CN102459648A - 基因失调的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述了涉及检测基因融合和/或染色体异常,例如易位、插入、倒位和缺失的方法、组合物和试剂盒。含有感兴趣基因的融合或基因异常的样品可以显示所述基因5’和3’区域的独立表达图式。所述方法、组合物和试剂盒对于检测导致目标基因5’部分相对于所述目标基因3’区域差异表达的突变是有用的。
Description
技术领域
本技术主要涉及检测基因失调,例如由基因融合和染色体异常导致的,可能与多种疾病相关的基因失调。在具体方面,本技术涉及使用多重定量RT-PCR检测基因失调。
技术背景
提供以下描述以帮助阅读者理解。提供的信息或引用的文献均不被承认是本发明的现有技术。
染色体结构的变化涉及染色体的部分改变而不是基因组中染色体数目或染色体组数的改变。有四种常见的突变类型:缺失和重复(二者都涉及染色体上DNA量的改变)、倒位(涉及染色体片段的排列改变)和易位(涉及染色体片段的位置改变)。这四类染色体结构突变都是由染色体中一个或多个断裂(breaks)引发的。如果断裂发生在基因内,则产生基因突变,其结果取决于该基因的功能及其表达时间。无论断裂发生在哪里,断裂过程留下断裂末端,该断裂末端会粘附于其他染色体断裂末端或其他染色体正常末端。
相互易位和罗伯逊易位是最常发生的易位类型。相互易位通常涉及不同染色体之间的双向交换。染色体断裂开,并且断裂点下游的片段交换位置。在平衡情况下,不产生遗传物质的净增加或减少,并且如果基因没有被扰乱,个体的表型通常不受影响。
当两条染色体在中心处融合并基本上结合为一体时,发生罗伯逊易位。保留来自两条染色体的大部分遗传物质。与平衡的相互易位相同,携带者可能正常,但产生遗传上不平衡的配子。大部分源自不平衡配子的后代不能存活,并在孕早期发生流产。如果携带者可育并且后代存活,可能发生多种缺陷。一种罗伯逊易位导染色体14和21融合。获得的后代可能遗传得到染色体21的三个拷贝,导致唐氏综合征。
基因异常例如重复、缺失、染色体易位和点突变通常导致病理状态。某些疾病,例如癌症是由生命过程中少数细胞获得的基因异常造成的,而在其他疾病中,基因异常存在于全部体细胞中,并且从受孕即存在。
发明概述
本文描述了涉及检测基因失调,如由基因融合和染色体异常,例如易位、插入、倒位和缺失导致的那些基因失调的方法、组合物和试剂盒。所述方法、组合物和试剂盒对于检测导致目标基因5’区域相对于其3’区域差异表达的突变是有用的。
在一方面,本公开提供检测目标基因失调的方法。所述方法可以包括:(a)用与目标基因5’区域互补的一个或多个5’目标引物对扩增生物样品中目标基因转录物的5’区域——如果存在;(b)用与目标基因3’区域互补的一个或多个3’目标引物对扩增生物样品中目标基因转录物的3’区域——如果存在;和(c)检测一个或多个5’目标引物对和一个或多个3’目标引物对产生的扩增产物的量。所述方法也可以提供,由步骤(a)和(b)产生的扩增产物量的差异表明目标基因失调。
在另一方面,本公开提供检测样品中目标基因是否存在失调的方法。所述方法可以包括:(a)测量测试样品中目标基因的5’区域和目标基因的3’区域的转录量;和(b)比较测试样品中目标基因的5’区域相对于3’区域的相对表达和参照样品中目标基因的5’区域相对于3’区域的相对表达。所述方法也可以提供,与参照样品相比测试样品中的相对表达的差异表明存在基因失调。在一个实施方式中,可以使用实时PCR并比较每个扩增子的阈值循环,或Ct值测定转录物的相对量。所述Ct值可以归一化成参照样品。
在另一方面,本公开提供诊断对象中癌症或癌症易感性的方法。所述方法可以包括:(a)用与目标基因5’区域互补的一个或多个5’目标引物对扩增生物样品中目标基因转录物的5’区域——如果存在;(b)用与目标基因3’区域互补的一个或多个3’目标引物对扩增生物样品中目标基因转录物的3’区域——如果存在;和(c)检测一个或多个5’目标引物对和一个或多个3’目标引物对产生的扩增产物的量。所述方法也可以提供,由步骤(a)和(b)产生的扩增产物量的差异表明对象患有癌症或易感由基因失调引起的癌症。
在另一方面,本公开提供诊断对象中前列腺癌或前列腺癌易感性的方法。所述方法可以包括:(a)用与目标基因5’区域互补的一个或多个5’目标引物对扩增生物样品中目标基因转录物的5’区域——如果存在;(b)用与目标基因3’区域互补的一个或多个3’目标引物对扩增生物样品中目标基因转录物的3’区域——如果存在;和(c)检测一个或多个5’目标引物对和一个或多个3’目标引物对产生的扩增产物的量。所述方法也可以提供,由步骤(a)和(b)产生的扩增产物量的差异表明目标基因失调。
在另一方面,本公开提供诊断对象中非小细胞肺癌(NSCLC)或NSCLC易感性的方法。所述方法可以包括:(a)用与目标基因5’区域互补的一个或多个5’目标引物对扩增生物样品中目标基因转录物的5’区域——如果存在;(b)用与目标基因3’区域互补的一个或多个3’目标引物对扩增生物样品中目标基因转录物的3’区域——如果存在;和(c)检测一个或多个5’目标引物对和一个或多个3’目标引物对产生的扩增产物的量。所述方法也可以提供,由步骤(a)和(b)产生的扩增产物量的差异表明目标基因失调。适当的目标基因包括例如ALK和EML4。
任选地,可以对含有感兴趣目标基因的核酸样品进行另一分析,以测定基因失调的性质。适当的分析包括例如比较杂交(例如比较基因组杂交)。比较杂交技术例如比较基因组杂交(CGH)受限于该技术只能检测不平衡重排(导致遗传物质增加或减少的重排)的事实。比较杂交不能充分地检测染色体异常例如平衡易位。因此,本发明的任何方法可以与比较杂交技术结合使用。具体地,在大多数白血病、淋巴瘤和实体肿瘤中主要的异常是平衡易位。本发明方法与比较杂交(例如CGH)的结合能检测平衡和不平衡重排并提供比在单独使用比较杂交技术的情况下更精确的诊断。在不平衡重排的情况下,比较杂交技术可以用作验证分析。如本文论述,目标基因失调可能由基因融合和染色体异常,包括例如易位、缺失、倒位和插入而引起。
适用于上述任何方法的目标基因包括例如跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)、ETS相关基因(ERG)、ETS易位变体1(ETV1)、溶质载体家族45成员3(SLC45A3)、人内源逆转录病毒K(HERV-K_22q11.3)、染色体15开放阅读框21(C15ORF21)、核内不均一核糖核蛋白A2/B1(HNRPA2B1)、ETS易位变体4(ETV4)、ETS易位变体5(ETV5)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)或棘皮动物微管相关蛋白类似蛋白4(EML4)、EUS、RANBP2、PAX、BUS、COL1A1CLTC、KIF5B FKHR、PDGFB、FEV、DDIT3、ATF1CREA、SP3、NR4A3、WT1、SYT、SSX1、SSX2、SSX4、BCR、ABL、BCL2、RARA、NPM和ATIC。
可以使用任何上述方法诊断任何癌症或与基因失调相关的其他病症。适于诊断的病症包括例如具有不确定的组织学的儿童软组织肉瘤。
在一个实施方式中,在多重扩增反应中,将生物样品与一个或多个5’目标引物对以及一个或多个3’目标引物接触。在一个实施方式中,使用与每个扩增产物互补的标记寡核苷酸探针实现检测。例如,每个寡核苷酸探针可以包含不同的可检测标记,例如供体荧光团和猝灭剂部分。在另一个实施方式中,至少一个5’区域的引物和/或至少一个3’区域的引物优选用不同的可检测标记被可检测地标记。在说明性实施方式中,使用定量RT-PCR例如实时RT-PCR完成扩增。
在一些实施方式中,染色体异常选自易位、缺失、倒位和插入。在一个实施方式中,生物样品是来自要测试染色体异常的对象的样品。
在一个实施方式中,所述方法还包括用与内源对照基因互补的引物对扩增存在于生物样品中的内源对照基因转录物的区域并检测该内源对照基因的区域的扩增。在一些实施方式中,扩增的目标基因转录物(即5’区域和3’区域)的量可以归一化成扩增的内源对照基因转录物的量。适当的内源对照基因包括例如ABL。
在本文的任何方面的实施方式中,所述方法还包括:(a)测量测试样品中第二目标基因的5’区域转录量和第二目标基因的3’区域的转录量;和(b)比较测试样品中第二目标基因的5’区域相对于3’区域的相对表达与参照样品中第二目标基因的5’区域相对于3’区域的相对表达。所述方法也可以提供,与参照样品相比测试样品中目标基因和第二目标基因的相对表达的差异表明存在目标基因:第二目标基因易位。示例性目标基因:第二目标基因易位包括TMPRSS2:ERG、TMPRSS2:ETV1和EML4:ALK。
适当的生物样品包括例如全血、分离的血细胞、血浆、血清和尿液。
在另一方面,本公开提供检测样品中基因异常的试剂盒。所述试剂盒可以包含:(a)至少一个用于测定目标基因5’区域的至少一个序列表达水平的寡核苷酸;和(b)至少一个用于测定目标基因3’区域的至少一个序列表达水平的寡核苷酸。在一个实施方式中,所述目标基因是TMPRSS2或ALK。在一些实施方式中,所述试剂盒还包含用于进行实时RT-PCR的一种或多种试剂。
附图简述
图1是显示用于TMPRSS2易位检测的定量RT-PCR设计的示意图。显示了为TMPRSS2的5’和3’区域设计的,用箭头代表的引物,以及用线代表的探针,用圆代表荧光团和猝灭剂。图A:正常前列腺中发现的TMPRSS2和成红血细胞转化特异性(ETS)转录物以及相对转录物水平(高/低)的示意图。图B:前列腺肿瘤中发现的TMPRSS2:ETS融合转录物以及相对转录物水平(高/低)的示意图。
图2是显示用实时RT-PCR获得的Ct值,通过上面显示的等式测定的来自25位前列腺癌患者FFPE肿瘤组织的TMPRSS2IDE分数(IDE scores)的点图。通过荧光实时RT-PCR验证的已知TMPRSS2:ERG融合状态(7个TMP:ERG阴性,18个TMP:ERG阳性)对结果进行分组。来自TMPRSS2:ERG阴性组的两个样本低于60(圈出),其中一个(M289)基于ETV表达数据(数据未示出)被怀疑具有TMPRSS2:ETV融合。
图3是显示对照样本(TMPRSS2:ERG前列腺癌细胞系)中TMPRSS2(图3A)和ERG(图3B)的原始基因内差异表达(IDE)值的柱形图。5’和3’区域的取向由TMPRSS2(图3A)和ERG(图3B)的原始IDE分数(绝对值不适用)表示。正值说明较高的5’水平,而负值说明较高的3’水平。正常前列腺RNA不包含TMPRSS2或ERG融合,对于TMPRSS2:ERG融合,VCaP细胞RNA是阳性的。
图4是显示FFPE组织中TMPRSS2IDE分数的柱形图。柱代表来自14个BPH样本和30个PCa样本的平均IDE分数。Y-误差线表示标准差。
图5是显示FFPE组织中ERG IDE分数的柱形图。圆柱代表来自14个BPH样本和30个PCa样本的平均IDE分数。Y-误差线代表标准差。
图6显示了用RT-PCR和片段分析直接检测到的EML4-ALK融合。向右的箭头表示正向引物,向左的箭头表示反向FAM标记引物。表中给出了每个变体的预期大小。
图7是比较ALK表达和ALK重排的检测方法结果的图表。柱形图代表来自4个对照细胞系和32个肺癌组织样本的ALK表达(浅色柱)和ALK IDE(深色柱)。水平虚线表示IDE分界线(IDE cutoff)水平。来自EML4:ALK片段分析、ALK IHC和ALK FISH的结果在图像下方的表中显示。有“-”的细胞表示阴性结果,有“+”的细胞表示阳性结果,有“Q”的细胞表示量不足。
发明详述
本文描述了用于检测样品中基因失调,例如由染色体或基因异常引起的那些基因失调的方法、试剂和试剂盒,其中所述失调导致目标基因特定部分的差异表达或量。染色体异常包括例如易位、缺失和插入。大规模突变能影响染色体和基因结构,包括例如大染色体区域的缺失,导致这些区域内的基因丢失;以及易位,其为突变,作用是将原本单独的DNA片段并列,可能将单独的基因组合形成功能上不同的融合基因(例如TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV和EML4-ALK)。例如,缺失可能导致原本较远的基因并列,产生融合蛋白质。另一个实例包括染色体倒位,其使染色体片段的取向变反。所有这些染色体异常都能扰乱或改变编码序列或影响特定编码序列转录水平的非编码区元件。
为便于理解本发明,以下定义了一些术语和短语。
如本文所用,除非另有说明,单数形式“一个(a、an)”和“该(the)”包括复数引用。因此,例如,对“一个寡核苷酸”的引用包含多个寡核苷酸分子,对标记的引用是对一个或多个标记的引用,对探针的引用是对一个或多个探针的引用,对“一个核酸”的引用是对一个或多个多聚核苷酸的引用。
如本文所有,除非另有说明,当涉及数值,术语“约”指所列举值的加或减10%。
本文所用的术语“扩增(amplification或amplify)”包含拷贝目标核酸,从而增加所选核酸序列拷贝数的方法。扩增可以是指数或线性的。目标核酸可以是DNA或RNA。以这种方法扩增的序列形成“扩增产物”。尽管下文说明的示例性方法涉及使用聚合酶链反应(PCR)扩增,但是本领域熟知多种其他核酸扩增方法(例如等温方法、滚环方法等)。熟练的技术人员将理解,这些其他方法可以代替PCR方法或与PCR方法一起使用。参见例如Saiki,″Amplification of Genomic DNA″in PCRProtocols,Innis等,Eds.,Academic Press,San Diego,CA 1990,pp.13-20;Wharam等,Nucleic Acids Res.,29(11):E54-E54,2001;Hafner等,Biotechniques,30(4):852-56,858,860,2001;Zhong等,Biotechniques,30(4):852-6,858,860,2001。
如本文所用,术语“检测”指观察可检测标记的信号,以说明样品中目标核酸的存在。术语检测不需要所述方法提供100%灵敏性和/或100%特异性。众所周知,“灵敏性”是对象有目标核酸序列时测试呈阳性的概率,而“特异性”是对象没有目标核酸序列时测试呈阴性的概率。优选至少50%的灵敏性,尽管显然更优选至少60%、至少70%、至少80%、至少90%和至少99%的灵敏性。优选至少50%的特异性,尽管显然更优选至少60%、至少70%、至少80%、至少90%和至少99%的特异性。检测也包含用假阳性和假阴性的分析。假阴性率可以是1%、5%、10%、15%、20%或甚至更高。假阳性率可以是1%、5%、10%、15%、20%或甚至更高。
本文所用的术语“互补(complement)”、“互补的(complementary)”或“互补性(complementarity)”指碱基配对原则相关的多核苷酸(即核苷酸序列例如寡核苷酸或基因组核酸)。本文所用的核酸序列的互补指当与所述核酸序列比对以便一条序列的5’端与另一序列的3’端配对时呈“反向平行相关”的寡核苷酸。例如,序列5’-A-G-T-3’与序列3’-T-C-A-5’是互补的。本发明的核酸中可以包含一些天然核酸中不常见的碱基,包括例如肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。互补不需要是完全的;稳定的双链体可以包含错配碱基对或未配对碱基。核酸技术领域的技术人员可以根据经验考虑多个变量包括例如寡核苷酸长度、碱基组成和寡核苷酸序列、离子强度和错配碱基对的发生率,确定双链体稳定性。互补可以是“部分”的,其中只有一些核酸碱基根据碱基配对原则配对。或者,核酸之间可以有“完全(complete)”、“总(total)”或“全(full)”互补性。
本文所用的术语“可检测标记”指与探针相连,用于识别与基因组核酸或参照核酸杂交的探针的分子或化合物,或一组分子或一组化合物。在一些情况下,所述可检测标记可以被直接检测。在其他情况下,所述可检测标记可以是结合对的一部分,可以随后被检测。所述可检测标记的信号可以用多种手段检测,取决于所述可检测标记的性质。用以检测可检测标记的手段的实例包括但不限于分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电磁、放射化学或化学手段,例如荧光、化学荧光或化学发光,或任何其他适当的手段。
在基因片段或染色体片段的语境中,“片段”指至少约10个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约25个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约250个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约个1000核苷酸、至少约2000个核苷酸、至少约5000个核苷酸、至少约10000个核苷酸、至少约20000个核苷酸、至少约50000个核苷酸、至少约100000个核苷酸、至少约500000个核苷酸、至少约1000000个核苷酸或更多的核苷酸残基序列。
本文所用的术语“基因异常”或“染色体异常”指核酸序列与野生型或正常基因序列的偏差。基因异常可以反映与生物体全部染色体的正常全遗传互补(genetic complement)相比,该生物体的全遗传互补或其任何部分的差异。例如,基因异常可以包含染色体或其部分的改变(例如缺失、重复、扩增);或染色体结构的改变(例如易位、点突变)。基因异常可以是遗传性的,即从一代传到下一代,或者是非遗传性的。基因异常可以存在于生物体的某些细胞中或其全部细胞中。
本文所用的术语“内源对照基因”指通常持续表达,并被认为参与日常细胞代谢的基因。内源对照基因是众所周知的,包括基因例如ABL、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH或GAPDH)、白蛋白、肌动蛋白、微管蛋白、亲环蛋白、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HRPT)、L32.28S和18S rRNA。在诊断分析中检测内源对照基因可以作为该分析的阳性对照。
术语“同一性(identity)”和“同一的(identical)”指序列之间同一性的程度。可以有部分同一性或完全同一性。部分同一的序列是与另一序列的同一性小于100%的序列。部分同一的序列可以具有至少70%或至少75%、至少80%或至少85%、或至少90%或至少95%的总体同一性。
如本文所用,术语“分离的”、“纯化的”或“基本纯化的”指从其天然环境中移除、分离或分开的,并且至少60%,优选地75%,最优选地90%不含与其天然相关的其他成分的分子例如核酸。分离的分子因而是基本纯化的分子。
本文所用的术语“多重PCR”指在同一反应容器中同时提供两种或多种产物的扩增和检测的分析。每种产物使用不同的引物对引导。多重反应还可以包含用于每种产物的特异性探针,该探针用不同的可检测部分被可检测地标记。
如本文所用,术语“寡核苷酸”指由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合构成的短聚合物。寡核苷酸长度通常在约10、11、12、13、14、15、20、25或30至约150个核苷酸(nt)之间,更优选地约10、11、12、13、14、15、20、25或30至约70个nt之间,最优选地在约18至约26个nt之间。
如本文所用,“引物”是与目标核苷酸序列互补,并且在DNA或RNA聚合酶存在下能导致核苷酸添加到引物3’末端的寡核苷酸。引物的3’核苷酸通常应当与相应核苷酸位置的目标序列相同,以便最优的延伸和/或扩增。术语“引物”包含各种形式的引物,可以是合成引物,包括肽核酸引物、锁定核酸引物、硫代磷酸修饰的引物、标记的引物等。如本文所用,“正向引物”是与dsDNA反义链互补的引物。“反向引物”与dsDNA有义链互补。如本文所用,“5’目标引物对”是扩增目标核苷酸序列5’区域的至少一个正向引物和至少一个反向引物。如本文所用,“3’目标引物对”是扩增目标核苷酸序列3’区域的至少一个正向引物和至少一个反向引物。
对目标核酸特异性的寡核苷酸(例如探针或引物)将在适当条件下与目标核酸“杂交”。如本文所用,“杂交(hybridization)”或“杂交(hybridizing)”指寡核苷酸单链通过碱基配对在限定的杂交条件下与互补链退火的过程。它是两个互补多核苷酸之间特异性,即非随机的相互作用。杂交和杂交强度(即核酸之间结合的强度)受核酸之间的互补程度、涉及条件的严格性以及形成的杂交物的Tm等因素影响。
“特异性杂交”表示两条核酸序列享有高度互补性。特异性杂交复合物在允许的退火条件下形成并在随后的任何洗涤步骤后保持杂交。核酸序列退火的允许条件可以由本领域技术人员常规地确定,并且可以在例如在约6×SSC存在的情况下在65℃下发生。杂交的严格性可以部分参照实施洗涤步骤的温度表示。该温度通常被选择为比特定序列在限定离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃至20℃。Tm是(在限定离子强度和pH下)50%的目标序列与完全配对的探针杂交的温度。本领域熟知计算Tm的方程和核酸杂交的条件。
如本文所用,当寡核苷酸和核酸比对时,如果寡核苷酸与核酸的一部分具有至少50%序列同一性,则该寡核苷酸对该核酸是“特异性”的。对核酸特异性的寡核苷酸是在适当的杂交或洗涤条件下能与感兴趣的目标杂交并基本不与不感兴趣的核酸杂交的寡核苷酸。优选较高水平的序列同一性,包括至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%,更优选至少98%序列同一性。序列同一性可以使用具有默认设置的可商业购得的计算机程序测定,所述程序采用本领域众所周知的算法(例如BLAST)。如本文所用,具有“高序列同一性”的序列在至少约50%比对的核苷酸位置,优选在至少约60%比对的核苷酸位置,更优选在至少约75%比对的核苷酸位置具有相同的核苷酸。
术语“目标核酸”、“目标基因”和“目标序列”在本文中可互换地使用,指意图被鉴定的核酸序列。目标核酸序列可以包含目标基因或任何其他感兴趣序列的5’或3’区域。目标核酸可以表示特定基因的可选序列或等位基因。目标核酸可以是双链或单链的,或部分双链的,或部分单链的,或发夹结构的分子。目标核酸可以是约1-5个碱基、约10个碱基、约20个碱基、约50个碱基、约100个碱基、约500个碱基、约1000个碱基、约2000个碱基、约2500个碱基、约3000个碱基、约3000个碱基、约4000个碱基、约5000个碱基、约7500个碱基、约10000个碱基、约20000个碱基、约30000个碱基、约40000个碱基、约50000个碱基、约75000个碱基、约100000个碱基、约1000000个碱基或更多。
当提及目标核酸时,术语“转录物”指代表细胞基因组核酸的任何核酸,包括例如任何形式的RNA(例如mRNA、前mRNA和snRNA)和合成的代表物例如cDNA。
本文所用的术语“测试样品”指包含核酸或被怀疑包含核酸的样品。在一些实施方式中,测试样品中的核酸根据本文公开的方法使用。在一些实施方式中,测试样品是生物样品。
本文所用的术语“生物样品”指包含目标核酸或用作本发明方法的目标核酸来源的样品。生物样品可以包括临床样品(即直接从患者获得)或分离的核酸,并且可以是细胞或非细胞液体和/或组织(例如活组织检查)样品。在一些实施方式中,样品从收集自对象的组织或体液获得。样品来源包括但不限于唾液(处理的或未处理的)、支气管肺泡灌洗夜(BAL)、支气管冲洗液(BW)、全血或任何类型的分离血细胞(例如淋巴细胞)、体液、脑脊液(CSF)、尿液、血浆、血清或组织(例如活组织检查材料)。本文所用的术语“患者样品”指从寻求疾病诊断和/或治疗的人获得的样品。在对象是胎儿的情况下,患者样品可以来自对象(即胎儿)、羊水或母体(例如母亲血液)。
如本文所用,术语“对象”指哺乳动物例如人,但也可以是另一种动物例如家养动物(例如狗、猫等)、家畜(例如牛、羊、猪、马等)或实验动物(例如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。术语“患者”指患有染色体异常相关疾病或被怀疑患有染色体异常相关疾病的“对象”。
技术概况。本文公开的是用于检测对象中是否存在目标基因失调的方法,其至少部分基于本技术的测试方法针对样品的结果。本文公开的测试样品由例如血液(或血液组分(fraction)例如血浆、血清或具体细胞成分)、淋巴、粘液、泪液、唾液、囊液、尿液、精液、粪便、CSF、腹水、全血以及身体组织的活组织检查样品、细针穿刺物(FNA)、支气管肺泡灌洗液(BAL)代表,但不以任何方式受限于这些。本公开还尤其涉及诊断或监测癌症的方法。所述癌症可以是肺癌或前列腺癌、骨和软组织肉瘤、多种白血病和淋巴瘤。
该技术主要提供检测、测量和比较测试样品中目标基因不同区域的基因表达。因此,多个方面涉及收集、制备、分离、鉴定、表征和比较测试样品中信使RNA的丰度。该技术还涉及检测和/或监测含有目标基因5’区域和目标基因3’区域的信使RNA的样品。如本文所用,短语“检测……量”或“检测……水平”指来自任何基因或基因部分例如基因5’区域、目标基因3’区域、参照基因的转录物的量化。所述量可以表示为浓度、拷贝数或Ct值。阈值循环或Ct值是进行实时核酸扩增时信号与阈值交叉(intersect)的循环。
不含有目标基因内染色体异常的样本将在5’区域和3’区域之间呈现相同的表达图式,因为它们以单分子的方式连接。然而,当目标基因受某些基因或染色体异常影响时,所述5’区域和3’区域可能显示其独立的表达图式。在易位的情况下,所述5’区域和3’区域将显示不同的表达图式,因为这两个区域现在在染色体上不再连接。
更具体地,经历某些重排的基因将表现出5’区域相对于3’区域的差异表达。这发生在基因5’区域保持在该基因调控元件——例如包含于5’非翻译区域(UTR)中的那些元件——控制下的情况中。该基因的3’区域被并列以便在不同调控元件的控制下或完全不受控制。由于这些类型的突变,该基因的5’区域(例如至少一条对5’区域而言特异的序列,以便它出现在突变断裂点或缺失位点的上游)根据该目标基因自身的调控元件而表达,而3’区域(例如至少一条对3’区域而言特异的序列,其出现在突变断裂点或缺失位点的下游)将不表达——这是在3’区域缺失,或易位到不活跃表达的位置的情况下——或以与不同基因的调控元件一致的水平表达。
因此,所述方法提供对导致基因5’区域相对于其3’区域差异表达的这些突变的检测。这种情况的一个实例发生在许多前列腺癌患者中,这些患者具有TMPRSS2基因的易位,使得TMPRSS2基因的5’区域保持在强TMPRSS2启动子控制下,而TMPRSS2基因的3’区域被易位,使得它通过不太强的ERG或ETV启动子表达。
如本文所用,短语“水平差异”和“量差异”指基因5’区域的转录物的量与该目标基因3’区域转录物的量相比的差异。在一个实施方式中,基因5’区域转录物与该目标基因3’区域转录物的量相比以增加的量或减少的量存在于样品中。在野生型或正常细胞中,目标基因5’区域转录物的量和目标基因3’区域转录物的量预期在相等或接近相等的量。相等的量指测得的5’区域和3’区域转录物或可检测信号(其与转录物的量相关)的量不表现出与对照样品中相同比较的统计学上显著差异。本领域技术人员已知比较这些值的方法,包括但不限于学生t-检验和方差分析。技术人员了解,由于本文使用的检测方法的固有技术差异,即使不存在染色体异常(即两个区域保持以单分子方式连接和在相同调控元件的控制下),5’区域的可检测信号的量也不必然等于3’区域的可检测信号的量。
在含有目标基因易位的样品中和没有易位的那些样品中预期发现的不同3’目标基因表达水平可以通过将3’目标基因表达水平归一化成5’目标基因的而建立。根据以下公式计算IDE分数:
IDE分数=2-(Ct 3’-目标基因 )-(Ct 5’-目标基因 )
其中,Ct(阈值循环)值可以通过RT-PCR获得。
在其他实施方式中,计算IDE分数时,3’和5’目标基因测量可以归一化成内源对照基因。一些有用的公式包括例如
(3’目标)/(对照)-(5’目标)/(对照),或
(3’目标)/(5’目标),或
Ln((3’目标)/(对照))-Ln((5’目标)/(对照))
在其他实施方式中,测试样品中测得的3’和5’转录物量可以归一化成对照样品而不是内源基因相同转录物的水平。
在一些实施方式中,如果5’和3’区域转录物或可检测信号的平均量在约1个标准差内、在约0.5个标准差内、在约0.2个标准差内、在约0.1个标准差内或在约0.01个标准差内,则这两个量之间可能没有显著差异。在该实例中,可以得出5’和3’区域以单分子方式表达和目标基因中没有染色体异常的结论。
在另一方面,如果5’区域和3’区域转录物或可检测信号的平均量超过约1个标准差、约1.5个标准差、约2.0个标准差或约2.5个标准差,则这两个量之间可能有显著差异。在该实例中,可以得出5’和3’区域在不同启动子的控制下表达(或者一个区域可能完全不表达)使得目标基因中存在染色体异常的结论。
测得的转录物或可检测信号(其与转录物的量相关)的量可以表示为目标基因5’区域相对目标基因3’区域表达的“相对量”或“比率”。相对量可以是单个值或值的范围。例如,可以使用值的范围产生形成的可检测信号的相对量与一些其他量(例如mRNA分子数)之间的标准曲线关系。如果目标基因5’区域相对目标基因3’区域表达的比率在统计学上小于或大于1,则检测到染色体异常。当该比率小于1时,目标基因3’区域已被易位到比原目标基因转录更活跃的基因组区域。当该比率大于1时,3’区域或已缺失或已被易位到与原目标基因相比转录不太活跃的基因组区域。
在一些实施方式中,从对象获得的样品被分析以确定特定基因或感兴趣核酸序列5’和3’区域的相对表达水平。实时RT-PCR(定量逆转录聚合酶链反应)是用于mRNA检测和定量的灵敏技术。与其他两种常用的用于定量mRNA水平的方法——RNA印迹分析和RNA酶保护分析——相比,RT-PCR可用于定量更小样品的mRNA水平。实际上,该技术灵敏到足以能够定量单个细胞的RNA。
只要已知感兴趣基因的序列,本领域技术人员将知道如何设计用于检测任何感兴趣基因的5’和3’差异表达的寡核苷酸引物和探针。引物的大小取决于多种因素,包括寡核苷酸的最终功能或用途。起例如延伸引物或探针功能的寡核苷酸将足够长以在催化剂例如DNA聚合酶和三磷酸脱氧核糖核苷存在的情况下引导延伸产物的合成。
可选地,插入或转座事件可以导致目标基因5’区域和3’区域的差异表达。例如启动子或其它调控元件的插入或可转座元件转座到感兴趣基因的编码序列中间可以产生目标基因5’区域以不同于目标基因3’区域的水平表达的情况。
任何这种导致目标基因5’区域和目标基因3’区域差异表达的突变可根据本文描述的方法、组合物和试剂盒检测。本领域技术人员知道如何将例如RT-PCR引物引向存在于转录起始处或其附近的感兴趣基因的5’区域,从而确保对应于5’区域的产物,其存在于潜在染色体异常的下游。本领域技术人员只需要参考目标基因的已知序列和已知的碱基配对原则,以确定有效的RT-PCR引物或引物对。同样,本领域技术人员能设计用于感兴趣基因3’区域的引物或引物对。在具体实例中,在存在已知染色体异常的情况下,本领域技术人员进一步通过已知突变位点知识的帮助,从而允许设计在突变位点处或其附近的引物,例如引物或引物对可以设计紧挨着突变位点的5’和紧挨着突变位点的3’;或者,例如引物或引物对可以设计在突变位点任一侧约5个核苷酸(nt)内、在突变位点任一侧约10个nt内、在突变位点任一侧约20个nt内、在突变位点任一侧约50个nt内、在突变位点任一侧约100个nt内、在突变位点任一侧约250个nt内或在突变位点任一侧约500个nt内。
染色体异常;类型和相关疾病。染色体异常可以反映与生物体全部染色体正常全基因互补相比该生物体全基因互补或其任何部分之间的差异。例如,基因异常可以包括染色体拷贝数的改变(例如非整倍性)或其部分的改变(例如缺失、重复、扩增);或染色体结构的改变(例如易位、点突变)。基因异常可能导致病理状态。尽管有些疾病例如癌症是由生命过程中少数细胞中获得的基因异常引起的,但术语“遗传疾病”最常指存在于全部体细胞中和从受孕即存在的疾病。基因异常可以是遗传性的或非遗传性的。
遗传重复是基因组序列区域的任何重复。它可以作为同源重组、逆转座事件或整个染色体复制中的差错而发生。基因的重复与多种疾病相关,例如一些畸形性骨肉瘤的病例与MYC基因的重复有关(Sarcoma,1(3-4):131-134,1997),一些乳腺癌的病例与HER-2/neu基因的重复有关(Ann Oncol.,12(suppl 1):S3-S8,2001),一些膀胱肿瘤的病例与c-erb-2基因的重复有关(CancerRes.,55:2422-2430,1995)。
缺失(又称为基因缺失、缺陷或缺失突变)是部分染色体或DNA序列丢失的基因畸变。缺失是遗传物质的丢失。从单个碱基到整个染色体片段,任何数量的核苷酸都可以缺失。缺失可以由减数分裂过程中染色体交换中的差错造成。缺失与多种遗传病症相关,包括一些男性不育病例和三分之二杜氏肌营养不良病例,染色体5短臂的部分缺失导致称为猫叫的综合征,又称为“猫啼”综合征。
染色体“易位”是非同源染色体之间部分的交换。它通常通过受影响细胞的细胞遗传学或核型分析进行检测。有两种主要类型:相互易位,其中全部染色体物质被保留;以及罗伯逊易位,其中部分染色体物质丢失。此外,易位可以是平衡的(其中物质平等交换,没有遗传信息的增加或丢失)或不平衡的(其中染色体物质的交换不平等,导致基因增加或丢失)。
染色体9和22之间的相互易位导致细胞遗传学上不同的近端着丝染色体,称为费城染色体。该易位融合染色体22的BCR基因座位与染色体9的原癌基因ABL座位,形成bcr/abl致癌蛋白(Tefferi等Mayo ClinPrvc,80(3):390-402,2005)。尽管费城染色体最初与CML相关,但现在已知它是其他血液疾病例如急性淋巴性白血病(ALL)的预后指示物。
易位与其他疾病相关。例如,染色体16的CBP基因与染色体11的MLL基因通过染色体11和16之间的易位而融合,与白血病相关(Zhang等,GenesChromosomes Cancer,41(3):257-65,2004)。类似地,染色体8和21之间的易位导致AML1和ETO基因的融合,与将近15%的急性粒细胞性白血病(AML)病例相关(Zhang等,Science,305:1286-9,2004)。此外,在多种形式的淋巴瘤中已鉴定出了许多染色体易位。例如涉及c-myc基因的染色体8和14之间的易位据报道存在于约80-85%的伯基特淋巴瘤/白血病病例中(Vega等,Arch Pathol Lab Med,127:1148-1160,2003)。另一个实例是导致EML4和ALK基因融合的易位。该EML4-ALK融合易位与NSCLC相关(Permer等,Neoplasia,10(3):298-302,2008)。示例性EML4:ALK融合包括已在3-7%所有NSCLC中鉴定的染色体2p倒位(inv(2)(p21;p23))和至少11个鉴定的EML4:ALK易位变体。在某些实施方式中,本文公开的IDE方法允许检测易位而不考虑染色体断裂点。
在另一个实例中,在前列腺癌中已鉴定出雄性激素相关基因TMPRSS2与ETS转录因子家族成员(例如ERG、ETV1和ETV4)的融合。在具有异常值表达(outlierexpression)的前列腺癌组织中发现了反复出现的TMPRSS2的5’非翻译区与ERG或ETV1的基因融合(Tomlins,S.等,Science,310:644-648,2005)。这些基因融合发生在大部分用PSA筛选鉴定的前列腺癌中,并且是ETS转录因子家族三个成员ERG(21q22.3)、ETV1(7p21.2)或ETV4(17q21)过量表达的驱动机制。已发现29个前列腺癌样品中有23个带有ERG或ETV1重排。细胞系实验表明,TMPRSS2的雄性激素响应启动子元件介导ETS家族成员在前列腺癌中的过量表达。考虑到前列腺癌的高发病率和该基因融合的高频率,TMPRS2-ETS基因融合是人类恶性肿瘤中迄今描述的最常见的基因畸变。ERG是ETS基因中与TMPRSS2最常见的融合伙伴。该基因融合被认为是前列腺癌发展中的早期事件。前列腺癌中的融合状态可以决定临床结果。因此,本文描述的方法、组合物和试剂盒对于检测前列腺癌患者中普遍的TMPRSS2易位,从而允许检测前列腺癌或者处于患前列腺癌风险中的个体是有用的。
基因异常也可以是点突变、插入或缺失。点突变或置换是一种导致单个碱基核苷酸被另一核苷酸替换的突变。插入和缺失包括单个碱基对的插入或缺失。基因或染色体中的突变通常与疾病相关,例如镰刀形细胞贫血症、囊性纤维化、血友病、苯丙酮尿症、脊柱裂等。
目标核酸和引物。本发明的方法涉及通过用一个或多个与目标基因5’区域互补的5’目标引物对扩增生物样品中目标基因转录物的5’区域——如果存在;以及用一个或多个与目标基因3’区域互补的3’目标引物对扩增生物样品中目标基因转录物的3’区域——如果存在,来检测目标基因中的染色体异常。这些区域可以使用基于包括所述区域的基因组和/或cDNA序列设计的寡核苷酸引物通过PCR进行扩增和分离。任何受染色体异常潜在影响的目标基因都可以根据本文所述的方法进行分析。
术语“5’区域”指相对于3’区域,位置接近多核苷酸5’末端的多核苷酸部分,并且可以包括或可以不包括相同多核苷酸最5’端的核苷酸(一个或多个)。在易位的背景下,5’区域指处于易位断裂点的5’方向或上游的区域。在本方法的背景下,5’区域可以位于目标基因转录部分的5’末端附近。在一些实施方式中,5’区域包括目标基因5’非翻译区域(UTR)的全部或部分。在其他实施方式中,5’区域位于起始密码子的下游(如果目标基因是蛋白编码基因);例如,在终止密码子下游至少10个、至少50个、至少100个、至少200个或至少500个核苷酸。要扩增的5’区域的大小可以根据所选检测方法而改变。在一些实施方式中,可以选择引物以扩增5’区域内至少10个、至少20个、至少30个、至少50个、至少100个、至少200个或至少500个核苷酸。
术语“3’区域”指相对于5’区域,位置接近多核苷酸3’末端的多核苷酸部分,并且可以包括或可以不包括相同多核苷酸最3’端的核苷酸(一个或多个)。在易位的背景下,3’区域指处于易位断裂点的3’方向或下游的区域。在本方法的背景下,3’区域可以位于目标基因转录部分的3’末端附近。在一些实施方式中,3’区域包括目标基因3’UTR的全部或部分。在其他实施方式中,3’区域位于终止密码子的上游(如果目标基因是蛋白编码基因);例如,在终止密码子上游至少10个、至少50个、至少100个、至少200个或至少500个核苷酸。要扩增的3’区域的大小可以根据所选检测方法而改变。在一些实施方式中,可以选择引物以扩增3’区域内至少10个、至少20个、至少30个、至少50个、至少100个、至少200个或至少500个核苷酸。
在评价已知基因异常时,术语“5’区域”和“3’区域”在一定程度上是相对而言的,因为每个区域被选择以处于造成基因异常的缺陷(例如断裂点)的不同侧。这些区域可以为方便起见或其他实质性原因(即同时评价其他异常例如突变(SNP)、缺失、插入等)而选择,并且不需要分别处于转录物的5’和3’端。当评价未知转录物的目标核酸(即特异性断裂点先前还没有被鉴定)时,优选特定目标基因5’区域与3’区域的之间距离应当最大化到可能允许检测两个区域间可能发生的多种染色体异常的最大程度。这一策略最大化与基因异常有关的任何断裂点在这两个区域间发生的可能性。在一个实施方式中,通过本发明方法评价的5’和3’区域中一个或两者位于转录物非翻译区(UTR)中。本领域熟知选择PCR扩增引物的指导原则。参见例如McPherson等,PCR Basics;From Background to Bench,Springer-Verlag,2000。有多种用于设计引物的计算机程序,例如Oligo (NationalBiosciences,Inc,Plymouth Minn.)、Mac Vector(Kodak/IB I)和GCG序列分析程序套装(Genetics Computer Group,Madison,WI 53711)。
样品制备。可以用本发明方法检测和定量目标核酸的样本可以根据本领域技术人员已知的方法从对象获得。样本可以取自身体组织和体液例如血液(包括全血、血清和血浆)、尿液、脑脊液(CSF)、滑液、胸膜液、心包液、眼内液、活检组织(tissue biopsy)或气管内吸出物、唾液、粪便、用拭子从例如皮肤、腹股沟、鼻和/或喉取下的样品。本领域技术人员熟知获得测试样品和参照样品的方法,包括但不限于吸出、组织切片、抽取血液或其它液体、外科或穿刺活检、收集石蜡包埋的组织、收集体液、收集粪便等。在一个实施方式中,测试样品可以从被怀疑患有疾病或基因异常的个体收集。在一些实施方式中,样本是来自患有或被怀疑患有疾病或基因异常的对象的组织样品(活检样品)。
核酸(DNA和/或RNA)可以根据本领域技术人员熟知的任何方法从样品中分离。如果需要,可以通过离心等收集或浓缩样品。样品的细胞可以进行裂解,例如通过用酶、热表面活性剂、超声或其组合处理进行。进行裂解处理是为了获得足够量的源自感兴趣细胞的RNA——如果存在于样品中,以使用RT-PCR进行检测。核酸不需要提取,但可以通过细胞或组织的适当处理而获得,如美国专利公开号2008/131876中所述。
在一个实施方式中,可以使用mRNA或者从mRNA或总RNA产生的cDNA。多种RNA提取方法适于分离RNA。适当的方法包括酚和氯仿提取。参见Maniatis等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d,Cold Spring Harbor Laboratory Press,page 16.54(1989)。此外,用于分离mRNA和合成cDNA的试剂盒可以商业购得,例如来自Qiagen的RNeasy Protect Mini试剂盒、RNeasy Protect Cell Mini试剂盒。
在一个实施方式中,使用双RNA/DNA分离方法,其采用基于trizol的试剂从患者样品初步分离RNA和DNA。一旦与患者样品接触,trizol中的酚和高盐试剂有效地灭活患者样品中可能存在的任何病原体(disease agent)或次级病原体。在从患者样品中分离出RNA和DNA后,可以使用硅基柱(silica based column)进一步分离RNA和DNA。硅基柱的使用允许快速高效地进行洗涤步骤,同时最小化污染的可能性。可以使用洗涤步骤除去PCR和RT-PCR抑制剂。由于可以与不同类型的患者样品使用并且旋转(spin)和洗涤步骤有效地除去PCR或RT-PCR抑制剂,核酸的柱纯化方法是有优势的。
核酸的扩增。核酸样品或目标核酸可以通过本领域技术人员已知的多种方法进行扩增。在适当的实施方式中,使用PCR扩增感兴趣核酸。简而言之,在PCR中,制备与标记序列相反互补链(opposite complementary strands)上的区域互补的两条引物序列。向反应混合物中加入过量的三磷酸脱氧核糖核苷以及DNA聚合酶例如Taq聚合酶。
在一个实施方式中,在多重扩增反应中扩增目标核酸。本领域已知多种多重扩增策略,并且可以与本发明的方法一起使用。根据病原体中所含的核酸类型,多重扩增策略可以使用PCR、RT-PCR或其组合。例如,如果存在RNA基因组,可以使用RT-PCR。PCR酶可以是具有逆转录和聚合酶功能的酶。此外,PCR酶可以有能力进行本领域已知的“热启动”反应。
如果样品中存在目标序列,引物将与该序列结合,并且聚合酶通过添加在核苷酸上而使引物沿着目标序列延伸。通过升高和降低反应混合物的温度,延伸的引物将从目标核酸上解离形成反应产物,过量的引物将与目标核酸和反应产物结合,并且重复该过程,从而产生扩增产物。循环参数可以根据要延伸的扩增产物的长度而变化。样品中可以包括利用寡核苷酸引物和/或探针的内部阳性扩增对照(IC)。
扩增核酸的检测。核酸的扩增可以通过本领域熟知的多种方法中任何一种检测,例如凝胶电泳、柱层析、探针杂交、测序、解链曲线分析或“实时”检测。
在一种方法中,来自两个或更多感兴趣片段的序列在同一反应容器中进行扩增(即“多重PCR”)。可以通过测量反应的终点或“实时”测量来进行检测。对于实时检测,引物和/或探针可以可检测地被标记,以允许例如引物被结合时或探针杂交时荧光的差异,并且在能监测反应过程中荧光变化的装置中进行扩增。核酸扩增的实时检测方法是周知的,包括例如系统、ScorpionTM双功能分子以及使用双链核酸的嵌入染料。
在终点检测中,可以通过首先按大小分离(size-separating)扩增子,然后检测按大小分离的扩增子,来检测扩增子。不同大小的扩增子的分离可以用例如凝胶电泳、柱层析或毛细管电泳完成。本领域熟知这些和其他分离方法。在一个实例中,大小差10个或更多个碱基对的约10个至约150个碱基对的扩增子可以例如在4%至5%琼脂糖凝胶(对于约150个至约300个碱基对的扩增子,为2%至3%琼脂糖凝胶)或6%至10%聚丙烯酰胺凝胶上分离。分离的核酸随后用染料例如溴化乙锭染色,并且所得染色带的大小可以与标准DNA梯状条带进行比较。
在另一个实施方式中,两个或更多感兴趣片段在单独的反应容器中进行扩增。如果扩增是特异性的,即一个引物对扩增一个感兴趣片段而不是其它的,则扩增的检测足以区分两种类型——将不需要大小分离。
在一些实施方式中,通过用特异性探针杂交来检测扩增的核酸。可以使用与扩增目标序列的一部分互补的探针寡核苷酸检测扩增的片段。杂交可以实时或非实时检测。每个目标序列的扩增核酸可以被同时(即在同一反应容器中)或单独(即在单独的反应容器中)检测。在一些实施方式中,使用两个或更多可区别标记的基因特异性寡核苷酸探针同时检测扩增的DNA,其中一个与第一目标序列杂交,以及其中一个与第二目标序列杂交。
可以用本领域已知的方法可检测地标记探针。有用的标记包括例如荧光染料(例如FITC、罗丹明、镧系磷光体(lanthamide phosphor)、德克萨斯红、FAM、JOE、Ca1Fluor RedQuasar)、32P、35S、3H、14C、125I、131I、电子致密试剂(例如金)、酶例如常用于ELISA的的酶(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、比色标记(例如胶体金)、磁性标记(例如DynabeadsTM)、生物素、地高辛配基(dioxigenin)或半抗原和可获得抗血清或单克隆抗体的蛋白。其他标记包括能分别与相应受体或寡核苷酸互补体(oligonucleotide complement)形成复合物的配体或寡核苷酸。标记可以直接参入要检测的核酸中,或其可以连接到与要检测核酸杂交或结合的探针(例如寡核苷酸)上。
实时PCR的一个常用方法使用荧光探针例如探针、分子信标和ScorpionsTM。实时PCR以比其他形式的检测最终扩增产品量的定量PCR更高的特异性、灵敏性和重复性对模板的初始量进行定量。实时PCR不检测扩增子的大小。ScorpionTM和技术中使用的探针基于荧光猝灭的原理,并且包括供体荧光团和猝灭部分。
在一个实施方式中,可检测标记是荧光团。本文所用的术语“荧光团”指吸收特定波长的光(激发频率)然后发射较长波长的光(发射频率)的分子。本文所用的术语“供体荧光团”指紧邻猝灭剂部分时将发射能量供给或转移给猝灭剂的荧光团。由于能量转供给猝灭剂,供体荧光团本身会以在没有紧密放置的猝灭剂部分时发射的特定发射频率发射较少的光。
本文所用的术语“猝灭剂部分”指这样的分子:其紧邻供体荧光团,吸收由供体产生的发射能量,并以热的形式将能量耗散或发射波长比供体发射波长更长的光。在后一种情况下,猝灭剂被认为是受体荧光团。猝灭部分可以通过接近(即碰撞)猝灭或通过荧光共振能量转移(“FRET”)起作用。FRET猝灭一般用在探针中,而接近猝灭用在分子信标和ScorpionTM型探针中。
在接近猝灭(又称为“接触”或“碰撞”猝灭)中,供体紧邻猝灭剂部分,使得供体的能量被转移到猝灭剂,猝灭剂以热的形式耗散该能量而不进行荧光发射。在FRET猝灭中,供体荧光团将其能量转移到猝灭剂,猝灭剂以更高波长将该能量作为荧光释放。接近猝灭需要供体和猝灭剂部分的位置非常近,而FRET猝灭也与距离相关,其发生在较大的距离上(通常1-10nm,能量传递取决于R-6,其中R是供体和受体之间的距离)。因此,当涉及FRET猝灭时,猝灭部分是受体荧光团,具有与供体发射频谱重叠的激发频谱。当使用FRET猝灭时,分析可以检测由于供体与猝灭剂(受体荧光团)之间距离增加而引起的供体荧光团荧光的增加,或者由于供体与猝灭剂(受体荧光团)之间距离减小而引起的受体荧光团发射的减小。
适当的荧光部分包括以下本领域已知的荧光团:4-乙酰氨基-4’-异硫氰酸芪-2,2′-二磺酸、吖啶及其衍生物(吖啶、吖啶异硫氰酸酯)、Alexa350、Alexa488、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa647(分子探针(Molecular Probes))、5-(2-氨乙基)氨基萘1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-(乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5-二磺酸酯(LuciferYellow VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺、Black HoleQuencher(BHQTM)染料(Biosearch Technologies)、R-6G、530/550、FL、亮黄、香豆素及衍生物(香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC,香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(trifluoromethylcouluarin)(香豆素151))、四氯四溴荧光素(cyanosine)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、5’,5”-二溴邻苯三酚磺酞(溴邻苯三酚红)、7-二乙基氨基-3-(4’-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetate)、4,4’-二异硫氰酸二氢-芪-2,2’-二磺酸、4,4’-二异硫氰酸芪-2,2′-二磺酸、5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS,丹磺酰氯)、4-(4’-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4’-异硫氰酸酯(DABITC)、Eclipse(Epoch Biosciences Inc.)、伊红及衍生物(伊红、伊红异硫氰酸酯)、赤藓红及其衍生物(赤藓红B、赤藓红异硫氰酸酯)、乙锭、荧光素及衍生物(5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、QFITC(XRITC)、四氯荧光素(TET))、荧光胺、IR 144、IR 1446、孔雀石绿异硫氰酸酯、4-甲基伞形酮、邻甲酚酞、硝基酪氨酸、碱性副品红、酚红、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、邻苯二甲醛、Oregon碘化丙啶、芘及衍生物(芘、丁酸芘、琥珀酰亚胺基1-丁酸芘)、7、9、21、35(Molecular Probes)、活性红4(Brilliant Red 3B-A)、罗丹明及衍生物(6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明绿、罗丹明X异硫氰酸酯、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红))、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、CAL FluorRed 610、Quasar 670、核黄素、玫红酸、铽螯合物衍生物。
可以使用其他荧光核苷酸类似物,参见例如Jameson,278Meth.Enzymol,363-390(1997);Zhu,22Nucl.Acids Res.,3418-3422(1994)。美国专利号5,652,099和6,268,132也描述了核苷酸类似物,其通过酶或化学合成而参入核酸例如DNA和/或RNA或寡核苷酸中,以产生荧光寡核苷酸。美国专利号5,135,717描述了用作荧光标记的酞菁染料和四苯三氮杂卟啉试剂(tetrabenztriazaporphyrin)。
可检测标记可以参入核酸中、与核酸连接或结合到核酸上。可以用多种长度的间隔臂连接标记,以减少潜在的立体位阻或对其他有用或期望性质的影响。参见例如Mansfield,Mol.Cell.Probes,9:145-156(1995)。可检测标记可以通过共价或非共价手段,例如通过转录,如通过使用Klenow聚合酶进行随机引物标记,或切口平移,或扩增,或本领域已知的等价方法而参入核酸中。例如,核苷酸碱基结合到可检测部分例如荧光染料上,然后在核酸合成或扩增过程中参入核酸中。
用ScorpionTM探针,使用单个分子实现序列特异性引导和PCR产物检测。ScorpionTM探针在未杂交状态下保持茎-环构型。荧光团连接到5’末端,并且通过与3’末端偶联的部分而猝灭。茎的3’部分也含有与引物的延伸产物互补的序列。该序列通过不可扩增单体与特异性引物的5’末端连接。在ScorpionTM引物延伸后,特异性探针序列能在延伸的扩增子内与其互补体结合,从而打开发夹环。这阻止荧光团的猝灭,并且观察到信号。通过反向引物和ScorpionTM的引物部分扩增特异性目标,产生延伸产物。由于ScorpionTM的探针元件与延伸产物结合,导致荧光团与猝灭剂分离,产生荧光信号。探针(Heid等,Genome Res,6:986-994,1996)使用Taq聚合酶的荧光5’外切核酸酶活性测量cDNA样品中目标序列的量。探针是包含通常位于5’碱基处或其附近的供体荧光团和通常位于3’碱基处或其附近的猝灭部分的寡核苷酸。猝灭剂部分可以是染料例如TAMRA或可以是非荧光分子例如4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)。参见Tyagi等,Nature Biotechnology,16:49-53(1998)。在被照射时,激发的荧光供体通过FRET而不是发出荧光将能量转移到邻近的猝灭部分。因此,供体与猝灭剂的紧邻阻止供体荧光的发射,同时探针是完整的。
探针被设计为退火(anneal)到PCR产物的内部区域。当聚合酶(例如逆转录酶)复制结合了探针的模板时,其5’外切核酸酶活性切割所述探针。这终止了猝灭剂的活性(没有FRET),并且供体荧光团开始发射荧光,所述荧光在与探针切割速率成比例的每个循环中增加。PCR产物的累积通过监测报告染料荧光的增加进行检测(注意:引物没有被标记)。如果猝灭剂是受体荧光团,则PCR产物的累积可以通过监测受体荧光团荧光的减少进行检测。
在适当的实施方式中,使用能检测一个或多个荧光标记的荧光的任何适当装置进行实时PCR。例如,该装置(例如ABI7900HT序列检测仪)上的实时检测在每个PCR循环期间监测荧光并计算报告信号的测量,或Rn值。阈值循环,或Ct值是荧光与阈值交叉的循环。阈值通过序列检测系统软件或人工测定。Ct值可以与反应中初始模板核酸的量相关。
在一些实施方式中,可以使用解链曲线分析检测扩增产物。解链曲线分析包括通过将扩增子暴露于温度梯度来测定核酸扩增子的解链温度以及观察荧光团的可检测信号。解链曲线分析基于以下事实:核酸序列在称为解链温度(Tm)的特征温度下解链,所述解链温度被定义为一半DNA双链体已分离为单链的温度。DNA的解链温度主要取决于其核苷酸组成。因此,富含G和C核苷酸的DNA分子的Tm比具有富含A和T核苷酸的DNA分子高。
当在所述方法中使用荧光染料测定核酸的解链温度时,荧光染料可以发射信号,所述信号可以与用于标记寡核苷酸的任何其他不同的荧光染料发射的信号区别开。在一些实施方式中,用于测定核酸解链温度的荧光染料可以由与用于标记寡核苷酸的任何其他不同的荧光染料所不同的波长能量进行激发。在一些实施方式中,用于测定检测的核酸解链温度的第二荧光染料是嵌入剂。适当的嵌入剂可以包括但不限于SYBRTM Green 1染料、SYBRTM染料、Pico Green、SYTO染料、SYTOX染料、溴化乙锭、乙锭同型二聚体-1、乙锭同型二聚体-2、乙锭衍生物、吖啶、吖啶橙、吖啶衍生物、乙锭-吖啶异二聚体、单叠氮乙锭、碘化丙锭、花菁单体、7-氨基放线菌素D、YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、花菁二聚体、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1、JO-PRO-1及其混合物。在适当的实施方式中,选择的嵌入剂是SYBRTMGreen 1染料。
通过检测失去荧光信号时的温度,可以测定解链温度。在公开的方法中,每个扩增的目标核酸可以具有不同的解链温度。例如,每个扩增的目标核酸可以具有与任何其他扩增的目标核酸差至少约1℃,更优选至少约2℃或甚至更优选至少约4℃的解链温度。
诊断方法。在一方面,本文所述的方法提供诊断对象中前列腺癌或癌症易感性。本文所用的术语“诊断(diagnose)”或“诊断(diagnosis)”指通过评估疾病或病症的征兆和症状,识别或确定生物体疾病或状况,或者疾病或状况的原因的行为或过程。通常,疾病或病症的诊断基于对指示该疾病的一个或多个因素和/或症状的评估。即,可以基于指示疾病或状况存在与否的因素存在与否或其量,进行诊断。每个被认为指示特定疾病诊断的因素或症状不需要排他地与该特定疾病相关,即可以从诊断因素或症状推断出不同诊断。同样也存在在没有特定疾病的个体中有指示该特定疾病的因素或症状的情况。该方法包括但不限于前列腺和肺癌,以及与这些癌症相关的易位、插入、倒位和缺失。
在一个实施方式中,将对象样品中TMPRSS2基因5’区域与TMPRSS2基因3’区域的表达水平进行对比,其中TMPRSS2基因5’区域与TMPRSS2基因3’区域表达水平的差异指示,对象中的前列腺癌或前列腺癌易感性。
预后方法。在一方面,本文所述的方法提供癌症或对象中的预后。本文所用的术语“预后”指临床状况或疾病的可能病程和结果的预测。患者的预后通常通过评估指示疾病有利或不利病程或结果的该疾病的因素或症状作出。术语预后不是指以100%的准确率预测状况的病程或结果的能力。相反,本领域技术人员将理解,术语“预后”指将发生某种病程或结果的增加的可能性;即,与没有表现出给定状况的个体相比时,表现出该状况的患者更有可能发生病程或结果。预后可以表示为患者能够预期存活的时间量。可选地,预后可以指疾病减轻的可能性或疾病预期保持减轻的时间量。预后可以以多种方式表示;例如,预后可以表示为一年、五年、十年等之后患者存活的机会百分比。可选地,预后可以表示为由于状况或疾病患者可以预期存活的平均年数。患者的预后可以被认为是相对的表示,其中许多因素影响最终的结果。例如,对于患有某些状况的患者,预后可以适当地表示为状况可以治疗或治愈的可能性,或疾病将减轻的可能性,而对于患有更严重状况的患者,预后可以适当地表示为特定时间段内存活的可能性。该方法包括但不限于前列腺和肺癌。
预后通常通过检查一个或多个预后因素或指征确定。这些因素或指征是标记,例如特定染色体易位的存在,患者(或患者样品)中这些标记的存在或量标志着给定病程或结果将发生的可能性。本领域技术人员理解,将预后指征与不利结果的诱因关联可能涉及统计学分析。
在一个实施方式中,将对象样品中TMPRSS2基因5’区域的表达水平与TMPRSS2基因3’区域的表达水平进行对比,其中TMPRSS2基因5’区域与TMPRSS2基因3’区域表达水平的差异指示,对象中前列腺癌的阶段、严重程度或结果。Nam等,Br J.Cancer,97:16390-1695,2007检查了165位在1998至2006年间进行了临床局部前列腺癌手术的患者的前列腺癌样本。他们测试了TMPRSS2:ERG基因融合产物的存在并进行了存活分析,以确定TMPRSS2:ERG融合基因的存在对前列腺癌复发风险的预后影响,从而对确立的预后因素进行调整。具有融合蛋白的患者子组具有比没有融合蛋白的患者(8.1%,P<0.0001)显著高的复发风险(5年时58.4%)。在用手术治疗的前列腺癌患者中,TMPRSS2:ERG融合基因的表达是强预后因素,并且与级别、阶段和PSA水平无关。因此,本方法在提供前列腺癌复发的预后中是有用的。
实施例1
以下的实施例说明了进行RT-PCR和实时分析的标准方案。TaqMan探针标记系统是实时检测PCR扩增子的示例性方法。以下实施例起说明本发明的作用,而决不意欲限制本发明的范围。
为检测涉及TMPRSS2的易位或融合——在前列腺癌患者的遗传样品中通常发现与ETS转录物融合——的存在,采取了如下方法:所述方法鉴定TMPRSS25’和3’部分的断裂,以及3’部分随后向不如与TMPRSS2通常相关的调控元件强的调控元件控制下的区域易位。ETS(E-26)是转录因子家族,包括例如ERG和ETS易位变体(ETV),ETV包括例如ETV1、ETV4和ETV5。TMPRSS2:ERG和TMPRSS2:ETV易位通常导致融合转录物的表达,所述融合转录物至少包含融合到ERG和ETV编码区的TMPRSS2的5’非翻译区。考虑到这一点,设计了实时RT-PCR分析,以分别分析TMPRSS2的5’和3’区域的表达水平(图1)。不包含涉及TMPRSS2的易位的样品表现出5’和3’区域之间相同的表达图式,因为它们相连并受相同的调控元件(例如,5’非翻译区中包含的调控元件)控制(图1,图A)。而包含TMPRSS2易位的样品显示出5’和3’区域的独立表达图式,与易位伙伴无关,因为这两个区域现在不再连接,并受不同调控元件控制(图1,图B)。在ERG和ETV易位的情况下,部分在前列腺中通常高水平表达的3’TMPRSS2具有远低于在未易位样品中的表达水平,因为它已经与ERG或ETV编码区和调控序列融合,所述调控序列在前列腺中通常赋予相对于TMPRSS2表达低的ERG或ETV表达水平。此检测系统的一个优势是TMPRSS2的易位伙伴不需要被预先鉴定和单独评价。
在包含TMPRSS2易位的样品中和没有易位的样品中预期发现的不同3’-TMPRSS2表达水平可以通过将3’TMPRSS2表达水平归一化成5’TMPRSS2表达水平而确立。在此研究中,根据以下公式计算TMPRSS2IDE分数:
IDE分数=2-(Ct 3’-目标基因 )-(Ct 5’-目标基因 )
其中,Ct值通过RT-PCR获得。
图2显示了通过TMPRSS2:ERG融合状态分组的25个福尔马林固定且石蜡包埋(FFPE)的组织样品的点图。例如,使用80的IDE分界值,至少84%的肿瘤样本(21/25)通过本发明的分析被精确地鉴定为融合阴性或阳性。由于患有前列腺癌的个体带有TMPRSS2:ETS融合的比例很大,所述的分析将成为诊断大部分前列腺癌病例而不考虑涉及的TMPRSS2融合类型的有益工具。
实施例2
RNA提取:通过柱纯化(高纯度miRNA分离试剂盒,Roche)提取来自福尔马林固定且石蜡包埋(FFPE)的组织的RNA,然后是DNase I消化(Invitrogen)。血浆RNA如下提取:研究1:通过(Biomerieux)提取来自每个供体的1mL血浆,然后DNase I消化(Invitrogen)。在研究2中进一步如下优化血浆提取:通过(Biomerieux)提取来自每个供体的2mL血浆,然后DNase I消化(Invitrogen)以及利用RNeasy小试剂盒(Qiagen)进行RNA浓缩。
实时RT-PCR:设计TaqMan引物和探针组,以独立地扩增每个基因(如图1所示的TMPRSS2模型)的5’和3’区域。在单独的反应中,通过实时RT-PCR(RNAUltrasense,Invitrogen;ABI 7900Sequence Detector,Applied Biosystems)扩增5’和3’转录区域和内源对照。
基因内差异表达(IDE)曲线计算
研究1:首先在来自20名患者(9名前列腺癌(“PCa”)患者,11名良性前列腺增生(“BPH”))的FFPE组织和来自42名患者(32名PCa和10名BPH)的血浆中分析TMPRSS2。IDE被表示为3’∶5’转录物水平的比率,所述转录物水平通过实时RT-PCR测定。通过比较来自FFPE组织的非恶性细胞与肿瘤细胞确立正常的3’∶5’比率(≥30)。然后使用该分界值鉴定血浆样本中的异常比率。
研究2:在第二个研究中进一步优化检测方法、定量方法和IDE计算。使用范围从1至150ng PC-3RNA(Ambion)的8点标准曲线从Ct值推算转录物量。使用通过标准曲线测定的转录区域量计算同一转录物的5’和3’水平差异的绝对值,并归一化成内源对照(ABL)(计算:IDE=(5’/ABL-3’/ABL)-b;其中b代表基因特异性归一化值)。通过分析来自正常前列腺RNA和已知TMPRSS2:ERG融合阳性样本的结果,测定正常范围。
FFPE组织中的TMPRSS2IDE:对来自前列腺癌或BPH患者的20个FFPE组织样本和42个血浆样本的最初研究利用简单的3’∶5’比率分界值确定TMPRSS2基因内差异表达与所分析的两个区域的相互(mutual)表达(表1)。在FFPE组织中,用小于30的3’∶5’比率分界值,于100%(9/9)前列腺癌样本中和9%(1/11)BPH样本中观察到TMPRSS2IDE。在血浆中,早期研究获得了20个通过QC标准的具有RNA的样品。在这20个样品中,于47%(7/15)PCa样品中观测到TMPRSS2IDE,60%(9/15)PCa对于TMPRSS2的5’、3’或两个区域呈阳性,20%(1/15)BPH样本对于TMPRSS2的1个区域呈阳性。
表1.BPH和PCa样本中TMPRSS2的初始IDE测定
UD,未检测到(只有3’或没有5’或3’)
对整个分析的优化提供了更好的IDE定量手段,并且初始研究被重复和扩展。使用改进的分析,首先在正常前列腺和证实TMPRSS2:ERG阳性的前列腺癌细胞系(VCaP,ATCC)中评价TMPRSS2IDE(图3)。如所预期的,正常前列腺TMPRSS2和ERG没有显示非常低的IDE分数,而VCaP细胞显示高阳性TMPRSS2分数(意指5’>3’)和高阴性ERG分数(意指3’>5’)的预期图式(pattern)。为便于分析,以后的IDE分数以绝对值表示。
从52个FFPE组织样品(32个PCa、14个BPH、6个最初诊断为BPH但根据进一步检查确定是非典型的或患有PIN)中纯化RNA并通过直接融合检测(TMPRSS2外显子1:ERG外显子4)和TMPRSS2IDE分析TMPRSS2:ERG融合。PCa中TMPRSS2IDE分数(平均值=1.6,SE=0.5)明显高于BPH(平均值=0.28,SE=0.06)(图4)。同样地,PCa中ERG IDE分数也明显高于BPH(图5)。直接TMPRSS2:ERG融合检测显示56%(18/32)的阳性PCa样本,没有显示阳性BPH(14)或非典型/PIN(6)样本(表2)。用0.25的分界值(IDE>0.25),在84%PCa(26/31)、67%非典型/PIN(4/6)和36%BPH(5/14)中观察到TMPRSS2IDE(表2)。
表2.通过在FFPE组织中检测TMPRSS2重排
血浆中TMPRSS2检测:也分析了血浆样本中TMPRSS2:ERG的存在以及TMPRSS2的5’UTR和3’编码区域。从总共67个样本(42个PCa和17个BPH)的1mL(研究1)或2mL(研究2)血浆中提取RNA。来自充分扩增内源对照的样品的结果显示在表3中。显然,研究2得到了与研究1中44%PCa和17%BPH相比较高的TMPRSS2的5’UTR或3’编码区域检测比率,其中78%(7/9)阳性PCa和0%BPH(0/3)。然而,最值得注意的是,分析TMPRSS2的5’UTR和3’编码区二者的表达与单独检测5’UTR或3’编码区相比增加阳性样本数量约10-15%,并且证明了相对于检测TMPRSS2:ERG融合——其中只发现了1个阳性PCa样本——显著的改进。总之,在44-78%PCa和0-17%BPH样本的血浆中检测到了TMPRSS2。
表3.血浆中TMPRSS2:ERG融合以及5’和3’TMPRSS2的检测
FFPE组织中的ERG和ETV1IDE:TMPRSS2IDE策略被扩展到ETS转录因子。具体地,ERG显示出在PCa样本(平均值=14.6,SE=5.5)中与在BPH(平均值=0.27,SE=0.03)中相比显著的差异(图5)。使用0.4的分界值(IDE>0.4),在97%PCa(29/30)、0%非典型/PIN(0/5)和7%BPH(1/14)中观测到ERG IDE(表4)。ETV1IDE(IDE分数>0.08)在PCa中较少见,其中在30%(9/30)的样本中发现它,但也在14%BPH(2/14)和20%非典型/PIN(1/5)中观测到它。所有前列腺癌样本对至少一种测试的标记呈阳性,80%对至少两种标记呈阳性,以及24%对全部三种呈阳性(表5)。没有BPH样本对一种以上的标记呈阳性。
表4:FFPE组织中ERG和ETV1IDE的检测
表5:FFPE组织中单个或多个IDE分数的频率
表6:用于IDE分析的扩增引物和探针
结论
与正常前列腺和BPH相比,在前列腺癌样本中TMPRSS2和ERG的基因内差异表达(IDE)显著高于。通过建立正常与异常IDE分数的分界值,发明人能检测来自77%前列腺癌样品而存在于29%BPH样品中的FFPE组织中的TMPRSS2差异。使用ERG实现了甚至更高的灵敏性和特异性,其中升高的IDE分数在97%前列腺癌样品和仅1个(7%)BPH样本中检测到。高百分比的PCa样本具有升高的ERG IDE分数可能归因于TMPRSS2的易位以及其他还待鉴定的5’融合伙伴,例如最近被发现参与ETV1和ETV5基因融合的那些,包括来自SLC45A3、HERV-K_22ql 1.3、Cl5ORF21和HNRPA2B 1的5’UTR(Helgeson等2008and Tomlins2007)。
在一些样品中,TMPRSS2和ETV1的IDE显示了意想不到的图式。不变地,ERG IDE倾向于以比5’水平高的水平存在的3’转录物区域,这与从下列理解所预期的一样:TMPRSS2易位(以及其他5’易位伙伴)的结果是伙伴ETS转录因子水平的增加。可选地,TMPRSS2和ETV1似乎表现得更复杂,因为不仅观察到了预期的IDE倾向,而且也在许多样品中观察到了相反的倾向,这意味着ETV1的5’区域和TMPRSS2的3’区域处于比其各自对应部分(counterpart)高的水平。该差异可能解释这样的观察:即在直接分析融合物时很少发现TMPRSS2:ETV1易位。由于这些变化,IDE值表示为绝对值以说明两种倾向的差异。值得注意的是,所有ETV1IDE阳性的BPH和非典型/PIN样本显示了相反倾向,而在前列腺癌样品中观测到了两个倾向。此外,超过四分之一的前列腺癌样品显示了ETV1和ERG两者的IDE。这可能是由于单个样本中多个焦点(focal point)或多个克隆(clonalities)的存在。然而很显然,ERG IDE主要在证实的前列腺癌中观测到和仅在一个BPH样本中观测到。
这些血浆样品研究(上述的研究1和研究2)证明,当两个区域都被评价时可以在44%(研究1)和78%(研究2)的前列腺癌患者样本中检测到5’或3’TMPRSS2,与之相比,当只分析TMPRSS2的一个区域时是30-37%(研究1)和67%(研究2)。通过分析TMPRSS2的两个区域以及通过改进提取和检测方法,发明人能增加检测到TMPRSS2的血浆样本数量。TMPRSS2只在来自研究1的一个BPH样本中检测到,研究2中的BPH样本未检测到。正常和BPH尿液样本中的TMPRSS2的5’UTR和3’编码区已被成功扩增,用于使用此IDE方法进行评价。
实施例3
在约5%的肺癌患者的NSCLC中发现了具有转化活性、棘皮动物微管相关蛋白类似蛋白4-间变性淋巴瘤激酶的融合基因(EML4-ALK)。EML4-ALK融合的存在可以预测这些患者对某些治疗的响应。发明人应用IDE方法测试使用IDE鉴定具有潜在ALK易位而不限于已知变体或融合伙伴的患者的能力。使用IDE方法,通过测定ALK IDE分界值,然后比较计算的分界值与来自肺癌组织样品的ALKIDE值,来分析患者肺癌组织样品。通过使用RT-PCR直接检测EML4-ALK融合,进一步分析阳性结果。最后,通过免疫组化(IHC)和/或荧光原位杂交(FISH)筛选NSCLC阳性样品的子集(subset)。
ALKIDE分界值测定:在来自56个NSCLC患者的肺癌组织样品中分析ALKIDE。ALD IDE分数表示为由实时RT-PCR测定的3’∶5’转录物水平的比率。ALK IDE分数如下计算:首先使用RT-PCR测定5’和3’ALK转录物水平,其次使用内源对照(ABL)的转录物水平对那些ALK转录物水平进行归一化(IDE=5’-ALK/ABL-3’-ALK/ABL)。使用EML4:ALK融合-阳性细胞系(NCI-H2228),建立0.7的阳性对照ALK IDE 3’∶5’比率分数。该0.7的ALK IDE分界值随后用于鉴定组织样本中的异常比率,表明ALK重排的存在。此方法的进一步验证证实,在两个EML4-ALK阴性NSCLC细胞系(NCI-H838和NCI-H1299)中ALK IDE值是0.0。
表7:用于IDE分析的ALK扩增引物和探针
肺癌组织中的ALK IDE:使用>0.7的ALK IDE 3’∶5’比率分界值,在EML4-ALK融合-阳性细胞系中,于11%(6/56)的肺癌组织样本中观测到了诊断上阳性的ALKIDE。发明人使用自行设计的RT-PCR引物组通过片段分析对这六个阳性样品进行了EML4-ALK融合的直接检测的测试(图6)。在六个样品中,于83%(5/6)中的样品中观测到了EML4-ALK融合。
免疫组化(IHC)和/或荧光原位杂交(FISH):通过IHC和/或FISH筛选NSCLC阳性样品的子集(子集结果如图7所示)。通过FISH进一步分析五个证实的ALKIDE阳性样品和另外五个具有轻微至中度ALK转录物水平升高(即ALK IDE>0.1)的样品。在十个样品中有八个显示了ALK重排和/或ALK基因扩增。通过FISH解释为具有ALK重排的三个样品使用ALK IDE也是阳性的。其余两个ALK IDE阳性样品(一个通过直接RT-PCR证实,一个未通过直接RT-PCR证实)通过FISH解释为重排阴性。
结论
将IDE方法应用于ALK对于鉴定ALK表达和染色体重排是有用的。ALK IDE精确地将全部FISH证实的重排分类为阳性,并且在至少一个其他证实的病案中检测到FISH没有鉴定到的重排。IDE方法起通用分子分析的作用,用于在多个肿瘤类型中测定ALK重排。此信息可进一步被医师用于决定适于患者的治疗。
其他实施方式
因此,应当理解,尽管本发明通过优选实施方式和任选特征进行了具体公开,但本领域技术人员可以进行本文公开的包含在其中的本发明的修改、改进和变形,并且这些修改、改进和变形被认为在本发明的范围内。提供的材料、方法和实施例代表了优选实施方式,是示例性的,意图不是对本发明范围的限制。
本文广泛且总体地描述了本发明。每个落入总体公开内的较窄种类和次总集合也形成本发明的部分。这包括用限制条件或否定限制除去该类中任何主题的对本发明的总体描述,无论除去的材料是否在本文中有具体叙述。
此外,在本发明的特征或方面以马库什组的形式描述的情况下,本领域技术人员将认识到,本发明也因此以马库什组成员中的任何单个成员或亚组的形式得以描述。
本文提及的所有公开、专利申请、专利和其他引文以其全部并入本文作为参考,达到与如同每个分别并入作为参考的相同程度。在冲突的情况下,以本说明书包括定义为准。
本文说明性地描述的发明可以适当地在缺乏本文没具体公开的任何要素、限制的情况下实施。因此,例如,术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被可扩展地理解而没有限制。此外,本文使用的术语和表达被用作描述性的术语,没有限制作用,并且不意欲使用这些术语和表达排除任何所示和所述特征或其部分的等价物,但应当认识到,在本发明请求保护的范围内多种修改是可能的。
其他实施方式阐述在权利要求书中。
Claims (45)
1.用于检测目标基因中失调的方法,包括:
(a)用与所述目标基因5’区域互补的一个或多个5’目标引物对扩增核酸样品中所述目标基因转录物的5’区域,如果存在;
(b)用与所述目标基因3’区域互补的一个或多个3’目标引物对扩增生物样品中所述目标基因转录物的3’区域,如果存在;
(c)检测所述一个或多个5’目标引物对和所述一个或多个3’目标引物对产生的扩增产物的量;和
(d)比较所述核酸样品中所述目标基因的所述5’区域相对所述3’区域的相对表达和参照样品中所述目标基因的所述5’区域相对所述3’区域的相对表达;和
(e)当步骤(a)和(b)产生的扩增产物的量表明所述目标基因失调时,鉴定所述核酸样品具有基因失调。
2.权利要求1所述的方法,其中所述目标基因选自TMPRSS2、ERG、ETV1、SLC45A3、HERV-K_22q11.3、C15ORF21、HNRPA2B1、ETV4、ETV5、ALK、EML4、EUS、RANBP2、PAX、BUS、COL1A1 CLTC、KIF5B FKHR、PDGFB、FEV、DDIT3、ATF1、CREA、SP3、NR4A3、WT1、SYT、SSX1、SSX2、SSX4、BCR、ABL、BCL2、RARA、NPM和ATIC。
3.权利要求1-2任一项所述的方法,其中所述目标基因是选自TMPRSS2、ERG、ETV1、ALK和EML4的一个或多个目标基因。
4.权利要求1-3任一项所述的方法,其中所述生物样品在多重扩增反应中与所述一个或多个5’目标引物对和所述一个或多个3’目标引物接触。
5.权利要求1-4任一项所述的方法,其中所述检测是使用与每个扩增产物互补的标记寡核苷酸探针完成的。
6.权利要求5所述的方法,其中每个寡核苷酸探针包含不同的可检测标记。
7.权利要求1-6任一项所述的方法,其中所述一个或多个5’目标引物对中至少一个引物包含第一可检测标记,并且所述一个或多个3’目标引物对中至少一个引物包含第二可检测标记。
8.权利要求1-7任一项所述的方法,其中所述扩增是使用定量RT-PCR进行的。
9.权利要求1-8任一项所述的方法,其中步骤(a)和(b)产生的扩增产物的所述量均被归一化成内源对照基因转录物的量。
10.权利要求9所述的方法,还包括用与所述内源对照基因互补的引物对扩增所述生物样品中存在的所述内源对照基因转录物的区域,以及检测所述内源对照基因所述区域的扩增。
11.权利要求10所述的方法,其中所述内源对照基因是ABL。
12.权利要求1-12任一项所述的方法,其中所述生物样品是从人对象获得的。
13.权利要求12所述的方法,其中所述生物样品选自全血、分离的血细胞、血浆、血清和尿液。
14.权利要求1-13任一项所述的方法,其中所述方法还包括:
(f)测量所述核酸样品中第二目标基因5’区域转录量和所述第二目标基因3’区域转录的量;
(g)比较所述核酸样品中所述第二目标基因5’区域相对3’区域的相对表达与参照样品中所述第二目标基因5’区域相对3’区域的相对表达;和
(h)当与所述参照样品相比测试样品中所述目标基因和所述第二目标基因的相对表达差异表明存在目标基因:第二目标基因易位时,鉴定所述核酸样品具有染色体异常。
15.权利要求14所述的方法,其中所述目标基因是TMPRSS,以及所述第二目标基因是ERG。
16.权利要求14所述的方法,其中所述目标基因是TMPRSS,以及所述第二目标基因是ETV1。
17.权利要求14所述的方法,其中所述目标基因是ALK,以及所述第二目标基因是EML4。
18.权利要求1-17任一项所述的方法,包括测定所述基因失调的原因。
19.权利要求18所述的方法,其中通过比较杂交测定所述基因失调的原因。
20.权利要求19所述的方法,其中所述比较杂交是比较基因组杂交。
21.权利要求18所述的方法,其中所述基因失调的原因是染色体异常。
22.权利要求21所述的方法,其中所述染色体异常选自易位、缺失、倒位和插入。
23.权利要求22所述的方法,其中所述染色体异常是易位。
24.用于检测测试样品中是否存在目标基因失调的方法,包括:
(a)测量所述测试样品和参照样品中所述目标基因5’区域和所述目标基因3’区域的转录量;和
(b)计算IDE分数,所述IDE分数比较所述目标基因的所述5’区域相对于所述3’区域的相对表达;
(c)比较所述测试样品中IDE分数与预定的分界值;
(d)当所述测试样品中所述IDE分数与所述分界值显著差异并且所述差异表明存在目标基因失调时,鉴定所述测试样品具有目标基因失调。
25.权利要求24所述的方法,其中所述测量通过RT-PCR进行,并且所述相对表达使用选自以下的公式测定为IDE分数:
IDE分数=2-(Ct3’-目标基因)-(Ct5’-目标基因)
和
(3’目标)/(5’目标)。
26.权利要求24-25任一项所述的方法,其中所述目标基因选自TMPRSS2、ERG、ETV1、SLC45A3、HERV-K_22q11.3、C15ORF21、HNRPA2B1、ETV4、ETV5、ALK、EML4、EUS、RANBP2、PAX、BUS、COL1A1 CLTC、KIF5B FKHR、PDGFB、FEV、DDIT3、ATF1、CREA、SP3、NR4A3、WT1、SYT、SSX1、SSX2、SSX4、BCR、ABL、BCL2、RARA、NPM和ATIC。
27.权利要求24-26任一项所述的方法,其中从所述测试样品扩增的目标基因5’区域和3’区域的量被归一化成从所述测试样品扩增的内源对照基因的量。
28.权利要求27所述的方法,其中所述测量通过RT-PCR进行,并且所述相对表达使用选自以下的公式测定为IDE分数:
(3’目标)/(对照)-(5’目标)/(对照),和
Ln(3’目标)/(对照)-Ln(5’目标)/(对照)。
29.权利要求27所述的方法,其中所述内源对照基因是ABL。
30.权利要求24-29任一项所述的方法,其中所述方法还包括:
(c)测量所述核酸样品中第二目标基因5’区域和所述第二目标基因3’区域的转录量;和
(f)计算所述第二目标基因的第二IDE分数,所述第二IDE分数比较所述第二目标基因的所述5’区域相对于所述3’区域的相对表达;
(g)比较所述测试样品中所述第二IDE分数与预定的分界值;
(f)当来自所述测试样品的第一和所述第二IDE分数均与它们各自的分界值显著差异并且两个差异均表明存在染色体异常时,鉴定所述测试样品具有染色体异常。
31.权利要求30所述的方法,其中所述第二目标选自ERG、ETV1和EML4。
32.用于诊断对象中癌症或癌症易感性的方法,包括:
(a)用与目标基因5’区域互补的一个或多个5’目标引物对扩增核酸样品中所述目标基因转录物的5’区域,如果存在;
(b)用与所述目标基因3’区域互补的一个或多个3’目标引物对扩增生物样品中所述目标基因转录物的3’区域,如果存在;和
(c)检测所述一个或多个5’目标引物对和所述一个或多个3’目标引物对产生的扩增产物的量;
(d)比较所述核酸样品中所述目标基的所述5’区域相对所述3’区域的相对表达和参照样品中所述目标基因的所述5’区域相对所述3’区域的相对表达;和
(e)当步骤(d)的比较表明所述目标基因失调时,诊断所述对象患有癌症或对癌症易感。
33.权利要求32所述的方法,其中所述目标基因选自TMPRSS2、ERG、ETV1、SLC45A3、HERV-K_22q11.3、C15ORF21、HNRPA2B1、ETV4和ETV5。
34.权利要求32-33任一项所述的方法,其中所述目标基因选自TMPRSS2、ERG和ETV1。
35.权利要求32-34任一项所述的方法,其中所述测量通过RT-PCR进行,并且所述相对表达使用选自以下的公式测定为IDE分数:
IDE分数=2-(Ct3’-目标基因)-(Ct5’-目标基因)
和
(3’目标)/(5’目标)。
36.权利要求32-35任一项所述的方法,其中步骤(a)和(b)产生的扩增产物的所述量均被归一化成内源对照基因转录物的量。
37.权利要求32-36任一项所述的方法,还包括用与内源对照基因互补的引物对扩增所述生物样品中存在的所述内源对照基因转录物的区域,并检测所述内源对照基因的所述区域的扩增。
38.权利要求36所述的方法,其中所述内源对照基因是ABL。
39.权利要求37所述的方法,其中所述测量通过RT-PCR进行,并且所述相对表达使用选自以下的公式测定为IDE分数:
(3’目标)/(对照)-(5’目标)/(对照),和
Ln(3’目标)/(对照)-Ln(5’目标)/(对照)。
40.权利要求32-39任一项所述的方法,其中所述生物样品选自全血、分离的血细胞、血浆、血清和尿液。
41.权利要求32-40任一项所述的方法,包括测定所述基因失调的原因。
42.权利要求41所述的方法,其中通过比较杂交测定所述基因失调的原因。
43.权利要求42所述的方法,其中所述比较杂交是比较基因组杂交。
44.权利要求41所述的方法,其中所述基因失调的原因是染色体异常。
45.权利要求44所述的方法,其中所述染色体异常选自易位、缺失、倒位和插入。
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