CN105861658A - 一种筛选优良发育囊胚的无创检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种筛选优良发育囊胚的无创检测方法，通过检测囊胚中少量滋养层细胞的DNA甲基化谱，以加纳德形态囊胚分级中的形态优良胚胎的甲基化水平平均值和模式作为筛选发育优良囊胚的标准，待测囊胚滋养层细胞的甲基化水平越接近优良胚胎甲基化水平或状态，胚胎发育越优良、越适于植入母体；同时对甲基化测序结果的分析可以判断染色体是否异常，直接剔除染色体异常的胚胎。本发明方法可以让临床医生选择既是染色体倍数正常、又是表观遗传图谱更优良的胚胎进行胚胎移植，可以大幅提升辅助生殖技术的精准性，有利于降低自然流产率，提高妊娠质量，提高试管婴儿出生率。

Description

一种筛选优良发育囊胚的无创检测方法
技术领域
本发明涉及全基因组水平的表观遗传信息学领域，具体地，涉及一种筛选优良发育囊胚的无创检测方法。
背景技术
体外受精和胚胎移植(IVF-ET)俗称“试管婴儿”。是一种特殊的临床辅助生殖技术，需要把卵子和精子都拿到体外来，让它们在体外人工控制的环境中完成受精过程，然后把早期胚胎移植到女性的子宫中，在子宫中孕育成为孩子。这种利用体外受精技术产生的婴儿也称为试管婴儿。植入前要对体外获得的胚胎进行筛选，目前临床上有以下两种方法：
(1)加德纳形态囊胚分级系统(Gardner morphological blastocystgrading system)。在试管婴儿过程中囊胚培育与移植是很重要的一个步骤。而试管婴儿囊胚质量的好坏是决定成功与否的重要因素。目前临床上采用加德纳形态囊胚分级系统，根据囊胚腔的大小和是否孵化,将囊胚的发育分为六个时期。1期:早期有腔室囊胚,囊胚腔小于胚胎总体积的1/2；2期:囊胚腔体积大于或等于胚胎总体积的1/2；3期:完全扩张囊胚，囊胚腔完全占据了胚胎的总体积；4期:扩张囊胚，囊胚腔完全充满胚胎，胚胎总体积变大，透明带变薄；5期:正在孵出的囊胚，囊胚的一部分从透明带中逸出；6期:孵出的囊胚,囊胚全部从透明带中逸出。处于3至6期的囊胚，还需对其内细胞团和滋养层细胞进行质量分级。细胞团分级：A级，细胞数目多，排列紧密；B级，细胞数目少,排列松散；C级，细胞数目很少。滋养层细胞分级：A级，上皮细胞层由较多的细胞组成，结构致密；B级，上皮细胞层由不多的细胞组成，结构松散；C级，上皮细胞层由稀疏的细胞组成。根据这个分级方法，最好的囊胚评分应该是第5天的囊胚3AA，第6、7天的囊胚4AA。在ART治疗中，AA级的胚胎是最理想的选择，但临床上只有33％的夫妇可以获得AA级胚胎用于植入，52％的患者只能获得B*级囊胚(包含AB,BA,BB)。AA级胚胎的出生率为39％，B*级的胚胎出生率约为28％，而C*级(包含BC,CB),出生率为4％，其中CC级的出生率几乎为0。
加德纳形态囊胚分级系统(Gardner morphological blastocystgrading system)，是传统的依赖显微镜技术，挑选形态学等级高的胚胎进行移植的胚胎形态学，准确率差。临床试验数据显示，只凭形态学检测的辅助生殖治疗的反复流产人群的流产率为33.5％，临床妊娠率为45.8％。因为试管婴儿平均成功率为20-30％，为提高一次植入成功率，一般会同次植入2-3个胚胎，因此往往会出现一些多胞胎的现象。多胞胎比单胎更具有风险性，这种危险对于妈妈和孩子来说都存在。因此，为了保护母子的安全，三胞胎以上，原则上需要进行减胎术，减胎手术有10％的机会造成全部胚胎流产。
所以需要新的方法提高试管婴儿成功率，避免了因盲目地移植了多个胚胎以提高妊娠成功率，导致多胎妊娠而不得不在孕期实施减胎术造成的危害及伦理道德上的冲突。
(2)胚胎植入前基因筛查，即第三代试管婴儿(pre-implantationgenetic screening/diagnosis,PGS/PGD)。1990年，英国Handyside成功地用聚合酶链反应(PCR)技术分析卵裂球对性连锁性疾病携带者进行胚胎性别筛选后的妊娠分娩，完成了世界上第一例PGS，开创了产前筛查的新纪元。进入90年代，植入前筛查技术有了飞速发展。1994年，Monne用荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH)技术，在植入前筛查染色体非整倍体及胚胎性别获得成功。此后，多重PCR，荧光PCR，多色FISH等技术陆续发展。1998年FISH开始应用于染色体平衡易位的PGS。通过选择正常和平衡配子或胚胎，PGS可显著降低染色体易位导致的反复自然流产率。同年，商业化供应的能同时筛查13，18，21，X和Y五条染色体的五色探针也开始用于PGS中进行高龄妇女卵子和胚胎的非整倍体筛选。1999年以来陆续开展的间期核转换(interphase nuclerconversion)技术，比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)，全基因组扩增(wholegenome amplification,WGA)技术相继用于PGS，进一步促进了该技术的研究和应用。2010年以来，高通量测序技术(High-throughputsequencing)开始飞速发展，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，对一个胚胎的基因组进行细致全貌的分析成为可能，将PGS带入全新的领域。国内外对PGS技术的研究热情一直没有停止过，目前PGS主要应用于以下遗传病的诊断：a.染色体数目异常；b.胚胎性别诊断；c.基因缺失型遗传病；d.胚胎单基因病检查。
目前，美国有约12％的生育期妇女需要借助辅助生殖技术ART生育子代。在自然受孕的人群中，也有相当一部分由于胚胎发育异常而流产。在ART术后，大部分胚胎发育异常而流产。基因组不稳定性，例如各种基因突变，染色体结构或数目异常等，是导致流产的一个重要原因。为排除基因缺陷的早期胚胎，临床上采用植入前遗传学诊断技术(preimplantation genetic diagnosis，PGD)。这种技术是采用显微操作的方法从植入前胚胎的滋养层中分离出数个细胞，对这几个细胞进行基因组检测。PGD技术目前被广泛用于临床，被称为“第三代试管婴儿”，大大降低了接受辅助生殖治疗的反复流产人群的流产率，提高了临床妊娠率。
PGS胚胎植入前基因筛查，只针对染色体数目或是DNA序列发生改变的遗传性疾病有筛查作用。临床上还有大部分不孕或流产并不是由于DNA序列的改变导致的，仍有大部分的胚胎流产是没有任何已知的原因。
表观遗传信息在动物发育过程中起着至关重要的作用。机体内的所有细胞共用一套DNA序列，然而在表观基因组的调控下，使得细胞分化成不同的种类，形成不同的器官。也就是说，在胚胎早期发育过程中不同发育阶段的细胞必须遵循特定的表观基因组模式，这种模式确保了胚胎的全能性，指导其向正确的方向分化发育。哺乳动物早期胚胎发育的过程中会出现全基因组水平的DNA去甲基化。人为地敲除甲基化转移酶DNMTs或是Tet3的基因序列，阻止DNA甲基化重编程，可以导致胚胎发育异常。
发明内容
本发明目的在于提供一种筛选优良发育囊胚的无创检测方法，基于胚胎植入前表观基因组筛查技术(preimplantation epigeneticexamination,PEGE)，该方法是世界上首次使用表观遗传信息的方法来鉴定胚胎的状态，在体外培养阶段的囊胚中，分离出几个滋养层细胞，这几个细胞对整个胚胎是无创伤性的，但可以代表整个胚胎的甲基化状态以及各条染色体的倍数状态。
在胚胎发育成桑椹胚后，桑椹胚进一步分裂，同时宫腔中的分泌液通过透明带渗入细胞而逐渐形成一囊腔，成为囊胚腔。包围在囊胚腔外的为扁平细胞层，该层细胞个体较小的，将演变为胎盘的一部分，称为滋养层细胞。聚集在胚胎的一端，个体较大的细胞，称为内细胞团(inner cell mass，ICM)，内细胞团的细胞是胚胎干细胞是一种未分化的细胞，具有发育全能性，将来发育成胎儿的各种组织。由于滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘，所以做基因诊断时，通常取少量滋养层细胞检测，这样不会影响正常胎盘的形成，更不会影响胎儿发育。
本发明采用“one-tube”方法构建微量细胞全基因组甲基化文库，之后对样品进行全基因组甲基化测序。将AA级胚胎的平均甲基化水平作为衡量标准，即临床植入前胚胎无创检测的定量标准。被测胚胎的甲基化状态越接近标准值，证明其发育状态越优良，发育成为正常胎儿的潜能越大，越适合移植。同时，对测量的甲基化结果进行分析，可以判断各个胚胎基因组中染色体倍数是否异常，而染色体不正常的胚胎不能被用作胚胎移植。因此，通过本发明的方法，可以让临床医生选择不仅是染色体倍数正常、而且是表观遗传图谱更优良的胚胎进行胚胎移植。
本发明研究发现，以加德纳形态囊胚分级中形态优良的AA级的胚胎全基因组甲基化水平非常一致(图1)；而形态学一般的B*胚胎中部分胚胎的全基因组甲基化水平与AA级水平一致、部分胚胎的甲基化水平与AA级胚胎的水平差别较大(图2)；形态学差的C*胚胎中绝大多数胚胎全基因组甲基化水平都与AA级胚胎的甲基化水平有明显差别(图1)。总之，形态学分型越差的和AA级相比，包含甲基化水平差别的胚胎的比例越大。
同时，本发明还发现所有的AA级胚胎的甲基化模式(DNAmethylation pattern)十分相似(图3、图4)，(即相同的基因组区域，不同的胚胎中呈现相同的高甲基化或是低甲基化的状态)。而低质量的胚胎呈现出各种不同的状态(图3、图4)。
本发明证明了人类早期胚胎发育过程中会出现全基因组水平的表观遗传信息的不稳定，这是导致出生率降低的重要因素之一，基因组DNA甲基化谱在胚胎发育的过程中起着至关重要的作用，甲基化有问题的胚胎中一些关键基因的调控区域甲基化出现了问题(图5、图6)。甲基化水平符合或接近标准的囊胚是胚胎移植的最理想选择。可以通过PEGE检测，筛选出甲基化水平更接近AA级的胚胎进行植入，直接对胚胎的表观遗传物质进行分析，判断胚胎是否发育异常，筛选出更加适合移植的胚胎。可以潜在地大幅提升辅助生殖技术的精准性，提高“试管婴儿”的妊娠成功率，降低自然流产率，提高妊娠质量，提高试管婴儿出生率(图7)。
而且，无创伤的获取几个滋养层细胞而测量的甲基化水平可以代表整个胚胎的DNA甲基化水平(图8)。因此，本检测方法首选无创伤的获取滋养层中的几个细胞，进而测量这几个细胞的甲基化图谱。以加纳德形态囊胚分级中的AA级胚胎的甲基化水平平均值0.3±0.02作为筛选优良发育囊胚的标准。对同一父母来源的多个胚胎，甲基化水平越接近0.3的胚胎越适合胚胎的移植。
过去检测胚胎是否可以移植的一个重要指标是胚胎的染色是否异常，测量的甲基化图谱，同时可以判定胚胎的各个染色体的倍数是否正常。例如使用甲基化图谱的数据，发现很多胚胎的染色体发生了错误(表2)，例如对样品s-25-4CC的染色体分析(图9)，发现第4号一个大片段多了一个拷贝、而第9号染色体中一个大片段少了一个拷贝，说明此胚胎不能用于胚胎的移植。
总之，通过无创伤的获取滋养层中的几个细胞，进行甲基化图谱的测量，可以获得甲基化水平指标、甲基化模式、以及染色体的状态，从而可以让临床医生选择既是染色体倍数正常、又是表观遗传图谱更优良的胚胎进行胚胎移植。
具体地，本发明提供一种筛选优良发育囊胚的无创检测方法，对待检囊胚滋养层细胞基因组进行甲基化检测，以加德纳形态囊胚分级系统评判出的形态优良胚胎的甲基化水平为标准，甲基化水平接近或等于该标准的，则待检囊胚发育优良，所述加德纳形态囊胚分级系统评判出的形态优良胚胎是指AA、AB、BA、BB级囊胚。
本发明提供的一种筛选优良发育囊胚的无创检测方法还包括以加德纳形态囊胚分级系统评判出的形态优良胚胎的甲基化模式(DNAmethylation pattern)为标准。
进一步地，本发明提供的一种筛选优良发育囊胚的无创检测方法还包括根据甲基化测序结果，判断囊胚各个染色体倍数是否正常，若为标准二倍体则待测囊胚染色体正常。
本发明提供了上述无创检测方法在提高妊娠率中的应用。
本发明提供了一种提高试管婴儿出生率的方法，筛选滋养层细胞甲基化水平接近或等于加德纳形态囊胚分级系统评判出的形态优良胚胎的甲基化水平值的囊胚进行移植，所述加德纳形态囊胚分级系统评判出的形态优良胚胎是指AA、AB、BA、BB级囊胚。
一种提高试管婴儿出生率的方法，还包括根据滋养层细胞的甲基化测序结果，筛选待测囊胚的甲基化测序结果显示所有染色体均为标准二倍体的囊胚进行移植。
本发明提供一种筛选优良发育囊胚的试剂盒，其为囊胚甲基化测序的试剂盒，以加德纳形态囊胚分级系统评判出的形态优良胚胎的甲基化水平为标准，甲基化水平接近或等于该标准的，则待检囊胚发育优良，所述加德纳形态囊胚分级系统评判出的形态优良胚胎是指AA、AB、BA、BB级囊胚。
进一步地，本发明提供的一种筛选优良发育囊胚的试剂盒为囊胚甲基化测序的试剂盒，当待测囊胚的甲基化测序结果显示所有染色体均为标准二倍体时，待测囊胚为发育优良囊胚。
优选地，本发明试剂盒的检测对象为囊胚的滋养层细胞。
本发明提供了加纳德形态囊胚分级中的形态优良胚胎的甲基化水平值在制备筛选优良发育囊胚的试剂盒中的应用，所述加德纳形态囊胚分级中的形态优良胚胎是指AA、AB、BA、BB级囊胚。
具体地，采用本发明实施例的甲基化测序方法对待检囊胚滋养层细胞的基因组进行甲基化测序，检测待检囊胚滋养层细胞的甲基化水平，若甲基化水平在0.3±0.2范围内，则待检囊胚发育优良。
优选地，待检囊胚滋养层细胞的甲基化水平在0.3±0.02范围内，则待检囊胚发育优良。
再优选地，待检囊胚滋养层细胞的甲基化模式(DNAmethylation pattern)接近AA级囊胚的模式，则待检囊胚发育优良。
更优选地，本发明筛选优良发育囊胚的无创检测方法还包括根据甲基化测序得到的数据，判断囊胚各个染色体倍数是否正常，若为标准二倍体则待测囊胚染色体正常。
进一步，本发明提供一种提高试管婴儿出生率的方法，采用本发明实施例的甲基化测序方法，筛选滋养层细胞甲基化水平为0.3±0.2的囊胚进行移植。
优选地，筛选滋养层细胞甲基化水平为0.3±0.02的囊胚进行移植。
更优选地，还包括根据滋养层细胞的甲基化测序结果，筛选所有染色体均为标准二倍体的囊胚进行移植。
本发明提供一种筛选优良发育囊胚的试剂盒，采用本发明实施例的甲基化测序方法，当待测囊胚的甲基化水平平均值为0.3±0.2、甲基化模式接近AA级囊胚的模式和/或待测囊胚的甲基化测序结果显示所有染色体均为标准二倍体时，待测囊胚发育优良。
优选地，本发明试剂盒当待测囊胚的甲基化水平平均值为0.3±0.02、甲基化模式接近AA级囊胚的模式和/或待测囊胚的甲基化测序结果显示所有染色体均为标准二倍体时，待测囊胚发育优良。
本发明试剂盒其检测对象为囊胚的滋养层细胞。
本发明还提供了加纳德形态囊胚分级中的AA级胚胎的甲基化水平值在制备筛选优良发育囊胚的试剂盒中的应用。采用本发明实施例的甲基化检测方法，检测到AA级胚胎的甲基化水平值为0.3±0.02。待检囊胚滋养层细胞的甲基化水平越接近0.3，则待检囊胚越适合胚胎移植。
本方法还可以同时检测胚胎中各条染色体的状态，染色体中没有出现拷贝数变化的胚胎才能用于胚胎移植，即都是标准的二倍体胚胎才可以用于移植。
本发明中，一种甲基化测序，同时获得两种指标，即胚胎DNA甲基化的图谱(含DNA甲基化水平)和胚胎各条染色体的状态，通过同时综合两个指标进行胚胎的筛选，用于胚胎的辅助生殖。对比过去的方法具有巨大的优势。
本发明方法是对植入前胚胎的发育状态和发育潜能的量化筛选。本发明方法和传统的形态学筛选具有相同的应用范围，适合所有形态学分型的胚胎，包括AA级，B*级或者C*级，但该方法更加客观，准确。同时，该技术可以用于所有胚胎的筛查，该技术有望大幅提升辅助生殖技术的精准性，降低手术风险，减轻患者痛苦，进一步提高试管婴儿成功率。本发明的有益效果具体表现在：
1、本发明方法是基于传统形态学和PGS基础之上，进一步对发育优良的胚胎进行量化筛选，提高试管婴儿成功率，降低流产率。
与传统依赖显微镜技术，挑选形态学等级高的胚胎进行移植的胚胎形态学相比，本发明方法更加客观，避免了形态学分型中人为的不确定性，很多形态学的检测更加依赖医护人员的个人经验。同时，形态学的好坏不能完全代表基因组和表观基因组的状态，无法准确预测囊胚的发育状态和潜能。而本发明方法可直接对胚胎的表观遗传信息进行测量和分析，准确判断胚胎是否具有标准的DNA甲基化图谱，是否具备正常发育成胎儿的潜能，同时也检测了染色体是否正常，筛选出发育良好的和染色体正常的胚胎。本PEGE方法，在国际上首次提出了使用表观遗传学信息进行筛选胚胎、进行移植前检测的概念。
2、本发明PEGE方法优于目前正在使用的PGS方法
PGD/PGS是国际上对胚胎的DNA序列和染色体结构进行分析的常用方法，判断胚胎是否存在染色体异常。但对正常的无染色体异常或遗传性疾病的大多数人群没有作用，无法提升大多数人群ART术后的妊娠率和婴儿出生率。而本发明筛选优良发育囊胚的无创检测方法适用于所有人群，同时也能够检测染色体的异常。因此本PEGE方法既完成了已有PGS方法检测染色体是否存在不等倍性的问题，同时又筛选了胚胎发育表观状态更好的胚胎，因此本方法明显的好于已有的PGS方法。因此本PEGE方法将来应用于临床有望成为植入前胚胎最常规、最基础、最精确的筛选的手段。
3、避免多胎妊娠，减少实施减胎术
因为试管婴儿平均成功率为20％-30％，为提高一次植入成功率，一般会同次植入2-3个胚胎，因此往往会出现一些多胞胎的现象。多胞胎比单胎更具有风险性，这种危险对于妈妈和孩子来说都存在。权威调查发现双胞胎的剖宫产率78.45％，早产占47.07％，合并症和并发症占39.7％。双胞胎以及多胞胎的母亲更容易在怀孕期间发生糖尿病、高血压等妊娠期综合征，而且产后出血的概率也要高，同时也比较容易发生早产。早产的孩子大都会发生先天性肺部疾病，而且这种疾病将是终生的。为了保护母子的安全，三胞胎以上，原则上需要进行减胎术，但减胎手术有10％的机会造成全部胚胎流产。本发明方法能够避免同次植入多个胚胎产生多胎妊娠的现象，减少了受孕母亲的痛苦，保证了抑制胚胎的成活率和妊娠的成功率。
附图说明
图1为形态学分型等级最高的AA级胚胎和等级低劣的CC或CB级胚胎的甲基化水平图。AA-1和CB-1的胚胎是来自同一对夫妇，AA-3和CC-6也是来源同一对夫妇。结果显示AA的甲基化水平在0.30±0.02间，而CC或CB的甲基化水平整体上与AA差别非常大。
图2为6例BB或BA级胚胎的甲基化水平图。两条虚线代表五个AA级胚胎甲基化水平的SD误差。结果显示3例的甲基化水平与AA类似(BB-3、BB-4、BB-5)，3例的甲基化水平与AA差异非常大(BA-1、BB-2、BB-6)。
图3为基于每个胚胎CpG甲基化模式进行的主成份分析图(PCA分析)。AA级胚胎的甲基化模式非常相似，而CC或CB的甲基化模式离AA的差别较大，而且各个胚胎之间的状态也差别较大。
图4为5例AA级别胚胎和7例CB或CC级胚胎中，不同基因组功能元件的平均甲基化水平。5例AA级胚胎各个功能元件的甲基化水平类似；而7例CC或CB级胚胎的各个功能元件的甲基化水平差异非常大，而且多数胚胎与AA有较大差别。
图5为不同形态学分型胚胎的甲基化重编程的功能分析图。形态学分型等级高的和等级低的胚胎之间相比，差异甲基化区域的功能富集分析。启动子位于DMRs区域的基因采用DAVID GO富集分析。基因内部DMRs区域的顺式作用元件通过GREAT tools分析。GO分析p值<0.05的有统计学意义。结果显示发生错误甲基化的区域常常发生在对细胞生存非常重要的基础代谢基因上、或与发育尤其是神经发育相关的基因上，说明正常的甲基化图谱对胚胎的发育至关重要。
图6为不同的胚胎中IDH2基因附近的增强子呈现不同的甲基化状态图。图中显示等级高和等级低的胚胎的平滑甲基化水平延伸基因区上下5kb的区域。样品AA1、AA2、AA3的增强子周围甲基化状态类似，而样品CC5和CC6的增强子甲基化状态出现问题。黑色的短条代表CpG位点。
图7为各种级别胚胎中甲基化水平在0.3±0.02范围内比例，以及不同级别胚胎的出生率。用C*的出生率代替CC和C*的出生率，因此图中的C*胚胎的出生率高于CC和C*的合计的出生率。此图说明，甲基化状态好的胚胎也倾向于获得更好的出生率。
图8为无创获取的几个滋养层细胞的甲基化水平类似于全胚胎的甲基化水平图。BB-7-TE和CC-8-TE分别是从胚胎BB-7和CC-8中取出的几个滋养层细胞。
图9为利用甲基化图谱的结果分析染色体拷贝数。样品s-25的第五号染色体的一个片段多出了一个拷贝，第9号染色体的一个片段少了一个拷贝。说明此胚胎染色体出现异常，不可以用作胚胎移植。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1人类囊胚中全基因组水平的DNA甲基化不稳定的发现
本发明收集了通过加德纳形态囊胚分级系统分级的等级最高的AA级和等级低劣的CC，BC或CB级的囊胚,这些囊胚来自合作单位北京大学第三医院和广州医科大学附属第三医院，患者做辅助生殖手术中，体外会同时培样几个囊胚，之后选择形态最优良的进行移植，其余的囊胚经患者本人同意，签订知情同意书后，捐献用于该课题科学研究。对每一个囊胚，进行单碱基分辨率的全基因组甲基化测序。本发明的“one-tube”实验方法如下：
1、样品准备
滋养层细胞从胚胎中分离出后，在不超过5μl的胚胎专用培养液或者PBS中保存在200μl管中，迅速冻存在-80℃中。
2、细胞裂解
表1细胞裂解缓冲液
将冻存的样品取出，室温融化后，直接离心，4℃3000g离心5min。56℃蛋白消化1.5h，然后75℃蛋白酶灭活30min。
3、DNA打断
加入未甲基化的Lamda DNA，比例为每1000pg样品DNA中加入5pg Lamda DNA。用超纯水，将样品量补平至50μl。打断条件：S2,50μl，400bp condition。体积浓缩至30μl。
4、End-Repair末端补平
准备反应缓冲液如下：
20℃反应30min，75℃反应20min，使酶失活。接着进行下一步，或者冻存至-20℃或更低温度。
5、dA-Tailing3’末端加A
在上一步的反应体系中，补入如下试剂：
37℃反应30min，75℃反应20min，使酶失活。接着进行下一步，或者冻存至-20℃或更低温度。
6、加接头
在上一步的反应体系中，补加如下试剂：
充分混合，16℃反应过夜(至少8h)。接着进行下一步，或者冻存至-20℃或更低温度。
7、使用甲基化建库试剂盒。
按照说明书配制适用于50ul样品的CT Conversion Reagent。准备Bisulfite Conversion mixture如下：
充分混合，把每份样品平均分配到两个管子里(75μl每管)，启动如下程序：98℃，10min；64℃，2h；4℃最多放置2h。将试剂盒中的柱头放到收集管上，加入600ul binding buffer，以及0.5μl CarrierRNA。将150μl样品加入上一步binding buffer中。用枪头轻轻吹打混匀，合上管盖放置5min。至少10000rpm，离心1min。将收集管中的试剂重新加到柱头中，再次离心1min。丢掉离心下的试剂。柱头加入100μl Wash Buffer，至少10000rpm，离心1min。柱头加入200μl De-sulphonation Buffer，室温放置15到20min。至少10000rpm，离心1min。丢掉离心下的试剂。柱头加入100μl Wash Buffer，至少10000rpm，离心1min。重复第27步，丢掉收集管中的试剂，将柱头放到新的1.5mL离心管中。加入11μl超纯水，室温放置10min。至少10000rpm，离心1min。重复第29步。离心下的样品即为Bisulfite处理后的DNA。接着进行下一步，或者冻存至-20℃或更低温度。
8、第一轮PCR扩增
使用PCR扩增试剂盒。准备如下扩增缓冲液：
按照如下循环步骤扩增：98℃45s；98℃15s，65℃30s，72℃30s，共6个循环；72℃1min。4℃保持。
接着进行下一步，或者冻存至-20℃或更低温度。
9、向上一步DNA样品中加入等体积(50μl)AMPure XP Beads，充分混匀，离心。37℃静置10min。将管子放在磁架上，静置5min。使用200ul的75％乙醇洗磁珠，然后吸弃上清。空气中晾磁珠2min，使乙醇挥发。用25μl 10mM Tris-HCl(pH 8.5)重悬磁珠，简单离心后，静置5min，然后放置在磁力架上静置5min。收集上清至新的200μl离心管中，接着进行下一步，或者冻存至-20℃或更低温度。
10、第二轮PCR扩增
使用PCR扩增试剂盒。准备如下扩增缓冲液：
按照如下循环步骤扩增：98℃45s；98℃15s，65℃30s，72℃30s，共13-16个循环；72℃1min；4℃保持。接着进行下一步，或者冻存至-20℃或更低温度。
11、胶回收
将DNA样本跑琼脂糖凝胶电泳，胶浓度为2％，电压控制在90V。按照测序要求，切下适当大小的DNA片段，进行胶回收。最后一步DNA洗脱时，使用无菌超纯水，分3次，共洗脱50μl。
12、去除接头
向上一步DNA样品中加入0.8x(40μl)AMPure XP Beads，充分混匀，离心。37℃静置10min。将管子放在磁架上，静置5min，等待磁珠被吸附。小心地吸取上清并丢弃，不要吸掉磁珠。使用200μl的75％乙醇洗磁珠，然后吸弃上清。空气中晾磁珠2min，使乙醇挥发。用15ul 10mM Tris-HCl(pH 8.5)重悬磁珠，简单离心后，静置5min，然后放置在磁力架上静置5min。收集上清至新的1.5mL离心管中，冻存至-20℃。此样品即为待测序的DNA样本。
通过上述步骤获得了DNA甲基化文库，库检合格后即可进行测序。获得的囊胚全基因组甲基化测序数据首先通过Bismark比对软件与人参考序列(hg19)进行比对。唯一比对到人基因组参考序列上的测序片段(read)在去掉PCR重复片段以及双端片段重合区域后，根据比对信息，分为Waston链片段和Crick链片段。通过Samtools软件，分别提取来自Waston链片段上的胞嘧啶(Cytosine)和Crick链片段上的腺嘌呤(Guanline)的甲基化信息，然后合并两条链上的信息得到每个CpG位点的甲基化水平。全基因组甲基化水平为各个CpG位点甲基化水平的平均值。
研究发现被检测的五个AA级囊胚的甲基化水平都很接近，而在7个被检测的低等级胚胎中，有6个胚胎的全基因组甲基化水平严重偏离AA级胚胎的平均值，并且他们之间的差异也很明显。和高等级的胚胎相比，这些低等级的胚胎有的是过度去甲基化，而另外一些是去甲基化不够充分(见图1)。而6例BB或BA级别的胚胎有3个甲基化水平与AA类似，是较好的候选移植胚胎，而有3个胚胎甲基化水平不是非常适合胚胎的移植(图2)。
进一步通过生物信息学DNA甲基化模式主成分分析(PCA)方法显示，5个AA级胚胎的甲基化模式都很类似，可以聚类在一起，(图3中圆圈表示)，而7个低等级的胚胎都分散在圆圈之外，甲基化模式和AA级胚胎的相差较大。
不同胚胎相同的功能原件区甲基化状态的比较分析发现，相同功能区域，五个AA级胚胎的甲基化模式相似，而在低等级的胚胎中，同一功能区域的甲基化状态各不相同(图4)。可见，人类胚胎早期发育的过程中会出现全基因组水平的表观基因组不稳定，AA级的胚胎全基因组甲基化水平非常一致(即相同的基因组区域，不同的胚胎中呈现相同的高甲基化或是低甲基化的状态)，形态学分级较低的B*和C*的胚胎全基因组甲基化水平出现了不同程度的偏差，形态学分型等级越低的和AA级相比其甲基化水平差别越大。由于临床上AA级胚胎的出生率是最高的，并且甲基化水平也很一致，因此认为AA级胚胎的甲基化模式是最正确的，可以指导早期胚胎的正常发育。
实施例2不正确的甲基化重编程影响调节胚胎早期发育的信号通路
对高级别胚胎和低级别胚胎中甲基化状态不同的区域进行基因功能的分析(gene ontology)。
分析结果发现，差异甲基化区域(DMR)位于基因启动子的这些基因主要富集在胚胎发育相关的许多通路上，例如细胞周期，DNA新陈代谢、DNA修饰、染色体定位、RNA编辑、DNA修复、细胞周期等(图5)。差异甲基化区域位于基因内部的这些基因主要富集在特定组织的发育，例如神经发育、神经元的分化和命运决定、脊髓的结构、mRNA的稳态等(图5)。
结果还显示，在级别最低的CC级胚胎中增强子区域的甲基化往往发生错误的重编程。差异甲基化区域位于增强子的这些基因富集在发育和代谢相关的通路上。图6展示的是IDH2基因的增强子及附近区域在不同胚胎中的甲基化状态，AA级的胚胎该区域均呈现低甲基化状态,而CC级胚胎则呈现高甲基化状态。增强子区域的高甲基化造成了IDH2基因表达量的大幅降低。
实施例3植入前囊胚的甲基化水平和ART术后的婴儿出生率的关系
本实施例将AA级囊胚的平均甲基化水平0.3±0.02作为衡量标准，即临床植入前囊胚无创检测的定量标准。这个标准是在形态学检测的基础之上，进一步精确的筛查正常发育囊胚的全新的临床指标。
为了进一步验证该指标精确性，本发明又收集了6个B*级的囊胚(图2)，结果显示B*级样品中有3个样品的甲基化水平明显偏离AA级囊胚的平均甲基化水平0.3这一标准。在图1中显示5例AA级样品中也有1个样品偏离标准，而检测的7个C*级胚胎，其中有6例均偏离标准，则各级囊胚甲基化水平符合标准的比例分别为AA级约80％，B*级约50％，C*级约14％(图7)。图7的结果显示，各级囊胚中甲基化水平符合标准的样品比例和该级临床上婴儿的出生率呈现显著正相关。
本实施例结果说明基因组DNA甲基化谱在胚胎发育的过程中起着至关重要的作用，甲基化水平符合或接近标准的囊胚是胚胎移植的最理想选择。
实施例4植入前表观基因组检查可以通过显微操作技术从囊胚中分离几个滋养层细胞来实现
在临床中，植入前遗传学诊断(PGD)技术已经拥有了20多年的应用历史，采用活组织检测的方法从囊胚中剥离几个细胞，用于基因突变和染色体异常等疾病的诊断。本实施例从各测试囊胚的滋养层细胞(TE)中分离出几个细胞，用实施例1中述及的“One Tube”极少量细胞全基因组甲基化文库的构建方法，分别构建不同囊胚的TE甲基化文库，同时将不同囊胚的剩余细胞做平行的甲基化文库。之后用Hiseq测序平台进行检测，图8中显示TE来源的少量细胞甲基化水平类似于该囊胚的整体甲基化水平，但可代表整个囊胚的甲基化谱。因此，可以用这种无创的活组织检测方法来筛选植入前胚胎甲基化谱更加优良的囊胚。
实施例5胚胎染色体不等倍性的检测
目前被广泛使用PGD/PGS是对胚胎的DNA序列和染色体结构进行分析，判断胚胎是否存在染色体异常。而本发明的DNA甲基化全基因测序结果也可以对染色体倍数进行判断，染色体异常算法基于对染色体片段的测序深度进行检测。比对之后的囊胚全基因组甲基化测序数据，剔除GC含量以及比对偏好性等因素之后，以一兆碱基(1Mb)为单位计算测序深度。然后通过隐马尔科夫链模型(HMM)根据测序深度相似性对染色体进行分割。测序深度出现极高或极低的区域表明此区段存在染色体加倍或缺失。表2结果显示在36例胚胎中有17个胚胎有染色体异常，不适合胚胎的移植。以样品s-25为例，其第五号染色体的一个片段多出了一个拷贝，第9号染色体的一个片段少了一个拷贝(图9)。
因此本发明PEGE方法既完成了已有PGS方法检测染色体是否存在不等倍性的问题，同时又筛选了胚胎发育表观状态更好的胚胎，因此本方法明显的好于已有的PGS方法。因此本PEGE方法将来应用于临床有望成为植入前胚胎最常规、最基础、最精确的筛选的手段。使用本发明PEGE方法可以同时检测染色体的异常问题，结果发现17例胚胎的染色体存在倍数的异常，这些胚胎完全不能用于胚胎的移植。
表2本发明方法对17例胚胎的染色体倍数检测情况
样品名称 性染色体XX/XY 染色体异常
1_4AA_350 XY
11_3CC_sort XY
13_6AA_sort XY
2-4CC_sort XX
7_3CC_sort XX
8-3CC-350 XY
9-3CC-350 X \+7
BL-1-2CB XY
BL-1-4AA XX
BL-2-2CC XY -21
BL-2-4AA XY -19
MLCC-19 XX \+8,-18
MLCC-20 XX
MLCC-21 XY \+4
s_11-4BA XX -22
s_12-4CB XY
s_13-5CB XY \-15,+17
s_15-4CA XY -20
s_16-4BA XX \+22,+2
s_17-4CC XY \+2,+8,-16,-18,+21
s_25-4CC XY \+5Q,-9Q
s_31-5BC XY \-21,-22
s_32-5CC XX \+22
s_43-4BB XY
s_44-4CC XY
s_54-4BC XX -14
s_6-4BB XX \+1P
s_6-5AA XY \-1P,-4P
s1 XX
s4AA-13 XY
s4AA-14 XY
s4CC-22 XY
s4CC-23 XX
s4CC-24 XY
s4CC-25 XX
s4CC-26 X -X
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种筛选优良发育囊胚的无创检测方法，其特征在于，对待检囊胚滋养层细胞基因组进行甲基化检测，以加德纳形态囊胚分级系统评判出的形态优良胚胎的甲基化水平为标准，甲基化水平接近或等于该标准的，则待检囊胚发育优良，所述加德纳形态囊胚分级系统评判出的形态优良胚胎是指AA、AB、BA、BB级囊胚。
2.如权利要求1所述的无创检测方法，其特征在于，还包括以加德纳形态囊胚分级系统评判出的形态优良胚胎的甲基化模式为标准。
3.如权利要求1-2任一所述的无创检测方法，其特征在于，还包括根据甲基化测序结果，判断囊胚各个染色体倍数是否正常，若为标准二倍体则待测囊胚染色体正常。
4.权利要求1-3任一所述的无创检测方法在提高妊娠率中的应用。
5.一种提高试管婴儿出生率的方法，其特征在于，筛选滋养层细胞甲基化水平接近或等于加德纳形态囊胚分级系统评判出的形态优良胚胎的甲基化水平值和/或甲基化模式的囊胚进行移植，所述加德纳形态囊胚分级系统评判出的形态优良胚胎是指AA、AB、BA、BB级囊胚。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括根据滋养层细胞的甲基化测序结果，筛选所有染色体数目均为标准二倍体的囊胚进行移植。
7.一种筛选优良发育囊胚的试剂盒，其特征在于，其为囊胚甲基化测序的试剂盒，以加德纳形态囊胚分级系统评判出的形态优良胚胎的甲基化水平为标准，甲基化水平接近或等于该标准的，则待检囊胚发育优良，所述加德纳形态囊胚分级系统评判出的形态优良胚胎是指AA、AB、BA、BB级囊胚。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，其为囊胚甲基化测序的试剂盒，当待测囊胚的甲基化测序结果显示所有染色体均为标准二倍体时，待测囊胚为发育优良囊胚。
9.如权利要求7或8所述的试剂盒，其检测对象为囊胚的滋养层细胞。
10.加德纳形态囊胚分级中的形态优良胚胎的甲基化水平值在制备筛选优良发育囊胚的试剂盒中的应用，所述加德纳形态囊胚分级中的形态优良胚胎是指AA、AB、BA、BB级囊胚。
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