CN112662772A

CN112662772A - Npm1基因突变检测试剂盒

Info

Publication number: CN112662772A
Application number: CN202011618550.1A
Authority: CN
Inventors: 王芳; 张�成; 孙黎; 郝玮; 李小青
Original assignee: Wuhan Haixi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuhan Haixi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2021-04-16

Abstract

本发明公开了一种NPM1基因突变检测试剂盒。所述试剂盒包括用于qPCR检测NPM1基因突变的引物和探针，以及内参基因Abelson检测引物和探针。针对一代测序技术检测灵敏度低，qPCR技术只能针对已知的突变类型或者融合基因进行定量检测的不足，本发明将两种技术联合使用，先用一代测序技术确定NPM1基因突变的突变类型，再针对突变类型设计引物和探针，用qPCR技术对NPM1突变类型进行定量检测，大大提高了NPM1基因突变检测的通量和灵敏度，可同时满足对NPM1基因突变进行定性和定量检测，为急性髓系白血病的早期诊断、复发、治疗方案的确定以及预后判断提供参考依据。

Description

NPM1基因突变检测试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，具体地说，涉及一种NPM1基因突变检测试剂盒。

背景技术

NPM1基因位于人类染色体5q35，包含12个外显子，编码由294个氨基酸组成的核磷蛋白成员。核磷蛋白通过参与核糖体的合成和中心体复制从而调控细胞增殖和周期进程。NPM1突变一般仅出现于第12号外显子，目前发现的NPM1基因突变以插入缺失为主，至少有50多种不同类型，主要突变类型为A、B和D，约占90％，其余稀有类型占比为10％。

NPM1基因突变是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)中常见的突变形式，其在AML的诊断、分型、预后判断及监测病灶残留等方面具有重要价值。目前用于NPM1基因突变检测的技术包括一代测序技术、实时荧光定量PCR技术(qPCR)和数字PCR技术等。一代测序技术是基因多态性和基因突变检测的金标准，也是其他检测技术的参考标准，可以直接测定样本的基因序列，得到基因变异的精确情况，并且能够对某一段DNA序列进行多位点突变检测，或未知突变检测，但该方法存在灵敏度低的缺陷，相比而言，qPCR技术具有较高的灵敏度，但必须针对已知的突变类型或者融合位点才能设计出相应的引物和探针。

发明内容

本发明的目的是提供一种NPM1基因突变检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种基于一代测序技术和qPCR技术检测25种NPM1基因突变的方法。

本发明构思如下：针对一代测序技术检测灵敏度低，qPCR技术只能针对已知的突变类型或者融合基因进行定量检测的不足，本发明将两种技术联合使用，先用一代测序技术确定NPM1基因突变的突变类型，再针对突变类型设计引物和探针，用qPCR技术对NPM1突变类型进行定量检测，大大提高了NPM1基因突变检测的通量和灵敏度，并且能够对NPM1基因突变同时实现定性和定量检测。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种NPM1基因突变检测引物，包括1条用于扩增NPM1基因的正向引物，1条用于扩增野生型NPM1基因的反向引物和25条用于扩增NPM1突变基因的反向引物，它们的引物序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3-27所示。

NPM1-F：5'-AAAGTGGAAGCCAAATTCATCAA-3'(SEQ ID NO:1)

NPM1基因野生型及突变类型	反向引物(5′-3′)	序列编号
			NPM1基因野生型	CCACTGCCAGAGATCGAATATTG	SEQ ID NO:2
c.863_864insTCTG(Type A)	CCTCCACTGCCAGACAGAGA	SEQ ID NO:3
			c.863_864insCATG(Type B)	TTCCTCCACTGCCATGCAG	SEQ ID NO:4
c.863_864insCCTG(Type D)	TTCCTCCACTGCCAGGCAG	SEQ ID NO:5
			c.863_864insCGTG(Type C)	TTCCTCCACTGCCACGCAG	SEQ ID NO:6
c.863_864insCTTG(Type P)	TTCCTCCACTGCCAAGCA	SEQ ID NO:7
			c.863_864insTATG	CTTCCTCCACTGCCATACAGA	SEQ ID NO:8
c.863_864insCTGC	TTCCTCCACTGCGCAGCAG	SEQ ID NO:9
			c.863_864insCCGG	TTCCTCCACTGCCCGGCAG	SEQ ID NO:10
c.863_864insCAGA	CTTCCTCCACTGCTCTGCAGA	SEQ ID NO:11
			c.863_864insCAGG	CTTCCTCCACTGCCCTGCAGA	SEQ ID NO:12
c.863_864insTCGG	CTTCCTCCACTGCCCGACAGAGA	SEQ ID NO:13
			c.863_864insCCAG	TTCCTCCACTGCCTGGCAG	SEQ ID NO:14
c.863_864insTTTG	CCTCCACTGCCAAACAGA	SEQ ID NO:15
			C.861_862insTGCT	TCCTCCACTGCCAAGCAGAGA	SEQ ID NO:16
c.861_862insTGCA	TCCTCCACTGCCATGCAGAGA	SEQ ID NO:17
			c.861_870delinsTTCCAGGCTATTCA	GACTTCCTTGAATAGCCTGGAAAGA	SEQ ID NO:18
c.862_863insGCAG	AGACTTCCTCCACTGCCT	SEQ ID NO:19
			c.862_863insGTCG	CTTCCTCCACTGCCCGACAGAG	SEQ ID NO:20
C.864_866delinsCCGGTCC	GACTTCCTCCACGGACCGGCAGAG	SEQ ID NO:21
			c.866_867insAGA	GAGACTTCCTCCACATCTTGCCA	SEQ ID NO:22
c.868_869delinsCGTTTC	GAGACTTCCTCGAAACGCTGCCA	SEQ ID NO:23
			c.868_869delinsCGCCTT	GAGACTTCCTCAAGGCGCTGCCA	SEQ ID NO:24
c.869_873delinsCTCTTTCTA	GAGACTTTAGAAAGAGACTGC	SEQ ID NO:25
			C.870_873delinsCTTTTCC	GAGACTTGGAAAAGCACTGCC	SEQ ID NO:26
C.870_873delinsCCTCGCCC	AAAGAGACTTGGGCGAGGCACTGC	SEQ ID NO:27

第二方面，本发明提供与引物NPM1-F/NPM1-R配合使用的探针，探针NPM1-Probe序列如下(SEQ ID NO:28)：

NPM1-Probe：5'-F-ATTGCTTCCGGATGACT-Q-3'；

其中，F为荧光基团(如FAM)，Q为荧光淬灭基团(如MGB)。

第三方面，本发明提供含有引物NPM1-F/NPM1-R和/或探针NPM1-Probe的检测试剂或试剂盒。

第四方面，本发明提供NPM1基因突变qPCR检测试剂盒，包含引物NPM1-F/NPM1-R和探针NPM1-Probe。

进一步地，所述试剂盒还包含内参基因Abelson检测引物和探针，引物和探针序列如下(SEQ ID NO:29-31)：

ABL-F：5'-GGTGAAAAGCTCCGGGTCTT-3'

ABL-R：5'-ACCCAGCCTTGGCCATTT-3'

ABL-Probe：5'-F-AATGGTGTGAAGCCCA-Q-3'；

其中，F为荧光基团(如FAM)，Q为荧光淬灭基团(如MGB)。

第五方面，本发明提供一种用于NPM1基因突变qPCR检测的反应体系，所述反应体系见表1：

表1

第六方面，本发明提供一种基于一代测序技术和qPCR技术检测25种NPM1基因突变的方法，所述方法包括：从骨髓或外周血样本中同时提取DNA和RNA，DNA样品用一代测序的方法确定患者的NPM1基因突变类型，然后针对突变位点设计定量PCR引物和探针，再将RNA样品经逆转录之后利用上述引物和探针(SEQ ID NO:1-28和SEQ ID NO:29-31)进行实时荧光定量PCR反应，以NPM1的质粒和Abelson的质粒分别做梯度稀释，稀释梯度为10⁵、10⁴、10³、10²，以此作为标准曲线来对NPM1和ABL1进行定量检测，以NPM1基因突变的拷贝数与内参Abelson基因的拷贝数计算比值，从而实现对NPM1基因突变进行定量检测。

一代测序方法可参考Falini B，Mecucci C，Tiacci E，et al.CytoplasmicNucleophosmin in Acute Myelogenous Leukemia with a Normal Karyotype[J].NewEngland Journal of Medicine,2005,352(3):254-266.

实时荧光定量PCR的反应条件见表2：

表2

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

(一)克服了一代测序技术灵敏度低的缺陷。

(二)突破了实时荧光定量PCR检测范围的局限性，可以不断扩大所检测到的NPM1基因突变类型。

(三)可同时实现对NPM1基因突变的定性和定量检测。

(四)为后期出现的相同突变类型的NPM1基因突变持续进行MRD监测提供有效手段。

附图说明

图1为本发明NPM1基因突变检测方法示意图。

图2为本发明较佳实施例中实时荧光定量PCR的检测结果。

图3为本发明较佳实施例中实时荧光定量PCR的突变类型扩增曲线。其中，A：NPM1c.863_864insTCTG(Type A)突变的扩增曲线；B：内参基因ABL1的扩增曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1基于一代测序技术和qPCR技术检测25种NPM1基因突变的方法

目前使用一代测序技术或者实时荧光定量PCR法对NPM1基因突变进行检测，由于一代测序技术灵敏度的原因会使得很多突变频率低的位点检测不到，实时荧光定量PCR技术检测范围的局限性使得很多突变类型没有办法检测，同时将两种方法联合使用，检测结果的灵敏度和通量都得到了扩大(图1)。本发明为急性髓系白血病的早期诊断、复发、治疗方案的确定以及预后判断提供参考依据。

所述方法包括：从骨髓或外周血样本中同时提取DNA和RNA，DNA样品用一代测序的方法确定患者的NPM1基因突变类型(共25种NPM1基因突变)，然后针对突变位点设计定量PCR引物和探针，其中正向引物和探针通用，针对25种突变位点设计特异性的反向引物，再将RNA样品经逆转录之后利用引物和探针(SEQ ID NO:1-27和SEQ ID NO:28-30)进行实时荧光定量PCR反应，以NPM1的质粒和Abelson的质粒分别做梯度稀释，稀释梯度为10⁵、10⁴、10³、10²，以此作为标准曲线来对NPM1和ABL1进行定量检测，以NPM1基因突变的拷贝数与内参Abelson基因的拷贝数计算比值，从而实现对NPM1基因突变进行定量检测。

根据一代测序结果，得到25种NPM1基因突变类型，具体如下：

突变类型
	c.863_864insTCTG(Type A)
c.863_864insCATG(Type B)
	c.863_864insCCTG(Type D)
c.863_864insCGTG(Type C)
	c.863_864insCTTG(Type P)
c.863_864insTATG
	c.863_864insCTGC
c.863_864insCCGG
	c.863_864insCAGA
c.863_864insCAGG
	c.863_864insTCGG
c.863_864insCCAG
	c.863_864insTTTG
C.861_862insTGCT
	c.861_862insTGCA
c.861_870del10insTTCCAGGCTATTCA
	c.862_863insGCAG
c.862_863insGTCG
	C.864_866delinsCCGGTCC
c.866_867insAGA
	c.868_869delinsCGTTTC
c.868_869delinsCGCCTT
	c.869_873delinsCTCTTTCTA
C.870_873delinsCTTTTCC
	C.870_873delinsCCTCGCCC

实时荧光定量PCR的反应体系见表1，反应条件见表2。

图2为实时荧光定量PCR的检测结果。图3(A和B)为实时荧光定量PCR的扩增曲线。

实施例2 AML患者NPM1基因突变检测实例

1.DNA和RNA的提取

1.1DNA的提取

1.1.1准备新的样本管和1.5ml EP管，样本管按照A1-A24、B1-B24编号，1.5ml EP管按照对应顺序进行标记。

1.1.2向样本管中加入40μl PK混合液，同时加入400μl全血样本，用枪头混匀。

1.1.3将样品管放置于样品管架S处。将枪头(含枪头套)放在T的位置。收集管放置于收集管板上。

1.1.4点击START，选择106程序，选择样本量400μl，洗脱体积100μl，START运行程序。

1.1.5程序结束后，得到DNA，将用过的试剂耗材放入指定的废物处理箱中。

1.2RNA的提取

1.2.1取2ml的全血溶8ml的1×ERL缓冲液于15mL离心管中，振荡混匀，置于冰上5min，以裂解红细胞。

1.2.2转速1500rpm，离心3min，然后弃上清液。

1.2.3重复1.2.2两次，加入1mL PBS吹打混匀。

1.2.4移入1.5mL离心管中。转速6600rcf，4℃离心1min，然后弃上清。

1.2.5收获细胞沉淀，加入1mL RNAiso Plus试剂，混匀，室温静置5min。

1.2.6加入0.2mL氯仿，振荡15s，室温静置2min。

1.2.7转速12000rcf，4℃离心10min，取上清到新的EP管中。

1.2.8加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，冰水浴20min。

1.2.9转速12000rcf，4℃离心10min，离心后在管侧和管底出现沉淀，弃上清。

1.2.10加入1mL 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。

1.2.11转速7500rcf，4℃离心5min，弃上清。

1.2.12重复1.2.10和1.2.11，室温干燥5-10min，然后加入50μL DEPC水溶解沉淀，即获得RNA溶液。

1.3浓度和纯度测定

1.3.1将提取的DNA用NanoDrop 2000分光广度仪进行浓度和纯度测定，DNA浓度应大于25ng/μl，并做好相应的记录，将定量好的DNA立即使用进行后续的检测或冻存于-20℃。注意：一般用OD₂₆₀/OD₂₈₀值检测DNA样品的纯度。正常OD₂₆₀/OD₂₈₀值约为1.7-1.9，说明DNA纯度较好；若OD₂₆₀/OD₂₈₀值小于1.7，说明可能有蛋白污染；若OD₂₆₀/OD₂₈₀值大于2.0，说明可能有RNA污染或DNA已经降解。

1.3.2将提取的RNA用NanoDrop 2000分光广度仪进行浓度和纯度测定，RNA浓度最好大于100ng/μL，并做好相应的记录，将定量好的RNA立即使用进行后续的检测或冻存于-20℃。注意：一般用OD₂₆₀/OD₂₈₀值检测RNA样品的纯度。正常OD₂₆₀/OD₂₈₀值约为1.8-2.0，说明RNA纯度较好；若OD₂₆₀/OD₂₈₀值>2.2，说明RNA已经降解；若OD₂₆₀/OD₂₈₀值<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显。RNA若长期保存，应存放于-70℃。

2.一代测序的方法确认突变

2.1准备PCR反应所需的试剂，将ddH₂O从4℃冰箱中取出，将2×Vazyme Lampmaster mix、Primers、DNA从-20℃冰箱内取出，室温下融化并涡旋3-5秒，瞬时离心，使液体收集到管底。

2.2按如下表配制每管内的PCR反应体系，通过1对特异性引物，引物序列如下，扩增NPM1基因的12号外显子。

NPM1 exon12-F：5′-GTAAAACGACGGCCAGTGTTAACTCTCTGGTGGTAGAATGAA-3′

NPM1 exon12-R：5′-GGAAACAGCTATGACCATGCAAGACTATTTGCCATTCCTAAC-3′

2.3配制如下PCR扩增体系：

成分	体积(μl)
		2×Vazyme Lamp master mix	5
ddH<sub>2</sub>O	3
		引物工作液	1
样品DNA	1
		总体积	10

每个样本均做一个，设置一组扩增的阴性对照(ddH₂O)。

2.4放入PCR仪，按照如下程序进行扩增：

2.5 PCR扩增结束后，将产物从PCR仪中取出，置于4℃冰箱内保存。

2.6将扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，检测是否扩增出来，扩增的目的条带大小为560bp。

2.7扩增出目的条带后，对扩增产物进行酶解测序，测序引物为5′-TGGCAATAGAACCTGGACAAC-3′。

2.8打开Mutation Surveyor软件，点击File，在GenBank Sequence File中加入NPM1基因Exon12上的参考序列，在Sample Files中输入NPM1基因突变测序的结果，点击OK。

2.9分析结束后，结果如下，此例标本为25种突变中的插入缺失突变c.868_869delinsCGCCTT。

3.设计定量的引物和探针

用ABI公司的Primer Express 3.0.1软件针对变异性位点设计引物探针，以NPM1基因c.863_864insTCTG(Type A)突变类型来说明。

3.1打开Primer Express 3.0.1软件，点击File出现如下的界面，在Type中可选择探针的类型，点击OK。

3.2进入File中的Sepuence界面，输入需要设计引物探针的序列，点击Tools中的Find Primers/Probes，就会出现可以使用的引物和探针序列，从中选取最优的引物和探针序列。

4.实时荧光定量PCR检测

4.1 RNA逆转成cDNA

4.1.1准备RT-PCR反应所需的试剂，将RNA放置于冰上备用，将特异性引物或随机引物、5×PrimeScript Buffer、PrimeScript RT Enzyme Mix I、RNase Free dH₂O从-20℃冰箱内取出，室温下融化并涡旋3-5秒，瞬时离心，使液体收集到管底。

4.1.2按表3配制每管内的反应体系，可先配制除样本RNA外的混合液，分装8μL到每管，再分别按操作记录加入样本RNA。

表3逆转录反应体系

成分	体积(μL)
		5×PrimeScript Buffer	4
随机引物	2
		PrimeScript RT Enzyme Mix I	1
RNase Free dH<sub>2</sub>O	1
		RNA	12
总体积	20

4.1.3打开Life Pro PCR仪，将盛有反应体系的8联管放置在金属模块上，按照表4程序进行反应：

表4逆转录PCR程序

4.1.4 PCR反应结束后，产物即为cDNA，可直接作为PCR反应的模板。将产物从PCR仪中取出，放置于4℃冰箱内暂存，以备后续实验，或冻存于-20℃。

4.2 qPCR

4.2.1准备PCR反应所需的试剂，将Taqman Fast Advanced Master Mix、ddH₂O从4℃冰箱中取出，将Primer&Probe混合液(2:1体积比)、cDNA从-20℃冰箱内取出，室温下融化并涡旋3-5秒，瞬时离心，使液体收集到管底。

4.2.2按样本数乘以“体积”栏中的数量，依需要多加上1-2个附加的反应，按照表1中体系配制预混液，分别分装15μl预混液于提前标记好的PCR管中，然后按操作记录顺序分别在对应的PCR孔中加入5μl待检样本cDNA、阴性对照样本(正常人cDNA)、空白对照(ddH₂O)。

4.2.3打开荧光定量PCR仪及电脑，按照需要设置好8联管摆放位置及荧光通道等，将盛有PCR反应体系的8联管放置在托盘架上，按照表2程序进行PCR扩增.

4.2.4 PCR完毕后，根据实际情况设置阈值线，分析扩增曲线，分别以NPM1和ABL1标准曲线来确定具体标本的NPM1拷贝数和ABL1拷贝数。

实施例3 NPM1基因突变检测引物、探针的优化实验

1、对内参基因ABL1探针进行优化，ABL1探针的荧光报告基团分别为FAM和VIC，淬灭探针为MGB，用8例正常人标本做比对实验，比对实验结果见表5，可见用FAM作为报告探针扩增效率优于VIC。

表5

内参基因	FAM-ABL(CT值)	VIC-ABL(CT值)
			N-1	25.65	26.94
N-2	24.89	26.16
			N-3	26.16	27.35
N-4	24.48	25.77
			N-5	24.60	25.97
N-6	25.03	26.42
			N-7	26.16	27.14
N-8	24.99	26.21

2、内参基因的选择优化实验

选取8例正常人的外周血，按照上述流程提取RNA，逆转成cDNA，分别用ABL1、ACTB和GAPDH这三个内参基因作比对实验，分别做三次重复，取3次检测结果CT值的平均值，实验结果见表6，可见ACTB的扩增效率明显优于ABL，而ABL的结果明显优于GAPDH，综合目前各种文献资料以及本实验的检测结果，最终选择将ABL作为内参基因。

表6

内参基因	ABL(CT值)	ACTB(CT值)	GAPDH(CT值)
				N-1	25.65	18.21	26.26
N-2	24.89	17.70	25.36
				N-3	26.16	19.09	27.17
N-4	24.48	18.23	25.60
				N-5	24.60	17.51	25.89
N-6	25.03	18.53	25.84
				N-7	26.16	19.18	27.04
N-8	24.99	18.11	25.53

3、PCR反应体系、反应条件的优化实验

3.1逆转录引物优化，用1例正常人和1例NPM1突变A型阳性患者标本提取RNA，分别用100uM随机引物、50uM Oligo(dT)、100uM特异性引物和ddH₂O进行逆转，对ABL基因进行扩增，做三次重复，取3次检测结果CT值的平均值，检测结果见表7，可见用100uM随机引物和100uM特异性引物逆转扩增效率基本上一致。

表7

逆转录引物	正常人(CT值)	NPM1突变A型患者(CT值)
			100uM随机引物	25.83	25.14
50uM Oligo(dT)	28.80	28.74
			100uM特异性引物	25.73	25.18
ddH<sub>2</sub>O	31.91	31.91

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 武汉海希生物科技有限公司

<120> NPM1基因突变检测试剂盒

<130> KHP201118318.5

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaagtggaag ccaaattcat caa 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccactgccag agatcgaata ttg 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctccactgc cagacagaga 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcctccact gccatgcag 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttcctccact gccaggcag 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcctccact gccacgcag 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttcctccact gccaagca 18

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttcctccac tgccatacag a 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttcctccact gcgcagcag 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttcctccact gcccggcag 19

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cttcctccac tgctctgcag a 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cttcctccac tgccctgcag a 21

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cttcctccac tgcccgacag aga 23

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttcctccact gcctggcag 19

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cctccactgc caaacaga 18

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcctccactg ccaagcagag a 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcctccactg ccatgcagag a 21

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gacttccttg aatagcctgg aaaga 25

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agacttcctc cactgcct 18

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cttcctccac tgcccgacag ag 22

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gacttcctcc acggaccggc agag 24

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gagacttcct ccacatcttg cca 23

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gagacttcct cgaaacgctg cca 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gagacttcct caaggcgctg cca 23

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gagactttag aaagagactg c 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gagacttgga aaagcactgc c 21

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aaagagactt gggcgaggca ctgc 24

<210> 28

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

attgcttccg gatgact 17

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ggtgaaaagc tccgggtctt 20

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

acccagcctt ggccattt 18

<210> 31

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aatggtgtga agccca 16

Claims

1.NPM1基因突变检测引物，其特征在于，包括1条用于扩增NPM1基因的正向引物，1条用于扩增野生型NPM1基因的反向引物和25条用于扩增NPM1突变基因的反向引物，它们的引物序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3-27所示。

2.与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于，探针NPM1-Probe序列如下：

NPM1-Probe：5'-F-ATTGCTTCCGGATGACT-Q-3'；

其中，F为荧光基团，Q为荧光淬灭基团。

3.含有权利要求1所述引物和/或的权利要求2所述探针的检测试剂或试剂盒。

4.NPM1基因突变qPCR检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述引物和权利要求2所述探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含内参基因Abelson检测引物和探针，引物和探针序列如下：

ABL-F：5'-GGTGAAAAGCTCCGGGTCTT-3'

ABL-R：5'-ACCCAGCCTTGGCCATTT-3'

ABL-Probe：5'-F-AATGGTGTGAAGCCCA-Q-3'；

其中，F为荧光基团，Q为荧光淬灭基团。

6.用于NPM1基因突变qPCR检测的反应体系，其特征在于，所述反应体系为：2×TaqManFast Advanced Master Mix 10μl，100μM正向引物0.5μl，100μM反向引物0.5μl，100μM探针0.25μl，cDNA 5μl，无核酶水3.75μl。