CN109920479A - 一种鉴别胚胎染色体倒位携带状态的方法 - Google Patents
一种鉴别胚胎染色体倒位携带状态的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于遗传诊断和人类辅助生殖领域,更具体地说,涉及胚胎植入前遗传学检测技术(PGT)。根据本发明所述方法,针对染色体倒位的患者及其配偶、体外授精后的胚胎和倒位携带者亲属的染色体进行家系单体型连锁分析,能快速、简便、准确地区分出染色体倒位携带型的胚胎和染色体正常型的胚胎,优先移植染色体正常型的胚胎,实现在胚胎移植前及时阻断染色体倒位向下一代的遗传传递,对于促进人口优生优育、降低出生缺陷及改善人类生殖健康具有重要意义,一定程度上推动了人类辅助生殖技术的发展进步。
Description
技术领域
本发明属于基因诊断和人类辅助生殖领域,具体而言,涉及胚胎植入前检测技术(PGT),是一种能够鉴别胚胎是否携带亲本倒位染色体的单体型连锁分析方法。
背景技术
染色体倒位是指染色体发生两次断裂后,产生的两断点之间染色体片段倒转180°后重新连接,包括臂内倒位及臂间倒位,倒位没有遗传物质的丢失。在中国不孕不育及不良妊娠史患者中染色体倒位发生率约为0.96-1.10%。尽管染色体倒位携带者一般情况无异常表型,但是其原始生殖细胞减数分裂会产生大量的异常配子,原始生殖细胞在细胞减数分裂I期,由倒位的染色体和与其对应的正常的同源染色体配对形成倒位环,会产生6种不同类型的配子,其中1种为完全正常型,1种为倒位携带型,其余均为异常型。研究表明染色体倒位会引起不孕不育、胚胎停育、胎儿发育异常等临床表型。
染色体倒位患者往往会求助于辅助生殖技术,通过胚胎植入前遗传学检测(Preimplantation Genetic Testing,PGT)方法筛选正常胚胎进行植入,从而提高妊娠率。PGT技术可以在染色体倒位患者中筛查出没有染色体大片段异常的健康胚胎,提高临床妊娠率。目前国内外实现PGT的技术主要有荧光原位杂交技术(FISH)、微阵列-比较基因组杂交技术(array-CGH),微阵列单核苷酸多态(SNP-array)和下一代测序(NGS)技术等。但是尽管如此,这些传统的PGT技术只能对胚胎的拷贝数变异进行检测。
到目前,没有任何关于鉴别胚胎染色体倒位携带状态的文章报道,现有技术还不能够准确区分染色体倒位携带型胚胎和完全正常型胚胎。而目前的技术主要是集中在筛查整倍性或大片段的拷贝数变异层面,不能对倒位患者的胚胎是染色体倒位携带型或完全正常型做进一步诊断,所有二倍体胚胎中理论上有50%的概率为染色体倒位携带。如果生育的胎儿仍然为染色体倒位携带者,那么其接下来可能会面临着同样的生育问题,给患者夫妻双方甚至整个家庭在精神上仍然有很大的潜在无形压力。最理想方案为通过胚胎植入前分析能够鉴别染色体倒位携带型胚胎及完全正常型胚胎,优先移植“完全正常型”胚胎,实现在胚胎移植前及时阻断染色体倒位向下一代的遗传传递,不仅具有重要的临床意义,更有利于缓解病人的生育压力,最大程度满足病人治疗需求,提高病人就医满意度,很大程度上提高了医疗服务质量水平。因此,探索一种应用简便、省时、高效,能够准确鉴别染色体倒位携带型胚胎及正常型胚胎的策略是我们急需解决的一个重要科学临床问题,从而实现精准医学治疗。
发明内容
针对上述现有技术中存在的缺陷,本发明建立了一种基于全基因组大规模SNP基因分型结果进行胚胎植入前单体型分析(PGH)的方法,能够在体外受精的胚胎移植入前及时区分携带倒位染色体的胚胎和正常染色体的胚胎,从而优先移植染色体完全正常的胚胎,及时阻断染色体倒位遗传给下一代。
本发明的具体技术方案如下:
本发明提供了一种鉴别胚胎染色体倒位携带状态的方法,包含以下步骤:
(1)样本基因分型
将染色体倒位携带者夫妇双方、至少一名携带者亲属和携带者夫妇体外受精胚胎进行大规模SNP基因型检测;携带者亲属可为与携带者具有相同倒位的亲属,也可为染色体正常的亲属;将染色体倒位携带者夫妇双方、携带者亲属称为参照样本,携带者夫妇体外受精胚胎称为待定样本;
(2)确定信息SNPs位点
信息SNPs的选择标准为:选择覆盖染色体倒位断裂点区域、整条倒位染色体、和与其相对应的正常的同源染色体上的信息SNPs;所述信息SNPs是在染色体倒位携带者中为杂合型,在其配偶中为纯合型,并且在携带者亲属中也是纯合型的SNP位点;所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-30Mb范围内;染色体每Mb范围内至少选择1个信息SNP;
(3)构建家系单体型
集合步骤(2)确定的信息SNPs位点,通过家系连锁分析得到该家系覆盖倒位断裂点区域、倒位染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型,上述染色体单体型的集合即为家系单体型;
(4)数据收集和分析
将待定样本中的染色体单体型信息和参照样本的单体型信息(即家系单体型)进行比对,通过整条染色体的单体型判断染色体倒位断裂点区域是否发生了同源重组:
i)当以与携带者具有相同倒位的亲属为参照时:
a.若待定样本染色体倒位断裂点区域没有发生重组,当待定样本断裂点区域单体型信息和参照样本中染色体倒位携带者以及与携带者具有相同倒位的亲属的单体型信息一致时,则为倒位携带胚胎;当待定样本倒位染色体断裂点区域单体型信息与参照样本中染色体倒位携带者单体型信息一致,但与携带相同倒位的携带者亲属的单体型信息不一致时,则为染色体完全正常的胚胎;
b.若待定样本染色体倒位断裂点区域发生了同源重组,则倒位携带或染色体完全正常胚胎的判断规则为:当只有其中1个断裂点区域的一端或两端发生同源重组,则判断规则与a相同;当2个断裂点区域中均仅有一端发生同源重组,则判断规则与a相同;当2个断裂点区域的两端均发生同源重组,则判断结果与a相反;
所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-30Mb范围;优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-20Mb范围内;更优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-10Mb范围内;同源重组片段覆盖染色体倒位断裂点或同源重组片段自染色体倒位断裂点起始。
ii)当以染色体正常的亲属为参照时:
a.若待定样本染色体倒位断裂点区域没有发生重组,当待定样本断裂点区域单体型信息和参照样本中染色体倒位携带者以及与携带者的染色体正常的亲属的单体型信息一致时,则为染色体完全正常的胚胎;当待定样本倒位染色体断裂点区域单体型信息与参照样本中染色体倒位携带者单体型信息一致,但与携带者的染色体正常的亲属的单体型信息不一致时,则为倒位携带胚胎;
b.若待定样本染色体倒位断裂点区域发生了同源重组,则倒位携带或染色体完全正常胚胎的判断规则为:当只有其中1个断裂点区域的一端或两端发生同源重组,则判断规则与a相同;当2个断裂点区域中均仅有一端发生同源重组,则判断规则与a相同;当2个断裂点区域的两端均发生同源重组,则判断结果与a相反,
所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-30Mb范围;优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-20Mb范围内;更优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-10Mb范围内;同源重组片段覆盖染色体倒位断裂点或同源重组片段自染色体倒位断裂点起始。
本发明还提供了一种用于鉴别胚胎染色体倒位携带状态的家系单体型的构建方法,包含以下步骤:
(1)样本基因分型:将染色体倒位携带者夫妇双方和至少一名携带者亲属进行大规模SNP基因型检测;携带者亲属可为与携带者具有相同染色体倒位的亲属,也可为染色体正常的亲属;
(2)确定信息SNPs位点:信息SNPs的选择标准为:选择覆盖染色体倒位断裂点区域、整条倒位染色体、和与其相对应的正常的同源染色体上的信息SNPs;所述信息SNPs是在染色体倒位携带者中为杂合型,在其配偶中为纯合型,并且在携带者亲属中也是纯合型的SNP位点;所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-30Mb范围内;染色体每Mb范围内至少选择1个信息SNP;
(3)构建家系单体型:集合步骤(2)确定的信息SNPs位点,通过家系连锁分析得到该家系覆盖倒位断裂点区域、倒位染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型,上述染色体单体型的集合即为家系单体型。
另一方面,本发明提供了一种用于鉴别胚胎染色体倒位携带状态的家系单体型的构建系统,所述系统包含能够计算处理样本数据的软件、和用于承载上述软件的硬件:
(1)所述系统还包含储存有染色体倒位携带者夫妇双方和至少一名携带者亲属进行大规模SNP基因型检测的基因分型数据的硬件;倒位携带者亲属可为与携带者具有相同染色体倒位的亲属,也可为染色体正常的亲属;将染色体倒位携带者夫妇双方、携带者亲属称为参照样本;
(2)所述软件根据下述规则确定信息SNPs位点:
信息SNPs的选择标准为:选择覆盖染色体倒位断裂点区域、整条倒位染色体、和与其相对应的正常的同源染色体上的信息SNPs;所述信息SNPs是在染色体倒位携带者中为杂合型,在其配偶中为纯合型,并且在携带者亲属中也是纯合型的SNP位点;所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-30Mb范围内;染色体每Mb范围内至少选择1个信息SNP;
(3)所述软件依照下述原则构建家系单体型:集合步骤(2)确定的信息SNPs位点,通过家系连锁分析得到该家系覆盖倒位断裂点区域、倒位染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型,上述染色体单体型的集合即为家系单体型。
另一方面,本发明提供了一种用于鉴别胚胎染色体倒位携带状态的系统,所述系统包含能够计算处理样本数据的软件、和用于承载上述软件的硬件:
(1)所述系统还包含储存有染色体倒位携带者夫妇双方、至少一名携带者亲属、和携带者夫妇体外受精胚胎进行大规模SNP基因型检测的基因分型数据的硬件;携带者亲属可为与携带者具有相同染色体倒位的亲属,也可为染色体正常的亲属;将染色体倒位携带者夫妇双方、携带者亲属称为参照样本,携带者夫妇体外受精胚胎称为待定样本;
(2)所述软件根据下述规则确定信息SNPs位点:
信息SNPs的选择标准为:选择覆盖染色体倒位断裂点区域、整条倒位染色体、和与其相对应的正常的同源染色体上的信息SNPs;所述信息SNPs是在染色体倒位携带者中为杂合型,在其配偶中为纯合型,并且在携带者亲属中也是纯合型的SNP位点;所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-30Mb范围内;染色体每Mb范围内至少选择1个信息SNP;
(3)所述软件根据下述原则构建家系单体型分析模型:
集合步骤(2)确定的信息SNPs位点,通过家系连锁分析得到该家系覆盖倒位断裂点区域、倒位染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型,上述染色体单体型的集合即为家系单体型;
(4)所述软件将待定样本中染色体的单体型信息和参照样本的单体型信息(即家系单体型)进行比对,通过整条染色体的单体型判断染色体倒位断裂点区域是否发生了同源重组:
i)当以与携带者具有相同倒位的亲属为参照时:
a.若待定样本染色体倒位断裂点区域没有发生重组,当待定样本断裂点区域单体型信息和参照样本中染色体倒位携带者以及与携带者具有相同倒位的亲属的单体型信息一致时,则为倒位携带胚胎;当待定样本倒位染色体断裂点区域单体型信息与参照样本中染色体倒位携带者单体型信息一致,但与携带相同倒位的携带者亲属的单体型信息不一致时,则为染色体完全正常的胚胎;
b.若待定样本染色体倒位断裂点区域发生了同源重组,则倒位携带或染色体完全正常胚胎的判断规则为:当只有其中1个断裂点区域的一端或两端发生同源重组,则判断规则与a相同;当2个断裂点区域中均仅有一端发生同源重组,则判断规则与a相同;当2个断裂点区域的两端均发生同源重组,则判断结果与a相反,
所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-30Mb范围;优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-20Mb范围内;更优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-10Mb范围内;同源重组片段覆盖染色体倒位断裂点或同源重组片段自染色体倒位断裂点起始;
ii)当以染色体正常的亲属为参照时:
a.若待定样本染色体倒位断裂点区域没有发生重组,当待定样本断裂点区域单体型信息和参照样本中染色体倒位携带者以及与携带者的染色体正常的亲属的单体型信息一致时,则为染色体完全正常的胚胎;当待定样本倒位染色体断裂点区域单体型信息与参照样本中染色体倒位携带者单体型信息一致,但与携带者的染色体正常的亲属的单体型信息不一致时,则为倒位携带胚胎;
b.若待定样本染色体倒位断裂点区域发生了同源重组,则倒位携带或染色体完全正常胚胎的判断规则为:当只有其中1个断裂点区域的一端或两端发生同源重组,则判断规则与a相同;当2个断裂点区域中均仅有一端发生同源重组,则判断规则与a相同;当2个断裂点区域的两端均发生同源重组,则判断结果与a相反,
所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-30Mb范围;优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-20Mb范围内;更优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-10Mb范围内;同源重组片段覆盖染色体倒位断裂点或同源重组片段自染色体倒位断裂点起始。
本发明所述家系单体型至少包含来自染色体倒位携带者夫妇双方和至少一名携带者亲属的覆盖倒位断裂点区域、倒位染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型信息,信息SNPs的确定方法如上所述。
本发明所述大规模SNP基因型检测覆盖23对染色体;大规模SNP基因型检测方法优选基因芯片和基因测序。
本发明选择胚胎发育至第3-7天时,活检获取1-10个细胞作为步骤1)中所述体外受精胚胎的检测样本;优选来源于胚胎卵裂球活检或囊胚滋养外胚层活检的细胞。
本发明信息SNPs位点在覆盖染色体倒位断裂点区域时,优选所述信息SNPs从断裂点上下游5-20Mb范围内选择,优选从断裂点上下游5-10Mb范围内选择。优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-20Mb范围内;更优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-10Mb范围内。
本发明构建家系单体型时,每条染色体每Mb范围内至少选择2、3、4、5、6、7、8、9或10个信息SNPs。
本发明将活检获取的细胞裂解,进行全基因组扩增;全基因组扩增方法可选自MDA方法、MALBAC方法、或其他全基因组扩增方法。
本发明所述染色体倒位携带者夫妇双方与携带者亲属的检测样本的来源为体细胞,优选外周血。
本发明所述鉴别染色体倒位携带胚胎和染色体完全正常胚胎的PGH方法具有如下优势:
1)可以对胚胎中染色体状态进行预测的同时,对23对染色体进行筛查;
2)除了断裂点区域的单体型,可以同时建立涉及倒位的整条染色体和对应的正常同源染色体的整条染色体的单体型,这可以显示病人的倒位染色体在断裂点区域的重组情况,PGH的预测可以包含断点区域到整个染色体;
3)适用于所有遗传性的染色体倒位家系;
4)方法相对简单,需时较短,整个鉴别过程可以在48h内完成,适用于常规临床工作;
5)鉴别准确率可达100%。
附图说明
图1.携带染色体倒位的家系图谱示意:空白方框或空白圆圈均表示染色体正常。
图2.本发明所述鉴别胚胎染色体倒位携带状态方法的分析流程示意图。
图3.2个家系的家系单体型图示:3A.1号家系;3B.2号家系;
具体实施方式
实施例1:患者及患者亲代的参照样本收集
募集了2例将接受辅助生殖的染色体倒位携带家庭,入选者均来自复旦大学附属妇产科医院、上海集爱遗传与不育诊疗中心。每个家庭都需要签署书面知情同意书,研究方案由复旦大学附属妇产科医院人类受试者伦理委员会批准。
从2017年6月到2018年6月,这2个家庭具有复发性自然流产史或者原发不育史,染色体倒位携带的夫妇一方在后文中简称为“患者”,另一方简称“患者配偶”,携带染色体倒位的家系图谱示意请见图1。在募集的同时抽取每对患者夫妇和患者亲属(患者父母优先考虑,也可为其他亲属)的外周血10ml。一部分外周血用于淋巴细胞培养,进行染色体核型分析;另一部分外周血按照本领域常规方式提取DNA,已备后续SNPs分型使用。
外周血染色体制备方法如下:
1、细胞培养
1).采血:酒精消毒皮肤,肘静脉采血,将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞,向10ml培养基中注入30-40滴全血,轻摇匀后置37℃恒温箱培养。
2).培养:时间为68小时。培养期间,定期轻摇匀,使细胞充分接触培养基。
3).秋水仙素处理:终止培养前2-4小时,在培养液中加入秋水仙碱(用1ml注射器5号针尖滴加2滴,使终浓度为0.07μg/ml)。
以上步骤均需无菌操作
2、染色体制备
1).收集细胞:将培养物全部转入洁净离心管中,以1000rpm离心8-10分钟,弃上清液。
2).低渗处理:向刻度离心管中加入预温37℃的低渗液8ml,用滴管混匀,置37℃恒温水浴中低渗15-25分钟。
3).预固定:低渗后加入0.5ml固定液,轻轻混匀后1000rpm离心8-10分钟。
4).一固定:弃上清液,加入5ml固定液,轻轻混匀,静置20分钟。1000rpm离心,弃上清液。
5).二固定、三固定:同一固定。
6).制悬液:弃上清液后,视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。
7).滴片:吸取细胞悬液自10-20cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上,轻吹散,气干。
8).染色:1:10Giemsa染色5-10分钟,细水洗去多余染液,气干。
9).镜检:低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相,油镜下观察染色体形态并计数。
如果患者的外周血细胞核型与其母亲相同,则患者的倒位遗传自母方;与父亲相同,则患者的倒位遗传自父亲。当患者父母无法取血(如去逝)或不同意取血时,患者的兄弟姐妹或其他亲属也可取外周血做核型分析,也可以作为构建家系单体型时的参照样本。
1-2号家系的染色体核型请见表1。
表1. 1-2号家系倒位染色体核型表
家系编号 | 染色体数目 | 携带者 | 倒位染色体核型 |
1 | 46 | XX | 46,XX,inv(4)(p14q27),mat |
2 | 46 | XY | 46,XY,inv(10)(q11.2q21),mat |
实施例2:囊胚活检和全基因组扩增(WGA)
1、体外受精
对募集的2个家庭进行体外受精(IVF),体外受精方法遵循本领域常规方法进行;这些家庭的母本/父本年龄、表型,排卵结果、受精卵数量和最终用于活检的囊胚数量列于表2。通过上述体外受精,2个家庭通过多次促排卵共获得6个囊胚进行后续的活检和单体型分析。
表2. 1-2号家系基本情况和体外受精情况
2、囊胚活检及全基因组扩增
取上述处于囊胚阶段的胚胎,在胚胎发育的第5或6天从滋养外胚层中移出3至10个细胞。将活检细胞置于装有碱性变性缓冲液(KOH)的PCR管中进行细胞裂解。再通过多重置换扩增(MDA)方法进行全基因组扩增(WGA)。依照试剂盒说明书中所述方法,用phi 29DNA聚合酶进行等温DNA扩增(Repli-g单细胞全基因组扩增试剂盒,QIAGEN GmbH,Hilden,Germany),具体操作流程如下:
1)预处理:Buffer DLB重悬
Buffer DLB加入500μl H2O sc混匀离心保存于–20℃,6个月;
2)buffer D2配制
DTT,1M 3μl
Buffer DLB(reconstituted) 33μl
Total volume 36μl
Buffer D2冻存于–20℃不超过3个月;
3)取4μl活检细胞裂解样品与3μl buffer D2混匀,65℃反应10min;
4)在步骤3)反应液中加入3μl终止液终止反应;
5)Master mix配制
6)在步骤4)获得的每个反应中加入40μl Master mix,总反应体系共50μl;
7)将步骤6)所述反应体系置于30℃反应8h,65℃、3min终止反应;
8)反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,于-20℃保存。
实施例3:SNP基因型分型和单体型(haplotypes)分析
1、SNP基因型检测
使用Illumina human Karyomap-12V1.0微阵列进行SNP基因型检测。每个Karyomap-12芯片包含近300,000个SNPs,可全面覆盖人23对染色体。将实施例2中进行囊胚活检和全基因组扩增获得的6个样本按照家系分组,分别与该家系患者夫妇、患者亲属的全基因组扩增样本2份编为一组,进行微阵列SNP基因型检测和分析,分组情况如表3所示。具体实验方法参照说明书进行,在此不再赘述。
表3. 1-2号家系SNP阵列实验分组
注:F代表女性,M代表男性
2、单体型分析
获得芯片检测的全部SNPs信息后,构建胚胎分子核型和家系单体型,分别用于鉴定胚胎染色体拷贝数状况和鉴别胚胎染色体倒位携带状态。具体操作方法如下:
A.家系单体型构建:
1)样本基因分型:将患者夫妇双方和患者亲属进行SNP基因分型;
2)确定信息SNPs位点:信息SNPs的选择标准为:选择覆盖染色体倒位断裂点区域、整条倒位染色体、和与其相对应的正常的同源染色体上的信息SNPs;所述信息SNPs是在染色体倒位携带者中为杂合型,在其配偶中为纯合型,并且在携带者亲属中也是纯合型的SNP位点;所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-30Mb范围内;染色体每Mb范围内至少选择1个信息SNP;
3)构建家系单体型:集合步骤(2)确定的信息SNPs位点,通过家系连锁分析得到该家系覆盖倒位断裂点区域、倒位染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型,上述染色体单体型的集合即为家系单体型。
所述家系单体型至少包含来自染色体倒位携带者夫妇双方和至少一名携带者亲属的覆盖倒位断裂点区域、倒位染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型信息,信息SNPs的确定方法如上所述。
1-2号家系的家系单体型构建信息,和待测胚胎染色体单体型与家系单体型对照后的初步分析信息如表4所示,图3展示了1-2号家系的家系单体型图:
表4. 1-2号家系的家系单体型构建信息及待测胚胎初步对照分析
1断裂点通过外周血染色体核型确定
B.区分携带倒位染色体或正常染色体的胚胎的方法:
将胚胎(囊胚)细胞中断裂点区域的单体型信息和参照样本构建的分析模型(即家系单体型)进行比对,通过整条染色体的单体型信息判断染色体倒位断裂点区域是否发生了同源重组:
i)当以与携带者具有相同倒位的亲属为参照时:
a.若待定样本染色体倒位断裂点区域没有发生重组,当待定样本断裂点区域单体型信息和参照样本中染色体倒位携带者以及与携带者具有相同倒位的亲属的单体型信息一致时,则为倒位携带胚胎;当待定样本断裂点区域单体型信息与参照样本中染色体倒位携带者单体型信息一致,但与携带相同倒位的携带者亲属的单体型信息不一致时,则为染色体完全正常的胚胎;
b.若待定样本染色体倒位断裂点区域发生了同源重组,则倒位携带或染色体完全正常胚胎的判断规则为:当只有其中1个断裂点区域的一端或两端发生同源重组,则判断规则与a相同;当2个断裂点区域中均仅有一端发生同源重组,则判断规则与a相同;当2个断裂点区域的两端均发生同源重组,则判断结果与a相反,
所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-30Mb范围;优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-10Mb范围内。同源重组片段覆盖染色体倒位断裂点或染色体倒位断裂点发生同源重组。
ii)当以染色体正常的亲属为参照时:
a.若待定样本染色体倒位断裂点区域没有发生重组,当待定样本断裂点区域单体型信息和参照样本中染色体倒位携带者以及携带者的染色体正常的亲属的单体型信息一致时,则为染色体完全正常的胚胎,当待定样本断裂点区域单体型信息与参照样本中染色体倒位携带者单体型信息一致,但与携带者的染色体正常的亲属的单体型信息不一致时,则为倒位携带胚胎;
b.若待定样本染色体倒位断裂点区域发生了同源重组,
则倒位携带或染色体完全正常胚胎的判断规则为:当只有其中1个断裂点区域的一端或两端发生同源重组,则判断规则与a相同;当2个断裂点区域中均仅有一端发生同源重组,则判断规则与a相同;当2个断裂点区域的两端均发生同源重组,则判断结果与a相反,
所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-30Mb范围;优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-20Mb范围内;更优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-10Mb范围内;同源重组片段覆盖染色体倒位断裂点或同源重组片段自染色体倒位断裂点起始。
3、1-2号家系胚胎染色体倒位筛查结果
经过家系单体型连锁分析,对6个待移植胚胎进行诊断,4个是倒位或者正常的染色体的整倍体(见表4),2个显示和倒位无关的变异;分别使用与携带者具有相同倒位的亲属或携带者的染色体正常的亲属为参照,分析上述4例倒位或者正常胚胎,采用上述Bi)或Bii)所述的区分方法对每个胚胎进行预测,预测结果一致:4例是染色体倒位携带胚胎,0例是完全正常胚胎。
实施例4:胚胎移植及胚胎染色体倒位单体型筛查方法效果验证
1、胚胎移植
按照本领域常规方法将上述实施例3表4中涉及的胚胎用于胚胎移植。3个冷冻囊胚(分别为家系1中的7号和8号胚胎、家系2中的1号胚胎)融化后均成活,一共经过了3个移植周期。家系1中的7号胚胎移植后未成功妊娠,其余2枚胚胎移植后成功妊娠。
2、妊娠中期行羊水穿刺/脐带血进行细胞遗传学分析验证
胚胎移植成功后,通过与妊娠中期常规羊水核型的比较来验证本发明所述鉴别染色体倒位携带状态检测方法的预测准确性。
羊水细胞染色体制备方法(原位法)
A.细胞培养
1).将羊水(约20ml)转移到无菌的离心管中,1000rpm离心10分钟;
2).去除上清液,用于其它分析,保留细胞悬液约0.5~1ml,用培养基混匀到2~2.5ml左右;
3).将细胞悬液平分到2~4只Chromslide培养皿中;
4).培养24/48小时后,向每只Chromslide培养皿中加入约2.5ml羊水培养基;
5).培养第5~6天后,对细胞生长状况进行观察,更换新的培养基;
6).1~2天后观察细胞的生长状况,如果细胞克隆数足够,向培养皿中加入秋水仙素,收获细胞,处理时间根据秋水溶液浓度确定。
B.染色体制备
1).倾斜Chromslide细胞培养皿,完全去除培养基;
2).加入3~4ml低渗液到每个培养皿中,室温处理10分钟;
3).直接向低渗液中加入0.5~0.7ml固定液,室温处理5分钟;
4).去除上清液,加入3~4ml新鲜的固定液,室温处理;
5).重复第四步1~2次;
6).去除固定液,在Maxchrome染色体分散仪(设定适当的参数)中进行染色体分散过程;
7).玻片干燥后,老化,显带。
若为脐带血,培养方法同实施例1
表5显示了已成功移植的胚胎中使用本发明所述鉴别染色体倒位携带胚胎或染色体正常胚胎方法所获得的诊断结果与羊水穿刺进行细胞遗传学分析验证的结果的具体信息。
表5.本发明预测结果与羊水穿刺/脐带血细胞遗传学验证结果对比
由表5可知,经过验证,家系单体型的预测结果和羊水穿刺术/脐带血中细胞的遗传学分析结果完全一致,证明本发明所述鉴别胚胎染色体倒位携带状态方法的灵敏度和特异性均为100%。
Claims (10)
1.一种用于鉴别胚胎染色体倒位携带状态的家系单体型的构建方法,其特征在于,包含以下步骤:
1)样本基因分型:将染色体倒位携带者夫妇双方和至少一名携带者亲属进行大规模SNP基因型检测;携带者亲属可为与携带者具有相同染色体倒位的亲属,也可为染色体正常的亲属;
2)确定信息SNPs位点:信息SNPs的选择标准为:选择覆盖染色体倒位断裂点区域、整条倒位染色体、和与其相对应的正常的同源染色体上的信息SNPs;所述信息SNPs是在染色体倒位携带者中为杂合型,在其配偶中为纯合型,并且在携带者亲属中是纯合型的SNP位点;所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-30Mb范围内;染色体每Mb范围内至少选择1个信息SNP;
3)构建家系单体型:集合步骤2)确定的信息SNPs位点,通过家系连锁分析得到该家系覆盖倒位断裂点区域、倒位染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型,上述染色体单体型的集合即为家系单体型。
2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤1)所述大规模SNP基因型检测覆盖23对染色体。
3.根据权利要求1或2所述方法,其特征在于,所述大规模SNP基因型检测采用基因芯片或基因测序方法。
4.根据权利要求1或2所述方法,其特征在于,步骤2)中在染色体倒位断裂点区域,所述信息SNPs从染色体倒位断裂点上下游5-20Mb范围内选择;更优选从断裂点上下游5-10Mb范围内选择;优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-20Mb范围内;更优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-10Mb范围内;更优选的,染色体每Mb范围内至少选择2、3、4、5、6、7、8、9或10个信息SNPs。
5.一种用于鉴别胚胎染色体倒位携带状态的家系单体型的构建系统,所述系统包含能够计算处理样本数据的软件、和用于承载上述软件的硬件,其特征在于,
1)所述系统还包含储存有染色体倒位携带者夫妇双方和至少一名携带者亲属进行大规模SNP基因型检测的基因分型数据的硬件;倒位携带者亲属可为与携带者具有相同染色体倒位的亲属,也可为染色体正常的亲属;将染色体倒位携带者夫妇双方、携带者亲属称为参照样本;
2)所述软件根据下述规则确定信息SNPs位点:
选择覆盖染色体倒位断裂点区域、整条倒位染色体、和与其相对应的正常的同源染色体上的信息SNPs;所述信息SNPs是在染色体倒位携带者中为杂合型,在其配偶中为纯合型,并且在携带者亲属中是纯合型的SNP位点;所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-30Mb范围内;染色体每Mb范围内至少选择1个信息SNP;
3)所述软件依照下述原则构建家系单体型:集合步骤2)确定的信息SNPs位点,通过家系连锁分析得到该家系覆盖倒位断裂点区域、倒位染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型,上述染色体单体型的集合即为家系单体型。
6.一种用于鉴别胚胎染色体倒位携带状态的系统,所述系统包含能够计算处理样本数据的软件、和用于承载上述软件的硬件,其特征在于,
1)所述系统还包含储存有染色体倒位携带者夫妇双方、至少一名携带者亲属、和携带者夫妇体外受精胚胎进行大规模SNP基因型检测的基因分型数据的硬件;携带者亲属可为与携带者具有相同染色体倒位的亲属,也可为染色体正常的亲属;将染色体倒位携带者夫妇双方、携带者亲属称为参照样本,携带者夫妇体外受精胚胎称为待定样本;
2)所述软件根据下述规则确定信息SNPs位点:
选择覆盖染色体倒位断裂点区域、整条倒位染色体、和与其相对应的正常的同源染色体上的信息SNPs;所述信息SNPs是在染色体倒位携带者中为杂合型,在其配偶中为纯合型,并且在携带者亲属中是纯合型的SNP位点;所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-30Mb范围内;染色体每Mb范围内至少选择1个信息SNP;
3)所述软件根据下述原则构建家系单体型分析模型:
集合步骤2)确定的信息SNPs位点,通过家系连锁分析得到该家系覆盖倒位断裂点区域、倒位染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型,上述染色体单体型的集合即为家系单体型;
4)所述软件将待定样本中染色体单体型信息与参照样本的单体型信息(即家系单体型)进行比对,通过整条染色体的单体型判断染色体倒位断裂点区域是否发生了同源重组:
i)当以与携带者具有相同倒位的亲属为参照时:
a.若待定样本染色体倒位断裂点区域没有发生重组,当待定样本断裂点区域单体型信息和参照样本中染色体倒位携带者以及与携带者具有相同倒位的亲属的单体型信息一致时,则为倒位携带胚胎;当待定样本倒位染色体断裂点区域单体型信息与参照样本中染色体倒位携带者单体型信息一致,但与携带相同倒位的携带者亲属的单体型信息不一致时,则为染色体完全正常的胚胎;
b.若待定样本染色体倒位断裂点区域发生了同源重组,则倒位携带或染色体完全正常胚胎的判断规则为:当只有其中1个断裂点区域的一端或两端发生同源重组,则判断规则与a相同;当2个断裂点区域中均仅有一端发生同源重组,则判断规则与a相同;当2个断裂点区域的两端均发生同源重组,则判断结果与a相反;
ii)当以染色体正常的亲属为参照时:
a.若待定样本染色体倒位断裂点区域没有发生重组,当待定样本断裂点区域单体型信息和参照样本中染色体倒位携带者以及与携带者的染色体正常的亲属的单体型信息一致时,则为染色体完全正常的胚胎;当待定样本倒位染色体断裂点区域单体型信息与参照样本中染色体倒位携带者单体型信息一致,但与携带者的染色体正常的亲属的单体型信息不一致时,则为倒位携带胚胎;
b.若待定样本染色体倒位断裂点区域发生了同源重组,则倒位携带或染色体完全正常胚胎的判断规则为:当只有其中1个断裂点区域的一端或两端发生同源重组,则判断规则与a相同;当2个断裂点区域中均仅有一端发生同源重组,则判断规则与a相同;当2个断裂点区域的两端均发生同源重组,则判断结果与a相反。
7.根据权利要求5或6所述系统,其特征在于,所述大规模SNP基因型检测覆盖23对染色体;大规模SNP基因型检测方法优选基因芯片和基因测序。
8.根据权利要求6所述系统,其特征在于,胚胎发育至第3-7天时,活检获取1-10个细胞作为所述体外受精胚胎的检测样本;优选来源于胚胎卵裂球活检或囊胚滋养外胚层活检的细胞;优选将活检获取的细胞裂解,进行全基因组扩增;全基因组扩增方法优选自MDA方法、MALBAC方法、或其他全基因组扩增方法。
9.根据权利要求5或6所述系统,其特征在于,在染色体倒位断裂点区域,所述信息SNPs从染色体倒位断裂点上下游5-20Mb范围内选择;更优选从断裂点上下游5-10Mb范围内选择;优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-20Mb范围内;更优选的,所述染色体倒位断裂点区域是指断裂点上下游5-10Mb范围内;更优选的,染色体每Mb范围内至少选择2、3、4、5、6、7、8、9或10个信息SNPs。
10.根据权利要求1所述方法、权利要求5或6所述系统,其特征在于,染色体倒位携带者夫妇双方与携带者亲属的检测样本来源为体细胞,优选外周血。
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