KR102222038B1 - 발육이 우수한 포배를 선별하는 비침습적 검사 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포배 중 소량의 영양외배엽 세포의 DNA 메틸화 프로파일에 대한 검사를 통하여, 가드너 형태 포배 그레이딩 중 형태가 우수한 배아의 메틸화 수준 평균치와 패턴을 발육이 우수한 포배의 선별 기준으로 하여, 검사대기중의 포배의 영양외배엽 세포의 메틸화 수준이 우수한 배아의 메틸화 수준 또는 상태에 가까울수록 배아의 발육이 더 우수하고, 모체 이식에 더 적합하며; 이와 동시에 메틸화 시퀀싱 결과에 대한 분석에 의하여 염색체 이상 여부를 판단할 수 있어 염색체에 이상이 있는 배아를 직접적으로 제거할 수 있는, 발육이 우수한 포배를 선별하는 비침습적 검사 방법에 관한 것이다.

Description

발육이 우수한 포배를 선별하는 비침습적 검사 방법
본 발명은 전체 게놈 수준의 후성유전정보학 분야에 관한 것으로서, 구체적으로, 발육이 우수한 포배를 선별하는 비침습적 검사 방법에 관한 것이다.
체외수정과 배아이식(IVF-ET)은 “시험관 아기”라고 속칭한다. 이는 난자와 정자를 체외로 채취하여 체외의 인위적으로 제어된 환경에서 수정과정을 마친 다음 초기 배아를 여성 자궁내에 이식하여 자궁에서 아기로 발육시키는 특별한 임상 보조생식기술이다. 이러한 체외수정 기술을 이용하여 태어난 아기를 “시험관 아기”라고도 한다. 이식 전 체외에서 얻은 배아는 선별을 진행하여야 하며, 현재 임상에서는 하기와 같은 2가지 방법이 있다:
(1) 가드너 형태 포배 그레이딩 시스템(Gardner morphological blastocyst grading system). 시험관 아기의 과정에서 포배의 배양과 이식은 매우 중요한 단계이다. 시험관 아기의 포배 질은 성공 여부를 결정하는 중요한 요소이다. 현재 임상에서는 가드너 형태 포배 그레이딩 시스템을 사용하여 포배강의 크기와 부화 여부에 따라 포배의 발육을 6개의 단계로 분류하였다. 1단계: 초기에 배아 총 체적의 1/2보다 작은 포배강이 있는 포배; 2단계: 포배강의 체적이 배아 총 체적의 1/2이상인 포배; 3단계: 포배강이 배아의 총 체적을 완전히 차지하는 완전히 확장된 포배; 4단계: 배아에 포배강이 완전히 가득차 배아의 총 체적이 증가되고 투명대가 얇아지는 확장된 포배; 5단계: 포배의 일부분이 투명대로부터 빠져나오는 부화되고 있는 포배; 6단계: 포배 전부가 투명대로부터 빠져나온 부화된 포배. 3~6단계에 머무른 포배는 이의 속세포덩이와 영양외배엽 세포에 대한 질 그레이딩도 진행하여야 한다. 세포덩이의 등급에 있어서, A급은 세포수가 많고 긴밀하게 배열되었으며; B급은 세포수가 적고 성기게 배열되었으며; C급은 세포수가 매우 적다. 영양외배엽 세포의 등급에 있어서, A급은 상피 세포층이 비교적 많은 세포로 구성되고 구조가 치밀하며; B급은 상피 세포층이 많지 않은 세포로 구성되고 구조가 느슨하며; C급은 상피 세포층이 희소한 세포로 구성되었다. 상기 그레이딩 방법에 따른 가장 좋은 포배의 평점은 5일째 포배인 3AA, 6, 7일째 포배인 4AA이다. ART치료에서 AA급 배아는 가장 적합한 선택이지만, 임상에서 33%의 부부만이 AA급 배아를 얻어 이식받을 수 있으며, 52%의 환자는 B*급 포배(AB, BA, BB를 포함)만 얻을 수 있다. AA급 배아의 출생률은 39%이고, B*급 배아의 출생률은 약 28%이지만, C*급(BC, CB를 포함) 배아의 출생률은 4%이며, 그중 CC급 배아의 출생률은 거의 0이다.
가드너 형태 포배 그레이딩 시스템(Gardner morphological blastocyst grading system)은 전통적인 현미경에 의존하는 기술이며, 형태학적 등급이 높은 배아를 선택하여 이식하는 배아 형태학으로서 정확도가 낮다. 임상시험 데이터에서 나타낸 바와 같이, 형태학적 검사에만 의한 보조생식치료에서 반복적으로 유산한 사람들의 유산율은 33.5%이고, 임상 임신율은 45.8%이다. 시험관 아기의 평균 성공률은 20~30%이기에, 일차 이식 성공률을 높이기 위하여, 일반적으로 2~3개의 배아를 동시에 이식하며, 이로 인하여 일부 다태 현상이 종종 나타날 수 있다. 다태는 단태에 비해 위험성이 더 높으며, 이러한 위험성은 엄마와 아기 모두에 존재한다. 따라서, 엄마와 아기의 안전을 보호하기 위하여, 삼둥이 이상은 원칙상 태아감소술을 진행하여야 하며, 태아감소술에서 모든 배아의 유산을 초래할 가능성은 10%이다.
따라서, 임신 성공률을 높이기 위한 맹목적인 다수 배아의 이식으로 인해 다태 임신을 초래하여, 임신 기간에 부득이하게 태아감소술을 실시하여 초래되는 위험 및 윤리 도덕 충돌을 방지하기 위하여, 시험관 아기의 성공률을 향상시키는 새로운 방법이 필요하다.
(2) 배아 이식 전 유전자 선별 검사, 즉, 제3대 시험관 아기(pre-implantation genetic screening/diagnosis, PGS/PGD). 1990년, 영국 Handyside는 성공적으로 중합효소연쇄반응(PCR) 기술로 난할구를 분석하여 반성(sex-linked) 질환 보유자에 대한 배아 성별 선별 후의 임신 분만을 실현함으로써, 세계적으로 최초로 PGS를 완성하였으며, 출산 전 선별 검사의 신기원을 열었다. 90년대에 들어서, 이식 전 선별 검사 기술은 급속하게 발전하였다. 1994년, Monne은 형광동소보합법(fluorescent in situ hybridization, FISH) 기술을 이용하여 이식 전 염색체 이수성 및 배아 성별의 선별 검사에 성공하였다. 그 후, 다중 PCR, 형광 PCR, 다색 FISH 등의 기술이 잇따라 발전하였다. 1998년, FISH는 염색체 균형전위의 PGS에 응용되기 시작하였다. 정상적이고 균형한 배우자(gamete) 또는 배아의 선택을 통하여 PGS는 염색체 전위로 인한 반복적인 자연유산율을 현저하게 낮출 수 있다. 같은 해에, 상업적으로 공급된 13, 18, 21, X 및 Y의 5개 염색체를 동시에 선별할 수 있는 5색 프로브도 PGS에 응용되어 고령 여성 난자와 배아의 이수성 선별에 적용되기 시작하였다. 1999년 이래, 잇따라 진행된 간기 핵 전환(interphase nuclear conversion) 기술, 비교유전자보합법(comparative genomic hybridization, CGH), 전체 게놈 증폭(whole genome amplification, WGA) 기술이 잇따라 PGS에 응용되었고, 해당 기술의 연구와 응용을 추가로 촉진하였다. 2010년 이래, 고처리율 시퀀싱 기술(High-throughput sequencing)이 급속히 발전함에 따라, 한번에 수십만 내지 수백만개의 DNA분자에 대해 시퀀싱을 진행하여, 한 배아의 게놈에 대해 세밀하고 전면적인 분석이 가능하게 되었으며, PGS를 새로운 분야로 이끌었다. 국내외 PGS기술에 대한 연구 열정은 한시도 멈춘적이 없으며, 현재 PGS는 주로 a. 염색체 이수성; b. 배아 성별 진단; c. 유전자 결실형 유전병; d. 배아 단일 유전자 질환 검사 등과 같은 유전병의 진단에 응용된다.
현재, 미국에는 약 12%의 가임기 여성이 보조생식기술(ART)의 도움을 받아 아이를 출산하여야 한다. 자연 임신한 사람들 중에도 일부는 배아 발육 이상으로 인해 유산된다. ART 시술 후, 대부분 배아는 발육 이상으로 인해 유산된다. 게놈의 불안정성, 예를 들어, 각종 유전자 돌연변이, 염색체 구조 이상 또는 이수성 등은 유산을 초래하는 중요한 원인 중의 하나이다. 유전자 결함이 있는 초기 배아를 배제하기 위하여, 임상에서는 이식 전 유전학 진단기술(preimplantation genetic diagnosis, PGD)을 사용한다. 이와 같은 기술은 미세 조작의 방법으로 이식 전 배아의 영양외배엽에서 다수 세포를 분리하여 이들 세포에 대한 게놈 검사를 진행하는 것이다. PGD 기술은 현재 임상에서 광범위하게 사용되어 “제3대 시험관 아기”라고 불리우며, 보조생식치료를 받는 반복 유산 사람들의 유산율을 크게 낮추어 임상 임신율을 향상시켰다.
PGS 배아 이식 전 유전자 선별 검사는 염색체 수 또는 DNA 서열이 변화된 유전성 질환에 대해서만 선별 검사 작용이 있다. 임상의 대부분 불임 또는 유산은 DNA 서열의 변화에 의한 것이 아니며, 대부분의 배아 유산은 여전히 그 어떠한 알려진 원인이 없다.
후성유전정보는 동물의 발육 과정에서 지극히 중요한 역할을 한다. 생체 내의 모든 세포는 일련의 DNA 서열을 공용하고 있으나, 후성유전체의 조절하에 세포를 상이한 종류로 분화되게 하여 상이한 기관이 형성된다. 다시 말하면, 배아 초기 발육 과정에서 상이한 발육 단계의 세포는 반드시 특정된 후성유전체 패턴을 따라야 하며, 이와 같은 패턴은 배아의 전능성을 확보하여 정확한 방향으로 분화 발육하도록 유도한다. 포유동물 초기 배아 발육 과정에서 전체 게놈 수준의 DNA의 탈 메틸화가 일어난다. 메틸기전달효소 DNMTs 또는 Tet3 유전자 서열의 인위적인 제거는 DNA메틸화 재프로그래밍을 저지하여 배아 발육 이상을 초래할 수 있다.
본 발명은 세계 최초로 후성유전정보의 방법으로 배아의 상태를 감별하여 체외 배양 단계의 포배에서 배아 전체에 대하여 비침습적인 것이지만 배아 전체의 DNA 메틸화 상태 및 각 염색체의 배수 상태를 대표할 수 있는 몇 개의 영양외배엽 세포를 분리하는, 배아 이식 전 후성유전체 선별 기술(preimplantation epigenetic examination, PEGE)을 기반으로 한 발육이 우수한 포배를 선별하는 비침습적 검사 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
배아가 상실배로 발육된 후 상실배는 추가로 분열하며, 이와 동시에 자궁강 내의 분비액은 투명대를 통해 세포에 삼투되어 점차적으로 할강이 형성되어 포배강으로 된다. 포배강 외부를 둘러싼 것은 편평세포층이며, 해당 층의 크기가 비교적 작은 세포는 태반의 일부로 변화되며, 영양외배엽 세포라고 한다. 배아 쪽에 몰려있는 크기가 비교적 큰 세포는 속세포덩이(inner cell mass, ICM)라고 하며, 속세포덩이의 세포는 배아줄기세포로서 미분화된 세포이며, 발육 전능성을 가지고 있어 나중에 태아의 각 조직으로 발육된다. 영양외배엽 세포는 나중에 태막과 태반으로 발육되기에, 유전자 진단시 일반적으로 소량의 영양외배엽 세포를 취하여 검사하며, 이는 정상적인 태반의 형성에 영향을 주지 않을 뿐만 아니라 태아의 발육에는 더 영향을 주지 않는다.
본 발명은 “one-tube” 방법으로 미량 세포의 전체 게놈 메틸화 라이브러리를 구축한 후, 샘플에 대해 전체 게놈 메틸화 시퀀싱을 진행하였다. AA급 배아의 평균 DNA 메틸화 수준을 평가 기준으로 하였는 바, 즉, 임상 이식 전 배아의 비침습적 검사의 정량 기준으로 하였다. 측정된 배아의 메틸화 상태가 기준치에 가까울수록, 이의 발육 상태가 더 우수하고, 정상 태아로 발육될 가능성이 더 크며, 이식에 더 적합하다는 것을 증명한다. 이와 동시에, 측정된 메틸화 결과에 대한 분석을 진행하면 각 배아 게놈 중 염색체 배수의 이상 여부를 판단할 수 있으며, 염색체에 이상이 있는 배아는 배아 이식에 사용될 수 없다. 따라서, 본 발명에 따른 방법에 의해 임상 의사들은 염색체 배수가 정상적일 뿐만 아니라 후성유전 프로파일이 더 우수한 배아를 선택하여 배아 이식을 할 수 있다.
본 발명에 따른 연구에 의하여, 가드너 형태 포배 그레이딩에서 형태가 우수한 AA급 배아의 전체 게놈 메틸화 수준은 매우 일치하며(도 1); 형태가 일반적인 B*급 배아에서 일부 배아의 전체 게놈 메틸화 수준은 AA급 수준과 일치하나, 일부 배아의 DNA 메틸화 수준은 AA급 배아의 수준과 차이가 비교적 크며(도 2); 형태가 차한 C*급 배아에서 대부분 배아의 전체 게놈 메틸화 수준은 AA급 배아의 DNA 메틸화 수준과 명확한 차이가 존재(도 1)하는 것을 발견하였다. 종합적으로, 형태학적 그레이딩이 나쁠수록 AA급에 비하여 DNA 메틸화 수준 차이가 있는 배아를 포함할 비율이 더 높다.
이와 동시에, 본 발명은 모든 AA급 배아의 DNA 메틸화 패턴(DNA methylation pattern)이 매우 유사(도 3, 도 4)(즉, 동일한 게놈 영역 상이한 배아에서 동일한 과메틸화 또는 저메틸화 상태를 나타냄)하다는 것도 발견하였다. 하지만, 저품질의 배아에서는 여러 가지 상이한 상태를 나타냈다(도 3, 도 4).
본 발명은 인간 초기 배아의 발육과정에서 전체 게놈 수준의 후성유전정보의 불안정이 나타날 수 있고, 이는 출생률 저하를 초래하는 중요한 요소 중의 하나이며, 게놈 DNA 메틸화 프로파일은 배아 발육과정에서 아주 중요한 역할을 하며, 메틸화에 문제가 있는 배아에서 일부 핵심 유전자 조절 영역의 메틸화에 문제가 발생하였다(도 5, 도 6)는 것을 증명하였다. DNA 메틸화 수준이 기준에 부합되거나 가까운 포배는 배아 이식의 가장 이상적인 선택이다. PEGE 검사를 통하여 DNA 메틸화 수준이 AA급에 더 가까운 배아를 선별하여 이식할 수 있으며, 배아의 후성유전물질에 대한 직접적인 분석을 진행하여 배아 발육의 이상 여부를 판단하여 이식에 더 적합한 배아를 선별할 수 있다. 보조생식기술의 정확도를 잠재적으로 크게 향상시킬 수 있고, “시험관 아기”의 임신 성공률을 향상시키며, 자연 유산율을 낮추고, 임신의 질을 향상시키며, 시험관 아기의 출생률을 증가시킬 수 있다(도 7).
또한, 비침습적으로 몇 개의 영양외배엽 세포를 수득하여 측정한 DNA 메틸화 수준은 배아 전체의 DNA 메틸화 수준을 대표할 수 있다(도 8). 따라서, 본 검사 방법은 우선 비침습적으로 영양외배엽에서 몇 개의 세포를 수득하며, 나아가 이들 세포의 메틸화 프로파일을 측정한다. 가드너 형태 포배 그레이딩에서의 AA급 배아의 DNA 메틸화 수준의 평균치인 0.3 ± 0.02 를 발육이 우수한 포배를 선별하는 기준으로 한다. 동일 부모 유래의 다수 배아에 대하여, DNA 메틸화 수준이 0.3에 가까운 배아일수록 배아 이식에 더 적합하다.
과거 배아 이식 가능 여부를 검사하는 하나의 중요한 지표는 배아 염색체 이상 여부이며, 측정한 메틸화 프로파일에 의해 배아의 각 염색체 배수의 정상 여부를 동시에 판정할 수 있다. 예로, 메틸화 프로파일의 데이터를 사용하여, 많은 배아의 염색체에 문제가 발생한 것을 발견하였으며(표 2), 예로, 샘플 s-25-4CC의 염색체에 대한 분석에서(도 9) 제5번에서 하나의 큰 단편이 하나 더 복제되었고, 제9번 염색체에서 하나의 큰 단편이 하나 적게 복제되었으므로, 해당 배아는 배아 이식에 사용될 수 없음을 설명한다.
종합적으로, 비침습적으로 영양외배엽에서 몇 개의 세포를 수득하여 메틸화 프로파일 측정을 진행함으로써 DNA 메틸화 수준 지표, DNA 메틸화 패턴, 및 염색체의 상태를 얻을 수 있으므로, 임상 의사들은 염색체 배수가 정상적일 뿐만 아니라 후성유전 프로파일이 더 우수한 배아를 선택하여 배아 이식을 할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 검사대기중의 포배 영양외배엽 세포 게놈에 대해 메틸화 검사를 진행하여, 가드너 형태 포배 그레이딩 시스템으로 판정한 형태가 우수한 배아의 DNA 메틸화 수준을 기준으로 하여, DNA 메틸화 수준이 해당 기준에 가깝거나 동일한 경우는 검사대기중 포배의 발육이 우수한 것이며, 상기 가드너 형태 포배 그레이딩 시스템으로 판정한 형태가 우수한 배아는 AA, AB, BA, BB급 포배를 의미하는, 발육이 우수한 포배를 선별하는 비침습적 검사 방법을 제공한다.
본 발명에서 제공한 발육이 우수한 포배를 선별하는 비침습적 검사 방법은 가드너 형태 포배 그레이딩 시스템으로 판정한 형태가 우수한 배아의 DNA 메틸화 패턴(DNA methylation pattern)을 기준으로 하는 것을 추가로 포함한다.
추가로, 본 발명에서 제공한 발육이 우수한 포배를 선별하는 비침습적 검사 방법은 메틸화 시퀀싱 결과에 의하여 포배의 각 염색체 배수의 정상 여부를 판단하는 것을 추가로 포함하며, 표준 이배체인 경우, 검사대기중의 포배의 염색체는 정상이다.
본 발명은 임신율 증가에 있어서, 상기 비침습적 검사 방법의 용도를 제공한다.
본 발명은 영양외배엽 세포의 DNA메틸화 수준이 가드너 형태 포배 그레이딩 시스템으로 판정한 형태가 우수한 배아의 DNA 메틸화 수준치에 가깝거나 동일한 포배를 선별하여 이식하며, 상기 가드너 형태 포배 그레이딩 시스템으로 판정한 형태가 우수한 배아는 AA, AB, BA, BB급 포배를 의미하는, 시험관 아기 출생률 증가 방법을 제공한다.
시험관 아기 출생률 증가 방법은 영양외배엽 세포의 메틸화 시퀀싱 결과에 따라, 검사대기중의 포배의 메틸화 시퀀싱 결과 모든 염색체가 모두 표준 이배체임을 나타내는 포배를 선별하여 이식하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명은 포배 메틸화 시퀀싱 키트로서, 가드너 형태 포배 그레이딩 시스템으로 판정한 형태가 우수한 배아의 DNA 메틸화 수준을 기준으로 하여, DNA 메틸화 수준이 해당 기준에 가깝거나 동일한 경우는 검사대기중 포배의 발육이 우수한 것이며, 상기 가드너 형태 포배 그레이딩 시스템으로 판정한 형태가 우수한 배아는 AA, AB, BA, BB급 포배를 의미하는, 발육이 우수한 포배를 선별하는 키트를 제공한다.
추가로, 본 발명에서 제공한 발육이 우수한 포배를 선별하는 키트는 포배 메틸화 시퀀싱 키트로서, 검사대기중의 포배의 DNA 메틸화 시퀀싱 결과 모든 염색체가 모두 표준 이배체임을 나타내는 경우, 검사대기중 포배는 발육이 우수한 포배이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 키트의 검사 대상은 포배의 영양외배엽 세포이다.
본 발명은 발육이 우수한 포배를 선별하는 키트의 제조에 있어서, 가드너 형태 포배 그레이딩에서 형태가 우수한 배아는 AA, AB, BA, BB급 포배를 의미하는 가드너 형태 포배 그레이딩에서 형태가 우수한 배아의 DNA 메틸화 수준치의 용도를 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 실시예에 따른 메틸화 시퀀싱 방법으로 검사대기중의 포배의 영양외배엽 세포의 게놈에 대한 DNA 메틸화 시퀀싱을 진행하여, 검사대기중의 포배의 영양외배엽 세포의 DNA 메틸화 수준을 검사하며, DNA 메틸화 수준이 0.3 ± 0.2 범위 내인 경우, 검사대기중 포배의 발육이 우수하다.
바람직하게는, 검사대기중의 포배의 영양외배엽 세포의 DNA 메틸화 수준이 0.3 ± 0.02 범위 내인 경우, 검사대기중 포배의 발육이 우수하다.
더 바람직하게는, 검사대기중의 포배의 영양외배엽 세포의 DNA 메틸화 패턴(DNA methylation pattern)이 AA급 포배의 패턴에 가까운 경우, 검사대기중 포배의 발육이 우수하다.
더 바람직하게는, 본 발명에 따른 발육이 우수한 포배를 선별하는 비침습적 검사 방법은 DNA 메틸화 시퀀싱으로 얻은 데이터에 의하여, 포배의 각 염색체 배수의 정상 여부를 판단하는 것을 추가로 포함하며, 표준 이배체인 경우, 검사대기중의 포배의 염색체는 정상이다.
추가로, 본 발명은 본 발명의 실시예에 따른 메틸화 시퀀싱 방법을 사용하여, 영양외배엽 세포의 DNA 메틸화 수준이 0.3 ± 0.2인 포배를 선별하여 이식 하는, 시험관 아기 출생률 증가 방법을 제공한다.
바람직하게는, 영양외배엽 세포의 DNA 메틸화 수준이 0.3 ± 0.02인 포배를 선별하여 이식한다.
더 바람직하게는, 영양외배엽 세포의 메틸화 시퀀싱 결과에 따라 모든 염색체가 모두 표준 이배체인 포배를 선별하여 이식하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명은 본 발명의 실시예에 따른 DNA 메틸화 시퀀싱 방법을 사용하여, 검사대기중의 포배의 DNA 메틸화 수준 평균치가 0.3 ± 0.2이고, DNA 메틸화 패턴이 AA급 포배의 패턴에 가까우며 및/또는 검사대기중의 포배의 메틸화 시퀀싱 결과 모든 염색체가 모두 표준 이배체임을 나타내는 경우, 검사대기중 포배의 발육이 우수한, 발육이 우수한 포배를 선별하는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 키트는 검사대기중의 포배의 DNA 메틸화 수준 평균치가 0.3 ± 0.02이고, DNA 메틸화 패턴이 AA급 포배의 패턴과 가까우며 및/또는 검사대기중의 포배의 메틸화 시퀀싱 결과 모든 염색체가 모두 표준 이배체를 나타내는 경우, 검사대기중 포배의 발육이 우수하다.
본 발명에 따른 키트의 검사 대상은 포배의 영양외배엽 세포이다.
본 발명은 발육이 우수한 포배를 선별하는 키트의 제조에 있어서, 가드너 형태 포배 그레이딩에서 AA급 배아의 DNA 메틸화 수준치의 용도를 제공한다. 본 발명의 실시예에 따른 메틸화 검사 방법으로 검사한 AA급 배아의 DNA 메틸화 수준치는 0.3 ± 0.02이다. 검사대기중의 포배 영양외배엽 세포의 DNA 메틸화 수준이 0.3에 가까울 수록 검사대기중 포배는 배아 이식에 더 적합하다.
본 방법에 따르면 배아 중 각 염색체의 상태를 동시에 검사할 수 있으며, 염색체에서 복제수의 변화가 없는 배아만이 배아 이식에 사용될 수 있는 바, 즉, 모두 표준 이배체인 배아만이 이식에 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 한가지 메틸화 시퀀싱은 두가지 지표를 동시에 얻을 수 있는 바, 즉, 배아 DNA 메틸화 프로파일(DNA 메틸화 수준을 포함)과 배아의 각 염색체의 상태를 동시에 얻을 수 있으며, 두가지 지표를 동시에 종합하여 배아를 선별하여 배아의 보조생식에 사용한다. 이는 과거 방법에 비해 탁월한 우세를 가지고 있다.
본 발명에 따른 방법은 이식 전 배아의 발육 상태와 발육 잠재력에 대한 양적 선별이다. 본 발명에 따른 방법과 전통적인 형태학적 선별은 동일한 응용범위를 가지며, AA급, B*급 또는 C*급을 포함한 모든 형태학적 그레이딩의 배아에 적합하나, 해당 방법은 더 객관적이고 정확하다. 이와 동시에, 해당 기술은 모든 배아의 선별에 사용될 수 있으며, 보조생식기술의 정확성을 크게 향상시키고, 수술 위험성을 저하시키며, 환자의 고통을 경감하며, 시험관 아기의 성공률을 추가로 증가시킬 것으로 기대된다. 본 발명의 유익한 효과는 구체적으로 하기와 같다:
1. 본 발명에 따른 방법은 전통적인 형태학과 PGS에 기초하여, 추가로 발육이 우수한 배아에 대해 양적 선별을 진행하여 시험관 아기의 성공률을 향상시키고, 유산율을 저하시킨다.
본 발명에 따른 방법은 전통적인 현미경에 의존하는 기술인 형태학적 등급이 높은 배아를 선택하여 이식하는 배아 형태학에 비하여 더욱 객관적이며, 형태학 그레이딩에서 많은 형태학적 검사가 의료진의 개인적인 경험에 더 의존하는 인위적인 불확정성을 방지하였다. 이와 동시에, 형태학적 우열은 게놈과 후성유전체의 상태를 완전히 대표할 수 없어, 포배의 발육상태와 잠재력을 정확히 예측할 수 없다. 하지만, 본 발명에 따른 방법은 배아의 후성유전정보에 대한 직접적인 측정과 분석을 진행할 수 있어, 배아가 표준 DNA 메틸화 프로파일을 가지고 있는지, 그리고 정상적으로 태아로 발육할 수 있는 잠재력이 있는지를 정확히 판단함과 동시에 염색체의 정상 여부를 검사하여, 발육이 우수하고 염색체가 정상인 배아를 선별할 수 있다. 본 발명의 PEGE 방법에 따르면, 후성유전학 정보를 사용하여 배아를 선별하고, 이식 전 검사를 진행하는 개념을 국제적으로 최초로 제출하였다.
2. 본 발명에 따른 PEGE 방법은 현재 사용되고 있는 PGS 방법에 비하여 우수하다.
PGD/PGS는 국제적으로 배아의 DNA 서열과 염색체 구조 분석에 흔히 사용되는 방법으로서, 배아에 염색체 이상 존재 여부를 판단한다. 하지만, 정상적인 염색체 이상 또는 유전성 질환이 없는 대다수 사람들에 대해 작용이 없으며, 대다수 사람들의 ART 시술 후의 임신율과 아기 출생률을 향상시킬 수 없다. 그러나 본 발명에 따른 발육이 우수한 포배를 선별하는 비침습적 검사 방법은 모든 사람들에게 적용 가능함과 동시에 염색체 이상을 검사할 수도 있다. 따라서, 본 발명에 따른 PEGE 방법은 기존의 PGS 방법의 염색체 이수성 문제 존재 여부에 대한 검사를 완성하였을 뿐만 아니라 배아 발육 후성상태가 더 우수한 배아를 선별하였으므로, 본 발명에 따른 방법은 기존 PGS 방법에 비해 현저히 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 PEGE 방법은 앞으로 임상에 응용되어 이식 전 배아에 대한 가장 보편적이고 기초적이며 정확한 선별 수단이 될 것으로 기대된다.
3. 다태 임신을 방지하여 태아감소술의 실시를 감소한다.
시험관 아기의 평균 성공률은 20%~30%인 바, 일차 이식 성공률을 높이기 위하여, 일반적으로 2~3개의 배아를 동시에 이식하며, 이로 인하여 일부 다태 현상이 종종 나타날 수 있다. 다태는 단태에 비해 위험성이 더 높으며, 이러한 위험성은 엄마와 아기 모두에 존재한다. 권위적인 조사에 따르면 쌍둥이의 제왕절개율은 78.45%이고, 조산은 47.07%이며, 합병증과 병발증은 39.7%이다. 쌍둥이 및 다둥이의 엄마는 임신기간에 당뇨병, 고혈압 등 임신기 증후군 발생 가능성이 더 크고, 산후 출혈의 확률도 더 높음과 동시에 조산 가능성도 더 크다. 조산아 대부분은 선천성 폐질환이 발생할 수 있으며, 이와 같은 질환은 평생 질환이다. 엄마와 아이의 안전을 위하여, 삼둥이 이상은 원칙상 태아감소술을 진행하여야 하나, 태아감소술의 모든 배아의 유산을 초래할 가능성은 10%이다. 본 발명에 따른 방법은 한번에 다수의 배아의 동시 이식에 따른 다태임신 현상 발생을 방지할 수 있고, 임산부의 고통을 감소하여 배아 생존율 억제와 임신의 성공률을 확보하였다.
도 1은 형태학 그레이딩에서 등급이 제일 높은 AA급 배아와 등급이 낮은 CC 또는 CB급 배아의 DNA 메틸화 수준 도면이다. AA-1과 CB-1의 배아는 동일 부부 유래이며, AA-3과 CC-6도 동일 부부 유래이다. AA의 DNA 메틸화 수준은 0.3 ± 0.02 사이이고, CC 또는 CB의 DNA 메틸화 수준은 전반적으로 AA와 매우 큰 차이가 있는 결과를 나타낸다.
도 2는 6개의 BB 또는 BA급 배아의 DNA 메틸화 수준 도면이다. 두 점선은 5개 AA급 배아의 DNA 메틸화 수준의 SD 오차를 나타낸다. 3개의 DNA 메틸화 수준은 AA와 유사하며(BB-3, BB-4, BB-5), 3개의 DNA 메틸화 수준은 AA와 매우 큰 차이가 있는(BA-1, BB-2, BB-6) 결과를 나타낸다.
도 3은 각 배아의 CpG 메틸화 패턴에 따른 주성분 분석 도면이다(PCA분석). AA급 배아의 DNA 메틸화 패턴은 매우 유사하나, CC 또는 CB의 DNA 메틸화 패턴은 AA와 비교적 큰 차이가 있고, 각 배아 사이의 상태도 비교적 큰 차이가 있다.
도 4는 5개 AA급 배아와 7개 CB 또는 CC급 배아에서 상이한 게놈 기능 요소의 평균 DNA 메틸화 수준이다. 5개 AA급 배아의 각 기능 요소의 DNA 메틸화 수준은 유사하나; 7개 CC또는 CB급 배아의 각 기능 요소의 DNA 메틸화 수준 차이는 매우 크며, 다수 배아는 AA와 비교적 큰 차이가 있다.
도 5는 상이한 형태학 그레이딩 배아의 메틸화 재프로그래밍 기능 분석 도면이다. 형태학 그레이딩에서 등급이 높은 배아와 등급이 낮은 배아를 비교하여, 메틸화 가변 영역(Differentially Methylated Region, DMR)의 기능농축분석을 진행한다. 프로모터가 DMRs 영역에 위치한 유전자는 DAVID GO 농축분석을 사용한다. 유전자 내부 DMRs 영역의 수평작용요소(cis-acting element)는 GREAT tools로 분석한다. GO분석에서 p값 < 0.05인 경우, 통계학적으로 의의가 있다. 메틸화 오류가 발생한 영역은 흔히 세포 생존에 아주 중요한 기초대사 유전자, 또는 발육, 특히 신경 발육 관련 유전자에서 발생하는 결과를 나타냈으며, 정상적인 메틸화 프로파일은 배아의 발육에 아주 중요하다는 것을 설명한다.
도 6은 상이한 배아에서 IDH2 유전자 부근의 인핸서가 서로 상이한 메틸화 상태를 나타내는 도면이다. 도면에서는 등급이 높은 배아와 등급이 낮은 배아의 평활한 DNA 메틸화 수준의 연장 게놈 영역의 상하 5kb의 영역을 나타냈다. 샘플 AA1, AA2, AA3의 인핸서 주변의 메틸화 상태는 유사하나, 샘플 CC5와 CC6의 인핸서 메틸화 상태는 문제가 발생하였다. 검정색 짧은 바는 CpG 위치를 표시한다.
도 7은 각 등급별 배아에서 DNA 메틸화 수준이 0.3 ± 0.02 범위인 비율 및 상이한 등급 배아의 출생률이다. C*의 출생률로 CC와 C*의 출생률을 대체하였기에, 도면에서 C* 배아의 출생률은 CC와 C*의 출생률 합계보다 높다. 해당 도면은 메틸화 상태가 우수한 배아는 더 우수한 출생률을 얻는 경향이 있다는 것을 설명한다.
도 8은 비침습적으로 얻은 몇 개의 영양외배엽 세포의 DNA 메틸화 수준이 전체 배아의 DNA 메틸화 수준과 유사한 것을 나타내는 도면이다. BB-7-TE와 CC-8-TE는 각각 배아 BB-7과 CC-8에서 채취한 몇 개의 영양외배엽 세포이다.
도 9는 DNA 메틸화 프로파일의 결과에 의해 염색체 복제수를 분석한 것이다. 샘플 s-25의 제5번 염색체에서 하나의 단편이 하나 더 복제되었고, 제9번 염색체의 하나의 단편이 하나 적게 복제되었다. 해당 배아 염색체는 이상이 발생하였으므로 배아 이식에 사용될 수 없음을 설명한다.
이하 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 요지와 실체를 벗어나지 않은 상황하에서, 본 발명에 따른 방법, 단계 또는 조건에 대한 수정 또는 교체는 모두 본 발명의 범위에 속한다.
특별한 설명이 한없는 한 실시예에서 사용한 화학 시약은 모두 통상적으로 시판되는 시약이며, 실시예에서 사용한 기술 수단은 당업자에게 잘 알려진 통상적인 수단이다.
실시예1. 인간 포배에서 전체 게놈 수준의 DNA메틸화 불안정의 발견
본 발명에서는 가드너 형태 포배 그레이딩 시스템으로 그레이딩한 등급이 제일 높은 AA급과 등급이 낮은 CC, BC 또는 CB급의 포배를 수집하였는 바, 이들 포배는 협력기관인 베이징대학 제3병원(Peking University Third Hospital)과 광저우의과대학부속 제3병원(The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University)에서 얻었으며, 환자의 보조생식수술에서 체외에서 동시에 몇 개의 포배를 배양한 후 형태가 제일 우수한 포배를 선택하여 이식하고, 나머지 포배는 환자 본인의 허락하에 동의서를 체결한 후 해당 과제의 과학연구에 사용되도록 기부하였다. 각각의 포배에 대하여 단일 염기 해상도의 전체 게놈 메틸화 시퀀싱을 진행하였다. 본 발명에 따른 “one-tube”실험 방법은 하기와 같다:
1. 샘플의 준비
영양외배엽 세포를 배아에서 분리한 후, 200μl 튜브에서 5μl 이하의 배아 전용 배양액 또는 PBS에 보관하여, -80℃에서 신속하게 냉동 보관하였다.
2. 세포의 분해
세포 분해 완충액
성분 첨가 부피 최종 농도
Tris-EDTA
(1M Tris，0.1M EDTA）		 0.1μl 20mM Tris，2mM EDTA
1M KCl 0.1μl 20mM
20mg/ml QIAGEN proteaseK 0.5μl 1ug/μl
10mg/ml RNAse A 0.5μl 1ug/μl
반응 총 부피 5~10μl
냉동 보관한 샘플을 꺼내어 실온에서 녹인 후, 4℃에서 3000g로 5min 동안 직접 원심분리하였다. 56℃에서 1.5h 동안 단백질 소화(Proteopepsis)를 진행한 후, 75℃에서 30min 동안 프로테아제를 불활성화시켰다.
3. DNA 절단
1000pg 샘플 DNA당 5pg Lamda DNA의 비율로 메틸화되지 않은 Lamda DNA를 첨가하였다. 초순수로 샘플량을 50μl까지 보충하였다. 절단 조건: S2, 50μl, 400bp condition. 부피는 30μl로 농축하였다.
4. End-Repair 말단 보충
하기와 같은 반응 완충액을 준비하였다:
Figure 112018111872474-pct00001
20℃에서 30min 동안 반응시키고, 75℃에서 20min 동안 반응시켜 효소를 불활성화시켰다. 계속하여 다음 단계를 진행하거나, -20℃ 또는 더 낮은 온도에서 냉동 보관하였다.
5. dA-Tailing 3' 말단에 A를 첨가
전 단계의 반응 체계에 하기와 같은 시약을 보충하였다:
Figure 112018111872474-pct00002
37℃에서 30min 동안 반응시키고, 75℃에서 20min 동안 반응시켜 효소를 불활성화시켰다. 계속하여 다음 단계를 진행하거나, -20℃ 또는 더 낮은 온도에서 냉동 보관하였다.
6. 어댑터의 첨가
전 단계의 반응 체계에 하기와 같은 시약을 보충하였다:
Figure 112018111872474-pct00003
충분히 혼합하여 16℃에서 밤새(최소 8h) 반응시켰다. 계속하여 다음 단계를 진행하거나, -20℃ 또는 더 낮은 온도에서 냉동 보관하였다.
7. 메틸화 라이브러리 키트의 사용
설명서에 따라 50μl 샘플에 적합한 CT Conversion Reagent를 배합하였다. 하기와 같이 Bisulfite Conversion mixture를 준비하였다:
Figure 112018111872474-pct00004
충분히 혼합하고, 각각의 샘플을 두개의 튜브에 평균 분배(튜브당 75μl)하고, 하기와 같은 과정을 수행하였다: 98℃ 10min; 64℃, 2h; 4℃에서 최대 2시간 동안 방치하였다. 키트 중의 스핀컬럼(spin column)을 수집관에 넣고, binding buffer 600μl 및 Carrier RNA 0.5μl를 첨가하였다. 전 단계의 binding buffer에 샘플 150μl를 첨가하였다. 피펫팅(pipetting)에 의해 균일하게 혼합하고, 튜브 덮개를 닫아 5min동안 방치하였다. 최소 10000rpm으로 1min 동안 원심분리하였다. 수집관 중의 시약을 다시 스핀컬럼에 첨가하고， 다시 1min 동안 원심분리하였다. 원심분리된 시약을 제거하였다. 스핀컬럼에 Wash Buffer 100μl를 첨가하고, 최소 10000rpm으로 1min 동안 원심분리하였다. 스핀컬럼에 De-sulphonation Buffer 200μl를 첨가하고, 실온에서 15~20min 동안 방치하였다. 최소 10000rpm으로 1min 동안 원심분리하였다. 원심분리된 시약을 제거하였다. 스핀컬럼에 Wash Buffer 100μl를 첨가하고, 최소 10000rpm으로 1min동안 원심분리하였다. 스핀컬럼에 Wash Buffer 100μl를 첨가하고, 최소 10000rpm으로 1min 동안 원심분리하는 단계를 반복하고, 수집관 중의 시약을 제거한 다음, 스핀컬럼을 새로운 1.5mL 원심분리 튜브에 넣었다. 초순수 11μl를 첨가하고, 실온에서 10min 동안 방치하였다. 최소 10000rpm으로 1min 동안 원심분리하였다. 초순수 11μl를 첨가하고, 실온에서 10min 동안 방치하고. 최소 10000rpm으로 1min 동안 원심분리하는 단계를 반복하였다. 원심분리된 샘플이 바로 Bisulfite로 처리한 후의 DNA이다. 계속하여 다음 단계를 진행하거나, -20℃ 또는 더 낮은 온도에서 냉동 보관하였다.
8. 제1차 PCR 증폭
PCR 증폭 키트를 사용하였다. 하기와 같은 증폭 완충액을 준비하였다:
Figure 112018111872474-pct00005
하기와 같은 순환 단계에 따라 증폭을 실시하였다: 98℃ 45s; 98℃ 15s; 65℃ 30s; 72℃ 30s, 총 6회 순환; 72℃ 1min. 4℃ 유지.
계속하여 다음 단계를 진행하거나, -20℃ 또는 더 낮은 온도에서 냉동 보관하였다.
9. 전 단계의 DNA 샘플에 동일한 부피(50μl)의 AMPure XP Beads를 첨가하고, 균일하게 충분히 혼합하여 원심분리하였다. 37℃에서 10min 동안 정치하였다. 튜브를 마그네틱 랙에 놓아 5min동안 정치하였다. 75% 에탄올 200μl로 자성비드를 세척한 다음, 상등액을 흡입하여 제거하였다. 공기 중에서 자성비드를 2min 동안 건조시켜 에탄올을 휘발시켰다. 10mM Tris-HCl(pH 8.5) 25μl를 사용하여 자성비드를 재현탁시키고, 간단한 원심분리 후 5min 동안 정치한 다음, 마그네틱 랙에 방치하여 5min 동안 정치하였다. 상등액을 수집하여 새로운 200μl 원심분리 튜브에 넣고, 계속하여 다음 단계를 진행하거나, -20℃ 또는 더 낮은 온도에서 냉동 보관하였다.
10. 제2차 PCR 증폭
PCR 증폭 키트를 사용하였다. 하기와 같은 증폭 완충액을 준비하였다:
Figure 112018111872474-pct00006
하기와 같은 순환 단계에 따라 증폭을 실시하였다: 98℃ 45s; 98℃ 15s; 65℃ 30s; 72℃ 30s, 총 13~16회 순환; 72℃ 1min; 4℃ 유지. 계속하여 다음 단계를 진행하거나, -20℃ 또는 더 낮은 온도에서 냉동 보관하였다.
11. 겔 회수
DNA 샘플에 대하여 아가로스 겔 전기영동을 실시하며, 겔 농도는 2%, 전압은 90V로 제어하였다. 시퀀싱 요구에 따라, 적절한 크기의 DNA 단편을 절단하여 겔 회수를 진행하였다. 최종 단계의 DNA 용출을 진행할 때, 무균 초순수를 사용하여 3회로 나누어 총 50μl를 용출하였다.
12. 어댑터 제거
전 단계의 DNA 샘플에 AMPure XP Beads 0.8x(40μl)를 첨가하여 충분히 혼합시키고 원심분리하였다. 37℃에서 10min 동안 정치하였다. 튜브를 마그네틱 랙에 놓아 5min 동안 정치하여 자성비드가 흡착될 때까지 기다렸다. 자성비드가 흡입되지 않도록 조심스럽게 상등액을 흡입하여 제거하였다. 75% 에탄올 200μl로 자성비드를 세척한 다음, 상등액을 흡입하여 제거하였다. 공기 중에서 자성비드를 2min 동안 건조시켜 에탄올을 휘발시켰다. 10mM Tris-HCl(pH 8.5) 15μl를 사용하여 자성비드를 재현탁시키고, 간단한 원심분리 후 5min 동안 정치한 다음, 마그네틱 랙에 방치하여 5min 동안 정치하였다. 상등액을 수집하여 새로운 1.5mL 원심분리 튜브에 넣고, -20℃에서 냉동 보관하였다. 이 샘플이 바로 시퀀싱할 DNA 샘플이다.
상기 단계를 통하여 DNA 메틸화 라이브러리를 얻었으며, 라이브러리 검사 합격 후 시퀀싱을 진행할 수 있다. 얻은 포배 전체 게놈 메틸화 시퀀싱 데이터는 먼저 Bismark 정렬 소프트웨어를 통해 인간 참조 서열(hg19)과 정렬하였다. 인간 게놈 참조 서열에 유일하게 정렬된 시퀀싱 단편(read)은 PCR 중복 단편 및 양단 단편의 겹치는 영역을 제거한 후, 정렬 정보에 따라 Waston 사슬 단편과 Crick 사슬 단편으로 분류하였다. Samtools 소프트웨어를 통해 Waston 사슬 단편 유래의 시토신(Cytosine)과 Crick 사슬 단편 유래의 아데닌의 메틸화 정보를 각각 채집한 다음, 두 사슬의 정보를 병합하여 각각의 CpG 위치의 DNA 메틸화 수준을 얻었다. 전체 게놈 메틸화 수준은 각 CpG 위치의 DNA 메틸화 수준의 평균치이다.
연구에 의하여 검사를 진행한 5개 AA급 포배의 DNA 메틸화 수준은 모두 매우 유사하나, 검사를 진행한 7개 등급이 낮은 배아 중 6개 배아의 전체 게놈 메틸화 수준이 AA급 배아의 평균치와 현저한 차이가 나며, 이들 사이의 차이도 매우 선명하다는 것을 발견하였다. 등급이 높은 배아와 비교할 경우, 이러한 저등급 배아 중 일부는 과도하게 탈메틸화된 것이며, 또 다른 일부는 탈메틸화가 충분히 이루어지지 않은 것이다(도 1 참조). 6개의 BB 또는 BA급 배아 중 3개 배아의 DNA 메틸화 수준은 AA와 유사한 것으로서, 비교적 우수한 후보 이식 배아이며, 다른 3개 배아의 DNA 메틸화 수준은 배아 이식에 적합하지 않다(도 2).
추가로 바이오정보학 DNA 메틸화 패턴 주성분 분석(PCA)방법에 의하여, 5개 AA급 배아의 DNA 메틸화 패턴은 모두 유사하여 집락화될 수 있으나(도 3에서 원으로 표시), 7개 등급이 낮은 배아는 원 밖에 분산되어 있으며, DNA 메틸화 패턴이 AA급 배아와 비교적 큰 차이가 있는 것으로 나타났다.
상이한 배아의 동일한 기능 요소 영역의 DNA 메틸화 상태에 대한 비교 분석에 의하여, 동일한 기능 영역에서 5개 AA급 배아의 DNA 메틸화 패턴은 유사하나, 저등급 배아에서 동일한 기능 영역의 메틸화 상태는 서로 다른 것으로 발견되었다(도 4). 이로부터 인간 배아 초기 발육 과정에서 전체 게놈 수준의 후성유전체 불안정이 나타날 수 있으며, AA급 배아의 전체 게놈 메닐화 수준은 매우 일치하고(즉, 동일한 게놈 영역, 상이한 배아에서 동일한 과메틸화 또는 저메틸화 상태를 나타냄), 형태학 그레이딩이 비교적 낮은 B*와 C*의 배아 전체 게놈 메틸화 수준은 상이한 정도의 편차가 나타났으며, 형태학적 그레이딩 등급이 낮을수록 이의 DNA 메틸화 수준은 AA급에 비하여 더 큰 차이가 있다. 임상에서는 AA급 배아의 출생률이 가장 높고, DNA 메틸화 수준도 매우 일치하기 때문에, AA급 배아의 DNA 메틸화 패턴은 가장 정확한 것으로서, 초기 배아의 정상 발육을 유도할 수 있다고 여긴다.
실시예2 . 정확하지 않은 메틸화 재프로그래밍이 배아 초기 발육을 조절하는 신호경로에 미치는 영향
등급이 높은 배아와 등급이 낮은 배아에서 메틸화 상태가 상이한 영역에 대하여 유전자 기능 분석(gene ontology)을 진행하였다.
분석 결과 메틸화 가변 영역(DMR)이 유전자 프로모터에 위치한 유전자들은 주로 세포주기, DNA 신진대사, DNA 수식, 염색체 위치, RNA 프로세싱, DNA 복구, 세포주기 등과 같은 배아 발육에 관련된 많은 경로에 밀집되어 있는 것을 발견하였다(도 5). 메틸화 가변 영역이 유전자 내부에 위치한 유전자들은 주로 신경 발육, 신경원의 분화와 운명의 결정(fate determination), 척수의 구조, mRNA의 안정상태 등과 같은 특정 조직의 발육에 밀집되어 있다(도 5).
또한, 등급이 가장 낮은 CC급 배아에서 인핸서 영역의 메틸화는 흔히 잘못된 재프로그래밍이 발생하는 결과도 나타냈다. 메틸화 가변 영역이 인핸서에 위치한 유전자들은 발육과 대사에 관련된 경로에 밀집되어 있다. 도6은 상이한 배아에서 IDH2 유전자의 인핸서 및 부근 영역의 메틸화 상태를 나타낸 것으로서, AA급 배아는 해당 영역에서 모두 저메틸화 상태를 나타냈으나, CC급 배아는 과메틸화 상태를 나타냈다. 인핸서 영역의 과메틸화는 IDH2 유전자 발현량의 큰 감소를 초래하였다.
실시예3 . 이식 전 포배의 DNA 메틸화 수준과 ART 시술 후의 아기 출생률의 관계
본 실시예에서 AA급 포배의 평균 DNA 메틸화 수준인 0.3 ± 0.02를 평가 기준으로 하는 바, 즉, 임상 이식 전 포배의 비침습적 검사의 정량 기준으로 한다. 해당 기준은 형태학 검사에 기초하여 정상 발육 포배를 더 정확하게 선별하는 신규 임상 지표이다.
해당 지표의 정확성을 추가로 검증하기 위하여, 본 발명은 6개의 B*급 포배를 더 수집하였고(도 2), B*급 샘플 중 3개 샘플의 DNA 메틸화 수준이 AA급 포배의 평균 DNA 메틸화 수준인 0.3의 기준을 현저히 벗어난 결과를 나타냈다. 도 1에서도 5개 AA급 샘플 중 1개 샘플이 기준을 벗어나고, 검사를 진행한 7개 C*급 배아 중 6개가 모두 기준을 벗어난 것으로 나타났으며, 각 등급 포배의 DNA 메틸화 수준이 기준에 부합되는 비율은 각각 AA급은 약 80%, B*급은 약 50%, C*급은 약 14%이다(도 7). 도 7의 결과에 의하면, 각 등급 포배 중 DNA 메틸화 수준이 기준에 부합되는 샘플의 비율과 임상에서의 해당 등급의 아기 출생률은 유의한 정적 상관관계(positive correlation)를 나타낸다.
본 실시예에 따른 결과는 게놈 DNA 메틸화 프로파일은 배아 발육의 과정에서 매우 중요한 역할을 하며, DNA 메틸화 수준이 기준에 부합되거나 가까운 포배는 배아 이식의 가장 이상적인 선택임을 설명하였다.
실시예4. 이식 전 후성유전체 검사는 미세조작 기술로 포배에서 몇 개의 영양외배엽 세포를 분리하는 것으로 실현할 수 있다.
임상에서, 이식 전 유전학 진단(PGD) 기술은 이미 20년 이상의 응용 역사가 있으며, 생체 조직 검사 방법을 사용하여 포배에서 몇 개의 세포를 박리하여 유전자 돌연변이와 염색체 이상 등 질환의 진단에 사용한다. 본 실시예에서는 각 시험 포배의 영양외배엽 세포(TE)에서 몇 개의 세포를 분리하고, 실시예1에서 언급한 “One Tube” 극소량 세포 전체 게놈 메틸화 라이브러리 구축 방법을 사용하여 상이한 포배의 TE 메틸화 라이브러리를 각각 구축하는 동시에 상이한 포배의 나머지 세포로 평행적 메틸화 라이브러리를 구축하였다. 이 후, Hiseq시퀀싱 플랫폼을 사용하여 검사를 진행하였으며, 도8에서 TE 유래의 소량의 세포 DNA 메틸화 수준이 해당 포배의 전체 DNA 메틸화 수준과 유사하지만, 전체 포배의 메틸화 프로파일을 대표할 수 있는 것을 나타냈다. 따라서, 이와 같은 비침습적 생체 조직 검사 방법을 사용하여 이식 전 배아 DNA 메틸화 프로파일이 더 우수한 포배를 선별할 수 있다.
실시예5. 배아 염색체 이수성 검사
현재 광범위하게 사용되고 있는 PGD/PGS는 배아의 DNA 서열과 염색체 구조를 분석하여 배아의 염색체 이상 존재 여부를 판단하는 것이다. 하지만, 본 발명에 따른 DNA 메틸화 전체 유전자 시퀀싱 결과에 의해서도 염색체 배수를 판단할 수 있으며, 염색체 이상 알고리즘은 염색체 단편의 시퀀싱 정도에 대한 검사를 기반으로 한다. 정렬 후의 포배 전체 게놈 메틸화 시퀀싱 데이터에 대하여, GC 함량 및 정렬 선호성 등 요소를 제거한 후, 1메가 염기(1Mb)를 단위로 시퀀싱 깊이(sequencing depth)를 계산하였다. 다음, 은닉마르코프모델(HMM)을 통하여 시퀀싱 깊이의 유사성에 따라 염색체를 절단하였다. 시퀀싱 깊이가 극히 높거나 극히 낮은 영역은 해당 영역에 염색체가 배수로 증가 또는 결실이 존재한다는 것을 의미한다. 표 2의 결과에 의하면, 36개 배아 중 17개 배아에 염색체 이상이 존재하며, 배아 이식에 적합하지 않다는 것을 나타냈다. 샘플s-25를 예로, 이의 제5번 염색체의 하나의 단편이 하나 더 복제되었고, 제9번 염색체의 하나의 단편이 하나 적게 복제되었다(도 9).
따라서, 본 발명에 따른 PEGE 방법은 기존 PGS방법의 염색체 이수성 문제 존재 여부에 대한 검사를 완성하였을 뿐만 아니라, 배아 발육 후성상태가 더 우수한 배아를 선별하였으므로, 본 발명에 따른 방법은 기존 PGS방법에 비해 현저히 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 PEGE 방법은 앞으로 임상에 응용되어 이식 전 배아에 대한 가장 보편적이고 기초적이며 정확한 선별 수단이 될 것으로 기대된다. 본 발명에 따른 PEGE방법을 사용하면 염색체의 이상 문제를 동시에 검사할 수 있으며, 그 결과 17개 배아의 염색체가 배수 이상이 존재하는 것을 발견하였으며, 이들 배아는 배아 이식에 사용될 수 없다.
본 발명에 따른 방법으로 17개 배아의 염색체 배수에 대한 검사 상황
샘플명 성염색체XX/XY 염색체 이상
1_4AA_350 XY
11_3CC_sort XY
13_6AA_sort XY
2-4CC_sort XX
7_3CC_sort XX
8-3CC-350 XY
9-3CC-350 X \+7
BL-1-2CB XY
BL-1-4AA XX
BL-2-2CC XY -21
BL-2-4AA XY -19
MLCC-19 XX \+8,-18
MLCC-20 XX
MLCC-21 XY \+4
s_11-4BA XX -22
s_12-4CB XY
s_13-5CB XY \-15,+17
s_15-4CA XY -20
s_16-4BA XX \+22,+2
s_17-4CC XY \+2,+8,-16,-18,+21
s_25-4CC XY \+5Q,-9Q
s_31-5BC XY \-21,-22
s_32-5CC XX \+22
s_43-4BB XY
s_44-4CC XY
s_54-4BC XX -14
s_6-4BB XX \+1P
s_6-5AA XY \-1P,-4P
s1 XX
s4AA-13 XY
s4AA-14 XY
s4CC-22 XY
s4CC-23 XX
s4CC-24 XY
s4CC-25 XX
s4CC-26 X -X
이상 본 발명을 일반적인 설명 및 구체적인 실시형태를 통하여 상세히 설명하였으나, 본 발명에 기초하여 간단한 수정 및 개선을 진행할 수 있음은 당업자에게 있어서 자명한 것이다. 따라서, 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 진행한 이와 같은 수정 및 개선은 모두 본 발명이 청구하는 범위에 속한다.
본 발명은 발육이 우수한 포배를 선별하는 비침습적 검사 방법을 제공한다. 포배 중 소량의 영양외배엽 세포의 DNA 메틸화 프로파일 검사를 통하여, 가드너 형태 포배 그레이딩에서 형태가 우수한 배아의 DNA 메틸화 수준 평균치와 패턴을 발육이 우수한 포배의 선별 기준으로 하여, 검사대기중 포배의 영양외배엽 세포의 DNA 메틸화 수준이 우수한 배아의 DNA 메틸화 수준 또는 상태에 가까울 수록 배아의 발육이 더 우수하고, 모체 이식에 더 적합하며; 이와 동시에 메틸화 시퀀싱 결과에 대한 분석에 의하여 염색체의 이상 여부를 판단할 수 있기에, 염색체 이상 배아를 직접적으로 제거할 수 있다. 본 발명에서 제공한 발육이 우수한 포배를 선별하는 비침습적 검사 방법에 의해, 임상의사들은 염색체 배수가 정상적일 뿐만 아니라 후성유전프로파일이 더 우수한 배아를 선택하여 배아 이식을 할 수 있어, 보조생식기술의 정확성을 크게 향상시키고, 자연 유산율 감소에 유리하며, 임신의 질을 향상시키며, 시험관 아기의 출생률 증가에 유리하기에, 비교적 우수한 경제적 가치와 응용 전망을 가지고 있다.

Claims (10)

  1. 검사대기중의 포배 영양외배엽 세포 게놈에 대해 메틸화 검사를 진행하여, 가드너 형태 포배 그레이딩 시스템(Gardner morphological blastocyst grading system)으로 판정한 형태가 우수한 배아의 DNA 메틸화 수준인 0.3을 기준으로 하여, DNA 메틸화 수준이 기준인 0.3 ± 0.2 범위 내에 있는 경우는 검사대기중 포배의 발육이 우수한 것이며, 상기 가드너 형태 포배 그레이딩 시스템으로 판정한 형태가 우수한 배아는 AA, AB, BA, BB급 포배를 의미하며, 상기 포배는 인간을 제외한 포유동물의 포배인 것을 특징으로 하는, 발육이 우수한 포배를 선별하는 비침습적 검사 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 가드너 형태 포배 그레이딩 시스템으로 판정한 형태가 우수한 배아의 DNA 메틸화 패턴을 기준으로 하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 비침습적 검사 방법.
  3. 제1항에 있어서, 메틸화 시퀀싱 결과에 의하여 포배의 각 염색체 배수의 정상 여부를 판단하는 것을 추가로 포함하며, 표준 이배체인 경우, 검사대기중의 포배의 염색체는 정상인 것을 특징으로 하는, 비침습적 검사 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 임신율을 증가시키기 위한, 비침습적 검사 방법.
  5. 영양외배엽 세포의 DNA 메틸화 수준이 (i) 0.3 ± 0.2 범위 내에 있되, 0.3은 가드너 형태 포배 그레이딩 시스템으로 판정한 형태가 우수한 배아의 DNA 메틸화 수준치를 의미하는 것인 DNA 메틸화 수준; 및 (ii) 가드너 형태 포배 그레이딩 시스템으로 판정한 형태가 우수한 배아의 DNA 메틸화 패턴인 AA급 포배의 DNA 메틸화 패턴에 해당하는 DNA 메틸화 패턴 중 어느 하나인 포배를 선별하여 이식하며, 상기 가드너 형태 포배 그레이딩 시스템으로 판정한 형태가 우수한 배아는 AA, AB, BA, BB급 포배를 의미하며, 상기 포배는 인간을 제외한 포유동물의 포배인 것을 특징으로 하는, 시험관 아기 포유동물의 출생률 증가 방법.
  6. 제5항에 있어서, 영양외배엽 세포의 메틸화 시퀀싱 결과에 따라 모든 염색체 수가 모두 표준 이배체인 포배를 선별하여 이식하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 삭제
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