CN106929504A - 检测急性早幼粒细胞白血病相关融合基因的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测急性早幼粒细胞白血病相关融合基因的试剂盒。具体而言，提供一种基于二代测序技术的、可同时检测急性早幼粒细胞白血病(APL)相关的多种RARα融合基因的检测试剂盒、基因检测方法，以及用于上述检测方法的二代测序DNA文库的构建方法、建库试剂盒。本发明的检测试剂盒包含用于构建二代测序DNA文库的试剂，以及用于对二代测序DNA文库进行上机测序的试剂。
Description
技术领域
本发明涉及可同时检测多种急性早幼粒细胞白血病相关融合基因的试剂盒及检测方法，属于分子检测技术领域。
背景技术
急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocyte leukemia，APL)是一种有着特异基因与染色体核型改变的特殊类型急性白血病。临床表现凶险，起病及治疗过程中容易发生出血和栓塞而引起死亡。近二十年来，由于全反式维甲酸(ATRA)及砷剂的临床应用，APL已成为可以治愈的白血病之一。APL易见于中青年人，平均发病年龄为39岁，流行病学研究证实国外APL发病率占同期白血病的5.0％～23.8％，占急性髓系白血病(AML)的6.2％～40.2％。国内多位学者报道发病率占同期急性白血病的3.3％～21.2％。
在基因检测方面，检测融合基因是诊断APL的最特异、敏感的方法之一，也是APL治疗方案选择、疗效分析、预后分析和复发预测最可靠的指标。
在APL相关融合基因检测方面，需要首先提取血液或骨髓中的总RNA并反转录得到cDNA，然后针对每种融合基因设计特异Taqman探针进行实时荧光定量PCR扩增检测，或者利用多重巢式RT-PCR定性检测多种融合基因。前一种方法的缺点是检测通量受限且样本需求量大；后一种方法的缺点是流程繁琐、耗时长。
因此，迫切希望开发出新的APL相关融合基因的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的基于二代测序的APL相关融合基因检测方法、检测试剂盒，以及构建用于上述检测方法的二代测序DNA文库的方法、建库试剂盒。
即，本发明包括：
1.一种用于APL相关融合基因检测的二代测序DNA文库的构建方法，该方法包括：
步骤A：将希望进行测序的cDNA进行末端修复，得到平末端DNA片段，该cDNA是由从人血液或骨髓样本中提取的总RNA反转录得到的；
步骤B：将平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；
步骤C：将所述3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；以及
步骤D：将所述加接头DNA片段进行第一次PCR扩增，得到第一次扩增产物；
步骤E：将所述第一次扩增产物进行巢式PCR扩增，得到第二次扩增产物；
其中，
所述步骤C中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQID NO:2所示的单链DNA的退火产物作为所述接头；
所述步骤D中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:51～62所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA作为PCR扩增引物；
所述步骤E中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:31～42所示的单链DNA、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA作为PCR扩增引物。
2.根据项1所述的方法，其中，在所述步骤A之前还包括下述步骤：
从人血液或骨髓样本中提取的总RNA，并由该总RNA反转录得到cDNA第一链和cDNA第二链。
3.根据项1所述的方法，其中，在所述步骤C与步骤D之间、步骤D与步骤E之间、和/或所述步骤E之后还包括对产物进行纯化的步骤。
4.一种APL相关融合基因检测方法，该方法包括下述步骤：
步骤A：将希望进行测序的cDNA进行末端修复，得到平末端DNA片段，该cDNA是由从人血液或骨髓样本中提取的总RNA反转录得到的；
步骤B：将平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；
步骤C：将所述3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；以及
步骤D：将所述加接头DNA片段进行第一次PCR扩增，得到第一次扩增产物；
步骤E：将所述第一次扩增产物进行巢式PCR扩增，得到第二次扩增产物；以及
步骤F：对所述第二次扩增产物进行二代测序，并基于测序结果进行生物信息学分析；
其中，
所述步骤C中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQID NO:2所示的单链DNA的退火产物作为所述接头；
所述步骤D中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:51～62所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA作为PCR扩增引物；
所述步骤E中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:31～42所示的单链DNA、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的单链DNA(index引物)以及核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA(公共引物)作为PCR扩增引物。
5.根据项4所述的方法，其中，在所述步骤A之前还包括下述步骤：
从人血液或骨髓样本中提取的总RNA，并由该总RNA反转录得到cDNA第一链和cDNA第二链。
6.根据项4所述的方法，其中，在所述步骤C与步骤D之间、步骤D与步骤E之间、和/或所述步骤E之后还包括对产物进行纯化的步骤。
7.根据项4所述的方法，其中，所述APL相关融合基因包括非典型APL中出现的PLZF-RARα、NuMA-RARα、NPM1-RARα、Stat5b-RARα、F1P1L1-RARα、PRKAR1A-RARα、BCOR-RARα和典型APL中出现的PML-RARα。
8.一种用于APL相关融合基因检测的二代测序DNA文库构建的试剂盒，其包含用于二代测序DNA文库构建的试剂，所述用于二代测序DNA文库构建的试剂包含：
核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的单链DNA，或者它们的退火产物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:31～42所示的单链DNA；
核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的单链DNA；
核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA；以及
核苷酸序列如SEQ ID NO:51～62所示的单链DNA。
9.根据项8所述的试剂盒，其还包含用于从人血液或骨髓样本中提取的总RNA、并由该总RNA反转录得到cDNA第一链和cDNA第二链的试剂。
10.根据项8所述的试剂盒，其中，所述用于构建二代DNA测序文库的试剂还包括选自下组中的至少一种或两种以上：T4DNA聚合酶、Klenow片段、Klenow缓冲液、DNA连接酶缓冲液、DNA连接酶、Taq酶、dNTP、T4多聚核苷酸激酶、以及T4多聚核苷酸激酶缓冲液。
11.根据项9所述的试剂盒，其中，所述用于从人血液或骨髓样本中提取的总RNA、并由该总RNA反转录得到cDNA第一链和cDNA第二链的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、乙醇、无RNA酶的双蒸水、随机引物、反转录酶、反转录反应缓冲液、RNA酶抑制剂、dNTP、DNA聚合酶以及核糖核酸酶H。
12.一种用于APL相关融合基因检测的试剂盒，其包含：
用于构建二代测序DNA文库的试剂，以及
用于对二代测序DNA文库进行上机测序的试剂；
其中，所述用于构建二代测序DNA文库的试剂包含：
核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的单链DNA，或者它们的退火产物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:31～42所示的单链DNA；
核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的单链DNA；
核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA；以及
核苷酸序列如SEQ ID NO:51～62所示的单链DNA。
13.根据项12所述的试剂盒，其还包含用于从人血液或骨髓样本中提取的总RNA、并由该总RNA反转录得到cDNA第一链和cDNA第二链的试剂。
14.根据项12所述的试剂盒，其中，所述用于构建二代DNA测序文库的试剂还包括选自下组中的至少一种或两种以上：T4DNA聚合酶、Klenow片段、Klenow缓冲液、DNA连接酶缓冲液、DNA连接酶、Taq酶、dNTP、T4多聚核苷酸激酶、以及T4多聚核苷酸激酶缓冲液。
15.根据项12所述的试剂盒，其中，所述用于从人血液或骨髓样本中提取的总RNA、并由该总RNA反转录得到cDNA第一链和cDNA第二链的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、乙醇、无RNA酶的双蒸水、随机引物、反转录酶、反转录反应缓冲液、RNA酶抑制剂、dNTP、DNA聚合酶以及核糖核酸酶H。
16.根据项12所述的试剂盒，其中，所述对二代测序DNA文库进行上机测序的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上：再合成试剂、线性化P7接头、线性化P5接头、DNA聚合酶、dNTP、冲洗杂交液/缓冲液、100％甲酰胺(质量/体积)、用于测序的Read 2引物、Indexi7测序引物、用于测序的Read 1引物、Hiseq Rapid PE Flow Cell、水、以及增强光感度/照相用试剂。
17.根据项8～11中任一项所述的试剂盒，其用于实施项1～3中任一项所述的方法。
18.根据项12～16中任一项所述的试剂盒，其用于实施项4～7中任一项所述的方法。
发明效果
根据本发明，可以基于二代测序技术同时检测多种APL相关融合基因，为急性早幼粒细胞白血病(APL)的诊断、微小残留病(MRD)的判断提供分子检测基础。
发明的具体实施方式
在一个方面中，本发明提供一种用于APL相关融合基因检测的二代测序DNA文库的构建方法(本发明的建库方法)，该方法包括：
步骤A：将希望进行测序的cDNA进行末端修复，得到平末端DNA片段，该cDNA是由从人血液或骨髓样本中提取的总RNA反转录得到的；
步骤B：将平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；
步骤C：将所述3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；以及
步骤D：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物；
其中，
所述步骤C中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQID NO:2所示的单链DNA的退火产物作为所述接头(P5接头)；
所述步骤D中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:51～62所示的单链DNA(GSP1引物池)以及核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA(公共引物)作为PCR扩增引物；
所述步骤E中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:31～42所示的单链DNA(GSP2引物池)、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的单链DNA(Index引 物)以及核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA(公共引物)作为PCR扩增引物。
在本说明书中，APL是指急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocyteleukemia)。APL相关融合基因是急性早幼粒细胞白血病特异性标志。通过采用本发明，理论上只要是与RARα发生融合或存在断裂点的突变，都能检出，包括但不限于：非典型APL中出现的PLZF-RARα、NuMA-RARα、NPM1-RARα、Stat5b-RARα、F1P1L1-RARα、PRKAR1A-RARα、BCOR-RARα和典型APL中出现的PML-RARα。
优选地，本发明的建库方法在所述步骤A之前还包括下述步骤：从人血液或骨髓样本中提取总RNA，并由该总RNA反转录得到cDNA第一链和cDNA第二链。对于该步骤中采用的具体方法没有特殊限制，可以采用本领域技术人员通常采用的那些方法，例如，可以使用Trizol试剂按标准操作流程提取总RNA，然后不进行DNase消化及mRNA钓取纯化，直接用随机引物进行反转录。
所述步骤A及步骤B可以通过本技术领域的常规方法来进行。
在所述步骤C中，使用核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的单链DNA的退火产物作为接头来进行加接头。该步骤可以使用DNA连接酶(例如T4DNA连接酶)在相应的反应体系中进行。
在所述步骤D、E中，使用上述各单链DNA作为PCR扩增引物来进行PCR扩增。该步骤可以使用DNA聚合酶(例如Ex taq DNA聚合酶)在相应的反应体系中进行。
优选地，在所述步骤C与步骤D之间、所述步骤D与步骤E、和/或所述步骤E之后还包括对产物进行纯化的步骤。所述纯化步骤可以按本技术领域通常采用的方法进行，例如进行磁珠纯化。
本发明的建库方法可以例如使用试剂盒来实施，因此，在另一个方面中，本发明提供一种用于APL相关融合基因检测的二代测序DNA文库构建的试剂盒(本发明的建库试剂盒)，其可用于实施本发明的建库方法，其包含用于构建二代测序DNA文库的试剂，所述用于构建二代测序DNA文库的试剂包含：
核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的单链DNA，或者它们的退火产物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:31～42所示的单链DNA、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA；以及
核苷酸序列如SEQ ID NO:51～62所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA。
优选地，所述用于构建二代DNA测序文库的试剂还包括选自下组中的至少一种或两种以上：T4DNA聚合酶、Klenow片段、Klenow缓冲液、DNA连接酶缓冲液、DNA连接酶、Taq酶、dNTP、T4多聚核苷酸激酶、以及T4多聚核苷酸激酶缓冲液。
优选地，本发明的建库试剂盒还可以包含用于从人血液或骨髓样本中提取的总RNA、并由该总RNA反转录得到cDNA第一链和cDNA第二链的试剂。优选地，所述用于从人血液或骨髓样本中提取的总RNA、并由该总RNA反转录得到cDNA第一链和cDNA第二链的试剂包括选自下组中的至少一种 或两种以上：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、乙醇、无RNA酶的双蒸水、随机引物、反转录酶、反转录反应缓冲液、RNA酶抑制剂、dNTP、DNA聚合酶以及核糖核酸酶H。
通过对所得的PCR第二次扩增产物进行二代测序，可以知晓样本中是否存在APL相关融合基因中的任意一种或两种以上，从而进行APL相关融合基因的检测，为急性早幼粒细胞白血病(APL)的诊断、微小残留病(MRD)的判断提供分子检测基础。需要说明的是，本发明的建库方法本身并不包含任何检测或诊断步骤。
在另一方面中，本发明提供一种APL相关融合基因检测方法(本发明的检测方法)，该方法包括下述步骤：
步骤A：将希望进行测序的cDNA进行末端修复，得到平末端DNA片段，该cDNA是由从人血液或骨髓样本中提取的总RNA反转录得到的；
步骤B：将平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；
步骤C：将所述3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；以及
步骤D：将所述加接头DNA片段进行第一次PCR扩增，得到第一次扩增产物；
步骤E：将所述第一次扩增产物进行巢式PCR扩增，得到第二次扩增产物；以及
步骤F：对所述第二次扩增产物进行二代测序，并基于测序结果进行生物信息学分析；
其中，
所述步骤C中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQID NO:2所示的单链DNA的退火产物作为所述接头；
所述步骤D中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:51～62所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA作为PCR扩增引物；
所述步骤E中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:31～42所示的单链DNA、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的单链DNA(index引物)以及核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA(公共引物)作为PCR扩增引物。
即，本发明的检测方法可以在本发明的建库方法的基础上增加所述步骤F。在所述步骤F中，对所述第二次扩增产物进行二代测序，并基于测序结果进行生物信息学分析。这里，二代测序可以采用本技术领域的常规方法来进行，例如，二代测序可以利用Illumina平台(例如HiSeq 2500或NextSeq 500)进行。然后，基于测序结果进行生物信息学分析，所述生物信息学分析例如可以这样进行：获取测序获得的reads中与RARα基因外显子或其片段连接区域的核苷酸序列的信息，然后将该核苷酸序列信息与参考基因组核苷酸序列信息进行比对，由此确定RARα基因是否发生了基因融合以及与之融合的基因(参考基因组hg19)。
本发明的检测方法可以例如使用试剂盒来实施，因此，在另一个方面中，本发明提供一种用于APL相关融合基因检测的试剂盒(本发明的检测试剂盒)，其包含：
用于构建二代测序DNA文库的试剂，以及
用于对二代测序DNA文库进行上机测序的试剂；
其中，所述用于构建二代测序DNA文库的试剂包含：
核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的单链DNA，或者它们的退火产物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:31～42所示的单链DNA、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA；以及
核苷酸序列如SEQ ID NO:51～62所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA。
即，本发明的检测试剂盒可以在本发明的建库试剂盒的基础上，增加用于对所构建的二代测序DNA文库进行上机测序的试剂。作为所述对二代测序DNA文库进行上机测序的试剂，包括但不限于选自下组中的至少一种或两种以上：再合成试剂、线性化P7接头、线性化P5接头、DNA聚合酶、dNTP、冲洗杂交液/缓冲液、100％甲酰胺(质量/体积)、用于测序的Read 2引物、Index i7测序引物、用于测序的Read 1引物、Hiseq Rapid PE Flow Cell、水、以及增强光感度/照相用试剂。
在本发明的建库试剂盒及检测试剂盒中，各试剂或装置优选单独包装，但在不影响本发明的实施的前提下，也可以混合包装。
实施例
以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以250ng总RNA起始建库，单一样本单一反应。样本编码RNR130626(样本1，临床患者)、RNR130627(样本2，临床患者)、HC14CS00067(样 本3，健康人)250ng总RNA未经DNase消化及mRNA钓取纯化，直接随机引物反转录，实验流程如下：
1.总RNA提取
从以上3份样本(200μL)中提取总RNA，完全按照Trizol试剂提取标准操作流程进行RNA提取，无需DNase消化及mRNA调取纯化，直接随机引物反转录。
2.反转录第一链的合成
1)向1μg总RNA(2μL)中加入1.0μL N6primer(0.1μg/μL)，12μL无RNAase的水。
2)在65℃，5分钟变性RNA二级结构后，立即置于冰上。
3)在0.2mLPCR管中按照下列的配比准备反应混合物：
4)混匀后在PCR仪上按照以下程序进行反应：
反应结束后，将将合成的cDNA一链产物用Ampure XP Beads(1.8×)进行回收，EB溶解，EB体积为21μL。
5×First strand buffer试剂来自于Invitrogen公司。
3.反转录第二链的合成
1)将合成的cDNA一链产物置于冰上共20μL
2)按照下列的配比准备反应混合物：
5×Second strand buffer试剂来自于Invitrogen公司。
混合均匀后，置于16℃Thermomixer上2小时(300rpm间歇振动15秒，静止2分钟)。
反应结束后，将将合成的cDNA二链产物用Ampure XP Beads(1.8×)进行回收，EB溶解，EB体积为37μL。
4.末端修复
按照下列的配比准备反应混合物：
在thermomixer 20℃条件下反应30分钟，将反应产物用Ampure XP Beads(1.8×)进行回收，EB溶解，EB体积为33μL。
10×PNK buffer来自Enzymatics公司
5.cDNA3'末端加“A”碱基
按照下列的配比准备反应混合物
在thermomixer37℃条件下反应30分钟。将反应产物用Ampure XP Beads(1.8×)进行回收，EB溶解，EB体积为20μL。
10×blue buffer来自Enzymatics公司。
6.Adapter连接
按照下列的配比准备反应混合物
在thermomixer20℃条件下反应15分钟，将反应产物用Ampure XP Beads(1.8×)进行回收，EB溶解，EB体积为20μL。
所述Adapter为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的退火产物。
2×Rapid buffer来自Enzymatics公司。
7.第一轮PCR
1)按照下列的配比准备反应混合物。
2)将反应管置于冰上，加入以下成分，反复吹打6–8次。
3)按下表进行PCR反应：
4)磁珠纯化
按照磁珠纯化标准流程，加入40μLXP beads到50μL反应液中。
最后用20μL 10mM Tris-HCl洗脱。
HiFi DNA Polymerase Mix来自kapa biosystems公司。
8.第二轮PCR(巢式PCR)
1)按照下列的配比准备反应混合物。
2)将反应管置于冰上，加入以下成分，反复吹打6–8次。
3)按下表进行PCR反应：
4)磁珠纯化同步骤7。HiFi DNA Polymerase Mix来自kapa biosystems公司。
9.文库纯化后，用安捷伦2100生物分析仪检测合格。
10.文库QPCR定量结果
11.Hiseq2500 PE100上机测序数据量0.5G data。
12.数据分析结果
样本1为NPM1-RARα融合基因阳性，说明其可能为APL患者。
样本2为PML-RARα融合基因阳性，说明其可能为APL患者。
样本3未检测到融合基因，说明其可能为正常人。
本说明中涉及的核苷酸序列如下。
SEQ ID NO:1：5'-GATCGGAAGAGCACACGTCT-3'；
SEQ ID NO:2：5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'；
RARαGSP2引物池
(Index-X)SEQ ID NO:4：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'
RARαGSP1引物池
| SEQ ID NO | 核苷酸序列(5'-3') |
| 51 | CTGCTCAGGTGTGTGCTGGCA |
| 52 | CCAAAGAGGGCAGGCTA |
| 53 | GATGGTGTGCTATATCCACTA |
| 54 | CTTGCAGCCCTCACAGG |
| 55 | CCACTTCAAAGCACTTCTGCA |
| 56 | CGTAGTGTATTTGCCCAGCTG |
| 57 | CAGGATGTCCAGGCAGGC |
| 58 | CTCCGCAGATGAGGCAGATG |
| 59 | CCTTGGCGCTGATGCTTCG |
| 60 | ATCCAGTAGATCTCAGTGGAAAG |
| 61 | TCATGGTGGGTGCAGGCA |
| 62 | AGCAATGGCTTGTGAGTTCTG |
(公共引物)SEQ ID NO:6:
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域技术人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
工业实用性
根据本发明，提供一种基于二代测序技术的、可同时检测多种APL相关融合基因的检测方法、检测试剂盒，以及构建用于上述检测方法的二代测序DNA文库的方法、建库试剂盒。
Claims (10)
1.一种用于APL相关融合基因检测的二代测序DNA文库的构建方法，该方法包括：
步骤A：将希望进行测序的cDNA进行末端修复，得到平末端DNA片段，该cDNA是由从人血液或骨髓样本中提取的总RNA反转录得到的；
步骤B：将平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；
步骤C：将所述3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；以及
步骤D：将所述加接头DNA片段进行第一次PCR扩增，得到第一次扩增产物；
步骤E：将所述第一次扩增产物进行巢式PCR扩增，得到第二次扩增产物；
其中，
所述步骤C中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示的单链DNA的退火产物作为所述接头；
所述步骤D中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:51～62所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA作为PCR扩增引物；
所述步骤E中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:31～42所示的单链DNA、核苷酸序列如SEQID NO:4所示的单链DNA以及核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA作为PCR扩增引物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述步骤A之前还包括下述步骤：
从人血液或骨髓样本中提取的总RNA，并由该总RNA反转录得到cDNA第一链和cDNA第二链。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述步骤C与步骤D之间、步骤D与步骤E之间、和/或所述步骤E之后还包括对产物进行纯化的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述APL相关融合基因包括非典型APL中出现的PLZF-RARα、NuMA-RARα、NPM1-RARα、Stat5b-RARα、F1P1L1-RARα、PRKAR1A-RARα、BCOR-RARα和典型APL中出现的PML-RARα。
5.一种用于APL相关融合基因检测的二代测序DNA文库构建的试剂盒，其包含用于构建二代测序DNA文库的试剂，所述用于构建二代测序DNA文库的试剂包含：
核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的单链DNA，或者它们的退火产物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:31～42所示的单链DNA；
核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的单链DNA；
核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA；以及
核苷酸序列如SEQ ID NO:51～62所示的单链DNA。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述用于构建二代DNA测序文库的试剂还包括选自下组中的至少一种或两种以上：T4DNA聚合酶、Klenow片段、Klenow缓冲液、DNA连接酶缓冲液、DNA连接酶、Taq酶、dNTP、T4多聚核苷酸激酶、以及T4多聚核苷酸激酶缓冲液。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其用于实施权利要求1～4中任一项所述的方法。
8.一种用于APL相关融合基因检测的试剂盒，其包含：
用于构建二代测序DNA文库的试剂，以及
用于对二代测序DNA文库进行上机测序的试剂；
其中，所述用于构建二代测序DNA文库的试剂包含：
核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的单链DNA，或者它们的退火产物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:31～42所示的单链DNA；
核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的单链DNA；
核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的单链DNA；以及
核苷酸序列如SEQ ID NO:51～62所示的单链DNA。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述用于构建二代DNA测序文库的试剂还包括选自下组中的至少一种或两种以上：T4DNA聚合酶、Klenow片段、Klenow缓冲液、DNA连接酶缓冲液、DNA连接酶、Taq酶、dNTP、T4多聚核苷酸激酶、以及T4多聚核苷酸激酶缓冲液。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述对二代测序DNA文库进行上机测序的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上：再合成试剂、线性化P7接头、线性化P5接头、DNA聚合酶、dNTP、冲洗杂交液/缓冲液、100％甲酰胺(质量/体积)、用于测序的Read 2引物、Indexi7测序引物、用于测序的Read 1引物、Hiseq Rapid PE Flow Cell、ddH2O、以及增强光感度/照相用试剂。
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Effective date of registration: 20240410 Address after: Room 701, Unit 2, Building 8, No. 88 Kechuang 6th Street, Beijing Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing, 100176 Patentee after: ANNOROAD GENE TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd. Country or region after: China Patentee after: BEIJING ANNOROAD MEDICAL LABORATORY Co.,Ltd. Address before: 100176 room 701, unit 2, building 8, courtyard 88, Kechuang 6th Street, Beijing Economic and Technological Development Zone, Beijing Patentee before: ANNOROAD GENE TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd. Country or region before: China Patentee before: ZHEJIANG ANNOROAD BIO-TECHNOLOGY Co.,Ltd. Patentee before: ANNOROAD (YIWU) MEDICAL INSPECTION CO.,LTD. |