ES2818625T3 - Genes de fusión asociados con el cáncer de próstata progresivo - Google Patents

Genes de fusión asociados con el cáncer de próstata progresivo Download PDF

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Yangping Yu
Joel B Nelson
George Michalopoulos
Chien-Cheng Tseng
Ying Ding
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Abstract

Un método para determinar si un sujeto tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo que comprende: determinar si una célula de cáncer de próstata obtenida del sujeto contiene un gen de fusión MAN2A1- FER, indicando la presencia del gen de fusión que el sujeto tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo.

Description

DESCRIPCIÓN
Genes de fusión asociados con el cáncer de próstata progresivo
Reivindicación de prioridad
La presente solicitud reivindica prioridad con respecto a la solicitud de patente estadounidense provisional con número de serie 61/921.836, presentada el 30 de diciembre de 2013, a la solicitud de patente estadounidense provisional con número de serie 62/014.487, presentada el 19 de junio de 2014, y a la solicitud de patente estadounidense provisional con número de serie 62/025.923, presentada el 17 de julio de 2014.
Información de subvención
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno con los números de subvención RO1 CA098249 y fue otorgada por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
1. Introducción
La presente invención versa sobre métodos para determinar qué pacientes con cáncer de próstata tienen mayor probabilidad de desarrollar una enfermedad progresiva en función de la presencia de genes de fusión específicos y sobre métodos para tratar a dichos pacientes.
2. Antecedentes de la invención
A pesar de la alta incidencia, solo una fracción de los hombres a los que se diagnostica cáncer de próstata desarrollan metástasis y aún menos mueren a causa de la enfermedad. La mayoría de los cánceres de próstata permanecen asintomáticos y clínicamente indolentes. Los mecanismos precisos para el desarrollo del cáncer de próstata progresivo y clínicamente preocupante siguen siendo difíciles de precisar. Además, la incapacidad de predecir la agresividad potencial del cáncer de próstata ha dado lugar a un sobretratamiento significativo de la enfermedad. La naturaleza dicotómica del cáncer de próstata —un subconjunto de neoplasias potencialmente fatales en el contexto más amplio de alteraciones histológicas que carecen de las características clínicas implícitas en esa etiqueta— es un reto fundamental en el tratamiento de la enfermedad. Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de métodos para determinar si un sujeto tiene un mayor riesgo de desarrollar cáncer de próstata progresivo. Nam et al, en Cancer Biology and Therapy 40-45, de enero de 2007, exponen que la expresión del gen de fusión TMPRSS2-ERG en células de cáncer de próstata es un importante factor pronóstico para el avance del cáncer.
3. Compendio de la invención
La presente invención versa sobre métodos y composiciones para determinar si un sujeto que tiene cáncer de próstata tiene un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad progresiva, y sobre métodos para tratar a tales sujetos. Se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que aproximadamente el 90 % de los hombres portan al menos uno de los siguientes genes de fusión: TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM135-CCDC67 y CCNH-C5orf30 experimentó recurrencia del cáncer de próstata, metástasis y/o fallecimiento específicamente por cáncer de próstata después de la prostatectomía radical (cada uno de los ejemplos de “cáncer de próstata progresivo”), mientras que estos resultados ocurrieron en solo el 36 % de los hombres que no portaban ninguno de estos genes de fusión. También se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que ningún paciente estudiado sobrevivió cinco años sin recurrencia si su cáncer de próstata primario contenía un gen de fusión TRMT11-GRIK2 o MTOR-TP53BP1. También se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la proteína codificada por el gen de fusión MAN2A1-FER exhibe actividad quinasa.
Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar si un sujeto tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo que comprende: determinar si una célula de cáncer de próstata obtenida del sujeto contiene un gen de fusión MAN2A1-FER, indicando la presencia del gen de fusión que el sujeto tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo.
Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona un inhibidor específico para el gen de fusión MAN2A1-FER para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata en un sujeto para el que se ha determinado que tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo, determinado por la presencia del gen de fusión en una célula de cáncer de próstata obtenida del sujeto.
Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona un agente que inhibe el producto de un gen de fusión MAN2A1-FER para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata en un sujeto para el que se ha determinado que tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo, determinado por la presencia del gen de fusión en una célula de cáncer de próstata obtenida del sujeto.
Según un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un ARNip que tiene como diana un gen de fusión MAN2A1-FER para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata en un sujeto para el que se ha determinado que tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo, determinado por la presencia del gen de fusión en una célula de cáncer de próstata obtenida del sujeto.
Según un quinto aspecto de la invención, se proporciona un agente anticanceroso para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata en un sujeto para el que se ha determinado que tiene un mayor riesgo de manifestar un cáncer de próstata progresivo, determinado por la presencia de un gen de fusión MAN2A1-FER en una célula de cáncer de próstata obtenida del sujeto.
Según un sexto aspecto de la invención, se proporciona un inhibidor de FER para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata en un sujeto con mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo según lo determinado por la presencia de un gen de fusión MAN2A1-FER en una célula de cáncer de próstata obtenida del sujeto. En una realización preferida de la invención, el inhibidor de FER es crizotinib.
Según un séptimo aspecto de la invención, se proporciona un equipo para detectar un gen de fusión MAN2A1-FER, que comprende una o más sondas específicas para el gen de fusión MAN2A1-FER para detectar el gen de fusión MAN2A1-FER o uno o más pares de cebadores específicos para el gen de fusión MAN2A1-FER para detectar el gen de fusión MAN2A1-FER.
Según un octavo aspecto de la invención, se proporciona un equipo para tratar el cáncer de próstata que comprende cebadores de ácido nucleico o sondas de ácido nucleico específicos para un gen de fusión MAN2A1-FER para detectar el gen de fusión MAN2A1-FER.
Según un noveno aspecto de la invención, se proporciona un inhibidor de EGFR para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata en un sujeto con mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo según se determina por la presencia de MAN2A1-FER en una célula de cáncer de próstata obtenida del sujeto. En una realización preferida de la invención, el inhibidor de EGFR es canertinib.
Según un décimo aspecto de la invención, se proporciona un agente capaz de editar el genoma dirigido para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer de próstata en un sujeto, comprendiendo el método (i) determinar si un sujeto tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo que comprende determinar si una muestra del sujeto contiene un gen de fusión MAN2A1-FER; y (ii) cuando la muestra contiene el gen de fusión, por lo que el sujeto tiene un mayor riesgo, realizar un procedimiento de edición genómica usando el agente para que tenga como diana el gen de fusión presente dentro de una o más células de cáncer de próstata del sujeto.
4. Breve descripción de las figuras
FIGURA 1. Eventos únicos de los genes de fusión. Panel izquierdo: Diagramas en miniatura del genoma de los genes de fusión, las direcciones de transcripción, las distancias entre los genes de unión y las direcciones de las fusiones. Panel central: Cromogramas de secuenciación representativos de genes de fusión. Se indican las secuencias de genes de unión (SEC ID Nos 45-52). Panel derecho: Diagramas de productos de traducción de genes de fusión. Azul: producto de traducción de genes conductores; Rojo: producto de traducción de genes pasajeros; Naranja: productos de traducción novedosos debidos a cambios en el marco de lectura o productos de traducción de una región no genética.
FIGURAS 2A-H. La hibridación fluorescente in situ sugiere una recombinación genómica en las células de cáncer de próstata. (A) Diagrama esquemático de la recombinación genómica MAN2A1 y FER y las posiciones de la sonda FISH. Se muestran imágenes FISH representativas para células epiteliales de próstata normales y células cancerosas positivas para la fusión MAN2A1-FER. Naranja denota la sonda 1; Verde denota la sonda 2. (B) Diagrama esquemático de la recombinación genómica SLC45A2 y AMACR y las posiciones de la sonda FISH. Se muestran imágenes FISH representativas para células epiteliales de próstata normales y células cancerosas positivas para la fusión SLC45A2-AMACR. Naranja denota la sonda 1; Verde denota la sonda 2. (C) Diagrama esquemático de la recombinación genómica MTOR y TP53BP1 y las posiciones de la sonda FISH. Se muestran imágenes FISH representativas para células epiteliales de próstata normales y células cancerosas positivas para la fusión MTOR-TP53BP1. Naranja denota la sonda 1; Verde denota la sonda 2. (D) Diagrama esquemático de la recombinación genómica de TRMT11 y GRIK2 y las posiciones de la sonda FISH. Se muestran imágenes FISH representativas para células epiteliales de próstata normales y células cancerosas positivas para la fusión TRMT11-GRIK2. Naranja denota la sonda 1; Verde denota la sonda 2. (E) Diagrama esquemático de la recombinación genómica LRRC59 y FLJ60017 y las posiciones de la sonda FISH. Se muestran imágenes FISH representativas para células epiteliales de próstata normales y células cancerosas positivas para la fusión LRRC59-FLJ60017. Naranja denota la sonda 1; Verde denota la sonda 2. (F) Diagrama esquemático de la recombinación genómica TMEM135 y CCDC67 y las posiciones de la sonda FISH. Se muestran imágenes FISH representativas para células epiteliales de próstata normales y células cancerosas positivas para la fusión TMEM135-CCDC67. Naranja denota la sonda 1; Verde denota la sonda 2. (G) Diagrama esquemático de la recombinación genómica CCNH y C5orf30 y las posiciones de la sonda FISH. Se muestran imágenes FISH representativas para células epiteliales de próstata normales y células cancerosas positivas para la fusión CCNH-C5orf30. Naranja denota la sonda 1; Verde denota la sonda 2. (H) Diagrama esquemático de la recombinación genómica KDM4B y AC011523.2 y las posiciones de la sonda FISH. Se muestran imágenes FISH representativas para células epiteliales de próstata normales y células cancerosas positivas para la fusión KDM4B-AC011523.2. Naranja denota la sonda 1; Verde denota la sonda 2.
FIGURAS 3A-D. Los genes de fusión en el cáncer de próstata están asociados con cánceres de próstata agresivos. (A) Distribución de 8 muestras de cáncer de próstata positivas para genes de fusión. Las muestras de pacientes que experimentaron recurrencia se indican con gris (PSADT>15 meses) o gris oscuro (PSADT<4 meses); las muestras de pacientes que no tuvieron recurrencia al menos 5 años con verde y las muestras de pacientes cuyo seguimiento clínico es continuo, pero menos de 5 años con blanco (indeterminado). (B) Correlación de eventos de genes de fusión con la recurrencia del cáncer de próstata. Se representa el porcentaje de recaída del cáncer de próstata cuando el gen de fusión es positivo en las muestras de cáncer de próstata para cada gen de fusión. El porcentaje de cáncer de próstata que experimenta recurrencia de muestras positivas para los transcritos de fusión se representa para cada transcrito de fusión. Izquierda, cohorte del Centro Médico de la Universidad de Pittsburgh; Centro, cohorte del Centro Médico de la Universidad de Stanford; Derecha, cohorte del Centro Médico Madison de la Universidad de Wisconsin. (C) Análisis ROC de un panel de 8 genes de fusión que predicen la recurrencia del cáncer de próstata (arriba) y el PSADT corto (abajo). (D) Análisis de Kaplan-Meier de pacientes que son positivos para cualquiera de TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM135-CCDC67 y CCNH-C5orf30 en comparación con aquellos que son negativos para estos eventos de fusión.
FIGURAS 4A-C. Los genes de fusión predicen la recurrencia del cáncer de próstata. (A) Esquema de las etapas de entrenamiento y validación en la construcción de modelos de predicción de genes de fusión para la recurrencia del cáncer de próstata y un PSADT corto. El algoritmo de predicción del gen de fusión de la recurrencia del cáncer de próstata y PSADT<4 meses se obtuvo de 90 muestras de cáncer de próstata asignadas al azar del Centro Médico de la Universidad de Pittsburgh (I). A continuación, el algoritmo se aplicó a 89 muestras del Centro Médico de la Universidad de Pittsburgh (II), a 21 muestras del Centro Médico de la Universidad de Stanford (III) y a 33 muestras del Centro Médico Madison de la Universidad de Wisconsin (IV). (B) Tasa de predicción de recurrencia del cáncer de próstata (arriba) y PSADT<4 meses usando cohortes de muestras de cáncer de próstata del Centro Médico de la Universidad de Pittsburgh, del Centro Médico de Stanford y del Centro Médico Madison de la Universidad de Wisconsin, basada en el algoritmo obtenido de una cohorte de 90 muestras de entrenamiento. (C) Análisis de Kaplan-Meier de pacientes que fueron positivos para cualquiera de TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM135-CCDC67 y CCNH-C5orf30 en comparación con aquellos que fueron negativos para estos eventos de fusión. Arriba, análisis de Kaplan-Meier de una cohorte de muestras de cáncer de próstata de la Universidad de Pittsburgh; se indica el valor p para la diferencia significativa en la supervivencia entre el grupo que es positivo para al menos un transcrito de fusión y el grupo que es negativo. Abajo, análisis de Kaplan-Meier de una cohorte de muestras de cáncer de próstata del Centro Médico de la Universidad de Stanford; se indica el valor p para la diferencia significativa en la supervivencia entre el grupo que es positivo para al menos un transcrito de fusión y el grupo que es negativo.
FIGURAS 5A-B. Estado de combinación del transcrito de fusión y del parámetro clínico/patológico para mejorar la predicción de recurrencia del cáncer de próstata. (A) Combinación de la clasificación de Gleason y el estado de 8 transcritos de fusión en muestras de cáncer de próstata usando la técnica LDA para predecir la recurrencia del cáncer de próstata. Izquierda, análisis ROC de Gleason solo o Gleason más la presencia de transcritos de fusión usando la técnica LDA en la predicción de la recurrencia del cáncer de próstata; se indica el valor p (prueba de permutación) para la diferencia significativa entre la curva ROC generada por Gleason solo y la curva generada por Gleason más la presencia de transcritos de fusión usando la técnica LDA. Centro, análisis de Kaplan-Meier de supervivencia libre de PSA de pacientes con cáncer de próstata con Gleason >8 con respecto a <8 de los conjuntos de datos de pruebas del UPMC, de Wisconsin y de Stanford; se indica el valor p (prueba de rango logarítmico) para la diferencia significativa en la supervivencia entre el grupo que tiene una puntuación de Gleason de al menos 8 y el grupo que tiene una puntuación de 7 o menor. Derecha, análisis de Kaplan-Meier de supervivencia libre de PSA de pacientes con cáncer de próstata con Gleason >8 o positivo para cualquiera de los 8 transcritos de fusión en las muestras de cáncer de próstata con respecto a los de <8 y negativo para los transcritos de fusión usando LDA de los conjuntos de datos de pruebas del UPMC, de Wisconsin y de Stanford. Se indica el valor p (prueba de rango logarítmico) para la diferencia significativa en la supervivencia entre el grupo que es positivo para al menos un transcrito de fusión o que tiene Gleason >8 y el grupo que es negativo para el transcrito de fusión y tiene Gleason<8. (B) Combinación de nomograma y el estado de 8 transcritos de fusión en muestras de cáncer de próstata usando la técnica LDA para predecir la recurrencia del cáncer de próstata. Izquierda, análisis ROC del nomograma solo o del nomograma más la presencia de transcritos de fusión usando la técnica LDA en la predicción de la recurrencia del cáncer de próstata. Se indica el valor p (prueba de permutación) para la diferencia significativa entre la curva ROC generada por el nomograma solo y la curva generada por el nomograma más la presencia de transcritos de fusión usando la técnica LDA. Centro, análisis de Kaplan-Meier de supervivencia libre de PSA de pacientes con cáncer de próstata con probabilidad>88 en comparación con <88 de los conjuntos de datos de pruebas del UPMC, de Wisconsin y de Stanford; se indica el valor p (prueba de rango logarítmico) para la diferencia significativa en la supervivencia entre el grupo que tiene una probabilidad>88 de supervivencia libre de PSA y el grupo que tiene probabilidad <88. Derecha, análisis de Kaplan-Meier de supervivencia libre de PSA de pacientes con cáncer de próstata con nomograma <88 o positivo para cualquiera de los 8 transcritos de fusión en las muestras de cáncer de próstata en comparación con los >88 y negativos para los transcritos de fusión usando LDA de los conjuntos de datos de pruebas del UPMC, de Wisconsin y de Stanford. Se indica el valor p (prueba de rango logarítmico) para la diferencia significativa en la supervivencia entre el grupo que es negativo para el transcrito de fusión y tiene una probabilidad>88 de supervivencia libre de PSA y el grupo que es positivo para el transcrito de fusión o tiene una probabilidad<88.
FIGURA 6. Diagramas de CIRCOS de la translocación genómica funcional del cáncer de próstata. Cinco translocaciones funcionales de cáncer de próstata se basaron en la secuenciación de ARN. Catorce de estas translocaciones funcionales estuvieron soportadas por un análisis de secuenciación del genoma completo. La translocación funcional se define como al menos un transcrito identificado en el proceso de translocación. Se excluyeron las translocaciones en áreas no genéticas.
FIGURAS 7A-B. Identificación de genes de fusión en 174 muestras de próstata. (A) Se realizaron RT-PCR de TMEM135-CCDC57, KDM4B-AC011523.2, MAN2A1-FER, TRMT11-GRIK2, CCNH-C5orf30, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ6001, TMPRSS2-ERG en 213 de muestras de cáncer de próstata. Se usó la RT-PCR de la p-actina como control de calidad. La asignación de carriles es la siguiente: 1-TP12-S0943T, 2-TP12-S0916T, 3-TP12-S0967T, 4-TP12-S1059T, 5-TP10-S093T, 6-JB770T, 7-TP08PPS0721T, 8-TP10-S0638T, 9-TP12-S1032T, 10-TP12-S0624T, 11-TP12-S0981T, 12-TP10PPS0420T, 13-TP12-S0966T, 14-TP12-S0988T, 15-TP12-S0704T, 16-PR053T, 17-IB110T, 18-TP12-S0928T, 19-TP12-S0816T, 20-TP12-S0789T, 21-TP12-S0805T, 22-TP12-S0803T, 23-TP12-S0765T, 24-TP12-S0770T, 25-TP12-S0799T, 26-TP12-S0795T, 27-TP12-S0786T, 28-PR534T, 29-TP12-S0790T, 30-TP12-S0740T, 31-TP12-S0723T, 32-PR536T, 33-FB76, 34-IB378T, 35-IB180T, 36-HB303T, 37-GB368, 38-HB327T, 39-HB346T, 40-PR227T, 41-HB322T, 42-HB658T, 43-IB289T, 44-HB492T, 45-IB111T, 46-TP12-S0466T, 47-TP12-S0456T, 48-TP12-S0246T, 49-TP12-S0608T, 50-TP12-S0340T, 51-TP12-S0337T, 52-TP12-S0048T, 53-TP12-S0191T, 54-TP12-S0194T, 55-TP12-S0049T, 56-HB340T, 57-TP12-S0102T, 58-PR530T, 59-1942T, 60-TP12-S1189T, 61-13745T, 62-5396T, 63-8432T, 64-HB261T, 65-FB183T, 66-HB591T, 67-HB568T, 68-HB526T, 69-TP08-S00542T, 70-IB298T, 71-TP09-S0420T, 72-PR303T, 73-GB400T, 74-PR018T, 75-HB603T, 76-PR310T, 77-JB197T, 78-PR300T, 79-PR236T, 80-JB154T, 81-PR434T, 82-7504T, 83-25313T, 84-8629T, 85-7270T, 86-2671T, 87-4308T, 88-28278T, 89-TP12-S1224T, 90-TP12-S0918T, 91-TP12-S1197T, 92-TP12-S0915T, 93-16464T, 94-2644T, 95-1199T, 96-15922T, 97-15733T, 98-16947T, 99-19381T, 100-6837T, 101-9122T, 102-6647T, 103-4336T, 104-29671T, 105-11462T, 106-8741T, 107-IB362T, 108-PR079T, 109-IB483T, 110-IB071T, 111-GB195T, 112-PR521T, 113-TP08-S00530T, 114-7221T, 115-JB426T, 116-34T, 117-HB951T, 118-FB94T, 119-IB273T, 120-DB237T, 121-IB134T, 122-HB021T, 123-HB033T, 124-FB174T, 125-KB170T, 126-FB120T, 127-HB504T, 128-HB305T, 129-FB421T, 130-TP09-S0721T, 131-FB238T, 132-HB46T, 133-TP11PP-S0638T, 134-PR306T, 135-HB207T, 136-HB235T, 137-IB112T, 138-IB136T, 139-PR375T, 140-2HB591T, 141-23HB021T, 142-TP09-S0006T, 143-2IB483T, 144-2HB568T, 145-M-11462T, 146-29825T, 147-3G989122T, 148-1AF8378T, 149-3Q-10614T, 150-4L98-27086T, 151-3D994336T, 152-3K5772T, 153-2K98-8378T, 154-14304T, 155-15463T, 156-15875T, 157-98TA-83782T, 158-562T, 159-14878T, 160-7943T, 161-995772T, 162-678T, 163-9927086T, 164-25265T, 165-HB705T, 166-33PR053T, 167-TP12-S0954T, 168-19PR530T, 169-34PR227T, 170-56FB76T, 171-TP09-S0704T, 172-78HB340T, 173-23FB120T, 174-23HB346T, 175-54IB289T, 176-TP13-S0109T, 177-TP13-S0456T, 178-TP13-S0248T, 179-TP13-S0464T, 180-TP13-S0043T, 181-TP13-S0314T, 182-8433T, 183-863176T, 184-R6TT, 185-84876T, 186-994308T, 187-991199T, 188-9812033T, 189-855327T, 190-9814481T, 191-R3T, 192-R13T, 193-R19T, 194-84375T, 195-832972T, 196-9210207T, 197-R57T, 198-828142T, 199-R26T, 200-23R19T, 201-8713205T, 202-9217293T, 203-R18T, 204-8712362T, 205-9412443T, 206-R10T, 207-92SR293T, 208-R16T, 209-849731T, 210-67R13T, 211-842620T, 212-R59T, 213-SR9R57T. (B) RT-PCR de TMEM135-CCDC67, KDM4B-AC011523.2, MAN2A1-FER, TRMT11-GRIK2, CCNH-C5orf30, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1 y LRRC59-FLJ60017 en 10 tejidos prostáticos de donantes de órganos.
FIGURA 8. Identificación de genes de fusión en 30 muestras prostáticas del Centro Médico de la Universidad de Stanford. Se realizaron RT-PCR de TMEM135-CCDC67, KDM4BAC011523.2, MAN2A1-FER, TRMT11-GRIK2, CCNH-C5orf30, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1 y LRRC59-FJL60017 en 30 muestras indicadas de cáncer de próstata. Se usó la RT-PCR de la p-actina como control de calidad.
FIGURA 9. Identificación de genes de fusión en 36 muestras prostáticas del Centro Médico Madison de la Universidad de Wisconsin. Se realizaron RT-PCR de TMEM135-CCDC67, KDM4B-AC011523.2, MAN2A1-FER, TRMT11-GRIK2, CCNH-C5orf30, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1 y LRRC59-FJL60017 en 36 muestras indicadas de cáncer de próstata. Se usó la RT-PCR de la p-actina como control de calidad.
FIGURA 10. Inactivación de la expresión de ARN GRIK1 y TRMT11 en cáncer de próstata positivo para la fusión TRMT11-GRIK2. Se realizaron RT-PCR en ARN de muestras de cáncer de próstata positivos para el gen de fusión TRMT11-GRIK2 usando cebadores específicos para GRIK2 y TRMT11. Se usaron productos de RT-PCR usando cebadores específicos para la p-actina como control de normalización de plantillas.
FIGURA 11. Análisis de puntos de ruptura genómicos de los genes de fusión. Panel superior: Diagramas en miniatura del genoma de los genes de fusión, las direcciones de transcripción, las distancias entre los genes de unión y las direcciones de la unión de los cromosomas. Panel central: Miniatura del genoma de fusión y la dirección de transcripción. Abajo: Cromogramas de secuenciación representativos que abarcan el punto de ruptura de unión de los cromosomas (SEC ID Nos 53-55).
FIGURAS 12A-B. Predicción de la recurrencia del cáncer de próstata y PSADT usando un panel de 8 genes de fusión. (A) Análisis ROC de un panel de 8 genes de fusión que predicen la recurrencia del cáncer de próstata usando 90 muestras de cáncer de próstata asignadas al azar del Centro Médico de la Universidad de Pittsburgh. Línea discontinua: predicción aleatoria; Línea continua: predicción de fusión; Punto azul: predicción óptima. Se indica el valor p (prueba de permutación) para la diferencia significativa entre la curva ROC generada por los transcriptos de fusión usando la técnica LDA y la curva de control de referencia. (B) Análisis ROC de un panel de 8 genes de fusión que predicen el PSADT corto del cáncer de próstata (<4 meses). Línea discontinua: predicción aleatoria; Línea continua: predicción de fusión; Punto azul: predicción óptima. Se indica el valor p (prueba de permutación) para la diferencia significativa entre la curva ROC generada por los transcriptos de fusión usando la técnica LDA y la curva de control de referencia.
FIGURAS 13A-C. Gen de fusión PTEN-NOLC1 en el cáncer de próstata. (A) Transcrito de fusión PTEN-NOLC1. Panel superior: Diagramas en miniatura del genoma de los genes PTEN y NOLC1, la dirección de transcripción, la distancia entre los genes de unión y la dirección de la fusión. Panel central: Cromograma de secuenciación representativo del transcrito de PTEN-NOLC1. Se indican las secuencias de genes de unión (SEQ ID NO 56). Panel inferior: Diagrama del producto de traducción del transcrito de fusión. Azul: Producto de traducción de genes de cabeza; Rojo: Producto de traducción de genes de cola. (B) Diagrama esquemático de la recombinación genómica de PTEN y NOLC1 y las posiciones de la sonda FISH. Se muestran imágenes FISH representativas para células epiteliales de próstata normales y células cancerosas positivas para la fusión TENNOLC1. Naranja (asterisco *) denota la sonda 1 (RP11-124B18); Verde (signo más ) denota la sonda 2 (CTD-3082D22). Las señales de unión por fusión se indican mediante flechas verdes. (C) Expresión de PTEN-NOLC1 en muestras de cáncer de próstata. Se realizaron RT-PCR en 215 muestras de cáncer de próstata usando cebadores específicos para el transcrito de fusión PTEN-NOLC1 (PN). Se realizaron RT-PCR que utilizaban cebadores específicos para la p-actina (BAT) como controles de normalización.
FIGURA 14. Análisis de motivos de MAN2A1-FER. Diagrama de dominio funcionales de las proteínas de fusión MAN2A1, FER y MAN2A1-FER.
FIGURA 15. Diagrama esquemático de la dirección de edición genómica en un punto de ruptura de genes de fusión en células de cáncer de próstata positivas para CCNH-C5orf30 (SEQ ID NO 57).
FIGURA 16. Diagrama esquemático de genes de fusión. Panel izquierdo: Diagrama esquemático del genoma de parejas de fusión. Se indican el locus genético, la distancia entre parejas, la dirección de transcripción y la dirección de fusión. Panel central: Histograma de secuenciación de Sanger que rodea el punto de fusión de cada gen de fusión (SEC ID Nos 40-44). Panel derecho: Productos proteicos predichos de genes de fusión. Azul: Proteína del gen de cabeza; Amarillo: Traducción de cambios en el marco de lectura; Rojo: Cola.
FIGURA 17. Diagrama esquemático de la formación de la fusión ZMPSTE24-ZMYM5. Se indican los dominios funcionales.
FIGURA 18. Diagrama esquemático de la formación de la fusión CLTC-ETV1. Se indican los dominios funcionales.
FIGURA 19. Diagrama esquemático de la formación de la fusión ACPP-SEC13. Se indican los dominios funcionales.
FIGURA 20. Diagrama esquemático de la formación de la fusión DOCK7-OLR1. Se indican los dominios funcionales.
FIGURA 21. Diagrama esquemático de la formación de la fusión PCMTD1-SNTG1. Se indican los dominios funcionales.
FIGURAS 22A-F. Actividad pro-crecimiento de MAN2A1-FER. (A) Expresión de MAN2A1-FER en muestras de cáncer de próstata primario. Se realizaron inmunotransferencias usando anticuerpos específicos para MAN2A1 (panel superior) o FER (panel inferior) en muestras de ARN MAN2A1-FER positivas (JB770t , FB174T y FB421T) o MAN2A1-FER negativas (IB071T, IB136T y HB504T). (B) Expresión de MAN2A1 -FER-FLAG en células RWPE-1. Se transfectaron células RWPE-1 con vectores pCDNA4-MAN2A1-FER-FLAG/pCDNA6. Se seleccionaron dos líneas celulares estables (RMF1 y RMF4) para demostrar la expresión inducida por tetraciclina de MAN2A1-FER-FLAG usando anticuerpos anti-FLAG. (C) La expresión de MAN2A1-FER-FLAG acelera la entrada en la fase S del ciclo celular. Las fases del ciclo celular se cuantificaron mediante análisis de citometría de flujo de la incorporación de BrdU y el marcado con yodo de propidio. (D) Colocalización de MAN2A1-FER-FLAG y la enzima N-acetilgalactosaminiltransferasa, residente en el aparato de Golgi. Se marcó MAN2A1-FER-FLAG con anticuerpos conjugados FITZ específicos para FLAG, mientras que la N-acetilgalactosaminiltransferasa se marcó con anticuerpos conjugados con rodamina específicos para la N-acetilgalactosaminiltransferasa. (E) Cosegregación de MAN2A1-FER-FLAG y N-acetilgalactosaminiltransferasa en ultracentrifugación en gradiente de sacarosa. (F) Expresión de MAN2A1-FER-FLAG inducida por fosforilación de tirosina de EGFR en ausencia de ligando de EGFR. Se privó de suero a células RMF1 y RMF4 durante 72 horas y posteriormente fueron inducidas con tetraciclina (5 |jg/ml) durante 12 horas. El EGFR se inmunoprecipitó con anticuerpos anti-EGFR y se inmunotransfirió con anticuerpos anti-fosfotirosina o anti-pTyr1068 de EGFR o anti-EGFR.
FIGURA 23. Destrucción específica de células que expresan MAN2A1-FER mediante Crisotinib y Canertinib.
La línea celular PC3 de cáncer de próstata fue transformada con pCDNA4-MAN2A1-FER-FLAG/pCDNA6. La expresión de MAN2A1-FER fue inducida con 5 jg/ml de tetraciclina. Se usaron como controles de segundo plano células no tratadas con tetraciclina ni ningún fármaco. Panel superior: El Crisotinib destruye específicamente las células que expresan MAN2A1-FER. Panel inferior: El Canertinib destruye específicamente las células que expresan MAN2A1-FER.
FIGURA 24. Diagrama esquemático de la proteína quimérica SLC45A2-AMACR. La fusión entre SLC45A2 y AMACR da lugar al truncamiento de dos tercios del dominio (MFS) en SLC45A2, pero retiene en gran medida el dominio CoA-transferasa de AMACR.
FIGURAS 25A-I. Actividad pro-crecimiento de SLC45A2-AMACR. (A) Expresión de SLC45A2-AMACR en muestras de cáncer de próstata primario. Se realizaron inmunotransferencias usando anticuerpos específicos para AMACR (panel superior) o SLC45A2 (panel inferior) en muestras de ARN SLC45A2-AMACR positivas (FB174T, HB207T, HB305T y FB238T) o SLC45A2-AMACR negativas (6637T, 6647T y 1199T). (B) Expresión de SLC45A2-AMACR-FLAG en células RWPE-1. Se transfectaron células RWPE-1 con vectores pCDNA4-SLC45A2-AMACR-FLAG/pCDNA6. Se seleccionaron dos líneas celulares estables (RSLAM n° 2 y RSLAM n° 3) para demostrar la expresión inducida por tetraciclina de SLC45A2-AMACR-FLAG usando anticuerpos anti-FLAG. (C) SLC45A2-AMACR se encuentra principalmente en la membrana plasmática. Se realizaron inmunotransferencias en la fracción membranosa (M) y la fracción no membranosa (NM) de células RSLAM n° 2 tratadas sin tetraciclina (panel superior) o con tetraciclina (panel inferior), usando anticuerpos específicos para AMACR (panel superior) y para FLAG (panel inferior). (D) Tinción de inmunofluorescencia de AMACR (panel superior) en células RSLAM n° 2 tratadas sin tetraciclina usando anticuerpos específicos para AMACR o de SLC45A2-AMACR-FLAG en células RSLAM n° 2 tratadas con tetraciclina usando anticuerpos específicos para FLAG. (E) La expresión de SLC45A2-AMACR aumenta el crecimiento celular en los ensayos de MTT. (F) La expresión de SLC45A2-AMACR-FLAG acelera la entrada en la fase S del ciclo celular. Las fases del ciclo celular se cuantificaron mediante análisis de citometría de flujo de la incorporación de BrdU y el marcado con yodo de propidio. (G) La expresión de SLC45A2-AMACR aumenta los niveles intracelulares de PIP2(3,4). (H) Validación mediante la técnica de doble híbrido en levadura de la interacción LC45A2-AMACR/SHIP2. (I) Coinmunoprecipitación de SHIP2 y SLC45A2-AMACR-FLAG en células RSLAM n° 2.
FIGURA 26. El Ebselen inhibe específicamente las células PC3 que expresan SLC45A2-AMACR. Se aplicaron células RWPE1, NIH3T3 no transformadas, y células PC3 transformadas SLC45A2-AMACR tratadas con (PC3/SLAM tet+) o sin tetraciclina (PC3/SLAM tet-) con la concentración indicada de Ebselen. Se examinaron los crecimientos celulares en relación con los controles no aplicados. CI50 para PC3/SLAM tet+ es 37 jM , mientras que para PC3/SLAM tet- es 173 jM. Para las células NIH3T3 y RWPE1, las CI50 son >300 jM.
FIGURA 27A-D. PTEN-NOLC1 se localiza en el núcleo y promueve el crecimiento celular. (A) Tinción por inmunofluorescencia de PTEN y PTEN-NOLC1-FLAG. Se transformaron células NIH3T3 y PC3 con pCDNA4-Pten-NOLC1-FLAG/pCDNA6 y fueron inducidas con tetraciclina. La tinción por inmunofluorescencia se realizó usando anticuerpos específicos para el epítopo FLAG. Las células NIH3T3 no inducidas y las células PC3 transfectadas con pCMV-Pten inmunoteñidas con anticuerpos específicos para Pten fueron controles. (B) Proliferación celular inducida por Pten-NOLCI-FLAG. Se cultivaron células (2000/pocillo) de (A) durante 4 días con tetraciclina. A continuación, se cuantificó el número de células. Las células no tratadas con tetraciclina fueron controles negativos. (C) Análisis del ciclo celular de las células NIH3T3 y PC3 transformadas con pCDNA4-Pten-NOLC1-FLAG/pCDNA6. (D) Análisis de formación de colonias de células NIH3T3 y PC3 transformadas con pCDNA4-Pten-NOLC1-FLAG/pCDNA6.
FIGURAS 28A-B. Terapia genética dirigida al punto de ruptura del genoma TMEM135-CCDC67. (A) La transfección de células Pc 3 que contenían el punto de ruptura TMEM135-CCDC67 con pTMEM135-CCDc67-TK-GFP y pNicKase-RFP-gRNA-TMEM135-CCDc67-BrkPt dio lugar a la integración y la expresión de TK-GFP. (B) El tratamiento de ganciclovir de células PC3 y PC3/TMEM135-CCDC67-BrkPt transfectadas con pTMEM135-CcDc67-TK-GFP y pNicKase-RFP-gRNA-TMEM135-CCDC67-BrkPt dio lugar a la destrucción específica de las células PC3 que contenían el punto de ruptura TMEM135-CCDC67.
5. Descripción detallada de la invención
En aras de la claridad y no a título de limitación, la descripción detallada se divide en las dos subsecciones siguientes:
(i) genes de fusión;
(ii) detección de genes de fusión;
(iii) métodos diagnósticos y métodos de tratamiento; y
(iv) equipos.
5.1 Genes de fusión
La expresión “gen de fusión”, según es usada en la presente memoria, se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos o proteínas que combina elementos de los genes enumerados o de sus transcritos de ARN de una manera que no se encuentra en las secuencias de ácidos nucleicos o proteínas de tipo natural/normal. Por ejemplo, pero no a título de limitación, en un gen de fusión en forma de ADN genómico, las posiciones relativas de porciones de las secuencias genómicas de los genes enumerados se alteran en relación con la secuencia de tipo natural/normal (por ejemplo, como se refleja en las posiciones o secuencias cromosómicas del NCBI aquí definidas). En un gen de fusión en forma de ARNm, hay presentes porciones de transcritos de ARN que surgen de ambos genes componentes (no necesariamente en el mismo registro que el transcrito de tipo natural y posiblemente incluyendo porciones que normalmente no están presentes en el transcrito maduro normal). En realizaciones no limitantes, dicha porción de ADN o ARNm genómico puede comprender al menos aproximadamente 10 nucleótidos consecutivos, o al menos aproximadamente 20 nucleótidos consecutivos, o al menos aproximadamente 30 nucleótidos consecutivos, o al menos 40 nucleótidos consecutivos. En un gen de fusión en forma de proteína, hay presentes porciones de secuencias de aminoácidos que surgen de ambos genes componentes (no a modo de limitación, al menos aproximadamente 5 aminoácidos o al menos aproximadamente 10 aminoácidos o al menos aproximadamente 20 aminoácidos ácidos o al menos aproximadamente 30 aminoácidos consecutivos). En este párrafo, las porciones que surgen de ambos genes, los transcritos o las proteínas no se refieren a secuencias que pueden ser idénticas en las formas de tipo natural de ambos genes (es decir, las porciones son “no compartidas”). Por ello, un gen de fusión representa, en términos generales, el empalme o una fusión de elementos genómicos que normalmente no están unidos.
El gen de fusión TRMT11-GRIK2 es una fusión entre el homólogo de metiltransferasa 11 de ARNt (“TRMT11”) y los genes del receptor de glutamato, ionotrópico, kainato 2 (“GRIK2”). El gen TRMT11 humano se encuentra normalmente en el cromosoma 6q11.1 y el gen GRIK2 humano se encuentra normalmente en el cromosoma 6q16.3. En determinadas realizaciones, el gen TRMT11 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 60487, cromosoma de secuencia 6; NC_000006.11 (126307576..126360422) y/o el gen GRIK2 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 2898, cromosoma de secuencia 6; NC_000006.11 (101841584..102517958).
El gen de fusión SLC45A2-AMACR es una fusión entre los genes de la familia 45 de acarreadores de soluto, miembro 2 (“SLC45A2”) y alfa-metilacil-CoA racemasa (“AMACR”). El gen SLC45A2 humano se localiza normalmente en el cromosoma humano 5p13.2 y el gen AMACR humano se localiza normalmente en el cromosoma 5p.13. En determinadas realizaciones, el gen SLC45A2 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 51151, cromosoma de secuencia 5; NC_000005.9 (33944721..33984780, complemento) y/o el gen AMACR es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 23600, cromosoma de secuencia 5; NC_000005.9 (33987091..34008220, complemento).
El gen de fusión MTOR-TP53BP1 es una fusión entre los genes de la diana mecanicista de la rapamicina (“MTOR”) y de la proteína 1 de unión a la proteína tumoral p53 (“TP53BP1”). El gen MTOR humano se localiza normalmente en el cromosoma 1p36.2 y el gen TP53BP1 humano se localiza normalmente en el cromosoma 15q15 - q21. En ciertas realizaciones, el gen MTOR es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 2475, cromosoma de secuencia 1 NC_000001.10 (11166588..11322614, complemento) y/o el gen TP53BP1 es el gen humano que tiene la identificación génica nCb I n° 7158, cromosoma de secuencia 15; NC_000015.9 (43695262..43802707, complemento).
El gen de fusión LRRC59-FLJ60017 es una fusión entre el gen de una repetición rica en leucina que contiene 59 (“LRRC59”) y el ácido nucleico “FLJ60017”. El gen LRRC59 humano se localiza normalmente en el cromosoma 17q21.33 y el ácido nucleico que codifica el FLJ60017 humano se localiza normalmente en el cromosoma 11q12.3. En ciertas realizaciones, el gen LRRC59 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 55379, cromosoma de secuencia 17; NC_000017.10 (48458594..48474914, complemento) y/o FLJ60017 tiene una secuencia de ácido nucleico según se establece en GeneBank AK_296299.
El gen de fusión TMEM135-CCDC67 es una fusión entre los genes de la proteína transmembranal 135 (“TMEM135”) y del dominio de enrollamiento espiral que contiene 67 (“CCDC67”). El gen TMEM135 humano se localiza normalmente en el cromosoma 11q14.2 y el gen CCDC67 humano se localiza normalmente en el cromosoma 11q21. En ciertas realizaciones, el gen TMEM135 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 65084, cromosoma de secuencia 11; NC_000011.9 (86748886..87039876) y/o el gen CCDC67 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 159989, cromosoma de secuencia 11; NC_000011.9 (93063156..93171636).
El gen de fusión CCNH-C5orf30 es una fusión entre los genes de la ciclina H y del marco de lectura abierto 30 del cromosoma 5 (“C5orf30”). El gen CCNH humano se localiza normalmente en el cromosoma 5q13.3-q14 y el gen C5orf30 humano se localiza normalmente en el cromosoma 5q21.1. En ciertas realizaciones, el gen CCNH es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 902, cromosoma de secuencia 5; NC_000005.9 (86687310..86708850, complemento) y/o el gen C5orf30 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 90355, cromosoma de secuencia 5; NC_000005.9 (102594442..102614361).
El gen de fusión KDM4B-AC011523.2 es una fusión entre la desmetilasa 4B específica de lisina (K) (“KDM4B”) y la región cromosómica “AC011523.2”. El gen KDM4B humano se encuentra normalmente en el cromosoma 19p13.3 y la región AC011523.2 humana se localiza normalmente en el cromosoma 19q13.4. En ciertas realizaciones, el gen KDM4B es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 23030, cromosoma de secuencia 19; NC_000019.9 (4969123..5153609); y/o la región AC011523.2 comprende una secuencia mostrada en la Figura 1. El gen de fusión MAN2A1-FER es una fusión entre el miembro 1 de la alfa manosidasa de clase 2A (“MAN2A1”) y la tirosina quinasa (relacionada con fps/fes) (“FER”). El gen MAN2A1 humano se encuentra normalmente en el cromosoma 5q21.3 y el gen FER humano se encuentra normalmente en el cromosoma 5q21. En ciertas realizaciones, el gen MAN2A1 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 4124, cromosoma de secuencia 5; NC_000005.9 (109025156..109203429) o NC_000005.9 (109034137..109035578); y/o el gen FER es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 2241, cromosoma de secuencia 5: NC_000005.9 (108083523..108523373).
El gen de fusión PTEN-NOLC1 es una fusión entre el homólogo de fosfatasa y tensina (“PTEN”) y la fosfoproteína 1 nucleolar y de cuerpo en espiral (“NOLC1”). El gen PTEN humano se encuentra normalmente en el cromosoma 10q23.3 y el gen NOLC1 humano se encuentra normalmente en el cromosoma 10q24.32. En ciertas realizaciones, el gen PTEN es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 5728, cromosoma de secuencia 10; NC_000010.11 (87863438..87970345) y/o el gen NOLC1 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 9221, cromosoma de secuencia 10; NC_000010.11 (102152176..102163871).
El gen de fusión ZMPSTE24-ZMYM4 es una fusión entre la metalopeptidasa de cinc STE24 (“ZMPSTE24”) y el dedo de cinc, MYM-tipo 4 (“ZMYM4”). La ZMPSTE24 humana se localiza normalmente en el cromosoma 1p34 y el gen ZMYM4 humano se localiza normalmente en el cromosoma 1p32-p34. En ciertas realizaciones, el gen ZMPSTE24 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 10269, cromosoma de secuencia 1; NC_000001.11 (40258050..40294184) y/o el gen ZMYM4 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 9202, cromosoma de secuencia 1; NC_000001.11 (35268850..35421944).
El gen de fusión CLTC-ETV1 es una fusión entre la clatrina de cadena pesada (Hc) (“CLTC”) y la variante 1 de ETS (“ETV1”). La CLTC humana se encuentra normalmente en el cromosoma 17q23.1 y el gen ETV1 humano se encuentra normalmente en el cromosoma 7p21.3. En ciertas realizaciones, el gen CLTC es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 1213, cromosoma de secuencia 17; NC_000017.11 (59619689..59696956) y/o el gen ETV1 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 2115, cromosoma de secuencia 7; NC_000007.14 (13891229..13991425, complemento).
El gen de fusión ACPP-SEC13 es una fusión entre la fosfatasa ácida prostética (“ACPP”) y el homólogo de SEC13 (“SEC13”). La ACPP humana se encuentra normalmente en el cromosoma 3q22.1 y el gen SEC13 humano se encuentra normalmente en el cromosoma 3p25-p24. En ciertas realizaciones, el gen ACPP es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 55, cromosoma de secuencia 3; NC_000003.12 (132317367..132368302) y/o el gen SEC13 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 6396, cromosoma de secuencia 3; NC_000003.12 (10300929..10321188, complemento).
El gen de fusión DOCK7-OLR1 es una fusión entre el dedicador de la citocinesis 7 (“DOCK7”) y el receptor 1 de lipoproteínas de baja densidad oxidadas (de tipo lectina) (“OLR1”). El DOCK7 humano se encuentra normalmente en el cromosoma 1p31.3 y el gen OLR1 humano se encuentra normalmente en el cromosoma 12p13.2-p12.3. En ciertas realizaciones, el gen DOCK7 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 85440, cromosoma de secuencia 1; NC_000001.11 (62454726..62688368, complemento) y/o el gen OLR1 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 4973, cromosoma de secuencia 12; NC_000012.12 (10158300..10172191, complemento).
El gen de fusión PCMTD1-SNTG1 es una fusión entre el dominio O-metiltransferasa de proteína-L-isoaspartato (D-aspartato) que contiene 1 (“PCMTD1”) y sintrofina gamma 1 (“SNTG1”). El PCMTD1 humano se encuentra normalmente en el cromosoma 8q11.23 y el gen SNTG1 humano se encuentra normalmente en el cromosoma 8q11.21. En ciertas realizaciones, el gen PCMTD1 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 115294, cromosoma de secuencia 8; NC_000008.11 (51817575 .51899186, complemento) y/o el gen SNTG1 es el gen humano que tiene la identificación génica NCBI n° 54212, cromosoma de secuencia 8; NC_000008.11 (49909789..50794118).
5.2 Detección de genes de fusión
Cualquiera de los genes de fusión precedentes descritos anteriormente en la sección 5.1 puede ser identificado mediante métodos conocidos en la técnica. Los genes de fusión pueden detectarse detectando la fusión de genes manifestada en ADN, ARN o proteína. Por ejemplo, y no a modo de limitación, la presencia de un gen de fusión puede detectarse determinando la presencia de la proteína codificada por el gen de fusión.
El gen de fusión puede detectarse en una muestra de un sujeto. “Paciente” o “sujeto”, usados indistintamente en el presente documento, se refiere a un sujeto humano o no humano. Ejemplos no limitantes de sujetos no humanos incluyen primates, perros, gatos, ratones, etc.
Al sujeto se le puede haber diagnosticado anteriormente o no que tiene cáncer de próstata.
En ciertas realizaciones no limitantes, una muestra incluye, sin limitación, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma sanguíneo, fluido biológico (por ejemplo, sangre, plasma, suero, heces, orina, fluido linfático, ascitis, lavado ductal, saliva y líquido cefalorraquídeo) y muestras tisulares. El origen de la muestra puede ser tejido sólido (por ejemplo, de un órgano fresco, congelado y/o conservado, una muestra de tejido, una biopsia o un aspirado), sangre o cualquier componente sanguíneo, fluidos corporales (como, por ejemplo, orina, linfa, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido peritoneal o líquido intersticial) o células del individuo, incluidas las células cancerosas en circulación. En determinadas realizaciones no limitantes, la muestra se obtiene de un cáncer. En determinadas realizaciones, la muestra puede ser una “muestra de biopsia” o “muestra clínica”, que son muestras derivadas de un sujeto. En ciertas realizaciones, la muestra incluye una o más células de cáncer de próstata de un sujeto. En ciertas realizaciones, los uno o más genes de fusión pueden ser detectados en una o más muestras obtenidas de un sujeto.
En ciertas realizaciones no limitantes, el gen de fusión es detectado mediante análisis de hibridación de ácidos nucleicos.
En ciertas realizaciones no limitantes, el gen de fusión es detectado mediante análisis de hibridación fluorescente in situ (FISH).
En ciertas realizaciones no limitantes, el gen de fusión es detectado mediante hibridación de ADN, tal como, sin limitación, análisis de transferencia Southern.
En ciertas realizaciones no limitantes, el gen de fusión es detectado mediante hibridación de ARN, tal como, sin limitación, análisis de transferencia Northern.
En ciertas realizaciones no limitantes, el gen de fusión es detectado mediante análisis de secuenciación de ácidos nucleicos.
En ciertas realizaciones no limitantes, el gen de fusión es detectado mediante sondas presentes en una matriz, un fragmento o una micromatriz de ADN.
En ciertas realizaciones no limitantes, el gen de fusión es detectado mediante un método que comprende la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (“RT-PCR”). En ciertas realizaciones no limitantes, el gen de fusión es detectado mediante un método que comprende la RT-PCR usando los uno o más pares de cebadores dados a conocer en la presente memoria (véase la Tabla 3).
En ciertas realizaciones no limitantes, el gen de fusión es detectado mediante análisis de unión de anticuerpos, tal como, sin limitación, análisis de inmunoelectrotransferencia Western e inmunohistoquímica.
En ciertas realizaciones no limitantes, cuando un gen de fusión combina genes que no están presentes normalmente en el mismo cromosoma, el análisis FISH puede demostrar sondas que se unen al mismo cromosoma. Por ejemplo, el análisis puede centrarse en el cromosoma en el que reside normalmente un gen y luego se puede realizar un análisis de hibridación para determinar si el otro gen también está presente en ese cromosoma.
5.3 Métodos diagnósticos y métodos de tratamiento
La descripción da a conocer métodos para evaluar si un sujeto que tiene cáncer de próstata tiene un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad progresiva, un mayor riesgo de recaída y/o un mayor riesgo de recaída rápida. La descripción describe, además, métodos para tratar sujetos con un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad progresiva, con un mayor riesgo de recaída y/o con un mayor riesgo de recaída rápida.
“Mayor riesgo”, según se usa en la presente memoria, significa un riesgo mayor que los sujetos que carecen de uno o más de los genes de fusión descritos; en ciertas realizaciones no limitantes, el riesgo aumenta de manera que el cáncer de próstata progresivo se produce en más del 50 %, más del 60 % o más del 70 % de los individuos que portan dicho gen de fusión en una o más células de su cáncer de próstata.
5.3.1 Métodos diagnósticos para evaluar el riesgo de cáncer progresivo
La descripción da a conocer métodos para determinar si un sujeto tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo.
En ciertas realizaciones no limitantes, el método para determinar si un sujeto tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo comprende determinar si una muestra del sujeto contiene uno o más genes de fusión seleccionados del grupo constituido por TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM135-CCDC67, KDM4B-AC011523.2, MAN2A1-FER, PTEN-NOLC1, CCNH-C5orf30, ZMPSTE24-ZMYM4, CLTC-ETV1, ACPP-SEC131, SNPP-SEC131 o una combinación de los mismos, siendo la presencia de uno o más genes de fusión en la muestra indicativa de que el sujeto tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo.
En ciertas realizaciones, el método para determinar si un sujeto tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo comprende determinar la presencia y/o la ausencia de uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once o más, doce o más, trece o más, catorce o más de los genes de fusión descritos en la presente memoria en una muestra de un sujeto. En ciertas realizaciones, la muestra puede incluir una o más células de cáncer de próstata de un sujeto.
En ciertas realizaciones no limitantes, el método para determinar si un sujeto tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo comprende determinar si una muestra del sujeto contiene uno o más genes de fusión seleccionados del grupo constituido por TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, PTEN-NOLC1 o MTOR-TP53BP1, siendo la presencia de uno o más genes de fusión en la muestra indicativa de que el sujeto tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo.
5.3.2 Métodos diagnósticos para evaluar el riesgo de recaída del cáncer de próstata
La descripción da a conocer métodos para determinar si un sujeto tiene riesgo de recaída o de recaída rápida del cáncer de próstata.
En ciertas realizaciones no limitantes, un método para determinar si un sujeto tiene riesgo de recaída rápida de cáncer de próstata (reflejado, por ejemplo, en una duplicación del antígeno prostático específico (PSA) en suero en menos de 4 meses), comprende determinar la suma:
{[del vector de si el gen de fusión TMEM135-CCDC67 está presente en una célula tumoral del sujeto] multiplicado por 0,4127877};
más
{[el vector de si el gen de fusión KDM4B-AC011523.2 está presente en una célula tumoral del sujeto] multiplicado por 0,4091903};
más
{[el vector de si el gen de fusión MAN2A1-FER está presente en una célula tumoral del sujeto] multiplicado por 0,3879886};
más
{[el vector de si el gen de fusión CCNH-C5orf30 está presente en una célula tumoral del sujeto] multiplicado por (­ 2,0193237)};
más
{[el vector de si el gen de fusión TRMT11-GRIK2 está presente en una célula tumoral del sujeto] multiplicado por (­ 2,3301892)};
más
{[el vector de si el gen de fusión SLC45A2-AMACR está presente en una célula tumoral del sujeto] multiplicado por (­ 2,1499750)};
más
{[el vector de si el gen de fusión MTOR-TP53BP1 está presente en una célula tumoral del sujeto] multiplicado por (­ 2,1140216)};
más
{[el vector de si el gen de fusión LRRC59-FLJ60017 está presente en una célula tumoral del sujeto] multiplicado por (-0,8611482)};
en la que, si la suma de lo anterior es inferior a 0,0716, entonces el sujeto tiene un mayor riesgo de manifestar una recaída rápida del cáncer de próstata. En lo anterior, cuando el gen de fusión particular está presente, el valor del vector es [+1] y cuando el gen de fusión particular está ausente, el valor del vector es [0].
En ciertas realizaciones no limitantes, un método para determinar si un sujeto tiene riesgo de recaída del cáncer de próstata comprende determinar la suma:
{[del vector de si el gen de fusión TMEM135-CCDC67 está presente en una célula tumoral del sujeto] multiplicado por (-0,01752496)};
más
{[el vector de si el gen de fusión KDM4B-AC011523.2 está presente en una célula tumoral del sujeto] multiplicado por (-0,16638222)};
más
{[el vector de si el gen de fusión MAN2A1-FER está presente en una célula tumoral del sujeto] multiplicado por 0,67180725};
más
{[el vector de si el gen de fusión CCNH-C5orf30 está presente en una célula tumoral del sujeto] multiplicado por (­ 0,62367777)};
más
{[el vector de si el gen de fusión TRMT11-GRIK2 está presente en una célula tumoral del sujeto] multiplicado por (­ 2,44068688)};
más
{[el vector de si el gen de fusión SLC45A2-AMACR está presente en una célula tumoral del sujeto] multiplicado por (­ 2,18012958)};
más
{[el vector de si el gen de fusión MTOR-TP53BP1 está presente en una célula tumoral del sujeto] multiplicado por (­ 1,79668048)};
más
{[el vector de si el gen de fusión LRRC59-FLJ60017 está presente en una célula tumoral del sujeto] multiplicado por (-1,75487809)};
en la que, si la suma de lo anterior es inferior a 0,056, entonces el sujeto tiene un mayor riesgo de manifestar una recaída del cáncer de próstata. En lo anterior, cuando el gen de fusión particular está presente, el valor del vector es [+1] y cuando el gen de fusión particular está ausente, el valor del vector es [0].
En ciertas realizaciones no limitantes, el método para determinar si un sujeto tiene un mayor riesgo de recaída del cáncer de próstata comprende determinar si una muestra del sujeto contiene uno o más genes de fusión seleccionados del grupo constituido por TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM135-CCDC67, KDM4B-AC011523.2, MAN2A1-FER, PTEN-NOLC1, CCNH-C5orf30, ZMPSTE24-ZMYM4, CLTC-ETV1, ACPP-SEC13, DOCK7-OLR1, PCMTD1-SNTG1 o una combinación de los mismos, siendo la presencia de uno o más genes de fusión en la muestra indicativa de que el sujeto tiene un mayor riesgo de recaída, utilizando la siguiente fórmula:
Z=-0,0325*X 1,6219*Y [Fórmula 1] siendo X% la puntuación del nomograma de la probabilidad libre de progresión a cinco años después de la cirugía (X puede estar entre 0 y 100), y siendo Y la presencia de cualquiera de los genes de fusión (donde Y = 0 si no hay genes de fusión presentes, e Y = 1 si están presentes uno o más genes de fusión). En lo anterior, cuando Z>=-1,9, entonces el paciente tiene riesgo de presentar una recaída del cáncer de próstata y cuando Z<-1,9, entonces el paciente no tiene riesgo de presentar una recaída del cáncer de próstata.
5.3.3 Métodos de tratamiento
La descripción da a conocer, además, métodos para tratar a un sujeto que tiene un mayor riesgo de cáncer de próstata progresivo, de recaída del cáncer de próstata o de recaída rápida del cáncer de próstata.
En ciertas realizaciones, el método de tratamiento de un sujeto comprende determinar si el sujeto tiene un mayor riesgo de cáncer de próstata progresivo determinando la presencia de uno o más genes de fusión seleccionados del grupo constituido por TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM135-CCDC67, KDM4B-AC011523.2, MAN2A1-FER, PTEN-NOLC1, CCNH-C5orf30, ZMPSTE24-ZMYM4, CLTC-ETV1, ACPP-SEC13, DOCK7-OLR1, PCMTD1-SNTG1 o una combinación de los mismos en una muestra del sujeto, en donde si uno o más genes de fusión están presentes en la muestra, por lo que el sujeto tiene un mayor riesgo, entonces se trata al sujeto para producir un efecto anticanceroso. En ciertas realizaciones, el método puede incluir determinar la presencia o la ausencia de uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más o de los nueve genes de fusión descritos en el presente documento.
“Efecto anticanceroso” se refiere a una o más de una reducción en la masa celular cancerosa agregada, una reducción en la tasa de crecimiento de las células cancerosas, una reducción en el avance del cáncer, una reducción en la proliferación de células cancerosas, una reducción en la masa tumoral, una reducción en el volumen del tumor, una reducción en la proliferación de células tumorales, una reducción en la tasa de crecimiento del tumor y/o una reducción en la metástasis del tumor. En determinadas realizaciones, un efecto anticanceroso puede referirse a una respuesta completa, una respuesta parcial, una enfermedad estable (sin progresión ni recaída), una respuesta con recaída posterior o supervivencia libre de progresión en un paciente diagnosticado con cáncer.
En ciertas realizaciones, el método de tratamiento de un sujeto comprende determinar si el sujeto tiene un mayor riesgo de cáncer de próstata progresivo determinando la presencia de uno o más genes de fusión seleccionados del grupo constituido por TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, PTEN-NOLC1 o MTOR-TP53BP1 o una combinación de los mismos en una muestra del sujeto, en donde, si se detectan uno o más genes de fusión en la muestra, por lo que el sujeto tiene riesgo, entonces se trata al sujeto para producir un efecto anticanceroso.
En ciertas realizaciones, el método de tratamiento de un sujeto comprende determinar si un paciente tiene un mayor riesgo de recaída del cáncer de próstata o de recaída rápida, según se ha descrito anteriormente en la sección 5.3, donde si el sujeto tiene un mayor riesgo de recaída rápida del cáncer de próstata, entonces se trata al sujeto para producir un efecto anticanceroso en el sujeto.
En ciertas realizaciones, el método para tratar a un sujeto comprende determinar si el sujeto tiene un mayor riesgo de cáncer de próstata progresivo, de recaída del cáncer de próstata o de recaída rápida como se ha descrito anteriormente, donde, si el sujeto tiene un mayor riesgo de cáncer de próstata progresivo, de recaída del cáncer de próstata o de recaída rápida, se administra a continuación al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor. En determinadas realizaciones, el inhibidor se puede administrar para producir un efecto anticanceroso en un sujeto.
“Cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad que puede lograr uno o más de los siguientes: un efecto anticanceroso, prolongación de la supervivencia y/o prolongación del periodo hasta la recaída.
En ciertas realizaciones, el método de tratamiento de un sujeto está dirigido a inhibir el gen de fusión y/o inhibir el producto del gen de fusión; por ejemplo, la proteína y/o el ARN codificado por el gen de fusión.
Ejemplos de inhibidores incluyen, sin limitación, compuestos, moléculas, productos químicos, polipéptidos y proteínas que inhiben y/o reducen la expresión y/o la actividad de la proteína codificada por un gen de fusión. Alternativa o adicionalmente, el inhibidor puede incluir compuestos, moléculas, productos químicos, polipéptidos y proteínas que inhiben y/o reducen la expresión y/o la actividad de una o más dianas aguas abajo del gen de fusión. Ejemplos adicionales no limitantes de inhibidores incluyen ribozimas, oligonucleótidos antisentido, moléculas de ARNhc y moléculas de ARNip que inhiben o reducen específicamente la expresión y/o la actividad del gen de fusión y/o inhiben o reducen la expresión y/o la actividad de una o más dianas aguas abajo del gen de fusión. Un ejemplo no limitante de un inhibidor comprende una secuencia de ácido nucleico antisentido, ARNhc o ARNip homóloga a al menos una porción de la secuencia del gen de fusión, siendo la homología de la porción relativa a la secuencia del gen de fusión al menos aproximadamente el 75 o al menos aproximadamente el 80 o al menos aproximadamente el 85 o al menos aproximadamente el 90 o al menos aproximadamente el 95 o al menos aproximadamente el 98 por ciento, pudiendo determinarse el porcentaje de homología, por ejemplo, mediante el soporte lógico BLAST o FASTA. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos antisentido, ARNhc o ARNip puede ser homóloga a la secuencia en el “fragmento de unión” que abarca el límite entre los genes empalmados del gen de fusión. En la Tabla 1 se muestran ejemplos no limitantes de ARNip homólogos a las secuencias de los fragmentos de unión de los genes de fusión divulgados.
En ciertas realizaciones no limitantes, la porción complementaria puede constituir al menos 10 nucleótidos o al menos 15 nucleótidos o al menos 20 nucleótidos o al menos 25 nucleótidos o al menos 30 nucleótidos, y las moléculas de ácido nucleico antisentido, ARNhc o ARNip pueden ser de hasta 15 o hasta 20 o hasta 25 o hasta 30 o hasta 35 o hasta 40 o hasta 45 o hasta 50 o hasta 75 o hasta 100 nucleótidos de longitud. Las moléculas antisentido, ARNhc o ARNip pueden comprender ADN o residuos atípicos o no naturales; por ejemplo, pero sin limitación, residuos de fosforotioato y ácidos nucleicos bloqueados.
En ciertas realizaciones, un inhibidor puede incluir un anticuerpo, o un derivado del mismo, que se une específicamente, inhibe y/o reduce la expresión y/o la actividad de la proteína codificada por el gen de fusión; por ejemplo, un anticuerpo antagonista. Alternativa o adicionalmente, un inhibidor puede incluir un anticuerpo, o un derivado del mismo, que se une específicamente e inhibe y/o reduce la expresión y/o la actividad de una o más dianas aguas abajo del gen de fusión. La frase “se une específicamente” se refiere a la unión, por ejemplo, de un anticuerpo a un epítopo o antígeno o determinante antigénico de tal manera que la unión pueda desplazarse o competir con una segunda preparación de epítopo, antígeno o determinante antigénico idéntico o similar. Ejemplos no limitantes de anticuerpos, y derivados de los mismos, que pueden usarse en los métodos divulgados incluyen anticuerpos policlonales o monoclonales, anticuerpos quiméricos, humanos, humanizados, primatizados (injertados en la CDR), recubiertos o monocatenarios, anticuerpos producidos en fase (por ejemplo, de bibliotecas de presentación de fagos), así como fragmentos de unión funcionales de anticuerpos. Los fragmentos de unión a anticuerpos, o porciones de los mismos, incluyen, pero sin limitación, Fv, Fab, Fab' y F(ab')2. Tales fragmentos se pueden producir mediante escisión enzimática o mediante técnicas recombinantes.
En ciertas realizaciones, cuando la proteína codificada por el gen de fusión detectado en la muestra del sujeto exhibe actividad quinasa, el método de tratamiento de un sujeto puede incluir administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor al sujeto que inhibe y/o reduce la actividad quinasa de la proteína codificada por el gen de fusión; es decir, un inhibidor de quinasa. Ejemplos no limitantes de inhibidores de la quinasa incluyen afatinib, alectinib, axitinib, bevacizumab, bosutinib, cetuximab, crizotinib, dasatinib, erlotinib, fostamatinib, gefitinib, GSK1838705A, ibrutinib, imatinib, lapatanibinibinib, nibrutinib, nibrutinib, lapatanibinib ranibizumab, ruxolitinib, sorafenib, sunitinib, su6656, trastuzumab, tofacitinib, vandetanib y vemurafenib. Por ejemplo, y no a modo de limitación, si la proteína codificada por el gen de fusión detectado en una muestra del sujeto exhibe actividad tirosina quinasa, se puede administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de tirosina quinasa.
En ciertas realizaciones, un método para tratar a un sujeto puede comprender determinar si el sujeto tiene un mayor riesgo de cáncer de próstata progresivo determinando la presencia de MAN2A1-FER en una muestra del sujeto, en donde, si el gen de fusión MAN2A1-FER está presente en la muestra, se trata a continuación al sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de FER. Ejemplos no limitantes de inhibidores de FER incluyen crisotinib, TAE684, WZ-4-49-8 y WZ-4-49-10. En realizaciones particulares no limitantes, el inhibidor de FER puede derivarse de compuestos de diaminopirimidina o pirazologirididina.
En la solicitud PCT n° WO 2009/019708 se dan a conocer ejemplos adicionales no limitantes de inhibidores de FER. En determinadas realizaciones, el inhibidor de FER puede incluir inhibidores de tirosina quinasa e inhibidores de ALK, ya que FER exhibe una alta similitud de secuencia con ALK.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de FER es un anticuerpo que reduce y/o inhibe la expresión y/o la actividad de la proteína MAN2A1-FER. En ciertas realizaciones, el inhibidor de FER comprende un ARNip que tiene como diana el gen de fusión MAN2A1-FER o la secuencia de unión del gen de fusión MAN2A1-FER. En la Tabla 1 se muestra un ejemplo no limitante de una secuencia de ARNip que tiene como diana el gen de fusión MAN2A1-FER.
Alternativa o adicionalmente, el método para tratar a un sujeto que expresa el gen de fusión MAN2A1-FER puede comprender administrar al sujeto un compuesto que reduce y/o inhibe la actividad y/o la expresión de una o más dianas aguas abajo del gen de fusión MAN2A1-FER. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el método puede incluir la inhibición del sistema de señalización EGFR-RAS-BRAF-MEk . Ejemplos no limitantes de compuestos que inhiben la actividad de EGFR incluyen erlotinib, cetuximab, gefitinib, bevacizumab, panitumumab y bortezomib. Un ejemplo no limitante de un compuesto que inhibe la actividad de BRAP incluye RAF265. Ejemplos no limitantes de compuestos que inhiben la actividad de MEK incluyen binimetinib, vemurafenib, PD-325901, selumetinib y trametinib. Ejemplos adicionales no limitantes de compuestos que inhiben el sistema de señalización EGFR-RAS-BRAF-MEK incluyen TAK-733, Honokiol, AZD8330, PD318088, BIX 02188, pimasertib, SL-327, BIX 02189, PD98059, MEK162, PD184352 y U0126-EtOH.
En ciertas realizaciones, un método para tratar a un sujeto puede comprender determinar si el sujeto tiene un mayor riesgo de cáncer de próstata progresivo determinando la presencia de SLC45A2-AMACR en una muestra del sujeto, en donde, si el gen de fusión SLC45A2-AMACR está presente en la muestra, se trata a continuación al sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la racemasa y/o un inhibidor de AMACR. Un ejemplo no limitante de inhibidores de la racemasa y/o de AMACR incluye ebselen, 2-(2,5-dihidroxi-4-metilfenil)-5-metilbenceno-1,4-diol (DMPMB), 2-metilsulfanil-7,9-dihidro-3H-purina-6,8-ditiona (MSDTP), 2,5-di(pirazol-1-il)benceno-1,4-diol (DPZBD), Rosa de Bengala, Rojo Congo, 3,5-di(piridin-4-il)-1,2,4-tiadiazol (DPTD), óxido de ebselen y coenzima A 3,7,12-trihidroxicolestanoílica (THCA-CoA). En realizaciones particulares no limitantes, el inhibidor de la racemasa puede ser un N-metiltiocarbamato. se describen En Wilson et al., Mol. Cancer Ther. (2011), 10 (5): 825-838 se dan a conocer otros ejemplos no limitantes de inhibidores de AMACR.
En ciertas realizaciones, el método para tratar a un sujeto comprende determinar si el sujeto tiene un mayor riesgo de cáncer de próstata progresivo, de recaída del cáncer de próstata o de recaída rápida, como se ha descrito anteriormente, en donde, si el sujeto tiene un mayor riesgo de cáncer de próstata progresivo, de recaída del cáncer de próstata o de recaída rápida, se le administra a continuación una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente anticanceroso. Un agente anticanceroso puede ser cualquier molécula, compuesto químico o composición que tenga un efecto anticanceroso. Agentes anticancerígenos incluyen, sin limitación, agentes quimioterapéuticos, agentes radioterapéuticos, citocinas, agentes antiangiogénicos, agentes inductores de apoptosis o inmunotoxinas anticancerosas. En determinadas realizaciones no limitantes, se puede administrar un inhibidor en combinación con uno o más agentes anticancerosos. “En combinación con”, como se usa en la presente memoria, significa que el inhibidor y uno o más agentes anticancerosos se administran a un sujeto como parte de un régimen o plan de tratamiento. Esta expresión no requiere que el inhibidor y/o el inhibidor de quinasa y uno o más agentes anticancerosos se combinen físicamente antes de la administración ni que se administren durante el mismo periodo de tiempo. Ejemplos no limitantes de agentes anticancerosos incluyen acetato de abiraterona, bicalutamida, cabazitaxel, casodex (bicalutamida), degarelix, docetaxel, enzalutamida, acetato de goserelina, jevtana (cabazitaxel), acetato de leuprolida, lupron (acetato de leuprolida), acetato de lupronida (leuprolida), Lupron Depot-3 meses (acetato de leuprolida), Lupron Depot-4 meses (acetato de leuprolida), Lupron Depot-Ped (acetato de leuprolida), clorhidrato de mitoxantrona, prednisona, Provenge (Sipuleucel-T), dicloruro de radio 223, Sipuleucel-T , Taxotere (docetaxel), Viadur (acetato de leuprolida), Xofigo (dicloruro de radio 223), Xtandi (enzalutamida), Zoladex (acetato de goserelina) y Zytiga (acetato de abiraterona).
En ciertas realizaciones, el método para tratar a un sujeto comprende determinar si el sujeto tiene un mayor riesgo de cáncer de próstata progresivo, de recaída del cáncer de próstata o de recaída rápida, según se ha descrito anteriormente, en donde, si el sujeto tiene un mayor riesgo de cáncer de próstata progresivo, de recaída del cáncer de próstata o de recaída rápida, se realizan a continuación una o más de crioterapia, radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal, terapia biológica, terapia con bisfosfonatos, ultrasonido concentrado de alta intensidad, monitorización frecuente, controles frecuentes del antígeno prostático específico (PSA) y prostatectomía radical. Un ejemplo no limitante de una terapia biológica es Sipuleucel-T. La terapia con bisfosfonatos incluye, sin limitación, clodronato o zoledronato. En ciertas realizaciones, estos métodos se pueden utilizar para producir un efecto anticanceroso en un sujeto.
La terapia hormonal puede incluir una o más orquiectomía y la administración de análogos y/o agonistas de la hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH), antagonistas de la LHRH, antiandrógenos o fármacos supresores de andrógenos. Ejemplos no limitantes de análogos y/o agonistas de LHRH incluyen leuprolida, goserelina y buserelina. Ejemplos no limitantes de antagonistas de LHRH incluyen abarelix, cetrorelix, ganirelix y degarelix. Fármacos anti-andrógenos incluyen, sin limitación, flutamida, bicalutamida, enzalutamida y nilutamida. Ejemplos no limitantes de fármacos supresores de andrógenos incluyen estrógenos, ketoconazol y aminoglutetimida. La monitorización frecuente puede incluir análisis de sangre de pSa , exámenes rectales digitales, ecografías y/o biopsias de próstata guiadas por ecografía transrrectal a intervalos regulares, por ejemplo, a intervalos de aproximadamente 3 a aproximadamente 6 meses, para controlar el estado del cáncer de próstata. La prostatectomía radical es un procedimiento quirúrgico que implica la extirpación de toda la glándula prostática y parte del tejido circundante. Las prostatectomías se pueden realizar mediante cirugía abierta o mediante cirugía laparoscópica.
En ciertas realizaciones, el método de tratamiento de un sujeto comprende determinar si un sujeto tiene un mayor riesgo de cáncer de próstata progresivo determinando la presencia de uno o más genes de fusión seleccionados del grupo constituido por TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM135-CCDC67, KDM4B-AC011523.2, MAN2A1-FER, PTEN-NOLC1, CCNH-C5orf30, ZMPSTE24-ZMYM4, CLTC-ETV1, ACPP-SEC13, DOCK7-OLR1, PCMTD1-SNTG1 o una combinación de los mismos en una muestra del sujeto, en donde, si se detectan uno o más genes de fusión en la muestra, se realiza a continuación una técnica de edición genómica dirigida en una o más células de cáncer de próstata dentro del sujeto.
En ciertas realizaciones, el método de tratamiento de un sujeto comprende determinar si un paciente tiene un mayor riesgo de recaída del cáncer de próstata o de recaída rápida según se ha descrito anteriormente en la sección 5.3, en donde, si el sujeto tiene un mayor riesgo de recaída del cáncer de próstata o de recaída rápida, se realiza a continuación una técnica de edición genómica dirigida en una o más células de cáncer de próstata dentro del sujeto.
La edición genómica es un método en el que las secuencias cromosómicas endógenas presentes en una o más células dentro de un sujeto pueden editarse —por ejemplo, modificarse— usando endonucleasas y ácidos nucleicos monocatenarios dirigidos. El método de edición genómica puede dar lugar a la inserción de una secuencia de ácido nucleico en una región específica dentro del genoma, a la escisión de una secuencia específica del genoma y/o a la sustitución de una secuencia genómica específica con una nueva secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el método de edición genómica puede incluir el uso de un ARN guía (ARNg), que incluye motivos adyacentes protoespaciadores (PAM), complementarios a una secuencia específica dentro de un genoma —por ejemplo, un punto de ruptura cromosómico asociado con un gen de fusión— para guiar una nucleasa —por ejemplo, una endonucleasa— hacia la secuencia genómica específica. Un ejemplo no limitante de una endonucleasa incluye la proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9). La endonucleasa puede dar como resultado la escisión de la secuencia del genoma diana y permitir la modificación del genoma en el sitio de escisión mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o recombinación homóloga. Un ejemplo no limitante del método de edición del genoma se describe en la Solicitud PCT n° WO 2014/093701.
En ciertas realizaciones, el método de edición genómica se puede utilizar para seleccionar como diana puntos de ruptura cromosómicos específicos de un gen de fusión presente en las células de cáncer de próstata. Dado que las células de próstata normales, no cancerosas, no contienen el gen de fusión y, por lo tanto, no contienen el punto de ruptura cromosómico asociado con el gen de fusión, las células de cáncer de próstata pueden constituirse específicamente en dianas mediante este método de edición genómica. Por ejemplo, y no a modo de limitación, la edición genómica se puede utilizar para promover la recombinación homóloga en un punto de ruptura cromosómico de un gen de fusión en una o más células de un sujeto para insertar una secuencia de ácido nucleico que codifica la timidina quinasa del virus del herpes simple 1 (HSV-1) en el punto de ruptura cromosómico. En ciertas realizaciones no limitantes, la secuencia de ácido nucleico de timidina quinasa de HSV-1 carece de un promotor y requiere integración en el genoma para su expresión. En ciertas realizaciones, se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del derivado de guanina, ganciclovir, o su homólogo oral, valganciclovir, a un sujeto que exprese la timidina quinasa de HSV-1. La timidina quinasa de HSV-1 puede fosforilar y convertir el ganciclovir y/o el valganciclovir en las formas trifosfato de ganciclovir y/o valganciclovir en una o más células de un sujeto. La forma trifosfato de ganciclovir y/o de valganciclovir es un inhibidor competitivo del trifosfato de desoxiguanosina (dGTP) y es un sustrato pobre de la elongación del ADN y puede dar lugar a la inhibición de la síntesis de ADN. La inhibición de la síntesis de ADN, a su vez, puede dar lugar a la reducción y/o la inhibición del crecimiento y/o supervivencia de las células de cáncer de próstata que contienen el punto de ruptura cromosómico diana y la secuencia integrada de ácidos nucleicos de timidina quinasa del virus del herpes simple 1 (HSV-1). Este método de edición genómica se puede utilizar para producir un efecto anticanceroso en un sujeto que se ha determinado que tiene un mayor riesgo de cáncer de próstata progresivo, de recaída del cáncer de próstata o de recaída rápida.
Tabla 1. Secuencias de ARNip
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El gen de cabeza está resaltado en verde y el gen de cola en amarillo. Las secuencias diana están subrayadas y en negrita.
5.4 Equipos
La descripción da a conocer equipos para detectar uno o más genes de fusión divulgados en la presente memoria y/o para implementar cualquiera de los métodos terapéuticos y de detección enumerados anteriormente.
Los tipos de equipos incluyen, sin limitación, conjuntos empaquetados de cebadores y sondas específicos a genes de fusión (por ejemplo, conjuntos de cebadores/sondas TaqMan), matrices/micromatrices, anticuerpos, que, además, contienen una o más sondas, cebadores u otros reactivos para detectar uno o más genes de fusión de la presente invención.
En ciertas realizaciones no limitantes, se proporciona un equipo que comprende uno o más cebadores o sondas de ácido nucleico y/o sondas de anticuerpos para usar en la realización de cualquiera de los métodos enumerados anteriormente. Dichas sondas pueden marcarse de forma detectable, por ejemplo, con biotina, marcador colorimétrico, fluorescente o radiactivo. Puede proporcionarse un cebador de ácido nucleico como parte de un par, por ejemplo, para su uso en la reacción en cadena de la polimerasa. En ciertas realizaciones no limitantes, un cebador de ácido nucleico puede tener al menos aproximadamente 10 nucleótidos o al menos aproximadamente 15 nucleótidos o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud y/o hasta aproximadamente 200 nucleótidos o hasta aproximadamente 150 nucleótidos o hasta aproximadamente 100 nucleótidos o hasta aproximadamente 75 nucleótidos o hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. Una sonda de ácido nucleico puede ser una sonda de oligonucleótidos y/o una sonda adecuada para el análisis FISH. En realizaciones específicas no limitantes, el equipo comprende cebadores y/o sondas para el análisis de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce de TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM135-CCDC67, KDM4B-AC011523.2, MAN2A1-FER, PTEN-NOLC1, CCNH-C5orf30, ZMPSTE24-ZMYM4, CLTC-ETV1, ACPP-SEC13, DOCK7-OLR1 y PCMTD1-SNTG1.
En ciertas realizaciones no limitantes, los cebadores y/o las sondas de ácido nucleico pueden inmovilizarse en un sustrato, superficie o soporte sólido, por ejemplo, en una micromatriz de ácido nucleico, en donde se conoce o es identificable la posición en la que cada cebador y/o sonda se une al soporte o superficie sólido. Los cebadores y/o las sondas de ácido nucleico pueden fijarse a un sustrato, como vidrio, plástico, papel, nailon u otro tipo de membrana, filtro, fragmento, perla o cualquier otro soporte sólido adecuado. Los cebadores y/o las sondas de ácido nucleico pueden sintetizarse directamente sobre el sustrato, o sintetizarse por separado del sustrato y luego fijarse al sustrato. Las matrices se pueden preparar usando métodos conocidos.
En realizaciones no limitantes, un equipo proporciona sondas de ácido nucleico para el análisis FISH de uno o más genes de fusión seleccionados del grupo constituido por: TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM135-CCDC67, CCNH-C5orf30, TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, KDM4B-AC011523.2, MAN2A1-FER, PTEN-NOLC1, MTOR-TP53BP1, ZMPSTE24-ZMYM4, CLTC-ETV1, ACPP-SEC13, DOCK7-OLR1 o PCMTD1-SNTG1. En realizaciones no limitantes, un equipo proporciona sondas de ácido nucleico para el análisis FISH de uno o más genes de fusión seleccionados del grupo constituido por: TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM135-CCDC67, PTEN-NOLC1 y CCNH-C5orf30, y TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, KDM4B-AC011523.2, MAN2A1-FER, MTORTP53BP1, ZMPSTE24-ZMYM4, CLTC-ETV1, ACPP-SEC13, DOCK7-OLR1 o PCMTD1-SNTG1. En realizaciones no limitantes específicas, se pueden proporcionar sondas para detectar un gen de fusión de manera que las sondas separadas se unan cada una a los dos componentes del gen de fusión o una sonda se puede unir a un “fragmento de unión” que abarca el límite entre los genes empalmados. En realizaciones no limitantes específicas, el equipo comprende dichas sondas para el análisis de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, seis, siete, ocho o los nueve de TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM135-CCDC67, KDM4B-AC011523.2, MAN2A1-FER, PTEN-NOLC1, CCNH-C5orf30, ZMPSTE24-ZMYM4, CLTC-ETV1, ACPP-SEC13, DOCK7-OLR1 o PCMTD1-SNTG1. En el Ejemplo 1 a continuación se proporciona un ejemplo de análisis FISH usado para identificar un gen de fusión.
En realizaciones no limitantes, un equipo proporciona cebadores de ácido nucleico para el análisis de PCR de uno o más genes de fusión seleccionados del grupo constituido por: TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM135-CCDC67, PTEN-NOLC1, CCNH-C5orf30, TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, KDM4BAC011523.2, MAN2A1-FER, MTOR-TP53BP1, ZMPSTE24-ZMYM4, CLTC-ETV1, ACPP-SEC13, DOCK7-OLR1 o PCMTD1-SNTG1. En realizaciones no limitantes, un equipo proporciona cebadores de ácido nucleico para el análisis de PCR de uno o más genes de fusión seleccionados del grupo constituido por: TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM135-CCDC67, PTEN-NOLC1 y CCNH-C5orf30, y TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, KDM4B-AC011523.2, MAN2A1-FER, MTOR-TP53BP1, ZMPSTE24-ZMYM4, CLTC-ETV1, ACPP-SEC13, DOCK7-OLR1 o PCMTD1-SNTG1. En realizaciones específicas no limitantes, el equipo comprende dichos cebadores para el análisis de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce de TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM135-CCDC67, KDM4B-AC011523.2, MAN2A1-FER, PTEN-NOLC1, CCNH-C5orf30, ZMPSTE24-ZMYM4, CLTC-ETV1, ACPP-SEC13, DOCK7-OLR1 y PCMTD1-SNTG1.
Los siguientes Ejemplos se ofrecen para ilustrar más completamente la divulgación, pero no debe interpretarse que sean limitantes del alcance de la misma.
6. Ejemplo 1: Eventos génicos de translocación y fusión en el cáncer de próstata progresivo
6.1 Resumen
Importancia: La predicción del resultado clínico del cáncer de próstata sigue siendo un reto importante después del diagnóstico. Se necesita con urgencia una prueba precisa y reproducible que prediga el comportamiento del cáncer de próstata.
Objetivo: Identificar biomarcadores que predicen la recurrencia del cáncer de próstata o del fallecimiento relacionado con el cáncer de próstata.
Diseño: Se secuenciaron el ADN genómico y/o el ARN total de diecinueve muestras de cáncer de próstata (T), tejidos de próstata benignos adyacentes adaptados (AT), sangres adaptadas (B) y próstatas de donantes de órganos (OD). Se descubrieron y validaron ocho nuevos genes de fusión. Estos 8 nuevos genes de fusión se analizaron luego en 174 muestras de próstata, incluidas 164 muestras de cáncer de próstata y 10 de donantes de órganos de próstata sanos. Se realizaron hasta 15 años de seguimientos clínicos en pacientes con cáncer de próstata.
Entorno: Centro Médico de la Universidad de Pittsburgh, ciudad universitaria Presbyterian y Shadyside.
Participantes: Se seleccionó a ciento sesenta y cuatro pacientes con cáncer de próstata sometidos a prostatectomía radical entre 1998 y 2012 para el análisis de expresión de genes de fusión. El 80,5 % (132/164) de los pacientes habían sido objeto de seguimiento durante al menos 5 años.
Medida principal: Identificar la presencia de cualquiera de los siguientes genes de fusión en muestras de cáncer de próstata: TMEM135-CCDC67, KDM4B-AC011523.2, MAN2A1-FER, TRMT11-GRIK2, CCNH-C5orf30, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1 y LRRC59-FLJ60017.
Resultados: Aproximadamente el 90 % de los hombres portadores de al menos uno de seis de estos genes de fusión (TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM135-CCDC67 y CCNH-C5orf30) experimentaron recaída del cáncer de próstata, metástasis y/o fallecimiento específico por cáncer de próstata después de una prostatectomía radical, mientras que estos resultados ocurrieron en solo el 36 % de los hombres que no portaban esos genes de fusión. Cuatro genes de fusión se presentaron exclusivamente en muestras de cáncer de próstata de pacientes que experimentaron recurrencia o fallecimiento relacionado con el cáncer de próstata. La formación de estos genes de fusión es el resultado de eventos de recombinación genómica.
Conclusión y relevancia: Estos hallazgos sugieren que la formación de estos genes de fusión está asociada con la recurrencia del cáncer de próstata y puede impulsar la progresión.
6.2 Introducción
A pesar de la alta incidencia1’ 2, solo una fracción de los hombres a los que se diagnostica cáncer de próstata desarrollan metástasis y aún menos mueren a causa de la enfermedad. La mayoría de los cánceres de próstata permanecen asintomáticos y clínicamente indolentes. Los mecanismos precisos para el desarrollo del cáncer de próstata progresivo y clínicamente preocupante siguen siendo difíciles de precisar. Además, la incapacidad de predecir la agresividad potencial del cáncer de próstata ha dado lugar a un sobretratamiento significativo de la enfermedad. La naturaleza dicotómica del cáncer de próstata —un subconjunto de neoplasias potencialmente fatales en el contexto más amplio de alteraciones histológicas que carecen de las características clínicas implícitas en esa etiqueta— es un reto fundamental en el tratamiento de la enfermedad.
Para identificar marcadores genómicos del cáncer de próstata, se realizó la secuenciación del genoma completo en 14 muestras de tejido prostático de 5 pacientes con cáncer de próstata: cinco cánceres de próstata (T) de pacientes que experimentaron malos resultados clínicos (recurrencia con aumento rápido del tiempo de duplicación del antígeno del cáncer de próstata (PSADT<4 meses)), cinco muestras de sangre (B) adaptadas y cuatro tejidos prostáticos benignos adaptados de los pacientes con cáncer de próstata (AT) (Tabla 2). En un paciente, no se disponía de tejido prostático adyacente normal. Se secuenció un promedio de 200 GB por muestra para lograr una cobertura de 33 veces de todo el genoma. Se secuenció el ARN total de todas las muestras de T y AT para lograr una cobertura > 1333 (promedio de 400 millones de lecturas/muestra) por gen. El ARN total de cuatro tejidos de próstata completamente benignos histológicamente, de la misma edad, recogidos de donantes de órganos sanos, se secuenció de forma similar como control tisular. Los datos de secuenciación se alinearon con el genoma de referencia humano HG193. A continuación, se identificaron y validaron los genes de fusión. Los inventores plantearon la hipótesis de que estos genes de fusión de muestras de cáncer que demuestran ser metastásicos están asociados a un resultado clínico desfavorable para los pacientes con cáncer de próstata. Se construyó un modelo de predicción para la recurrencia del cáncer de próstata y el tiempo de duplicación del antígeno específico a la próstata (PSADT) posoperatorio corto. A continuación, este modelo se aplicó a 89 muestras adicionales de cáncer de próstata del Centro Médico de la Universidad de Pittsburgh, a 30 muestras del Centro Médico de la Universidad de Stanford y a 36 muestras del Centro Médico Madison de la Universidad de Wisconsin con un seguimiento de 1 a 15 años. Ciento veintisiete de estas muestras son de pacientes que experimentaron recurrencia del cáncer de próstata después de la prostatectomía radical y 106 son de pacientes sin evidencia de recurrencia durante al menos 5 años después de la cirugía. Las 46 muestras restantes son de pacientes que tenían menos de 5 años de seguimiento y aún no habían experimentado recurrencia bioquímica.
Los genes de fusión recién validados se analizaron luego en 164 muestras de cáncer de próstata con un seguimiento clínico que varió de 2 a 15 años. Setenta y ocho de estas muestras son de pacientes que experimentaron recidiva del cáncer de próstata después de la prostatectomía radical, mientras que 54 son de pacientes que no tuvieron recidiva durante al menos 5 años después de la cirugía. Las muestras restantes son de pacientes que se sometieron a prostatectomía radical hacía menos de 5 años. Se analizó la asociación de la expresión de genes de fusión con la recurrencia del cáncer de próstata.
6.3 Métodos
Muestras tisulares. Se obtuvieron diecinueve muestras de cáncer de próstata (T), de tejidos prostáticos benignos adyacentes (AT) adaptados, de sangres adaptadas (B) y próstatas de donantes de órganos (OD) del Banco de Tejidos de la Universidad de Pittsburgh según las directrices reglamentarias institucionales (Tabla 2). Para asegurar una alta pureza (>80 %) de las células tumorales, los patólogos realizaron una microdisección con aguja para aislar las células tumorales de los tejidos normales adyacentes (a una distancia >3 mm del tumor). Para las muestras de AT y OD, se realizaron microdisecciones con aguja similares para lograr una pureza epitelial del 80 %. El ADN genómico de estos tejidos se extrajo utilizando un equipo de extracción de ADN tisular y sanguíneo disponible comercialmente (Qiagen, Hilden, Alemania). Los protocolos de obtención y procedimiento de tejido fueron aprobados por la Junta de Institucional de Inspección de la Universidad de Pittsburgh.
Preparación de la biblioteca de secuenciación del genoma completo y del transcriptoma. Para preparar las bibliotecas de ADN genómico, se sometió a 50 ng de ADN a las reacciones de marcado usando el equipo de preparación de muestras de ADN NEXTERA (Madison, Wisconsin) durante 5 min a 55 °C. A continuación, se amplificó el ADN con adaptador y cebadores de secuenciación durante 9 ciclos del siguiente procedimiento: 95 °C durante 10 s, 62 °C durante 30 s y 72 °C durante 3 min. Los productos de la PCR se purificaron con perlas Ampure. A continuación, se analizó la calidad de las bibliotecas de ADN genómico con qPCR usando cebadores de secuenciación de Illumina y se cuantificó con el bioanalizador Agilent 2000. Para la secuenciación del transcriptoma, se extrajo el ARN total de muestras de próstata usando Trizol y se trató con DNAse1. A continuación, se eliminó el ARN ribosómico de las muestras usando el equipo magnético RIBO-ZERO™ (Epicentre, Madison, Wisconsin). El ARN se transcribió de forma inversa a ADNc y se amplificó usando el equipo de preparación de muestras de TRUSEQ™ RNA v2 de Illumina, Inc (San Diego, California). Los procesos de preparación de la biblioteca, como adenilación, ligadura y amplificación, se realizaron siguiendo el manual proporcionado por el fabricante. La cantidad y la calidad de las bibliotecas fueron evaluadas como las descritas en la preparación de la biblioteca de ADN genómico.
Secuenciación del genoma completo y del transcriptoma. Se aplicó al análisis el sistema de secuenciación del genoma completo de Illumina. Los procedimientos de operación siguieron estrictamente las instrucciones del fabricante. Sucintamente, las bibliotecas de ADN se hibridaron con células de flujo y se sometieron a extensión de cebadores y amplificación de puente en un proceso cBot automático durante 4 h para generar grupos de plantillas de secuenciación de ADN. Estas células de flujo agrupadas fueron sometidas luego al análisis de secuenciación en el sistema Illumina HiSeq2000. Todas las muestras se secuenciaron con ejecuciones de extremos emparejados durante 200 ciclos.
Alineamiento de lecturas. Las lecturas de la secuencia de ADN del genoma completo de 5 T, 4 AT y 5 B se alinearon mediante BWA3 versión 1.4.1 contra el genoma de referencia humano UCSC hg19, permitiendo un máximo de 2 discrepancias de bases por lectura (100 nucleótidos). Después del alineamiento, la cobertura promedio de todo el genoma es superior a 30X para las 14 muestras. Se aplicó la herramienta de Picard (http://picard.sourceforge.net) para eliminar las lecturas duplicadas después del alineamiento. Las lecturas de la secuencia de ARN (de 5 T, 4 muestras de AT y 4 de OD adaptadas) tuvieron una cobertura promedio de 1333X. Las lecturas de secuencia de ARN del transcriptoma completo se alinearon con el genoma de referencia UCSC hg19 usando Tophat4-6 versión 1.4.1. Se permitieron 2 discrepancias máximas por lectura.
Detección de genes de fusión. Para identificar eventos de genes de fusión, los inventores aplicaron un algoritmo Fusioncatcher (v0.97) en muestras de secuenciación de ARN. Los resultados del análisis del soporte lógico habían sido validados con una alta tasa de precisión en líneas celulares de cáncer de mama. Tanto el alineamiento BOWTIE como el BLAT se aplicaron en el análisis y se presentaron gráficamente con el soporte lógico CIRCOS. La lista preliminar de transcritos de fusión candidatos se filtra en Fusioncatcher basándose en el conocimiento biológico existente de la bibliografía que incluye: (1) Si se sabe que los genes son el parálogo del otro en Ensembl; (2) Si uno de los transcritos de fusión es el pseudogén de la pareja; (3) Si uno de los transcritos de fusión es ARN micro/de transferencia/nuclear pequeño; (4) Si se sabe que el transcrito de fusión es un evento falso positivo (por ejemplo, una base de datos de genes combinados21); (5) Si se ha encontrado en muestras sanas (Illumina Body Map 2.0 [http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-513/]); (6) Si los genes de cabeza y de cola se superponen entre sí en la misma cadena. Los genes de fusión se visualizaron con el soporte lógico CIRCOS como se muestra en la Figura 6.
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Clasificador de aprendizaje automático para predecir el estado de recaída. Se usaron 8 genes de fusión procedentes de 5 muestras tumorales validadas por RT-PCR, secuenciación de Sanger y análisis de hibridación fluorescente in situ (FISH) como características para predecir el estado de recaída (rápida frente a no rápida y recaída frente a no recaída) en una gran cohorte de validación (PSADT<4 meses en contraposición con PSADT>15 meses o no recurrente). La presencia de cada par de fusión se codificó como 1 o 0 para representar si en la muestra existe el gen de fusión. Se utilizó el análisis discriminante lineal (LDA) para construir un clasificador. A la luz de la incidencia relativamente rara de los transcritos de fusión (4,4 %-9,0 %) en la cohorte de entrenamiento de Pittsburgh de los inventores de 90 muestras, los inventores también aplicaron una regla de predicción simple basada en la presencia en cualquier subconjunto de los ocho genes de fusión (es decir, se predice que un paciente es recurrente si existe algún transcrito de fusión en un subconjunto designado). Se aplicó la validación cruzada dejando uno fuera (LOOCV) para construir el modelo y evaluar el rendimiento de la predicción. Se construyeron curvas ROC variando los parámetros en la construcción del clasificador LDA y se seleccionó el modelo de predicción óptimo con el mejor índice de Youden (=sensibilidad+especificidad-1)22, y luego se evaluó en una cohorte de prueba de Pittsburgh de 89 muestras, una cohorte de prueba de Stanford de 21 muestras y una cohorte de prueba de Wisconsin de 30 muestras. Para comparar la significación estadística de la diferencia de AUC entre dos modelos, se usa una prueba de arranque para generar valores p23. Para comparar la precisión de dos modelos, se aplica una prueba para proporciones iguales usando “prop.test” en R.
Para demostrar el valor predictivo traslacional potencial de estos transcritos de fusión, se incorporó a los modelos de predicción de los inventores la información de la probabilidad de supervivencia libre de PSA a cinco años estimada por nomograma y las puntuaciones de Gleason de los pacientes. Se generaron los siguientes modelos: (I) 8 transcritos de fusión solos, (II) Puntuaciones de Gleason solas, (III) Valores de nomograma solos, (IV) Puntuaciones de Gleason 8 transcritos de fusión, (V) valores de nomograma 8 transcritos de fusión. En las Tablas 7-16 está disponible la información completa sobre la precisión, la sensibilidad, la especificidad y el índice de Youden de la predicción para estos ocho modelos.
RT-PCR. Para verificar los genes de fusión detectados por la secuenciación del transcriptoma y del genoma completo, se realizó una transcripción inversa del ARN total con hexámero aleatorio. Se sintetizó ADNc bicatenario como se ha descrito anteriormente9, 10. Se realizaron PCR usando los cebadores indicados en la Tabla 3 usando la siguiente condición: 94 °C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 61 °C durante 1 min y 72 °C durante 2 min.
Tabla 3. Secuencias de cebadores para RT-PCR
Genes de fusión Secuencias______________________________ _____________________________
TMEM13S-CCDC67 5^TTGGCATGATAGACeAGTCCC~375'~CAGCACCAAGGGAATGTGTAG-3' (SEQ ID NO 58/SEQ ID NO 59) M t0 f‘TP53BPl 5'*TTGGCATGATAGACCAGTCCC-375*-CAGCACCAAGGGAATGTGTAG-3* (SEQ ID NO 60/SEQ ID NO 61) TKMTn-GBUÜ 5'-GCGCTGXCGTGTACCCT7AAC*3Y5'-GGTAAGGGTAGTATTGGGrAGC-3' (seo id no 62/seq id no 63) CCNH~C5orf3Q S'-CCAGGGCTGGAATTACTATGG-3V5'-AAGCACCAGTCTGCACAATCC-3' (SEO ID NO 64/SEQ ID NO 65) $LC45AÍ-ÁMACK 5-TT GATGT CT GCTCCCATCAGG-3 Y5-TGATATCGTG6CCAGCTAACC-3' (SEQ ID NO 66/SEQID N067> KDM48- ACÜUSM2 5'~AACACGCCCTACCTGTACTTC-375 -CTG ASCAAAGACAGC AAC ACC-3' (SEQ id no 68/seq id no 69) MAN2AXT£ft 5f-TGGAAGT^CAAGTCAGC6CAG-3'/S'-GCTGTCTTTGTGTGCAAACTCC-3' (SEQ ID NO 70/SEQ ID NO 71) LRHCStbfU&QCl 7 S'-GTGACTGCTTGGATGAGAAGC-3'/5'-CCAGCATGCAGCTTTTCTGAG-3' (seq id no 72/seq id no 73) TMPPSS2-EBO 5 'AGTAGGC6CGAGtTAAG€AGG-375'~GGG ACAGTCTGAATCATGTC03 ' <SEQ ID NO 74/SEQID NO 75)
(3-actina 5'-TCAAGATCATTGCTCCnXCTGAGC-375'-TGCTGTeACCTTCACCGTTGCAGT-3'(SEQ ID NO 76/SEQ ID NO 77)
Hibridación fluorescente in situ. Se colocaron portaobjetos de tejidos fijados en formol y embebidos en parafina (5 micrómetros) en 2XSSC a 37 °C durante 30 min. A continuación, se retiraron los portaobjetos y se deshidrataron en etanol al 70 % y al 85 % durante 2 min cada uno a temperatura ambiente y se secaron al aire. El ADN de los clones seleccionados (Tabla 4) se extrajo usando el equipo Nucleobond AX (Macherey-Nagel, Easton, Pensilvania). Las sondas marcadas con biotina se prepararon utilizando un procedimiento estándar de traslación de mellas y se hibridaron con portaobjetos de muestras como se ha descrito anteriormente11, 12.
Tabla 4. Clon de cromosomas bacterianos artificiales para FISH____________
Genes de fusión Sonda 1 Sonda 2
TMEMJ 35-CCDC67 RP11-80F20 RP11-1034E22
Mtor-TP53BPJ RP4-647M16 RP11-114F23
TRMT11-GRIK2 RP11-92N18 RP11-70117
CCNH-C5orf30 RP11-111M24 RP11-244M13
SLC45A2-AMACR RP11-179D3 RP11-1072121
KDM4B-AC011523.2 RP11-241K5 RP11-655K24
MAN2A1-FER RP11-452L20 RP11-328A14
LRRC59-SLC35B3 RP11-269110 RP11-360D22
LRRC59-FLJ60017 RP11-269110 CTD-2116N11
6.4. Resultados
Genes de fusión descubiertos por ARN y secuenciación del genoma completo. El programa Fusioncatcher7 identificó un total de 76 eventos de fusión de ARN en muestras de cáncer de próstata. Trece de estos eventos de fusión fueron sugeridos por secuenciación del genoma. Para controlar los eventos de genes de fusión basados en tejidos, se eliminaron los genes de fusión presentes en cualquiera de los cuatro tejidos prostáticos de donantes de órganos de la misma edad (Tabla 5). Además, también se eliminaron los genes de fusión con menos de 20 kb entre cada elemento y leídos en la dirección cis. Como resultado de este filtrado, 28 de 76 eventos de genes de fusión se identificaron como específicos del cáncer de próstata (Tabla 6 y Figura 6). Entre estos eventos de fusión, se encontró el TMPRSS2-ERG, el gen de fusión del cáncer de próstata más común13-15, en dos muestras de cáncer de próstata. La mayoría de los eventos de fusión identificados son nuevos y no están documentados en la bibliografía. Ninguno de los 29 genes de fusión fue identificado en el análisis del transcriptoma AT adaptado. Para validar estos genes de fusión, se realizó una RT-PCR usando cebadores específicos para regiones de genes de fusión que abarcan los puntos de ruptura de fusión y se secuenciaron los productos de PCR. Ocho de estos eventos de genes de fusión se validaron mediante secuenciación (Figura 1).
Cinco de los ocho eventos de fusión dieron lugar al truncamiento de un gen conductor y un cambio en el marco de lectura en la traducción de un gen pasajero. Uno de los genes de fusión produjo una ciclina H truncada y un marco de lectura abierto independiente de una proteína nueva cuya función se desconoce. Sin embargo, dos eventos de fusión produjeron proteínas quiméricas que posiblemente conservan al menos la función parcial de ambos genes. Uno de estos productos de fusión son los 703 aminoácidos del N-terminal de a-manosidasa 2A (MAN2A1) que se fusionan con los 250 aminoácidos del C-terminal de FER, una tirosina quinasa felina. La proteína de fusión retiene el dominio glucosidasa, pero su dominio manosidasa se reemplaza por un dominio tirosina quinasa de FER. Otro producto de proteína de fusión produce una quimera de proteína transportadora asociada a membrana (SLC45A20) y alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR). La proteína quimérica tiene 5 de sus 10 dominios transmembranales eliminados de SLC45A2 y reemplazados con dominio metil-acil CoA transferasa de AMACR. Curiosamente, tanto la fusión MAN2A1-FER como la SLC45A2-AMACR están en la dirección trans, lo que elimina la posibilidad de un evento de fusión por una simple deleción cromosómica o el colapso de un transcrito de ARN sumamente grande.
La hibridación fluorescente in situ sugiere la recombinación genómica subyacente a la formación del gen de fusión. Para investigar el mecanismo de estos eventos de fusión, se realizó hibridación fluorescente in situ (FISH) en tejidos de cáncer de próstata en los que estaba presente el gen de fusión. Usando las sondas que rodean el punto de ruptura de MAN2A1, se observó una separación física de señales entre 5' y 3' MAN2A1 en células cancerosas que contenían el gen de fusión, a diferencia de la naturaleza superpuesta de estas señales en los alelos de tipo natural en células epiteliales de próstata normales (Figura 2). Se produjo una hibridación de “ruptura” similar en muestras de cáncer de próstata positivas para SLC45A2-AMACR (Figura 2B). Estos hallazgos indican que las fusiones MAN2A1-FER y SLC45A2-AMACR son el resultado de la recombinación cromosómica. Curiosamente, en las células de cáncer de próstata que contienen señales de “ruptura” de MAN2A1, solo el 31 % de las células retuvieron la señal del extremo 3', lo que sugiere que la recombinación del ADN genómico en la mayoría de las células de cáncer de próstata da como resultado el truncamiento del extremo C-terminal de MAN2A1. Se encontró una “pérdida colateral” similar del N-terminal de AMACR en las células de cáncer de próstata que expresan la fusión SLC45A2-AMACR (el 29 % retiene la señal N-terminal de AMACR). Otros análisis FISH confirman que las translocaciones genómicas se producen en las células cancerosas que expresan los genes de fusión TRMT11-GRIK2, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM137-CCDC67, CCNH-C5orf30 y KDM4B-AC011523.2 (Figuras 2C-G). Estos genes de fusión están separados por un gran segmento de ADN genómico (TRMT11-GRIK2, TMEM135-CCDC67, CCNH-C5orf30 y KDM4BAC011523.2) o ubicados en cromosomas separados (MTOR-TP53BP1 y LRRC59-FLJ60017). Las señales de unión de las hibridaciones en las células de cáncer de próstata sugieren que estos genes de fusión se reubicaron para yuxtaponerse a sus parejas de fusión. Finalmente, se identificaron los puntos de ruptura genómicos en 3 pares de fusión mediante la secuenciación de Sanger del ADN genómico del cáncer (CCNH-C5orf30, TMEM135-CCDC67 y LRRC59-FLJ60017) (Figura 11).
Asociación de genes de fusión con la recurrencia del cáncer de próstata. Una alteración genómica en el cáncer de próstata sin consecuencias clínicas es de importancia limitada. Por lo tanto, se investigó la asociación de estos genes de fusión con la progresión del cáncer de próstata en muestras de cáncer de próstata obtenidas de 213 hombres y de tejidos prostáticos totalmente benignos obtenidos de 10 donantes de órganos libres de enfermedad urológica de entre 20 y 70 años. Las muestras de cáncer de próstata se vincularon a los resultados clínicos después de la prostatectomía radical: aquellos sin recurrencia detectable del antígeno específico a la próstata (PSA) después de un mínimo de cinco años de observación, aquellos cuyos resultados clínicos se desconocen y aquellos que tuvieron una recurrencia de PSA observada dentro de los cinco años. Para 179 de las 223 muestras de cáncer de próstata, se dispuso de datos de resultados clínicos después de la prostatectomía radical, y 81 no tuvieron recurrencia detectable del antígeno específico a la próstata (PSA) después de un mínimo de cinco años de seguimiento, mientras que 98 desarrollaron recurrencia bioquímica (definida como PSA medible > 0,2 ng/ml). Solo el 7,4% (6/81) de los cánceres de próstata primarios expresaron uno de los genes de fusión en pacientes no recurrentes. Por el contrario, el 52 % (51/98) de los cánceres de próstata primarios expresaron al menos una fusión en pacientes que desarrollaron recurrencia (Figura 3 y Figura 7A). No se detectó ningún gen de fusión en tejidos de próstata benignos obtenidos de donantes de órganos sanos (Figura 7B). Se observaron tres eventos de fusión exclusivamente en el cáncer de próstata recurrente después de la prostatectomía radical (TRMT11-GRIK2, MTOR-TP53BP1 y LRRC59-FLJ60017; Figuras 3A y B).
La prueba exacta de Fisher mostró una diferencia significativa en el estado recurrente entre los pacientes con al menos uno de los 8 transcritos de fusión y los que no (p = 6,8*10-16). En los conjuntos de datos combinados de UPMC, Stanford y Wisconsin, el 91 % (69/76) de los pacientes positivos para uno de los transcritos de fusión experimentaron una recurrencia del cáncer de próstata en los 5 años posteriores a la resección de la próstata. Con base en la hipótesis de que la presencia de al menos uno de los 8 transcritos de fusión indicaría una recurrencia para un paciente con cáncer de próstata, se construyó y probó un modelo de predicción del cáncer de próstata, utilizando 90 muestras de cáncer de próstata seleccionadas al azar del Centro Médico de la Universidad de Pittsburgh (conjunto de entrenamiento). Esta cohorte de entrenamiento produjo una precisión en la predicción de la recurrencia del cáncer de próstata del 71 % con una especificidad del 89 % y una sensibilidad del 58 % (p<0,005) (Figura 12A, Tabla 10). Cuando este modelo se aplicó a una cohorte separada de 89 muestras (conjunto de prueba), el modelo predijo correctamente la recurrencia en el 70 % de los pacientes. Para validar aún más este modelo, los inventores probaron su desempeño en una cohorte de 30 pacientes (21 con seguimiento clínico cualificado) del Centro Médico de la Universidad de Stanford y una cohorte de 36 pacientes (30 con seguimiento clínico cualificado) del Centro Médico Madison de la Universidad de Wisconsin (Figura 3, Figura 8 y Figura 9). Una vez más, el modelo predijo correctamente la recurrencia con 76,2 % de precisión y con 89 % de especificidad y 67 % de sensibilidad en la cohorte de cáncer de próstata de Stanford, y 80% de precisión y con 100% de especificidad y 63% de sensibilidad en la cohorte de Wisconsin (Tabla 11).
De manera similar a la naturaleza dicotómica del cáncer de próstata en general, el cáncer de próstata recurrente puede progresar de manera indolente o agresiva. Un tiempo de duplicación de PSA (PSADT) de menos de cuatro meses después de la prostatectomía radical está muy asociado con el desarrollo temprano de la enfermedad metastásica y el fallecimiento específico por cáncer de próstata, mientras que estos eventos son raros y remotos en hombres con PSADT de más de 15 meses16, 17. Se encontró una fuerte asociación entre los genes de fusión (por ejemplo, TRMT11-GRIK2, SLC45A2-AMACR, MTOR-TP53BP1, LRRC59-FLJ60017, TMEM135-CCDC67 y CCNH-C5orf30) con la recurrencia del cáncer de próstata (p = 4,2*10-9) y un PSADT inferior a cuatro meses (p = 6*10-9). Para examinar si estos eventos de genes de fusión tienen valor pronóstico para el resultado clínico del cáncer de próstata, se realizaron análisis de curva operativa del receptor (ROC) con ponderaciones variables de los genes de fusión. Como se muestra en la Figura 3C, el panel de ocho genes de fusión predijo correctamente el 74,4 % para el tiempo de duplicación del PSA en menos de cuatro meses en la cohorte de entrenamiento de 90 muestras, y el 67 % para la recurrencia del cáncer de próstata. Para optimizar el modelo de predicción, se seleccionaron seis genes de fusión para una mejor asociación con la supervivencia libre de enfermedad después de la prostatectomía radical. Cuando se aplicó el mismo algoritmo a un conjunto de pruebas de 89 muestras separado del Centro Médico de la Universidad de Pittsburgh y a una cohorte de 21 muestras del Centro Médico de la Universidad de Stanford, se encontró que la tasa de predicción para PSADT<4 meses era del 78 % y el 71 %, respectivamente (Figura 4B). Como se muestra en la Figura 3D, el 89,5 % de los pacientes tuvo una recurrencia de la enfermedad observada dentro de los cinco años de la prostatectomía radical si portaban alguno de los seis genes de fusión. Además, y como se muestra en la Figura 4C, el 84,2 % de los pacientes tuvieron una recurrencia de la enfermedad observada dentro de los cinco años de la prostatectomía radical si portaban alguno de los ocho genes de fusión. Ningún paciente sobrevivió cinco años sin recurrencia si su cáncer de próstata primario contenía un gen de fusión TRMT11-GRIK2 o MTOR-TP53BP1. En cambio, el 68 % de los pacientes estaban libres de recurrencia de la enfermedad si no se detectaba ninguno de los nuevos genes de fusión en su cáncer de próstata primario. También se identificaron hallazgos similares en la cohorte de Stanford: el 88,9 % de los pacientes experimentaron recurrencia del cáncer de próstata si llevaban algún transcrito de fusión, mientras que el 66,7 % de los pacientes estaban libres de recurrencia de la enfermedad si eran negativos.
Tabla 5
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Los eventos de fusión más frecuentes en el cáncer de próstata son TRMT11-GRIK2 (7,9 % o 22/279) y SLC45A2-AMACR (7,2% o 20/279) (Figuras 3A, 7-9). La fusión TRMT11-GRIK2 representa un truncamiento gigante de TRMT11, una metiltransferasa de ARNt, y la eliminación de GRIK2, un receptor de glutamato, pero que está documentado que posee actividad supresora de tumores18. De hecho, GRIK2 no se expresó en muestras de cáncer de próstata que contienen fusiones TRMT11-GRIK2, mientras que se detectó en muestras de próstata de donantes de órganos (Figura 10). Solo 4 de 14 muestras con TRMT11-GRIK2 expresaron TRMT11 sin fusión de longitud completa. Por tanto, el evento de fusión de TRMT11-GRIK2 representa una pérdida de función en lugar de una ganancia.
La combinación de la detección de transcritos de fusión y los parámetros clínicos/patológicos mejoró la tasa de predicción de la recurrencia del cáncer de próstata. Las muestras de cáncer de próstata con al menos un transcrito de fusión se correlacionan con una fase más avanzada del cáncer de próstata (p=0,004), el estado de afectación de los ganglios linfáticos (P=0,005) y puntuaciones de nomograma más bajas (p=0,0003) (Tabla 12). La clasificación de Gleason por sí sola produjo una tasa de predicción de recurrencia del cáncer de próstata del 61,1 %, con una especificidad del 85,7 % y una sensibilidad del 39,6 % en la cohorte de entrenamiento UPMC de 90 muestras, cuando se utilizó Gleason>8 como punto de corte para predecir la recurrencia del cáncer de próstata. El modelo de Gleason arrojó una precisión de predicción que varió del 57 al 60 % en 3 cohortes de prueba separadas (Tablas 13 y 14). Sin embargo, cuando el estado de los transcritos de fusión se combinó con una clasificación de Gleason>8, se encontró una mejora de la predicción para las 4 cohortes: 72 % para la cohorte de entrenamiento UPMC, 74 % para la cohorte de prueba UPMC, 76 % para la cohorte de Stanford y 90 % para la cohorte de Wisconsin. La ROC mostró un AUC (área bajo la curva, por sus siglas en inglés) significativamente mayor (0,84 frente a 0,67, P = 6,6*10-7) y una mayor precisión de la prueba (77,7 % frente al 59,7 %, P=0,0019) (Figura 5A) cuando se combinó la puntuación de Gleason con detección de cualquiera de los 8 transcritos de fusión. De manera similar, la predicción del nomograma de la recurrencia del cáncer de próstata tiene la mejor precisión del 76 % con una sensibilidad del 68,8 % y una especificidad del 83,3 % en el análisis de la cohorte de entrenamiento UPMC de 90 muestras (Tabla 15). Cuando este modelo se aplicó a las pruebas de UPMC, a las cohortes de Stanford y Wisconsin de forma independiente, los resultados mostraron que la precisión de la predicción osciló entre el 60 % y el 75 % entre las 3 cohortes (Tabla 16). Cuando se combinó el nomograma con el estado de 8 transcritos de fusión utilizando la técnica LDA para construir un clasificador, la precisión de la predicción mejora al 81-83% entre las cohortes de prueba (Tabla 16). La ROC mostró un aumento del AUC de 0,76 a 0,87 (P=0,0001) y una mejora de la precisión del 69 % al 81 % (P=0,026, Figura 5B). Como resultado, los inventores llegaron a la conclusión de que el clasificador que combina el nomograma y el panel de 8 genes de fusión genera la mejor precisión de predicción que supera a cada herramienta de diagnóstico por sí sola.
6.5 Exposición
Las secuencias del transcriptoma y del genoma completo revelaron numerosos transcritos de ARN de fusión que se producían no solo en el cáncer de próstata sino también en muestras de próstata de donantes de órganos sanos (Tabla 17). Algunos de estos eventos de fusión se pueden verificar mediante secuenciación en los productos de ADNc. Se desconocen las funciones de estos nuevos transcritos. Dado que la mayoría de estos transcritos de ARN quimérico en individuos sanos son productos de empalme de dos genes adyacentes, es probable que sean las nuevas isoformas de los genes existentes. Estos “genes” independientes previamente definidos en el transcrito podrían ser una de las isoformas empalmadas preferidas de los genes más grandes existentes.
Tabla 6. Transcritos de fusión putativos de 5 muestras de cáncer de próstata
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Este análisis revela un número significativo de eventos de genes de fusión específicos del cáncer. Estas fusiones no son detectables ni en la próstata del donante de órganos ni en los tejidos benignos de la próstata de los pacientes con cáncer de próstata. La mayoría de estos transcritos de fusión parecen expresarse en baja abundancia, detectándose solo un promedio de 6,6 lecturas de estos transcritos de fusión en una secuenciación>1333x. De hecho, cuando la cobertura se redujo a 600x en los estudios de simulación, solo se detectó MTOR-TP53BP1 de manera sistemática. Las características de estos genes de fusión son que tienen una gran distancia entre los genes de unión o tienen una dirección transversal de fusión que solo podría ocurrir cuando se produce la recombinación cromosómica. En cualquier escenario, la alteración del ADN en el ámbito del genoma debe ser el mecanismo subyacente.
Aunque la asociación entre los ocho nuevos transcritos de fusión y la recurrencia del cáncer de próstata es sorprendente, aún no se han aclarado las funciones biológicas de estos transcritos de fusión. Dada la función conocida de los genes que contribuyen a los transcritos de fusión, su formación puede tener impacto en varios sistemas celulares, como la estabilidad del ARN24 (TRMT11-GRIK2), la glicosilación de proteínas25 (MAN2A1-FER), la progresión del ciclo celular26, 27, 28 (CCNH-C5orf50 y MTOR-TP53BP1), la importación nuclear del factor de crecimiento de fibroblastos29 (LRRC59-FLJ60017), la desmetilación de histonas30 (KDM4B-AC011523.2) y el metabolismo de ácidos grasos31 (SLC45A2-AMACR). Muchos de estos sistemas parecen ser fundamentales para el crecimiento y la supervivencia celulares.
Dos de los genes de fusión son de particular interés: MAN2A1-FER y SLC45A2-AMACR. En primer lugar, MAN2A1 es una manosidasa fundamental en la glicosilación de las proteínas19. Normalmente se localiza en el aparato de Golgi. El truncamiento en MAN2A1-FER reemplaza el dominio manosidasa con un dominio tirosina quinasa de FER20, mientras que deja intacto el dominio glicosil transferasa. La proteína quimérica probablemente pierde la función manosidasa. El nuevo dominio quinasa en MAN2A1-FER puede conferir a la proteína quimérica una actividad tirosina quinasa. Por lo tanto, el impacto de este gen de fusión podría ser profundo: glicosilación y fosforilación anormales en cientos de proteínas secretadas o de la membrana plasmática. Puede tener un impacto en las interacciones célula-célula y en la transducción de señales, y generar una nueva respuesta inmunitaria a las células cancerosas. En segundo lugar, AMACR es una racemasa que cataliza los estereoisómeros 2R de los ácidos fitánico y pristánico a sus homólogos S. AMACR es esencial para la p-oxidación de los ácidos grasos ramificados en las mitocondrias. SLC45A2 es un acarreador de soluto transmembranal conocido por su papel protector en el melanoma. La proteína quimérica SLC45A2-AMACR tiene 5 dominios transmembranal de SlC45A2 truncados y reemplazados con una racemasa en gran parte intacta. SLC45A2-AMACR también pierde el sitio diana de las mitocondrias en AMACR. Presumiblemente, la proteína de fusión estaría ubicada en la membrana plasmática. Es de interés que todas las muestras de cáncer de próstata con fusión SLC45A2-AMACR demostraron ser muy agresivas. La identificación de los sistemas de señalización de esta proteína quimérica puede obtener una visión fundamental del comportamiento del cáncer de próstata.
Aunque la prevalencia de cada transcrito de fusión en muestras de cáncer de próstata es baja (entre el 2,9 % y el 7,9%), hasta el 60% de los cánceres de próstata que posteriormente reaparecieron y tuvieron un PSADT corto fueron positivos para al menos uno de estos transcritos de fusión. La especificidad de estos transcritos de fusión para predecir la recurrencia del cáncer de próstata parece notablemente alta, oscilando entre el 89 y el 100 % entre 4 cohortes de predicción separadas. No hubo supervivientes sin recurrencia a largo plazo si el tumor primario contenía transcritos de fusión TRMT11-GRIK2, MTOR-TP53BP1 o LRRC59-FLJ60017.
Hasta donde sepan los inventores, este es el primer informe que muestra que un conjunto de genes de fusión está fuertemente asociado con un pronóstico desfavorable del cáncer de próstata. Este descubrimiento puede tener un impacto importante en la práctica clínica a la luz del límite del PSA sérico y la clasificación de Gleason de las muestras de biopsia para predecir el resultado clínico del cáncer de próstata. La detección de uno de estos genes de fusión de asociación de recurrencia del cáncer de próstata en una muestra de cáncer de próstata puede justificar un régimen de tratamiento más agresivo. El ARN de fusión y las proteínas quiméricas validadas en este estudio pueden sentar las bases para una futura terapia de direccionamiento molecular para pacientes con cáncer de próstata portadores de estos genes.
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T l . r rí i líni l i n r r l h r Wi n in
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TablalO: Estado de 8 genes de fusión que predicen la recurrencia del cáncer de próstata en la cohorte de entrenamiento de 90 muestras del UPMC*____________________________________ _________________
Número de fusión precisión sensibilidad especificidad Indice de Youden Panel de 8 transcritos de fusión
1 0,567 0,19 1 0,19
2 0,644 0,33 1 0,33
3 0,622 0,33 0,95 0,29
4 0,622 0,33 0,95 0,29
5 0,644 0,38 0,95 0,33
6 0,711 0,5 0,95 0,45
7 0,689 0,5 0,91 0,40
8 0,711 0,58 0,89 0,47
Panel de 8 transcritos de fusión más TMPRSS2-ERG
1 0,589 0,42 0,79 0,20
2 0,622 0,48 0,79 0,27
3 0,6 0,48 0,74 0,22
4 0,6 0,48 0,74 0,22
5 0,611 0,5 0,74 0,24
6 0,656 0,58 0,74 0,32
7 0,633 0,58 0,69 0,27
8 0,656 0,63 0,69 0,32
*: Usando cualquier transcrito de fusión como punto de corte
Tabla 11: Estado de 8 genes de fusión con o sin TMPRSS2-ERG que predice la recurrencia del cáncer de próstata* Cohorte precisión sensibilidad especificidad 8 transcritos de fusión
UPMC de entrenamiento 0,711 0,58 0,89
UPMC de prueba 0,705 0,51 0,95 Wisconsin 0,8 0,63 1
Stanford 0,762 0,67 0,89
Pruebas combinadas** 0,734 0,56 0,951
8 transcritos de fusión más TMPRSS2-ERG
UPMC de entrenamiento 0,656 0,63 0,69
UPMC de prueba 0,681 0,67 0,69 Wisconsin 0,767 0,69 0,86
Stanford 0,762 0,83 0,67
Pruebas combinadas** 0,712 0,70 0,73
*: Usando cualquier transcrito de fusión como punto de corte; Combinando los conjuntos de datos del UPMC de prueba, de Stanford y de Wisconsin
Tabla 12: Asociación de transcritos de fusión con parámetros clínicos/patológicos
Gen de fusión Valor P
Gleason PSA (preoperatorio) Fase del tumor Nodo linfático Nomograma
TMEM135-CCDC67 0,59 0,98 0,432 0,082 0,21
KDM48-AC011523.2 0,64 0,726 0,688 0,588 0,588
MAN2A1-FER 0,781 0,721 0,679 0,140 1.07E-03
CCNH-C5orf30 0,14 0,313 0,254 0,059 0,156
TRMT11-GRIK2 0,012 0,227 5,38E-04 0,013 8,56E-03
SLC45A2-AMACR 0,566 0,441 0,022 0,181 0,015
MTOR-TP53BP1 0,993 0,57 0,731 1 0,775
LRRC59-FLJ60017 0,877 0,034 0,226 0,206 0,188
Al menos uno 0,064 0,138 3,852e-3 4,77e-3 2,86E-04
TMPRSS2-ERG 0,869 0,306 0,642 0,042 0,325
Tabla 13: Predicción de la puntuación de Gleason del estado de recurrencia de 90 muestras de la cohorte del UPMC de entrenamiento
Puntuación precisión sensibilidad especificidad índice de Youden 6 0,5333333 1 0 0
7 0,6111111 0,95833333 0,2142857 0,17261905
8 0,6111111 0,39583333 0,8571429 0,25297619
9 0,5111111 0,16666667 0,9047619 0,07142857
10 0,4666667 0,02083333 0,9761905 -0,00297619
Tabla 14: Predicción de la puntuación de Gleason del estado de recurrencia de 2291 muestras de las cohortes de entrenamiento y de pruebas del UPMC, de Stanford y de Wisconsin*
Cohorte precisión sensibilidad especificidad Gleason solo
UPMC de entrenamiento 0,611 0,40 0,86
UPMC de prueba 0,602 0,41 0,85
Wisconsin 0,6 0,31 0,93
Stanford 0,571 0,25 1
Pruebas combinadas** 0,597 0,37 0,89
Gleason más 8 transcritos de fusiónt
UPMC de entrenamiento 0,722 0,65 0,81
UPMC de prueba 0,139 0,59 0,92
Wisconsin 0,9 0,81 1
Stanford 0,762 0,61 0,89
Pruebas combinadas** 0,777 0,65 0,94
Gleason más 8 transcritos de fusión más TMPRSS2-ERGt
UPMC de entrenamiento 0,644 0,73 0,55
UPMC de prueba 0,705 0,80 0,59
Wisconsin 0,833 0,88 0,79
Stanford 0,762 0,83 0,67
Pruebas combinadas** 0,741 0,82 0,65
*: Usando Gleason >= 8 como punto de corte; T Usando Gleason >=8 o la presencia de cualquier transcrito de fusión como punto de corte; *: Usando <88 o la presencia de cualquier transcrito de fusión o TMPRSS2-ERG como punto de corte; **: Combinando los conjuntos de datos del UPMC de prueba, de Stanford y de Wisconsin; I; La puntuación de Gleason no está clasificada en una muestra y no está incluida en el análisis
Tabla 15: Predicción de nomograma del estado de recurrencia de 90 muestras de la cohorte de UPMC de entrenamiento
Probabilidad* precisión sensibilidad especificidad índice de Youden 0 0,4666667 0 1 0
1 0,4666667 0 1 0
2 0,4666667 0 1 0
3 0,4666667 0 1 0
4 0,4666667 0 1 0
5 0,4666667 0 1 0
6 0,4666667 0 1 0
7 0,4666667 0 1 0
8 0,4666667 0 1 0
9 0,4666667 0 1 0
10 0,4666667 0 1 0
11 0,4666667 0 1 0
12 0,4666667 0 1 0
13 0,4777778 0,02083333 1 0,02083333
14 0,4777778 0,02083333 1 0,02083333
15 0,4777778 0,02083333 1 0,02083333
16 0,4777778 0,02083333 1 0,02083333
17 0,4777778 0,02083333 1 0,02083333
18 0,4777778 0,02083333 1 0,02083333
19 0,4888889 0,04166667 1 0,04166667
20 0,4888889 0,04166667 1 0,04166667
21 0,4888889 0,04166667 1 0,04166667
22 0,4888889 0,04166667 1 0,04166667
23 0,4888889 0,04166667 1 0,04166667
24 0,4888889 0,04166667 1 0,04166667
25 0,5 0,0625 1 0,0625
26 0,5 0,0625 1 0,0625
27 0,5111111 0,08333333 1 0,08333333
28 0,5111111 0,08333333 1 0,08333333
29 0,5333333 0,125 1 0,125
30 0,5222222 0,125 0,97619048 0,10119048
31 0,5222222 0,125 0,97619048 0,10119048
32 0,5222222 0,125 0,97619048 0,10119048
33 0,5333333 0,14583333 0,97619048 0,12202381
Probabilidad* precisión sensibilidad especificidad índice de Youden 34 0,5444444 0,16666667 0,97619048 0,14285714
35 0,5444444 0,16666667 0,97619048 0,14285714
36 0,5444444 0,16666667 0,97619048 0,14285714
37 0,5444444 0,16666667 0,97619048 0,14285714
38 0,5555556 0,1875 0,97619048 0,16369048
39 0,5555556 0,1875 0,97619048 0,16369048
40 0,5555556 0,1875 0,97619048 0,16369048
41 0,5555556 0,1875 0,97619048 0,16369048
42 0,5555556 0,1875 0,97619048 0,16369048
43 0,5777778 0,22916667 0,97619048 0,20535714
44 0,5888889 0,25 0,97619048 0,22619048
45 0,5888889 0,25 0,97619048 0,22619048
46 0,5888889 0,25 0,97619048 0,22619048
47 0,6 0,27083333 0,97619048 0,24702381
48 0,6 0,27083333 0,97619048 0,24702381
49 0,6 0,27083333 0,97619048 0,24702381
50 0,6111111 0,29166667 0,97619048 0,26785714
51 0,6111111 0,29166667 0,97619048 0,26785714
52 0,6111111 0,29166667 0,97619048 0,26785714
53 0,6222222 0,3125 0,97619048 0,28869048
54 0,6222222 0,3125 0,97619048 0,28869048
55 0,6222222 0,3125 0,97619048 0,28869048
56 0,6222222 0,3125 0,97619048 0,28869048
57 0,6333333 0,33333333 0,91619048 0,30952381
58 0,6444444 0,35416667 0,97619048 0,33035714
59 0,6444444 0,35416667 0,97619048 0,33035714
60 0,6555556 0,375 0,97619048 0,35119048
61 0,6555556 0,375 0,97619048 0,35119048
62 0,6555556 0,375 0,97619048 0,35119048
63 0,6444444 0,375 0,95238095 0,32138095
64 0,6333333 0,375 0,92857143 0,30357143
65 0,6333333 0,375 0,92857143 0,30357143
66 0,6444444 0,39583333 0,92857143 0,32440476
67 0,6555556 0,41660067 0,92857143 0,3452381
68 0,6555556 0,41660067 0,92857143 0,3452381
69 0,6555556 0,41660067 0,92857143 0,3452381
70 0,6777778 0,45833333 0,92857143 0,38690476
71 0,6777778 0,47916667 0,9047619 0,38392851
72 0,6777778 0,5 0,88095238 0,38095238
73 0,6888889 0,52083333 0,88095238 0,40178571
74 0,6888889 0,52083333 0,88095238 0,40178571
75 0,6888889 0,52083333 0,88095238 0,40178571
76 0,6888889 0,52083333 0,88095238 0,40178571
77 0,7 0,54166667 0,88095238 0,42261905
78 0,7 0,54166667 0,88095238 0,42261905
79 0,7 0,54166667 0,88095238 0,42261905
80 0,7111111 0,5625 0,88095238 0,44345238
81 0,7111111 0,5625 0,88095238 0,44345238
82 0,7111111 0,58333333 0,85714286 0,44047619
83 0,7 0,58333333 0,83333333 0,41006667
84 0,7 0,58333333 0,83333333 0,41006667
85 0,7111111 0,80416667 0,83333333 0,4375
86 0,7333333 0,64583333 0,83333333 0,47916667
87 0,7444444 0,66666667 0,83333333 0,5
88 0,7555556 0,0075 0,83333333 0,52083333
89 0,7333333 0,70833333 0,76190476 0,4702381
90 0,7222222 0,70833333 0,73809524 0,44642857
91 0,7111111 0,72916667 0,69047619 0,41964286
92 0,7 0,75 0,64285714 0,39285714
93 0,7111111 0,83333333 0,57142857 0,4047619
94 0,6777778 0,85416667 0,47619048 0,33035714
95 0,6888889 0,875 0,47619048 0,35119048
96 0,6777778 0,875 0,45238095 0,32738095
97 0,6222222 0,95833333 0,23809524 0,19642857
98 0,5444444 1 0,02380952 0,02380952 Probabilidad* precisión sensibilidad especificidad índice de Youden
99 0,5335533 1 0 0
100 0,5335533 1 0 0
*: Probabilidad de supervivencia libre de PSA durante 5 años
Tabla 16: Predicción de nomograma del estado de recurrencia de 2291 muestras de las cohortes de entrenamiento y de pruebas del UPMC, de Stanford y de Wisconsin
Cohorte precisión sensibilidad especificidad Nomograma solo*
UPMC de entrenamiento 0,756 0,69 0,83
UPMC de prueba 0,75 0,80 0,69
Wisconsin 0,6 0,31 0,93
Stanford 0,619 0,33 1
Pruebas combinadas** 0,691 0,57 0,84
Nomograma más 8 transcritos de fusión*
UPMC de entrenamiento 0,778 0,69 0,88
UPMC de prueba 0,807 0,76 0,87
Wisconsin 0,833 0,69 1
Stanford 0,81 0,75 0,89
Pruebas combinadas** 0,813 0,74 0,90
Nomograma más 8 transcritos de fusión más TMPRSS2-ERGt
UPMC de entrenamiento 0,656 0,63 0,69
UPMC de prueba 0,681 0,67 0,69
Wisconsin 0,767 0,69 0,86
Stanford 0,762 0,83 0,67
Pruebas combinadas** 0,719 0,62 0,84
*: Usando <88 como punto de corte; f : Usando <88 o cualquier transcrito de fusión como punto de corte; *: Usando <88 o cualquier transcrito de fusión o TMPRSS2-ERG como punto de corte; **: Combinando los conjuntos de datos del UPMC de prueba, de Stanford y de Wisconsin; i; La puntuación de Gleason no está clasificada en una muestra y no está incluida en el análisis
Tabla 17. Tran ri iv f i n r ni n n n r n n
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6.6. Referencias
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7. Ejemplo 2: Genes de fusión PTEN-NOLC1
Se realizó la secuenciación del transcriptoma en 15 muestras de cáncer de próstata de pacientes que experimentaron recurrencia del cáncer de próstata después de una prostatectomía radical. Uno de los transcritos de fusión de genes candidatos es PTEN-NOLC1. Para validar el transcrito de fusión, se realizaron RT-PCR con cebadores específicos para PTEN-NOLC1 en la muestra de cáncer de próstata que resultó positiva para el transcrito de fusión, usando los cebadores siguientes: 5'GCATTTGCAGTATAGAGCGTGC3' (SEQ ID NO 28)/ 5'GTCTAAGAGGGAAGAGGCATTG3' (SEQ ID NO 29), en las condiciones siguientes: 94 °C durante 5 min, luego 30 ciclos de 94 °C durante 10 segundos, 61 °C durante 1 min y 72 °C durante 3 min, seguido de 10 min a 72 °C para la extensión. Se generó un producto de PCR de 158 pb. Posteriormente, se secuenció el producto de PCR. Se confirmó el transcrito de fusión PTEN-NOLC1 (Figura 13A). Para investigar el mecanismo del transcrito de fusión PTEN-NOLC1, se realizaron hibridaciones fluorescentes in situ (FISH) usando sondas correspondientes al extremo 5' del genoma de PTEN (RP11-124B18) y al extremo 3' del genoma de NOLC1 (CTD-3082D22), respectivamente. En células epiteliales de próstata normales, estas 2 sondas se hibridaron con distintas ubicaciones separadas en el genoma debido a una separación de más de 14 mega pares base de estos 2 genes (Figura 13B). En cambio, estas dos señales parecían fusionarse para generar una señal superpuesta en el genoma del cáncer de próstata a partir de una muestra que es positiva para el transcrito de fusión PTEN-NOLC1. Curiosamente, el PTEN sin fusión fue casi indetectable en esta muestra de cáncer de próstata, lo que sugiere que la fusión PTEN-NOLC1 estaba acompañada de deleción de PTEN en otro alelo. Estos resultados sugieren que el reordenamiento del genoma es el mecanismo subyacente para la transcripción de PTEN-NOLC1. Para investigar la importancia clínica de la fusión PTEN-NOLC1, se analizaron 215 muestras de cáncer de próstata para determinar la expresión de PTEN-NOLC1. Se encontró que más del 14% (31/215) de las muestras de cáncer de próstata expresaban PTEN-NOLC1 (Figura 13C). Entre las muestras positivas, el 77% (24/31, p=0,03) de los pacientes experimentaron recurrencia del cáncer de próstata. Esto indica que la fusión PTEN-NOLC1 se asocia con un resultado clínico desfavorable. Curiosamente, el análisis, por parte de los inventores, de adenocarcinoma pulmonar, glioblastoma multiforme y carcinoma hepatocelular indica que un número significativo de estos cánceres también son positivos para la fusión PTEN-NOLC1: glioblastoma multiforme 35/38, carcinoma hepatocelular 3/20 y adenocarcinoma pulmonar 29/40. Estos resultados sugieren que la fusión PTEN-NOLC1 puede tener amplias implicaciones para el desarrollo del cáncer.
La expresión de Pten-NOLCI en células NIH3T3 y PC3 aumentó el crecimiento celular. Para investigar si PTEN-NOLC1 tiene actividad favorecedora del crecimiento, los inventores ligaron el ADNc de PTEN-NOLC1 en un vector pCDNA-FLAG para crear pCDNA4-PTEN-NOLC1-FLAG. Posteriormente, transfectaron células NIH3T3 y PC3 (una línea celular de cáncer de próstata humano) con pCDNA4-PTEN-NOLC1-FLAG/pCDNA6. Como se muestra en la Figura 27B, la inducción de células NIH3T3 y PC3 produce un aumento del crecimiento celular de 10,3 (p <0,01) y 3,1 veces (p <0,01), respectivamente. Estos se acompañaron de un aumento de 2,3 veces (p <0,01) y 2,7 veces (p <0,001) de la entrada de células en la fase S en células NIH3T3 y PC3 en el análisis del ciclo celular (Figura 27C). Los análisis de formación de colonias indican que la expresión de PTEN-NOLC1 produjo un número 2,2 veces (p <0,001) más alto de colonias de suspensión de células individuales para las células NIH3T3 que los controles no inducidos y 2,7 veces (p <0,01) más colonias para células PC3 cuando fueron inducidas a expresar PTEN-NOLC1-FLAG (Figura 27D).
Para investigar la localización subcelular de PTEN-NOLC1, las células NIH3T3 transformadas con pCDNA4-PTEN-NOLC1-FLAG/pCDNA6 fueron inducidas con tetraciclina para expresar PTEN-NOLC1-FLAG. Como se muestra en la Figura 27A, la mayor parte de PTEN-NOLC1-FLAG se localizaba en el núcleo de las células. Esto es contrario a la localización citoplasmática de PTEN. También se detectó PTEN-NOLC1-FLAG en la fracción de núcleo purificada. Sin entrar en consideraciones teóricas particulares, estos resultados indican que la formación de fusiones con NOLC1 altera la localización subcelular de PTEN-NOLC1 del citoplasma al núcleo.8
8. Ejemplo 3: Selección terapéutica de dianas en el transcrito de fusión que contiene la proteína quimérica MAN2A1-FER
8.1. Resultados
MAN2A1-FER probablemente produce quinasa FER activada. MAN2A1-FER estuvo presente en el cáncer de próstata, el carcinoma hepatocelular y el glioblastoma multiforme. MAN2A1 es una enzima de Golgi necesaria para la conversión de una estructura rica en manosa en una de tipo complejo de N-glicano para la glicosilación madura de una proteína de membrana1, 2 Se sabe poco sobre su relación con las neoplasias malignas humanas. Por otro lado, FER, una tirosina quinasa, es un oncogén bien documentado3, 4 Varios estudios demostraron que el FER activa el receptor de andrógenos (AR) fosforilando Tyr223 en AR5, y que es esencial para la activación de EGFR por NFkB6.
Algunos estudios indican que el FER es un componente esencial de la señalización de la tirosina quinasa 1 (STK1)6 de las células madre y del receptor (kit) del factor de crecimiento de los mastocitos7, 8 La sobreexpresión de FER se asocia con resultados clínicos desfavorables de cáncer de mama9, carcinoma de células renales10’ 11, cáncer de pulmón no microcelular12’ 13 y carcinoma hepatocelular14 Los extremos N de muchas tirosina quinasas sirven para restringir la actividad quinasa y están regulados por otras moléculas. Los dominios de algunos N-terminales seleccionan dianas específicas para las quinasas y se unen a las mismas. La eliminación del extremo N de una proteína quinasa puede producir una actividad quinasa activada constitutivamente que puede alterar los sistemas de señalización y genera un crecimiento celular desinhibido. La mejor analogía con MAN2A1-FER es BCR-Abl. Cuando c-Abl está intacto, su actividad quinasa está restringida. La eliminación del dominio SH3 en c-Abl en la proteína de fusión BCR-Abl convierte la tirosina quinasa Abl mutante en un oncogén que desempeña un papel clave en el desarrollo de la leucemia linfoblástica aguda y de la leucemia mielógena crónica. El FER de tipo natural con dominio SH2 intacto es inactivo en la actividad quinasa cuando se analiza en un sistema libre de células. En el gen de fusión MAN2A1-FER, el extremo N-terminal de FER sufre una pérdida de los dominios SH2 y FHC (Figura 14). Estos dominios se reemplazaron con glucosidasa y el dominio central de a-manosidasa de MAN2A1. Como resultado, se puede activar la actividad quinasa y se pueden alterar dianas de sustrato de la tirosina quinasa FER.
La expresión de MAN2A1-FER acelera la entrada del ciclo celular en la fase S y aumentó la fosforilación de tirosina de EGFR en ausencia del ligando de EGFR. Para investigar si la proteína quimérica MAN2A1-FER se expresa en muestras de cáncer de próstata que contienen el transcrito MAN2A1-FER, se analizaron extractos de proteínas de 5 muestras de cáncer de próstata positivas para el ARN de MAN2A1-FER usando anticuerpos específicos para MAN2A1 o FER. Estos resultados demostraron que las muestras expresaban una proteína de 115 Kd reconocida por los anticuerpos MAN2A1 y FER (Figura 22). Esta proteína no se detecta en muestras de cáncer de próstata que son negativas para el transcrito MAN2A1-FER.
Cuando se obligó a MAN2A1-FER a expresarse en células RWPE1, una línea celular epitelial de próstata no transformada, aumentó la proporción de células en la fase S entre 4,6 y 5 veces (p<0,001). Se determinó que MAN2A1-FER estaba colocalizado con proteína de Golgi en análisis tanto de inmunofluorescencia como de gradiente de sacarosa, apoyando la idea de que MAN2A1-FER se localiza principalmente en el aparato de Golgi. Curiosamente, la expresión de MAN2A1-FER aumentó la fosforilación de tirosina de EGFR en células RWPE1 en ausencia de ligando de EGFR, lo que sugiere que MAN2A1-FER puede fosforilar ectópicamente el dominio extracelular de EGFR. Así, MAN2A1-FER puede funcionar como un oncogén transformante y poseer actividad tirosina quinasa intrínseca derivada de su dominio quinasa FER. Sin entrar en consideraciones teóricas particulares, el dominio quinasa de MAN2A1-FER puede ser el conductor de su actividad oncogénica a través de la fosforilación ectópica de proteínas transmembranales tales como EGFR.
La selección terapéutica de MAN2A1-FER como diana da como resultado células de cáncer de próstata de muerte celular específicas que expresan MAN2A1-FER. Con base en los análisis anteriores, los inventores razonan que la ubicación subcelular alterada y la especificidad del sustrato de la quinasa FER crearán una actividad oncogénica de MAN2A1-FER. Una gran parte de esta actividad oncogénica resulta de la fosforilación ectópica y la activación de EGFR y de sus sistemas de señalización aguas abajo. Así, se puede intervenir y alterar los sistemas oncogénicos de MAN2A1-FER utilizando 2 planteamientos diferentes. El primer planteamiento es inhibir la actividad quinasa de MAN2A1-FER seleccionando como dianas a las proteínas MAN2A1-FER usando moléculas pequeñas que puedan inhibir la tirosina quinasa. Se encuentran disponibles varias moléculas pequeñas específicas para FER, como la diaminopirimidina TAE684 y las pirazologirididinas WZ-4-49-8 y WZ-4-49-10, inhibidor genérico de ALK/FER crisotinib. Entre estos inhibidores compuestos, el Crisotinib ha sido autorizado por la FDA para tratar el cáncer de pulmón de no microcelular avanzado y metastásico positivo para EML4-ALK, otra proteína de fusión de tirosina quinasa. Se ha demostrado que el fármaco puede reducir la masa tumoral en al menos un 30 % en la mayoría de los pacientes.
Para investigar si el Crisotinib también es eficaz contra las células cancerosas positivas para MAN2A1-FER, los inventores transformaron la línea celular de cáncer de próstata humano PC3 con pCDNA4-MAN2A1-FER-FLAG/pCDNA6 para expresar la proteína de fusión MAN2A1-FER. Estas células fueron tratadas con dosis bajas de Crisotinib durante 24 horas. Como se muestra en la Figura 22, el tratamiento dio como resultado la muerte celular del 31 % en las células que expresaban MAN2A1-FER, mientras que apenas mató el mismo tipo de células cancerosas que no expresan esta proteína de fusión. Un análisis del efecto de la dosificación mostró que la expresión de MAN2A1-FER reduce la CE50 que mata el cáncer en al menos 2 magnitudes (~ 100 veces). Así, es razonable tratar el cáncer de próstata positivo a MAN2A1-FER con Crisotinib en una dosis que no sea dañina para las células humanas normales.
El segundo planteamiento es seleccionar como diana la activación de EGFR mediante inhibidores de EGFR. Estos incluyen erlotinib, cetuximab, bevacizumab, canertinib y bortezomib. Muchos de estos fármacos fueron autorizados por la FDA y se usan ampliamente en diversos tumores sólidos humanos. Para cuestionar la efectividad de la interrupción de la activación de EGFR en el tratamiento del cáncer de próstata, los inventores trataron con canertinib células PC3 transformadas con MAN2A1-FER. Como se muestra en la Figura 23, el tratamiento también produjo un 34 % de muerte celular de las células que expresaban MAN2A1-FER. En cambio, el efecto sobre las células que no expresaban MAN2A1-FER (Tet-) fue mínimo: el nivel de muerte celular es similar al de los controles no tratados.
Estos resultados sugieren que la activación de EGFR es una de las vías fundamentales para la actividad oncogénica de MAN2A1-FER. Curiosamente, cuando los inventores intentaron interceptar la molécula de señalización aguas abajo de EGFR, MEK, usando un fármaco experimental AZD6244, el efecto destructivo diferencial se moderó en gran medida y desapareció (datos no mostrados). Ello sugiere que otros sistemas de señalización para EGFR pueden eludir la señalización de MEK.
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9. Ejemplo 4. Eliminación de células cancerosas positivas para transcritos de fusión mediante edición genómica
Recientes avances en la edición genómica usando ZFN y CAS9 han hecho posible seleccionar como diana una secuencia específica del genoma del cáncer que no está presente en las células normales. El mecanismo de formación del transcrito de fusión es el reordenamiento cromosómico. Como resultado, los puntos de ruptura en el cromosoma se identifican fácilmente en un genoma de cáncer. Las células normales no tienen reordenamientos cromosómicos similares y, por lo tanto, son negativas para el punto de ruptura. Seleccionar como diana un punto de ruptura específico en el genoma del cáncer de próstata probablemente genere un tratamiento eficaz para el cáncer de próstata. Dado que se ha identificado el punto de ruptura genómico de CCNH-C5ORF30 y TMEM135-CCDC67, puede usarse la tecnología de edición genómica dirigida al punto de ruptura de CCNH-C5orf30 o TMEM135-CCDC67 para destruir células cancerosas.
Como se muestra en la Figura 15, la recombinación genómica en el caso de cáncer de próstata 3T produjo un punto de ruptura en el cromosoma 5 que conecta el intrón 6 de CCNH con el intrón 1 de C5orf30. El punto de ruptura resultante es único en el caso de cáncer de próstata 3T. El punto de ruptura es positivo en la mayoría de los tejidos del cáncer de próstata, pero negativo para los tejidos normales de este paciente. Un ARN guía (ARNg) de 23 pb que incluye la secuencia del motivo adyacente protoespaciador (PAM) está diseñado específicamente para la región del punto de ruptura. La secuencia de ADN correspondiente a esta secuencia diana se liga artificialmente en un vector que contiene el resto de ARNg y CAS9. Esta secuencia se recombina y se empaqueta en virus recombinantes (adenovirus o lentivirus). Se construye una timidina quinasa del virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) sin promotor en un vector lanzadera para adenovirus junto con la secuencia de la etiqueta de empalme de la unión intrón/exón del exón 7 de CCNH. Una secuencia de 500 pb que rodea el punto de ruptura de CCNH-C5orf30 de cada lado también se liga al vector lanzadera para producir una recombinación homóloga eficaz para completar la construcción del ADN donador. El vector se recombina y se empaqueta en AdEasy para generar virus recombinantes. Estos virus se administran a pacientes o animales que tienen cáncer positivo para el transcrito de fusión CCNH-C5orf30. Esto lleva a la inserción del ADN donador en el sitio diana (punto de ruptura de fusión). Dado que la TK de HSV-1 en virus recombinante no tiene promotor, no ocurrirá transcripción alguna si el ADNc de la TK de HSV-1 no se integra en un genoma activo de transcripción. Sin embargo, la transcripción de la TK de HSV-1 es activa si la TK de HSV-1 se integra en el sitio diana de CCNH-C5orf30, ya que este transcrito es fácilmente detectable en la muestra de cáncer de próstata de este paciente. Cuando el paciente 3T toma ganciclovir o su homólogo oral valganciclovir, el homólogo se convierte fácilmente en un análogo de guanina trifosfato por la TK de HSV-1 y se incorpora a los genomas de las células cancerosas. Esto conduce a la detención del alargamiento del ADN en las células que son positivas para CCNH-C5orf30. Dado que la TK de mamífero no fosforila el ganciclovir, el ganciclovir no se convierte en forma activa (trifosfato) en las células que son negativas para la proteína TK del HSV-1. Así, se minimiza el impacto del ganciclovir en las células normales.
La técnica descrita anteriormente se aplicó a células que tenían el punto de ruptura TMEM135-CCDC67. Dado que ninguno de los genes de fusión identificado por los inventores estaba presente hasta ahora en las líneas celulares de cáncer de próstata, los inventores crearon un punto de ruptura del genoma TMEM135-CCDC67 que es idéntico a la muestra de cáncer de próstata analizada por ellos. La expresión del punto de ruptura TMEM135-CCDC67 fue impulsada por un promotor del CMV. Posteriormente, los inventores construyeron un ADN donador que abarcaba la TK de HSV-1 y los sitios de empalme del exón 14 de TMEM135. Cuando los inventores cotransfectaron este ADN donador con un vector que expresaba ARNg dirigido al punto de ruptura TMEM135-CCDC67 en células PC3 que contenían este punto de ruptura del genoma, se identificó la integración de la TK en el genoma (Figura 28A). En cambio, cuando los inventores transfectaron los mismos pares de ADN en células que no contenían el punto de ruptura, no se encontró integración de la TK (datos no mostrados). El tratamiento de las células PC3 sin el punto de ruptura de TMEM135-CCDC67 tiene una muerte celular mínima, mientras que el mismo tratamiento de las células PC3 que contienen el punto de ruptura con ganciclovir dio como resultado un aumento de 8 veces la muerte celular (Figura 28B). Esto es notable si se considera solo una eficacia de transfección del 5-10% usando el método de liposomas convencional. Sin entrar en consideraciones teóricas particulares, estos datos sugieren que casi todas las células que recibieron el ADN murieron cuando fueron tratadas con ganciclovir, si contenían el punto de ruptura. En vista de este resultado prometedor, tanto el casete TMEM135-CCDC67-TK como el ADN NicKase-gRNATMEM135-CCDC67-BrkPt están ahora en proceso de empaquetamiento en adenovirus. El virus recombinante será interfectado en estas células en los experimentos futuros. Esto mejorará drásticamente la eficiencia de la administración en el posterior estudio en animales y probablemente en seres humanos.
10. Ejemplo 5: Nuevos transcritos de fusión asociados con el cáncer de próstata progresivo
El análisis de 68 muestras adicionales de cáncer de próstata mediante secuenciación del transcriptoma conduce al descubrimiento de 5 nuevos transcritos de fusión adicionales presentes en el cáncer de próstata. Se hace notar que un número significativo de cánceres de próstata no contenían transcritos de fusión en la secuenciación de ARN. Aunque se realizaron secuenciaciones importantes de transcriptomas en 30 muestras de cáncer de próstata que resultaron no recurrentes durante un periodo prolongado de tiempo, no se identificaron transcritos de fusión viables en estas muestras usando el soporte lógico detector de fusiones. Estos 5 transcritos de fusión se validaron mediante la secuenciación de Sanger de los productos de RT-PCR (Figura 16). Se utilizaron los siguientes cebadores: ACPP-SEC13: 5-TCCCATTGACACCTTTCCCAC (SEQ ID NO 30)/5-TGAGGCTTCCAGGTACAACAG (SEQ ID NO 31);
CLTC-ETV1: 5'-GCCCAGTTGCAGAAAGGAATG(SEQ ID NO 32)/5-CTTGATTTTCAGTGGCAGGCC (SEQ ID NO 33);
DOCK7-OLR1: 5'-GACTACGTCTCATGCCTTTCC (SEQ ID NO 34)/5-TTCTCATCAGGCTGGTCCTTC (SEQ ID NO 35);
PCMTD1-SNTG: 5-GATGTGGTGGAATATGCCAAGG (SEQ ID NO 36)/5-AAATCCATGTGCTGTGGCACC (SEQ ID NO 37); y
ZMPSTE24-ZMYM4: 5'-CGCAATGAGGAAGAAGGGAAC (SEQ ID NO 38)/5-CATAAATCTG G AATAG G G CTCAG (SEQ ID NO 39).
10.1. Resultados
Genes de fusión ZMPSTE24-ZMYM4. Este transcrito de fusión fue descubierto en una muestra de cáncer de próstata de un paciente que experimentó la recurrencia del cáncer de próstata 1,8 meses después de la prostatectomía radical. Los ganglios linfáticos pélvicos del paciente fueron positivos para cáncer de próstata metastásico, mientras que su muestra de cáncer primario se clasificó con Gleason 7. Además de ZMPSTE24-ZMYM4, su muestra de cáncer de próstata también fue positiva para CCNH-c5orf30. ZMPSTE24 es una metaloproteinasa de cinc implicada en la escisión proteolítica postraduccional que oculta la prelamina A farnesilada para formar lamina A madura. La mutación de esta proteína se asocia con la displasia mandibuloacral1. Se ha sugerido que ZMPSTE24 puede ser un mediador que promueve el cáncer de próstata invasivo2. ZMYM4 es un gen antiapoptótico cuyo dominio funcional se encuentra en la región no traducida 3'. Se ha demostrado que la expresión de la UTR 3' de ZMYM4 resiste la muerte celular inducida por interferón y mediante la inhibición de la actividad AUF13. La formación de la fusión entre ZMPSTE24 y ZMYM4 produce un truncamiento de 159 aminoácidos del extremo C-terminal de ZMPSTE24 y de 1315 aminoácidos del extremo N-terminal de ZMYM4. El análisis de motivos sugiere que la fusión ZMPSTE24-ZMYM4 eliminará aproximadamente el 50 % del dominio peptidasa de ZMPSTE24 y eliminará todos los dedos de cinc de ZMYM4, pero dejará intactos ZUF3504 (dominio de función desconocida) y el dominio inhibidor de la apoptosis (Figura 17). Así, la fusión ZMPSTE24-ZMYM4 puede proporcionar a las células cancerosas una herramienta importante para resistir la muerte celular programada.
Genes de fusión CLTC-ETV1. Se descubrió CLTC-ETV1 en una muestra de cáncer de próstata que tenía la clasificación 7 de Gleason. El paciente experimentó una recurrencia del cáncer de próstata 22 meses después de la prostatectomía radical y este había progresado rápidamente. Además de CLTC-ETV1, la muestra de cáncer de próstata también fue positiva para la fusión TRMT11-GRIK2. CLTC es un componente proteico principal de vesículas recubiertas y depresiones recubiertas, y se expresa universalmente. Su presencia es esencial para la creación de la forma celular y la motilidad celular. ETV1 es un factor de transcripción que se ha demostrado que se sobreexpresa en el cáncer de próstata. Se ha demostrado que ETV1 se asocia con al menos 12 genes de cabeza diferentes en el cáncer de próstata y el sarcoma de Ewing4, 5. Sin embargo, la mayoría de estas fusiones no producen un factor de transcripción funcional de ETV1 debido a cambios en el marco de lectura en la fusión o a que quedan pocos aminoácidos después de la fusión. Al contrario, la fusión CLTC-ETV1 conserva un dominio de transcripción en gran parte intacto en ETV1 y probablemente representa el primer ejemplo de posible fusión funcional de ETV1 en el cáncer de próstata. La fusión CLTC-ETV1 elimina 3 dominios de clatrina de CLTC (Figura 18). Esto puede afectar a la función de CLTC para la formación de depresiones recubiertas. Se ha demostrado que ETV1 es oncogénico en varios sistemas de órganos6, 8. El dominio regulador se encuentra en el N-terminal. El dominio regulador contiene el sitio de fosforilación de MAPK, así como el sitio de ubiquitinación por COP19, 10. El truncamiento en el extremo N-terminal de ETV1 elimina todos estos elementos reguladores de ETV1. Así, el nivel de proteína CLTC-ETV1 puede incrementarse debido a una menor degradación y la actividad de ETV1 puede volverse constitutiva debido a la falta de restricción reguladora en la proteína de fusión. Dado que se ha demostrado que ETV1 se sobreexpresa en muchos cánceres de próstata, la fusión CLTC-ETV1 podría ser el mecanismo subyacente.
Genes de fusión ACPP-SEC13. El transcrito de fusión ACPP-SEC13 fue descubierto en una muestra de cáncer de próstata de pacientes que experimentaron recurrencia, pero que también tenían un aumento lento de PSA con un tiempo de duplicación de más de 20 meses. La clasificación de Gleason fue 7. El examen patológico revela la invasión de la vesícula seminal por parte de células del cáncer de próstata. La ACPP es fosfatasa ácida específica de la próstata y se expresa abundantemente en las células acinares de la próstata, mientras que SEC13 pertenece a la familia de las proteínas de repetición WD y es necesaria para la biogénesis de vesículas del retículo endoplasmático11. Estudios recientes sugieren que SEC13 es una subunidad de GATOR2, una proteína octomérica activadora de la GTPasa. La inhibición de SEC13 suprime la activación de mTOR12. En la fusión ACPP-SEC13, solo se conservan los 72 aminoácidos del N-terminal de ACPP y más de 2/3 del dominio de fosfatasa se trunca, mientras que SEC13 pierde 196 aminoácidos de su N-terminal y tiene 3 dominios de repetición WD eliminados (Figura 19). Debido al gran truncamiento de los dominios fundamentales en ambas proteínas, cabe esperar que ACPP-SEC13 no contenga ni fosfatasa ni actividad de activación de la GTPasa. Tal pérdida de función puede conducir a una hiperactividad de mTOR y puede hacerla insensible a la privación de aminoácidos. Un tratamiento potencial dirigido a pacientes positivos para ACPP-SEC13 podría ser el uso de un inhibidor de mTOR, ya que las células cancerosas pueden volverse hipersensibles a los inhibidores de mTOR cuando SEC13 no es funcional.
Genes de fusión DOCK7-OLR1. El transcrito de fusión DOCK7-OLR1 fue descubierto en una muestra de cáncer de próstata de un paciente que experimentó cáncer de próstata recurrente 30,5 meses después de la prostatectomía radical. Sin embargo, el aumento de PSA pareció rápido, con un PSADT inferior a 3 meses. La clasificación de Gleason del cáncer de próstata fue 7, y no hubo invasión de la vesícula seminal u otros órganos adyacentes en el momento de la cirugía. El margen quirúrgico fue negativo. Ello sugiere claramente que algunas células de cáncer de próstata se habían escapado de la ubicación principal antes de la cirugía. DOCK7 es un factor de intercambio de nucleótidos de guanina que interviene en la migración y la polarización celulares13, 14, mientras que OLR1 es un receptor de lipoproteínas de baja densidad que pertenece a la superfamilia de lectinas de tipo C. OLR1 internaliza y degrada y se une a la lipoproteína de baja densidad oxidada15. A diferencia de los 3 transcritos de fusión anteriores, DOCK7-OLR1 no produce una proteína quimérica. En vez de ello, se produce una traducción separada de DOCK7 y OLR1 a partir del transcrito de fusión. La fusión eliminó una parte significativa del dominio de citocinesis de DOCK7, de modo que la regulación de la motilidad por DOCK7 podría verse comprometida. Sin embargo, el transcrito de fusión producirá una proteína OLR1 intacta (Figura 20). OLR1 estaba implicado en la apoptosis mediada por Fas. La importancia funcional de su expresión bajo el control del promotor DOCK7 ha de ser investigada.
Genes de fusión PCMTD1-SNTG1. El transcrito de fusión PCMTD1-SNTG1 fue descubierto en una muestra de cáncer de próstata de un paciente que experimentó cáncer de próstata recurrente 5,5 meses después de la prostatectomía radical. El aumento de PSA fue rápido con un PSADT inferior a 3 meses. La clasificación de Gleason fue 9. Se identificó una invasión de la vesícula seminal en la muestra de prostatectomía. La muestra de cáncer de próstata también fue positiva para SLC45A2-AMACR y LRRC59-FLJ60017. PCMTD1 es una proteína que contiene el dominio de D-aspartato metiltransferasa. No se ha estudiado la función de PCMTD1. SNTG1 es un miembro de la familia de las sintrofinas. SNTG1 pertenece a la proteína de membrana periférica. Un estudio reciente sugiere que SNTG1 puede regular la localización subcelular de la diacilglicerol quinasa zeta y que regula la terminación de la señalización de diacilglicerol. De forma similar a la fusión DOCK7-OLR1, la fusión PCMTD1-SNTG1 no produce una proteína quimérica. La fusión PCMTD1-SNTG1 produce un PCMTD1 truncado. El truncamiento elimina la mitad del dominio de metiltransferasa de PCMTD1. Sin embargo, SNTG1 está intacta (Figura 21). Dado que la diacilglicerol quinasa debilita la actividad de la proteína quinasa C al agotar la disponibilidad de diacilglicerol, un nivel más alto de SNTG1 podría mejorar la señalización de PKC si la fusión PCMDT1-SNTG1 aumenta la expresión de SNTG1. Alternativamente, alterar la función de PCMTD1 puede tener un impacto en el metabolismo celular y el crecimiento celular que todavía ha de ser definido.
10.2 Referencias
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8. Jane-Valbuena, J., Widlund, H. R., Perner, S., Johnson, L.A., Dibner, A. C., Lin, W. M., Baker, A. C., Nazarian, R. M., Vijayendran, K. G., Sellers, W. R., Hahn, W. C., Duncan, L. M., Rubin, M. A., Fisher, D. E. y Garraway, L. A. An oncogenic role for ETV1 in melanoma. Cancerresearch 70(5), 2075-2084.
9. Vitari, A. C., Leong, K. G., Newton, K., Yee, C., O'Rourke, K., Liu, J., Phu, L., Vij, R., Ferrando, R., Couto, S.S., Mohan, S., Pandita, A., Hongo, J. A., Arnott, D., Wertz, I.E., Gao, W. Q., French, D.
10. M. y Dixit, V. M. COP1 is a tumour suppressor that causes degradation of ETS transcription factors. Nature 474(7351), 403-406
11. Willardsen, M., Hutcheson, D. A., Moore, K. B. y Vetter, M. L. The ETS transcription factor Etv1 mediates FGF signaling to initiate proneural gene expression during Xenopus laevis retinal development. Mechanisms of development 131, 57-67
12. Enninga, J., Levay, A. y Fontoura, B. M. (2003) Sec13 shuttles between the nucleus and the cytoplasm and stably interacts with Nup96 at the nuclear pore complex. Molecular and cellular biology 23(20), 7271-7284.
13. Bar-Peled, L., Chantranupong, L., Cherniack, A. D., Chen, W.W., Ottina, K. A., Grabiner, B. C., Spear, E. D., Carter, S. L., Meyerson, M. y Sabatini, D. M. A Tumor suppressor complex with GAP activity for the Rag GTPases that signal amino acid sufficiency to mTORC1. Science (Nueva York, N.Y. 340(6136), 1100-1106.
14. Watabe-Uchida, M., John, K. A., Janas, J. A., Newey, S. E., y Van Aelst, L. (2006) The Rae activator DOCK7 regulates neuronal polarity through local phosphorylation of stathmin/Op18. Neuron 51(6), 727-739.
15. Nellist, M., Burgers, P. C., van den Ouweland, A. M., Halley, D. J. y Luider, T. M. (2005) Phosphorylation and binding partner analysis of the TSC 1-TSC2 complex. Biochemical and biophysical research communications 333(3), 818-826.
11. Ejemplo 6: Genes de fusión SLC45A2-AMACR
11.1 Resultados
El transcrito de fusión de la familia 45 de acarreadores de soluto, miembro 2-alfa-metilacil-CoA racemasa (SLC45A2-AMACR) produce una proteína quimérica con 187 aminoácidos del N-terminal de SLC45A2 y los 311 aminoácidos del C-terminal de AMACR. SLC45A2 es una proteína transportadora que se sabe que se sobreexpresa en el melanoma1, mientras que AMACR es una enzima involucrada en el metabolismo de los ácidos grasos ramificados y es conocida por su sobreexpresión en varias neoplasias malignas humanas. SLC45A2-AMACR reemplaza 5 dominios transmembranales y citosólicos de SLC45A2 con un dominio racemasa intacto de AMACR2, mientras que deja intactos los dominios extracelular y transmembranal del N-terminal (Figura 24). La mayoría de los pacientes con cáncer de próstata que dieron positivo para SLC45A2-AMACR experimentaron una recidiva del cáncer de próstata en los 5 años posteriores al tratamiento quirúrgico. Estudios anteriores sugieren que AMACR es esencial para el crecimiento óptimo de las células de cáncer de próstata in vivo. El silenciamiento génico de AMACR o el tratamiento del cáncer de próstata con inhibidores de AMACR dio lugar a la muerte de las células cancerosas tanto in vitro como in vivo3. La formación de SLC45A2-AMACR genera racemasa ectópica para el metabolismo de los ácidos grasos para soportar el crecimiento de las células del cáncer de próstata.
La transformación de las células epiteliales de la próstata con SLC45A2-AMACR da lugar a un crecimiento y transformación celular espectacular, posiblemente a través de la activación del sistema SHIP2-Akt. Para investigar si la proteína quimérica SLC45A2-AMACR se expresa en muestras de cáncer de próstata que contienen el transcrito SLC45A2-AMACR, se analizaron extractos de proteínas de 4 muestras de cáncer de próstata positivas para ARN SLC45A2-AMACR usando anticuerpos específicos para MAN2A1 o FER. Los resultados mostraron que estas muestras expresaban una proteína de 50 Kd reconocida por los anticuerpos MAN2A1 y FER (Figura 25A). Esta proteína no se detectó en muestras de cáncer de próstata que fueron negativas para el transcrito SLC45A2-AMa Cr . Cuando se obligó a SLC45A2-AMACR a expresarse en células RWPE1, una línea celular epitelial de próstata no transformada, aumentó la proporción de células en la fase S en un promedio de 8,7 veces (p <0,001). Los ensayos de mostraron un aumento de 7,5 veces en la proliferación celular (p <0,001) (Figuras 25 E-F). Mediante tinción de inmunofluorescencia y análisis de fraccionamiento membranoso, se determinó que SLC45A2-AMACR estaba localizado en la membrana plasmática. Esto contrasta con la AMACR nativa, que se encuentra principalmente en las mitocondrias o en el citoplasma. Para investigar cuáles son las posibles moléculas de señalización que median el crecimiento celular y la síntesis de ADN inducidos por SLC45A2-AMACR, se realizó un cribado mediante la técnica de doble híbrido en levadura de la biblioteca de doble híbrido en levadura de la próstata usando pBD-SLC45A2-AMACR. Después de 3 rondas de cribado metabólico, se identificaron 15 clones únicos que contienen proteínas de unión a SLC45A2-AMACR. Uno de estos clones codifica inositol-polifosfato 1 de tipo fosfatasa (INPPL1, también denominado SHIP2). SHIP2 es un dominio SH2 que contiene inositol fosfatasa que convierte PIP3(3,4,5) en PIP2(3,4). A diferencia de Pten, que convierte PIP3(3,4,5) en una PIP2(4,5) inactiva, la PIP2(3,4) generada por SHIP2 tiene una unión de mayor afinidad con AKT que la PIP3(3,4,5), y así hiperactiva el sistema AKT. La interacción entre SLC45A2 y SHIP2 se validó mediante análisis de cotransfección de doble híbrido en levadura y ensayos de coinmunoprecipitación en células que expresaban SLC45A2-AMACR (Figuras 25G-H). La inducción de la expresión de SLC45A2-AMACR en 2 clones diferentes de células RWPE1 generó un nivel 2,1 y 2,3 veces mayor de PIP2(3,4), respectivamente. Estos resultados indican que la unión de SLC45A2-AMACR y SHIP2 lleva a la activación de la actividad de la fosfatasa SHIP2 y probablemente al sistema de señalización de AKT.
Selección terapéutica de SLC45A2-AMACR como diana usando un inhibidor de la racemasa. Para investigar si seleccionar SLC45A2-AMACR como diana es un planteamiento viable para tratar el cáncer de próstata, los inventores eligieron 2 planteamientos: 1) Interceptar el sistema SLC45A2-AMACR/SHIP2-Akt con moléculas pequeñas; y 2) bloquear la actividad racemasa ectópica de SLC45A2-AMACR con ebselen o trifluoro-ibuprofeno. Sorprendentemente, inhibidores tanto de SHIP2 como de MTOR destruyeron las células PC3 de forma eficaz, independientemente de si estaban transformadas con SLC45A2-AMACR. La expresión de SLC45A2-AMACR solo sensibilizó moderadamente las células PC3 a la rapamicina. Esto probablemente se deba al estado negativo de Pten de las células PC3, por lo que el sistema de Akt está completamente activado independientemente de la presencia de SLC45A2-AMACR. Por otro lado, cuando los inventores aplicaron ebselen, potente inhibidor de la racemasa de AMACR, a células PC3 que expresaban SLC45A2-AMACR, se encontró una inhibición del crecimiento celular 5 veces mayor en las células PC3 transformadas con pCDNA4-SLC45A2-AMACR-FLAG/pCDNA6 con respecto a los controles. En cambio, las células RWPE1 no transformadas y las células NIH3T3 que expresaban poca AMACR eran en gran medida insensibles a la destrucción por ebselen (Figura 26). La sensibilidad diferencial a los inhibidores de AMACR por parte de las células normales frente a las células cancerosas puede resultar muy útil en el tratamiento del cáncer de próstata positivo para este gen de fusión.
11.2. Referencias
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2. Krolewski, J. J., Lee, R., Eddy, R., Shows, T. B. y Dalla-Favera, R. (1990) Identification and chromosomal mapping of new human tyrosine kinase genes. Oncogene 5(3), 277-282.
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar si un sujeto tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo que comprende: determinar si una célula de cáncer de próstata obtenida del sujeto contiene un gen de fusión MAN2A1-FER, indicando la presencia del gen de fusión que el sujeto tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo.
2. El método de la reivindicación 1 en donde el gen de fusión se detecta mediante análisis FISH; o en donde el gen de fusión se detecta mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa; o en donde el cáncer de próstata progresivo está en forma de recaída; o en donde el cáncer de próstata progresivo está en forma de recaída rápida; o que comprende, además, determinar una puntuación de nomograma del sujeto.
3. Un inhibidor específico del gen de fusión MAN2A1-FER para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata en un sujeto para el que se ha determinado que tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo, determinado por la presencia del gen de fusión en una célula de cáncer de próstata obtenida del sujeto.
4. Un agente que inhibe el producto de un gen de fusión MAN2A1-FER para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata en un sujeto para el que se ha determinado que tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo, determinado por la presencia del gen de fusión en una célula de cáncer de próstata obtenida del sujeto.
5. Un ARNip que tiene como diana un gen de fusión MAN2A1-FER para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata en un sujeto para el que se ha determinado que tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo, determinado por la presencia del gen de fusión en una célula de cáncer de próstata obtenida del sujeto.
6. Un agente anticanceroso para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata en un sujeto para el que se ha determinado que tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo, determinado por la presencia de un gen de fusión MAN2A1-FER en una célula de cáncer de próstata obtenida del sujeto.
7. Un inhibidor de FER para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata en un sujeto con mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo según lo determinado por la presencia de un gen de fusión MAN2A1-FER en una célula de cáncer de próstata obtenida del sujeto.
8. El inhibidor para su uso según la reivindicación 3, el agente para su uso según la reivindicación 4, el ARNip para su uso según la reivindicación 5, el agente anticanceroso para su uso según la reivindicación 6 o el inhibidor de FER para su uso según la reivindicación 7, en donde se determina que el sujeto tiene un mayor riesgo de recaída rápida; o en donde se determina que el sujeto tiene un mayor riesgo de recaída.
9. Un equipo para detectar un gen de fusión MAN2A1-FER, que comprende una o más sondas específicas para el gen de fusión MAN2A1-FER para detectar el gen de fusión MAN2A1-FER o uno o más pares de cebadores específicos para el gen de fusión MAN2A1-FER para detectar el gen de fusión MAN2A1-FER.
10. Un equipo para el tratamiento del cáncer de próstata que comprende cebadores de ácido nucleico o sondas de ácido nucleico específicos para un gen de fusión MAN2A1-FER para detectar el gen de fusión MAN2A1-FER.
11. Un inhibidor de EGFR para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata en un sujeto con mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo según lo determinado por la presencia de MAN2A1-FER en una célula de cáncer de próstata obtenida del sujeto.
12. El inhibidor de FER para su uso según la reivindicación 7, en donde el inhibidor de FER es crizotinib.
13. El inhibidor de EGFR para uso según la reivindicación 11, en donde el inhibidor de EGFR es canertinib.
14. Un agente capaz de editar el genoma dirigido para su uso en un método para tratar o prevenir el cáncer de próstata en un sujeto, comprendiendo el método (i) determinar si un sujeto tiene un mayor riesgo de manifestar cáncer de próstata progresivo que comprende determinar si una muestra del sujeto contiene un gen de fusión MAN2A1-FER; y (ii) cuando la muestra contiene el gen de fusión, por lo que el sujeto tiene un mayor riesgo, realizar un procedimiento de edición genómica usando el agente para que tenga como diana el gen de fusión presente dentro de una o más células de cáncer de próstata del sujeto.
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