CN103923987A - 一种基于高通量测序检测13、18、21三体综合征的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及临床样品中检测13、18、21号染色体数目异常的一种方法，该方法应用多重PCR扩增技术结合高通量测序技术，检测母体血浆中胎儿游离核酸，通过扩增13、18和21号染色体特异性的SNP位点，精确定量母体血浆中胎儿13、18和21号染色体上SNP剂量比例后分析染色体数目异常，从而建立一种可以快速、准确、无创性筛查13、18和21三体的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及检测临床样品中13、18和21号染色体数目异常的检测方法，特别是涉及以多重PCR扩增结合高通量测序技术通过检测母血浆中胎儿游离核酸多态性来实现无创性产前筛查13、18和21-三体综合征的检测方法。
背景技术
21、18及13三体综合征是常见的常染色体三体综合征。21三体综合征是胎儿最常见的染色体病，在新生儿中的发病率约为1/800，占小儿染色体病的70-80％，发病率随着母亲年龄的增高而增高。目前我国大约有100万以上的患者，平均20分钟就有一例21-三体综合征患儿出生，全国每年出生的21-三体综合征患儿可多达27万例左右。21-三体综合征患者由于多了1条第21号染色体，主要表现为智力低下，发育迟缓和特殊面容。18三体综合征是仅次于21-三体综合征，第二常见的三体疾病。新生婴儿中的发生率为1∶3500～8000，多发生在年龄较大的父、母亲。18三体综合征的畸形主要包括中胚层及其衍化物的异常，如骨骼、泌尿生殖系统、心脏等最明显，胎儿多于生后数周死亡。13三体综合征临床表现患儿多发畸形比18三体综合征及21三体综合征均严重。在已知的病例中，大龄产妇占的比例比较大。由于三体综合征给父母、家庭和社会带来了无可挽回的痛苦和沉重的精神负担，因此对高龄孕妇等高危人群进行产前诊断尤为重要和必要。当前在进行产前诊断时，必须采取创伤性的手段获取胎儿细胞样本如羊水或者绒毛组织，尽管这些创伤性的手段相对比较安全，但是对胎儿和母亲仍然存在一定的风险，因此临床上只对可能怀有遗传异常胎儿的高风险孕妇进行产前诊断。为了避免潜在的风险，在过去几十年中，人们一直广泛应用的方法是从母血中分离胎儿有核红细胞，但是由于胎儿有核红细胞在母血中含量稀少，需要进行细胞富集等种种操作程序限制了该方法的发展和实际应用。
2000年，Poon等发现了母血浆中存在胎儿游离核糖核酸(RNA)。目前研究发现母血浆胎儿RNA的稳定存在可能是由于合体滋养层微颗粒的保护而避免了血浆中RNA酶的消化作用，同时研究也发现胎盘是游离胎儿RNA主要的来源，并且来源于胎盘的RNA容易被检测到。母血浆中一些胎儿游离RNA同性别无关，且母亲自身无表达，如位于21号染色体上胎盘特异表达的PLAC4基因。由于在一个正常胎儿，人类染色体的二倍体性使得杂合性SNP(单核苷酸多态性)其等位基因剂量比例将会出现1∶1，而对于一个21-三体的患儿，其等位基因的剂量比例将会为1∶2或者2∶1。对于基因编码区的SNP位点而言，每条染色体上特定基因携带的这些SNP位点必将随着转录而传递到mRNA(信使RNA)上，成为“RNA-SNP”，杂合性的RNA-SNP位点的基因剂量比例也必定符合基因组DNA杂合性SNP剂量的比例情况，因此可以用母血浆中胎盘表达的mRNA来无创性的评估胎盘细胞染色体数目异常与否，也就可以评估胎儿染色体数目异常与否。依据此原理，本发明人找到了位于21号染色体上的三个基因PLAC4、COL6A2和COL6A1，于18号染色体上的两个基因SERPINB2和C18orf42，位于13号染色体上的在，位于13号染色体上的三个基因C13orf45、TNFSF13B和ITM2B，在胎盘组织中特异性表达，并能母体血浆游离核酸中检测到。
应用多重PCR技术扩增目标SNPs序列。借助一系列标准的分子生物学，将接头连接到扩增的DNA片段上，接头用于后续的扩增和测序。库检文库质量经agilent2100和qubit2.0检测合格后上高通量测序仪。测序完成后，比较杂合性等位基因信号值，以此判断胎儿染色体数目是否异常。高通量测序技术准确度高，操作简单、所需样本量少、数据量大，可同时检测多个样本。且该方法数据分析简单，不需庞大复杂的生物信息学分析，可快速给出结果。
本发明人应用多重PCR扩增技术结合高通量测序技术，通过精确定量母血浆中胎儿13、18和21号染色体上胎盘特异表达SNP剂量比例，建立一种可以快速、准确、无创性筛查13、18和21三体的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种无创性产前筛查13、18和21三体综合征的检测方法，该检测方法以高通量测技术技术检测母血浆中胎儿游离核酸，通过扩增13、18和21号染色体特异性的SNP位点，并根据扩增产物剂量的差异分析染色体数目异常。
为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：
(1)可特异性检测母体血浆中胎儿游离核酸的SNPs位点；
(2)针对一组特异性染色体SNPs位点进行多种PCR扩增的引物序列；
(3)以高通量测序法检测一组特异性染色体SNP位点。
基于以上检测方法，包括(1)提供包括特异性SNPs位点及其序列(2)通过多重扩增体系一次扩增多个SNP位点；(3)扩增后应用高通量测序法，检测各位点不同的等位基因型，等位基因型比检测靶多核苷酸的存在和相对量。
根据本发明的PCR引物优化，可一管等效率的扩增多个SNP位点，针对21号染色体上rs8130833位点的是：
5’-GTATTGCAACACCATTTGGG-3’(SEQ ID NO：1)、
5’-TAGAACCATGTTTAGGCCAG-3’(SEQ ID NO：2)、
针对21号染色体上rs9977003位点的是：
5’-CTTTGCCTTTCTAGTAATTC-3’(SEQ ID NO：3)、
5’-ATCTTGGTGCTGAACGTGTG-3’(SEQ ID NO：4)、
针对21号染色体上rs115957676位点的是：
5’-AGCAAGGGCACCGTCCACTT-3’(SEQ ID NO：5)、
5’-CTCGGCCTGCAGCTTGATG-3’(SEQ ID NO：6)、
针对21号染色体上rs113969925位点的是：
5’-ATCAGCCAGACCATCGACAC-3’(SEQ ID NO：7)、
5’-GAATTACTTTCCACCTGCGG-3’(SEQ ID NO：8)、
针对18号染色体上rs6098位点的是：
5’-TCGCAGACTTCTCACCAAAC-3’(SEQ ID NO：9)、
5’-TCTCAGCTCTGCAATCAATG-3’(SEQ ID NO：10)、
针对18号染色体上rs62097460位点的是：
5’-TGTGAATGAGGAGGGCACTG-3’(SEQ ID NO：11)、
5’-GGATGATCTGCCACAAACTG-3’(SEQ ID NO：12)、针对18号染色体上rs1395063位点的是：
5’-TGCTTCTTGGTTAACTCCCC-3’(SEQ ID NO：13)、
5’-GAGAGAATCAGTGACAACCG-3’(SEQ ID NO：14)、针对18号染色体上rs1367083位点的是：
5’-GAGTTTGACGGCTCCGTTAC-3’(SEQ ID NO：15)、
5’-AACCCGTGTTACCTGTGATG-3’(SEQ ID NO：16)、针对13号染色体上rs143069838位点的是：
5’-AGGGCGGCCACCTGGTAGAA-3’(SEQ ID NO：17)、
5’-ATCCTCCAAAGACGGAAAGC-3’(SEQ ID NO：18)、针对13号染色体上rs77273581位点的是：
5’-AATTAGCAGGGTGTGAGAAC-3’(SEQ ID NO：19)、
5’-CTGGTGACTTTGTTTCGATG-3’(SEQ ID NO：20)、
针对13号染色体上rs11556899位点的是：
5’-AAGAAGGACGAGCCCAAGAG-3’(SEQ ID NO：21)、
5’-CTCGGACCTTGCAGTCCAC-3’(SEQ ID NO：22)、
针对13号染色体上rs113956182位点的是：
5'-AAACTCTCTATAGCCAGATG-3’(SEQ ID NO：23)、
5'-CTGCAGAGGGCTCATTTAAG-3’(SEQ ID NO：24)。
本方法所提到的多重PCR是指：一个混合多种成分在单个eppendorf管内的扩增反应体系；来源于母血浆中胎儿游离RNA逆转录的cDNA作为模板。根据本方法，其中所说的多重扩增反应的循环数是10-15循环。
本方法根据测序中碱基信号值分析染色体特异性SNP位点扩增产物的基因剂量。进一步根据SNP位点扩增产物等位基因的数目和等位基因扩增产物的相对浓度来分析所选染色体的数目是否存在异常。本方法选用的SNP位点是存在于胚胎或者胎儿细胞的遗传物质，在人群中存在多态性，所扩增的产物片段在100-500bp之间，优选在150-250bp之间。应用高通量测序发对SNP位点进行检测，检测SNP位点等位基因数目的差别和基因剂量的差别，为染色体数目异常性疾病的分析提供依据。
本方法所述的21号染色体数目异常是指21号染色体三体，选用21号染色体特异性的遗传标记位点，其中在21号染色体上的位点rs8130833、rs9977003、rs115957676和rs113969925。可以至少用一个SNP位点rs8130833或rs9977003或rs115957676或rs113969925来分析21号染色体三体综合征，优选rs8130833、rs9977003、rs115957676和rs113969925位点中的两个或者两个以上进行联合检测。
本方法所述的18号染色体数目异常是指18号染色体三体，选用18号染色体特异性的遗传标记位点，其中在18号染色体上的位点rs8130833、rs9977003、rs115957676和rs113969925。可以至少用一个SNP位点rs6098或rs62097460或rs1395063或rs1367083来分析18号染色体三体综合征，优选rs6098、rs62097460、rs1395063和rs1367083位点中的两个或两个以上进行联合检测。
本方法所述的13号染色体数目异常是指13号染色体三体，选用13号染色体特异性的遗传标记位点，其中在13号染色体上的位点rs143069838、rs77273581、rs11556899和rs113956182。可以至少用一个SNP位点rs143069838或rs77273581或rs11556899或rs113956182来分析13三体综合征，优选rrs143069838、rs77273581、rs11556899和rs113956182中的两个或两个以上进行联合检测。
简而言之，本方法包括多重PCR引物；选择来源于母血浆的胎儿RNA作为模板；将胎儿RNA逆转录为cDNA；应用高通量测序法对PCR产物进行测序，并分析测序数据。
值得特别说明的是，本方法可以同时检测包括21号染色体的四个SNP位点、18号染色体上的四个位点和13号染色体上的四个位点。通过对本方法优化，可以对正常样本中所选的十四个位点同时进行均衡扩增，测序时也可对十三个位点进行同等信号值的检测，因此本方法可以对异常样本中可能存在的13、18和21三体异常同时进行分析和筛查。
附图说明
图1显示一个正常女性样本测序信号图。样本类型为全血。
图2显示一个21三体异常样本多测序信号图。样本类型为孕妇游离血浆。
图3显示一个18-三体异常样本多测序信号图。样本类型为孕妇游离血浆。
图4显示一个13-三体异常样本多测序信号图。样本类型为孕妇游离血浆。
具体实施方式
实施例1：检测方法在正常人中的使用
(1)该方法中所用到的试剂：
GenMag Circulating DNA from Plasma、QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT、ION PLUSFRAGMENT LIBRARY KIT EACH、ION XPRESS BARCODE ADAPTERS1-16、无水乙醇、AMPure XP beads、agilent2100HS DNA检测试剂盒、ION PI CHIP KIT V2-8PACK、ION PISEQUENCING200KIT V3、ION PI TEMPLATE OT2200KIT V3、纯化磁珠Dynabeads Myone、异丙醇、浓盐酸、氢氧化钠等。
(2)标本采集、运送和保存：
a.标本采集：标本为母体血液。血液为常规取静脉血5ml，EDTA抗凝处理。
b.保存：可立即检测，4℃保存一周。
c.运输：标本运送应采用0℃冰壶。
(3)检测步骤和结果分析：
a.母血浆的收集和处理：
收集的血样先用EDTA抗凝，4℃，1600g离心10min；仔细转移血浆到平底聚丙烯管中再次4℃，16000g离心10min。收集上清到新聚丙烯管中同TRIzol LS试剂混合。所有样本-80℃保存直到提取RNA。
b.RNA提取及纯化：
RNA提取使用Invitrogen的TRIzol LS及Qiagen的RNeasy Micro Kit提取试剂盒。具体步骤如下：1.6ml血浆混合2ml TRIzol LS(Invitrogen)和0.4ml氯仿，4℃12000g离心15min，上清转移到新的聚丙烯管中，用70％的乙醇溶液等体积混合上清溶液，混合后应用RNeasyminicolumn(Qiagen)按照说明书进行处理。总RNA溶解后用RNase-Free DNase Set(Qiagen)处理去除基因组DNA的污染。
c.反转录处理
逆转录反应
逆转录条件：50℃反应30分钟，94℃反应5分钟。
d.cDNA文库构建
i：多重PCR扩增反应
PCR反应条件：95℃预变性15分钟，然后94℃15秒，62℃15秒，72℃30秒，共10个循环；最后4℃Hold。
ii：末端修复反应
反应30min，反应结束，进行纯化，获得20ul的DNA。
iii：链接反应
反应30min，反应结束，进行纯化，获得12.5ul的DNA。
iv：PCR扩增反应
PCR反应条件：72℃20min，95℃预变性15分钟，然后94℃15秒，62℃15秒，72℃30秒，共10个循环；最后4℃Hold
e.上高通量测序仪；
f.数据分析。
根据测序仪检测到的信号值计算SNP等位基因比值。结果图谱如图1所示。其中图1为正常人的结果分析图谱。
实施例2：应用本方法检测21-三体综合征
选取1份母体血浆，其胎儿疑似三体综合征，应用实施例1的试剂盒按照上述标准程序进行RNA提取纯化。RNA逆转录后，多重PCR后，建库并上机测序。扩增分析位点的基因型，位点rs8130833和rs115957676均形成2∶1的信号比值，因此可判断为21三体综合征，本方法可实现快速无创检测21三体综合征。其中图2为21三体胎儿其母体血浆的结果分析图谱。
实施例3：应用本方法检测18-三体综合征
选取1份母体血浆，其胎儿疑似三体综合征，应用实施例1的试剂盒按照上述标准程序进行RNA提取纯化。RNA逆转录后，多重PCR后，建库并上机测序。扩增分析位点的基因型，位点rs6098形成2∶1的信号比值，位点rs1367083形成1∶2的信号比值，因此可判断为18三体综合征，本方法可实现快速无创检测21-三体综合征。其中图3为18三体胎儿其母体血浆的结果分析图谱。
实施例4：应用本方法检测13-三体综合征
选取1份母体血浆，其胎儿疑似三体综合征，应用实施例1的试剂盒按照上述标准程序进行RNA提取纯化。RNA逆转录后，多重PCR后，建库并上机测序。扩增分析位点的基因型，位点rs143069838形成2∶1的信号比值，位点rs11556899形成1∶2的信号比值，因此可判断为13三体综合征，本方法可实现快速无创检测13三体综合征。其中图4为13三体胎儿其母体血浆的结果分析图谱。
Claims (2)
1.一种基于高通量测序无创性产前筛查13、18和21三体综合征的检测方法，该检测方法包括(a)多重PCR扩增引物；(b)可特异性检测母体血浆中胎儿游离核酸的SNPs位点；(c)以高通量测序法检测一组特异性染色体SNP位点；且针对染色体特异性的遗传标记位点的扩增引物分别为：
针对21号染色体rs8130833位点的是：
5’-GTATTGCAACACCATTTGGG-3’(SEQ ID NO：1)、
5’-TAGAACCATGTTTAGGCCAG-3’(SEQ ID NO：2)、
针对21号染色体上rs9977003位点的是：
5’-CTTTGCCTTTCTAGTAATTC-3’(SEQ ID NO：3)、
5’-ATCTTGGTGCTGAACGTGTG-3’(SEQ ID NO：4)、
针对21号染色体上rs115957676位点的是：
5’-AGCAAGGGCACCGTCCACTT-3’(SEQ ID NO：5)、
5’-CTCGGCCTGCAGCTTGATG-3’(SEQ D NO：6)、
针对21号染色体上rs113969925位点的是：
5’-ATCAGCCAGACCATCGACAC-3’(SEQ ID NO：7)、
5’-GAATTACTTTCCACCTGCGG-3’(SEQ ID NO：8)、
针对18号染色体上rs6098位点的是：
5’-TCGCAGACTTCTCACCAAAC-3’(SEQ ID NO：9)、
5’-TCTCAGCTCTGCAATCAATG-3’(SEQ ID NO：10)、
针对18号染色体上rs62097460位点的是：
5’-TGTGAATGAGGAGGGCACTG-3’(SEQ ID NO：11)、
5’-GGATGATCTGCCACAAACTG-3’(SEQ ID NO：12)、
针对18号染色体上rs1395063位点的是：
5’-TGCTTCTTGGTTAACTCCCC-3’(SEQ ID NO：13)、
5’-GAGAGAATCAGTGACAACCG-3’(SEQ ID NO：14)、
针对18号染色体上rs1367083位点的是：
5’-GAGTTTGACGGCTCCGTTAC-3’(SEQ ID NO：15)、
5’-AACCCGTGTTACCTGTGATG-3’(SEQ ID NO：16)、
针对13号染色体上rs143069838位点的是：
5’-AGGGCGGCCACCTGGTAGAA-3’(SEQ ID NO：17)、
5’-ATCCTCCAAAGACGGAAAGC-3’(SEQ ID NO：18)、
针对13号染色体上rs77273581位点的是：
5’-AATTAGCAGGGTGTGAGAAC-3’(SEQ ID NO：19)、
5'-CTGGTGACTTTGTTTCGATG-3’(SEQ ID NO：20)、
针对13号染色体上rs11556899位点的是：
5’-AAGAAGGACGAGCCCAAGAG-3’(SEQ ID NO：21)、
5’-CTCGGACCTTGCAGTCCAC-3’(SEQ ID NO：22)、
针对13号染色体上rs113956182位点的是：
5’-AAACTCTCTATAGCCAGATG-3’(SEQ ID NO：23)、
5’-CTGCAGAGGGCTCATTTAAG-3’(SEQ ID NO：24)。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征还在于该方法通过多重扩增体系一次扩增所述多个SNP位点；然后应用高通量测序法检测等位基因，并比较信号值。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: GUANGZHOU DARUI BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: DAAN GENE CO., LTD., ZHONGSHAN UNIV. Effective date: 20141203 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Li Ming Inventor after: Yang Xuexi Inventor after: Zhu Anna Inventor after: Li Fenxia Inventor before: Yang Xuexi Inventor before: Zhu Anna Inventor before: Li Fenxia Inventor before: Li Ming |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: YANG XUEXI ZHU ANNA LI FENXIA LI MING TO: LI MING YANG XUEXI ZHU ANNA LI FENXIA |
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| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20141203 Address after: 510665 6 litchi mountain road, Guangzhou hi tech Industrial Development Zone, Guangdong, China Applicant after: Guangzhou Da Rui Biotechnology Ltd. Address before: 510665 No. 19 Xiangshan Road, hi tech Development Zone, Guangdong, Guangzhou Applicant before: Daan Gene Co., Ltd., Zhongshan Univ. |
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| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Guangzhou Da Rui Biotechnology Ltd. Document name: Notification of Passing Examination on Formalities |
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140716 |