CN112063698A - 检测npm1-rara融合基因表达量的寡核苷酸和方法 - Google Patents

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陈雪青
王淑一
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明提供了一种检测急性早幼粒白血病患者体内NPM1‑RARa融合基因的表达水平寡核苷酸和检测方法，包括检测NPM1‑RARa‑1，NPM1‑RARa‑2融合基因的引物和探针。本发明采用实时荧光PCR技术及利用目标基因和内参基因的检测引物和探针的双标准曲线法，可用于检测APL患者体内融合基因NPM1‑RARa‑1和NPM1‑RARa‑2的表达水平。不仅能有效节约检测时间，提高检测精度。同时可作为APL个体化治疗方案的选择和制定的依据之一，对调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、及时干预治疗避免血液学复发都具有重要意义，且便于临床开展个体化治疗。

Description

检测NPM1-RARA融合基因表达量的寡核苷酸和方法
技术领域
本专利涉及分子检测诊断领域，特别设计采用探针Taqman实时荧光定量PCR技术检测NPM1-RARA融合基因情况的寡核苷酸、试剂盒和检测方法。
背景技术
急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是AML(acutemyeloid 1eukemia)的一个特殊亚型M3型，约占AML的15％，发病年龄以20岁以上中青年为主，病程凶险，有较高的出血倾向和早期死亡率。95％以上的APL患者可见其15号染色体和17号染色体易位，形成特征性的t(15；17)(q22；q21)，即PML-RARa融合基因，是APL特征性遗传学标志。
PML-RARa融合基因编码的PML-RARa蛋白可与RXRa形成二聚体，竞争野生型的RARa与RXRa的结合，阻止粒细胞分化和成熟，同时异常早幼粒细胞凋亡不足，从而在骨髓中堆积大量的异常早幼粒细胞。全反式维甲酸(ATRA)和亚砷酸(ATO)是APL的主要治疗方案，两者联合应用可使APL的完全缓解率(CR)达到90％以上。研究发现ATRA可靶向降解PML-RARa融合蛋白，恢复野生型RARa和PML基因功能，重新诱导粒细胞分化成熟。ATO可作用于PML，诱导PML-RARa融合蛋白和野生型PML蛋白快速降解。两种药物协同作用且无交叉耐药，治疗效果好，使APL成为临床可治愈的急性髓细胞白血病。
虽然95％以上APL患者均具有PML-RARa融合基因，但仍有约5％的患者缺乏该融合基因，称为不典型APL患者。不典型APL患者中发现RARa与其它伙伴基因的融合，目前研究报道共有13种，分别为NPM1-RARa、PLZF-RARa、BCOR-RARa、FIP1L1-RARa、NuMA-RARa、PRKAR1A-RARa、OBFC2A-RARa、STAT5B-RARa、GTF2I-RARa、IRF2BP2-RARa、TBLR1-RARa、FNDC3B-RARa和TFG-RARa融合基因。尽管这些融合基因均与RARa相关，但由于其伙伴基因不同，它们对ATRA和ATO治疗的反应性不一，其中伴有PLZF-RARa和STAT5B-RARa融合基因的APL患者对ATRA治疗不敏感或耐受，整体治疗效果不佳，预后不良。伴有BCOR-RARa融合基因的APL患者对ATRA敏感但对ATO耐受，而伴有NPM1-RARa融合基因的APL患者对ATRA敏感。
APL患者进行融合基因筛查有助于临床诊断，且根据融合基因的类型选择治疗方案可避免过度治疗，比如伴有PLZF-RARa和STAT5B-RARa融合基因的APL患者，因为对ATRA治疗不敏感，因此不能按照常规APL治疗方案进行治疗。针对患者的融合基因类型进行个体化治疗，可提高治疗有效率，降低医疗费用，提高患者生存率。
目前融合基因多是用荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)方法、细胞遗传学(常规染色体检测)及荧光原位杂交技术等方法检测，每种方法各有其优势和不足。细胞遗传学方法可以检测变异型或隐匿性的染色体异常以及伴随的复杂染色体异常，这些信息对临床预后有一定的指导意义,但对某些融合基因的分型无法区分。实时荧光定量PCR是目前最常用的方法。其优点是特异性好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有比较大的线性范围等优点。对融合基因的定量可以检测微小残留病灶，为病情进展，治疗效果提供依据；缺点是由于影响因素较多，假阳性和假阴性率较高，引物的设计也影响检出。FISH方法检测比实时荧光定量PCR更加直观，但相较而言，FISH的灵敏度较低，而且只能定性。本研究采用实时荧光定量PCR法，将实时荧光定量PCR技术结合Tapman探针，利用双标准曲线的方法，构建内参基因ABL和目的基因NPM1-RARa的定量标准曲线，检测受测者体内RARa相关融合基因的表达。
发明内容
本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，用实时荧光PCR技术检测NPM1-RARa融合基因的两种融合类型NPM1-RARa-1和NPM1-RARa-2。通过调整引物、探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。可用于制定APL个体化治疗方案。
本发明目的之一是提供了一种利用荧光定量PCR技术检测NPM1-RARa融合基因相对表达量的寡核苷酸，包括检测目的基因NPM1-RARa-1和NPM1-RARa-2用的上游引物NPM1-RARa-1-F、NPM1-RARa-2-F和共用的下游引物RARa-R，探针为RARa-Probe；检测内参基因Abl用的上下游引物为Abl-F、Abl-R和探针为Abl-Probe。具体的引物及探针碱基序列如下：
NPM1-RARa-1-F:5’-CCTACCTAAGTGCGTGCC-3’；
NPM1-RARa-2-F:5’-GCATATTAGTGGACAGCACTTAG-3’；
RARA-R:5’-GTGGTAGCCTGAGGACTTGT-3’；
RARA-Probe:5’-FAM-AGACCCAGAGCAGCAGTTCTGAAGAGA-TAMRA-3’；
Abl-F:5’-GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG-3’；
Abl-R:5’-ATGATATAGAACGGGGGCTC-3’；
Abl-Probe:5’-FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA-3’。
本发明还提供了一种检测NPM1-RARa融合基因相对表达量的方法，包括
(1)提取样本中的RNA；
(2)将(1)提取出的RNA逆转录为cDNA；
(3)加入(2)中所述的cDNA到反应管中，利用检测用上游引物NPM1-RARa-1-F、NPM1-RARa-2-F和共用的下游引物RARa-R，以及利用检测内参基因Abl的上下游引物为Abl-F、Abl-R和探针为Abl-Probe定量检测样本中的Abl表达量，具体的引物及探针碱基序列如下：
NPM1-RARa-1-F:5’-CCTACCTAAGTGCGTGCC-3’；
NPM1-RARa-2-F:5’-GCATATTAGTGGACAGCACTTAG-3’；
RARA-R:5’-GTGGTAGCCTGAGGACTTGT-3’；
RARA-Probe:5’-FAM-AGACCCAGAGCAGCAGTTCTGAAGAGA-TAMRA-3’；
Abl-F:5’-GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG-3’；
Abl-R:5’-ATGATATAGAACGGGGGCTC-3’；
Abl-Probe:5’-FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA-3’。
(4)计算样本中NPM1-RARa-1-F、NPM1-RARa-2-F融合基因的相对表达量。
本发明还提供了一种定量检测样本中NPM1-RARa融合基因相对表达量的试剂盒，所述试剂盒包括样本RNA提取液；红细胞裂解液；检测体系PCR反应液；阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD Probe qPCR Mix、检测目的基因NPM1-RARa-1和NPM1-RARa-2用的上游引物NPM1-RARa-1-F、NPM1-RARa-2-F和共用的下游引物RARa-R，探针为RARa-Probe；检测内参基因Abl用的上下游引物为Abl-F、Abl-R和探针为Abl-Probe。具体的引物及探针碱基序列如下：
NPM1-RARa-1-F:5’-CCTACCTAAGTGCGTGCC-3’；
NPM1-RARa-2-F:5’-GCATATTAGTGGACAGCACTTAG-3’；
RARA-R:5’-GTGGTAGCCTGAGGACTTGT-3’；
RARA-Probe:5’-FAM-AGACCCAGAGCAGCAGTTCTGAAGAGA-TAMRA-3’；
Abl-F:5’-GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG-3’；
Abl-R:5’-ATGATATAGAACGGGGGCTC-3’；
Abl-Probe:5’-FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA-3’。
进一步地，所述试剂盒还包括红细胞裂解液，所述红细胞裂解液包括16μmol/L氯化铵、1mmol/L碳酸氢钾和12.5μmol/L EDTA。
进一步地，所述试剂盒还包括样本RNA提取液，所述样本RNA提取液包括TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNase-free水。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
进一步地，所述阳性对照品为含NPM1-RARa-1，NPM1-RARa-2质粒溶液；阴性对照品：不含NPM1-RARa-1，NPM1-RARa-2融合基因溶液；所述空白对照品为去离子水。
本发明的有益效果：本发明将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因Abl和目的基因NPM1-RARa-1，NPM1-RARa-2的定量标准曲线，检测受测者体内NPM1-RARa-1，NPM1-RARa-2的相对于内参基因的表达水平。本试剂盒将两种融合类型的探针和下游引物均设在RARa基因的第3外显子上，针对其融合类型设计了特异性上游引物，如此设计可降低检测成本，减少操作时间和步骤。相比于以往的FISH和△△CT法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于临床上APL患者体内NPM1-RARa-1，NPM1-RARa-2融合基因表达量及微量残留检测，对于调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、及时干预治疗避免血液学复发等都具有重要意义。
附图说明
图1以NPM1-RARa-1阳性质粒为模板绘制的标准扩增曲线图。
图2以NPM1-RARa-2阳性质粒为模板绘制的标准扩增曲线图。
图3以Abl阳性质粒为模板绘制的标准扩增曲线图。
图4白血病1号样本NPM1-RARa-1的检测结果图。
图5白血病1号样本NPM1-RARa-2的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
用于检测样本中NPM1-RARa-1，NPM1-RARa-2相对表达量的核酸检测方法，可用于辅助临床上急性粒细胞白血病的诊断及个体化治疗方案的制定，还可对患者预后进行预测。该检测的试剂和试剂盒中的成分包括包括：
(1)RNA提取试剂，RNAsimple Total RNA kit(TIANGEN)
(2)RNA逆转录试剂，ReverTra Ace qPCR RT Kit试剂盒(TOYOBO公司)。
(3)检测体系PCR反应液，THNDERBIRD Probe qPCR Mix(2×)(TOYOBO公司)。
检测目的基因用上下游引物NPM1-RARa-1-F，NPM1-RARa-2-F，RARa-R，探针为RARa-Probe；检测内参基因Abl用引物为Abl-F，Abl-R，探针为Abl-Probe。具体的引物及探针碱基序列如下：
NPM1-RARa-1-F:5’-CCTACCTAAGTGCGTGCC-3’；
NPM1-RARa-2-F:5’-GCATATTAGTGGACAGCACTTAG-3’；
RARA-R:5’-GTGGTAGCCTGAGGACTTGT-3’；
RARA-Probe:5’-FAM-AGACCCAGAGCAGCAGTTCTGAAGAGA-TAMRA-3’；
Abl-F:5’-GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG-3’；
Abl-R:5’-ATGATATAGAACGGGGGCTC-3’；
Abl-Probe:5’-FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA-3’。
所述阳性对照品为含NPM1-RARa-1，NPM1-RARa-2质粒溶液；阴性对照品：不含NPM1-RARa-1，NPM1-RARa-2融合基因溶液；所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。
实施例2
1.样本外周血或骨髓总RNA提取操作流程：
(1)采集抗凝新鲜血液或骨髓1ml，登记好年龄、性别；
(2)直接取新鲜血液或骨髓，加入3倍体积RZ(推荐0.25ml血液+0.75ml RZ)，充分振荡混匀。
(3)将匀浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
(4)可选步骤：4℃12,000rpm(～13,400×g)离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。
(5)加入200μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min。
(6)4℃ 12,000rpm(～13,400×g)离心10min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液RZ试剂的50％。把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(7)缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，4℃ 12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱CR3，请分两次转入吸附柱CR3中，4℃ 12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃掉收集管中的废液。
(8)向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RD(使用前请先检查是否已加入乙醇)，4℃12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液，将CR3放入收集管中。
(9)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，4℃ 12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。
(10)重复操作步骤9
(11)将吸附柱放入2ml收集管中，4℃ 12,000rpm(～13,400×g)离心2min，去除残余液体。
(12)将吸附柱CR3转入一个新的1.5ml离心管中，加30μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，4℃ 12,000rpm(～13,400×g)离心2min。
(13)测定RNA浓度及纯度，-80℃保存备用。
2.将RNA逆转录为cDNA
参考TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将步骤1中获得的RNA逆转录为cDNA，-20℃保存备用。
3.荧光定量PCR检测
(1)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各XμL，每人份23μL分装，且每人份检测2次：
X＝23μL检测体系PCR反应液×2×(6份Abl内参基因校准品+6份目的基因校准品+n份样本)+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照；其中，6份目的基因校准品指的是108、107、106、105、104、103copies/μL的NPM1-RARa-1和NPM1-RARa-2阳性质粒溶液，每份目的基因校准品都需要检测2次，用于绘制针对NPM1-RARa-1和NPM1-RARa-2融合基因的标准曲线(如图1和图2所示)；6份Abl内参基因校准品指的是108、107、106、105、104、103copies/μL的Abl阳性质粒溶液，每份Abl内参基因校准品都需要检测2次，用于绘制针对Abl内参基因的标准曲线(如图3所示)。
(2)加样：加入检测体系PCR反应液中2μL cDNA；阳性对照和阴性对照直接加2μL阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μL生理盐水或不加任何物质。
(3)检测：在实时荧光PCR仪上进行检测，可用仪器包括ABI7300，7500(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃ 15s，60℃ 40sec 40个循环，荧光信号于60℃ 40sec时采集。
(4)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数，然后按照下列原则进行判断：
1)内参阳性时，检测结果才认为有效；
2)阳性判断标准：Ct<36，为阳性；35≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞38，为阴性。
实施例3
1.灵敏度测试
NPM1-RARa-1、NPM1-RARa-2分别以1000、100、10拷贝数的质粒作为模板进行实验，每个浓度重复10管进行灵敏度测试。结果发现NPM1-RARa-1和NPM1-RARa-2的检测灵敏度均为100copies/μL。
2.特异度测试
取送检的健康体检人群外周血样本11例，按实施例2所述方法提取RNA、进行逆转录、配制试剂并进行荧光定量PCR检测。
对每份样本而言，取2μL经逆转录获得的cDNA，加入到检测体系PCR反应液中。同时做阳性、阴性、空白对照各一份，内参基因/目的基因的标准曲线各两份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测16份样本，每份样本重复2次，一份阳性对照品，一份阴性对照品和一份空白对照品。
检测结果发现11例样本中所有样本的Abl均起线，但NPM1-RARa-1、NPM1-RARa-2未有标本出现起线。
表1健康体检标本检测结果
Figure BDA0002658954700000081
实施例4
取送检的白血病患者外周血或骨髓样本11例，按实施例2所述方法提取RNA、进行逆转录、配制试剂并进行荧光定量PCR检测。
对每份样本而言，取2μL经逆转录获得的cDNA，加入到检测体系PCR反应液中。同时做阳性、阴性、空白对照各一份，内参基因/目的基因的标准曲线各两份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测16份样本，每份样本重复2次，一份阳性对照品，一份阴性对照品和一份空白对照品。
检测结果发现11例样本中所有样本的Abl均起线，但NPM1-RARa-1、NPM1-RARa-2未有标本出现起线。
表2健康体检标本检测结果
Figure BDA0002658954700000082
序列表
<110> 福州艾迪康医学检验所有限公司
<120> 检测NPM1-RARA融合基因表达量的寡核苷酸和方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctacctaag tgcgtgcc 18
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatattagt ggacagcact tag 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtggtagcct gaggacttgt 20
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agacccagag cagcagttct gaagaga 27
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccgtgaaga ccttgaagga g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgatataga acgggggctc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acctggtgca gctccttggg 20

Claims (4)

1.一种利用荧光定量PCR技术检测NPM1-RARa融合基因相对表达量的寡核苷酸，包括检测目的基因NPM1-RARa-1和NPM1-RARa-2用的上游引物NPM1-RARa-1-F、NPM1-RARa-2-F和共用的下游引物RARa-R，探针为RARa-Probe；具体的引物及探针碱基序列如下：
NPM1-RARa-1-F:5’-CCTACCTAAGTGCGTGCC-3’；
NPM1-RARa-2-F:5’-GCATATTAGTGGACAGCACTTAG-3’；
RARA-R:5’-GTGGTAGCCTGAGGACTTGT-3’；
RARA-Probe:5’-FAM-AGACCCAGAGCAGCAGTTCTGAAGAGA-TAMRA-3’。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，还包括检测内参基因Abl用的上下游引物为Abl-F、Abl-R和探针为Abl-Probe；具体的引物及探针碱基序列如下：
Abl-F:5’-GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG-3’；
Abl-R:5’-ATGATATAGAACGGGGGCTC-3’；
Abl-Probe:5’-FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA-3’。
3.一种检测NPM1-RARa融合基因相对表达量的方法，包括
(1)提取样本中的RNA；
(2)将(1)提取出的RNA逆转录为cDNA；
(3)加入(2)中所述的cDNA到反应管中，利用检测用上游引物NPM1-RARa-1-F、NPM1-RARa-2-F和共用的下游引物RARa-R，以及利用检测内参基因Abl的上下游引物为Abl-F、Abl-R和探针为Abl-Probe定量检测样本中的Abl表达量，具体的引物及探针碱基序列如下：
NPM1-RARa-1-F:5’-CCTACCTAAGTGCGTGCC-3’；
NPM1-RARa-2-F:5’-GCATATTAGTGGACAGCACTTAG-3’；
RARA-R:5’-GTGGTAGCCTGAGGACTTGT-3’；
RARA-Probe:5’-FAM-AGACCCAGAGCAGCAGTTCTGAAGAGA-TAMRA-3’；
Abl-F:5’-GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG-3’；
Abl-R:5’-ATGATATAGAACGGGGGCTC-3’；
Abl-Probe:5’-FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA-3’；
(4)计算样本中NPM1-RARa-1-F、NPM1-RARa-2-F融合基因的相对表达量。
4.根据专利要求3所述的方法，其特征在于，然后按照下列原则进行判断：
1)内参阳性时，检测结果才认为有效；
2)阳性判断标准：Ct<36，为阳性；35≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞38，为阴性。
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