CN103361743A - 一种用于产前诊断的dna文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种可用于产前诊断的DNA文库构建方法。本发明,直接运用孕妇血浆建库,减少了DNA提取步骤,从而减少了孕妇血浆使用量,同时较少了胎儿DNA含量出现偏差的可能,而且大幅度的减少了DNA文库构建的成本和时间;本发明的另一方面涉及根据上述的任一种制备方法制得的DNA 文库;本发明的再一方面涉及一种DNA 测序方法。该发明具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及医学和生物技术,具体涉及一种用于产前诊断的DNA文库的构建方法。
背景技术
新生儿中有少部分存在先天性遗传病或出生缺陷,给社会和家庭带来巨大的经济和精神负担。2007年中国有1564万新生儿出生,其中出生缺陷率超过1%。出生缺陷是影响我国全民健康水平和人口素质的重要问题。国家“十一五”规划纲要将生殖健康相关技术列为科技发展优先主题;2006-2020年国家中长期规划也将“出生缺陷防治”作为重点领域和优先主题。我国每年约出生80~120万缺陷婴儿;造成经济损失约10亿元人民币。遗传病是新生儿缺陷的最主要原因之一,而且许多先天性出生缺陷往往缺乏有效的治疗方法,因此早期诊断和预防是目前降低出生缺陷的最有效措施。
遗传缺陷的种类多,成因复杂。比如,其中由染色体拷贝数的变化导致遗传缺陷的疾病包括:唐氏综合征(T21)、爱德华氏综合征(T18)、帕陶氏综合征(T13)等。其中由DNA 甲基化或三核苷酸重复突变导致遗传缺陷的疾病包括:X 染色体易损综合症(Fragile X)。其中由基因多态性导致遗传缺陷的疾病包括:年龄相关性黄斑变性,假性剥脱综合征和阿尔兹海默病。
因此,胎儿有否换上遗传缺陷疾病是孕妇选择进行产前检查的主要原因,是降低畸形儿出生率最为有效的办法之一。现在世界上进行这类诊断通常是在孕期第16到18周间进行的,办法一是通过子宫穿刺羊膜腔,从羊水中获取胚胎细胞,二是提取胎盘组织进行活体检查,但这两种办法都比较复杂,且都是采用介入式方法进行,对孕妇和胎儿有可能引起一定的损伤,甚至有时会引发宫内感染、羊膜破裂、流产、胎儿畸形或死亡等。由于其潜在的风险,此类诊断临床上一般只针对高龄孕妇和有家族畸形遗传史的孕妇进行,其排查和检测的范围小,因此,也难以对整个新生儿先天性遗传病或出生缺陷的产前诊断做出足够的贡献。
目前,开发新的方便、安全的胎儿基因或染色体诊断技术是国内外相关领域的热点领域。随着孕妇体内含有胎儿游离DNA的发现,和DNA大规模并行测序的应用,使无创产前基因检测成为可能。但由于血浆中游离的DNA总量非常少,这使得如果要达到能够完成DNA大规模并行测序DNA文库构建所需的游离DNA的总量,需要对大量的孕妇血浆进行DNA提取;另一方面,孕妇体内胎儿游离DNA仅占孕妇血浆中总游离DNA的3%-6%。在对孕妇血浆进行游离DNA提取时,可能使胎儿的游离DNA丢失,从而导致最终测序数据出现偏差而导致检测错误发生。
在无创产前基因检测中需要一种更加方便,更加准确的文库构建方法。本方法正是基于此而开发。本DNA文库构建方法,直接运用孕妇血浆建库,减少了DNA提取步骤,从而减少了孕妇血浆使用量,同时较少了胎儿DNA含量出现偏差的可能,而且大幅度的减少了DNA文库构建的成本和时间。
发明内容
基于能够利用孕妇外周血中游离的DNA来建立胎儿的有效DNA文库,从而完成胎儿遗传缺陷疾病产前无创检测。且结果准确,无假阳性和无假阴性的基础上,本发明提供一种产前无创检测中快速构建游离DNA文库的方法。
本发明构建游离DNA文库的方法步骤如下:
1、对孕妇血浆中游离DNA进行末端修复,纯化;
2、对1步骤所得DNA进行3’端加“A”碱基处理;
3、对2步骤所得DNA两端进行加接头处理,纯化;
4、对3步骤所得DNA进行PCR,纯化后DNA文库构建完成。
本发明的另一方面涉及根据上述的任一种制备方法制得的DNA 文库。该DNA 文库可用于产前检测。
一种DNA 测序方法,包括将权利要求5 所述的DNA 文库进行测序的步骤;优选地,使用高通量测序平台进行测序;具体地,所述高通量测序平台为illumina测序平台。
本发明的DNA文库构建方法的优点是省略了从孕妇血浆中提取DNA的步骤和DNA的3’端加“A”碱基处理后的纯化步骤,同时更换了PCR步骤中所用的DNA聚合酶,从而得到了与传统方法相比,质量相同或更好的DNA文库。本DNA文库构建方法,直接运用孕妇血浆建库,减少了DNA提取步骤,从而减少了孕妇血浆使用量,同时降低了胎儿DNA含量出现偏差的可能,而且大幅度地减少了DNA文库构建的成本和时间。
附图说明
图1.传统文库构建流程与本发明文库构建流程对比图。
图2.应用本发明方法所构建的DNA文库Agilent Bioanalyzer 2100检测结果。如图所示,在295 bp处存在一个主峰,物质的量浓度为146.0 ng/μl,摩尔浓度为146.0 nmol/l;Lower marker 片段大小为15 bp,物质的量浓度为4.20 ng/μl,摩尔浓度为424.2 nmol/l;Upper Marker 片段大小为1500 bp,物质的量浓度为2.10 ng/μl,摩尔浓度为2.1 nmol/l。
图3.传统文库构建流程所构建的DNA文库Agilent Bioanalyzer 2100检测结果。如图所示,在297 bp片段大小处存在一个主峰,物质的量浓度为9.51 ng/μl, 摩尔浓度为48.5 nmol/l;Lower marker 片段大小为15 bp,物质的量浓度为4.20 ng/μl,摩尔浓度为424.2 nmol/l ;Upper Marker 片段大小为1500 bp,物质的量浓度为2.10 ng/μl,摩尔浓度为2.1 nmol/l。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的实施方法与材料仅作示范之用。
实施例一:本发明的文库构建流程。
1.孕妇血浆中游离DNA的末端修复
从孕妇的血液中提取的DNA是双链DNA片段,这些片段或是平末端的,或是含有3′或5′突出末端。这一步是通过T4 DNA聚合酶、大肠杆菌DNA多聚酶I大片段(Klenow片段)、和多核苷酸激酶T4(T4 PNK),使突出端磷酸化成平末端。3′到5′外切酶活性去除3′突出端,聚合酶活性填充5′突出端。最终使游离DNA具有平末端。
材料:
孕妇血浆;
dNTPs 的混合物(10 mM);
T4 DNA 聚合酶(3单位/μl);
Klenow 片段(5单位/μl);
T4 PNK(10单位/μl)及PNK缓冲液;
DNA纯化用磁珠;
PCR 仪。
程序:
A.准备以下反应的组合;
B.在PCR 仪孵育30 分钟,温度20℃;
C.纯化——用磁珠对反应后产物进行纯化,用19.5μL的洗脱缓冲液EB(Elution Buffer)洗脱。
2.对DNA进行3′端加“A”碱基处理
接头序列需要连接到在3′端加上了单个“T”碱基突出端的磷酸化的DNA 片段的平末端。要进行这一连接,需要先在第一步获得的DNA模板片段的3′端先添加互补的“A”碱基。而这需要使用缺失了3′到5′外切酶活性的Klenow 片段来完成。
材料:
第一步获得的DNA(19.5 μl);
Klenow 缓冲液(10×);
dATP(1 mM);
Klenow 片段(缺失3′到5′外切酶活性, 5单位/μl);
PCR 仪。程序:
A.准备以下反应的组合;
B.在PCR 仪孵育30 分钟,温度37℃。
3.接头(Adapter)与DNA 片段的两端进行连接。
为了使DNA能够在下一步PCR中能够特异性扩增,我们要在之前所得DNA片段用DNA连接酶在其两端各连接一个特异性接头(Adapter)。
连接反应所需接头序列:
接头序列1:5’ P-GATCGGAAGAGCACACGTCT 3’
接头序列2:5’ P-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3’
使用时等比例混合。
材料:第二步获得的DNA;
DNA 连接酶缓冲液(2×);
DNA 连接酶(1单位/μl);
Adapter;
PCR仪;
DNA纯化用磁珠。
程序:
A.准备以下反应的组合;
B.在PCR 仪孵育15 分钟,温度20℃。
C.纯化——用磁珠对反应后产物进行纯化,用38.2 μL的洗脱缓冲液EB(Elution Buffer)洗脱。
4.对两端连接接头的DNA片段进行PCR扩增。
对两端连接接头修饰过的DNA片段进行PCR扩增,一方面在PCR的过程中将DNA片段两端添加上与测序引物匹配的碱基序列,另一方面保证DNA片段有足够的总量用来进行接下来的测序。
PCR扩增中所用到的引物序列:
PCR引物1:
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3’
PCR引物2:
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 3’
材料
第三步纯化后获得的DNA;
10×Pfx DNA聚合酶扩增缓冲液;
dNTP 的混合物(10 mM);
MgSO4 (50 mM);
PCR 引物1(10 pmol/μL);
PCR 引物2 (10 pmol/μL);
Pfx DNA 聚合酶(2.5U/μL)。
程序:
A.准备以下反应的组合;
B.按以下方法进行PCR扩增
94℃保持2分钟;
然后:【94℃,15秒;62℃,30秒;72℃,30秒】15个循环;
然后72℃保持10分钟;
然后将样本保持在4℃保存。
C.纯化——用磁珠对反应后产物进行纯化,用一定量的洗脱缓冲液EB(Elution Buffer)洗脱。
文库制备完成,将文库保存在适当环境备用。
将实施案例所得到的文库,使用Agilent Bioanalyzer 2100检测片段大小及浓度,结果见图2(注:Agilent Bioanalyzer 2100检测图中,15 bp和1500 bp两个峰值为别为检测芯片自带的lower maker和upper maker,用来计算DNA产物的浓度及片段大小)。从此图中可以看出,与传统流程所构建文库相比(检测图见图3)无论从质量浓度(Conc.)还是摩尔浓度(Molarity)来看,均有较大幅度的提高,这是在相同实验条件下,传统流程所不能达到的,并且从DNA产物片段大小(Size)来看,二者相比并无明显差别,改进流程所构建文库完全符合文库测序前要求。
实施例二:文库构建中PCR用DNA聚合酶的筛选
我们在确定本发明文库构建流程中,为解决最终文库产量低的情况,曾对多种PCR用DNA聚合酶进行多方面的筛选,最终确定4种DNA聚合酶(包括传统流程中的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix)进行实际的实验对比。DNA聚合酶名称及生产厂家如下表:
具体筛选过程如下:
1.孕妇血浆中游离DNA的末端修复
从孕妇的血液中提取的DNA是双链DNA片段,这些片段或是平末端的,或是含有3或5′突出末端。这一步是通过T4 DNA聚合酶、大肠杆菌DNA多聚酶I大片段(Klenow片段)、和多核苷酸激酶T4,使突出端磷酸化成平末端。3′到5′外切酶活性去除3′突出端,聚合酶活性填充5′突出端。最终使游离DNA具有平末端。
材料:
孕妇血浆;
dNTPs 的混合物(10 mM);
T4 DNA 聚合酶(3单位/μl);
Klenow 片段(5单位/μl);
T4 PNK (T4 多核苷酸激酶, 10单位/μl)及PNK缓冲液;
DNA纯化用磁珠;
PCR 仪。
程序:
D.准备以下反应的组合;
E.在PCR 仪孵育30 分钟,温度20℃;
F.纯化——用磁珠对反应后产物进行纯化,用19.5μL的洗脱缓冲液EB(Elution Buffer)洗脱。
2.对DNA进行3’端加“A”碱基处理
接头序列需要连接到在3′端加上了单个“T”碱基突出端的磷酸化的DNA 片段的平末端。要进行这一连接,需要先在第一步获得的DNA模板片段的3′端先添加互补的“A”碱基。而这需要使用缺失了3′到5′外切酶活性的Klenow 片段来完成。
材料:
第一步获得的DNA(19.5 μl);
Klenow 缓冲液(10×);
dATP(1 mM);
Klenow 片段(缺失3′到5′外切酶活性, 5 U/μl);
PCR 仪。
程序:
C.准备以下反应的组合
D.在PCR 仪孵育30 分钟,温度37℃。
3.接头(Adapter)与DNA 片段的两端进行连接。
为了使DNA能够在下一步PCR中能够特异性扩增,我们要在之前所得DNA片段用DNA连接酶在其两端各连接一个特异性接头(Adapter)。
连接反应所需接头序列:
接头序列1:5’ P-GATCGGAAGAGCACACGTCT 3’
接头序列2:5’ P-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3’
使用时等比例混合。
材料:
第二步获得的DNA;
DNA 连接酶缓冲液(2×);
DNA 连接酶(1 U/μl);
Adapter;
PCR仪;
DNA纯化用磁珠。
程序:
A.准备以下反应的组合
D.在PCR 仪孵育15 分钟,温度20℃。
E.纯化——用磁珠对反应后产物进行纯化,用38.2 μL的洗脱缓冲液EB(Elution Buffer)洗脱。
4.对两端连接接头的DNA片段进行PCR扩增。
对两端连接接头修饰过的DNA片段进行PCR扩增,一方面在PCR的过程中将DNA片段两端添加上与测序引物匹配的碱基序列,另一方面保证DNA片段有足够的总量用来进行接下来的测序。
PCR扩增中所用到的引物序列:
PCR引物1:
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3’
PCR引物2:
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 3’
此步骤中,我们对四种PCR用 DNA聚合酶进行了单独的平行测试,每种DNA聚合酶的体系参照各自的使用说明说进行配制。
程序:
1)VeraSeq2.0 DNA Polymerase体系配制
A.准备以下反应的组合
B.按以下方法进行PCR扩增
98℃保持2分钟;
然后:【94℃,15秒;62℃,30秒;72℃,30秒】15个循环;
然后72℃保持10分钟;
然后将样本保持在4℃保存。
C.纯化——用磁珠对反应后产物进行纯化,用一定量的洗脱缓冲液EB(Elution Buffer)洗脱。
2)Q5™ High-Fidelity 2X Master Mix体系配制
A.准备以下反应的组合
B.按以下方法进行PCR扩增
98℃保持2分钟;
然后:【98℃,15秒;62℃,30秒;72℃,30秒】15个循环;
然后72℃保持10分钟;
然后将样本保持在4℃保存。
C.纯化——用磁珠对反应后产物进行纯化,用一定量的洗脱缓冲液EB(Elution Buffer)洗脱。
3)Phusion High-Fidelity PCR Master Mix 体系配制(对照组)
A.准备以下反应的组合
B.按以下方法进行PCR扩增
98℃保持2分钟;
然后:【98℃,15秒;62℃,30秒;72℃,30秒】15个循环;
然后72℃保持10分钟;
然后将样本保持在4℃保存。
C.纯化——用磁珠对反应后产物进行纯化,用一定量的洗脱缓冲液EB(Elution Buffer)洗脱。
4)Platinum® Pfx DNA Polymerase 体系配制
A.准备以下反应的组合
B.按以下方法进行PCR扩增
98℃保持2分钟;
然后:【94℃,15秒;62℃,30秒;72℃,30秒】15个循环;
然后72℃保持10分钟;
然后将样本保持在4℃保存。
C.纯化——用磁珠对反应后产物进行纯化,用一定量的洗脱缓冲液EB(Elution Buffer)洗脱。
文库分别平行构建完成后,对每个文库进行产量测定,结果显示,使用Q5™ High-Fidelity 2X Master Mix 和Platinum® Pfx DNA Polymerase的文库产量会明显远高于对照组和VeraSeq2.0 DNAPolymerase,其中使用Platinum® Pfx DNA Polymerase的文库产量又比使用Q5™ High-Fidelity 2X Master Mix的高出约25%。之后,我们又进行了多个批次的总计约200个样本的重复试验,最终结果与之前结果保持一致。
根据以上结果,我们同时综合考虑聚合酶保真性,每次反应的试剂成本等因素,最终选取了Platinum® Pfx DNA Polymerase作为本发明中文库PCR步骤所用酶。
具体测试数据如下表:
实施例三:文库构建中PCR扩增条件的摸索
在选定PCR用的DNA聚合酶品牌种类后,我们对Platinum® Pfx DNAPolymerase的体系使用做了调整,已取得更加适合本实验流程的扩增体系。
1.孕妇血浆中游离DNA的末端修复
从孕妇的血液中提取的DNA是双链DNA片段,这些片段或是平末端的,或是含有3或5′突出末端。这一步是通过T4 DNA聚合酶,大肠杆菌DNA多聚酶I大片段(Klenow片段),和多核苷酸激酶T4,使突出端磷酸化成平末端。3′到5′外切酶活性去除3′突出端,聚合酶活性填充5′突出端。最终使游离DNA具有平末端。
材料:
孕妇血浆;
dNTPs 的混合物(10 mM);
T4 DNA 聚合酶(3单位/μl);
Klenow 片段(5单位/μl);
T4 PNK(T4 多核苷酸激酶, 10单位/μl)及PNK缓冲液;
DNA纯化用磁珠;
PCR 仪。
程序:
G.准备以下反应的组合;
H.在PCR 仪孵育30 分钟,温度20℃;
I.纯化——用磁珠对反应后产物进行纯化,用19.5μL的洗脱缓冲液EB(Elution Buffer)洗脱。
2.对DNA进行3’端加“A”碱基处理
接头序列需要连接到在3′端加上了单个“T”碱基突出端的磷酸化的DNA 片段的平末端。要进行这一连接,需要先在第一步获得的DNA模板片段的3′端先添加互补的“A”碱基。而这需要使用缺失了3′到5′外切酶活性的Klenow 片段来完成。
材料:
第一步获得的DNA(19.5 μl);
Klenow 缓冲液(10×);
dATP(1mM);
Klenow 片段( 缺失3′到5′外切酶活性, 5 U/μl);
PCR 仪。
程序:
A.准备以下反应的组合
B.在PCR 仪孵育30 分钟,温度37℃。
3.接头(Adapter)与DNA 片段的两端进行连接。
为了使DNA能够在下一步PCR中能够特异性扩增,我们要在之前所得DNA片段用DNA连接酶在其两端各连接一个特异性接头(Adapter)。
连接反应所需接头序列:
接头序列1:5‘ P-GATCGGAAGAGCACACGTCT 3’
接头序列2:5‘ P-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3’
使用时等比例混合。
材料:
第二步获得的DNA;
DNA 连接酶缓冲液(2×);
DNA 连接酶(1 U/μl);
Adapter;
PCR仪;
DNA纯化用磁珠。
程序:
准备以下反应的组合;
在PCR 仪孵育15 分钟,温度20℃。
纯化——用磁珠对反应后产物进行纯化,用一定量的洗脱缓冲液EB(Elution Buffer)洗脱。
4.对两端连接接头的DNA片段进行PCR扩增。
对两端连接接头修饰过的DNA片段进行PCR扩增,一方面在PCR的过程中将DNA片段两端添加上与测序引物匹配的碱基序列,另一方面保证DNA片段有足够的总量用来进行接下来的测序。
PCR扩增中所用到的引物序列:
PCR引物1:
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3’
PCR引物2:
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 3’
材料
第三步纯化后获得的DNA;
10×Pfx DNA聚合酶扩增缓冲液;
dNTP 的混合物 (10 mM);
MgSO4 (50 mM);
PCR 引物1(10 pmol/μL);
PCR 引物2 (10 pmol/μL);
Pfx DNA 聚合酶(2.5U/μL)。
程序:
准备以下反应的组合;
按以下方法进行PCR扩增
94℃保持2分钟;
然后:【94℃,15秒;62℃,30秒;72℃,30秒】15个循环;
然后72℃保持10分钟;
然后将样本保持在4℃保存。
纯化——用磁珠对反应后产物进行纯化,用一定量的洗脱缓冲液EB(Elution Buffer)洗脱。
文库制备完成,将文库保存在适当环境备用。
文库分别平行构建完成后,对每个文库进行产量测定,结果显示,组一的文库产量会明显高于其他两组。之后,我们又进行了多个批次的总计约150个样本的重复试验,最终结果与之前结果保持一致,另外,综合考虑每个样本的成本,所以我们选取组一的PCR体系作为本发明的PCR体系。
具体测试数据如下表:
本发明方法中,在PCR步骤,更换了传统流程中使用的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix,使用了Platinum® Pfx DNA Polymerase,同时我们对Platinum® Pfx DNA Polymerase的PCR反应体系也进行了重新的摸索,从结果中可以发现,Platinum® Pfx DNA Polymerase无论是在扩增效率还是在保真性上,都远远优于Phusion High-Fidelity PCR Master Mix。因此Platinum® Pfx DNA Polymerase也是本发明虽然减少血浆起始用量但是最终文库质量比传统流程高的一个重要因素。
从图2、3中可以看出,与传统流程所构建文库相比(检测图见图3)无论从质量浓度(Conc.)还是摩尔浓度(Molarity)来看,均有较大幅度的提高,这是在相同实验条件下,传统流程无法达到的,并且从DNA产物片段大小(Size)来看,二者相比并无明显差别,改进流程所构建文库完全符合文库测序前要求。
在测序数据中,文库的GC含量是判断文库是否合格的一个重要标准,会对后期的数据分析及结果判断产生很大的影响,正常文库的GC含量为39%-42%,文库GC含量低于39%或高于42%都会被判断不合格,需重新进行文库构建。我们为了验证本发明方法所构建文库的质量,分三个批次共150个样本进行两种文库构建方法对比验证,结果显示,在150个样本中,传统方法构建的文库中有9例样本因出现GC含量高于42%或低于39%被判定文库不合格,需重新进行文库构建,占全部文库数的6%;而本发明所示方法构建的文库中,GC含量不正常数为0,无一需要重新进行文库构建,合格率100%。从上述结果来看,本发明能够显著降低在DNA提取和文库构建中对DNA引入的偏差而导致的测序结果不理想的情况。在后期结果判断上,可大幅降低假阳性和假阴性结果出现的可能。
以上仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说, 本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、替换、 改进等, 均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种DNA文库的建库方法,其特征在于方法步骤如下:
(1).对孕妇血浆中游离DNA进行末端修复,纯化;
(2).对1步骤所得DNA进行3’端加“A”碱基处理;
(3).对2步骤所得DNA两端进行加接头处理,纯化;
(4).对3步骤所得DNA进行PCR,纯化后DNA文库构建完成。
2.如权利要求1所述的DNA文库构建方法,其特征在于,步骤(1)省略了从孕妇血浆中提取DNA的步骤,通过T4 DNA聚合酶、大肠杆菌DNA多聚酶I大片段(Klenow片段)、和多核苷酸激酶T4(T4 PNK),使突出端磷酸化成平末端。
3.如权利要求1所述的DNA文库构建方法,其特征在于,步骤(2)省略了DNA的3’端加“A”碱基处理后的纯化步骤。
4.如权利要求1所述的DNA文库构建方法,其特征在于,步骤(3)中连接反应所需接头为:
接头序列1:5’ P-GATCGGAAGAGCACACGTCT 3’
接头序列2:5’ P-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3’。
5.如权利要求1所述的DNA文库构建方法,其特征在于,步骤(4)中PCR反应使用的DNA聚合酶为Platinum® Pfx DNA Polymerase。
6.根据权利要求1-5所述的方法制得的DNA文库。
7.一种DNA 测序方法,其特征在于,包括将权利要求1-5 所述的DNA文库进行测序的步骤;具体地,使用高通量测序平台进行测序,所述高通量测序平台为illumina测序平台。
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CN2013103117648A CN103361743A (zh) | 2013-07-23 | 2013-07-23 | 一种用于产前诊断的dna文库构建方法 |
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CN2013103117648A CN103361743A (zh) | 2013-07-23 | 2013-07-23 | 一种用于产前诊断的dna文库构建方法 |
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PB01 | Publication | ||
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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