM/L，所述野生探针c在反应体系中的终浓度为0.22μM/L；所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.9μM/L～1.5μM/L，所述下游引物a在反应体系中的终浓度为0.9μM/L～1μM/L，所述通用下游引物b和通用下游引物c在反应体系中的终浓度为1.9μM/L～2μM/L。
上述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端的报告荧光基团是FAM，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端的报告荧光基团是HEX、VIC、TET或Cy3，所述淬灭荧光基团是BHQ1或MGB。
上述数字PCR预混液中包括DNA聚合酶、超纯水、dNTPs混合液、参比荧光ROX和缓冲液；所述液滴稳定剂中包括矿物油。
上述EGFR基因突变检测试剂盒反应时，反应体系中包括数字PCR预混液10体积，引物探针混合液2体积，液滴稳定剂2体积，模板1体积，灭菌超纯水5体积，所述模板的使用浓度为0.1ng/ul～1ng/ul。
本发明具有积极的效果：
(1)本发明的EGFR基因突变检测试剂盒采用多重探针数字PCR技术，能够同时检测19外显子E19-Dels缺失突变、20外显子T790M突变和位于21外显子L858R突变，并且可以计算出EGFR基因突变率。本发明对对引物探针进行了优化设计，针对不同的突变分别使用不同的荧光素标记的探针，检测时带不同荧光的液滴将被相应识别出来，分别被计数。在保证荧光信号强度与探针浓度成正比的前提下，调整荧光素的浓度以及调整两种荧光素混合的配比，可以一次同时3种突变。本发明解决了样本中cfDNA含量低、样本量少的问题，具有更好的组内稳定性，能够更好地用于疾病的无创检测。
(2)本发明的EGFR基因突变检测试剂盒与一般的定量相比，不用设置标准品，也不需要设置质控品，一般的检测技术是定性检测，突变含量为1/100时可检出突变，当突变样本含量为1/1000和1/2500时均无法检出突变，本发明的技术可以达到真正意义上的绝对定量，检测出低至1个拷贝数模板量，克服了qPCR不具有精确定量的缺点。
(3)本发明的EGFR基因突变检测试剂盒对样本溶液采用微滴化处理，减少背景干扰，根据荧光类型、荧光微滴个数结果，能够直接判读拷贝数，操作简化，降低检测成本，以前的检测技术方法的灵敏度一般在1％～50％之间，而本发明的实验方法的灵敏度可以达到0.001％，检测样本中EGFR基因野生型和突变型的绝对量和比例。
(4)本发明的EGFR基因突变检测试剂盒使用数字PCR技术检测EGFR基因突变，提供了一种无创、快捷、定量动态检测非小细胞肺癌患者EGFR基因突变情况的方法，可以检测EGFR基因突变的突变率变化，对非小细胞肺癌的治疗和预后具有重要的指导意义。
附图说明
图1为用本发明的试剂盒对阳性对照进行检测的结果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
本发明的序列均来自NCBI,根据NCBI数据库公布的人类表皮生长因子受体EGFR基因野生型基序列和突变基因序列，设计高特异性引物和多条特异性探针，见表2。DNA来源可以是血清/血浆、血浆、外周血、口腔黏膜等。
一、试剂盒的组成。
本实施例的EGFR基因突变检测试剂盒，包括数字PCR预混液、液滴稳定剂、引物探针混合液和阳性对照。试剂盒各成分如表1所示。
表1试剂盒成分表
成分 分装 试剂公司
数字PCR预混液 1管 Life technologies
液滴稳定剂 1管 Raindance technologies
引物探针混合液 1管 百力格
阳性对照 1管 ——
上述表1中试剂盒组分的说明如下：
1)数字PCR预混液的主要成分包括DNA聚合酶、超纯水、dNTPs混合液、参比荧光ROX、缓冲液等(由Life technologies公司提供，货号：1508099)。
2)液滴稳定剂的主要成分是矿物油，(由Raindance technologies公司提供，货号：30-00826)，主要作用是微滴化处理过程将反应体系形成油包水小液滴。
3)引物探针混合液包括检测19外显子E19-dels位点的上游引物a、下游引物a、缺失探针a和检测探针a，检测20外显子L858R位点的突变上游引物b、野生下游引物b、通用下游引物b、突变探针b、野生探针b，以及检测21外显子T790M位点的突变上游引物c、野生上游引物c、通用下游引物c、突变探针c和野生探针c。引物探针的核苷酸序列如表2所示。
表2引物和探针序列表
探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。探针的5’端标记的荧光报告基团是FAM或VIC，探针的3’端标记的淬灭基团是BHQ1。
19外显子E19-dels位点缺失突变，主要发生746-753位氨基酸不同程度的缺失突变，设计的是针对缺失区域的缺失探针a和针对缺失区域外的检测探针a。缺失探针a的5’端标记的是FAM，检测探针a的5’端标记的是VIC。当模板(DNA模板)发生缺失突变时，检测探针a有VIC荧光信号，缺失探针a没有FAM荧光信号；当模板未发生突变时，检测探针a有VIC荧光信号，缺失探针a有FAM荧光信号。
20外显子T790M位点突变，设计的是突变探针b和野生探针b。突变探针b的5’端标记的是FAM，野生探针b的5’端标记的是VIC。当模板发生突变时，突变探针b与20号外显子突变模板互补产生FAM荧光信号；当模板为未发生突变时，野生探针b与20号外显子野生模板互补产生VIC荧光信号。
21外显子L858R位点突变，设计的是突变探针c和野生探针c。突变探针c的5’端标记的是FAM，野生探针c的5’端标记的是VIC。当模板发生突变时，突变探针c与21号外显子突变模板互补产生FAM荧光信号；当模板为未发生突变时，野生探针c与21号外显子野生模板互补产生VIC荧光信号。
探针在引物扩增片段内设计，所述探针的相关参数为：Tm值60.0℃～80.0℃，GC含量45.0％～65.0％，上游引物是与下游引物配对的相关参数达到最佳的一段序列，为提高特异性，可在所述特异性上游引物的3’末端第2、或第3个碱基或第4个碱基处再引入一个错配碱基。当所述模板发生突变时，引物和探针的3’末端碱基可与突变碱基互补配对产生荧光信号；当模板为未发生突变，引物和探针3’末端由于碱基不配对，不能产生荧光信号。
探针引物干粉由百力格合成，母液由干粉加入灭菌超纯水稀释而成，引物和探针混合液均由母液加入灭菌超纯水稀释而成。
本发明优化实验条件使得引物探针使用浓度组合效果最佳，上述引物和探针是对EGFR 19外显子、20外显子、21外显子设计优化的，尤其是针对数字PCR平台的检测。
在数字PCR反应体系中，19外显子的上游引物a、下游引物a的使用浓度为1μM/L～15μM/L，最终反应体系中的浓度为0.1μM/L～1.5μM/L，优选地，19外显子上游引物a、下游引物a在最终反应体系中的浓度为0.9μM/L。19外显子缺失探针a的使用浓度为1μM/L～5μM/L，在最终反应体系中的浓度为0.1μM/L～0.5μM/L，优选地，19外显子缺失探针a在最终反应体系中的浓度为0.14μM/L。19外显子检测探针a的使用浓度为1μM/L～5μM/L，在最终反应体系中的浓度为0.1μM/L～0.5μM/L，优选地，19外显子检测探针a在最终反应体系中的浓度为0.2μM/L。
20号外显子突变上游引物b和野生上游引物b的使用浓度为1μM/L～15μM/L，在最终反应体系中的浓度为0.1μM/L～1.5μM/L，优选地，20号外显子突变上游引物b和野生上游引物b在最终反应体系中的浓度为1μM/L。20号外显子通用下游引物b的使用浓度为10μM/L～30μM/L，在最终反应体系中浓度为1μM/L～3μM/L，优选地，20号外显子通用下游引物b在最终反应体系中的浓度为2μM/L。20号外显子突变探针b的使用浓度为1μM/L～5μM/L，在最终反应体系中的浓度为0.1μM/L～0.5μM/L，优选地，20号外显子突变探针b在反应体系中的最终浓度为0.16μM/L。20号外显子野生探针b的使用浓度为1μM/L～5μM/L，在最终反应体系中的浓度为0.1μM/L～0.5μM/L，优选地，20号外显子野生探针b在反应体系中的最终浓度为0.2μM/L。
21号外显子突变上游引物c和野生上游引物c的使用浓度为1μM/L～15μM/L，在最终反应体系中的浓度为0.1μM/L～1.5μM/L，优选地，21号外显子突变上游引物c和野生上游引物c在最终反应体系中的浓度为0.9μM/L。21号外显子通用下游引物c的使用浓度为10μM/L～30μM/L，在最终反应体系中浓度为1μM/L～3μM/L，优选地，21号外显子通用下游引物c在最终反应体系中的浓度为1.9μM/L。21号外显子突变探针c的使用浓度为1μM/L～5μM/L，在最终反应体系中的浓度为0.1μM/L～0.5μM/L，优选地，21号外显子突变探针c在反应体系中的最终浓度为0.19μM/L，21号外显子野生探针c的使用浓度为1μM/L～5μM/L，在最终反应体系中的浓度为0.1μM/L～0.5μM/L，优选地，21号外显子野生探针c在反应体系中的最终浓度为0.22μM/L。
4)阳性对照来源于携带EGFR基因突变的阳性细胞株(H1975：T790M和L858R；H1650：E746-A750)，突变型与野生型EGFR基因的DNA按照比例为1:100。
二、试剂盒的使用方法。
本实施例的EGFR基因突变检测试剂盒的具体检测步骤如下：
1、DNA提取
采集非小细胞肺癌患者的血清/血浆样本5ml，高速离心，分离上清，得到血清/血浆。用德国Qiagen公司提供的血清/血浆总DNA提取试剂盒(货号：55114)，按照试剂盒操作说明书抽提患者血清/血浆中的游离DNA。获得血清/血浆样本游离DNA后，通过Thermo-Fisher公司3.0核酸蛋白荧光定量仪，测定血清/血浆样本游离DNA浓度和纯度，控制样本质量。
2、数字PCR反应液制备
根据表3中的PCR反应体系，取试剂盒中20μl的数字PCR预混液、4μl的引物探针混合液，加入2ul的模板、4μl的液滴稳定剂，加入灭菌超纯水补至40μl，制得数字PCR反应反应液。模板是指血清/血浆样本稀释后的样本DNA、阳性对照或阴性对照，样本DNA稀释后的浓度为0.1ng/ul～1ng/ul，阴性对照为高压灭菌水。
表3 PCR反应体系表
反应成分 加入浓度 加入体积
数字PCR预混液 2× 20ul
引物探针混合液 --- 4ul
液滴稳定剂 10× 4ul
模板 0.1ng/ul～1ng/ul 2ul
ddH2O to 40ul
3、PCR反应微滴制备
将微滴发生板放入8通道微滴生成器中，用Raindance公司生产的微滴生成器RainDrop Source对样本进行微滴化处理，将数字PCR混合液制作成PCR微反应液滴，形成500～800万个油包水液滴。本实验的反应体系通过微滴发生器形成上百万个皮升级大小的油包水小液滴后再进行PCR反应，每个微滴中会含有1个或者不含目的基因的模板。
4、PCR扩增
采用博日公司的PCR扩增仪对生成的微滴进行PCR扩增，扩增的反应程序如表4所示。
表4 PCR反应程序表
优选地，数字PCR扩增的条件为：预变性阶段的条件95℃，10min；循环1，40个循环，条件为95℃15s，58℃15s，60℃45s；循环2条件为98℃10min；循环3条件为12℃30min。
5、微滴检测
PCR反应结束后，将8联管置于微滴分析仪中，用Raindance公司生产的微滴分析仪RainDrop Sense对每个微滴逐个检测，含有荧光信号的微滴标记为1，不含荧光信号标记为0，再对微滴计数，软件自动分析，通过泊松分布公式计算突变型和野生型模板的拷贝数(液滴数)。
泊松分布公式如下：
6、PCR结果判定
对PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号判断待测样品中EGFR基因19外显子的E19-dels位点是否缺失，20外显子的T790M位点和21外显子的L858R位点是否突变，并且可以统计缺失或突变的模板数量及含量。
对于19外显子的E19-dels位点，FAM信号微滴数是非缺失型模板的拷贝数，VIC信号通道是非缺失型模板和缺失型模板的拷贝数之和。
对于20外显子的T790M位点，FAM信号微滴数是突变型模板的拷贝数，VIC信号微滴数是野生型模板的拷贝数。
对于21外显子的L858R位点，FAM信号微滴数是突变型模板的拷贝数，VIC信号微滴数是野生型模板的拷贝数。
7、突变率计算
19外显子的E19-dels位点缺失突变率(ME19-Dels)的计算公式如下：
ME19-Dels＝(SVIC19-SFAM19)/SVIC*100％。
其中，SVIC19为非缺失型模板和缺失型模板的拷贝数之和，SFAM19为非缺失型模板的拷贝数。
20外显子的T790M位点突变率(MT790M)的计算公式如下：
MT790M＝SFAM20/(SVIC20+SFAM20)*100％。
其中，SFAM20为20外显子的T790M位点为突变型时模板的拷贝数，SVIC20为20外显子的T790M位点为野生型时模板的拷贝数。
21外显子的L858R位点突变率(ML858R)的计算公式如下：
ML858R＝SFAM21/(SVIC21+SFAM21)*100％。
其中，SFAM21为21外显子的L858R位点为突变型时模板的拷贝数，SVIC21为21外显子的L858R位点为野生型时模板的拷贝数。
根据公式和实验结果计算出突变率，根据EGFR基因突变率的变化趋势可以间接作为非小细胞肺癌患者临床病情变化趋势的一种指导。
采用本实施例的EGFR基因突变检测试剂盒检测阳性对照，通过用Raindance公司的微滴分析仪RainDrop Sense对每个微滴逐个检测，对微滴计数，软件自动分析，通过泊松分布公式计算，得到的检测结果图如图1所示。
19-Dels-WT圈中是19外显子的E19-dels位点缺失型和非缺失型模板目的片段的液滴数之和，19-Dels-Mut是19外显子的E19-dels位点非缺失型模板目的片段的液滴数。T790M-WT圈中是20外显子的T790M位点野生型模板目的片段的液滴数，T790M-Mut圈中是20外显子的T790M位点突变型模板目的片段的液滴数。L858R-WT圈中是21外显子的L858R位点野生型模板目的片段的液滴数，L858R-Mut圈中是21外显子的L858R位点突变型模板目的片段的液滴数。empty droplets圈中是不包括以上目的片段的液滴数。可以明显看到各目的片段的区域界线清晰，仅通过一次反应即可统计出肺癌患者的样本的突变情况，并准确计算出突变率，有助于非小细胞肺癌患者后期治疗方案的确定。
三、试剂盒灵敏度和特异性
突变质粒的构建：用表2中的相应的引物，扩增包含相应缺失型和突变型样本的目的片段产物，构建pMD19-T载体，克隆的载体寄给上海迈浦生物科技有限公司测序验证，由该公司提供EGFR缺失和突变的重组质粒载体。质粒载体的空载体为pMD19-T载体。
野生型质粒的构建：用表2中的相应的引物，扩增含相应非缺失型和野生型样本的目的片段产物，构建入pMD19-T载体，克隆的载体寄给上海迈浦生物科技有限公司测序验证，并由该公司提供EGFR野生型的重组质粒载体。质粒载体的空载体为pMD19-T载体。
取EGFR基因19外显子的野生型和突变型质粒(约1010copies/ul)，用TE缓冲液依次逐级稀释分别得到4.0×108copies/ul，4.0×107copies/ul，4.0×106copies/ul，4.0×105copies/ul，4.0×104copies/ul，4.0×103copies/ul模板，配制成突变等位基因/野生等位基因分别为0.01、0.001、0.0001、0.00001的4.0×104野生型质粒和4.0×104突变型质粒的模板。
取EGFR 20外显子的野生型和突变型质粒(约1010copies/ul)，用TE缓冲液依次逐级稀释分别得到2.0×108copies/ul，2.0×107copies/ul，2.0×106copies/ul，2.0×105copies/ul，2.0×104copies/ul，2.0×103copies/ul模板，配成突变等位基因/野生等位基因分别为0.01、0.001、0.0001、0.00001的2.0×104野生型质粒和2.0×104突变型质粒的模板。
取EGFR 21外显子的野生型和突变型质粒(约1010copies/ul)，用TE缓冲液依次逐级稀释分别得到3.0×108copies/ul，3.0×107copies/ul，3.0×106copies/ul，3.0×105copies/ul，3.0×104copies/ul，3.0×103copies/ul模板，配成突变等位基因/野生等位基因分别为0.01、0.001、0.0001、0.00001的3.0×104野生型质粒和3.0×104突变型质粒的模板。
以上述构建成功的不同比例EGFR基因突变型质粒和野生型质粒的模板为检测样本，采用本实施例的EGFR基因突变检测试剂盒进行检测，根据实验结果得出该反应体系检测的灵敏度如下：
(1)19外显子的E19-dels位点灵敏度
0.01/1质粒突变/总拷贝数＝452/39136 0.011549 误差 0.001549％
0.001/1质粒突变/总拷贝数＝41/39842 0.001029 误差 0.000029％
0.0001/1质粒突变/总拷贝数＝5/40547 0.000123 误差 0.000023％
(2)20外显子的T790M位点灵敏度
0.01/1质粒突变/总拷贝数＝208/18952 0.010975 误差 0.000975％
0.001/1质粒突变/总拷贝数＝23/19842 0.001159 误差 0.000159％
0.0001/1质粒突变/总拷贝数＝3/20529 0.000146 误差 0.000046％
0.00001/1质粒突变/总拷贝数＝0/19861 0.000000 误差 0.000000％
(3)21外显子的L858R位点灵敏度
0.01/1质粒突变/总拷贝数＝308/29736 0.010358 误差 0.000358％
0.001/1质粒突变/总拷贝数＝29/29099 0.000997 误差 0.000003％
0.0001/1质粒突变/总拷贝数＝3/30036 0.000099 误差 0.000001％
0.00001/1质粒突变/总拷贝数＝0/30081 0.000000 误差 0.000000％
以上检测数据显示，纯野生型质粒模板与纯突变型质粒模板检测结果与总拷贝数结果基本一致，RainDance数字PCR仪对本发明试剂盒中检测E19-Dels、L858R及T790M检测的灵敏度可达0.01％。
四、应用例
取10例非小细胞肺癌患者的血清/血浆标本，这10名患者已经采用扩增受阻突变系统对的组织标本进行EGFR基因突变检测，并且已经获得明确的突变检测结果，这些组织标本分别含有E19-dels、L858R、T790M突变的一种或两种，或者不包括本发明检测的EGFR基因突变位点。采用本实施例的EGFR基因突变检测试剂盒进行检测，检测结果为：10例标本中2例样本为E19-Dels阳性，1例标本为L858R阳性，4例标本为T790M阳性，检测结果与组织样本采用金标准(ARMS法)对比，组织与血清/血浆基因突变检测总的一致性为100％。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海赛安生物医药科技有限公司
<120> EGFR基因突变检测引物探针及其试剂盒
<130> 无
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ctctgtcata gggactctg 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cacacagcaa agcagaaac 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
agatgttgct tctcttaatt cct 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ctagggtctt ccactctttc a 21
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
caccgtgcag ctcatctt 18
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gcagccgaag ggcatgagct gaa 23
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
caccgtgcag ctcattac 18
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gcagccgaag ggcatgagct gtg 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gcacacacca gttgagcagg 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
gtcaagatca cagattttgg gag 23
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
cgcacccagc agtttgcac 19
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
gtcaagatca cagattttga ct 22
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
cgcacccagc agtttgcga 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
tgtcaggaaa atgctggct 19

Claims (10)

1.一种EGFR基因突变检测引物探针，其特征在于：包括用于检测19外显子E19-Dels位点的上游引物a、下游引物a、缺失探针a和检测探针a，用于检测20外显子T790M位点的突变上游引物b、突变探针b、野生上游引物b、野生探针b、通用下游引物b，以及用于检测21外显子L858R位点的突变上游引物c、突变探针c、野生上游引物c、野生探针c、通用下游引物c；
所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物a的核苷酸序列如SEQID No.2所示，所述缺失探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述检测探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述突变上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述突变探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述野生上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述野生探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述通用下游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
所述突变上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，所述突变探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，所述野生上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，所述野生探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，所述通用下游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端设有一种报告荧光基团，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端设有另一种报告荧光基团，所述缺失探针a、检测探针a、突变探针b、野生探针b、突变探针c和野生探针c的3’端设有淬灭荧光基团；
所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～1.5μM/L，所述通用下游引物在反应体系中的终浓度为1μM/L～3μM/L；
所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～0.19μM/L，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c在反应体系中的终浓度为0.2μM/L～0.5μM/L。
2.根据权利要求1所述的EGFR基因突变检测引物探针，其特征在于：所述缺失探针a在反应体系中的终浓度为0.14μM/L，所述突变探针b在反应体系中的终浓度为0.16μM/L，所述突变探针c在反应体系中的终浓度为0.19μM/L；所述检测探针a在反应体系中的终浓度为0.2μM/L，所述野生探针b在反应体系中的终浓度为0.2μM/L，所述野生探针c在反应体系中的终浓度为0.22μM/L。
3.根据权利要求1所述的EGFR基因突变检测引物探针，其特征在于：所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.9μM/L～1.5μM/L，所述下游引物a在反应体系中的终浓度为0.9μM/L～1μM/L，所述通用下游引物b和通用下游引物c在反应体系中的终浓度为1.9μM/L～2μM/L。
4.根据权利要求1所述的EGFR基因突变检测引物探针，其特征在于：所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端的报告荧光基团是FAM，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端的报告荧光基团是HEX 、VIC、TET或Cy3，所述淬灭荧光基团是BHQ1或MGB。
5.一种采用如权利要求1所述的引物探针的EGFR基因突变检测产品。
6.一种EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于：包括用于配制数字PCR反应液的数字PCR预混液、液滴稳定剂和引物探针混合液；
所述引物探针混合液中包括用于检测19外显子E19-Dels位点的上游引物a、下游引物a、缺失探针a和检测探针a，用于检测20外显子T790M位点的突变上游引物b、突变探针b、野生上游引物b、野生探针b、通用下游引物b，以及用于检测21外显子L858R位点的突变上游引物c、突变探针c、野生上游引物c、野生探针c、通用下游引物c；
所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物a的核苷酸序列如SEQID No.2所示，所述缺失探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述检测探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述突变上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述突变探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述野生上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述野生探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述通用下游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
所述突变上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，所述突变探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，所述野生上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，所述野生探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，所述通用下游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端设有一种报告荧光基团，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端设有另一种报告荧光基团，所述缺失探针a、检测探针a、突变探针b、野生探针b、突变探针c和野生探针c的3’端设有淬灭荧光基团；
所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～1.5μM/L，所述通用下游引物在反应体系中的终浓度为1μM/L～3μM/L；
所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c在反应体系中的终浓度为0.1μM/L～0.19μM/L，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c在反应体系中的终浓度为0.2μM/L～0.5μM/L。
7.根据权利要求6所述的EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于：所述缺失探针a在反应体系中的终浓度为0.14μM/L，所述突变探针b在反应体系中的终浓度为0.16μM/L，所述突变探针c在反应体系中的终浓度为0.19μM/L；所述检测探针a在反应体系中的终浓度为0.2μM/L，所述野生探针b在反应体系中的终浓度为0.2μM/L，所述野生探针c在反应体系中的终浓度为0.22μM/L；所述各上游引物在反应体系中的终浓度为0.9μM/L～1.5μM/L，所述下游引物a在反应体系中的终浓度为0.9μM/L～1μM/L，所述通用下游引物b和通用下游引物c在反应体系中的终浓度为1.9μM/L～2μM/L。
8.根据权利要求6所述的EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于：所述缺失探针a、突变探针b和突变探针c的5’端的报告荧光基团是FAM，所述检测探针a、野生探针b和野生探针c的5’端的报告荧光基团是HEX 、VIC、TET或Cy3，所述淬灭荧光基团是BHQ1或MGB。
9.根据权利要求6所述的EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于：所述数字PCR预混液中包括DNA聚合酶、超纯水、dNTPs混合液、参比荧光ROX和缓冲液；所述液滴稳定剂中包括矿物油。
10.根据权利要求6所述的EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于：反应时，反应体系中包括数字PCR预混液10体积，引物探针混合液2体积，液滴稳定剂2体积，模板1体积，灭菌超纯水5体积，所述模板的使用浓度为0.1ng/ul～1ng/ul。
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