CN109880904A - 外周血浆中egfr基因外显子19缺失突变的检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
外周血浆中EGFR基因外显子19缺失突变的检测方法及应用，根据EGFR基因序列，设置包括上游引物和下游引物扩增引物一对，根据EXON19DEL(COSM6223、COSM6225、COSM12728、COSM6218、COSM6254、COSM6255、COSM12382、COSM12369)突变序列，设置检测野生型序列的探针和检测突变型序列的探针。进行病人组织、血液等样本的检测；采用Taqman‑ddPCR法，仅需无创方式获得外周血即可检测EXON19DEL突变，高灵敏度、强特异性特征，经验证灵敏度最高可达到0.0625％，即实现极低浓度突变核酸的检出(0.0625％)。
Description
技术领域
本发明属于医学和生物技术领域，涉及IPC分类C12Q包含酶或微生物的测定或检验方法，可用于指导肿瘤用药技术，尤其是外周血浆中EGFR基因外显子19缺失突变的检测方法及应用。
背景技术
医学和生物技术领域中，基因或引物的测定采用含化学指示剂的组合物用于试验技术；中国专利对此公开有限。
目前，江西海普洛斯生物科技有限公司提出的中国专利申请201810330420提供了一种检测PIK3CA基因E545K的引物探针组合物及其检测方法，所述引物探针组合物包括针对PIK3CA基因E545K位点的特异性引物SEQ ID NO.1-2、针对PIK3CA基因E545K位点的突变型探针SEQ ID NO.3和针对PIK3CA基因E545K位点的野生型探针SEQ ID NO.4，通过针对E545K位点特定区域进行设计引物并修饰探针，二者相互匹配，并将ddPCR与高特异性的引物探针组合物相结合，对cfDNA的提取、PCR循环数和退火温度进行优化，各步骤协同增效，最终提高了检测的精确度、稳定性和灵敏度，具有广阔的应用前景和市场价值。
又如，上海张江转化医学研发中心有限公司、上海宝藤生物医药科技股份有限公司和上海宝藤医学检验所有限公司提出的中国专利申请201510017009.8提供了一ddPCR技术监测肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂继发耐药的方法，及其在监控酪氨酸激酶抑制剂治疗肺癌过程中的应用。首先对肺癌患者外周血浆进行DNA抽提，再利用ddPCR技术检测其中EGFR的耐药突变位点T790M的突变情况，并以此判定该患者是否产生耐药。
对于发生EGFR突变的晚期非小细胞肺癌患者，应用表皮生长因子受体-酪氨酸抑制剂(EGFR-TKIs)类靶向药物治疗非常有效，例如吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、阿法特罗(afatinib)、达沙替尼(dasatinib)和奥希替尼(osimertinib)。因此，非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识，检测EGFR基因是否突变成为肺癌病人是否使用EGFR靶向药物的前提条件。尽管肿瘤组织和肿瘤细胞学样本是EGFR突变检测的最佳样本，但此类样本获取难度大。
检测血浆中的游离核酸(Circulating free DNA,简称“cfDNA”),又称“液体活检”，避免了获取肿瘤组织的活检，有益于临床上诊断应用。比如，使用液体活检后，重复采血成为可能，从而，易于实现在肿瘤发生过程中，或者，癌症治疗期间追踪cfDNA的变化，进而有效监控病情变化，但是，应用cfDNA检测准确并特异地检测EGFR突变目前存在巨大的技术挑战。首先，EGFR检测方法灵敏度存疑。血液中的cfDNA含量因人而异，而且大部分情况下都非常低，而其中肿瘤来源的游离核酸(Circulating tumor DNA,简称“ctDNA”)质量更是参差不齐，含量高低不一。其次，EGFR检测方法特异性有待提高。Douillard et al报道，使用血浆检测EGFR突变与肿瘤组织检测结果的符合度仅为65％。
目前，应用血浆或血清ctDNA检测EGFR突变检测方法主要包括：
(1)高分辨率熔解曲线(HRM)。HRM是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析技术。检测敏感度在1-10％左右。然而，由于染料法假阳性高，后期需要测序验证，导致检测周期较长。
(2)探针扩增阻滞突变法(ARMS-qPCR)。普世华康江苏医疗技术有限公司提出的专利号CN104099422A公开了一种检测肠癌热点基因突变位点的组合物，所述组合物包括SEQ？NO：1至SEQ NO：17的引物序列，还包括SEQ NO：18至SEQ NO：21的block序列。适合从血浆等体液中检测肠癌驱动基因的热点突变，可以实时、无创地对肠癌患者进行诊断，复发监控和疗效评估。利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，将有某种点突变的模板与正常模板区分开来，该检测方法的灵敏度高于HRM，约为1％。
(3)等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应(CAST-PCR)。普世华康江苏医疗技术有限公司提出的CN104099422A专利同样涉及的该技术。CAST-PCR通过一段特异设计的MGB探针来阻止引物与野生型DNA结合，选择性的优先扩增突变型DNA，该检测方法的灵敏度在0.1％-1％左右。Barbano R.et al应用CAST-PCR技术检测临床样本BRAF基因的V600E和V600K突变，其方法的灵敏度为1％。
总之，现有EGFR突变检测技术大都为染料法或者探针法荧光定量PCR技术，这些技术不但存在灵敏度低、准确率低、阳性判读方法复杂等缺陷，而且对于样本的类型与质量要求严苛，例如有的方法要求提供组织样本，部分方法虽然可以处理血浆/血清样本，但却要求样本来自肿瘤三期或者四期病人。对于肿瘤血浆/血清等样本，由于存在核酸含量少、目标突变比例极低等难点，传统方法无法准确检测其EGFR突变。
发明内容
本发明的目的是提供外周血浆中EGFR基因外显子19缺失突变的检测方法及应用，非创伤性在血液中高特异性高灵敏度检测，克服现有技术中EGFR基因EXON19DEL突变检测中必须以病理组织作为起始材料的缺陷，以便根据检测结果指导对于具有EGFR基因exon19del突变的肺癌患者对表皮生长因子受体-酪氨酸抑制剂(EGFR-TKIs)类靶向药物的用药。
本发明的目的将通过以下技术措施来实现：根据EGFR基因序列，设置包括上游引物和下游引物扩增引物一对，根据EXON19DEL(COSM6223、COSM6225、COSM12728、COSM6218、COSM6254、COSM6255、COSM12382、COSM12369)突变序列，设置检测野生型序列的探针和检测突变型序列的探针。采用上述引物和探针进行ddPCR，并优化出低频突变检出的最佳条件；应用该方法进行病人组织、血液等样本的检测；对EGFR EXON19DEL位点突变进行检测的方法包括以下步骤：
1)根据EGFR基因序列，设置特异性扩增外显子19引物对。根据EXON19DEL突变序列设计分别检测野生型模板和突变型模板的探针对。采用上述引物和探针，进行ddPCR，并优化出低频突变检测的最佳条件。
2)抽提样本的核酸。选择适合样本类型的方法抽提核酸，所述样本类型包括外周血细胞、外周血血浆/血清、体液、腔道的脱落物、病变组织。
特别地，对于血液样本的游离核酸抽提，步骤如下：
第一，采血管的选择。如果采用普通采血管，不能含有肝素，而且需要在4h内分离血浆，如果血液不能及时处理，需选用含血细胞稳定技术的采血管，如Streck Cell-FreeDNA Blood Collection Tube或PAXgene Blood ccfDNA Tube,本发明采用PAXgene BloodccfDNA Tube采集血液样本。
第二，血浆的分离。血浆的分离：第一步低速离心去除细胞，4℃、1900g、10min；第二步高速离心进一步去除细胞来源核酸杂质，4℃、16000g、10min。
第三，裂解。每毫升血浆加入100ul Proteinase K和0.8ml Buffer ACL，且每个样本加入1ug carrier RNA。60℃孵育30min。每毫升血浆加入1.8ml缓冲液ACB。涡旋混匀。冰浴5min。
第四，核酸吸附至硅膜。将第三步裂解液加入核酸吸附柱。
第五，清洗。分别使用缓冲液ACW1、ACW2和96-100％乙醇清洗核酸吸附柱。
第六，乙醇去除。56℃、10min挥发乙醇。
第七，洗脱。20-100ul AVE洗脱核酸。
3)ddPCR。
第一，PCR体系的配置。在试剂准备区按照下表配置PCR体系：2×ddPCR Supermixfor Probe(No dUTP)计10ul，引物1(Exon19del-F1)计1.1ul，引物2(Exon19del-R1)计1.1ul，探针1(WTp-EXON19DEL)0.55ul，探针2(MTp-EXON19DEL)计0.55ul，模板5ul，加水补齐至22ul。
第二，加模板。在样本制备区按照以下顺序加入模板：空白对照、阴性对照、弱阳性对照、阳性对照。
第三，微滴的生成。在微滴生成区，将20ul PCR反应液加入微滴生成卡的样本孔，70ul微滴生成油加至微滴生成卡的加油孔，加样结束后用密封垫密封微滴生成卡，然后置于微滴发生仪内，启动并生成微滴。用移液器小心转移微滴至effendorf 96孔PCR板，覆盖上热封膜，在热封仪内以180℃、5s参数进行热封。
第四，PCR。经过退火温度优化实验，发现56.3℃退火15s，数字PCR效果最优。按照以下程序进行PCR：95℃10min，40个循环(94℃30s，56.3℃15s，72℃15s)，98℃10min，升降温速率2℃/s。
第五，读板。提前预热Bio-rad QX200仪器。打开程序QuantaSoft，设置FAM/HEX检测通道，开始读板。根据读板结果，判断样本阳性或者阴性。
尤其是，对EGFR基因EXON19DEL位点突变进行检测的试剂盒，适用于EGFR基因第20外显子突变的检测。所述试剂盒包括PCR引物探针、反应体系、反应条件、阴性对照DNA样本、阳性对照DNA样本。具体包括以下内容：
(1)引物和探针。合成以下寡核苷酸片段和修饰寡核苷酸片段，并溶解于10uM TE。
(2)PCR试剂。DNA聚合酶使用Bio-rad 2×ddPCR Supermix(with no dNTP)。
(3)反应体系。见前述部分。
(4)反应条件。见前述部分。
(5)模板。空白对照为水，阴性对照为正常人白细胞基因组，弱阳性对照DNA样本，抽提与样本来源相同的正常材料的核酸，通过NanoDrop或者Qubit定量后，加入0.1-1％细胞系HCC827基因组，作为弱阳性对照，强阳性对照为细胞系HCC827基因组。
尤其是，肿瘤诊断的判断方法包括，检测EGFR基因EXON19DEL突变，若检测结果为阳性，则判定发生EXON19DEL突变，有可能发生肿瘤，若检测结果为阴性，则判定未发生EXON19DEL突变，在本方法检测范围内未发生肿瘤。进一步通过基因检测指导肿瘤靶向药物用药的方法。所述肿瘤包括但不限于肺癌患者。所述肿瘤靶向药物是表皮生长因子受体抑制剂(EGFR-TKIs)，包括但不限于吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、阿法特罗(afatinib)、达沙替尼(dasatinib)和奥希替尼(osimertinib)。所述指导肿瘤靶向药物用药方法具体指，使用本发明方法检测EGFR基因EXON19DEL突变，若检测结果为阳性，则判定发生EXON19DEL突变，患者建议使用EGFR-TKIs，若检测结果为阴性，则判定未发生EXON19DEL突变，建议进行EGFR其他位点突变的检测，根据检测结果进行用药指导。
尤其是，从健康人白细胞抽提基因组(以下称“tgDNA”)作为野生型模板，从中国科学院细胞库购买具有EGFR基因EXON19DEL突变的细胞系HCC827，经过细胞培养并抽提基因组(以下称“HCC827”)，基因组经nanodrop和ddPCR精确定量和突变验证后，作为突变型模板。
尤其是，ddPCR法检测EGFR基因EXON19DEL突变的方法优化。
1)引物对的筛选；根据EGFR第20外显子序列，设计5对引物对，引物合成自上海生工生物有限公司，具体序列如下。
筛选PCR体系：Taq HS聚合酶0.2ul，10×HS PCR缓冲液2ul，dNTP混合物1.6ul，引物1计1ul，引物2计1ul，DNA模板tgDNA计5ul，水补齐体系至20ul。筛选PCR程序：95℃10min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃20s)。经过PCR筛选，引物对1(Exon19del-F1/Exon19del-R1)对目的片段扩增效率最高，且不产生引物二聚体。该引物对作为EGFR基因EXON19DEL突变的检测引物对。
1)ddPCR反应程序的优化；根据EGFR基因EXON19DEL突变序列(EXON19DEL突变信息见下表)，设计分别识别野生型序列和突变型序列的两条探针WTp-EXON19DEL/MTp-EXON19DEL。结合筛选引物对和上述探针，对于ddPCR反应程序进行优化。
在试剂准备区配置以下PCR体系：2×ddPCR Supermix for Probe(No dUTP)10ul，引物1(Exon19del-F1)计1.1ul，引物2(Exon19del-R1)计1.1ul，探针1(WTp-EXON19DEL)计0.55ul，探针2(MTp-EXON19DEL)计0.55ul，模板5ul，加水补齐至22ul。
在样本制备区，按照阴性对照、阳性对照顺序加入模板；阴性对照为tgDNA，阳性对照为HCC827基因组。
在微滴生成区，将20ul PCR反应液加入微滴生成卡的样本孔，70ul微滴生成油加之至微滴生成卡的加油孔，加样结束后用密封垫密封微滴生成卡，然后，置于微滴发生仪内，启动并生成微滴。用移液器小心转移微滴至effendorf 96孔PCR板，覆盖上热封膜，在热封仪内以180℃、5s参数进行热封。
在样本分析区PCR。PCR程序为：95℃10min，40个循环{94℃30s，退火温度梯度(50℃、50.7℃、52℃、53.9℃、56.3℃、58.3℃、59.4℃、60℃)15s，72℃15s}，98℃10min，升降温速率2℃/s。提前预热Bio-rad QX200仪器。打开程序QuantaSoft，设置FAM/HEX检测通道，开始读板。
尤其是，计算HCC827和tgDNA基因组拷贝数(copies/ul)，用TE将二者均稀释至4000copies/ul。将HCC827掺入tgDNA，使得EXON19DEL突变模板比例分别为0.0625％、0.125％、0.25％、0.5％、1％，制作成梯度稀释模板。
按照以下方法验证EXON19DEL突变检测方法。验证ddPCR体系：2×ddPCR Supermixfor Probe(No dUTP)计10ul，引物1(Exon19del-F1)计1.1ul，引物2(Exon19del-R1)计1.1ul，探针1(WTp-EXON19DEL)计0.55ul，探针2(MTp-EXON19DEL)计0.55ul，模板5ul，加水补齐至22ul。
在样本制备区按照以下顺序加入模板：空白对照、阴性对照、梯度稀释模板、阳性对照。空白对照为水，阴性对照为tgDNA，梯度稀释模板为掺入0.0625％-1％突变型模板的野生型模板，阳性对照为HCC827基因组。
按照实施例1相同方法将PCR反应体系生成微滴，热封PCR板。按照优化PCR程序进行PCR：95℃10min，40个循环(94℃30s，56.3℃15s，72℃15s)，98℃10min，升降温速率2℃/s。打开Bio-rad QX200仪器，设置读板程序，开始读板。ddPCR结果见附图2，EGFR基因EXON19DEL检测方法的验证。由图可知，本检测方法在所有检测浓度(0.0625％-2％)内的线性度都非常好,即本方法的灵敏度达到0.0625％。
尤其是，ddPCR法以水或者tgDNA为模板，背景干净，无污染。此外，在野生型模板中掺入0.0625％-1％突变型模板，检测野生型模板拷贝数正常，检测突变型模板比例与理论比例相符，且呈线性相关，检测突变型模板比例即突变型模板除以总模板乘以100％；R2值为0.991。在0.0625％-1％灵敏度区间内，检测值准确，最低检测灵敏度为0.0625％。
本发明的优点和效果：采用Taqman-ddPCR法，仅需无创方式获得外周血即可检测EXON19DEL突变，指导肿瘤靶向药物使用，高灵敏度、强特异性特征，可用于肿瘤的早期诊断，与现有技术HRM、Arms-qPCR、CAST-PCR等相比，测灵敏度高，特异性强。
附图说明
图1为本发明实施例1中QuantaSoft FAM/HEX检测通道读板结果示意图。
图2为本发明实施例2中QuantaSoft FAM/HEX检测通道读板结果示意图。
图3为本发明实施例3中病例CA019经ddPCR读板结果示意图。
图4为本发明实施例3中病例CA023经ddPCR读板结果示意图。
具体实施方式
本发明原理在于，ddPCR(droplet digital PCR,数字微滴PCR)是新一代PCR技术，将一个样本分配至几万个相互独立的小微滴，每个微滴分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个微滴的荧光信号进行分析。ddPCR具有灵敏度高、无需标准曲线即可准确定量、操作简单等优点。Zhang B.et al通过对比arms-PCR和ddPCR发现，后者灵敏度可达到前者的10倍。
本发明结合新一代ddPCR技术和Taqman探针技术，将Taqman探针应用于数字PCR(Taqman-ddPCR法)，突破肿瘤早期诊断存在核酸含量低、突变序列含量极低等技术瓶颈，高灵敏度和高特异性准确检测早期血浆等难度高样本的EGFR EXON19DEL突变，不仅可以准确检测组织、体液样本，还可以处理血浆/血清等难度高的样本，经验证灵敏度最高可达到0.0625％，即实现极低浓度突变核酸的检出(0.0625％)。从而大大提高和改善该类患者的生存期和预后。
本发明，根据EGFR基因序列，设置包括上游引物和下游引物扩增引物一对，根据EXON19DEL(COSM6223、COSM6225、COSM12728、COSM6218、COSM6254、COSM6255、COSM12382、COSM12369)突变序列，设置检测野生型序列的探针和检测突变型序列的探针。采用上述引物和探针进行ddPCR，并优化出低频突变检出的最佳条件。应用该方法进行病人组织、血液等样本的检测。
本发明中，对EGFR EXON19DEL位点突变进行检测的方法包括以下步骤：
1)根据EGFR基因序列，设置特异性扩增外显子19引物对。根据EXON19DEL突变序列设计分别检测野生型模板和突变型模板的探针对。采用上述引物和探针，进行ddPCR，并优化出低频突变检测的最佳条件。
2)抽提样本的核酸。选择适合样本类型的方法抽提核酸，所述样本类型包括外周血细胞、外周血血浆/血清、体液、腔道的脱落物、病变组织。
特别地，对于血液样本的游离核酸抽提，步骤如下：
第一，采血管的选择。如果采用普通采血管，不能含有肝素，而且需要在4h内分离血浆，如果血液不能及时处理，需选用含血细胞稳定技术的采血管，如Streck Cell-FreeDNA Blood Collection Tube或PAXgene Blood ccfDNA Tube,本发明采用PAXgene BloodccfDNA Tube采集血液样本。
第二，血浆的分离。血浆的分离：第一步低速离心去除细胞，4℃、1900g、10min；第二步高速离心进一步去除细胞来源核酸杂质，4℃、16000g、10min。
第三，裂解。每毫升血浆加入100ul Proteinase K和0.8ml Buffer ACL，且每个样本加入1ug carrier RNA。60℃孵育30min。每毫升血浆加入1.8ml缓冲液ACB。涡旋混匀。冰浴5min。
第四，核酸吸附至硅膜。将第三步裂解液加入核酸吸附柱。
第五，清洗。分别使用缓冲液ACW1、ACW2和96-100％乙醇清洗核酸吸附柱。
第六，乙醇去除。56℃、10min挥发乙醇。
第七，洗脱。20-100ul AVE洗脱核酸。
3)ddPCR。
第一，PCR体系的配置。在试剂准备区按照下表配置PCR体系：2×ddPCR Supermixfor Probe(No dUTP)计10ul，引物1(Exon19del-F1)计1.1ul，引物2(Exon19del-R1)计1.1ul，探针1(WTp-EXON19DEL)0.55ul，探针2(MTp-EXON19DEL)计0.55ul，模板5ul，加水补齐至22ul。
第二，加模板。在样本制备区按照以下顺序加入模板：空白对照、阴性对照、弱阳性对照、阳性对照。
第三，微滴的生成。在微滴生成区，将20ul PCR反应液加入微滴生成卡的样本孔，70ul微滴生成油加至微滴生成卡的加油孔，加样结束后用密封垫密封微滴生成卡，然后置于微滴发生仪内，启动并生成微滴。用移液器小心转移微滴至effendorf 96孔PCR板，覆盖上热封膜，在热封仪内以180℃、5s参数进行热封。
第四，PCR。经过退火温度优化实验，发现56.3℃退火15s，数字PCR效果最优。按照以下程序进行PCR：95℃10min，40个循环(94℃30s，56.3℃15s，72℃15s)，98℃10min，升降温速率2℃/s。
第五，读板。提前预热Bio-rad QX200仪器。打开程序QuantaSoft，设置FAM/HEX检测通道，开始读板。根据读板结果，判断样本阳性或者阴性。
本发明中，对EGFR基因EXON19DEL位点突变进行检测的试剂盒，适用于EGFR基因第20外显子突变的检测。所述试剂盒包括PCR引物探针、反应体系、反应条件、阴性对照DNA样本、阳性对照DNA样本。具体包括以下内容：
(1)引物和探针。合成以下寡核苷酸片段和修饰寡核苷酸片段，并溶解于10uM TE。
(2)PCR试剂。DNA聚合酶使用Bio-rad 2×ddPCR Supermix(with no dNTP)。
(3)反应体系。见前述部分。
(4)反应条件。见前述部分。
(5)模板。空白对照为水，阴性对照为正常人白细胞基因组，弱阳性对照DNA样本，抽提与样本来源相同的正常材料的核酸，通过NanoDrop或者Qubit定量后，加入0.1-1％细胞系HCC827基因组，作为弱阳性对照，强阳性对照为细胞系HCC827基因组。
本发明中，肿瘤诊断的判断方法包括，检测EGFR基因EXON19DEL突变，若检测结果为阳性，则判定发生EXON19DEL突变，有可能发生肿瘤，若检测结果为阴性，则判定未发生EXON19DEL突变，在本方法检测范围内未发生肿瘤。进一步通过基因检测指导肿瘤靶向药物用药的方法。
所述肿瘤包括但不限于肺癌患者。
所述肿瘤靶向药物是表皮生长因子受体抑制剂(EGFR-TKIs)，包括但不限于吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、阿法特罗(afatinib)、达沙替尼(dasatinib)和奥希替尼(osimertinib)。
所述指导肿瘤靶向药物用药方法具体指，使用本发明方法检测EGFR基因EXON19DEL突变，若检测结果为阳性，则判定发生EXON19DEL突变，患者建议使用EGFR-TKIs，若检测结果为阴性，则判定未发生EXON19DEL突变，建议进行EGFR其他位点突变的检测，根据检测结果进行用药指导。
本发明从健康人白细胞抽提基因组(以下称“tgDNA”)作为野生型模板，从中国科学院细胞库购买具有EGFR基因EXON19DEL突变的细胞系HCC827，经过细胞培养并抽提基因组(以下称“HCC827”)，基因组经nanodrop和ddPCR精确定量和突变验证后，作为突变型模板。
本发明中，通过基因检测进行肿瘤早期诊断的方法。所述肿瘤包括但不限于肺癌患者。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1；ddPCR法检测EGFR基因EXON19DEL突变的方法优化。
1)引物对的筛选；根据EGFR第20外显子序列，设计5对引物对，引物合成自上海生工生物有限公司，具体序列如下。
筛选PCR体系：Taq HS聚合酶0.2ul，10×HS PCR缓冲液2ul，dNTP混合物1.6ul，引物1计1ul，引物2计1ul，DNA模板tgDNA计5ul，水补齐体系至20ul。筛选PCR程序：95℃10min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃20s)。经过PCR筛选，引物对1(Exon19del-F1/Exon19del-R1)对目的片段扩增效率最高，且不产生引物二聚体。该引物对作为EGFR基因EXON19DEL突变的检测引物对。
1)ddPCR反应程序的优化；根据EGFR基因EXON19DEL突变序列(EXON19DEL突变信息见下表)，设计分别识别野生型序列和突变型序列的两条探针WTp-EXON19DEL/MTp-EXON19DEL。结合筛选引物对和上述探针，对于ddPCR反应程序进行优化。
在试剂准备区配置以下PCR体系：2×ddPCR Supermix for Probe(No dUTP)10ul，引物1(Exon19del-F1)计1.1ul，引物2(Exon19del-R1)计1.1ul，探针1(WTp-EXON19DEL)计0.55ul，探针2(MTp-EXON19DEL)计0.55ul，模板5ul，加水补齐至22ul。
在样本制备区，按照阴性对照、阳性对照顺序加入模板；阴性对照为tgDNA，阳性对照为HCC827基因组。
在微滴生成区，将20ul PCR反应液加入微滴生成卡的样本孔，70ul微滴生成油加之至微滴生成卡的加油孔，加样结束后用密封垫密封微滴生成卡，然后，置于微滴发生仪内，启动并生成微滴。用移液器小心转移微滴至effendorf 96孔PCR板，覆盖上热封膜，在热封仪内以180℃、5s参数进行热封。
在样本分析区PCR。PCR程序为：95℃10min，40个循环{94℃30s，退火温度梯度(50℃、50.7℃、52℃、53.9℃、56.3℃、58.3℃、59.4℃、60℃)15s，72℃15s}，98℃10min，升降温速率2℃/s。提前预热Bio-rad QX200仪器。打开程序QuantaSoft，设置FAM/HEX检测通道，开始读板。
读板结果如附图1所示，检测EXON19DEL突变Taqman-ddPCR方法的退火温度优化，孔A-H代表退火温度梯度60℃、59.4℃、58.3℃、56.3℃、53.9℃、52℃、50.7℃、50℃。A,FAM通道检测细胞株HCC827的1-D振幅图；B,HEX通道检测细胞株HCC827的1-D振幅。HEX通道指示突变型模板的微滴及其荧光强度(Amplitude)，FAM-HEX通道指示野生型模板的微滴及其荧光强度(Amplitude)。通过FAM-HEX双阳性的微滴数可以计算野生型模板拷贝数(copies/ul)，通过HEX通道的微滴数可以推测ddPCR体系中是否存在突变型模板并可精确计算拷贝数(copies/ul)。
ddPCR反应程序优化实验，需要综合分析随着退火温度的变化，野生型模板和突变型模板的ddPCR扩增情况。最优的退火温度应满足两个条件：野生型模板阴性对照HEX通道无微滴背景干净，突变型模板内阳性信号和阴性信号容易区分，FAM通道和HEX通道荧光强度高。根据附图1，发现56.3℃退火15s，ddPCR阴性对照无污染、阴性信号和阳性信号之间区分最明显，为最优退火温度。
实施例2；ddPCR法检测EGFR基因EXON19DEL突变的方法验证；
根据实施例1中HCC827作为模板的ddPCR结果，计算FAM通道拷贝数和HCC827总拷贝数，二者相除乘以100％，得到HCC827突变率即突变型模板比例为66％。
根据实施例1计算HCC827和tgDNA基因组拷贝数(copies/ul)，用TE将二者均稀释至4000copies/ul。将HCC827掺入tgDNA，使得EXON19DEL突变模板比例分别为0.0625％、0.125％、0.25％、0.5％、1％，制作成梯度稀释模板。
按照以下方法验证EXON19DEL突变检测方法。验证ddPCR体系：2×ddPCR Supermixfor Probe(No dUTP)计10ul，引物1(Exon19del-F1)计1.1ul，引物2(Exon19del-R1)计1.1ul，探针1(WTp-EXON19DEL)计0.55ul，探针2(MTp-EXON19DEL)计0.55ul，模板5ul，加水补齐至22ul。
在样本制备区按照以下顺序加入模板：空白对照、阴性对照、梯度稀释模板、阳性对照。空白对照为水，阴性对照为tgDNA，梯度稀释模板为掺入0.0625％-1％突变型模板的野生型模板，阳性对照为HCC827基因组。
按照实施例1相同方法将PCR反应体系生成微滴，热封PCR板。按照优化PCR程序进行PCR：95℃10min，40个循环(94℃30s，56.3℃15s，72℃15s)，98℃10min，升降温速率2℃/s。打开Bio-rad QX200仪器，设置读板程序，开始读板。ddPCR结果见附图2，EGFR基因EXON19DEL检测方法的验证。由图可知，本检测方法在所有检测浓度(0.0625％-2％)内的线性度都非常好,即本方法的灵敏度达到0.0625％。
本实施例中，ddPCR法以水或者tgDNA为模板，背景干净，无污染。此外，在野生型模板中掺入0.0625％-1％突变型模板，检测野生型模板拷贝数正常，检测突变型模板比例与理论比例相符，且呈线性相关，检测突变型模板比例即突变型模板除以总模板乘以100％；R2值为0.991。在0.0625％-1％灵敏度区间内，检测值准确，最低检测灵敏度为0.0625％。
实施例3；ddPCR法检出患者EXON19DEL突变指导肿瘤靶向药物用药；
病例CA019和CA023均为肺腺癌IV期病人。通过采集静脉血，两次离心分离血浆(第一次低速离心，4℃、1900g、10min，第二次高速离心，4℃、16000g、10min)，小心移取上清1ml至50ml离心管。通过QIAGEN游离核酸抽提试剂盒抽提血浆游离核酸。抽提核酸经Qubit定量。定量后储存于样本制备室-20℃冰箱内。
本发明ddPCR法检测EGFR基因EXON19DEL突变。检测PCR体系：2×ddPCR Supermixfor Probe(No dUTP)计10ul，引物1(Exon19del-F1)计1.1ul，引物2(Exon19del-R1)计1.1ul，探针1(WTp-EXON19DEL)计0.55ul，探针2(MTp-EXON19DEL)计0.55ul，模板5ul，加水补齐至22ul。
在样本制备区按照以下顺序加入模板：空白对照、阴性对照、病例CA019游离核酸或病例CA023游离核酸、弱阳性对照、强阳性对照。空白对照为水，阴性对照为tgDNA，病例游离核酸为受检样本，阳性对照为HCC827基因组。样本检测弱阳性对照：采集健康人血液，抽提游离核酸，根据游离核酸浓度掺入0.1％-1％突变型模板，作为与样本来源相同且浓度相当的弱阳性对照。
按照实施例1相同方法将PCR反应体系生成微滴，热封PCR板。按照优化PCR程序进行PCR：95℃10min，40个循环(94℃30s，56.3℃15s，72℃15s)，98℃10min，升降温速率2℃/s。打开Bio-rad QX200仪器，设置读板程序，开始读板。ddPCR结果见附图3和附图4，本次EXON19DEL检测以水或者tgDNA为模板，背景干净，弱阳性对照和强阳性对照拷贝数和比例正常。由附图3可知，病例CA019经ddPCR检测为阴性。FAM-HEX通道的2D图振幅图，右上45°角为野生型信号。病例CA019FAM-HEX通道检出野生型模板38.7copies/ul，HEX通道未检出信号，该样本判读为阴性，不含有EGFR基因EXON19DEL突变，后续可以继续检测EGFR基因上其他基因突变，进而进行用药指导。由图4可知，病例CA023经ddPCR检测为阳性。FAM-HEX通道的2D图：右下侧2为突变信号。病例CA023FAM-HEX通道检出野生型模板145copies/ul，HEX通道检出突变型模板11.8copies/ul，突变率为7.6％，该样本判读为阳性，建议使用表皮生长因子受体-酪氨酸抑制剂(EGFR-TKIs)类靶向药物治疗。两例病例的具体检测数据见下表。
本发明实施例中，所使用的仪器如下：Bio-Rad QX200Droplet Digital PCR系统，life simplex PCR仪，nanodrop仪，QIAGEN真空驱动装置，Eppendorf大型台式冷冻高速离心机，Eppendorf高速离心机，水浴锅，涡旋震荡仪，冰箱，金属浴，迷你离心机。
本发明实施例中，所使用的试剂包括：宝生物公司的Taq HS聚合酶、10×HS PCR缓冲液、dNTP混合物，上海Bio-rad的2×ddPCR Supermix for Probe(No dUTP)、微滴生成油、微滴分析油，以及QIAGEN的游离核酸抽提试剂盒。
本发明实施例中，所使用耗材包括：德国莎斯特的0.6ml离心管、1.5ml离心管和0.1-10ul、10ul-200ul、100ul-1000ul滤芯枪头，上海Bio-rad的微滴发生卡、密封垫、热封膜，Eppendorf的96孔半裙边PCR板。
本发明实施例中，所使用探针合成自上海生工公司，所以探针含HPLC分析图谱，纯度达到HPLC级。野生型模板检测探针，5’端用荧光染料FAM修饰，3’端用淬灭基团BHQ1修饰,当FAM修饰探针与突变型模板结合后，DNA聚合酶延伸至5’端，水解荧光基团，发出荧光，该信号经ddPCR分析仪检测得到FAM通道信号。突变型模板检测探针，5’端用荧光染料HEX修饰，3’端用淬灭基团BHQ1修饰，当HEX修饰探针与野生型模板结合后，DNA聚合酶延伸至5’端，水解荧光基团，发出荧光，该信号经ddPCR分析仪检测得到HEX通道信号。探针合成后加入TE稀释成100uM贮存液，然后取部分用TE稀释成10uM使用浓度，PCR体系中探针浓度均为10uM。
本发明中所使用引物合成自上海生工公司，引物合成后加入TE稀释成100uM贮存液，取部分用TE稀释成10uM使用浓度，PCR体系中引物浓度均为10uM。
Claims (7)
1.外周血浆中EGFR基因外显子19缺失突变的检测方法及应用，其特征在于，根据EGFR基因序列，设置包括上游引物和下游引物扩增引物一对，根据EXON19DEL(COSM6223、COSM6225、COSM12728、COSM6218、COSM6254、COSM6255、COSM12382、COSM12369)突变序列，设置检测野生型序列的探针和检测突变型序列的探针。采用上述引物和探针进行ddPCR，并优化出低频突变检出的最佳条件；应用该方法进行病人组织、血液等样本的检测；对EGFREXON19DEL位点突变进行检测的方法包括以下步骤：
1)根据EGFR基因序列，设置特异性扩增外显子19引物对；根据EXON19DEL突变序列设计分别检测野生型模板和突变型模板的探针对；采用上述引物和探针，进行ddPCR，并优化出低频突变检测的最佳条件；
2)抽提样本的核酸；选择适合样本类型的方法抽提核酸，所述样本类型包括外周血细胞、外周血血浆/血清、体液、腔道的脱落物、病变组织；
特别地，对于血液样本的游离核酸抽提，步骤如下：
第一、采血管的选择；如果采用普通采血管，不能含有肝素，而且需要在4h内分离血浆，如果血液不能及时处理，需选用含血细胞稳定技术的采血管；
第二、血浆的分离；血浆的分离：第一步低速离心去除细胞，4℃、1900g、10min；第二步高速离心进一步去除细胞来源核酸杂质，4℃、16000g、10min；
第三、裂解；每毫升血浆加入100ul Proteinase K和0.8ml Buffer ACL，且每个样本加入1ug carrier RNA；60℃孵育30min；每毫升血浆加入1.8ml缓冲液ACB；涡旋混匀；冰浴5min；
第四、核酸吸附至硅膜；将第三步裂解液加入核酸吸附柱；
第五、清洗；分别使用缓冲液ACW1、ACW2和96-100％乙醇清洗核酸吸附柱；
第六、乙醇去除。56℃、10min挥发乙醇；
第七、洗脱、20-100ul AVE洗脱核酸；
3)ddPCR；
第一、PCR体系的配置；在试剂准备区按照下表配置PCR体系：2×ddPCR Supermix forProbe(No dUTP)计10ul，引物1(Exon19del-F1)计1.1ul，引物2(Exon19del-R1)计1.1ul，探针1(WTp-EXON19DEL)0.55ul，探针2(MTp-EXON19DEL)计0.55ul，模板5ul，加水补齐至22ul；
第二、加模板；在样本制备区按照以下顺序加入模板：空白对照、阴性对照、弱阳性对照、阳性对照；
第三、微滴的生成；在微滴生成区，将20ul PCR反应液加入微滴生成卡的样本孔，70ul微滴生成油加至微滴生成卡的加油孔，加样结束后用密封垫密封微滴生成卡，然后置于微滴发生仪内，启动并生成微滴；用移液器小心转移微滴至effendorf 96孔PCR板，覆盖上热封膜，在热封仪内以180℃、5s参数进行热封；
第四、PCR；经过退火温度优化实验，发现56.3℃退火15s，数字PCR效果最优；按照以下程序进行PCR：95℃10min，40个循环(94℃30s，56.3℃15s，72℃15s)，98℃10min，升降温速率2℃/s；
第五、读板；提前预热Bio-rad QX200仪器；打开程序QuantaSoft，设置FAM/HEX检测通道，开始读板；根据读板结果，判断样本阳性或者阴性。
2.如权利要求1所述的外周血浆中EGFR基因外显子19缺失突变的检测方法及应用，其特征在于，对EGFR基因EXON19DEL位点突变进行检测的试剂盒，适用于EGFR基因第20外显子突变的检测；所述试剂盒包括PCR引物探针、反应体系、反应条件、阴性对照DNA样本、阳性对照DNA样本；具体包括以下内容：
(1)引物和探针；合成以下寡核苷酸片段和修饰寡核苷酸片段，并溶解于10uM TE；
(2)PCR试剂；DNA聚合酶使用Bio-rad 2×ddPCR Supermix(with no dNTP)；
(3)反应体系；
(4)反应条件；
(5)模板；空白对照为水，阴性对照为正常人白细胞基因组，弱阳性对照DNA样本，抽提与样本来源相同的正常材料的核酸，通过NanoDrop或者Qubit定量后，加入0.1-1％细胞系HCC827基因组，作为弱阳性对照，强阳性对照为细胞系HCC827基因组。
3.如权利要求1所述的外周血浆中EGFR基因外显子19缺失突变的检测方法及应用，其特征在于，肿瘤诊断的判断方法包括，检测EGFR基因EXON19DEL突变，若检测结果为阳性，则判定发生EXON19DEL突变，有可能发生肿瘤，若检测结果为阴性，则判定未发生EXON19DEL突变，在检测范围内未发生肿瘤；进一步通过基因检测指导肿瘤靶向药物用药的方法；所述肿瘤包括但不限于肺癌患者；所述肿瘤靶向药物是表皮生长因子受体抑制剂(EGFR-TKIs)，包括但不限于吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、阿法特罗(afatinib)、达沙替尼(dasatinib)和奥希替尼(osimertinib)；所述指导肿瘤靶向药物用药方法具体指，使用本发明方法检测EGFR基因EXON19DEL突变，若检测结果为阳性，则判定发生EXON19DEL突变，患者建议使用EGFR-TKIs，若检测结果为阴性，则判定未发生EXON19DEL突变，建议进行EGFR其他位点突变的检测，根据检测结果进行用药指导。
4.如权利要求1所述的外周血浆中EGFR基因外显子19缺失突变的检测方法及应用，其特征在于，从健康人白细胞抽提基因组即“tgDNA”作为野生型模板，从中国科学院细胞库购买具有EGFR基因EXON19DEL突变的细胞系HCC827，经过细胞培养并抽提基因组即“HCC827”，基因组经nanodrop和ddPCR精确定量和突变验证后，作为突变型模板。
5.如权利要求1所述的外周血浆中EGFR基因外显子19缺失突变的检测方法及应用，其特征在于，ddPCR法检测EGFR基因EXON19DEL突变的方法优化措施包括：
1)引物对的筛选；根据EGFR第20外显子序列，设计5对引物对，具体序列如下：
筛选PCR体系：Taq HS聚合酶0.2ul，10×HS PCR缓冲液2ul，dNTP混合物1.6ul，引物1计1ul，引物2计1ul，DNA模板tgDNA计5ul，水补齐体系至20ul；筛选PCR程序：95℃10min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃20s)；经过PCR筛选，引物对1(Exon19del-F1/Exon19del-R1)对目的片段扩增效率最高，且不产生引物二聚体；该引物对作为EGFR基因EXON19DEL突变的检测引物对；
1)ddPCR反应程序的优化；根据EGFR基因EXON19DEL突变序列，设计分别识别野生型序列和突变型序列的两条探针WTp-EXON19DEL/MTp-EXON19DEL；结合筛选引物对和上述探针，对于ddPCR反应程序进行优化；EXON19DEL突变信息见下表：
在试剂准备区配置以下PCR体系：2×ddPCR Supermix for Probe(No dUTP)10ul，引物1(Exon19del-F1)计1.1ul，引物2(Exon19del-R1)计1.1ul，探针1(WTp-EXON19DEL)计0.55ul，探针2(MTp-EXON19DEL)计0.55ul，模板5ul，加水补齐至22ul；
在样本制备区，按照阴性对照、阳性对照顺序加入模板；阴性对照为tgDNA，阳性对照为HCC827基因组；
在微滴生成区，将20ul PCR反应液加入微滴生成卡的样本孔，70ul微滴生成油加之至微滴生成卡的加油孔，加样结束后用密封垫密封微滴生成卡，然后，置于微滴发生仪内，启动并生成微滴；用移液器小心转移微滴至effendorf 96孔PCR板，覆盖上热封膜，在热封仪内以180℃、5s参数进行热封；
在样本分析区PCR；PCR程序为：95℃10min，40个循环{94℃30s，退火温度梯度(50℃、50.7℃、52℃、53.9℃、56.3℃、58.3℃、59.4℃、60℃)15s，72℃15s}，98℃10min，升降温速率2℃/s；提前预热Bio-rad QX200仪器；打开程序QuantaSoft，设置FAM/HEX检测通道，开始读板。
6.如权利要求1所述的外周血浆中EGFR基因外显子19缺失突变的检测方法及应用，其特征在于，计算HCC827和tgDNA基因组拷贝数(copies/ul)，用TE将二者均稀释至4000copies/ul；将HCC827掺入tgDNA，使得EXON19DEL突变模板比例分别为0.0625％、0.125％、0.25％、0.5％、1％，制作成梯度稀释模板；
按照以下方法验证EXON19DEL突变检测方法。验证ddPCR体系：2×ddPCR Supermix forProbe(No dUTP)计10ul，引物1(Exon19del-F1)计1.1ul，引物2(Exon19del-R1)计1.1ul，探针1(WTp-EXON19DEL)计0.55ul，探针2(MTp-EXON19DEL)计0.55ul，模板5ul，加水补齐至22ul；
在样本制备区按照以下顺序加入模板：空白对照、阴性对照、梯度稀释模板、阳性对照；空白对照为水，阴性对照为tgDNA，梯度稀释模板为掺入0.0625％-1％突变型模板的野生型模板，阳性对照为HCC827基因组；
将PCR反应体系生成微滴，热封PCR板；按照优化PCR程序进行PCR：95℃10min，40个循环(94℃30s，56.3℃15s，72℃15s)，98℃10min，升降温速率2℃/s；打开Bio-rad QX200仪器，设置读板程序，开始读板；在所有检测浓度(0.0625％-2％)内的线性度都非常好,即本方法的灵敏度达到0.0625％。
7.如权利要求1所述的外周血浆中EGFR基因外显子19缺失突变的检测方法及应用，其特征在于，ddPCR法以水或者tgDNA为模板；在野生型模板中掺入0.0625％-1％突变型模板，检测野生型模板拷贝数正常，检测突变型模板比例与理论比例相符，且呈线性相关，检测突变型模板比例即突变型模板除以总模板乘以100％；R2值为0.991。在0.0625％-1％灵敏度区间内，检测值准确，最低检测灵敏度为0.0625％。
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| CN112725330A (zh) * | 2021-01-25 | 2021-04-30 | 温州全新生物科技有限公司 | 一种外周血cfDNA提取前的纯化方法 |
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