KR20190130613A - 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제 - Google Patents

핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제 Download PDF

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KR20190130613A
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데이비드 알. 리우
알렉시스 크리스틴 코모르
리웨이 첸
홀리 에이. 리스
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프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
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Abstract

본 개시내용의 일부 측면은 세포 또는 대상체의 게놈 내에서, 예를 들어, 인간 게놈 내에서 단일 부위를 편집하는 것을 포함하는, 핵산의 표적화된 편집에 유용한 전략, 시스템, 시약, 방법, 및 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp), 예를 들어, Cpf1 또는 그의 변이체, 및 핵산 편집 단백질 또는 단백질 도메인, 예를 들어, 데아미나제 도메인의 융합 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, 표적화된 핵산 편집 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 표적화된 핵산 편집 단백질, 예를 들어, napDNAbp (예를 들어, CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2C3, 및 아르고노트) 및 핵산 편집 단백질 또는 도메인의 융합 단백질의 생성을 위한 시약 및 키트가 제공된다.

Description

핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제
핵산 서열의 표적화된 편집, 예를 들어, 게놈 DNA 내로의 특이적 변형의 표적화된 절단 또는 표적화된 도입은 유전자 기능의 연구를 위한 매우 유망한 접근법이며, 또한 인간 유전 질환에 대한 새로운 요법을 제공하는 잠재력을 갖는다.1 이상적인 핵산 편집 기술은 3가지 특징을 갖는다: (1) 목적하는 변형을 설치하는 높은 효율; (2) 최소의 오프-타겟(off-target) 활성; 및 (3) 주어진 핵산에서의 임의의 부위, 예를 들어, 인간 게놈 내의 임의의 부위를 정확하게 편집하도록 프로그램되는 능력.2 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN),3 전사 활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN),4 및 가장 최근, RNA-가이드된 DNA 엔도뉴클레아제 Cas95를 포함한 현행 게놈 조작 도구는 게놈에서 서열-특이적 DNA 절단을 실시한다. 이 프로그램가능한 절단은 비-상동 말단 연결 (NHEJ)을 통한 절단 부위에서의 DNA의 돌연변이, 또는 상동성-지정 복구 (HDR)를 통한 절단 부위 주위의 DNA의 대체를 발생시킬 수 있다.6,7
현재의 기술에 대한 한 가지 결점은 NHEJ 및 HDR 둘 다가 전형적으로 보통의 유전자 편집 효율 뿐만 아니라, 목적하는 변경과 경쟁할 수 있는 원치 않는 유전자 변경을 발생시키는 확률적 과정라는 점이다.8 많은 유전 질환은 원칙적으로 게놈에서의 특이적 위치에서 특이적 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 질환과 연관된 유전자의 특이적 코돈에서의 C에서 T로의 변화)를 실시함으로써 치료될 수 있기 때문에,9 이러한 정확성 유전자 편집을 달성하기 위한 프로그램가능한 방식의 개발은 강한 새로운 연구 도구, 뿐만 아니라 유전자 편집-기반 인간 치료제에 대한 잠재적인 새로운 접근법 둘 다를 제시할 것이다.
핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp), 예컨대 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 시스템은 다양한 유기체 및 세포주에서 강건하고 일반적인 게놈 조작을 가능하게 하도록 변형된11 최근 발견된 원핵생물 적응 면역계이다.10 CRISPR-Cas (CRISPR 연관된) 시스템은 염기-쌍형성을 통해 복합체를 표적 DNA 서열에 국재화하는 가이드로서 RNA 분자 (sgRNA)를 사용하는 단백질-RNA 복합체이다.12 천연 시스템에서, Cas 단백질은 그 후 표적화된 DNA 서열을 절단하는 엔도뉴클레아제로서 작용한다.13 표적 DNA 서열은 sgRNA에 양쪽 상보적이고, 또한 시스템이 기능하도록 하기 위해 상보적 영역의 3'-말단에 "프로토스페이서-인접 모티프" (PAM)를 함유해야 한다.14
공지된 Cas 단백질 중에서, 에스. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9는 게놈 조작을 위한 도구로서 주로 광범위하게 사용되었다.15 이 Cas9 단백질은 2개의 별개의 뉴클레아제 도메인을 함유하는 큰 다중-도메인 단백질이다. 점 돌연변이는 Cas9 내로 도입되어 뉴클레아제 활성을 폐지할 수 있으며, 이는 sgRNA-프로그램된 방식으로 DNA에 결합하는 그의 능력을 여전히 보유하는 데드 Cas9 (dCas9)를 발생시킨다.16 원칙적으로, 또 다른 단백질 또는 도메인에 융합되는 경우, dCas9는 단순히 적절한 sgRNA와의 공동-발현에 의해 그 단백질 또는 도메인을 사실상 임의의 DNA 서열에 표적화할 수 있다.
게놈 조작 목적을 위한 dCas9 복합체의 잠재력은 엄청나다. 단백질을 sgRNA에 의해 프로그램된 게놈에서의 특이적 부위로 가져오는 그의 고유한 능력은 이론적으로 데아미나제 (예를 들어, 시티딘 데아미나제), 전사 활성인자, 전사 리프레서, 히스톤-변형 단백질, 인테그라제, 및 레콤비나제를 포함한 뉴클레아제를 넘어 다양한 부위-특이적 게놈 조작 도구로 개발될 수 있다.11 이들 잠재적 용도 중 일부는 최근 RNA-가이드된 전사 활성인자,17,18 전사 리프레서,16,19,20 및 크로마틴 변형 효소21를 제공하기 위한 전사 활성인자와의 dCas9 융합물을 통해 실행되었다. 다양한 sgRNA와의 이들 융합물의 단순한 공동-발현은 표적 유전자의 특이적 발현을 발생시킨다. 이들 중대한 연구는 게놈의 정확한 조작을 위한 용이하게 프로그램가능한 서열-특이적 이펙터의 설계 및 구축을 위한 방식을 조성하였다.
본 개시내용의 일부 측면은 링커에 의해 융합된 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp), 예를 들어 CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, 또는 아르고노트 단백질, 및 시티딘 데아미나제 도메인의 특정 구성이 표적 시티딘 잔기를 효율적으로 탈아미노화하는 데 유용하다는 인식에 기초한다. 본 개시내용의 다른 측면은 링커를 통해 napDNAbp의 N-말단에 융합된 시티딘 데아미나제 도메인을 갖는 핵염기 편집 융합 단백질이 이중 가닥 DNA 표적 분자에서 표적 핵산을 효율적으로 탈아미노화할 수 있었다는 인식에 관한 것이다. 예를 들어, 하기 실시예 3 및 4를 참조하며, 이는 본원에서 염기 편집제로도 지칭되는 융합 단백질이 다른 염기 편집제, 예컨대 UGI 도메인을 갖지 않는 염기 편집제보다 더 적은 indel을 생성하고, 더 효율적으로 표적 핵산을 탈아미노화한다는 것을 입증한다. 본 개시내용의 다른 측면은 링커를 통해 napDNAbp의 N-말단에 융합된 시티딘 데아미나제 도메인을 갖는 핵염기 편집 융합 단백질이, 융합 단백질이 1개 초과의 UGI 도메인으로 구성된 경우에 더 높은 효율 및 크게 개선된 생성물 순도를 갖는 염기 편집을 수행한다는 인식에 관한 것이다. 예를 들어, 실시예 17을 참조하며, 이는 2개의 UGI 도메인을 포함하는 융합 단백질 (예를 들어, 염기 편집제)이 다른 염기 편집제, 예컨대 1개의 UGI 도메인을 포함하는 것들보다 더 적은 indel을 생성하고 표적 핵산을 더 효율적으로 탈아미노화한다는 것을 입증한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp); (ii) 시티딘 데아미나제 도메인; 및 (iii) 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인을 포함하며, 여기서 napDNAbp는 CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3 또는 아르고노트 단백질이다. 일부 실시양태에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 CasX 단백질이다. 일부 실시양태에서, CasX 단백질은 서열식별번호: 29 또는 30과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CasX 단백질은 서열식별번호: 29 또는 30의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp); (ii) 시티딘 데아미나제 도메인; (iii) 제1 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인; 및 (iv) 제2 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인을 포함하며, 여기서 napDNAbp는 Cas9, dCas9 또는 Cas9 니카제 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 dCas9 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3 또는 아르고노트 단백질이다. 일부 실시양태에서, dCas9 단백질은 에스. 피오게네스 dCas9 (SpCas9d)이다. 일부 실시양태에서, dCas9 단백질은 D10A 돌연변이를 보유하는 에스. 피오게네스 dCas9이다. 일부 실시양태에서, dCas9 단백질은 서열식별번호: 6 또는 7과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, dCas9 단백질은 서열식별번호: 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, dCas9 단백질은 에스. 아우레우스(S. aureus) dCas9 (SaCas9d)이다. 일부 실시양태에서, dCas9 단백질은 D10A 돌연변이를 보유하는 에스. 아우레우스 dCas9이다. 일부 실시양태에서, dCas9 단백질은 서열식별번호: 33-36과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, dCas9 단백질은 서열식별번호: 33-36의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 CasY 단백질이다. 일부 실시양태에서, CasY 단백질은 서열식별번호: 31과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CasY 단백질은 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 Cpf1 또는 Cpf1 돌연변이체 단백질이다. 일부 실시양태에서, Cpf1 또는 Cpf1 돌연변이체 단백질은 서열식별번호: 9-24 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cpf1 또는 Cpf1 돌연변이체 단백질은 서열식별번호: 9-24 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 C2c1 단백질이다. 일부 실시양태에서, C2c1 단백질은 서열식별번호: 26과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, C2c1 단백질은 서열식별번호: 26의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 C2c2 단백질이다. 일부 실시양태에서, C2c2 단백질은 서열식별번호: 27과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, C2c2 단백질은 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 C2c3 단백질이다. 일부 실시양태에서, C2c3 단백질은 서열식별번호: 28과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, C2c3 단백질은 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 아르고노트 단백질이다. 일부 실시양태에서, 아르고노트 단백질은 서열식별번호: 25와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아르고노트 단백질은 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 융합 단백질이 큰 비율의 indel을 생성하지 않으면서 1개 이상의 돌연변이 (예를 들어, C에서 T로의 돌연변이)를 생성할 수 있다는 인식에 기초한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 (예를 들어, 염기 편집 단백질) 중 임의의 것은 10% 미만의 indel을 생성한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 (예를 들어, 염기 편집 단백질) 중 임의의 것은 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5.5%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만의 indel을 생성한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 napDNAbp 및 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 1 (APOBEC1) 데아미나제 도메인을 포함하며, 여기서 데아미나제 도메인은 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604)를 포함하는 링커를 통해 napDNAbp 도메인의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 본원에 제공된 napDNAbp 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 래트 APOBEC1 (서열식별번호: 76)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간 APOBEC1 (서열식별번호: 74)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 pmCDA1 (서열식별번호: 81)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간 APOBEC3G (서열식별번호: 60)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 (서열식별번호: 82-84) 중 어느 하나의 인간 APOBEC3G 변이체이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 napDNAbp 및 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 1 촉매 폴리펩티드-유사 3G (APOBEC3G) 데아미나제 도메인을 포함하며, 여기서 데아미나제 도메인은 임의의 길이 또는 조성 (예를 들어, 아미노산 서열, 펩티드, 중합체, 또는 결합)의 링커를 통해 napDNAbp 도메인의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 605)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 napDNAbp 및 시티딘 데아미나제 1 (CDA1) 데아미나제 도메인을 포함하며, 여기서 데아미나제 도메인은 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604)를 포함하는 링커를 통해 napDNAbp 도메인의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 605)를 포함한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 본원에 제공된 napDNAbp 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 napDNAbp 및 활성화-유도된 시티딘 데아미나제 (AID) 데아미나제 도메인을 포함하며, 여기서 데아미나제 도메인은 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604)를 포함하는 링커를 통해 napDNAbp 도메인의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 605)를 포함한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 본원에 제공된 napDNAbp 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 링커에 의해 융합된 napDNAbp, 및 시티딘 데아미나제 도메인의 특정 구성이 표적 시티딘 잔기를 효율적으로 탈아미노화하는 데 유용하다는 인식에 기초한다. 본 개시내용의 다른 측면은 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604)를 포함하는 링커를 통해 napDNAbp의 N-말단에 융합된 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 1 (APOBEC1) 데아미나제 도메인을 갖는 핵염기 편집 융합 단백질이 이중 가닥 DNA 표적 분자에서 표적 핵산을 효율적으로 탈아미노화할 수 있었다는 인식에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 napDNAbp 도메인 및 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 1 (APOBEC1) 데아미나제 도메인을 포함하며, 여기서, 데아미나제 도메인은 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604)를 포함하는 링커를 통해 napDNAbp의 N-말단에 융합된다.
본 개시내용의 일부 측면은 대상체의 게놈, 예를 들어, 인간의 게놈 내에서 단일 부위를 편집하는 것을 포함하는, 핵산의 표적화된 편집에 유용한 전략, 시스템, 시약, 방법, 및 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp (예를 들어, CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3 또는 아르고노트 단백질) 및 데아미나제 또는 데아미나제 도메인의 융합 단백질이 제공된다. 일부 실시양태에서, 표적화된 핵산 편집 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 표적화된 핵산 편집 단백질, 예를 들어, napDNAbp 및 데아미나제 또는 데아미나제 도메인의 융합 단백질의 생성을 위한 시약 및 키트가 제공된다.
본 개시내용의 일부 측면은 제2 단백질 (예를 들어, 효소 도메인, 예컨대 시티딘 데아미나제 도메인)에 융합되고, 따라서 융합 단백질을 형성하는 본원에 제공된 바와 같은 napDNAbp를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질은 효소 도메인, 또는 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 효소 도메인은 뉴클레아제, 니카제, 레콤비나제, 데아미나제, 메틸트랜스퍼라제, 메틸라제, 아세틸라제, 아세틸트랜스퍼라제, 전사 활성인자, 또는 전사 리프레서 도메인이다. 일부 실시양태에서, 효소 도메인은 핵산 편집 도메인이다. 일부 실시양태에서, 핵산 편집 도메인은 데아미나제 도메인이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 시토신 데아미나제 또는 시티딘 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 패밀리 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC1 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC2 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3A 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3B 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3C 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3D 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3E 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3F 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3G 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3H 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC4 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 활성화-유도된 데아미나제 (AID)이다. 데아미나제는 임의의 적합한 유기체 (예를 들어, 인간 또는 래트)로부터의 것일 수 있다는 것이 인지되어야 한다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이, 소, 개, 래트, 또는 마우스로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 래트 APOBEC1 (서열식별번호: 76)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간 APOBEC1 (서열식별번호: 74)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 pmCDA1이다.
본 개시내용의 일부 측면은 (i) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3 또는 아르고노트 단백질 도메인; 및 (ii) 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 1 (APOBEC1) 데아미나제 도메인을 포함하며, 데아미나제 도메인이 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604)의 아미노산 서열을 포함하는 링커를 통해 napDNAbp의 N-말단에 융합된 것인 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 래트 APOBEC1 (서열식별번호: 76)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간 APOBEC1 (서열식별번호: 74)이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 591의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 5737의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 pmCDA1 (서열식별번호: 81)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간 APOBEC3G (서열식별번호: 60)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 서열식별번호: 82-84 중 어느 하나의 인간 APOBEC3G 변이체이다.
본 개시내용의 다른 측면은 데아미나제 도메인, napDNAbp 도메인 및 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인을 포함하는 융합 단백질이 핵산 분자에서 표적 뉴클레오티드를 탈아미노화하기 위한 개선된 효율을 입증한다는 인식에 관한 것이다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, U:G 헤테로듀플렉스 DNA의 존재에 대한 세포의 DNA-복구 반응은 세포에서의 핵염기 편집 효율의 감소의 원인이 될 수 있다. 우라실 DNA 글리코실라제 (UDG)는 세포에서 DNA로부터 U의 제거를 촉매하며, 이는 가장 흔한 결과로서 U:G 쌍의 C:G 쌍으로의 복귀를 갖는 염기 절제 복구를 개시할 수 있다. 본원에 입증된 바와 같이, 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 (UGI)는 인간 UDG 활성을 억제할 수 있다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 염기 절제 복구는 단일 가닥에 결합하고/거나, 편집된 염기를 차단하고/거나, UGI를 억제하고/거나, 염기 절제 복구를 억제하고/거나, 편집된 염기를 보호하고/거나, 비-편집단 가닥의 "고정"을 촉진시키는 등의 분자에 의해 억제될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 UGI 도메인에 융합된 napDNAbp-시티딘 데아미나제 도메인을 포함하는 융합 단백질을 고려한다.
본 개시내용의 추가 측면은 데아미나제 도메인, napDNAbp 도메인, 및 1개 초과의 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 초과의 UGI 도메인)을 포함하는 융합 단백질이 핵산 분자에서의 표적 뉴클레오티드를 탈아미노화하기 위한 개선된 효율 및/또는 개선된 핵산 생성물 순도를 입증한다는 인식에 관한 것이다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 제2 UGI 도메인의 부가는 G:U 염기 편집 중간체에 대한 UDG의 접근을 실질적으로 감소시킴으로써 염기 편집의 효율을 개선시킬 수 있다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 염기 편집제 중 임의의 것이 유의한 비율의 indel을 생성하지 않고, 특이적 뉴클레오티드 염기를 변형할 수 있다는 인식에 기초한다. 본원에 사용된 "indel"은 핵산 내의 뉴클레오티드 염기의 삽입 또는 결실을 지칭한다. 이러한 삽입 또는 결실은 유전자의 코딩 영역 내의 프레임 시프트 돌연변이를 야기할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산에서 삽입 또는 결실 (즉, indel)을 생성하지 않고, 핵산 내에서 특이적 뉴클레오티드를 효율적으로 변형시키는 (예를 들어 돌연변이시키거나 탈아미노화하는) 염기 편집제를 생성하는 것이 바람직하다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 편집제 중 임의의 것은 indel에 비해 보다 큰 비율의 의도된 변형 (예를 들어, 점 돌연변이 또는 탈아미노화)을 생성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 편집제 중 임의의 것은 목적하는 돌연변이의 특정 백분율을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 목적하는 돌연변이는 C에서 T로의 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 목적하는 돌연변이는 C에서 A로의 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 목적하는 돌연변이는 C에서 G로의 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 편집제 중 임의의 것은 목적하는 돌연변이의 적어도 1%를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 편집제 중 임의의 것은 목적하는 돌연변이의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 생성할 수 있다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 염기 편집제 중 임의의 것이 유의한 수의 비의도된 돌연변이, 예컨대 비의도된 점 돌연변이를 생성하지 않고, 핵산 (예를 들어 대상체의 게놈 내의 핵산)에서 의도된 돌연변이, 예컨대 점 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있다는 인식에 기초한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질의 데아미나제 도메인은 napDNAbp 도메인의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, UGI 도메인은 napDNAbp 도메인의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, napDNAbp 및 핵산 편집 도메인은 링커를 통해 융합된다. 일부 실시양태에서, napDNAbp 도메인 및 UGI 도메인은 링커를 통해 융합된다. 일부 실시양태에서, 제2 UGI 도메인은 제1 UGI 도메인의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, 제1 UGI 도메인 및 제2 UGI 도메인은 링커를 통해 융합된다.
특정 실시양태에서, 링커는 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 도메인 중 임의의 것을 연결하는 데 사용될 수 있다. 링커는 공유 결합만큼 단순할 수 있거나, 이는 다수의 원자 길이의 중합체 링커일 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드이거나, 아미노산에 기초한다.　 다른 실시양태에서, 링커는 펩티드-유사가 아니다.　 특정 실시양태에서, 링커는 공유 결합 (예를 들어, 탄소-탄소 결합, 디술피드 결합, 탄소-헤테로원자 결합 등)이다.　 특정 실시양태에서, 링커는 아미드 연결의 탄소-질소 결합이다.　 특정 실시양태에서, 링커는 시클릭 또는 아시클릭, 치환된 또는 비치환된, 분지된 또는 비분지된 지방족 또는 헤테로지방족 링커이다. 특정 실시양태에서, 링커는 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아미드, 폴리에스테르 등)이다.　 특정 실시양태에서, 링커는 아미노알칸산의 단량체, 이량체, 또는 중합체를 포함한다.　 특정 실시양태에서, 링커는 아미노알칸산 (예를 들어, 글리신, 에탄산, 알라닌, 베타-알라닌, 3-아미노프로판산, 4-아미노부탄산, 5-펜탄산 등)을 포함한다.　 특정 실시양태에서, 링커는 아미노헥산산 (Ahx)의 단량체, 이량체, 또는 중합체를 포함한다.　 특정 실시양태에서, 링커는 카르보시클릭 모이어티 (예를 들어, 시클로펜탄, 시클로헥산)에 기초한다. 다른 실시양태에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 (PEG)를 포함한다.　 다른 실시양태에서, 링커는 아미노산을 포함한다.　 특정 실시양태에서, 링커는 펩티드를 포함한다.　 특정 실시양태에서, 링커는 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 페닐 고리에 기초한다.　 링커는 펩티드에서 링커로 친핵체 (예를 들어, 티올, 아미노)의 부착을 용이하게 하는 관능화된 모이어티를 포함할 수 있다. 임의의 친전자체는 링커의 일부로서 사용될 수 있다. 예시적인 친전자체는 활성화된 에스테르, 활성화된 아미드, 마이클 수용자, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 아실 할라이드, 및 이소티오시아네이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 (GGGGS)n (서열식별번호: 607), (G)n (서열식별번호: 608), (EAAAK)n (서열식별번호: 609), (GGS)n (서열식별번호: 610), (SGGS)n (서열식별번호: 606), SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604), (XP)n (서열식별번호: 611), SGGS(GGS)n (서열식별번호: 612), SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 605), 또는 그의 임의의 조합을 포함하며, 여기서 n은 독립적으로 정수 1 내지 30이고, X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 (GGS)n (서열식별번호: 610)을 포함하며, 여기서 n은 1, 3 또는 7이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGS(GGS)n (서열식별번호: 612)을 포함하며, 여기서 n은 2이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 605)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 구조 [핵산 편집 도메인]-[임의적인 링커 서열]-[napDNAbp]-[임의적인 링커 서열]-[UGI]를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 구조 [핵산 편집 도메인]-[임의적인 링커 서열]-[UGI]-[임의적인 링커 서열]-[napDNAbp]; [UGI]-[임의적인 링커 서열]-[핵산 편집 도메인]-[임의적인 링커 서열]-[napDNAbp]; [UGI]-[임의적인 링커 서열]-[napDNAbp]-[임의적인 링커 서열]-[핵산 편집 도메인]; [napDNAbp]-[임의적인 링커 서열]-[UGI]-[임의적인 링커 서열]-[핵산 편집 도메인]; [napDNAbp]-[임의적인 링커 서열]-[핵산 편집 도메인]-[임의적인 링커 서열]-[UGI]; 또는 [핵산 편집 도메인]-[임의적인 링커 서열]-[napDNAbp]-[임의적인 링커 서열]-[제1 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[제2 UGI]를 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 편집 도메인은 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 편집 도메인은 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 시티딘 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 패밀리 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC1 데아미나제, APOBEC2 데아미나제, APOBEC3A 데아미나제, APOBEC3B 데아미나제, APOBEC3C 데아미나제, APOBEC3D 데아미나제, APOBEC3F 데아미나제, APOBEC3G 데아미나제, APOBEC3H 데아미나제 또는 APOBEC4 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 활성화-유도된 데아미나제 (AID)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 시티딘 데아미나제 1 (CDA1)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 칠성장어 CDA1 (pmCDA1) 데아미나제이다.
일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이, 소, 개, 래트 또는 마우스로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서 데아미나제는 래트로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 (서열식별번호: 76)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 래트 APOBEC1 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 (서열식별번호: 74)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 인간 APOBEC1 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 pmCDA1 (서열식별번호: 81)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간 APOBEC3G (서열식별번호: 60)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 (서열식별번호: 82-84) 중 어느 하나의 인간 APOBEC3G 변이체이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 서열식별번호: 49-84에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다.
일부 실시양태에서, UGI 도메인은 서열식별번호: 134와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI 도메인은 서열식별번호: 134에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 바와 같은 napDNAbp 융합 단백질, 및 napDNAbp에 결합된 가이드 RNA를 포함하는 복합체를 제공한다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 napDNAbp, 융합 단백질 또는 복합체를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용의 일부 측면은 DNA 분자를 (a) 본원에 제공된 바와 같은 napDNAbp 또는 융합 단백질과, 및 가이드 RNA와 (여기서 가이드 RNA는 약 15-100 뉴클레오티드 길이이고, 표적 서열에 상보적인 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드를 포함함); (b) 또는 본원에 제공된 바와 같은 napDNAbp, napDNAbp 융합 단백질, 또는 gRNA를 갖는 napDNAbp 또는 napDNAbp 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 일부 측면은 (a) 본원에 제공된 바와 같은 napDNAbp 또는 napDNAbp 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 (b) (a)의 서열의 발현을 유도하는 이종 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 가이드 RNA 백본을 코딩하는 발현 구축물을 추가로 포함하며, 여기서 구축물은 표적 서열과 동일하거나 그에 상보적인 핵산 서열의 가이드 RNA 백본 내로의 클로닝을 허용하도록 위치된 클로닝 부위를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 바와 같은 융합 단백질의 napDNAbp를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 개시내용의 일부 측면은 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 이종 프로모터를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 바와 같은 napDNAbp 단백질, 융합 단백질, 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
Cas9 도메인 (예를 들어 Cas9, nCas9, 또는 dCas9)을 포함하는 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 본원에 제공된 napDNAbp 중 임의의 것, 예를 들어 CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3 또는 아르고노트 단백질로 대체될 수 있다는 것이 인지되어야 한다.
상기 리포터 시스템의 예시적 실시양태의 설명은 단지 예시적 목적으로 제공되며, 제한하는 것으로 비의도된다. 추가의 리포터 시스템, 예를 들어 상기 상세히 기재된 예시적 시스템의 변형이 또한 본 개시내용에 포괄된다.
상기 요약은 비제한적 방식으로 본원에 개시된 기술의 실시양태, 이점, 특색 및 용도의 일부를 예시하는 것으로 의도된다. 본원에 개시된 기술의 다른 실시양태, 이점, 특색 및 용도는 상세한 설명, 도면, 실시예 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 단일 가닥 DNA 기질에 대한 데아미나제의 데아미나제 활성을 나타낸다. 무작위화된 PAM 서열 (NNN PAM)을 사용한 단일 가닥 DNA 기질을 음성 대조군으로서 사용하였다. 사용된 정규 PAM 서열은 (NGG PAM)을 포함한다.
도 2는 단일 가닥 DNA 기질에 대한 Cas9:데아미나제 융합 단백질의 활성을 나타낸다.
도 3은 Cas9:데아미나제:sgRNA 복합체에 의한 이중 가닥 DNA 기질 결합을 예시한다.
도 4는 이중 가닥 DNA 탈아미노화 검정을 예시한다.
도 5는 Cas9 융합물이 이중-가닥 DNA 표적 서열의 위치 3-11 (도 5에서의 개략도에 따라 넘버링됨)을 표적화할 수 있다는 것을 입증한다. 상부 겔: 1 μM rAPOBEC1-GGS-dCas9, 125 nM dsDNA, 1 당량 sgRNA. 중간 겔: 1 μM rAPOBEC1-(GGS)3(서열식별번호: 610)-dCas9, 125 nM dsDNA, 1 당량 sgRNA. 하부 겔: 1.85 μM rAPOBEC1-XTEN-dCas9, 125 nM dsDNA, 1 당량 sgRNA.
도 6은 교정 가이드 RNA, 예를 들어, 교정 sgRNA가 데아미나제 활성에 요구된다는 것을 입증한다.
도 7은 데아미나제-dCas9:sgRNA 복합체에 의한 생체내 표적 서열의 표적 DNA 결합의 메카니즘을 예시한다.
도 8은 예시적인 질환-연관된 표적 서열의 성공적인 탈아미노화를 나타낸다.
도 9는 His6-rAPOBEC1-XTEN-dCas9를 사용한 시험관내 C→T 편집 효율을 나타낸다.
도 10은 HEK293T 세포에서의 C→T 편집 효율이 UGI와의 융합에 의해 크게 증진된다는 것을 나타낸다.
도 11a 내지 11c는 NBE1이 시험관내에서 특이적, 가이드 RNA-프로그램된 C에서 U로의 전환을 매개한다는 것을 나타낸다. 도 11a: 핵염기 편집 전략. 가이드 RNA에 의해 특정된 유전자좌에 표적 C를 갖는 DNA가 dCas9에 의해 결합되며, 이는 DNA 기질의 국소적 변성을 매개한다. 테더링된 APOBEC1 효소에 의한 시티딘 탈아미노화는 표적 C를 U로 전환시킨다. 생성된 G:U 헤테로듀플렉스는 DNA 복제 또는 복구 후에 A:T 염기 쌍으로 영구적으로 전환될 수 있다. U가 주형 DNA 가닥 중에 있는 경우, 이는 또한 전사 후에 G에서 A로의 돌연변이를 함유하는 RNA 전사체를 발생시킬 것이다. 도 11b: 대략 5개의 뉴클레오티드의 활성 윈도우를 나타내는 탈아미노화 검정. 37℃에서 2시간 동안 dsDNA 기질과 함께 NBE1-sgRNA 복합체의 인큐베이션 후, 5' 형광단-표지된 DNA를 단리하고, 37℃에서 1시간 동안 USER 효소 (우라실 DNA 글리코실라제 및 엔도뉴클레아제 VIII)와 함께 인큐베이션하여 임의의 우라실의 부위에서 DNA 절단을 유도하였다. 생성된 DNA를 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분할하고, 임의의 형광단-연결된 가닥을 가시화하였다. 각각의 레인은 프로토스페이서 내의 표적 C의 위치에 따라, 또는 표적 C가 존재하지 않는 경우 "-"로 표지되며, 이는 PAM으로부터 원위의 염기를 위치 1로서 카운팅한다. 도 11c: NBE1의 서열 특이성 및 sgRNA-의존성을 나타내는 데아미나제 검정. 위치 7에 표적 C를 갖는 DNA 기질을 도 11b에서와 같이 교정 sgRNA, 미스매칭된 sgRNA와 함께, 또는 sgRNA 없이 NBE1과 함께 인큐베이션하였다. C에서 U로의 편집은 미스매칭된 sgRNA에서 또는 sgRNA가 없는 것에서 관찰되지 않는다. 양성 대조군 샘플은 위치 7에 합성적으로 혼입된 U를 갖는 DNA 서열을 함유한다.
도 12a 내지 12b는 시험관내에서의 핵염기 편집 효율에 대한 서열 컨텍스트 및 표적 C 위치의 효과를 나타낸다. 도 12a: 시험관내에서의 편집 효율에 대한 표적 C 주위의 서열을 변화시키는 것의 효과. 프로토스페이서 서열 5'-TTATTTCGTGGATTTATTTA-3' (서열식별번호: 591)에서 C7에 대한 표적화된 가닥의 80% (양쪽 가닥으로부터의 총 서열분석 판독물의 40%)의 탈아미노화 수율은 1.0으로서 정의되었으며, 위치 1-6 및 8-13에 모든 가능한 단일-염기 돌연변이를 함유하는 기질의 상대적 탈아미노화 효율이 나타나 있다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 2회 이상의 독립적인 생물학적 반복의 평균 및 표준 편차를 반영한다. 도 12b: 시험관내에서의 편집 효율에 대한 각각의 NC 모티프의 위치적 효과. 각각의 NC 표적 모티프는 우측에 제시된 서열에 지시된 바와 같이 프로토스페이서 내의 위치 1에서 8까지 다양화되었다 (PAM은 적색으로 나타냄, 프로토스페이서 플러스 프로토스페이서에 대해 5'의 1개의 염기가 또한 제시됨). NBE1과 함께 인큐베이션 후의 넘버링된 표적 C 위치의 각각에 T를 함유하는 총 서열 판독물의 백분율이 그래프에 나타나 있다. 시험관내에서 최대 가능한 탈아미노화 수율은 총 서열분석 판독물의 50% (표적화된 가닥의 100%)라는 것에 주목한다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 2회 또는 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 및 표준 편차를 반영한다. 도 12b는 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 619 내지 626을 나타낸다.
도 13a 내지 13c는 인간 세포에서의 핵염기 편집을 나타낸다. 도 13a: 핵염기 편집제에 의해 표적화된 6개의 포유동물 세포 게놈 유전자좌의 프로토스페이서 및 PAM 서열. 표적 C는 프로토스페이서 내의 그의 위치에 상응하는 아래첨자 수로 지시된다. 도 13a는 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 127 내지 132를 나타낸다. 도 13b: HEK293T 세포를 NBE1, NBE2, 또는 NBE3 및 적절한 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고, 6개의 유전자좌에서 고처리량 DNA 서열분석에 의해 분석하였다. 표적 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는, 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 모든 6개의 게놈 유전자좌에서 NBE1, NBE2, 및 NBE3에 대해, 및 6개의 부위 중 3개 (EMX1, HEK293 부위 3, 및 HEK293 부위 4)에서 공여자 HDR 주형을 갖는 야생형 Cas9에 대해 나타나 있다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 및 표준 편차를 반영한다. 도 13c: 모든 6개의 게놈 유전자좌에 대해 NBE2 및 NBE3으로의, 또는 6개의 부위 중 3개 (EMX1, HEK293 부위 3, 및 HEK293 부위 4)에서 야생형 Cas9 및 HDR에 대한 단일-가닥 DNA 주형으로의 HEK293T 세포의 처리 후의, 방법에 기재된 바와 같이 계산된 indel 형성의 빈도가 나타나 있다. 값은 상이한 날에 수행된 적어도 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균을 반영한다.
도 14a 내지 14c는 포유동물 세포에서의 3가지 질환-관련 돌연변이의 NBE2- 및 NBE3-매개된 교정을 나타낸다. 각각의 부위에 대해, 프로토스페이서의 서열은 돌연변이의 명칭의 우측에 지시되고, PAM 및 돌연변이의 원인이 되는 염기는 프로토스페이서 내의 그의 위치에 상응하는 아래첨자 수를 갖는 볼드체로 지시된다. 각각의 질환-연관된 대립유전자 위의 아미노산 서열은 적색으로의 핵염기 편집 후에 교정된 아미노산 서열과 함께 나타나 있다. 각각의 서열 아래에는 상응하는 염기를 갖는 총 서열분석 판독물의 백분율이 있다. 세포를 NBE2 또는 NBE3 및 적절한 sgRNA를 코딩하는 플라스미드로 뉴클레오펙션시켰다. 뉴클레오펙션 2일 후에, 게놈 DNA를 추출하고, HTS에 의해 분석하여 병원성 돌연변이 교정을 평가하였다. 도 14a: 알츠하이머병-연관된 APOE4 대립유전자는 총 판독물의 11% (뉴클레오펙션된 성상세포의 44%)에서 NBE3에 의해 마우스 성상세포에서의 APOE3'로 전환된다. 2개의 인근의 C는 또한 T로 전환되지만, 생성된 단백질의 예측된 서열 (서열식별번호: 627)에 대한 변화는 없다. 도 14b: 암-연관된 p53 N239D 돌연변이는 돌연변이에 대해 이형접합성인 처리된 인간 림프종 세포의 11% (뉴클레오펙션된 세포의 12%)에서 NBE2에 의해 교정된다 (서열식별번호: 628). 도 14c: p53 Y163C 돌연변이는 뉴클레오펙션된 인간 유방암 세포의 7.6%에서 NBE3에 의해 교정된다 (서열식별번호: 629).
도 15a 내지 15d는 핵염기 편집에 대한 데아미나제-dCas9 링커 길이 및 조성의 효과를 나타낸다. GGS (도 15a), (GGS)3 (서열식별번호: 610) (도 15b), XTEN (도 15c), 또는 (GGS)7 (서열식별번호: 610)의 데아미나제-Cas9 링커를 갖는 핵염기 편집제의 탈아미노화 윈도우를 나타내는 겔-기반 데아미나제 검정 (도 15d). 37℃에서 2시간 동안 125 nM dsDNA 기질과 함께 1.85 μM 편집제-sgRNA 복합체의 인큐베이션 후, 염료-접합된 DNA를 단리하고, USER 효소 (우라실 DNA 글리코실라제 및 엔도뉴클레아제 VIII)와 함께 37℃에서 추가의 1시간 동안 인큐베이션하여 임의의 우라실의 부위에서 DNA 백본을 절단하였다. 생성된 DNA를 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분할하고, 염료-접합된 가닥을 영상화하였다. 각각의 레인은 프로토스페이서 내의 표적 C의 위치에 따라, 또는 표적 C가 존재하지 않는 경우 -로 넘버링된다. 8U는 위치 8에 합성적으로 혼입된 U를 갖는 양성 대조군 서열이다.
도 16a 내지 16b는 NBE1이 시험관내에서 질환-관련 돌연변이를 교정할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 16a: 7가지 질환-관련 돌연변이의 프로토스페이서 및 PAM 서열. 각 경우에 질환-연관된 표적 C는 프로토스페이서 내의 그의 위치를 반영하는 아래첨자 수로 지시된다. 둘 다의 APOE4 SNP를 제외한 모든 돌연변이에 대해, 표적 C는 주형 (비-코딩) 가닥에 있다. 도 16a는 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 631 내지 636을 나타낸다. 도 16b: NBE1와 함께 인큐베이션, DNA 단리, 및 USER 효소와 함께 인큐베이션하여 U를 함유하는 위치에서 DNA를 절단하기 전 (-) 및 후 (+)의 각각의 dsDNA 올리고뉴클레오티드를 나타내는 데아미나제 검정. USER 효소를 갖는 프로토스페이서 내의 다양한 위치에 U를 함유하는 합성 올리고뉴클레오티드의 인큐베이션으로부터의 양성 대조군 레인이 U의 위치를 지시하는 상응하는 수와 함께 나타나 있다.
도 17은 NBE1의 프로세싱성을 나타낸다. 8개의 연속적 C를 함유하는 60량체 DNA 올리고뉴클레오티드의 프로토스페이서 및 PAM이 상부에 나타나 있다. 올리고뉴클레오티드 (125 nM)를 NBE1 (2 μM)과 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. DNA를 단리하고, 고처리량 서열분석에 의해 분석하였다. 관찰된 가장 빈번한 9개의 서열에 대한 총 판독물의 퍼센트가 나타나 있다. 대다수의 편집된 가닥 (>93%)은 T로 전환된 1개 초과의 C를 갖는다. 이 도면은 서열식별번호: 309를 나타낸다.
도 18a 내지 18h는 UGI를 NBE1에 융합시켜 NBE2를 생성하는 것의 효과를 나타낸다. 도 18a: 핵염기 편집제로 표적화된 6개의 포유동물 세포 게놈 유전자좌의 프로토스페이서 및 PAM 서열. 편집가능한 C는 프로토스페이서 내의 그의 위치에 상응하는 표지로 지시된다. 도 18a는 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 127 내지 132를 나타낸다. 도 18b 내지 18g: HEK293T 세포를 NBE1, NBE2, 또는 NBE1 및 UGI, 및 적절한 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고, 6개의 유전자좌에서 고처리량 DNA 서열분석에 의해 분석하였다. 지시된 표적 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 모든 6개의 게놈 유전자좌에서 NBE1, NBE1 및 UGI, 및 NBE2에 대해 나타나 있다. 도 18h: NBE1, 별개의 플라스미드 상의 NBE1 플러스 UGI, NBE2, 및 비처리된 세포에 대한 관심 프로토스페이서 주위의 510개의 C에서의 C에서 T로의 돌연변이 비율이 나타나 있다. 데이터는 1.5x106개의 세포로부터의 3,000,000개의 DNA 서열분석 판독물의 결과를 나타낸다. 값은 상이한 날에 수행된 적어도 2회의 생물학적 실험의 평균을 반영한다.
도 19는 U2OS 및 HEK293T 세포에서의 NBE2의 핵염기 편집 효율을 나타낸다. NBE2에 의한 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 HEK293T 세포 및 U2OS 세포에서의 6개의 표적화된 게놈 유전자좌 각각에 대해 나타나 있다. HEK293T 세포를 리포펙타민 2000을 사용하여 형질감염시키고, U2OS 세포를 뉴클레오펙션시켰다. U2OS 뉴클레오펙션 효율은 74%였다. 플라스미드 전달 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고, HTS에 의해 6개의 게놈 유전자좌에서 핵염기 편집에 대해 분석하였다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 적어도 2회의 생물학적 실험의 평균 및 표준 편차를 반영한다.
도 20은 핵염기 편집이 다중 세포 분열에 걸쳐 지속된다는 것을 나타낸다. NBE2에 의한 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 세포를 계대하기 전 및 후의 HEK293T 세포에서의 2개의 게놈 유전자좌에서 제시된다. HEK293T 세포를 리포펙타민 2000을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후에, 세포를 수거하고, 반으로 분할하였다. 하나의 반은 HTS 분석에 적용하고, 다른 반은 대략 5회의 세포 분열 동안 번식시킨 후, 수거하고, HTS 분석에 적용하였다.
도 21은 원칙적으로 핵염기 편집에 의해 교정될 수 있는 클린바(ClinVar)로부터의 유전적 변이체를 나타낸다. 인간 유전적 변이 및 그의 상응하는 표현형의 NCBI 클린바 데이터베이스68를 현행 핵염기 편집 기술에 의해 교정될 수 있는 유전 질환에 대해 조사하였다. 결과를 좌측에 열거된 연속적 제한을 시행함으로써 필터링하였다. x-축은 로그 스케일의 그 제한 및 모든 상기 제한들을 충족시키는 경우의 수를 나타낸다.
도 22는 6개의 게놈 유전자좌에서의 편집가능한 C의 시험관내 확인을 나타낸다. 6개의 상이한 게놈 부위를 매칭시키는 서열을 갖는 합성 80량체를 NBE1과 함께 인큐베이션한 후, HTS를 통해 핵염기 편집에 대해 분석하였다. 각각의 부위에 대해, 프로토스페이서의 서열은 부위의 명칭의 우측에 지시되고, PAM은 적색으로 강조된다. 각각의 서열 아래에는 상응하는 염기를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율이 있다. 표적 C는 시험관내 전환 효율이 >10%인 경우 "편집가능한" 것으로 간주되었다. 최대 수율은 비-표적화된 가닥이 핵염기 편집에 대한 기질이 아니기 때문에 총 DNA 서열분석 판독물의 50%이다. 이 도면은 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 127 내지 132를 나타낸다.
도 23은 EMX1 오프-타겟에서의 NBE1, NBE2, 및 NBE3의 활성을 나타낸다. HEK293T 세포를 NBE1, NBE2, 또는 NBE3 및 EMX1 서열을 매칭시키는 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 리포펙타민 2000을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고, PCR에 의해 증폭시키고, 고처리량 DNA 서열분석에 의해 EMX1 sgRNA에 대한 온-타겟(on-target) 유전자좌, 플러스 상부 10개의 공지된 Cas9 오프-타겟 유전자좌에서, GUIDE-seq 방법55을 사용하여 이전에 결정된 바와 같이 분석하였다. EMX1 오프-타겟 5개의 유전자좌는 증폭하지 않았으며, 나타내지 않는다. 온-타겟 및 오프-타겟 프로토스페이서 및 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)의 서열이 제시된다. 프로토스페이서 내의 원래 C의 각각의 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 NBE1, NBE2, 및 NBE3에 대해 나타나 있다. 맨 우측에는 각각의 서열에 대해 보고된 서열분석 판독물의 총 수가 제시된다. 이 도면은 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 127, 및 637 내지 645를 나타낸다.
도 24는 FANCF 오프-타겟에서의 NBE1, NBE2, 및 NBE3의 활성을 나타낸다. HEK293T 세포를 NBE1, NBE2, 또는 NBE3 및 FANCF 서열을 매칭시키는 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 리포펙타민 2000을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고, PCR에 의해 증폭시키고, 고처리량 DNA 서열분석에 의해 FANCF sgRNA에 대한 온-타겟 유전자좌, 플러스 모든 공지된 Cas9 오프-타겟 유전자좌에서, GUIDE-seq 방법55을 사용하여 이전에 결정된 바와 같이 분석하였다. 온-타겟 및 오프-타겟 프로토스페이서 및 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)의 서열이 제시된다. 프로토스페이서 내의 원래 C의 각각의 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 NBE1, NBE2, 및 NBE3에 대해 나타나 있다. 맨 우측에는 각각의 서열에 대해 보고된 서열분석 판독물의 총 수가 제시된다. 이 도면은 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 128 및 646 내지 653을 나타낸다.
도 25는 HEK293 부위 2 오프-타겟에서의 NBE1, NBE2, 및 NBE3의 활성을 나타낸다. HEK293T 세포를 NBE1, NBE2, 또는 NBE3 및 HEK293 부위 2 서열을 매칭시키는 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 리포펙타민 2000을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고, PCR에 의해 증폭시키고, 고처리량 DNA 서열분석에 의해 HEK293 부위 2 sgRNA에 대한 온-타겟 유전자좌, 플러스 모든 공지된 Cas9 오프-타겟 유전자좌에서, GUIDE-seq 방법55을 사용하여 이전에 결정된 바와 같이 분석하였다. 온-타겟 및 오프-타겟 프로토스페이서 및 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)의 서열이 제시된다. 프로토스페이서 내의 원래 C의 각각의 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 NBE1, NBE2, 및 NBE3에 대해 나타나 있다. 맨 우측에는 각각의 서열에 대해 보고된 서열분석 판독물의 총 수가 제시된다. 이 도면은 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 129, 654, 및 655를 나타낸다.
도 26은 HEK293 부위 3 오프-타겟에서의 NBE1, NBE2, 및 NBE3의 활성을 나타낸다. HEK293T 세포를 NBE1, NBE2, 또는 NBE3 및 HEK293 부위 3 서열을 매칭시키는 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 리포펙타민 2000을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고, PCR에 의해 증폭시키고, 고처리량 DNA 서열분석에 의해 HEK293 부위 3 sgRNA에 대한 온-타겟 유전자좌, 플러스 모든 공지된 Cas9 오프-타겟 유전자좌에서, GUIDE-seq 방법55을 사용하여 이전에 결정된 바와 같이 분석하였다. 온-타겟 및 오프-타겟 프로토스페이서 및 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)의 서열이 제시된다. 프로토스페이서 내의 원래 C의 각각의 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 NBE1, NBE2, 및 NBE3에 대해 나타나 있다. 맨 우측에는 각각의 서열에 대해 보고된 서열분석 판독물의 총 수가 제시된다. 이 도면은 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 130 및 656 내지 660을 나타낸다.
도 27은 HEK293 부위 4 오프-타겟에서의 NBE1, NBE2, 및 NBE3의 활성을 나타낸다. HEK293T 세포를 NBE1, NBE2, 또는 NBE3 및 HEK293 부위 4 서열을 매칭시키는 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 리포펙타민 2000을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고, PCR에 의해 증폭시키고, 고처리량 DNA 서열분석에 의해 HEK293 부위 4 sgRNA에 대한 온-타겟 유전자좌, 플러스 상부 10개의 공지된 Cas9 오프-타겟 유전자좌에서, GUIDE-seq 방법55을 사용하여 이전에 결정된 바와 같이 분석하였다. 온-타겟 및 오프-타겟 프로토스페이서 및 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)의 서열이 제시된다. 프로토스페이서 내의 원래 C의 각각의 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 NBE1, NBE2, 및 NBE3에 대해 나타나 있다. 맨 우측에는 각각의 서열에 대해 보고된 서열분석 판독물의 총 수가 제시된다. 이 도면은 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 131 및 661 내지 670을 나타낸다.
도 28은 비-표적 C 돌연변이 비율을 나타낸다. 여기에는 시험된 6개의 온-타겟 및 34개의 오프-타겟 유전자좌 주위의 2,500개의 별개의 시토신에서의 C에서 T로의 돌연변이 비율이 나타나 있으며, 이는 대략 1.8x106개의 세포로부터 유래된 총 14,700,000개의 서열 판독물을 나타낸다.
도 29a 내지 29c는 인간 세포에서의 염기 편집을 나타낸다. 도 29a는 포유동물 세포에서의 가능한 염기 편집 결과물을 나타낸다. 초기 편집은 U:G 미스매치를 발생시켰다. 우라실 DNA 글리코실라제 (UDG)에 의한 U의 인식 및 절제는 염기 절제 복구 (BER)를 개시하였으며, 이는 C:G 출발 상태로의 복귀를 야기한다. BER은 BE2 및 BE3에 의해 저해되었으며, 이는 UDG를 억제하였다. U:G 미스매치는 또한 미스매치 복구 (MMR)에 의해 프로세싱되었으며, 이는 미스매치의 니킹된 가닥을 우선적으로 복구하였다. BE3은 G를 함유하는 비-편집된 가닥을 니킹하였으며, 이는 U:G 미스매치의 목적하는 U:A 또는 T:A 결과물로의 해결을 선호한다. 도 29b는 하기 실시예에서의 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 처리된 HEK293T 세포를 나타낸다. 지시된 표적 위치에서 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율은 BE1, BE2, 또는 BE3으로의 처리, 또는 공여자 HDR 주형을 갖는 야생형 Cas9로의 처리에 대해 나타낸다. 도 29c는 도 29b에서의 처리 후의 indel 형성의 빈도를 나타낸다. 값은 도 34에 열거되어 있다. 도 29b 및 29c에 대해, 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 및 s.d.를 반영한다.
도 30a 내지 30b는 포유동물 세포에서의 2가지 질환-관련 돌연변이의 BE3-매개된 교정을 나타낸다. 프로토스페이서의 서열은 돌연변이의 우측에 나타나 있으며, PAM 및 표적 염기는 적색으로 프로토스페이서 내의 그의 위치를 지시하는 아래첨자 수와 함께 나타나 있다. 각각의 서열의 아래에는 상응하는 염기를 갖는 총 서열분석 판독물의 백분율이 있다. 세포를 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 처리하였다. 도 30a는 총 판독물의 74.9%에서 BE3에 의한 마우스 성상세포에서 APOE3r로 전환된 알츠하이머병-연관된 APOE4 대립유전자를 나타낸다. 2개의 인근의 C는 또한 T로 전환되었지만, 생성된 단백질의 예측된 서열에 대한 변화는 없었다. 야생형 Cas9 및 공여자 ssDNA로의 이들 세포의 동일한 처리는 26.1% indel 형성과 함께, 단지 0.3% 교정을 발생시킨다. 이 도면은 서열식별번호: 671 및 627을 나타낸다. 도 30b는 0.7% indel 형성을 갖는 뉴클레오펙션된 인간 유방암 세포의 7.6%에서 BE3에 의해 교정된 암 연관된 p53 Y163C 돌연변이를 나타낸다. 야생형 Cas9 및 공여자 ssDNA로의 이들 세포의 동일한 처리는 6.1% indel 형성과 함께, 돌연변이 교정을 발생시키지 않는다. 이 도면은 서열식별번호: 672 및 629를 나타낸다.
도 31은 HEK293 부위 2 오프-타겟에서의 BE1, BE2, 및 BE3의 활성을 나타낸다. HEK293T 세포를 BE1, BE2, 또는 BE3 및 HEK293 부위 2 서열을 매칭시키는 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 리포펙타민 2000을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고, PCR에 의해 증폭시키고, 고처리량 DNA 서열분석에 의해 HEK293 부위 2 sgRNA에 대한 온-타겟 유전자좌, 플러스 모든 공지된 Cas9 및 dCas9 오프-타겟 유전자좌에서, GUIDE-seq 방법을 사용하여 종(Joung) 및 동료들 (63), 및 크로마틴 면역침전 고처리량 서열분석 (ChIP-seq) 실험을 사용하여 아들리(Adli) 및 동료들 (18)에 의해 이전에 결정된 바와 같이 분석하였다. 온-타겟 및 오프-타겟 프로토스페이서 및 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)의 서열이 제시된다. 프로토스페이서 내의 원래 C의 각각의 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 BE1, BE2, 및 BE3에 대해 나타나 있다. 맨 우측에는 보고된 서열분석 판독물의 총 수, 및 각각의 서열에 대해 보고된 ChIP-seq 신호 강도가 제시된다. 이 도면은 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 129, 654, 655 및 673 내지 677을 나타낸다.
도 32는 HEK293 부위 3 오프-타겟에서의 BE1, BE2, 및 BE3의 활성을 나타낸다. HEK293T 세포를 BE1, BE2, 또는 BE3 및 HEK293 부위 3 서열을 매칭시키는 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 리포펙타민 2000을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고, PCR에 의해 증폭시키고, 고처리량 DNA 서열분석에 의해 HEK293 부위 3 sgRNA에 대한 온-타겟 유전자좌, 플러스 모든 공지된 Cas9 오프-타겟 유전자좌 및 상부 5개의 공지된 dCas9 오프-타겟 유전자좌에서, GUIDE-seq 방법54을 사용하여, 및 크로마틴 면역침전 고처리량 서열분석 (ChIP-seq) 실험61을 사용하여 종 및 동료들에 의해 이전에 결정된 바와 같이 분석하였다. 온-타겟 및 오프-타겟 프로토스페이서 및 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)의 서열이 제시된다. 프로토스페이서 내의 원래 C의 각각의 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 BE1, BE2, 및 BE3에 대해 나타나 있다. 맨 우측에는 보고된 서열분석 판독물의 총 수, 및 각각의 서열에 대해 보고된 ChIP-seq 신호 강도가 제시된다. 이 도면은 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 130, 656 내지 660 및 678-682를 나타낸다.
도 33은 HEK293 부위 4 오프-타겟에서의 BE1, BE2, 및 BE3의 활성을 나타낸다. HEK293T 세포를 BE1, BE2, 또는 BE3 및 HEK293 부위 4 서열을 매칭시키는 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 리포펙타민 2000을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고, PCR에 의해 증폭시키고, 고처리량 DNA 서열분석에 의해 HEK293 부위 4 sgRNA에 대한 온-타겟 유전자좌, 플러스 상부 10개의 공지된 Cas9 오프-타겟 유전자좌 및 상부 5개의 공지된 dCas9 오프-타겟 유전자좌에서, GUIDE-seq 방법54을 사용하여, 및 크로마틴 면역침전 고처리량 서열분석 (ChIP-seq) 실험61을 사용하여 이전에 결정된 바와 같이 분석하였다. 온-타겟 및 오프-타겟 프로토스페이서 및 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)의 서열이 제시된다. 프로토스페이서 내의 원래 C의 각각의 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 BE1, BE2, 및 BE3에 대해 나타나 있다. 맨 우측에는 보고된 서열분석 판독물의 총 수, 및 각각의 서열에 대해 보고된 ChIP-seq 신호 강도가 제시된다. 이 도면은 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 131, 661 내지 670, 683 및 684를 나타낸다.
도 34는 마우스 성상세포에서 알츠하이머병-연관된 APOE4 대립유전자의 APOE3r로의 BE3-매개된 교정 후의 비-프로토스페이서 염기의 돌연변이 비율을 나타낸다. 도 30a 및 도 34b로부터의 프로토스페이서의 어느 한 측 상의 50개의 염기의 DNA 서열이 프로토스페이서에 대한 각각의 염기의 위치와 함께 나타나 있다. PAM에 대해 원위의 프로토스페이서의 측은 양수로 지정되는 반면, PAM과 함께 PAM을 포함하는 측은 음수로 지정된다. 각각의 서열의 아래에는 비처리된 세포에 대한, BE3 및 APOE4 C158R 돌연변이를 표적화하는 sgRNA로 처리된 세포에 대한, 또는 BE3 및 VEGFA 유전자좌를 표적화하는 sgRNA로 처리된 세포에 대한 상응하는 염기를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율이 있다. 어떠한 BE3-처리된 샘플도 비처리된 대조군의 것 초과의 돌연변이 비율을 발생시키지 않았다. 이 도면은 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 685 내지 688을 나타낸다.
도 35는 HCC1954 인간 세포에서의 암-연관된 p53 Y163C 돌연변이의 BE3-매개된 교정 후의 비-프로토스페이서 염기의 돌연변이 비율을 나타낸다. 도 30b 및 도 39b로부터의 프로토스페이서의 어느 한 측 상의 50개의 염기의 DNA 서열이 프로토스페이서에 대한 각각의 염기의 위치와 함께 나타나 있다. PAM에 대해 원위의 프로토스페이서의 측은 양수로 지정되는 반면, PAM과 함께 PAM을 포함하는 측은 음수로 지정된다. 각각의 서열의 아래에는 비처리된 세포에 대한, BE3 및 TP53 Y163C 돌연변이를 표적화하는 sgRNA로 처리된 세포에 대한, 또는 BE3 및 VEGFA 유전자좌를 표적화하는 sgRNA로 처리된 세포에 대한 상응하는 염기를 갖는 총 서열분석 판독물의 백분율이 있다. 어떠한 BE3-처리된 샘플도 비처리된 대조군의 것 초과의 돌연변이 비율을 발생시키지 않았다. 이 도면은 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 689 내지 692를 나타낸다.
도 36a 내지 36f는 염기 편집에 대한 데아미나제, 링커 길이, 및 링커 조성의 효과를 나타낸다. 도 36a는 ssDNA에 대한 rAPOBEC1, pmCDA1, hAID, hAPOBEC3G, rAPOBEC1-GGS-dCas9, rAPOBEC1-(GGS)3(서열식별번호: 610)-dCas9, 및 dCas9-(GGS)3(서열식별번호: 610)-rAPOBEC1의 활성을 나타내는 겔-기반 데아미나제 검정을 나타낸다. 효소를 포유동물 세포 용해물-유래된 시험관내 전사-번역 시스템에서 발현시키고, 1.8 μM 염료-접합된 ssDNA 및 USER 효소 (우라실 DNA 글리코실라제 및 엔도뉴클레아제 VIII)와 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 DNA를 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분할하고, 영상화하였다. 양성 대조군은 표적 C와 동일한 위치에 합성적으로 혼입된 U를 갖는 서열이다. 도 36b는 도 36c 내지 36f에 사용된 발현되고 정제된 단백질의 쿠마시-염색된 변성 PAGE 겔을 나타낸다. 도 36c 내지 36f는 GGS (도 36c), (GGS)3 (서열식별번호: 610) (도 36d), XTEN (도 36e), 또는 (GGS)7 (서열식별번호: 610) (도 36f)의 데아미나제-Cas9 링커를 갖는 염기 편집제의 탈아미노화 윈도우를 나타내는 겔-기반 데아미나제 검정을 나타낸다. 125 nM dsDNA 기질과 함께 sgRNA와 복합체화된 1.85 μM 데아미나제-dCas9 융합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 염료-접합된 DNA를 단리하고, USER 효소와 함게 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 임의의 우라실의 부위에서 DNA 백본을 절단하였다. 생성된 DNA를 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분해하고, 염료-접합된 가닥을 영상화하였다. 각각의 레인은 프로토스페이서 내의 표적 C의 위치에 따라, 또는 표적 C가 존재하지 않는 경우 -로 넘버링된다. 8U는 위치 8에 합성적으로 혼입된 U를 갖는 양성 대조군 서열이다.
도 37a 내지 37c는 BE1 염기 편집 효율이 포유동물 세포에서 극적으로 감소되었음을 나타낸다. 도 37a: 염기 편집제에 의해 표적화된 6개의 포유동물 세포 게놈 유전자좌의 프로토스페이서 및 PAM 서열. 표적 C는 프로토스페이서 내의 그의 위치에 상응하는 아래첨자 수와 함께 적색으로 지시된다. 도 37b는 6개의 상이한 게놈 부위를 매칭시키는 서열을 갖는 합성 80량체를 BE1과 함께 인큐베이션한 후, HTS에 의해 염기 편집에 대해 분석하였음을 나타낸다. 각각의 부위에 대해, PAM과 함께 프로토스페이서의 서열은 부위의 명칭의 우측에 지시된다. 각각의 서열의 아래에는 상응하는 염기를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율이 있다. 본 발명자들은 시험관내 전환 효율이 >10%인 경우 표적 C를 "편집가능한" 것으로 간주하였다. 최대 수율은 비-표적화된 가닥이 BE1에 의해 영향을 받지 않기 때문에 총 DNA 서열분석 판독물의 50%이다. 값은 단일 실험으로부터 나타나 있다. 도 37c는 HEK293T 세포를 BE1 및 적절한 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰음을 나타낸다. 형질감염 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고, 고처리량 DNA 서열분석에 의해 6개의 유전자좌에서 분석하였다. 지시된 표적 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 BE1에 대해 모든 6개의 게놈 유전자좌에서 나타나 있다. HEK293T 세포로부터의 모든 데이터의 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 및 표준 편차를 반영한다. 도 37a는 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 127 내지 132를 나타낸다. 도 37b는 위에서 아래로 각각 서열식별번호: 127 내지 132를 나타낸다.
도 38은 염기 편집이 다중 세포 분열에 걸쳐 지속된다는 것을 나타낸다. BE2 및 BE3에 의한 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 세포를 계대하기 전 및 후에 HEK293T 세포에서 HEK293 부위 3 및 4에 대해 나타나 있다. HEK293T 세포를 BE2 또는 BE3 및 HEK293 부위 3 또는 4를 표적화하는 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 뉴클레오펙션시켰다. 뉴클레오펙션 3일 후에, 세포를 수거하고, 반으로 분할하였다. 하나의 반은 HTS 분석으로 처리하고, 다른 반은 대략 5회의 세포 분열 동안 번식시킨 후, 수거하고, HTS 분석에 적용하였다. 값 및 오차 막대는 적어도 2회의 생물학적 실험의 평균 및 표준 편차를 반영한다.
도 39a 내지 39c는 비-표적 C/G 돌연변이 비율을 나타낸다. 여기에는 시험된 6개의 온-타겟 및 34개의 오프-타겟 유전자좌 주위의 2,500개의 별개의 시토신 및 구아닌에서의 C에서 T로의 및 G에서 A로의 돌연변이 비율이 나타나 있으며, 이는 대략 1.8x106개의 세포로부터 유래된 총 14,700,000개의 서열 판독물을 나타낸다. 도 39a 및 39b는 BE1, BE2, 및 BE3에 의한 세포의 비-표적 C에서 T로의 및 G에서 A로의 전환 백분율이 모든 2,500개의 시토신/구아닌에 대한 프로토스페이서에 대한 그의 위치에 대해 개별적으로 플롯팅된다는 것을 나타낸다. PAM에 대해 원위의 프로토스페이서의 측은 양수로 지정되는 반면, PAM을 포함하는 측은 음수로 지정된다. 도 39c는 BE1, BE2, 및 BE3에 의한 평균 비-표적 세포의 C에서 T로의 및 G에서 A로의 전환 백분율, 뿐만 아니라 최고 및 최저 개별 전환 백분율이 나타나 있다는 것을 나타낸다.
도 40a 내지 40b는 포유동물 세포에서의 2가지 질환-관련 돌연변이의 BE3-매개된 교정의 추가적인 데이터 세트를 나타낸다. 각각의 부위에 대해, 프로토스페이서의 서열은 돌연변이의 명칭의 우측에 지시되고, PAM 및 돌연변이의 원인이 되는 염기는 프로토스페이서 내의 그의 위치에 상응하는 아래첨자 수와 함께 적색 볼드체로 지시된다. 각각의 질환-연관된 대립유전자 위의 아미노산 서열이 염기 편집 후의 교정된 아미노산 서열과 함께 나타나 있다. 각각의 서열 아래에는 상응하는 염기를 갖는 총 서열분석 판독물의 백분율이 있다. 세포를 BE3 및 적절한 sgRNA를 코딩하는 플라스미드로 뉴클레오펙션시켰다. 뉴클레오펙션 2일 후에, 게놈 DNA를 뉴클레오펙션된 세포로부터 추출하고, HTS에 의해 분석하여 병원성 돌연변이 교정을 평가하였다. 도 40a는 알츠하이머병-연관된 APOE4 대립유전자가 단지 교정 sgRNA로 처리된 경우에만 총 판독물의 58.3%에서 BE3에 의해 마우스 성상세포에서 APOE3r로 전환된다는 것을 나타낸다. 2개의 인근의 C는 또한 T로 전환되지만, 생성된 단백질의 예측된 서열에 대한 변화는 없다. 야생형 Cas9 및 공여자 ssDNA로의 이들 세포의 동일한 처리는 26.7% indel 형성과 함께, 0.2% 교정을 발생시킨다. 도 40b는 암-연관된 p53 Y163C 돌연변이가 단지 교정 sgRNA로 처리된 경우에만 뉴클레오펙션된 인간 유방암 세포의 3.3%에서 BE3에 의해 교정된다는 것을 나타낸다. 야생형 Cas9 및 공여자 ssDNA로의 이들 세포의 동일한 처리는 8.0% indel 형성과 함께, 검출가능한 돌연변이 교정을 발생시키지 않는다. 도 40a 내지 40b는 서열식별번호: 671, 627, 672 및 629를 나타낸다.
도 41은 단일-가닥 DNA (ssDNA) 기질에 대한 다양한 데아미나제의 활성을 시험하는 데 사용될 수 있는 예시적인 USER (우라실-특이적 절제 시약) 효소-기반 검정의 개략적 표현을 나타낸다.
도 42는 pmCDA-nCas9-UGI-NLS 구축물 및 염기 편집제 (rAPOBEC1) 및 음성 대조군 (비처리)에 비한 HeK-3 부위에서의 그의 활성의 개략도이다. 이 도면은 서열식별번호: 693을 나타낸다.
도 43은 pmCDA1-XTEN-nCas9-UGI-NLS 구축물 및 염기 편집제 (rAPOBEC1) 및 음성 대조군 (비처리)에 비한 HeK-3 부위에서의 그의 활성의 개략도이다. 이 도면은 서열식별번호: 694를 나타낸다.
도 44는 시티딘 데아미나제 (CDA) 또는 APOBEC를 사용하여 T로 전환된 표적 C를 갖는 총 서열분석 판독물의 퍼센트를 나타낸다.
도 45는 데아미나제 (CDA) 또는 APOBEC를 사용하여 A로 전환된 표적 C를 갖는 총 서열분석 판독물의 퍼센트를 나타낸다.
도 46은 데아미나제 (CDA) 또는 APOBEC를 사용하여 G로 전환된 표적 C를 갖는 총 서열분석 판독물의 퍼센트를 나타낸다.
도 47은 huAPOBEC3G-XTEN-nCas9-UGI-NLS 구축물, 및 돌연변이된 형태 (huAPOBEC3G*(D316R_D317R)-XTEN-nCas9-UGI-NLS, 염기 편집제 (rAPOBEC1) 및 음성 대조군 (비처리)에 비한 HeK-2 부위에서의 그의 활성의 개략도이다. 이 도면은 서열식별번호: 695를 나타낸다.
도 48은 실시예 7의 선택 검정에 사용된 LacZ 구축물의 개략도를 나타낸다.
도 49은 상이한 플라스미드 및 구축물로부터의 복귀 데이터를 나타낸다.
도 50은 lacZ 복귀 및 복귀된 클론의 정제의 확인을 나타낸다.
도 51은 실시예 7에 사용된 탈아미노화 선택 플라스미드를 나타내는 개략도이다.
도 52는 클로람페니콜 복귀 검정 (pmCDA1 융합)의 결과를 나타낸다.
도 53a 내지 53b는 2개의 구축물의 DNA 교정 유도를 입증하였다.
도 54는 클로람페니콜 복귀 검정 (huAPOBEC3G 융합)의 결과를 나타낸다.
도 55는 EMX1 오프-타겟에서의 BE3 및 HF-BE3의 활성을 나타낸다. 서열은 위에서 아래로 서열식별번호: 127 및 637-645에 상응한다.
도 56은 BE3 및 HF-BE3의 온-타겟 염기 편집 효율을 나타낸다.
도 57은 돌연변이가 다양한 정도로 시티딘 탈아미노화에 영향을 미친다는 것을 입증하는 그래프이다. 각각이 촉매작용을 약간 손상시키는 돌연변이의 조합은 다른 것에 비해 한 위치에서 선택적 탈아미노화를 허용한다. FANCF 부위는 GGAATC6C7C8TTC11TGCAGCACCTGG (서열식별번호: 128)였다.
도 58은 차세대 염기 편집제를 나타내는 개략도이다.
도 59는 Cas9 변이체로부터 제조된 새로운 염기 편집제를 예시하는 개략도이다.
도 60은 상이한 NGA PAM 부위의 염기-편집된 백분율을 나타낸다.
도 61은 NGCG PAM EMX (VRER BE3) 및 C1TC3C4C5ATC8AC10ATCAACCGGT (서열식별번호: 696) 스페이서를 사용한 시티딘의 염기-편집된 백분율을 나타낸다.
도 62는 상이한 NNGRRT PAM 부위로부터 생성되는 염기화된-편집된 백분율을 나타낸다.
도 63은 상이한 NNHRRT PAM 부위로부터 생성되는 염기화된-편집된 백분율을 나타낸다.
도 64a 내지 64c는 Cpf1 BE2를 사용하여 상이한 TTTN PAM 부위로부터 생성되는 염기-편집된 백분율을 나타낸다. 사용된 스페이서는 TTTCCTC3C4C5C6C7C8C9AC11AGGTAGAACAT (도 64a, 서열식별번호: 697), TTTCC1C2TC4TGTC8C9AC11ACCCTCATCCTG (도 64b, 서열식별번호: 698), 및 TTTCC1C2C3AGTC7C8TC10C11AC13AC15C16C17TGAAAC (도 64c, 서열식별번호: 699)였다.
도 65는 시티딘 데아미나제 점 돌연변이유발의 동역학 조정을 통해 달성된 바와 같은 선택적 탈아미노화를 나타내는 개략도이다.
도 66은 스페이서에서 다중 시티딘으로의 세포 배양에서 프로빙된 탈아미노화 윈도우에 대한 다양한 돌연변이의 효과를 나타내는 그래프이다. 사용된 스페이서는 TGC3C4C5C6TC8C9C10TC12C13C14TGGCCC (서열식별번호: 700)였다.
도 67은 스페이서에서 다중 시티딘으로의 세포 배양에서 프로빙된 탈아미노화 윈도우에 대한 다양한 돌연변이의 효과를 나타내는 그래프이다. 사용된 스페이서는 AGAGC5C6C7C8C9C10C11TC13AAAGAGA (서열식별번호: 701)였다.
도 68은 제한된 수의 시티딘을 갖는 FANCF 부위에 대한 다양한 돌연변이의 효과를 나타내는 그래프이다. 사용된 스페이서는 GGAATC6C7C8TTC11TGCAGCACCTGG (서열식별번호: 128)였다. 삼중 돌연변이체 (W90Y, R126E, R132E)는 제6 위치에서 시티딘을 우선적으로 편집한다는 것에 주의한다.
도 69는 제한된 수의 시티딘을 갖는 HEK3 부위에 대한 다양한 돌연변이의 효과를 나타내는 그래프이다. 사용된 스페이서는 GGCC4C5AGACTGAGCACGTGATGG (서열식별번호: 702)였다. 이중 및 삼중 돌연변이체는 제4 위치에서의 시티딘에 비해 제5 위치에서의 시티딘을 우선적을 편집한다는 것에 주의한다.
도 70은 제한된 수의 시티딘을 갖는 EMX1 부위에 대한 다양한 돌연변이의 효과를 나타내는 그래프이다. 사용된 스페이서는 GAGTC5C6GAGCAGAAGAAGAAGGG (서열식별번호: 703)였다. 삼중 돌연변이체는 제6이 아니라 단지 제5 위치에서의 시티딘을 편집한다는 것에 주의한다.
도 71은 제한된 수의 시티딘을 갖는 HEK2 부위에 대한 다양한 돌연변이의 효과를 나타내는 그래프이다. 사용된 스페이서는 GAAC4AC6AAAGCATAGACTGCGGG (서열식별번호: 704)였다.
도 72는 불멸화 성상세포에서의 BE3 및 돌연변이 W90Y R132E를 포함하는 BE3의 온-타겟 염기 편집 효율을 나타낸다.
도 73은 3가지 Cpf1 융합 구축물의 개략도를 나타낸다.
도 74는 BE3 및 HF-BE3 (EMX1, FANCF, 및 RNF2)의 플라스미드 전달의 비교를 나타낸다.
도 75는 BE3 및 HF-BE3 (HEK3 및 HEK 4)의 플라스미드 전달의 비교를 나타낸다.
도 76은 모든 10개의 부위에서의 EMX-1의 오프-타겟 편집을 나타낸다. 이 도면은 서열식별번호: 127 및 637-645를 나타낸다.
도 77은 GAGTCCGAGCAGAAGAAGAAG (서열식별번호: 705) 스페이서를 사용한 HEK 세포에의 데아미나제 단백질 리포펙션을 나타낸다. EMX-1 온-타겟 및 EMX-1 오프 타겟 부위 2를 조사하였다.
도 78은 GGAATCCCTTCTGCAGCACCTGG (서열식별번호: 706) 스페이서를 사용한 HEK 세포에의 데아미나제 단백질 리포펙션을 나타낸다. FANCF 온 타겟 및 FANCF 오프 타겟 부위 1을 조사하였다.
도 79는 GGCCCAGACTGAGCACGTGA (서열식별번호: 707) 스페이서를 사용한 HEK 세포에의 데아미나제 단백질 리포펙션을 나타낸다. HEK-3 온 타겟 부위를 조사하였다.
도 80은 GGCACTGCGGCTGGAGGTGGGGG (서열식별번호: 708) 스페이서를 사용한 HEK 세포에의 데아미나제 단백질 리포펙션을 나타낸다. HEK-4 온 타겟, 오프 타겟 부위 1, 부위 3, 및 부위 4.
도 81은 sgHR_13 (GTCAGGTCGAGGGTTCTGTC (서열식별번호: 709) 스페이서; C8 표적: 정지를 위해 G51), sgHR_14 (GGGCCGCAGTATCCTCACTC (서열식별번호: 710) 스페이서; C7 표적; C7 표적: 정지를 위해 Q68), 및 sgHR_15 (CCGCCAGTCCCAGTACGGGA (서열식별번호: 711) 스페이서; C10 및 C11은 정지를 위한 표적: W239 또는 W237임)에 대한 sgRNA 활성에 대한 시험관내 검정의 결과를 나타낸다.
도 82는 sgHR_17 (CAACCACTGCTCAAAGATGC (서열식별번호: 712) 스페이서; C4 및 C5는 정지를 위한 표적: W410임), 및 sgHR_16 (CTTCCAGGATGAGAACACAG (서열식별번호: 713) 스페이서; C4 및 C5는 정지를 위한 표적: W273임)에 대한 시험관내 검정의 결과를 나타낸다.
도 83은 제브라피시 배아에서의 sgHR_13과 복합체화된 BE3 단백질의 직접 주사를 나타낸다.
도 84는 제브라피시 배아에서의 sgHR_16과 복합체화된 BE3 단백질의 직접 주사를 나타낸다.
도 85는 제브라피시 배아에서의 sgHR_17과 복합체화된 BE3 단백질의 직접 주사를 나타낸다.
도 86은 시토신에서 티민으로의 변화를 생성할 수 있는 염기 편집제를 사용하여 생성될 수 있는 예시적인 핵산 변화를 나타낸다.
도 87은 염기 편집제 (예를 들어, BE3)가 하나의 APOE 이소형 (예를 들어, APOE4)을 알츠하이머병의 감소된 위험과 연관된 또 다른 APOE 이소형 (예를 들어, APOE3r)으로 편집하는 데 사용될 수 있는 방법을 입증하는 아포지단백질 E (APOE) 이소형의 예시를 나타낸다.
도 88은 마우스 성상세포에서의 APOE4에서 APOE3r로의 염기 편집을 나타낸다. 이 도면은 서열식별번호: 671 및 627을 나타낸다.
도 89는 아르기닌 잔기 37에서의 단백질의 조기 말단절단을 유발하는 PRNP의 염기 편집을 나타낸다. 이 도면은 서열식별번호: 557 및 714를 나타낸다.
도 90은 (UGI가 억제하는) UDG를 녹아웃시키는 것이 C에서 T로의 염기 편집의 효율의 청결도를 극적으로 개선시킨다는 것을 나타낸다.
도 91은 니카제를 갖지만 UGI를 갖지 않는 염기 편집제의 사용이 결과물의 혼합물을 매우 높은 indel 비율로 야기한다는 것을 나타낸다.
도 92a 내지 92g는 SaBE3, SaKKH-BE3, VQR-BE3, EQR-BE3, 및 VRER-BE3이 인간 세포에서 비-NGG PAM을 함유하는 표적 부위에서의 효율적인 염기 편집을 매개한다는 것을 나타낸다. 도 92a는 에스. 피오게네스 및 에스. 아우레우스 Cas9를 사용한 염기 편집제 아키텍처를 나타낸다. 도 92b는 대안의 또는 완화된 PAM 요건을 갖는 최근 특징화된 Cas9 변이체를 나타낸다. 도 92c 및 92d는 실시예 12에 기재된 바와 같이 제시된 염기 편집제 변이체로 처리된 HEK293T 세포를 나타낸다. 지시된 표적 위치에 T로 전환된 C를 갖는 (형질감염된 세포에 대해 풍부화가 없는) 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율이 나타나 있다. 시험된 각각의 표적의 PAM 서열은 X-축 아래에 나타나 있다. 차트는 NNGRRT PAM을 갖는 게놈 유전자좌에서의 SaBE3 및 SaKKH-BE3 (도 92c), NNNRRT PAM을 갖는 게놈 유전자좌에서의 SaBE3 및 SaKKH-BE3 (도 92d), NGAG PAM (도 92e), 및 NGAH PAM (도 92f)을 갖는 게놈 유전자좌에서의 VQR-BE3 및 EQR-BE3, 및 NGCG PAM을 갖는 게놈 유전자좌에서의 VRER-BE3 (도 92g)에 대한 결과를 나타낸다. 값 및 오차 막대는 적어도 2회의 생물학적 반복의 평균 및 표준 편차를 반영한다.
도 93a 내지 93c는 시티딘 데아미나제 도메인에서의 돌연변이를 갖는 염기 편집제가 좁혀진 편집 윈도우를 나타낸다는 것을 입증한다. 도 93a 내지 93c는 돌연변이체 염기 편집제 및 적절한 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 HEK293T 세포를 나타낸다. 형질감염 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고, 고처리량 DNA 서열분석에 의해 지시된 유전자좌에서 분석하였다. 지시된 표적 위치에 T로 변화된 C를 갖는 (형질감염된 세포에 대한 풍부화가 없는) 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율이 EMX1 부위 (서열식별번호: 721), HEK293 부위 3 (서열식별번호: 719), FANCF 부위 (서열식별번호: 722), HEK293 부위 2 (서열식별번호: 720), 부위 A (서열식별번호: 715), 및 부위 B (서열식별번호: 718) 유전자좌에 대해 나타나 있다. 도 93a는 염기 편집 윈도우를 좁히는 특정 시티딘 데아미나제 돌연변이를 예시한다. 추가의 돌연변이의 특징화에 대해서는 도 98을 참조한다. 도 93b는 게놈 유전자좌 상의 편집 윈도우 폭을 실시하는 시티딘 데아미나제 돌연변이의 효과를 나타낸다. 유익한 돌연변이를 조합하는 것은 편집 윈도우를 좁히는 것에 대해 상가 효과를 갖는다. 도 93c는 YE1-BE3, YE2-BE3, EE-BE3, 및 YEE-BE3이 염기 편집의 생성물 분포를 실시하여, BE3과 대조적으로 우세하게 단독으로-변형된 생성물을 생성한다는 것을 나타낸다. 값 및 오차 막대는 적어도 2회의 생물학적 반복의 평균 및 표준 편차를 반영한다.
도 94a 및 94b는 원칙적으로 이 연구에서 개발된 염기 편집제에 의해 교정될 수 있는 클린바로부터의 유전적 변이체를 나타낸다. 인간 유전적 변이 및 그의 상응하는 표현형의 NCBI 클린바 데이터베이스를 이론적으로 염기 편집에 의해 교정될 수 있는 유전 질환에 대해 조사하였다. 도 94a는 변경된 PAM 특이성을 갖는 염기 편집제의 사용을 통한 클린바 데이터베이스에서의 모든 병원성 T→C 돌연변이 중에서 염기 편집 표적화 범주의 개선을 입증한다. 백색 분획은 BE3, 또는 본 작업에서 개발된 5개의 변형된-PAM 염기 편집제와 함께의 BE3 중 어느 하나의 PAM 요건에 기초하여 접근가능한 병원성 T→C 돌연변이의 비율을 나타낸다. 도 94b는 좁혀진 활성 윈도우를 갖는 염기 편집제의 사용을 통한 클린바 데이터베이스에서의 모든 병원성 T→C 돌연변이 중에서 염기 편집 표적화 범주의 개선을 나타낸다. BE3은 도 93a 내지 93c에 나타낸 것과 대등한 효율로 위치 4-8에서 C를 편집하는 것으로 가정하였다. YEE-BE3은 그의 활성 윈도우 내에서 C5>C6>C7>다른 것들 선호도로 편집하는 것으로 가정하였다. 백색 분획은 다른 C와 대등한 편집을 갖지 않는 편집된 BE3일 수 있는 (좌측), 또는 다른 C와 대등한 편집을 갖지 않는 편집된 BE3 또는 YEE-BE3일 수 있는 (우측) 병원성 T→C 돌연변이의 비율을 나타낸다.
도 95a 내지 95b는 염기 편집 윈도우 폭에 대한 말단절단된 가이드 RNA의 효과를 나타낸다. HEK293T 세포를 상이한 5' 말단절단 길이의 BE3 및 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 처리된 세포를 실시예에 기재된 바와 같이 분석하였다. 도 95a는 EMX1 게놈 유전자좌 내의 부위에서의, 프로토스페이서 및 PAM 서열 (상부, 서열식별번호: 715) 및 지시된 표적 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는 세포의 C에서 T로의 전환 백분율을 나타낸다. 이 부위에서, 염기 편집 윈도우는 17-nt 말단절단된 gRNA의 사용을 통해 변경되었다. 도 95b는 HEK 부위 3 및 부위 4 게놈 유전자좌 내의 부위에서의, 프로토스페이서 및 PAM 서열 (상부, 서열식별번호: 715 및 716) 및 지시된 표적 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는 세포의 C에서 T로의 전환 백분율을 나타낸다. 이들 부위에서, 염기 편집 윈도우의 변화는 관찰되지 않았지만, sgRNA가 말단절단되는 경우 모든 기질 염기에 대한 편집 효율의 선형 감소가 주목되었다.
도 96은 염기 편집 윈도우 폭에 대한 APOBEC1-Cas9 링커 길이의 효과를 나타낸다. HEK293T 세포를 XTEN, GGS, (GGS)3 (서열식별번호: 610), (GGS)5 (서열식별번호: 610), 또는 (GGS)7 (서열식별번호: 610) 및 sgRNA의 rAPOBEC1-Cas9 링커를 갖는 염기 편집제를 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 처리된 세포를 실시예에 기재된 바와 같이 분석하였다. 지시된 표적 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 상이한 링커를 갖는 다양한 염기 편집제에 대해 나타나 있다.
도 97a 내지 97c는 염기 편집 윈도우 폭에 대한 rAPOBEC 돌연변이의 효과를 나타낸다. 도 97c는 부위 A 또는 부위 B 중 어느 하나를 표적화하는 sgRNA 및 지시된 BE3 점 돌연변이체를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 HEK293T 세포를 나타낸다. 처리된 세포를 실시예에 기재된 바와 같이 분석하였다. 프로토스페이서에서의 및 프로토스페이서의 3개의 염기 쌍 내의 모든 C가 제시되며, 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 나타나 있다. 그 내에서 편집 효율이 반수-최대 값을 초과하는 뉴클레오티드의 계산된 수로서 정의되는 '편집 윈도우 폭'이 모든 시험된 돌연변이체에 대해 제시된다.
도 98은 포유동물 세포에서의 염기 편집의 생성물 분포에 대한 APOBEC1 돌연변이의 효과를 나타낸다. HEK293T 세포를 BE3 또는 그의 돌연변이체 및 적절한 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 처리된 세포를 실시예에 기재된 바와 같이 분석하였다. 지시된 표적 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 나타나 있다 (좌측). C에서 T로의 전환을 함유하는 총 서열분석 판독물의 퍼센트는 우측에 나타나 있다. BE3 점 돌연변이체는 단지 1개의 표적 시티딘을 갖는 부위인 HEK 부위 4에서 염기 편집 효율에 유의하게 영향을 미치지 않는다.
도 99는 BE3 및 HF-BE3에서의 온-타겟 편집 혈장 전달의 비교를 나타낸다.
도 100은 BE3의 단백질 및 혈장 전달에서의 온-타겟 편집의 비교를 나타낸다.
도 101은 HF-BE3의 단백질 및 혈장 전달에서의 온-타겟 편집의 비교를 나타낸다.
도 102는 리포펙션 및 HF 돌연변이를 설치하는 것 둘 다가 오프-타겟 탈아미노화 사건을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 다이아몬드는 오프 타겟이 검출되지 않았음을 지시하며, 특이성 비는 100으로 설정되었다.
도 103은 프로토스페이서 (NNNNTC2TC4TC6TC8TC10TC12TC14TC16TC18TC20NGG, 서열식별번호: 723)에서의 짝수 위치에 놓인 C를 사용한 합성 기질 상의 시험관내 C에서 T로의 편집을 나타낸다.
도 104는 프로토스페이서 (NNNNTC2TC4TC6TC8TC10TC12TC14TC16TC18TC20NGG, 서열식별번호: 723)에서의 홀수 위치에 놓인 C를 사용한 합성 기질 상의 시험관내 C에서 T로의 편집을 나타낸다.
도 105는 플라스미드 대 단백질 전달을 갖는 염기 편집의 특이성 비를 나타내는 2개의 그래프를 포함한다.
도 106a 내지 106b는 비-NGG PAM 부위에 대한 BE3 활성을 나타낸다. HEK293T 세포를 BE3 및 적절한 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 처리된 세포를 실시예에 기재된 바와 같이 분석하였다. 도 106a는 부위에 대한 BE3 활성이 SaBE3 또는 SaKKH-BE3에 의해 효율적으로 표적화될 수 있다는 것을 나타낸다. BE3은 NAG PAM에 대해 낮지만 유의한 활성을 나타낸다. 이 도면은 서열식별번호: 728 및 729를 나타낸다. 도 106b는 BE3이 VQR-BE3 또는 VRER-BE3과는 대조적으로 NGA 또는 NGCG PAM을 갖는 부위에서 유의하게 감소된 편집을 갖는다는 것을 나타낸다. 이 도면은 서열식별번호: 730 및 731을 나타낸다.
도 107a 내지 107b는 VQR-BE3 및 SaKKH-BE3에 대한 APOBEC1 돌연변이의 효과를 나타낸다. HEK293T 세포를 VQR-BE3, SaKKH-BE3 또는 그의 돌연변이체 및 적절한 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 처리된 세포를 하기 실시예에 기재된 바와 같이 분석하였다. 지시된 표적 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 나타나 있다. 도 107a는 윈도우-조정 돌연변이가 VQR-BE3에 적용되어 NGA PAM에 의해 표적화가능한 부위에서 선택적 염기 편집을 가능하게 할 수 있다는 것을 나타낸다. 이 도면은 서열식별번호: 732 및 733을 나타낸다. 도 107b는 SaKKH-BE3에 적용되는 경우, 돌연변이가 표적 윈도우 내의 염기 선택성을 부여하지 않고 염기 편집 효율의 전반적 감소를 유발한다는 것을 나타낸다. 이 도면은 서열식별번호: 728 및 734를 나타낸다.
도 108은 뉴클레오티드 편집의 개략적 표현을 나타낸다. 하기 약어가 사용된다: (MMR) - 미스매치 복구, (BE3 니카제) - Cas9 니카제 도메인을 포함하는 염기 편집제 3을 지칭함, (UGI) - 우라실 글리코실라제 억제제, UDG - 우라실 DNA 글리코실라제, (APOBEC) - APOBEC 시티딘 데아미나제를 지칭함.
도 109는 예시적인 염기 편집 구축물의 개략적 표현을 나타낸다. 염기 편집 구축물의 구조적 배열은 BE3, BE4-pmCDA1, BE4-hAID, BE4-3G, BE4-N, BE4-SSB, BE4-(GGS)3, BE4-XTEN, BE4-32aa, BE4-2xUGI 및 BE4에 대해 나타나 있다. 링커는 회색으로 나타나 있다 (XTEN, SGGS (서열식별번호: 606), (GGS)3 (서열식별번호: 610), 및 32aa). 데아미나제가 제시된다 (rAPOBEC1, pmCDA1, hAID, 및 hAPOBEC3G). 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 (UGI)가 제시된다. 단일-가닥 DNA 결합 단백질 (SSB)은 자주색으로 제시된다. Cas9 니카제인 dCas9 (A840H)는 적색으로 제시된다. 도 109에는 또한 하기 표적 서열이 나타나 있다: EMX1, FANCF, HEK2, HEK3, HEK4, 및 RNF2. 아미노산 서열은 위에서 아래로 서열식별번호: 127-132로 지시된다. PAM 서열은 마지막 3개의 뉴클레오티드이다. 표적 시토신 (C)은 넘버링되고 적색으로 지시된다.
도 110은 EMX1 서열, GAGTC5CGAGCAGAAGAAGAAGGG (서열식별번호: 127)의 표적화된 시토신 (C5) 상에서 지시된 염기 편집 구축물 (BE3, pmCDA1 hAID, hAPOBEC3G, BE4-N, BE4-SSB, BE4-(GGS)3, BE-XTEN, BE4-32aa, 및 BE4-2xUGI)에 대한 염기 편집 결과를 보여준다. 돌연변이된 표적화된 시토신(C5)의 총 백분율은 "C5" 하에 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다. indel의 총 백분율은 "indel" 하에 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다. 아데닌 (A), 구아닌 (G) 또는 티민 (T)으로 돌연변이된 돌연변이된 시토신의 비율이 파이 차트에서 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다.
도 111은 FANCF 서열, GGAATCCC8TTCTGCAGCACCTGG (서열식별번호: 128)의 표적화된 시토신 (C8) 상에 표시된 염기 편집 구축물 (BE3, pmCDA1 hAID, hAPOBEC3G, BE4-N, BE4-SSB, BE4-(GGS)3, BE-XTEN, BE4-32aa, 및 BE4-2xUGI)에 대한 염기 편집 결과를 보여준다. 돌연변이된 표적화된 시토신 (C8)의 총 백분율은 "C8" 하에 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다. indel의 총 백분율은 "indel" 하에 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다. 아데닌(A), 구아닌(G) 또는 티민(T)으로 돌연변이된 돌연변이된 시토신의 비율이 파이 차트에서 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다.
도 112는 HEK2 서열 GAACAC6AAAGCATAGACTGCGGG (서열식별번호: 129)의 표적화된 시토신 (C6) 상에서 지시된 염기 편집 구축물 (BE3, pmCDA1 hAID, hAPOBEC3G, BE4-N, BE4-SSB, BE4-(GGS)3, BE-XTEN, BE4-32aa, 및 BE4-2xUGI)에 대한 염기 편집 결과를 보여준다. 돌연변이된 표적화된 시토신 (C6)의 총 백분율은 "C6" 하에 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다. indel의 총 백분율은 "indel" 하에 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다. 아데닌(A), 구아닌(G) 또는 티민(T)으로 돌연변이된 돌연변이된 시토신의 비율이 파이 차트에서 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다.
도 113은 HEK3 서열 GGCCC5AGACTGAGCACGTGATGG (서열식별번호: 130)의 표적화된 시토신 (C5) 상에서 지시된 염기 편집 구축물 (BE3, pmCDA1 hAID, hAPOBEC3G, BE4-N, BE4-SSB, BE4-(GGS)3, BE-XTEN, BE4-32aa, 및 BE4-2xUGI)에 대한 염기 편집 결과를 보여준다. 돌연변이된 표적화된 시토신 (C5)의 총 백분율은 "C5" 하에 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다. indel의 총 백분율은 "indel" 하에 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다. 아데닌(A), 구아닌(G) 또는 티민(T)으로 돌연변이된 돌연변이된 시토신의 비율을 파이 차트에서 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다.
도 114는 HEK4 서열 GGCAC5TGCGGCTGGAGGTCCGGG (서열식별번호: 131)의 표적화된 시토신 (C5) 상에서 지시된 염기 편집 구축물 (BE3, pmCDA1 hAID, hAPOBEC3G, BE4-N, BE4-SSB, BE4-(GGS)3, BE-XTEN, BE4-32aa, 및 BE4-2xUGI)에 대한 염기 편집 결과를 보여준다. 돌연변이된 표적화된 시토신 (C5)의 총 백분율은 "C5" 하에 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다. indel의 총 백분율은 "indel" 하에 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다. 아데닌(A), 구아닌(G) 또는 티민(T)으로 돌연변이된 돌연변이된 시토신의 비율을 파이 차트에서 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다.
도 115는 RNF2 서열 GTCATC6TTAGTCATTACCTGAGG (서열식별번호: 132)의 표적화된 시토신 (C6) 상에서 지시된 염기 편집 구축물 (BE3, pmCDA1 hAID, hAPOBEC3G, BE4-N, BE4-SSB, BE4-(GGS)3, BE-XTEN, BE4-32aa, 및 BE4-2xUGI)에 대한 염기 편집 결과를 보여준다. 돌연변이된 표적화된 시토신 (C6)의 총 백분율은 "C6" 하에 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다. indel의 총 백분율은 "indel" 하에 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다. 아데닌(A), 구아닌(G) 또는 티민(T)으로 돌연변이된 돌연변이된 시토신의 비율을 파이 차트에서 각각의 염기 편집 구축물에 대해 지시된다.
도 116은 표적 가닥을 니킹하는 Cpf1 돌연변이체에 대해 시험하기 위해 사용된 예시적인 형광 표지된 (Cy3 표지된) DNA 구축물을 보여준다. 1의 DNA 구축물에서, 비-표적 가닥 (상부 가닥) 및 표적 가닥 (하부 가닥)은 둘 다 형광 표지된다. 2의 DNA 구축물에서, 비-표적 가닥 (상부 가닥)은 형광 표지되고, 표적 가닥 (하부 가닥)은 형광 표지되지 않는다. 3의 DNA 구축물에서, 비-표적 가닥 (상부 가닥)은 형광 표지되지 않고, 표적 가닥 (하부 가닥)은 형광 표지된다.
도 117은 30분 (30 min) 또는 2시간 초과 (2h+)의 반응 시간에 걸쳐 도 116에 제시된 DNA 구축물의 표적 및 비-표적 가닥을 절단하는 다양한 Cpf1 구축물 (예를 들어, R836A, R1138A, 야생형)의 능력을 입증하는 데이터를 보여준다.
도 118은 아키텍처를 갖는 염기 편집제, APOBEC-AsCpf1(R912A)-UGI가 표적 서열의 제7에서 제11 염기의 윈도우를 갖는 C 잔기 (예를 들어, 표적 서열 FANCF1, FANCF2, HEK3-3 및 HEK3-4의 것)를 편집할 수 있다는 것을 입증하는 데이터를 보여준다. BG는 배경 돌연변이 수준 (비처리)을 나타낸다. AsCpf1은 AsCpf1 단독 처리군 (대조군)을 나타내고, APOBEC-AsCpf1 (R912A)-UGI는 표적 가닥을 우선적으로 절단하는 Cpf1을 함유하는 염기 편집제를 나타내고, APOBEC-AsCpf1 (R1225A)-UGI는 비-표적 가닥을 절단하는 Cpf1을 함유하는 자기-무력화 염기 편집제를 나타낸다. FANCF1, FANCF2, HEK3-3, 및 HEK3-4의 표적 서열은 하기와 같다:
Figure pct00001

도 119는 Cpf1 단백질 (예를 들어, AsCpf1 또는 LbCpf1)을 포함하는 염기 편집제의 개략적 표현을 나타낸다. 상이한 링커 서열 (예를 들어, XTEN, GGS, (GGS)3 (서열식별번호: 610), (GGS)5 (서열식별번호: 610), 및 (GGS)7 (서열식별번호: 610))을 "링커"로 표지된 부분에 대해 시험하였고, 그 결과는 도 120에 제시된다.
도 120은 HEK3 부위 TGCTTCTC8CAGCCCTGGCCTGG (서열식별번호: 592)의 C8 잔기를 편집하는 도 119에 제시된 구축물의 능력을 입증하는 데이터를 보여준다. APOBEC 도메인을 Cpf1 도메인 (예를 들어, LbCpf1(R836A) 또는 AsCpf1(R912A))에 연결하는 상이한 링커 서열을 시험하였다. 시험된 예시적인 링커는 XTEN, GGS, (GGS)3 (서열식별번호: 610), (GGS)5 (서열식별번호: 610), 및 (GGS)7 (서열식별번호: 610)을 포함한다.
도 121은, HEK3의 잔기 TGCTTCTC8C9AGCCCTGGCCTGG (서열식별번호: 592)의 C8 및 C9 편집을 위한, LbCpf1 도메인을 갖는 도 119에 제시된 구축물의 능력을 입증하는 데이터를 보여준다. APOBEC 도메인을 LbCpf1 도메인에 연결하는 통합 생물정보학 VU의 센터에 의해 유지된 데이터베이스로부터의 상이한 링커 서열을 시험하였다. 시험된 예시적인 링커는 1au7, 1c1k, 1c20, 1ee8, 1flz, 1ign, 1jmc, 1sfe, 2ezx 및 2reb를 포함한다.
도 122는 N 및 C 말단이 표시된 AsCpf1의 구조의 개략적 표현을 나타낸다.
도 123은 N 및 C 말단이 표시된 SpCas9의 구조의 개략적 표현을 나타낸다.
도 124는 AsCpf1의 개략적 표현을 나타내고, 여기서 적색 원은 편집 윈도우가 있다고 예측되는 면적을 나타낸다. 정사각형은 APOBEC 활성을 방해할 수 있는 나선 영역을 나타낸다.
도 125a 및 125b는 고충실도 염기 편집제 (HF-BE3)의 조작 및 시험관내 특징화를 보여준다. 도 125a는 HF-BE3의 개략적 표현을 보여준다. BE3에 도입되어 HF-BE3을 생성하는 점 돌연변이가 제시된다. 상기 표현은 PDB 구조 4UN3 (Cas9), 4ROV (시티딘 데아미나제) 및 1UGI (우라실 DNA 글리코실라제 억제제)를 사용하였다. 도 125b는 'TC' 반복 프로토스페이서를 함유하는 합성 기질의 시험관내 탈아미노화를 보여준다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 2개의 독립적인 반복의 평균 및 범위를 반영한다.
도 126a 내지 126c는 염기 편집제 단백질의 정제를 보여준다. 도 126a는 염기 편집제 발현을 위한 최적 이. 콜라이 균주의 선택을 보여준다. 18℃에서 16시간 동안 IPTG-유도된 단백질 발현 후에, 조 세포 용해물을 단백질 함량에 대해 분석하였다. BL21 스타 (DE3) (써모 피셔(Thermo Fisher)) 세포는 BE3 및 HF-BE3 둘 다의 가장 유망한 발현후 수준을 보여주었고, 염기 편집제의 발현에 사용되었다. 도 126b는 발현된 염기 편집제 단백질의 정제를 보여준다. 염기 편집제의 C-말단 상에 His6 태그를 위치시키는 것은 BE3 및 HF-BE3 둘 다에 대한 말단절단 생성물의 생산을 유도한다 (레인 1 및 2). 예상외로, 이러한 말단절단 생성물은 His6 태그를 단백질의 N-말단에 위치시킴으로써 제거하였다 (레인 3-6). Cas9 발현에 최적인 것 (OD600 = 0.4)보다 늦게 OD600 = 0.7 (레인 4-5)의 세포 밀도로 염기 편집제의 발현을 유도하는 것은, 염기 편집 단백질의 수율을 개선시킨다. 수동 HisPur 수지 칼럼을 사용하여 정제를 수행한 후, 양이온 교환 FPLC (Akta)를 수행하였다. 도 126c는 정제된 BE3 및 HF-BE3을 보여준다. 상이한 농도의 정제된 BE3 및 HF-BE3을 열 및 LDS를 사용하여 변성시키고, 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하였다. 단백질 샘플은 본 연구에 사용된 단백질을 대표한다. 도 126a 내지 126c의 겔은 BOLT 비스-트리스 플러스 4-12% 폴리아크릴아미드 (써모 피셔)이다. 전기영동 및 염색을 방법에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 127a 내지 127d는 인간 세포에서의 고충실도 염기 편집제 (HF-BE3)의 활성을 보여준다. 도 127a 내지 127c는 비-반복적 게놈 유전자좌 EMX1 (도 127a), FANCF (도 127b), 및 HEK293 부위 3 (도 127c)을 표적화하는 sgRNA로 처리된 HEK293T 세포로부터의 게놈 DNA의 고처리량 서열분석을 사용하여 BE3 및 HF-BE3의 플라스미드 형질감염과 연관된 온- 및 오프-타겟 편집을 검정하였다는 것을 보여준다. 각각의 sgRNA와 연관된 온- 및 오프-타겟 유전자좌는 수직선에 의해 분리된다. 도 127d는 VEGFA 부위 2를 표적화하는 고도로 반복되는 sgRNA와 연관된 온- 및 오프-타겟 편집을 보여준다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다. 도 127a 내지 127c의 경우, 별은 처리된 샘플과 비처리된 대조군 사이의 비교에 기초한 유의한 편집을 나타낸다. * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 및 *** p ≤ 0.001 (스튜던트 양측 t-검정). 도 127d의 경우, 모든 처리된 샘플이 대조군에 비해 유의한 편집을 나타내었기 때문에 별표는 제시되지 않았다. 개별 p-값이 표 16에 열거되어 있다.
도 128a 내지 128c는 배양된 인간 세포에서 온-타겟 및 오프-타겟 염기 편집의 효율에 대한 BE3 단백질 또는 플라스미드의 투여량의 효과를 보여준다. 도 128a는 각각의 sgRNA에 대한 활성 윈도우에서의 모든 편집된 시토신에 걸쳐 각각의 4개의 게놈 유전자좌에서의 온-타겟 편집 효율을 평균내었음을 보여준다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3개의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.E.M을 반영한다. 도 128b 및 128c는 HEK293T 세포에서의 BE3 플라스미드 적정 (도 128b) 또는 BE3 단백질 적정 (도 128c)으로부터 발생한 EMX1 부위에서의 온- 및 오프-타겟 편집을 보여준다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다.
도 129a 내지 129b는 BE3 및 HF-BE3의 플라스미드 및 단백질 전달에 대한 온-표적:오프-타겟 염기 편집 빈도 비를 보여준다. 활성 윈도우 내의 특정한 시토신에서의 온-타겟 편집 백분율을 표시된 오프-타겟 유전자좌에 대한 상응하는 시토신에서의 오프-타겟 편집 백분율로 나눔으로써 염기 편집 온-타겟:오프-타겟 특이성 비를 계산하였다 (방법 참조). 오프-타겟 편집이 검출 한계값 미만인 경우 (서열분석 판독물의 0.025%), 본 발명자들은 오프-타겟 편집을 검출 한계 (0.025%)로 설정하고, 이 상한으로 온-타겟 편집 백분율을 나누었다. ◆로 표시되는 이들 경우에, 제시된 특이성 비는 하한을 나타낸다. 특이성 비가 비-반복적 sgRNA FANCF, HEK293 부위 3, 및 FANCF (도 129a) 및 고도로 반복적인 sgRNA VEGFA 부위 2 (도 129b)에 대해 제시된다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다.
도 130a 내지 130d는 배양된 인간 세포로의 염기 편집제의 단백질 전달을 보여준다. 도 130a 내지 130d는 EMX1 (도 130a), FANCF (도 130b), HEK293 부위 3 (도 130c) 및 VEGFA 부위 2 (도 130d)를 표적화하는 sgRNA와 복합체화된 염기 편집제의 RNP 전달과 연관된 온- 및 오프-타겟 편집을 보여준다. 오프-타겟 염기 편집은 비-반복적 sgRNA에 대한 모든 서열분석된 유전자좌에서 검출불가능하였다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다. 별은 처리된 샘플과 비처리 대조군 사이의 비교에 기초한 유의한 편집을 나타낸다. * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 및 *** p ≤ 0.001 (스튜던트 양측 t-검정).
도 131a 내지 131c는 게놈 유전자좌에서의 염기 편집과 연관된 indel 형성을 나타낸다. 도 131a는 VEGFA 부위 2, EMX1, FANCF, 및 HEK293 부위 3 sgRNA에 대한 온-타겟 유전자좌에서의 indel 빈도를 보여준다. 도 131b는 염기 편집:indel 형성의 비를 보여준다. 다이아몬드 (◆)는 어떤 indel도 검출되지 않았음을 나타낸다 (처리된 샘플 및 비처리된 대조군에서 indel 빈도의 유의한 차이가 없음). 도 131c는 도 131a에서 조사된 온-타겟 부위와 연관된 오프-타겟 유전자좌에서 관찰된 indel을 보여준다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다.
도 132a 내지 132d는 BE3의 RNP 전달을 사용하여 제브라피시 배아에서의 및 살아있는 마우스의 내이에서의 DNA-무함유 생체내 염기 편집을 보여준다. 도 132a는 표시된 sgRNA와 복합체화된 BE3의 주사 4일 후 수거된 제브라피쉬에서의 온-타겟 게놈 편집을 보여준다. 값 및 오차 막대는 평균 ± s.d.의 3개의 주사된 및 3개의 대조군 제브라피쉬를 반영한다. 대조군은 비관련된 sgRNA와 복합체화된 BE3을 주사하였다. 도 132b는 양이온성 지질 나노입자 내로 캡슐화된 BE3:sgRNA 복합체의 생체내 주사를 보여주는 개략도를 보여준다. 도 132c는 VEGFA 부위 2 게놈 유전자좌에서의 염기 편집제 윈도우 내의 시토신 잔기의 염기 편집을 보여준다. 도 132d는 VEGFA 부위 2 표적 유전자좌의 염기 편집 윈도우 내의 각각의 시토신에서의 온-타겟 편집을 보여준다. 도 132d (도 132c 및 132d)는 값 및 오차 막대가 VEGFA 부위 2를 표적화하는 sgRNA로 주사된 3마리의 마우스, 3마리의 주사되지 않은 마우스 및 비관련 sgRNA로 주사된 1마리의 마우스의 평균 ± S.E.M.을 반영한다.
도 133a 내지 133e는 뮤린 NIH/3T3 세포에서의 온- 및 오프-타겟 염기 편집을 보여준다. 도 133a는 'VEGFA 부위 2' sgRNA와 연관된 온-타겟 염기 편집을 보여준다 (서열에 대해서는 도 132e 참조). 음성 대조군은 BE3을 코딩하지만 sgRNA를 코딩하지는 않는 플라스미드로 처리된 세포에 상응한다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다. 도 133b 내지 133e는 이러한 부위와 연관된 오프-타겟 편집이 이러한 sgRNA (도 132e에 제시된 서열)에 대한 상위 4개의 예측된 오프-타겟 유전자좌에서의 고처리량 DNA 서열분석을 사용하여 측정되었음을 보여준다. 도 133b는 오프-타겟 2를 보여주고, 도 133c는 오프-타겟 1을 보여주고, 도 133d는 오프-타겟 3을 보여주고, 도 133e는 오프-타겟 4를 보여준다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다.
도 134a 내지 134b는 생체내-편집된 뮤린 조직으로부터의 오프-타겟 염기 편집 및 온-타겟 indel 분석을 보여준다. 도 134a는 VEGFA 부위 2와 연관된 오프-타겟 유전자좌의 염기 편집 윈도우 내의 각각의 시토신에 대해 플롯팅된 편집을 보여준다. 도 134b는 온-타겟 염기 편집제 유전자좌에서의 indel 비율을 보여준다. 값 및 오차 막대는 3개의 주사된 및 3개의 대조군 마우스의 평균 ± S.E.M을 반영한다.
도 135a 내지 135c는 UNG 녹아웃의 염기 편집 생성물 순도에 대한 효과를 보여준다. 도 135a는 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같은 BE3으로 처리된 HAP1 (UNG+) 및 HAP1 UNG- 세포를 보여준다. 편집된 DNA 서열분석 판독물 (표적 C가 돌연변이된 판독물) 중에서의 생성물 분포가 제시된다. 도 135b는 시험된 게놈 유전자좌의 프로토스페이서 및 PAM 서열을 보여주고, 도 135a에서 분석된 표적 C는 적색으로 제시된다. 도 135c는 HAP1 세포 또는 HAP1 UNG- 세포에서 BE3으로 처리한 후의 indel 형성의 빈도를 보여준다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다.
도 136a 내지 136d는 생성물 순도에 대한 다중-C 염기 편집의 효과를 보여준다. 도 136a는 비처리된, BE3-처리된, 및 AID-BE3-처리된 인간 HEK293T 세포의 대표적인 고처리량 서열분석 데이터를 보여준다. 프로토스페이서의 서열은 상부에 제시되고, PAM 및 표적 C는 적색으로 제시되고, 아래첨자처리된 숫자는 프로토스페이서 내에서의 그의 위치를 나타낸다. 각각의 서열 아래에는 상응하는 염기를 갖는 총 서열분석 판독물의 백분율이 있다. 비-T 염기가 아니라 T로 명확하게 편집된 표적 C의 상대적인 백분율은 1개의 C만을 편집한 BE3-처리된 세포에서보다, 이 유전자에서 3개의 C를 편집한 AID-BE3-처리된 세포에서 훨씬 더 높다. 도 136b는 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같은 BE3, CDA1-BE3, 및 AID-BE3으로 처리된 HEK293T 세포를 보여준다. 편집된 DNA 서열분석 판독물 (표적 C가 돌연변이된 판독물) 중에서의 생성물 분포가 제시된다. 도 136c는 연구된 게놈 유전자좌의 프로토스페이서 및 PAM 서열을 보여주고, 도 136b에서 분석된 표적 C는 적색으로 제시된다. 도 136d는 도 136a에 제시된 처리 후의 indel 형성의 빈도를 보여준다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다.
도 137a 내지 137c는 BE3의 아키텍처 변화의 C→T 편집 효율 및 생성물 순도에 대한 효과를 보여준다. 도 137a는 연구된 게놈 유전자좌의 프로토스페이서 및 PAM 서열을 보여주고, 도 137c에서의 표적 C는 자주색 및 적색으로 제시되고, 도 137b에서의 표적 C는 적색으로 제시된다. 도 137b는 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같은 BE3, SSB-BE3, N-UGI-BE3, 및 BE3-2xUGI로 처리된 HEK293T 세포를 보여준다. 편집된 DNA 서열분석 판독물 (표적 C가 돌연변이된 판독물) 중에서의 생성물 분포가 BE3, N-UGI-BE3 및 BE3-2xUGI에 대해 제시된다. 도 137c는 C→T 염기 편집 효율을 나타낸다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다.
도 138a 내지 138d는 C→T 편집 효율 및 생성물 순도에 대한 BE3에서의 링커 길이 변동의 효과를 보여준다. 도 138a는 BE3, BE3C, BE3D, 및 BE3E의 아키텍처를 보여주고, 도 138b는 연구된 게놈 유전자좌의 프로토스페이서 및 PAM 서열을 보여주고, 도 138c에서의 표적 C는 자주색 및 적석으로 제시되고, 도 138d에서의 표적 C는 적색으로 제시된다. 도 138c는 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같은 BE3, BE3C, BE3D, 또는 BE3E로 처리된 HEK293T 세포를 보여준다. C→T 염기 편집 효율이 제시된다. 도 138d는 BE3, BE3C, BE3D 및 BE3E에 대한 편집된 DNA 서열분석 판독물 (표적 C가 돌연변이된 판독물) 중에서의 생성물 분포를 보여준다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다.
도 139a 내지 139d는 BE4가 BE3과 비교하여 염기 편집 효율 및 생성물 순도를 증가시킨다는 것을 보여준다. 도 139a는 BE3, BE4, 및 표적-AID의 아키텍처를 나타낸다. 도 139b는 연구된 게놈 유전자좌의 프로토스페이서 및 PAM 서열을 보여주고, 도 139c에서의 표적 C는 자주색 및 적색으로 제시되고, 도 139d에서의 표적 C는 적색으로 제시된다. 도 139c는 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같은 BE3, BE4, 또는 표적-AID로 처리된 HEK293T 세포를 보여준다. C→T 염기 편집 효율이 제시된다. 도 139d는 BE3 및 BE4에 대한 편집된 DNA 서열분석 판독물 (표적 C가 돌연변이된 판독물) 중에서의의 생성물 분포를 보여준다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다.
도 140a 내지 140c는 CDA1-BE3 및 AID-BE3이 BE3에 비해 더 효율적으로 표적 G에 이은 C를 편집한다는 것을 보여준다. 도 140a는 연구된 게놈 유전자좌의 프로토스페이서 및 PAM 서열을 보여주고, BE3, CDA1-BE3, 및 AID-BE3에 의해 편집된 표적 C는 적색으로 제시되고, 오직 CDA1-BE3 및 AID-BE3에 의해 편집된 표적 C (G에 이어짐)는 자주색으로 제시된다. 도 140b는 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같은 BE3, CDA1-BE3, AID-BE3, 또는 APOBEC3G-BE3으로 처리된 HEK293T 세포를 보여준다. C→T 염기 편집 효율이 제시된다. 도 140c는 HEK2 유전자좌를 표적화하는 BE3, CDA1-BE3, 또는 AID-BE3으로 처리되고 프로토스페이서의 서열에 따라 비닝되고 분석된 HEK293T 세포로부터의 개별 DNA 서열분석 판독물을 보여주고, 이는 CDA1-BE3 및 AID-BE3에 의한 명확한 C에서 T로의 편집을 갖는 서열분석 판독물의 > 85%가 둘 다 T로 편집된 C를 갖는다는 것을 밝혀냈다 (도 140c).
도 141a 내지 141c는 다수의 편집가능한 C를 갖는 부위에서의 불균일한 편집이 보다 낮은 생성물 순도를 발생시킨다는 것을 보여준다. 도 141a는 연구된 게놈 유전자좌의 프로토스페이서 및 PAM 서열을 보여주고, 도 141c에서의 표적 C는 자주색 및 적색으로 제시되고, 도 141b에서의 표적 C는 적색으로 제시된다. 도 141b 및 141c는 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같은 BE3으로 처리된 HEK293T 세포를 보여준다. 편집된 DNA 서열분석 판독물 (표적 C가 돌연변이된 판독물) 중에서의 생성물 분포가 제시된다. C에서 비-T로의 편집은 편집 효율이 동일한 유전자좌 내의 2개의 C에 대해 동일하지 않은 경우에 더 빈번하다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다.
도 142a 내지 142d는 다수의 C의 염기 편집이 보다 높은 염기 편집 생성물 순도를 발생시킨다는 것을 보여준다. 도 142a는 연구된 게놈 유전자좌의 프로토스페이서 및 PAM 서열을 보여주고, 도 142b에서 조사된 표적 C는 적색으로 제시된다. 도 142b는 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같은 BE3 또는 BE3B (UGI가 결여됨)로 처리된 HEK293T 세포를 보여준다. 편집된 DNA 서열분석 판독물 (표적 C가 돌연변이된 판독물) 중에서의 생성물 분포가 제시된다. 도 142c는 HEK2 유전자좌를 표적화하는 BE3 또는 BE3B (UGI가 결여됨)로 처리된 HEK293T 세포로부터의 HTS 판독물이 위치 6의 1차 표적 C의 정체에 따라 비닝된 것을 나타낸다. 이어서, 생성된 판독물을 위치 4에서 2차 표적 C에서의 염기의 정체에 대해 분석하였다. 상기 판독물에서 단일 편집 사건만이 있는 경우, C6은 비-T로 부정확하게 편집될 가능성이 더 크다. 도 142d는 HEK4 유전자좌 (오직 단일 편집가능한 C를 갖는 부위)를 표적화하는 BE3 또는 BE3B로 처리된 세포에서, C5에서 A, G, 및 T를 갖는 편집된 판독물의 분포를 보여주고, 이는 단일 G:U 미스매치가 UNG-개시된 염기 절제 복구를 통해 프로세싱되어 생성물의 혼합물을 제공한다는 것을 예시한다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다.
도 143은 다수의 C의 염기 편집이 HEK3 및 RNF2 유전자좌에서 보다 높은 염기 편집 생성물 순도를 발생시키는 것을 보여준다. HEK3 및 RNF2 유전자좌를 표적화하는 BE3 또는 BE3B (UGI 없음)로 처리된 HEK293T 세포로부터의 DNA 서열분석 판독물을 1차 표적 C 위치 (적색)에서의 염기의 정체에 따라 분리하였다. 이어서, 서열분석 판독물의 4개 군을 2차 표적 C 위치 (자주색)에서의 염기의 정체에 대해 조사하였다. BE3의 경우, 1차 표적 C (적색)가 부정확하게 G로 편집될 경우, 2차 표적 C는 C로 유지될 가능성이 더 크다. 반대로, 1차 표적 C (적색)가 T로 전환되는 경우, 2차 표적 C는 또한 동일한 서열분석 판독물에서 T로 편집될 가능성이 더 크다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다.
도 144a 내지 144c는 BE4가 BE3보다 더 낮은 indel 빈도를 유도하고, 표적-AID는 CDA1-BE3과 유사한 생성물 순도를 나타낸다. 도 144a는 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같은 BE3, BE4, 또는 표적-AID로 처리된 HEK293T 세포를 보여준다. indel 형성의 빈도 (실시예 17의 물질 및 방법 참조)가 제시된다. 도 144b는 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같은 CDA1-BE3 또는 표적-AID로 처리된 HEK293T 세포를 보여준다. 편집된 DNA 서열분석 판독물 (표적 C가 돌연변이된 판독물) 중에서의 생성물 분포가 제시된다. 도 144c는 연구된 게놈 유전자좌의 프로토스페이서 및 PAM 서열을 보여주고, 도 144b에서 조사된 표적 C는 적색으로 제시된다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3개의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다.
도 145a 내지 145c는 SaBE4가 SaBE3과 비교하여 증가된 염기 편집 수율 및 생성물 순도를 나타낸다는 것을 보여준다. 도 145a는 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같은 SaBE3 및 SaBE4로 처리된 HEK293T 세포를 보여준다. 나타난 표적 위치에서 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율이 제시된다. 도 145b는 연구된 게놈 유전자좌의 프로토스페이서 및 PAM 서열을 보여주고, 도 145a에서의 표적 C는 자주색 및 적색으로 제시되고, 도 145c에서 연구된 표적 C는 적색으로 제시된다. 도 145c는 편집된 DNA 서열분석 판독물 (표적 C가 돌연변이된 판독물) 중에서의 생성물 분포를 나타낸다. 값 및 오차 막대는 상이한 날에 수행된 3회의 독립적인 생물학적 반복의 평균 ± S.D.를 반영한다.
도 146은 EMX1 유전자좌에서의 BE3, CDA1-BE3, AID-BE3, 또는 APOBEC3G-BE3으로의 처리로부터의 염기 편집 결과를 보여준다. 프로토스페이서의 서열은 상단에 제시되고, PAM 및 표적 염기는 적색으로 표시되고, 아래첨자 수는 프로토스페이서 내에서의 그의 위치를 나타낸다. 각각의 서열 아래에는 상응하는 염기를 갖는 총 서열분석 판독물의 백분율이 있다. 세포를 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 처리하였다. 제시된 값은 하나의 대표적인 실험으로부터의 것이다.
도 147은 FANCF 유전자좌에서의 BE3, CDA1-BE3, AID-BE3, 또는 APOBEC3G-BE3으로의 처리로부터의 염기 편집 결과를 보여준다. 프로토스페이서의 서열은 상단에 제시되고, PAM 및 표적 염기는 적색으로 표시되고, 아래첨자표시된 숫자는 프로토스페이서 내에서의 그의 위치를 나타낸다. 각각의 서열 아래에는 상응하는 염기를 갖는 총 서열분석 판독물의 백분율이 있다. 세포를 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 처리하였다. 제시된 값은 하나의 대표적인 실험으로부터의 것이다.
도 148은 HEK2 유전자좌에서의 BE3, CDA1-BE3, AID-BE3, 또는 APOBEC3G-BE3으로의 처리로부터의 염기 편집 결과를 보여준다. 프로토스페이서의 서열은 상단에 제시되고, PAM 및 표적 염기는 적색으로 표시되고, 아래첨자표시된 숫자는 프로토스페이서 내에서의 그의 위치를 나타낸다. 각각의 서열 아래에는 상응하는 염기를 갖는 총 서열분석 판독물의 백분율이 있다. 세포를 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 처리하였다. 제시된 값은 하나의 대표적인 실험으로부터의 것이다.
도 149는 HEK3 유전자좌에서의 BE3, CDA1-BE3, AID-BE3, 또는 APOBEC3G-BE3으로의 처리로부터의 염기 편집 결과를 보여준다. 프로토스페이서의 서열은 상단에 제시되고, PAM 및 표적 염기는 적색으로 표시되고, 아래첨자표시된 숫자는 프로토스페이서 내에서의 그의 위치를 나타낸다. 각각의 서열 아래에는 상응하는 염기를 갖는 총 서열분석 판독물의 백분율이 있다. 세포를 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 처리하였다. 제시된 값은 하나의 대표적인 실험으로부터의 것이다.
도 150은 HEK4 유전자좌에서의 BE3, CDA1-BE3, AID-BE3, 또는 APOBEC3G-BE3으로의 처리로부터의 염기 편집 결과를 보여준다. 프로토스페이서의 서열은 상단에 제시되고, PAM 및 표적 염기는 적색으로 표시되고, 아래첨자표시된 숫자는 프로토스페이서 내에서의 그의 위치를 나타낸다. 각각의 서열 아래에는 상응하는 염기를 갖는 총 서열분석 판독물의 백분율이 있다. 세포를 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 처리하였다. 제시된 값은 하나의 대표적인 실험으로부터의 것이다.
도 151은 RNF2 유전자좌에서의 BE3, CDA1-BE3, AID-BE3, 또는 APOBEC3G-BE3으로의 처리로부터의 염기 편집 결과를 보여준다. 프로토스페이서의 서열은 상단에 제시되고, PAM 및 표적 염기는 적색으로 표시되고, 아래첨자표시된 숫자는 프로토스페이서 내에서의 그의 위치를 나타낸다. 각각의 서열 아래에는 상응하는 염기를 갖는 총 서열분석 판독물의 백분율이 있다. 세포를 실시예 17의 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 처리하였다. 제시된 값은 하나의 대표적인 실험으로부터의 것이다.
도 152는 LBCpf1 융합 구축물의 개략도를 보여준다. 구축물 10은 [Apobec]-[LbCpf1]-[UGI]-[UGI]의 도메인 배열을 갖고; 구축물 11은 [Apobec]-[LbCpf1]-[UGI]의 도메인 배열을 갖고; 구축물 12는 [UGI]-[Apobec]-[LbCpf1]의 도메인 배열을 갖고; 구축물 13은 [Apobec]-[UGI]-[LbCpf1]의 도메인 배열을 갖고; 구축물 14는 [LbCpf1]-[UGI]-[Apobec]의 도메인 배열을 갖고; 구축물 15는 [LbCpf1]-[Apobec]-[UGI]의 도메인 배열을 갖는다. 각각의 구축물에 대해, 3개의 상이한 LbCpf1 단백질 (D/N/A, 이는 뉴클레아제 데드 LbCpf1 (D); LbCpf1 니카제 (N) 및 뉴클레아제 활성 LbCpf1 (A)을 지칭함)을 사용하였다.
도 153은 19개 뉴클레오티드 길이의 가이드, 즉 EMX19: TACTTTGTCCTCCGGTTCT (서열식별번호: 744)를 사용한 EMX 표적 TTTGTAC3TTTGTC9C10TC12C13GGTTC18TG (서열식별번호: 738) 내 6개 C 잔기의 C에서 T로의 편집의 백분율을 보여준다. 편집을 도 152에 제시된 몇몇 구축물에 대해 시험하였다.
도 154는 18개 뉴클레오티드 길이의 가이드, 즉 EMX18: TACTTTGTCCTCCGGTTC (서열식별번호: 745)를 사용한 EMX 표적 TTTGTAC3TTTGTC9C10TC12C13GGTTC18TG (서열식별번호: 738) 내 6개 C 잔기의 C에서 T로의 편집의 백분율을 보여준다. 편집을 도 152에 제시된 몇몇 구축물에 대해 시험하였다.
도 155는 17개 뉴클레오티드 길이의 가이드, 즉 EMX17: TACTTTGTCCTCCGGTT (서열식별번호: 746)를 사용한 EMX 표적 TTTGTAC3TTTGTC9C10TC12C13GGTTC18TG (서열식별번호: 738) 내 6개 C 잔기의 C에서 T로의 편집의 백분율을 보여준다. 편집을 도 152에 제시된 몇몇 구축물에 대해 시험하였다.
도 156은 23개 뉴클레오티드의 길이의 가이드, 즉, Hek2_23: CAGCCCGCTGGCCCTGTAAAGGA (서열식별번호: 747)를 사용한 HEK2 표적 TTTCC1AGC4C5C6GC8TGGC12C13C14TGTAAA (서열식별번호: 739) 내 8개 C 잔기의 C에서 T로의 편집의 백분율을 보여준다. 편집을 도 152에 제시된 몇몇 구축물에 대해 시험하였다.
도 157은 20개 뉴클레오티드 길이의 가이드, 즉, Hek2_20: CAGCCCGCTGGCCCTGTAAA (서열식별번호: 748)를 사용한 HEK2 표적 TTTCC1AGC4C5C6GC8TGGC12C13C14TGTAAA (서열식별번호: 739) 내 8개 C 잔기의 C에서 T로의 편집의 백분율을 보여준다. 편집을 도 152에 제시된 몇몇 구축물에 대해 시험하였다.
도 158은 19개 뉴클레오티드 길이의 가이드, 즉, Hek2_19: CAGCCCGCTGGCCCTGTAA (서열식별번호: 749)를 사용한 HEK2 표적 TTTCC1AGC4C5C6GC8TGGC12C13C14TGTAAA (서열식별번호: 739) 내 8개 C 잔기의 C에서 T로의 편집의 백분율을 보여준다. 편집을 도 152에 제시된 몇몇 구축물에 대해 시험하였다.
도 159는 18개 뉴클레오티드의 길이의 가이드, 즉, Hek2_18: CAGCCCGCTGGCCCTGTA (서열식별번호: 750)를 사용한 HEK2 표적 TTTCC1AGC4C5C6GC8TGGC12C13C14TGTAAA (서열식별번호: 739) 내 8개 C 잔기의 C에서 T로의 편집의 백분율을 보여준다. 편집을 도 152에 제시된 몇몇 구축물에 대해 시험하였다.
도 160은 (indel 카운트에 기초한 조정 후의) 편집 백분율 값, 및 도 153에 도시된 실험에 대한 indel의 백분율을 나타낸다.
도 161은 (indel 카운트에 기초한 조정 후의) 편집 백분율 값, 및 도 154에 도시된 실험에 대한 indel의 백분율을 나타낸다.
도 162는 (indel 카운트에 기초한 조정 후의) 편집 백분율 값, 및 도 155에 도시된 실험에 대한 indel의 백분율을 나타낸다.
도 163은 (indel 카운트에 기초한 조정 후의) 편집 백분율 값, 및 도 156에 도시된 실험에 대한 indel의 백분율을 나타낸다.
도 164는 (indel 카운트에 기초한 조정 후의) 편집 백분율 값, 및 도 157에 도시된 실험에 대한 indel의 백분율을 나타낸다.
도 165는 (indel 카운트에 기초한 조정 후의) 편집 백분율 값, 및 도 158에 도시된 실험에 대한 indel의 백분율을 나타낸다.
도 166은 (indel 카운트에 기초한 조정 후의) 편집 백분율 값, 및 도 159에 도시된 실험에 대한 indel의 백분율을 나타낸다.
정의
본원 및 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 단수 및 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "작용제"에 대한 언급은 단일 작용제 및 복수의 이러한 작용제를 포함한다.
용어 "핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질" 또는 "napDNAbp"는 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA), 예컨대 napDNAbp를 특정 핵산 서열로 가이드하는 가이드 핵산 (예를 들어, gRNA)과 예를 들어 표적 핵산 서열에 혼성화함으로써 회합되는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, Cas9 단백질은 Cas9 단백질을 가이드 RNA에 상보적인 특정 DNA 서열로 가이드하는 가이드 RNA와 회합될 수 있다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 부류 2 미생물 CRISPR-Cas 이펙터이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 Cas9 도메인, 예를 들어 뉴클레아제 활성 Cas9, Cas9 니카제 (nCas9) 또는 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9)이다. 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질의 예는, 비제한적으로, Cas9 (예를 들어, dCas9 및 nCas9), CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2C3 및 아르고노트를 포함한다. 그러나, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질은 또한 RNA에 결합하는 핵산 프로그램가능한 단백질을 포함한다는 것이 인지되어야 한다. 예를 들어, napDNAbp는 napDNAbp를 RNA로 가이드하는 핵산과 회합될 수 있다. 다른 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질은 이들이 본 개시내용에 구체적으로 기재되어 있지 않을 수 있더라도 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다.
일부 실시양태에서, napDNAbp는 "RNA-프로그램가능한 뉴클레아제" 또는 "RNA-가이드된 뉴클레아제"이다. 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 절단을 위한 표적이 아닌 1개 이상의 RNA(들)와 복합체를 형성하는 (예를 들어, 그와 결합하거나 회합하는) 뉴클레아제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, RNA-프로그램가능한 뉴클레아제는, RNA와의 복합체로 존재하는 경우, 뉴클레아제:RNA 복합체로 지칭될 수 있다. 전형적으로, 결합된 RNA(들)는 가이드 RNA (gRNA)로 지칭된다. gRNA는 2개 이상의 RNA의 복합체로서, 또는 단일 RNA 분자로서 존재할 수 있다. 단일 RNA 분자로서 존재하는 gRNA는 단일-가이드 RNA (sgRNA)로 지칭될 수 있지만, "gRNA"는 또한 단일 분자로서 또는 2개 이상의 분자의 복합체로서 존재하는 가이드 RNA를 지칭하는 데 사용된다. 전형적으로, 단일 RNA 종으로서 존재하는 gRNA는 2개의 도메인을 포함한다: (1) 표적 핵산에 대한 상동성을 공유하는 (즉, 표적에 대한 Cas9 복합체의 결합을 지시하는) 도메인; 및 (2) Cas9 단백질에 결합하는 도메인. 일부 실시양태에서, 도메인 (2)는 tracrRNA로 공지된 서열에 상응하며, 스템-루프 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 도메인 (2)는 문헌 [Jinek et al., Science 337:816-821 (2012)] (이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 제공된 바와 같은 tracrRNA와 동일하거나 상동이다. gRNA의 다른 예 (예를 들어, 도메인 2를 포함하는 것)는 2013년 9월 6일에 출원된 발명의 명칭 "스위칭가능한 Cas9 뉴클레아제 및 그의 용도"인 미국 특허 가출원 U.S.S.N. 61/874,682, 및 2013년 9월 6일에 출원된 발명의 명칭 "기능적 뉴클레아제를 위한 전달 시스템"인 미국 특허 가출원 U.S.S.N. 61/874,746에서 찾아볼 수 있으며, 각각의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, gRNA는 도메인 (1) 및 (2) 중 2개 이상을 포함하며, "연장된 gRNA"로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 연장된 gRNA는, 본원에 기재된 바와 같이, 2개 이상의 Cas9 단백질과 결합될 것이고, 2개 이상의 별개의 영역에서 표적 핵산과 결합될 것이다. gRNA는 표적 부위에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 상기 표적 부위에 대한 뉴클레아제/RNA 복합체의 결합을 매개하여, 뉴클레아제:RNA 복합체의 서열 특이성을 제공한다. 일부 실시양태에서, RNA-프로그램가능한 뉴클레아제는 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 (CRISPR-회합된 시스템) Cas9 엔도뉴클레아제, 예를 들어, Cas9 (Csn1)이다 (예를 들어, 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663 (2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607 (2011); 및 "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821 (2012)] 참조).
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 sgRNA 중 임의의 것은 napDNAbp에 결합하는 서열, 예를 들어, sgRNA 백본 서열을 포함한다. 예를 들어 sgRNA는 문헌 [Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, and Charpentier E (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337, 816-812; Mali P, Esvelt KM, Church GM (2013) Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods, 10, 957-963; Li JF, Norville JE, Aach J, McCromack M, Zhang D, Bush J, Church GM, and Sheen J (2013) Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nature Biotech, 31, 688-691; Hwang WY, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, Peterson RT, Yeh JRJ, Joung JK (2013) Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases. Nat Biotechnol, 31, 227-229; Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F (2013) Multiplex genome engineering using CRIPSR/Cas systems. Science, 339, 819-823; Cho SW, Kim S, Kim JM, Kim JS (2013) Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol, 31, 230-232; Jinek MJ, East A, Cheng A, Lin S, Ma E, Doudna J (2013) RNA-programmed genome editing in human cells. eLIFE, 2:e00471; DiCarlo JE, Norville JE, Mali P, Rios, Aach J, Church GM (2013) Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucl Acids Res, 41, 4336-4343; Briner AE, Donohoue PD, Gomaa AA, Selle K, Slorach EM, Nye CH, Haurwitz RE, Beisel CL, May AP, and Barrangou R (2014) Guide RNA functional modules direct Cas9 activity and orthogonality. Mol Cell, 56, 333-339]에 기재되어 있으며, 이들 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 gRNA (예를 들어, sgRNA) 중 임의의 것은 GTAATTTCTACTAAGTGTAGAT (서열식별번호: 741)의 핵산 서열 (여기서 서열식별번호: 741의 각각의 T는 우라실 (U)이며, 즉, GUAAUUUCUACUAAGUGUAGAU임), 또는 서열 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUU-3' (서열식별번호: 618)를 포함한다.
RNA-프로그램가능한 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)는 DNA 절단 부위를 표적화하기 위해 RNA:DNA 혼성화를 사용하기 때문에, 이들 단백질은 원칙적으로 가이드 RNA에 의해 특정된 임의의 서열을 표적화할 수 있다. 부위-특이적 절단을 위해 (예를 들어, 게놈을 변형시키기 위해) RNA-프로그램가능한 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 사용하는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Cong, L. et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013); Mali, P. et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013); Hwang, W.Y. et al., Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013); Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013); Dicarlo, J.E. et al., Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research (2013); Jiang, W. et al., RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology 31, 233-239 (2013)] 참조).
용어 "Cas9" 또는 "Cas9 뉴클레아제"는 Cas9 단백질, 또는 그의 단편 (예를 들어, Cas9의 활성, 불활성, 또는 부분적 활성 DNA 절단 도메인, 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질)을 포함하는 RNA-가이드된 뉴클레아제를 지칭한다. Cas9 뉴클레아제는 또한 때때로 casn1 뉴클레아제 또는 CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부)-연관된 뉴클레아제로 지칭된다. CRISPR은 이동성 유전 요소 (바이러스, 수송가능한 요소 및 접합성 플라스미드)에 대한 보호를 제공하는 적응 면역계이다. CRISPR 클러스터는 스페이서, 선행 이동성 요소에 상보적인 서열, 및 표적 침입 핵산을 함유한다. CRISPR 클러스터는 전사되고, CRISPR RNA (crRNA)로 프로세싱된다. 유형 II CRISPR 시스템에서, 프리-crRNA의 교정 프로세싱은 트랜스-코딩된 소형 RNA (tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 단백질을 요구한다. tracrRNA는 프리-crRNA의 리보뉴클레아제 3-보조된 프로세싱을 위한 가이드로서 작용한다. 이어서, Cas9/crRNA/tracrRNA는 스페이서에 상보적인 선형 또는 원형 dsDNA 표적을 내핵분해적으로 절단한다. crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥은 먼저 내핵분해적으로 절단된 후, 외핵분해적으로 3'-5' 트리밍된다. 사실상, DNA-결합 및 절단은 전형적으로 단백질 및 둘 다의 RNA를 요구한다. 그러나, 단일 가이드 RNA ("sgRNA", 또는 간단히 "gNRA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 측면을 단일 RNA 종 내로 혼입하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)]을 참조하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. Cas9는 자기 대 비-자기를 구별하는 것을 돕기 위한 CRISPR 반복 서열 (PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)에서의 짧은 모티프를 인식한다. Cas9 뉴클레아제 서열 및 구조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)]; ["CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); 및 "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). Cas9 오르톨로그는 에스. 피오게네스 및 에스. 써모필루스(S. thermophilus)를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 종에서 기재되었다. 추가의 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 문헌 [Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737] (그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 유기체 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 뉴클레아제는 불활성 (예를 들어, 불활성화된) DNA 절단 도메인을 가지며, 즉, Cas9는 니카제이다.
뉴클레아제-불활성화된 Cas9 단백질은 상호교환가능하게 (뉴클레아제-"데드" Cas9에 대해) "dCas9" 단백질로 지칭될 수 있다. 불활성 DNA 절단 도메인을 갖는 Cas9 단백질 (또는 그의 단편)을 생성하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression" (2013) Cell. 28;152(5):1173-83] 참조, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). 예를 들어, Cas9의 DNA 절단 도메인은 2개의 서브도메인, 즉, HNH 뉴클레아제 서브도메인 및 RuvC1 서브도메인을 포함하는 것으로 공지되어 있다. HNH 서브도메인은 gRNA에 상보적인 가닥을 절단하는 반면, RuvC1 서브도메인은 비-상보적 가닥을 절단한다. 이들 서브도메인 내의 돌연변이는 Cas9의 뉴클레아제 활성을 침묵시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 D10A 및 H840A는 에스. 피오게네스 Cas9의 뉴클레아제 활성을 완전히 불활성화시킨다 (Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28;152(5):1173-83 (2013)). 일부 실시양태에서, Cas9의 단편을 포함하는 단백질이 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단백질은 2개의 Cas9 도메인 중 1개를 포함한다: (1) Cas9의 gRNA 결합 도메인; 또는 (2) Cas9의 DNA 절단 도메인. 일부 실시양태에서, Cas9 또는 그의 단편을 포함하는 단백질은 "Cas9 변이체"로 지칭된다. Cas9 변이체는 Cas9, 또는 그의 단편에 대한 상동성을 공유한다. 예를 들어 Cas9 변이체는 야생형 Cas9와 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 야생형 Cas9와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개, 또는 그 초과의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 단편이 야생형 Cas9의 상응하는 단편과 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 적어도 약 99.9% 동일하도록 Cas9의 단편 (예를 들어, gRNA 결합 도메인 또는 DNA-절단 도메인)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단편은 상응하는 야생형 Cas9의 아미노산 길이의 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이다.
일부 실시양태에서, 단편은 적어도 100개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 단편은 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 또는 적어도 1300개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 야생형 Cas9는 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9 (NCBI 참조 서열: NC_017053.1, 서열식별번호: 1 (뉴클레오티드); 서열식별번호: 2 (아미노산))에 상응한다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
(단일 밑줄: HNH 도메인; 이중 밑줄: RuvC 도메인)
일부 실시양태에서, 야생형 Cas9는 서열식별번호:3 (뉴클레오티드) 및/또는 서열식별번호: 4 (아미노산)에 상응하거나, 이를 포함한다:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
(단일 밑줄: HNH 도메인; 이중 밑줄: RuvC 도메인)
일부 실시양태에서, 야생형 Cas9는 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9 (NCBI 참조 서열: NC_002737.2, 서열식별번호: 5 (뉴클레오티드); 및 유니프롯 참조 서열: Q99ZW2, 서열식별번호: 6 (아미노산))에 상응한다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
(단일 밑줄: HNH 도메인; 이중 밑줄: RuvC 도메인)
일부 실시양태에서, Cas9는 코리네박테리움 울세란스(Corynebacterium ulcerans) (NCBI Ref: NC_015683.1, NC_017317.1); 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) (NCBI Ref: NC_016782.1, NC_016786.1); 스피로플라스마 시르피디콜라(Spiroplasma syrphidicola) (NCBI Ref: NC_021284.1); 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia) (NCBI Ref: NC_017861.1); 스피로플라스마 타이와넨스(Spiroplasma taiwanense) (NCBI Ref: NC_021846.1); 스트렙토코쿠스 이니아에(Streptococcus iniae) (NCBI Ref: NC_021314.1); 벨리엘라 발티카(Belliella baltica) (NCBI Ref: NC_018010.1); 시크로플렉수스 토르퀴스I(Psychroflexus torquisI) (NCBI Ref: NC_018721.1); 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) (NCBI Ref: YP_820832.1), 리스테리아 인노쿠아(Listeria innocua) (NCBI Ref: NP_472073.1), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) (NCBI Ref: YP_002344900.1) 또는 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) (NCBI Ref: YP_002342100.1)로부터의 Cas9 또는 실시예 5에 열거된 유기체 중 임의의 것으로부터의 Cas9를 지칭한다.
일부 실시양태에서, dCas9는 Cas9 뉴클레아제 활성을 불활성화시키는 1개 이상의 돌연변이를 갖는 Cas9 아미노산 서열에 상응하거나, 부분적으로 또는 전체적으로 이를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, dCas9 도메인은 D10A 및/또는 H840A 돌연변이를 포함한다.
dCas9 (D10A 및 H840A):
Figure pct00011
(단일 밑줄: HNH 도메인; 이중 밑줄: RuvC 도메인).
일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 D10A 돌연변이를 포함하는 반면, 위치 840에서의 잔기는 서열식별번호: 6에 제공된 아미노산 서열에, 또는 또 다른 Cas9 도메인, 예컨대 본원에 제공된 Cas9 단백질 중 임의의 것에 제공된 아미노산 서열 중 임의의 것에서의 상응하는 위치에 히스티딘을 보유한다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 촉매 잔기 H840의 존재는 Cas9의 활성을 복원하여 표적화된 C와 대향하는 G를 함유하는 비-편집된 (예를 들어, 비-탈아미노화된) 가닥을 절단한다. H840의 (예를 들어, A840으로부터의) 복원은 C를 함유하는 표적 가닥의 절단을 발생시키지 않는다. 이러한 Cas9 변이체는 gRNA-한정된 표적 서열에 기초하여 특이적 위치에서 단일-가닥 DNA 파괴 (닉)를 생성할 수 있으며, 이는 비-편집된 가닥의 복구를 발생시키고, 궁극적으로 비-편집된 가닥 상의 G에서 A로의 변화를 발생시킨다. 이 과정의 개략적 표현은 도 108에 나타나 있다. 간략하게, C-G 염기 쌍의 C를 데아미나제, 예를 들어, APOBEC 데아미나제에 의해 U로 탈아미노화할 수 있다. G를 갖는 비-편집된 가닥을 니킹하는 것은 미스매치 복구 메카니즘을 통한 G의 제거를 용이하게 한다. UGI는 UDG를 억제하고, 이는 U의 제거를 방지한다.
다른 실시양태에서, 예를 들어, 뉴클레아제 불활성화된 Cas9 (dCas9)를 발생시키는, D10A 및 H840A 이외의 돌연변이를 갖는 dCas9 변이체가 제공된다. 이러한 돌연변이는, 예로서, D10 및 H820에 다른 아미노산 치환, 또는 Cas9의 뉴클레아제 도메인 내에 다른 치환 (예를 들어, HNH 뉴클레아제 서브도메인 및/또는 RuvC1 서브도메인에서의 치환)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 6과 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 적어도 약 99.9% 동일한 dCas9의 변이체 또는 상동체 (예를 들어, 서열식별번호: 6의 변이체)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 6보다 약 5개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 15개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 75개 아미노산, 약 100개 아미노산 이상 더 짧거나, 더 긴 아미노산 서열을 갖는 dCas9의 변이체 (예를 들어, 서열식별번호: 6의 변이체)가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 융합 단백질은 Cas9 단백질의 전장 아미노산 서열, 예를 들어, 본원에 제공된 Cas9 서열 중 하나를 포함한다. 그러나, 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 융합 단백질은 전장 Cas9 서열을 포함하지 않지만, 단지 그의 단편을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 Cas9 융합 단백질은 Cas9 단편을 포함하고, 단편은 crRNA 및 tracrRNA 또는 sgRNA에 결합하지만, 예를 들어, 그것이 단지 뉴클레아제 도메인의 말단절단된 형태만을 포함하거나, 뉴클레아제 도메인을 전혀 포함하지 않는다는 점에서 기능적 뉴클레아제 도메인을 포함하지 않는다. 적합한 Cas9 도메인 및 Cas9 단편의 예시적인 아미노산 서열은 본원에 제공되며, Cas9 도메인 및 단편의 추가의 적합한 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
일부 실시양태에서, Cas9는 코리네박테리움 울세란스 (NCBI Ref: NC_015683.1, NC_017317.1); 코리네박테리움 디프테리아 (NCBI Ref: NC_016782.1, NC_016786.1); 스피로플라스마 시르피디콜라 (NCBI Ref: NC_021284.1); 프레보텔라 인터메디아 (NCBI Ref: NC_017861.1); 스피로플라스마 타이와넨스 (NCBI Ref: NC_021846.1); 스트렙토코쿠스 이니아에 (NCBI Ref: NC_021314.1); 벨리엘라 발티카 (NCBI Ref: NC_018010.1); 시크로플렉수스 토르퀴스I (NCBI Ref: NC_018721.1); 스트렙토코쿠스 써모필루스 (NCBI Ref: YP_820832.1); 리스테리아 인노쿠아 (NCBI Ref: NP_472073.1); 캄필로박터 제주니 (NCBI Ref: YP_002344900.1); 또는 네이세리아 메닝기티디스 (NCBI Ref: YP_002342100.1)로부터의 Cas9를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "데아미나제" 또는 "데아미나제 도메인"은 탈아미노화 반응을 촉매하는 단백질 또는 효소를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 각각 시티딘 또는 데옥시시티딘의 우리딘 또는 데옥시우리딘으로의 가수분해적 탈아미노화를 촉매하는 시티딘 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 시토신의 우라실로의 가수분해적 탈아미노화를 촉매하는 시티딘 데아미나제 도메인이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 유기체, 예컨대 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이, 소, 개, 래트, 또는 마우스로부터의 자연-발생 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 자연에서 발생하지 않는 유기체로부터의 자연-발생 데아미나제의 변이체이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 유기체로부터의 자연-발생 데아미나제와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75% 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 목적하는 생물학적 반응을 유발하는 데 충분한 생물학적 활성제의 양을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 뉴클레아제의 유효량은 뉴클레아제에 의해 특이적으로 결합되고 절단되는 표적 부위의 절단을 유도하는 데 충분한 뉴클레아제의 양을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질의, 예를 들어, 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인 및 핵산 편집 도메인 (예를 들어, 데아미나제 도메인)을 포함하는 융합 단백질의 유효량은 융합 단백질에 의해 특이적으로 결합되고 편집되는 표적 부위의 편집을 유도하는 데 충분한 융합 단백질의 양을 지칭할 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 작용제, 예를 들어, 융합 단백질, 뉴클레아제, 데아미나제, 레콤비나제, 혼성 단백질, 단백질 이량체, 단백질 (또는 단백질 이량체) 및 폴리뉴클레오티드의 복합체, 또는 폴리뉴클레오티드의 유효량은 예를 들어, 목적하는 생물학적 반응, 예를 들어, 편집될 특이적 대립유전자, 게놈, 또는 표적 부위, 표적화되는 세포 또는 조직, 및 사용되는 작용제와 같은 다양한 인자에 의존할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "링커"는 2개의 분자 또는 모이어티, 예를 들어, 융합 단백질의 2개의 도메인, 예컨대, 예를 들어, 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인 및 핵산 편집 도메인 (예를 들어, 데아미나제 도메인)을 연결하는 화학적 기 또는 분자를 지칭한다. 링커는 예를 들어 임의의 길이 및 조성의 아미노산 서열, 펩티드, 또는 중합체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 Cas9 뉴클레아제 도메인, 및 핵산 편집 단백질의 촉매 도메인을 포함한 RNA-프로그램가능한 뉴클레아제의 gRNA 결합 도메인을 연결한다. 일부 실시양태에서, 링커는 dCas9 및 핵산 편집 단백질을 연결한다. 전형적으로, 링커는 2개의 기, 분자, 또는 다른 모이어티 사이에 위치되거나, 그에 의해 플랭킹되고, 공유 결합을 통해 각각의 것에 대해 연결되며, 따라서 2개를 연결한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 또는 복수의 아미노산 (예를 들어, 펩티드 또는 단백질)이다. 일부 실시양태에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학적 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 링커는 1 내지 100개 아미노산 길이, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30 내지 35, 35 내지 40, 40 내지 45, 45 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 150, 또는 150 내지 200개 아미노산 길이이다. 보다 긴 또는 보다 짧은 링커가 또한 고려된다.
본원에 사용된 용어 "돌연변이"는 서열, 예를 들어, 핵산 또는 아미노산 서열 내의 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 또는 서열 내의 1개 이상의 잔기의 결실 또는 삽입을 지칭한다. 돌연변이는 전형적으로 서열 내의 잔기의 위치에 의해 이어지는 원래 잔기를 확인함으로써, 및 새롭게 치환된 잔기의 확인에 의해 본원에 기재된다. 본원에 제공된 아미노산 치환 (돌연변이)을 생성하는 다양한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))]에 의해 제공된다.
본원에 사용된 용어 "핵산" 및 "핵산 분자"는 핵염기 및 산성 모이어티, 예를 들어, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 중합체 핵산, 예를 들어, 3개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자는 인접한 뉴클레오티드가 포스포디에스테르 연결을 통해 서로 연결된 선형 분자이다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기 (예를 들어 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 3개 이상의 개별 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 쇄를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환가능하게 뉴클레오티드 (예를 들어, 일련의 적어도 3개의 뉴클레오티드)의 중합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 RNA 뿐만 아니라 단일 및/또는 이중-가닥 DNA를 포괄한다. 핵산은 예를 들어, 게놈, 전사체, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, snRNA, 플라스미드, 코스미드, 염색체, 크로마티드 또는 다른 자연 발생 핵산 분자의 맥락에서 자연 발생일 수 있다. 한편, 핵산 분자는 비-자연 발생 분자, 예를 들어, 재조합 DNA 또는 RNA, 인공 염색체, 조작된 게놈, 또는 그의 단편, 또는 합성 DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드이거나, 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 게다가, 용어 "핵산", "DNA", "RNA", 및/또는 유사한 용어는 핵산 유사체, 예를 들어, 포스포디에스테르 백본 이외의 것을 갖는 유사체를 포함한다. 핵산은 천연 공급원으로부터 정제되고, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생성되고, 임의로 정제되고, 화학적으로 합성되는 등을 할 수 있다. 적절한 경우, 예를 들어, 화학적으로 합성된 분자의 경우, 핵산은 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 및 백본 변형을 갖는 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 달리 나타내지 않는 한 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 천연 뉴클레오시드 (예를 들어 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘); 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기 (예를 들어, 메틸화된 염기); 개재된 염기; 변형된 당 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스); 및/또는 변형된 포스페이트 기 (예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연결)이거나, 이를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "핵산 편집 도메인"은 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA)에 대해 1개 이상의 변형 (예를 들어, 시티딘 잔기의 탈아미노화)을 생성할 수 있는 단백질 또는 효소를 지칭한다. 예시적인 핵산 편집 도메인은 데아미나제, 뉴클레아제, 니카제, 레콤비나제, 메틸트랜스퍼라제, 메틸라제, 아세틸라제, 아세틸트랜스퍼라제, 전사 활성인자, 또는 전사 리프레서 도메인을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 핵산 편집 도메인은 데아미나제 (예를 들어, 시티딘 데아미나제, 예컨대 APOBEC 또는 AID 데아미나제)이다.
본원에 사용된 용어 "증식성 질환"은 세포 또는 세포 집단이 비정상적으로 상승된 증식 속도를 나타낸다는 점에서 세포 또는 조직 항상성이 교란된 임의의 질환을 지칭한다. 증식성 질환은 과다증식성 질환, 예컨대 전-신생물성 과다형성 상태 및 신생물성 질환을 포함한다. 신생물성 질환은 세포의 비정상적 증식을 특징으로 하며, 양성 및 악성 신생물 둘 다를 포함한다. 악성 신생물은 또한 암으로 지칭된다.
용어 "단백질", "펩티드", 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 펩티드 (아미드) 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 용어는 임의의 크기, 구조, 또는 기능의 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 적어도 3개 아미노산 길이일 것이다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 개별 단백질 또는 단백질의 집합을 지칭할 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드에서의 아미노산 중 1개 이상은 예를 들어, 화학 물질, 예컨대 탄수화물 기, 히드록실 기, 포스페이트 기, 파르네실 기, 이소파르네실 기, 지방산 기, 접합용 링커의 첨가, 관능화, 또는 다른 변형 등에 의해 변형될 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 또한 단일 분자일 수 있거나, 다중-분자 복합체일 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 단지 자연 발생 단백질 또는 펩티드의 단편일 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 자연 발생, 재조합, 또는 합성, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "융합 단백질"은 적어도 2종의 상이한 단백질로부터의 단백질 도메인을 포함하는 하이브리드 폴리펩티드를 지칭한다. 1종의 단백질은 융합 단백질의 아미노-말단 (N-말단) 부분에 또는 카르복시-말단 (C-말단) 단백질에 위치하며, 따라서 각각 "아미노-말단 융합 단백질" 또는 "카르복시-말단 융합 단백질"을 형성할 수 있다. 단백질은 핵산 편집 단백질의 상이한 도메인, 예를 들어, 핵산 결합 도메인 (예를 들어, 표적 부위에의 단백질의 결합을 지정하는 Cas9의 gRNA 결합 도메인) 및 핵산 절단 도메인 또는 촉매 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 단백질성 부분, 예를 들어, 핵산 결합 도메인을 구성하는 아미노산 서열, 및 유기 화합물, 예를 들어, 핵산 절단제로서 작용할 수 있는 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 핵산, 예를 들어, RNA와의 복합체에 있거나, 그와 회합된다. 본원에 제공된 단백질 중 임의의 것은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 단백질은 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질에 특히 적합한 재조합 단백질 발현 및 정제를 통해 생성될 수 있다. 재조합 단백질 발현 및 정제를 위한 방법은 널리 공지되어 있으며, 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))]에 기재된 것들을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 개별 유기체, 예를 들어, 개별 포유동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 영장류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 설치류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 양, 염소, 소, 고양이, 또는 개이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 척추동물, 양서류, 파충류, 어류, 곤충류, 파리, 또는 선충류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 연구 동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 유전자 조작된, 예를 들어, 유전자 조작된 비-인간 대상체이다. 대상체는 양쪽 성별의 및 임의의 발달 단계의 것일 수 있다.
용어 "표적 부위"는 데아미나제 또는 데아미나제를 포함하는 융합 단백질 (예를 들어, 본원에 제공된 dCas9-데아미나제 융합 단백질)에 의해 탈아미노화되는 핵산 분자 내의 서열을 지칭한다.
용어 "치료", "치료하다", 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애, 또는 그의 1종 이상의 증상을 역전시키거나, 경감시키거나, 그의 발병을 지연시키거나, 그의 진행을 억제하는 것을 목표로 하는 임상적 개입을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "치료", "치료하다", 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애, 또는 그의 1종 이상의 증상을 역전시키거나, 경감시키거나, 그의 발병을 지연시키거나, 그의 진행을 억제하는 것을 목표로 하는 임상적 개입을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료는 1종 이상의 증상이 발달된 후에 및/또는 질환이 진단된 후에 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료는 증상의 부재 하에서, 예를 들어, 증상의 발병을 예방하거나 지연시키거나, 또는 질환의 발병 또는 진행을 억제하기 위해 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료는 증상의 발병 전에 (예를 들어, 증상의 병력의 관점에서 및/또는 유전적 또는 다른 감수성 인자의 관점에서) 감수성 개체에게 투여될 수 있다. 치료는 또한 증상이 해결된 후에, 예를 들어, 그의 재발을 예방하거나 지연시키기 위해 계속될 수 있다.
단백질 또는 핵산과 관련하여 본원에 사용된 용어 "재조합"은 자연에서 발생하지 않지만, 인간 조작의 생성물인 단백질 또는 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 재조합 단백질 또는 핵산 분자는 임의의 자연 발생 서열과 비교하여 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 적어도 7개의 돌연변이를 포함하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "제약 조성물"은 질환 또는 장애의 치료와 관련하여 대상체에게 투여될 수 있는 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 활성 성분, 예를 들어 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "염기 편집제 (BE)" 또는 "핵염기 편집제 (NBE)"는 핵산 서열 (예를 들어, DNA 또는 RNA) 내의 염기 (예를 들어, A, T, C, G 또는 U)에 변형을 가할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 작용제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 핵산 내의 염기를 탈아미노화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 DNA 분자 내의 염기를 탈아미노화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 DNA 중 시토신 (C)을 탈아미노화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 시티딘 데아미나제 도메인에 융합된 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 시티딘 데아미나제에 융합된 Cas9 (예를 들어, dCas9 및 nCas9), CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, 또는 아르고노트 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 시티딘 데아미나제에 융합된 Cas9 니카제 (nCas9)이다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 시티딘 데아미나제에 융합된 뉴클레아제-불활성 Cas9 (dCas9)이다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 염기 절제 복구의 억제제, 예를 들어 UGI 도메인에 융합된다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 시티딘 데아미나제에 융합된 CasX 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 시티딘 데아미나제에 융합된 CasY 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 시티딘 데아미나제에 융합된 Cpf1 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 시티딘 데아미나제에 융합된 C2c1 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 시티딘 데아미나제에 융합된 C2c2 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 시티딘 데아미나제에 융합된 C2c3 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 시티딘 데아미나제에 융합된 아르고노트 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "우라실 글리코실라제 억제제" 또는 "UGI"는 우라실-DNA 글리코실라제 염기-절제 복구 효소를 억제할 수 있는 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "Cas9 니카제"는 듀플렉스 핵산 분자 (예를 들어, 듀플렉스 DNA 분자)의 단지 1개의 가닥만을 절단할 수 있는 Cas9 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, Cas9 니카제는 D10A 돌연변이를 포함하고, 서열식별번호: 6의 위치 H840에 히스티딘, 또는 또 다른 Cas9 도메인, 예컨대 본원에 제공된 Cas9 단백질 중 임의의 것에서의 상응하는 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, Cas9 니카제는 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 Cas9 니카제는 활성 HNH 뉴클레아제 도메인을 가지며, DNA의 비-표적화된 가닥, 즉, gRNA에 의해 결합된 가닥을 절단할 수 있다. 또한, 이러한 Cas9 니카제는 불활성 RuvC 뉴클레아제 도메인을 가지며, DNA의 표적화된 가닥, 즉, 염기 편집을 목적하는 하는 가닥을 절단할 수 없다.
예시적인 Cas9 니카제 (클로닝 벡터 pPlatTET-gRNA2; 수탁 번호 BAV54124).
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발명의 특정 실시양태의 상세한 설명
본 개시내용의 일부 측면은 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 도메인 (예를 들어, Cas9, 또는 Cpf1 단백질) 및 효소 도메인, 예를 들어, DNA-편집 도메인, 예컨대, 예를 들어, 데아미나제 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 데아미나제에 의한 핵염기의 탈아미노화는 각각의 잔기에서 점 돌연변이를 발생시킬 수 있으며, 이는 본원에서 핵산 편집으로 지칭된다. 따라서, Cas9 변이체 또는 도메인 및 DNA 편집 도메인을 포함하는 융합 단백질은 핵산 서열의 표적화된 편집에 사용될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 시험관내에서 DNA의 표적화된 편집에, 예를 들어, 돌연변이체 세포 또는 동물의 생성에; 표적화된 돌연변이의 도입에, 예를 들어, 생체외에서의 세포에서의, 예를 들어, 동일한 또는 또 다른 대상체 내로 후속적으로 재-도입된 대상체로부터 얻어진 세포에서의 유전적 결함의 교정에; 및 표적화된 돌연변이의 도입, 예를 들어 대상체에서 질환-연관된 유전자에서의 유전적 결함의 교정 또는 탈활성화 돌연변이의 도입에 유용하다. 전형적으로, 본원에 기재된 융합 단백질의 Cas9 도메인은 임의의 뉴클레아제 활성을 갖지 않지만, 대신 Cas9 단편 또는 dCas9 단백질 또는 도메인이다. 본 발명의 다른 측면은 (i) 핵산 서열에 결합할 수 있는 도메인 (예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 단백질); (ii) 효소 도메인, 예를 들어, DNA-편집 도메인 (예를 들어, 데아미나제 도메인); 및 (iii) 1개 이상의 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 적어도 1개의 UGI 도메인의 존재는 UGI 도메인이 없는 융합 단백질과 비교하여 염기 편집 효율을 증가시킨다. 2개의 UGI 도메인을 포함하는 융합 단백질은 1개의 UGI 도메인을 갖거나 UGI 도메인을 갖지 않는 융합 단백질과 비교하여 염기 편집 효율 및 생성물 순도를 추가로 증가시킨다. 본원에 기재된 바와 같은 Cas9 융합 단백질의 사용 방법이 또한 제공된다.
핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질
본 개시내용의 일부 측면은 단백질, 예컨대 염기 편집제를 특정 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열에 가이드하는 데 사용될 수 있는 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질을 제공한다. 본원에 제공된 융합 단백질 (예를 들어, 염기 편집제) 중 임의의 것은 임의의 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)을 포함할 수 있다는 것이 인지되어야 한다. 예를 들어, Cas9 도메인을 포함하는 본원에 기재된 융합 단백질 중 임의의 것은 Cas9 도메인 대신 또 다른 napDNAbp, 예컨대 CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, 및 아르고노트를 사용할 수 있다. 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질은, 비제한적으로, Cas9 (예를 들어, dCas9 및 nCas9), CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2C3, 및 아르고노트를 포함한다. Cas9와 상이한 PAM 특이성을 갖는 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질의 한 예는 프레보텔라 및 프란시셀라 1로부터의 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (Cpf1)이다. Cas9와 유사하게, Cpf1도 또한 부류 2 CRISPR 이펙터이다. Cpf1은 Cas9와 구분되는 특색을 가지면서 강건한 DNA 간섭을 매개한다. Cpf1은 tracrRNA가 결여된 단일 RNA-가이드 엔도뉴클레아제이고, 이는 T-풍부 프로토스페이서-인접 모티프 (TTN, TTTN 또는 YTN)를 사용한다. 더욱이, Cpf1은 엇갈린 DNA 이중-가닥 파괴를 통해 DNA를 절단한다. 16종의 Cpf1-패밀리 단백질 중에서, 아시다미노코쿠스 및 라크노스피라세아에로부터의 2종의 효소는 인간 세포에서 효율적인 게놈-편집 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. Cpf1 단백질은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Yamano et al., "Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA." Cell (165) 2016, p. 949-962]에 이전에 기재되어 있으며; 이들 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
가이드 뉴클레오티드 서열-프로그램가능한 DNA 결합 단백질 도메인으로서 사용될 수 있는 뉴클레아제-불활성 Cpf1 (dCpf1) 변이체가 또한 본 발명의 조성물 및 방법에 유용하다. Cpf1 단백질은 Cas9의 RuvC 도메인과 유사한 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 갖지만, HNH 엔도뉴클레아제 도메인은 갖지 않고, Cpf1의 N-말단은 Cas9의 알파-나선 인식 로브를 갖지 않는다. Cpf1의 RuvC-유사 도메인은 양쪽 DNA 가닥의 절단을 담당하고, RuvC-유사 도메인의 불활성화는 Cpf1 뉴클레아제 활성을 불활성화한다는 것이 문헌 [Zetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015 (이는 본원에 참조로 포함됨)]에 제시되었다. 예를 들어, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) Cpf1 (서열식별번호: 15)에서 D917A, E1006A, 또는 D1255A에 상응하는 돌연변이는 Cpf1 뉴클레아제 활성을 불활성화한다. 일부 실시양태에서, 데드 Cpf1 (dCpf1)은 서열식별번호: 9에서 D917A, E1006A, D1255A, D917A/E1006A, D917A/D1255A, E1006A/D1255A, 또는 D917A/E1006A/D1255A에 상응하는 돌연변이를 포함한다. Cpf1의 RuvC 도메인을 불활성화하는 임의의 돌연변이, 예를 들어 치환 돌연변이, 결실 또는 삽입이 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것의 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 Cpf1 단백질이다. 일부 실시양태에서, Cpf1 단백질은 Cpf1 니카제 (nCpf1)이다. 일부 실시양태에서, Cpf1 단백질은 뉴클레아제 불활성 Cpf1 (dCpf1)이다. 일부 실시양태에서, Cpf1, nCpf1, 또는 dCpf1은 서열식별번호: 9-24 중 어느 하나와 적어도 85% 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, dCpf1은 서열식별번호: 9-16 중 어느 하나와 적어도 85% 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 9에서 D917A, E1006A, D1255A, D917A/E1006A, D917A/D1255A, E1006A/D1255A 또는 D917A/ E1006A/D1255A에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, dCpf1 단백질은 서열식별번호: 9-16 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 박테리아 종으로부터의 Cpf1도 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다는 것이 인지되어야 한다.
야생형 프란시셀라 노비시다 Cpf1 (서열식별번호: 9) (D917, E1006, 및 D1255는 볼드체 및 밑줄표시됨)
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Figure pct00015
프란시셀라 노비시다 Cpf1 D917A (서열식별번호: 10) (A917, E1006, 및 D1255는 볼드체 및 밑줄표시됨)
Figure pct00016
Figure pct00017
프란시셀라 노비시다 Cpf1 E1006A (서열식별번호: 11) (D917, A1006, 및 D1255는 볼드체 및 밑줄표시됨)
Figure pct00018
프란시셀라 노비시다 Cpf1 D1255A (서열식별번호: 12) (D917, E1006, 및 A1255는 볼드체 및 밑줄표시됨)
Figure pct00019
프란시셀라 노비시다 Cpf1 D917A/E1006A (서열식별번호: 13) (A917, A1006, 및 D1255는 볼드체 및 밑줄표시됨)
Figure pct00020
Figure pct00021
프란시셀라 노비시다 Cpf1 D917A/D1255A (서열식별번호: 14) (A917, E1006, 및 A1255는 볼드체 및 밑줄표시됨)
Figure pct00022
Figure pct00023
프란시셀라 노비시다 Cpf1 E1006A/D1255A (서열식별번호: 15) (D917, A1006, 및 A1255는 볼드체 및 밑줄표시됨)
Figure pct00024
Figure pct00025
프란시셀라 노비시다 Cpf1 D917A/E1006A/D1255A (서열식별번호: 16) (A917, A1006, 및 A1255는 볼드체 및 밑줄표시됨)
Figure pct00026
일부 실시양태에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질은 아시다미노코쿠스(Acidaminococcus) 종 (AsCpf1)으로부터의 Cpf1 단백질이다. 아시다미노코쿠스 종으로부터의 Cpf1 단백질이 이전에 기재되었고, 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예시적인 아시다미노코쿠스 Cpf1 단백질 (AsCpf1)은, 비제한적으로, 본원에 제공된 AsCpf1 단백질 중 임의의 것을 포함한다.
야생형 AsCpf1- 잔기 R912는 볼드체로 밑줄표시되어 제시되고, 잔기 661-667은 이탤릭체로 밑줄표시되어 제시된다.
Figure pct00027
AsCpf1(R912A)- 잔기 A912는 볼드체로 밑줄표시되어 제시되고, 잔기 661-667은 이탤릭체로 밑줄표시되어 제시된다.
Figure pct00028
일부 실시양태에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질은 라크노스피라세아에(Lachnospiraceae) 종 (LbCpf1)으로부터의 Cpf1 단백질이다. 라크노스피라세아에 종으로부터의 Cpf1 단백질이 이전에 기재되었고, 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예시적인 라크노스피라세아에 Cpf1 단백질 (LbCpf1)은, 비제한적으로, 본원에 제공된 LbCpf1 단백질 중 임의의 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, LbCpf1은 니카제이다. 일부 실시양태에서, LbCpf1 니카제는 서열식별번호: 18과 관련하여 R836X 돌연변이체를 포함하며, 여기서 X는 R을 제외한 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, LbCpf1 니카제는 서열식별번호: 18과 관련하여 R836A 돌연변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, LbCpf1은 뉴클레아제 불활성 LbCpf1 (dLbCpf1)이다. 일부 실시양태에서, dLbCpf1은 서열식별번호: 18과 관련하여 D832X 돌연변이체를 포함하며, 여기서 X는 D를 제외한 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, dLbCpf1은 서열식별번호: 18과 관련하여 D832A 돌연변이체를 포함한다. 추가의 dCpf1 단백질은 관련 기술분야, 예를 들어, 문헌 [Li et al. "Base editing with a Cpf1-cytidine deaminase fusion" Nature Biotechnology; March 2018 DOI: 10.1038/nbt.4102]에 기재되어 있으며; 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, dCpf1은 문헌 [Li et al.]에 기재된 Cpf1의 점 돌연변이 D832A, E1006A, D1125A 중 1, 2 또는 3개를 포함한다.
야생형 LbCpf1 - 잔기 R836 및 R1138은 볼드체로 밑줄표시되어 제시된다.
Figure pct00029
LbCpf1 (R836A)- 잔기 A836은 볼드체로 밑줄표시되어 제시된다.
Figure pct00030
LbCpf1 (R1138A)- 잔기 A1138은 볼드체로 밑줄표시되어 제시된다.
Figure pct00031
일부 실시양태에서, Cpf1 단백질은 손상된 Cpf1 단백질이다. 본원에 사용된 "손상된 Cpf1" 단백질은 야생형 Cpf1 단백질과 비교하여 감소된 뉴클레아제 활성을 갖는 Cpf1 단백질이다. 일부 실시양태에서, 손상된 Cpf1 단백질은 비-표적 가닥보다 표적 가닥을 더 효율적으로 우선적으로 절단한다. 예를 들어, Cpf1 단백질은 편집될 뉴클레오티드가 상주하는 듀플렉싱된 핵산 분자의 가닥을 우선적으로 절단한다. 일부 실시양태에서, 손상된 Cpf1 단백질은 표적 가닥보다 비-표적 가닥을 더 효율적으로 우선적으로 절단한다. 예를 들어, Cpf1 단백질은 편집될 뉴클레오티드가 상주하지 않는 듀플렉싱된 핵산 분자의 가닥을 우선적으로 절단한다. 일부 실시양태에서, 손상된 Cpf1 단백질은 그것이 비-표적 가닥을 절단하는 것보다 표적 가닥을 적어도 5% 더 효율적으로 우선적으로 절단한다. 일부 실시양태에서, 손상된 Cpf1 단백질은 그것이 비-표적 가닥을 절단하는 것보다 표적 가닥을 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 100% 더 효율적으로 우선적으로 절단한다.
일부 실시양태에서, 손상된 Cpf1 단백질은 비-자연 발생 Cpf1 단백질이다. 일부 실시양태에서, 손상된 Cpf1 단백질은 야생형 Cpf1 단백질에 비해 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 손상된 Cpf1 단백질은 야생형 Cpf1 단백질에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 손상된 Cpf1 단백질은 서열식별번호: 18에, 또는 또 다른 Cpf1 단백질 내의 상응하는 아미노산에 제시된 바와 같은 R836A 돌연변이를 포함한다. 서열식별번호: 18의 R836A에 대한 상동 잔기 (예를 들어, 상응하는 아미노산)를 포함하는 Cpf1이 또한 유사한 결과를 달성하기 위해 돌연변이될 수 있다는 것이 인지되어야 한다. 일부 실시양태에서, 손상된 Cpf1 단백질은 서열식별번호: 18에, 또는 또 다른 Cpf1 단백질 내의 상응하는 아미노산에 제시된 바와 같은 R1138A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 손상된 Cpf1 단백질은 서열식별번호: 17에, 또는 또 다른 Cpf1 단백질 내의 상응하는 아미노산에 제시된 바와 같은 R912A 돌연변이를 포함한다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 서열식별번호: 18 (LbCpf1)의 잔기 R836 및 서열식별번호: 17 (AsCpf1)의 잔기 R912는 상응하는 (예를 들어, 상동) 잔기의 예이다. 예를 들어, 서열식별번호: 17 및 18 사이의 정렬 부분은 R912 및 R836이 상응하는 잔기임을 보여준다.
Figure pct00032
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 Cpf1 단백질 중 임의의 것은 1개 이상의 아미노산 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 Cpf1 단백질 중 임의의 것은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산 결실을 포함한다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, Cpf1에 융합된 데아미나제 (예를 들어, APOBEC)의 기능을 폐쇄할 수 있는, AsCpf1 (서열식별번호: 17)의 잔기 661-667을 포함하는 Cpf1 내의 나선 영역이 존재한다. 이러한 영역은 아미노산 서열 KKTGDQK를 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 측면은 Cpf1에서의 이러한 나선 영역을 방해하는 돌연변이 (예를 들어, 결실)를 포함하는 Cpf1 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, Cpf1 단백질은 서열식별번호: 17에서 하기 잔기 중 1개 이상의 결실, 또는 또 다른 Cpf1 단백질에서 1개 이상의 상응하는 결실을 포함한다: K661, K662, T663, G664, D665, Q666 및 K667. 일부 실시양태에서, Cpf1 단백질은 서열식별번호: 17에서 T663 및 D665 결실, 또는 또 다른 Cpf1 단백질에서 상응하는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cpf1 단백질은 서열식별번호: 17에서 K662, T663, D665, 및 Q666 결실, 또는 또 다른 Cpf1 단백질에서 상응하는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cpf1 단백질은 서열식별번호: 17에서 K661, K662, T663, D665, Q666 및 K667 결실, 또는 또 다른 Cpf1 단백질에서 상응하는 결실을 포함한다.
AsCpf1 (T663 및 D665 결실됨)
Figure pct00033
Figure pct00034
AsCpf1 (K662, T663, D665, 및 Q666 결실됨)
Figure pct00035
AsCpf1 (K661, K662, T663, D665, Q666, 및 K667 결실됨)
Figure pct00036
일부 실시양태에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 표적 서열에서 정규 (NGG) PAM 서열을 필요로 하지 않는 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 아르고노트 단백질이다. 이러한 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질의 한 예는 나트로노박테리움 그레고리(Natronobacterium gregoryi)로부터의 아르고노트 단백질 (NgAgo)이다. NgAgo는 ssDNA-가이드 엔도뉴클레아제이다. NgAgo는 ~24개 뉴클레오티드 (gDNA) 길이의 5'-인산화된 ssDNA에 결합하여 그것을 그의 표적 부위로 가이드하고, gDNA 부위에서 DNA 이중-가닥 파괴를 만든다. Cas9와 대조적으로, NgAgo-gDNA 시스템은 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)를 필요로 하지 않는다. 뉴클레아제 불활성 NgAgo (dNgAgo)를 사용하는 것은 표적화될 수 있는 염기를 크게 확장시킬 수 있다. NgAgo의 특징화 및 용도는 문헌 [Gao et al., Nat. Biotechnol., 2016 Jul;34(7):768-73. PubMed PMID: 27136078; Swarts et al., Nature 507(7491) (2014):258-61; 및 Swarts et al., Nucleic Acids Res. 43(10) (2015):5120-9]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 나트로노박테리움 그레고리 아르고노트의 서열은 서열식별번호: 25에 제공된다.
일부 실시양태에서, napDNAbp는 아르고노트 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 자연 발생 아르고노트 단백질과 적어도 85% 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 자연 발생 아르고노트 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 서열식별번호: 25 중 어느 하나와 적어도 85% 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 서열식별번호: 25 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
야생형 나트로노박테리움 그레고리 아르고노트 (서열식별번호: 25)
Figure pct00037
일부 실시양태에서, napDNAbp는 아르고노트 단백질의 원핵 상동체이다. 아르고노트 단백질의 원핵 상동체는 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Makarova K., et al., "Prokaryotic homologs of Argonaute proteins are predicted to function as key components of a novel system of defense against mobile genetic elements", Biol. Direct. 2009 Aug 25;4:29. doi: 10.1186/1745-6150-4-29]에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 마리니토가 피에조필라(Marinitoga piezophila) 아르고노트 (MpAgo) 단백질이다. CRISPR-회합된 마리니토가 피에조필라 아르고노트 (MpAgo) 단백질은 5'-인산화된 가이드를 사용하여 단일-가닥 표적 서열을 절단한다. 5' 가이드는 모든 공지된 아르고노트에 의해 사용된다. MpAgo-RNA 복합체의 결정 구조는 5' 포스페이트 상호작용을 차단하는 잔기를 포함하는 가이드 가닥 결합 부위를 보여준다. 이러한 데이터는 5'-히드록실화된 가이드에 대한 비정규 특이성을 갖는 아르고노트 하위부류의 진화를 시사한다. 예를 들어, 문헌 [Kaya et al., "A bacterial Argonaute with noncanonical guide RNA specificity", Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Apr 12;113(15):4057-62]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 다른 아르고노트 단백질이, 예를 들어 데아미나제 (예를 들어, 시티딘 데아미나제)를 표적 핵산 (예를 들어, ssRNA)으로 가이드하기 위해, 본원에 기재된 융합 단백질 (예를 들어, 염기 편집제) 중 임의의 것에서 사용될 수 있다는 것이 인지되어야 한다.
일부 실시양태에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 미생물 CRISPR-Cas 시스템의 단일 이펙터이다. 미생물 CRISPR-Cas 시스템의 단일 이펙터는, 비제한적으로, Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, 및 C2c3을 포함한다. 전형적으로, 미생물 CRISPR-Cas 시스템은 부류 1 및 부류 2 시스템으로 나뉜다. 부류 1 시스템은 멀티서브유닛 이펙터 복합체를 갖는 반면에, 부류 2 시스템은 단일 단백질 이펙터를 갖는다. Cas9 및 Cpf1은 부류 2 이펙터이다. Cas9 및 Cpf1 이외에, 3종의 별개의 부류 2 CRISPR-Cas 시스템 (C2c1, C2c2, 및 C2c3)은 문헌 [Shmakov et al., "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems", Mol. Cell, 2015 Nov 5; 60(3): 385-397]에 기재되어 있으며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 상기 시스템 중 2종인 C2c1 및 C2c3의 이펙터는 Cpf1과 관련된 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 함유한다. 제3 시스템인 C2c2는 2개의 예측된 HEPN RNase 도메인을 갖는 이펙터를 함유한다. 성숙 CRISPR RNA의 생산은, C2c1에 의한 CRISPR RNA의 생산과 달리 tracrRNA-비의존성이다. C2c1은 DNA 절단을 위해 CRISPR RNA 및 tracrRNA 둘 다에 의존한다. 박테리아 C2c2는 그의 RNA-활성화된 단일-가닥 RNA 분해 활성과 구분되는, CRISPR RNA 성숙을 위한 고유한 RNase 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 이들 RNase 기능은 서로 상이하고, Cpf1의 CRISPR RNA-프로세싱 거동과 상이하다. 예를 들어, 문헌 [East-Seletsky, et al., "Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection", Nature, 2016 Oct 13;538(7624):270-273]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 렙토트리키아 샤히이(Leptotrichia shahii)의 C2c2의 시험관내 생화학적 분석은 C2c2가 단일 CRISPR RNA에 의해 가이드되고 상보적 프로토스페이서를 보유하는 ssRNA 표적을 절단하도록 프로그램화될 수 있다는 것을 밝혀냈다. 2개의 보존된 HEPN 도메인 내의 촉매 잔기는 절단을 매개한다. 촉매 잔기 내의 돌연변이는 촉매 불활성 RNA-결합 단백질을 생성한다. 예를 들어, 문헌 [Abudayyeh et al., "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector," Science, 2016 Aug 5; 353(6299)]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
알리시클로바실루스 아시도테레스트리스(Alicyclobaccillus acidoterrastris) C2c1 (AacC2c1)의 결정 구조는 키메라 단일-분자 가이드 RNA (sgRNA)와의 복합체로 보고되었다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌 [Liu et al., "C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism", Mol. Cell, 2017 Jan 19;65(2):310-322]을 참조한다. 또한 3원 복합체로서 표적 DNA에 결합된 알리시클로바실루스 아시도테레스트리스 C2c1에 대한 결정 구조가 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Yang et al., "PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease", Cell, 2016 Dec 15;167(7):1814-1828]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. AacC2c1의 촉매 적격 입체형태는 표적 및 비-표적 DNA 가닥 둘 다와 함께, 단일 RuvC 촉매 포켓 내에 독립적으로 위치된 채로 포획되었고, 이때 C2c1-매개 절단은 표적 DNA의 엇갈린 7개-뉴클레오티드 파괴를 일으켰다. C2c1 3원 복합체와 이전에 확인된 Cas9 및 Cpf1 대응부 사이의 구조적 비교는 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 사용된 메카니즘의 다양성을 입증한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것의 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 C2c1, C2c2 또는 C2c3 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 C2c1 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 C2c2 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 C2c3 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 자연 발생 C2c1, C2c2 또는 C2c3 단백질과 적어도 85% 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 자연 발생 C2c1, C2c2 또는 C2c3 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 서열식별번호: 26-28 중 어느 하나와 적어도 85% 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 서열식별번호: 26-28 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 박테리아 종으로부터의 C2c1, C2c2, 또는 C2c3이 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다는 것이 인지되어야 한다.
C2c1 (uniprot.org/uniprot/T0D7A2#)
sp|T0D7A2|C2C1_ALIAG CRISPR-회합된 엔도뉴클레아제 C2c1 OS=알리시클로바실루스 아시도테레스트리스 (균주 ATCC 49025 / DSM 3922 / CIP 106132 / NCIMB 13137 / GD3B) GN=c2c1 PE=1 SV=1
Figure pct00038
C2c2 (uniprot.org/uniprot/P0DOC6)
>sp|P0DOC6|C2C2_LEPSD CRISPR-회합된 엔도뉴클레아제 C2c2 OS=렙토트리키아 샤히이 (균주 DSM 19757 / CCUG 47503 / CIP 107916 / JCM 16776 / LB37) GN=c2c2 PE=1 SV=1
Figure pct00039
C2c3, >CEPX01008730.1 해양 메타게놈 게놈 어셈블리 TARA_037_MES_0.1-0.22, 콘티그 TARA_037_MES_0.1-0.22_스캐폴드22115_1, 전체 게놈 샷건 서열로부터 번역됨.
Figure pct00040
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것의 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 단세포 원핵 미생물의 역 및 계를 구성하는 고세균 (예를 들어 나노고세균)으로부터의 Cas9이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 예를 들어 본원에 참조로 포함된 문헌 [Burstein et al., "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes." Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21]에 기재되어 있는 CasX 또는 CasY이다. 게놈-분해 메타게놈학을 사용하여, 생명체의 고세균 역에서 최초 보고된 Cas9를 포함한, 수많은 CRISPR-Cas 시스템이 확인되었다. 이러한 분기 Cas9 단백질은 나노고세균에서 활성 CRISPR-Cas 시스템의 일부로서 발견되었다. 박테리아에서, 2종의 이전에 공지되지 않은 시스템인 CRISPR-CasX 및 CRISPR-CasY가 발견되었으며, 이는 이제껏 발견된 시스템 중 가장 소형이다. 일부 실시양태에서, Cas9는 CasX 또는 CasX의 변이체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, Cas9는 CasY 또는 CasY의 변이체를 지칭한다. 다른 RNA-가이드 DNA 결합 단백질은 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)로서 사용될 수 있고 본 개시내용의 범주 내에 있다는 것이 인지되어야 한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것의 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 CasX 또는 CasY 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 CasX 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 CasY 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 자연 발생 CasX 또는 CasY 단백질과 적어도 85% 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 자연 발생 CasX 또는 CasY 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 서열식별번호: 29-31 중 어느 하나와 적어도 85% 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 서열식별번호: 29-31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 박테리아 종으로부터의 CasX 및 CasY가 또한 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다는 것이 인지되어야 한다.
CasX (uniprot.org/uniprot/F0NN87; uniprot.org/uniprot/F0NH53)
>tr|F0NN87|F0NN87_SULIH CRISPR-회합된 Casx 단백질 OS=술폴로부스 이슬란디쿠스 (균주 HVE10/4) GN=SiH_0402 PE=4 SV=1
Figure pct00041
>tr|F0NH53|F0NH53_SULIR CRISPR 회합된 단백질, Casx OS=술폴로부스 이슬란디쿠스 (균주 REY15A) GN=SiRe_0771 PE=4 SV=1
Figure pct00042
CasY (ncbi.nlm.nih.gov/protein/APG80656.1)
>APG80656.1 CRISPR-회합된 단백질 CasY [배양되지 않은 파르쿠박테리아 군 박테리아]
Figure pct00043
핵염기 편집제의 Cas9 도메인
비제한적, 예시적인 Cas9 도메인이 본원에 제공된다. Cas9 도메인은 뉴클레아제 활성 Cas9 도메인, 뉴클레아제 불활성 Cas9 도메인, 또는 Cas9 니카제일 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 뉴클레아제 활성 도메인이다. 예를 들어, Cas9 도메인은 듀플렉싱된 핵산의 양쪽 가닥 (예를 들어, 듀플렉싱된 DNA 분자의 양쪽 가닥)을 절단하는 Cas9 도메인일 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서 Cas9 도메인은 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 60% 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개, 또는 그 초과의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나와 비교하여 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000, 적어도 1100, 또는 적어도 1200개의 동일한 인접 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인 (dCas9)이다. 예를 들어, dCas9 도메인은 듀플렉싱된 핵산 분자의 어느 하나의 가닥을 절단하지 않고 듀플렉싱된 핵산 분자에 (예를 들어, gRNA 분자를 통해) 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제-불활성 dCas9 도메인은 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열의 D10X 돌연변이 및 H840X 돌연변이, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산 변화이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제-불활성 dCas9 도메인은 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열의 D10A 돌연변이 및 H840A 돌연변이, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 한 예로서, 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인은 서열식별번호: 32에 제시된 아미노산 서열을 포함한다 (클로닝 벡터 pPlatTET-gRNA2, 수탁 번호 BAV54124).
Figure pct00044
추가의 적합한 뉴클레아제-불활성 dCas9 도메인은 본 개시내용 및 관련 기술분야의 지식에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 이는 본 개시내용의 범주 내에 있다. 이러한 추가의 예시적인 적합한 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인은 D10A/H840A, D10A/D839A/H840A 및 D10A/D839A/H840A/N863A 돌연변이체 도메인을 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Prashant et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening 및 paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838] 참조). 일부 실시양태에서 dCas9 도메인은 본원에 제공된 dCas9 도메인 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 또는 그 초과의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나와 비교하여 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, at leat 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000, 적어도 1100, 또는 적어도 1200개의 동일한 인접 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 Cas9 니카제이다. Cas9 니카제는 듀플렉싱된 핵산 분자 (예를 들어, 듀플렉싱된 DNA 분자)의 단지 1개의 가닥만을 절단할 수 있는 Cas9 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 니카제는 듀플렉스 핵산 분자의 표적 가닥을 절단하며, 이는 Cas9 니카제가 Cas9에 결합된 gRNA (예를 들어, sgRNA)에 염기 쌍형성된 (그에 상보적인) 가닥을 절단한다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, Cas9 니카제는 D10A 돌연변이를 포함하며, 서열식별번호: 6의 위치 840에 히스티딘, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, Cas9 니카제는 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 니카제는 듀플렉스 핵산 분자의 비-표적, 비-염기-편집된 가닥을 절단하며, 이는 Cas9 니카제가 Cas9에 결합된 gRNA (예를 들어, sgRNA)에 염기 쌍형성되지 않은 가닥을 절단한다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, Cas9 니카제는 H840A 돌연변이를 포함하며, 서열식별번호: 6의 위치 10에 아스파르트산 잔기, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 갖는다. 일부 실시양태에서, Cas9 니카제는 본원에 제공된 Cas9 니카제 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 적합한 Cas9 니카제는 본 개시내용 및 관련 기술분야의 지식에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 본 개시내용의 범위 내에 있다.
감소된 PAM 배타성을 갖는 Cas9 도메인
본 개시내용의 일부 측면은 상이한 PAM 특이성을 갖는 Cas9 도메인을 제공한다. 전형적으로, Cas9 단백질, 예컨대 에스. 피오게네스로부터의 Cas9 (spCas9)는 특정한 핵산 영역에 결합하는 정규 NGG PAM 서열을 요구한다. 이는 게놈 내에서 목적하는 염기를 편집하는 능력을 제한할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 편집 융합 단백질은 예를 들어 표적 염기가 PAM의 대략 15 염기 상류인 4개의 염기 영역 (예를 들어, "탈아미노화 윈도우") 내에 놓이는 정확한 위치에 놓일 필요가 있을 수 있다. 문헌 [Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016)]을 참조하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 정규 (예를 들어, NGG) PAM 서열을 함유하지 않는 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 Cas9 도메인을 함유할 수 있다. 비-정규 PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 관련 기술분야에 기재되어 있으며, 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 비-정규 PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 문헌 [Kleinstiver, B. P., et al., "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities" Nature 523, 481-485 (2015); 및 Kleinstiver, B. P., et al., "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition" Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)]에 기재되어 있으며; 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 스타필로코쿠스 아우레우스로부터의 Cas9 도메인 (SaCas9)이다. 일부 실시양태에서, SaCas9 도메인은 뉴클레아제 활성 SaCas9, 뉴클레아제 불활성 SaCas9 (SaCas9d), 또는 SaCas9 니카제 (SaCas9n)이다. 일부 실시양태에서, SaCas9는 아미노산 서열 서열식별번호: 33을 포함한다. 일부 실시양태에서, SaCas9는 서열식별번호: 33의 N579X 돌연변이, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 N을 제외한 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, SaCas9는 서열식별번호: 33의 N579A 돌연변이, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, SaCas9 도메인, SaCas9d 도메인, 또는 SaCas9n 도메인은 비-정규 PAM을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, SaCas9 도메인, SaCas9d 도메인, 또는 SaCas9n 도메인은 NNGRRT PAM 서열을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, SaCas9 도메인은 서열식별번호: 33의 E781X, N967X, 및 R1014X 돌연변이 중 1개 이상, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, SaCas9 도메인은 서열식별번호: 33의 E781K, N967K, 및 R1014H 돌연변이 중 1개 이상, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, SaCas9 도메인은 서열식별번호: 33의 E781K, N967K, 또는 R1014H 돌연변이, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것의 Cas9 도메인은 서열식별번호: 33-36 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것의 Cas9 도메인은 서열식별번호: 33-36 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것의 Cas9 도메인은 서열식별번호: 33-36 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다.
예시적인 SaCas9 서열
Figure pct00045
밑줄표시되어 있고, 볼드체인 서열식별번호: 33의 잔기 N579는 돌연변이되어 (예를 들어, A579로) SaCas9 니카제를 생성할 수 있다.
예시적인 SaCas9d 서열
Figure pct00046
밑줄표시되어 있고, 볼드체인 서열식별번호: 34의 잔기 D10은 돌연변이되어 (예를 들어, A10으로) 뉴클레아제 불활성 SaCas9d를 생성할 수 있다.
예시적인 SaCas9n 서열
Figure pct00047
Figure pct00048
서열식별번호: 33의 N579로부터 돌연변이되어 SaCas9 니카제를 생성할 수 있는 서열식별번호: 35의 잔기 A579는 밑줄표시되어 있고, 볼드체이다.
예시적인 SaKKH Cas9
Figure pct00049
서열식별번호: 36의 N579로부터 돌연변이되어 SaCas9 니카제를 생성할 수 있는 서열식별번호: 36의 잔기 A579는 밑줄표시되어 있고, 볼드체이다. 서열식별번호: 36의 E781, N967, 및 R1014로부터 돌연변이되어 SaKKH Cas9를 생성할 수 있는 서열식별번호: 36의 잔기 K781, K967, 및 H1014는 밑줄표시되어 있고, 이탤릭체이다.
일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9 도메인 (SpCas9)이다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 뉴클레아제 활성 SpCas9, 뉴클레아제 불활성 SpCas9 (SpCas9d), 또는 SpCas9 니카제 (SpCas9n)이다. 일부 실시양태에서, SpCas9는 아미노산 서열 서열식별번호: 37을 포함한다. 일부 실시양태에서, SpCas9는 서열식별번호: 37의 D9X 돌연변이, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 D를 제외한 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, SpCas9는 서열식별번호: 37의 D9A 돌연변이, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인, SpCas9d 도메인, 또는 SpCas9n 도메인은 비-정규 PAM을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인, SpCas9d 도메인, 또는 SpCas9n 도메인은 NGG, NGA, 또는 NGCG PAM 서열을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 서열식별번호: 37의 D1134X, R1334X, 및 T1336X 돌연변이 중 1개 이상, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 서열식별번호: 37의 D1134E, R1334Q, 및 T1336R 돌연변이 중 1개 이상, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 서열식별번호: 37의 D1134E, R1334Q, 및 T1336R 돌연변이, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 서열식별번호: 37의 D1134X, R1334X, 및 T1336X 돌연변이 중 1개 이상, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 서열식별번호: 37의 D1134V, R1334Q, 및 T1336R 돌연변이 중 1개 이상, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 서열식별번호: 37의 D1134V, R1334Q, 및 T1336R 돌연변이, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 서열식별번호: 37의 D1134X, G1217X, R1334X, 및 T1336X 돌연변이 중 1개 이상, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 서열식별번호: 37의 D1134V, G1217R, R1334Q, 및 T1336R 돌연변이 중 1개 이상, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 서열식별번호: 37의 D1134V, G1217R, R1334Q, 및 T1336R 돌연변이, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것의 Cas9 도메인은 서열식별번호: 37-41 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것의 Cas9 도메인은 서열식별번호: 37-41 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것의 Cas9 도메인은 서열식별번호: 37-41 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다.
예시적인 SpCas9
Figure pct00050
Figure pct00051
예시적인 SpCas9n
Figure pct00052
예시적인 SpEQR Cas9
Figure pct00053
서열식별번호: 39의 D1134, R1334, 및 T1336로부터 돌연변이되어 SpEQR Cas9를 생성할 수 있는 서열식별번호: 39의 잔기 E1134, Q1334, 및 R1336은 밑줄표시되어 있고, 볼드체이다.
예시적인 SpVQR Cas9
Figure pct00054
서열식별번호: 40의 D1134, R1334, 및 T1336으로부터 돌연변이되어 SpVQR Cas9를 생성할 수 있는 서열식별번호: 40의 잔기 V1134, Q1334, 및 R1336은 밑줄표시되어 있고, 볼드체이다.
예시적인 SpVRER Cas9
Figure pct00055
Figure pct00056
서열식별번호: 41의 D1134, G1217, R1334, 및 T1336으로부터 돌연변이되어 SpVRER Cas9를 생성할 수 있는 서열식별번호: 41의 잔기 V1134, R1217, Q1334, 및 R1336은 밑줄표시되어 있고, 볼드체이다.
하기는 비-정규 (예를 들어, 비-NGG) PAM 서열을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있는 예시적인 융합 단백질 (예를 들어, 염기 편집 단백질)이다:
예시적인 SaBE3 (rAPOBEC1-XTEN-SaCas9n-UGI-NLS)
Figure pct00057
Figure pct00058
예시적인 SaKKH-BE3 (rAPOBEC1-XTEN-SaCas9n-UGI-NLS)
Figure pct00059
예시적인 EQR-BE3 (rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS)
Figure pct00060
Figure pct00061
VQR-BE3 (rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS)
Figure pct00062
VRER-BE3 (rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS)
Figure pct00063
고 충실도 염기 편집제
본 개시내용의 일부 측면은 고 충실도를 갖는 Cas9 도메인을 포함하는 Cas9 융합 단백질 (예를 들어, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것)을 제공한다. 본 개시내용의 추가의 측면은 야생형 Cas9 도메인과 비교하여 Cas9 도메인 및 DNA의 당-포스페이트 백본 사이의 감소된 정전기적 상호작용을 갖는 Cas9 도메인을 포함하는 Cas9 융합 단백질 (예를 들어, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것)을 제공한다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인 (예를 들어, 야생형 Cas9 도메인)은 Cas9 도메인 및 DNA의 당-포스페이트 백본 사이의 회합을 감소시키는 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 Cas9 융합 단백질 중 임의의 것은 서열식별번호: 6에 제공된 아미노산 서열의 N497X, R661X, Q695X, 및/또는 Q926X 돌연변이 중 1개 이상, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 Cas9 융합 단백질 중 임의의 것은 서열식별번호: 6에 제공된 아미노산 서열의 N497A, R661A, Q695A, 및/또는 Q926A 돌연변이 중 1개 이상, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 서열식별번호: 6에 제공된 아미노산 서열의 D10A 돌연변이, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것의) Cas9 도메인은 서열식별번호: 47에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 48에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 고 충실도를 갖는 Cas9 도메인은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 고 충실도를 갖는 Cas9 도메인은 문헌 [Kleinstiver, B.P., et al. "High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects." Nature 529, 490-495 (2016); 및 Slaymaker, I.M., et al. "Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity." Science 351, 84-88 (2015)]에 기재되어 있으며; 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원에 제공된 염기 편집제, 예를 들어 염기 편집제 2 (BE2) 또는 염기 편집제 3 (BE3)은 본원에 기재된 바와 같은 Cas9 도메인을 변형시켜 고 충실도 염기 편집제, 예를 들어 고 충실도 염기 편집제 2 (HF-BE2) 또는 고 충실도 염기 편집제 3 (HF-BE3)을 생성함으로써 고 충실도 염기 편집제로 전환될 수 있다는 것이 인지되어야 한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제 2 (BE2)는 데아미나제 도메인, dCas9, 및 UGI 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제 3 (BE3)은 데아미나제 도메인, nCas9 도메인 및 UGI 도메인을 포함한다.
서열식별번호: 6의 Cas9에 대한 돌연변이가 볼드체 및 밑줄표시되어 있는 Cas9 도메인
Figure pct00064
Figure pct00065
HF-BE3
Figure pct00066
Cas9 융합 단백질
본원에 개시된 Cas9 도메인 (예를 들어, 뉴클레아제 활성 Cas9 단백질, 뉴클레아제-불활성 dCas9 단백질, 또는 Cas9 니카제 단백질) 중 임의의 것은 제2 단백질에 융합될 수 있으며, 따라서 본원에 제공된 융합 단백질은 본원에 제공된 Cas9 도메인 및 제2 단백질, 또는 "융합 파트너"를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질은 Cas9 도메인의 N-말단에 융합된다. 그러나, 다른 실시양태에서, 제2 단백질은 Cas9 도메인의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인에 융합되는 제2 단백질은 핵산 편집 도메인이다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인 및 핵산 편집 도메인은 링커를 통해 융합되는 반면, 다른 실시양태에서, Cas9 도메인 및 핵산 편집 도메인은 서로에게 직접적으로 융합된다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인 및 핵산 편집 도메인은 임의의 길이 또는 조성의 링커를 통해 융합된다. 예를 들어, 링커는 임의의 길이 및 조성의 결합, 1개 이상의 아미노산, 펩티드, 또는 중합체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 (GGGS)n (서열식별번호: 613), (GGGGS)n (서열식별번호: 607), (G)n (서열식별번호: 608), (EAAAK)n (서열식별번호: 609), (GGS)n (서열식별번호: 610), (SGGS)n (서열식별번호: 606), SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604), SGGS(GGS)n (서열식별번호: 612), SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 605), 또는 (XP)n (서열식별번호: 611) 모티프, 또는 이들 중 임의의 것의 조합을 포함하며, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 30의 정수이고, X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 링커는 (GGS)n 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1, 3, 또는 7이다. 일부 실시양태에서, 링커는 (GGS)n (서열식별번호: 610) 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGS(GGS)n (서열식별번호: 612)을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGS(GGS)n (서열식별번호: 612)을 포함하며, 여기서 n은 2이다. 일부 실시양태에서, 링커는 SGSETPGTSESATPES의 아미노산 서열 (서열식별번호: 604) (실시예에서 XTEN 링커로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 605) (실시예에서 32개 아미노산 링커로도 지칭됨)를 포함한다. 링커의 길이는 실시예에 예시된 바와 같이 편집되는 염기에 영항을 미칠 수 있다. 예를 들어, 3-아미노산 길이의 링커 (예를 들어, (GGS)1)는 PAM 서열에 대해 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 4개 염기 편집 윈도우를 줄 수 있는 반면, 9-아미노산 링커 (예를 들어, (GGS)3 (서열식별번호: 610))는 PAM 서열에 대해 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 6, 4 내지 5, 5 내지 6개 염기 편집 윈도우를 줄 수 있다. 16-아미노산 링커 (예를 들어, XTEN 링커)는 예외적으로 강한 활성으로 PAM 서열에 대해 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 7, 4 내지 6, 4 내지 5, 5 내지 7, 5 내지 6, 6 내지 7개 염기 윈도우를 줄 수 있으며, 21-아미노산 링커 (예를 들어, (GGS)7 (서열식별번호: 610))는 PAM 서열에 대해 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 4 내지 5, 5 내지 8, 5 내지 7, 5 내지 6, 6 내지 8, 6 내지 7, 7 내지 8개 염기 편집 윈도우를 줄 수 있다. 링커 길이를 다양화하는 것은 본 개시내용의 dCas9 융합 단백질이 PAM 서열과 상이한 거리의 핵염기를 편집하는 것을 허용한다는 신규한 발견은, PAM 서열이 유전자에서 교정되는 질환-유발 돌연변이에 대한 거리를 다양화하는 것일 수 있기 때문에 상당한 임상적 중요성을 부여한다. 여기서 실시예에 기재된 바와 같은 링커 길이는 제한적인 것을 의미하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
일부 실시양태에서, 제2 단백질은 효소 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 효소 도메인은 핵산 편집 도메인이다. 이러한 핵산 편집 도메인은 비제한적으로 뉴클레아제, 니카제, 레콤비나제, 데아미나제, 메틸트랜스퍼라제, 메틸라제, 아세틸라제, 또는 아세틸트랜스퍼라제일 수 있다. 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 비제한적 예시적인 결합 도메인은 전사 활성인자 도메인 및 전사 리프레서 도메인을 포함한다.
데아미나제 도메인
일부 실시양태에서, 제2 단백질은 핵산 편집 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 편집 도메인은 C에서 U로의 염기 변화를 촉매할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 편집 도메인은 데아미나제 도메인이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 시티딘 데아미나제 또는 시티딘 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 패밀리 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC1 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC2 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3A 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3B 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3C 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3D 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3E 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3F 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3G 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3H 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC4 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 활성화-유도된 데아미나제 (AID)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 척추동물 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 무척추동물 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이, 소, 개, 래트, 또는 마우스 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 래트 데아미나제, 예를 들어, rAPOBEC1이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 활성화-유도된 시티딘 데아미나제 (AID)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 시티딘 데아미나제 1 (CDA1)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 페트로미존 마리누스 (Petromyzon marinus) 시티딘 데아미나제 1 (pmCDA1)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간 APOBEC3G (서열식별번호: 60)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간 APOBEC3G의 단편 (서열식별번호: 83)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 D316R_D317R 돌연변이를 포함하는 인간 APOBEC3G 변이체 (서열식별번호: 82)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간 APOBEC3G 및 서열식별번호: 60에서의 D316R_D317R 돌연변이에 상응하는 돌연변이를 포함하는 단편 (서열식별번호: 84)이다.
일부 실시양태에서, 핵산 편집 도메인은 서열식별번호: 49-84 중 어느 하나의 데아미나제 도메인과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하다. 일부 실시양태에서, 핵산 편집 도메인은 서열식별번호: 49-84 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
염기 편집제의 편집 윈도우를 조정하는 데아미나제 도메인
본 개시내용의 일부 측면은 예를 들어 데아미나제 도메인에서의 점 돌연변이를 생성함으로써 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것의 데아미나제 도메인 촉매 활성을 조정하는 것이 융합 단백질 (예를 들어, 염기 편집제)의 프로세싱성에 영향을 미친다는 인식에 기초한다. 예를 들어, 염기 편집 융합 단백질 내의 데아미나제 도메인의 촉매 활성을 감소시키지만 제거하지는 않는 돌연변이는 데아미나제 도메인이 표적 잔기에 인접한 잔기의 탈아미노화를 촉매함으로써, 탈아미노화 윈도우를 좁힐 가능성을 적게 할 수 있다. 탈아미노화 윈도우를 좁히는 능력은 특이적 표적 잔기의 인접한 잔기의 원치 않는 탈아미노화를 방지할 수 있으며, 이는 오프-타겟 효과를 감소시키거나 방지할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 촉매 데아미나제 활성을 감소시킨 데아미나제 도메인 (예를 들어, 시티딘 데아미나제 도메인)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 적절한 대조군과 비교하여 촉매 데아미나제 활성을 감소시킨 데아미나제 도메인 (예를 들어, 시티딘 데아미나제 도메인)을 포함한다. 예를 들어, 적절한 대조군은 1개 이상의 돌연변이를 데아미나제 내로 도입하기 전의 데아미나제의 데아미나제 활성일 수 있다. 다른 실시양태에서, 적절한 대조군은 야생형 데아미나제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적절한 대조군은 야생형 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 패밀리 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 적절한 대조군은 APOBEC1 데아미나제, APOBEC2 데아미나제, APOBEC3A 데아미나제, APOBEC3B 데아미나제, APOBEC3C 데아미나제, APOBEC3D 데아미나제, APOBEC3F 데아미나제, APOBEC3G 데아미나제, 또는 APOBEC3H 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 적절한 대조군은 활성화 유도된 데아미나제 (AID)이다. 일부 실시양태에서, 적절한 대조군은 페트로미존 마리누스로부터의 시티딘 데아미나제 1 (pmCDA1)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 도메인은 적절한 대조군과 비교하여 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 더 적은 촉매 데아미나제 활성을 갖는 데아미나제 도메인일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 rAPOBEC1 (서열식별번호: 76)의 H121X, H122X, R126X, R126X, R118X, W90X, W90X, 및 R132X로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 rAPOBEC1 (서열식별번호: 76)의 H121R, H122R, R126A, R126E, R118A, W90A, W90Y, 및 R132E로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 hAPOBEC3G (서열식별번호: 60)의 D316X, D317X, R320X, R320X, R313X, W285X, W285X, R326X로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 hAPOBEC3G (서열식별번호: 60)의 D316R, D317R, R320A, R320E, R313A, W285A, W285Y, R326E로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 rAPOBEC1 (서열식별번호: 76)의 H121R 및 H122R돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 rAPOBEC1 (서열식별번호: 76)의 R126A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 rAPOBEC1 (서열식별번호: 76)의 R126E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 rAPOBEC1 (서열식별번호: 76)의 R118A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 rAPOBEC1 (서열식별번호: 76)의 W90A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 rAPOBEC1 (서열식별번호: 76)의 W90Y 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 rAPOBEC1 (서열식별번호: 76)의 R132E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 rAPOBEC1 (서열식별번호: 76)의 W90Y 및 R126E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 rAPOBEC1 (서열식별번호: 76)의 R126E 및 R132E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 rAPOBEC1 (서열식별번호: 76)의 W90Y 및 R132E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 rAPOBEC1 (서열식별번호: 76)의 W90Y, R126E, 및 R132E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 hAPOBEC3G (서열식별번호: 60)의 D316R 및 D317R 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 hAPOBEC3G (서열식별번호: 60)의 R320A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 hAPOBEC3G (서열식별번호: 60)의 R320E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 hAPOBEC3G (서열식별번호: 60)의 R313A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 hAPOBEC3G (서열식별번호: 60)의 W285A 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 hAPOBEC3G (서열식별번호: 60)의 W285Y 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 hAPOBEC3G (서열식별번호: 60)의 R326E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 hAPOBEC3G (서열식별번호: 60)의 W285Y 및 R320E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 hAPOBEC3G (서열식별번호: 60)의 R320E 및 R326E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 hAPOBEC3G (서열식별번호: 60)의 W285Y 및 R326E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 hAPOBEC3G (서열식별번호: 60)의 W285Y, R320E, 및 R326E 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 APOBEC 데아미나제를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 (i) 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인; 및 (ii) 핵산 편집 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인 (dCas9)은 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, Cas9의 뉴클레아제 활성을 불활성화시키는 돌연변이를 포함한다. Cas9의 뉴클레아제 도메인을 불활성이 되게 하는 돌연변이는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Cas9의 DNA 절단 도메인은 2가지 서브도메인, 즉, HNH 뉴클레아제 서브도메인 및 RuvC1 서브도메인을 포함하는 것으로 공지되어 있다. HNH 서브도메인은 gRNA에 상보적인 가닥을 절단하는 반면, RuvC1 서브도메인은 비-상보적 가닥을 절단한다. 이들 서브도메인 내의 돌연변이는 Cas9의 뉴클레아제 활성을 침묵시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 D10A 및 H840A는 에스. 피오게네스 Cas9의 뉴클레아제 활성을 완전히 불활성화시킨다 (Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28;152(5):1173-83 (2013)). 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 dCas9는 서열식별번호: 6에 제공된 아미노산 서열의 D10A 돌연변이, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 dCas9는 서열식별번호: 6에 제공된 아미노산 서열의 H840A 돌연변이, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 dCas9는 서열식별번호: 6에 제공된 아미노산 서열의 D10A 및 H840A 돌연변이 둘 다, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9는 서열식별번호: 6에 제공된 아미노산 서열의 위치 840에 히스티딘 잔기, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 추가로 포함한다. 촉매 잔기 H840의 존재는 Cas9의 활성을 복원하여 표적화된 C에 대향하는 G를 함유하는 비-편집된 가닥을 절단한다. H840의 복원은 C를 함유하는 표적 가닥의 절단을 발생시키지 않는다. 일부 실시양태에서, dCas9는 서열식별번호: 32의 아미노산 서열을 포함한다. Cas9의 뉴클레아제 도메인을 불활성화시키는 다른 돌연변이는 또한 본 개시내용의 dCas9에 포함될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본원에 개시된 돌연변이를 포함하는 Cas9 또는 dCas9 도메인은 전장 Cas9, 또는 그의 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9, 또는 그의 단편을 포함하는 단백질은 "Cas9 변이체"로 지칭된다. Cas9 변이체는 Cas9, 또는 그의 단편과 상동성을 공유한다. 예를 들어 Cas9 변이체는 야생형 Cas9와 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 단편이 야생형 Cas9, 예를 들어, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 Cas9의 상응하는 단편과 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 적어도 약 99.9% 동일하도록 Cas9의 단편 (예를 들어, gRNA 결합 도메인 또는 DNA-절단 도메인)을 포함한다.
본 개시내용의 Cas9 융합 단백질 중 임의의 것은 핵산 편집 도메인 (예를 들어, 핵산을 변형시킬 수 있는 효소, 예컨대 데아미나제)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 편집 도메인은 DNA-편집 도메인이다. 일부 실시양태에서, 핵산 편집 도메인은 데아미나제 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 편집 도메인은 데아미나제 또는 데아미나제 도메인을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 시티딘 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 패밀리 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC1 패밀리 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 활성화-유도된 시티딘 데아미나제 (AID)이다. 일부 핵산 편집 도메인 뿐만 아니라 이러한 도메인을 포함하는 Cas9 융합 단백질은 본원에 상세히 기재되어 있다. 추가의 적합한 핵산 편집 도메인은 본 개시내용 및 관련 기술분야의 지식에 기초하여 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
본 개시내용의 일부 측면은 핵산 편집 도메인에 융합된 Cas9 도메인을 포함하며, 핵산 편집 도메인이 Cas9 도메인의 N-말단에 융합된 것인 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인 및 핵산 편집-편집 도메인은 링커를 통해 융합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 (GGGS)n (서열식별번호: 613), (GGGGS)n (서열식별번호: 607), (G)n (서열식별번호: 608), (EAAAK)n (서열식별번호: 609), (GGS)n (서열식별번호: 610), (SGGS)n (서열식별번호: 606), SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604) 모티프 (예를 들어, 문헌 [Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82] 참조; 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨), 또는 (XP)n (서열식별번호: 611) 모티프, 또는 이들 중 임의의 것의 조합을 포함하며, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 30의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30이거나, 1개 초과의 링커 또는 1개 초과의 링커 모티프가 존재하는 경우, 그의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 링커는 (GGS)n (서열식별번호: 610) 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이다. 일부 실시양태에서, 링커는 (GGS)n (서열식별번호: 610) 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1, 3, 또는 7이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604)를 포함한다. 추가의 적합한 링커 모티프 및 링커 배위는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 적합한 링커 모티프 및 배위는 문헌 [Chen et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 2013; 65(10):1357-69]에 기재된 것들을 포함하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 추가의 적합한 링커 서열은 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 예시적인 Cas9 융합 단백질의 일반적 아키텍처는 구조:
[NH2]-[핵산 편집 도메인]-[Cas9]-[COOH] 또는
[NH2]-[핵산 편집 도메인]-[링커]-[Cas9]-[COOH]
를 포함하며, 여기서 NH2는 융합 단백질의 N-말단이고, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다.
본 개시내용의 융합 단백질은 하나 이상의 추가의 특색을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 핵 국재화 서열 (NLS)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 NLS는 핵산 편집 도메인 및 Cas9 도메인 사이에 국재화된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 NLS는 Cas9 도메인의 C-말단에 국재화된다.
존재할 수 있는 다른 예시적인 특색은 국재화 서열, 예컨대 세포질 국재화 서열, 방출 서열, 예컨대 핵 방출 서열, 또는 다른 국재화 서열, 뿐만 아니라 융합 단백질의 가용화, 정제, 또는 검출에 유용한 서열 태그이다. 본원에 제공된 적합한 단백질 태그는 비오틴 카르복실라제 운반체 단백질 (BCCP) 태그, myc-태그, 칼모둘린-태그, FLAG-태그, 헤마글루티닌 (HA)-태그, 히스티딘 태그 또는 His-태그로도 지칭되는 폴리히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질 (MBP)-태그, nus-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)-태그, 녹색 형광 단백질 (GFP)-태그, 티오레독신-태그, S-태그, 소프태그 (예를 들어, 소프태그 1, 소프태그 3), 스트렙-태그, 비오틴 리가제 태그, FlAsH 태그, V5 태그, 및 SBP-태그를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가의 적합한 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 1개 이상의 His 태그를 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 편집 도메인은 데아미나제이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 데아미나제 도메인을 갖는 예시적인 Cas9 융합 단백질의 일반적 아키텍처는 구조:
[NH2]-[NLS]-[데아미나제]-[Cas9]-[COOH],
[NH2]-[Cas9]-[데아미나제]-[COOH],
[NH2]-[데아미나제]-[Cas9]-[COOH], 또는
[NH2]-[데아미나제]-[Cas9]-[NLS]-[COOH]
를 포함하며; 여기서 NLS는 핵 국재화 서열이고, NH2는 융합 단백질의 N-말단이고, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다. 핵 국재화 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, NLS 서열은 플랭크(Plank) 등, PCT/EP2000/011690에 기재되어 있으며, 그의 내용은 예시적인 핵 국재화 서열의 그의 개시내용에 대해 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, NLS는 아미노산 서열 PKKKRKV (서열식별번호: 614) 또는 MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC (서열식별번호: 615)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 Cas9 및 데아미나제 사이에 삽입된다. 일부 실시양태에서, NLS는 Cas9 도메인의 C-말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, NLS는 Cas9 도메인의 N-말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, NLS는 데아미나제 및 Cas9 도메인 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, NLS는 데아미나제 도메인의 N-말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, NLS는 데아미나제 도메인의 C-말단에 위치한다.
핵산 편집 도메인의 한 예시적인 적합한 유형은 예를 들어, APOBEC 패밀리의 시티딘 데아미나제이다. 시티딘 데아미나제 효소의 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 패밀리는 제어되고 유익한 방식으로 돌연변이유발을 개시하는 기능을 하는 11개의 단백질을 포괄한다.29 한 패밀리 구성원인 활성화-유도된 시티딘 데아미나제 (AID)는 ssDNA에서의 시토신을 전사-의존성, 가닥-편형된 방식으로 우라실로 전환시킴으로써 항체의 성숙을 담당한다.30 아포지단백질 B 편집 복합체 3 (APOBEC3) 효소는 역전사된 바이러스 ssDNA에서의 시토신의 탈아미노화를 통해 특정 HIV-1 균주에 대해 인간 세포에 보호를 제공한다.31 이들 단백질 모두는 촉매 활성을 위해 Zn2+-배위 모티프 (His-X-Glu-X23-26-Pro-Cys-X2-4-Cys; 서열식별번호: 616) 및 결합된 물 분자를 요구한다. Glu 잔기는 탈아미노화 반응에서 친핵성 공격을 위해 물 분자를 수산화아연으로 활성화시키는 작용을 한다. 각각의 패밀리 구성원은 그 자신의 특정 "핫스팟"에서 우선적으로 탈아미노화하며, 이는 hAID에 대해 WRC (W는 A 또는 T이고, R은 A 또는 G임), 내지 hAPOBEC3F에 대해 TTC의 범위이다.32 APOBEC3G의 촉매 도메인의 최근의 결정 구조는 6개의 α-나선에 의해 플랭킹된 5-가닥 β-시트 코어로 구성된 2차 구조를 밝혀내었으며, 이는 전체 패밀리에 걸쳐 보존되는 것으로 여겨진다.33 활성 중심 루프는 ssDNA 결합 및 "핫스팟" 동일성을 측정하는 것 둘 다를 담당하는 것으로 나타났다.34 이들 효소의 과다발현은 게놈 불안정성 및 암과 관련되었으며, 따라서, 서열-특이적 표적화의 중요성을 강조한다.35
본 개시내용의 일부 측면은 시티딘 데아미나제 효소, 예컨대 APOBEC 효소의 활성이 게놈 DNA에서의 특이적 부위에 지정될 수 있다는 인식에 관한 것이다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, Cas9를 인식제로서 사용하는 것의 이점은 (1) Cas9의 서열 특이성이 sgRNA 서열을 간단히 변화시킴으로써 용이하게 변경될 수 있고; (2) Cas9가 dsDNA를 변성시킴으로써 그의 표적 서열에 결합하고, 이는 단일-가닥인 DNA의 신장, 및 따라서 데아미나제에 대한 생존성 기질을 발생시킨다는 것을 포함한다. 다른 촉매 도메인, 또는 다른 데아미나제로부터의 촉매 도메인은 또한 Cas9와 융합 단백질을 생성하는 데 사용될 수 있으며, 본 개시내용은 이와 관련하여 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시내용의 일부 측면은 Cas9:데아미나제 융합 단백질이 도 3에서의 넘버링 스킴에 따른 위치 3 내지 11에서 뉴클레오티드를 효율적으로 탈아미노화할 수 있다는 인식에 기초한다. Cas9:데아미나제 융합 단백질에 의해 표적화될 수 있는 뉴클레오티드에 관하여 본원에 제공된 결과의 관점에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 융합 단백질을 탈아미노화되는 뉴클레오티드를 포함하는 표적 서열에 표적화하기 위한 적합한 가이드 RNA를 설계할 수 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 데아미나제 도메인 및 Cas9 도메인은 링커를 통해 서로에게 융합된다. 특정 용도를 위해 데아미나제 활성을 위한 최적 길이를 달성하기 위해, 데아미나제 도메인 (예를 들어, AID) 및 Cas9 도메인 사이의 다양한 링커 길이 및 유연성이 사용될 수 있다 (예를 들어, 형태 (GGGGS)n (서열식별번호: 607), (GGS)n (서열식별번호: 610), 및 (G)n (서열식별번호: 608)의 매우 유연한 링커 내지 형태 (EAAAK)n (서열식별번호: 609), (SGGS)n (서열식별번호: 606), SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604) (예를 들어, 문헌 [Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82] 참조; 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨) 및 (XP)n (서열식별번호: 611)의 보다 단단한 링커)36. 일부 실시양태에서, 링커는 (GGS)n (서열식별번호: 610) 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1, 3, 또는 7이다. 일부 실시양태에서, 링커는 (SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604) 모티프를 포함한다.
본 개시내용의 측면에 따른 Cas9 도메인에 융합될 수 있는 일부 예시적인 적합한 핵산 편집 도메인, 예를 들어, 데아미나제 및 데아미나제 도메인이 하기 제공된다. 일부 실시양태에서, 각각의 서열의 활성 도메인, 예를 들어, 국재화 신호가 없는 도메인 (핵 방출 신호, 세포질 국재화 신호가 없는 핵 국재화 서열)이 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
인간 AID:
Figure pct00067
(밑줄: 핵 국재화 서열; 이중 밑줄: 핵 방출 신호)
마우스 AID:
Figure pct00068
(밑줄: 핵 국재화 서열; 이중 밑줄: 핵 방출 신호)
개 AID:
Figure pct00069
(밑줄: 핵 국재화 서열; 이중 밑줄: 핵 방출 신호)
소 AID:
Figure pct00070
(밑줄: 핵 국재화 서열; 이중 밑줄: 핵 방출 신호)
래트 AID:
Figure pct00071
(밑줄: 핵 국재화 서열; 이중 밑줄: 핵 방출 신호)
마우스 APOBEC-3:
Figure pct00072
(이탤릭체: 핵산 편집 도메인)
래트 APOBEC-3:
Figure pct00073
(이탤릭체: 핵산 편집 도메인)
레수스 마카크 APOBEC-3G:
Figure pct00074
(이탤릭체: 핵산 편집 도메인; 밑줄: 세포질 국재화 신호)
침팬지 APOBEC-3G:
Figure pct00075
(이탤릭체: 핵산 편집 도메인; 밑줄: 세포질 국재화 신호)
녹색 원숭이 APOBEC-3G:
Figure pct00076
(이탤릭체: 핵산 편집 도메인; 밑줄: 세포질 국재화 신호)
인간 APOBEC-3G:
Figure pct00077
(이탤릭체: 핵산 편집 도메인; 밑줄: 세포질 국재화 신호)
인간 APOBEC-3F:
Figure pct00078
(이탤릭체: 핵산 편집 도메인)
인간 APOBEC-3B:
Figure pct00079
(이탤릭체: 핵산 편집 도메인)
래트 APOBEC-3B:
Figure pct00080
소 APOBEC-3B:
Figure pct00081
침팬지 APOBEC-3B:
Figure pct00082
인간 APOBEC-3C:
Figure pct00083
(이탤릭체: 핵산 편집 도메인)
고릴라 APOBEC3C:
Figure pct00084
(이탤릭체: 핵산 편집 도메인)
인간 APOBEC-3A:
Figure pct00085
(이탤릭체: 핵산 편집 도메인)
레수스 마카크 APOBEC-3A:
Figure pct00086
(이탤릭체: 핵산 편집 도메인)
소 APOBEC-3A:
Figure pct00087
(이탤릭체: 핵산 편집 도메인)
인간 APOBEC-3H:
Figure pct00088
(이탤릭체: 핵산 편집 도메인)
레수스 마카크 APOBEC-3H:
Figure pct00089
인간 APOBEC-3D:
Figure pct00090
(이탤릭체: 핵산 편집 도메인)
인간 APOBEC-1:
Figure pct00091
마우스 APOBEC-1:
Figure pct00092
래트 APOBEC-1:
Figure pct00093
인간 APOBEC-2:
Figure pct00094
마우스 APOBEC-2:
Figure pct00095
래트 APOBEC-2:
Figure pct00096
소 APOBEC-2:
Figure pct00097
페트로미존 마리누스 CDA1 (pmCDA1)
Figure pct00098
인간 APOBEC3G D316R_D317R
Figure pct00099
인간 APOBEC3G 쇄 A
Figure pct00100
인간 APOBEC3G 쇄 A D120R_D121R
Figure pct00101
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 융합 단백질은 핵산 편집 효소의 전장 아미노산, 예를 들어, 상기 제공된 서열 중 하나를 포함한다. 그러나, 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 융합 단백질은 핵산 편집 효소의 전장 서열을 포함하지 않고, 단지 그의 단편만을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 Cas9 도메인 및 핵산 편집 효소의 단편을 포함하고, 예를 들어, 단편은 핵산 편집 도메인을 포함한다. 핵산 편집 도메인의 예시적인 아미노산 서열은 상기 서열에서 이탤릭체 문자로 나타나 있으며, 이러한 도메인의 추가의 적합한 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
예를 들어, 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인에 융합될 수 있는 본 발명의 측면에 따라 사용될 수 있는 추가의 적합한 핵산 편집 효소 서열, 예를 들어, 데아미나제 효소 및 도메인 서열은 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 이러한 추가의 효소 서열은 본원에 제공된 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 유사한 데아미나제 효소 또는 데아미나제 도메인 서열을 포함한다. 추가의 적합한 Cas9 도메인, 변이체, 및 서열은 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이러한 추가의 적합한 Cas9 도메인의 예는 D10A, D10A/D839A/H840A, 및 D10A/D839A/H840A/N863A 돌연변이체 도메인을 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 문헌 [Prashant et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838] 참조; 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, Cas9는 서열식별번호: 6에 제공된 아미노산 서열의 위치 840에 히스티딘 잔기, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 촉매 잔기 H840의 존재는 Cas9의 활성을 복원하여 표적화된 C에 대향하는 G를 함유하는 비-편집된 가닥을 절단한다. H840의 복원은 C를 함유하는 표적 가닥의 절단을 발생시키지 않는다.
Cas9 도메인 및 데아미나제 도메인을 포함하는 융합 단백질을 생성하기 위한 추가의 적합한 전략은 관련 기술분야의 일반적 지식과 조합으로 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 링커를 사용한 또는 링커를 사용하지 않는 본 개시내용의 측면에 따른 융합 단백질을 생성하기 위한 적합한 전략은 또한 본 개시내용 및 관련 기술분야의 지식의 관점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Gilbert et al., CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 2013; 154(2):442-51]은 링커로서 2개의 NLS (SPKKKRKVEAS, 서열식별번호: 617)를 사용한 VP64와의 Cas9의 C-말단 융합이 전사 활성화에 사용될 수 있다는 것을 보여주었다. 문헌 [Mali et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 2013; 31(9):833-8]은 링커 없이 VP64와의 C-말단 융합물이 전사 활성화에 사용될 수 있다는 것을 보고하였다. 그리고, 문헌 [Maeder et al., CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nat Methods. 2013; 10: 977-979]은 Gly4Ser (서열식별번호: 613) 링커를 사용한 VP64와의 C-말단 융합물이 전사 활성인자로서 사용될 수 있다는 것을 보고하였다. 최근, dCas9-FokI 뉴클레아제 융합물은 성공적으로 생성되었으며, 모 Cas9 효소와 비교하여 개선된 효소적 특이성을 나타낸다 (문헌 [Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82, 및 Tsai SQ, Wyvekens N, Khayter C, Foden JA, Thapar V, Reyon D, Goodwin MJ, Aryee MJ, Joung JK. Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. Nat Biotechnol. 2014; 32(6):569-76]. PMID: 24770325 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604) 또는 GGGGS (서열식별번호: 607) 링커는 각각 FokI-dCas9 융합 단백질에 사용됨).
본 개시내용의 일부 측면은 (i) Cas9 효소 또는 도메인 (예를 들어, 제1 단백질); 및 (ii) 핵산-편집 효소 또는 도메인 (예를 들어, 제2 단백질)을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 측면에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 (iii) 프로그램가능한 DNA-결합 단백질, 예를 들어, 아연-핑거 도메인, TALE, 또는 제2 Cas9 단백질 (예를 들어, 제3 단백질)을 추가로 포함한다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 프로그램가능한 DNA-결합 단백질 (예를 들어, 제2 Cas9 단백질)을 (i) Cas9 효소 또는 도메인 (예를 들어, 제1 단백질); 및 (ii) 핵산-편집 효소 또는 도메인 (예를 들어, 제2 단백질)을 포함하는 융합 단백질에 융합시키는 것은 표적 핵산 서열에 대한 융합 단백질의 특이성을 개선시키는 데, 또는 정규 PAM (NGG) 서열을 함유하지 않는 표적 핵산 서열에 결합하는 융합 단백질의 특이성 또는 결합 친화도를 개선시키는 데 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제3 단백질은 Cas9 단백질 (예를 들어, 제2 Cas9 단백질)이다. 일부 실시양태에서, 제3 단백질은 본원에 제공된 Cas9 단백질 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, 제3 단백질은 Cas9 단백질 (예를 들어, 제1 단백질)에 대한 융합 단백질 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, 제3 단백질은 Cas9 단백질 (예를 들어, 제1 단백질)에 대한 융합 단백질 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인 (예를 들어, 제1 단백질) 및 제3 단백질 (예를 들어, 제2 Cas9 단백질)은 링커 (예를 들어, 제2 링커)를 통해 융합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 (GGGGS)n (서열식별번호: 607), (G)n (서열식별번호: 608), (EAAAK)n (서열식별번호: 609), (GGS)n (서열식별번호: 610), (SGGS)n (서열식별번호: 606), SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604), SGGS(GGS)n (서열식별번호: 612), SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 605), 또는 (XP)n (서열식별번호: 611) 모티프, 또는 이들 중 임의의 것의 조합을 포함하며, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 30의 정수이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 예시적인 napDNAbp 융합 단백질의 일반적 아키텍처는 구조:
[NH2]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[napDNAbp]-[제3 단백질]-[COOH];
[NH2]-[제3 단백질]-[napDNAbp]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[COOH];
[NH2]-[napDNAbp]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[제3 단백질]-[COOH];
[NH2]-[제3 단백질]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[napDNAbp]-[COOH];
[NH2]-[UGI]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[napDNAbp]-[제3 단백질]-[COOH];
[NH2]-[UGI]-[제3 단백질]-[napDNAbp]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[COOH];
[NH2]-[UGI]-[napDNAbp]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[제3 단백질]-[COOH];
[NH2]-[UGI]-[제3 단백질]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[napDNAbp]-[COOH];
[NH2]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[napDNAbp]-[제3 단백질]-[UGI]-[COOH];
[NH2]-[제3 단백질]-[napDNAbp]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[UGI]-[COOH];
[NH2]-[NapDNAbp]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[제3 단백질]-[UGI]-[COOH];
[NH2]-[제3 단백질]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[NapDNAbp]-[UGI]-[COOH]; 또는
[NH2]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[NapDNAbp]-[제1 UGI 도메인]-[제2 UGI 도메인]-[COOH]
를 포함하며; 여기서 NH2는 융합 단백질의 N-말단이고, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다. 일부 실시양태에서, 상기 일반적 아키텍처에 사용된 "]-["는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타낸다. 다른 예에서, 본원에 제공된 예시적인 NapDNAbp 융합 단백질의 일반적 아키텍처는 구조:
[NH2]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[NapDNAbp]-[제2 NapDNAbp 단백질]-[COOH];
[NH2]-[제2 NapDNAbp 단백질]-[NapDNAbp]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[COOH];
[NH2]-[NapDNAbp]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[제2 NapDNAbp 단백질]-[COOH];
[NH2]-[제2 NapDNAbp 단백질]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[NapDNAbp]-[COOH];
[NH2]-[UGI]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[NapDNAbp]-[제2 NapDNAbp 단백질]-[COOH],
[NH2]-[UGI]-[제2 NapDNAbp 단백질]-[NapDNAbp]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[COOH];
[NH2]-[UGI]-[NapDNAbp]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[제2 NapDNAbp 단백질]-[COOH];
[NH2]-[UGI]-[제2 NapDNAbp 단백질]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[NapDNAbp]-[COOH];
[NH2]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[NapDNAbp]-[제2 NapDNAbp 단백질]-[UGI]-[COOH];
[NH2]-[제2 NapDNAbp 단백질]-[NapDNAbp]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[UGI]-[COOH];
[NH2]-[NapDNAbp]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[제2 NapDNAbp 단백질]-[UGI]-[COOH]; 또는
[NH2]-[제2 NapDNAbp 단백질]-[핵산-편집 효소 또는 도메인]-[NapDNAbp]-[UGI]-[COOH]
를 포함하며; 여기서 NH2는 융합 단백질의 N-말단이고, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다. 일부 실시양태에서, 상기 일반적 아키텍처에 사용된 "]-["는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 제2 NapDNAbp는 dCas9 단백질이다. 일부 예에서, 본원에 제공된 예시적인 Cas9 융합 단백질의 일반적 아키텍처는 도 3에 제시된 바와 같은 구조를 포함한다. 예시적인 Cas9 융합 단백질의 일반적 아키텍처 중 임의의 것에 제공된 단백질 중 임의의 것은 본원에 제공된 링커 중 1종 이상에 의해 연결될 수 있다는 것이 인지되어야 한다. 일부 실시양태에서, 링커는 동일하다. 일부 실시양태에서, 링커는 상이하다. 일부 실시양태에서, 예시적인 Cas9 융합 단백질의 일반적 아키텍처 중 임의의 것에 제공된 단백질 중 1종 이상은 링커를 통해 융합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 핵 표적화 서열, 예를 들어 핵 국재화 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 핵 국재화 서열 (NLS)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, NLS는 융합 단백질의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 융합 단백질의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 제3 단백질의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 제3 단백질의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 Cas9 단백질의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 Cas9 단백질의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 핵산-편집 효소 또는 도메인의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 핵산-편집 효소 또는 도메인의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 UGI 단백질의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 UGI 단백질의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 1종 이상의 링커를 통해 융합 단백질에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 링커 없이 융합 단백질에 융합된다.
우라실 글리코실라제 억제제 융합 단백질
본 개시내용의 일부 측면은 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인 (예를 들어, 뉴클레아제 활성 Cas9 도메인, 뉴클레아제 불활성 dCas9 도메인, 또는 Cas9 니카제)을 포함하는 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 직접적으로 또는 링커를 통해 UGI 도메인에 추가로 융합될 수 있다. 본 개시내용의 일부 측면은 증가된 핵염기 편집 효율을 갖는 데아미나제-dCas9 융합 단백질, 데아미나제-뉴클레아제 활성 Cas9 융합 단백질 및 데아미나제-Cas9 니카제 융합 단백질을 제공한다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, U:G 헤테로듀플렉스 DNA의 존재에 대한 세포의 DNA-복구 반응은 세포에서의 핵염기 편집 효율의 감소의 원인이 될 수 있다. 예를 들어, 우라실 DNA 글리코실라제 (UDG)는 세포에서의 DNA로부터의 U의 제거를 촉매하며, 이는 염기 절제 복구를 개시할 수 있고, 가장 흔한 결과물로서 U:G 쌍의 C:G 쌍으로의 복귀를 갖는다. 하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 (UGI)는 인간 UDG 활성을 억제할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 UGI 도메인에 추가로 융합된 dCas9-핵산 편집 도메인을 포함하는 융합 단백질을 고려한다. 본 개시내용은 또한 UGI 도메인에 추가로 융합된 Cas9 니카제-핵산 편집 도메인을 포함하는 융합 단백질을 고려한다. UGI 도메인의 사용은 C에서 U로의 변화를 촉매할 수 있는 핵산 편집 도메인의 편집 효율을 증가시킬 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, UGI 도메인을 포함하는 융합 단백질은 C 잔기를 탈아미노화하는 데 보다 효율적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 구조:
[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[dCas9]-[임의적인 링커 서열]-[UGI];
[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[UGI]-[임의적인 링커 서열]-[dCas9];
[UGI]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[dCas9];
[UGI]-[임의적인 링커 서열]-[dCas9]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제];
[dCas9]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[UGI];
[dCas9]-[임의적인 링커 서열]-[UGI]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제];
[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[dCas9]-[임의적인 링커 서열]-[제1 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[제2 UGI];
[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[제1 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[제2 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[dCas9];
[제1 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[제2 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[dCas9];
[제1 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[제2 UGi]-[임의적인 링커 서열]-[dCas9]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제];
[dCas9]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[제1 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[제2 UGI]; 또는
[dCas9]-[임의적인 링커 서열]-[제1 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[제2 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]
를 포함한다.
다른 실시양태에서, 융합 단백질은 구조:
[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[Cas9 니카제]-[임의적인 링커 서열]-[UGI];
[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[UGI]-[임의적인 링커 서열]-[Cas9 니카제];
[UGI]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[Cas9 니카제];
[UGI]-[임의적인 링커 서열]-[Cas9 니카제]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제];
[Cas9 니카제]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[UGI];
[Cas9 니카제]-[임의적인 링커 서열]-[UGI]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제];
[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[Cas9 니카제]-[임의적인 링커 서열]-[제1 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[제2 UGI];
[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[제1 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[제2 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[Cas9 니카제];
[제1 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[제2 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[Cas9 니카제];
[제1 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[제2 UGi]-[임의적인 링커 서열]-[Cas9 니카제]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제];
[Cas9 니카제]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[제1 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[제2 UGI]; 또는
[Cas9 니카제]-[임의적인 링커 서열]-[제1 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[제2 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]
를 포함한다.
상기 기재된 융합 단백질 중 임의의 것은 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp); (ii) 시티딘 데아미나제 도메인; 및 (iii) 2개 이상의 UGI 도메인으로 구성될 수 있으며, 여기서 2개 이상의 UGI 도메인은 구축물에서 서로 인접할 수 있거나 (예를 들어, [제1 UGI]-[제2 UGI], 여기서 "-"는 임의적인 링커임), 또는 2개 이상의 UGI 도메인은 (i)의 napDNAbp 및/또는 (ii)의 시티딘 데아미나제 도메인에 의해 분리될 수 있다는 것 (예를 들어, [제1 UGI]-[데아미나제]-[제2 UGI], [제1 UGI]-[napDNAbp]-[제2 UGI], [제1 UGI]-[데아미나제]-[napDNAbp]-[제2 UGI] 등, 여기서 "-"는 임의적인 링커임)이 인지되어야 한다.
또 다른 측면에서, 융합 단백질은 (i) Cas9 효소 또는 도메인; (ii) 핵산-편집 효소 또는 도메인 (예를 들어, 제2 단백질) (예를 들어, 시티딘 데아미나제 도메인); (iii) 제1 우라실 글리코실라제 억제제 도메인 (UGI) (예를 들어, 제3 단백질); 및 (iv) 제2 우라실 글리코실라제 억제제 도메인 (UGI) (예를 들어, 제4 단백질)을 포함한다. 제1 및 제2 우라실 글리코실라제 억제제 도메인 (UGI)은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인 (예를 들어, 제1 단백질) 및 데아미나제 (예를 들어, 제2 단백질)는 링커를 통해 융합된다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 데아미나제의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질 (예를 들어, 제1 단백질) 및 제1 UGI 도메인 (예를 들어, 제3 단백질)은 링커 (예를 들어, 제2 링커)를 통해 융합된다. 일부 실시양태에서, 제1 UGI 도메인은 Cas9 단백질의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, 제1 UGI 도메인 (예를 들어, 제3 단백질) 및 제2 UGI 도메인 (예를 들어, 제4 단백질)은 링커 (예를 들어, 제3 링커)를 통해 융합된다. 일부 실시양태에서, 제2 UGI 도메인은 제1 UGI 도메인의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 (GGGGS)n (서열식별번호: 607), (G)n (서열식별번호: 608), (EAAAK)n (서열식별번호: 609), (GGS)n (서열식별번호: 610), (SGGS)n (서열식별번호: 606), SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604), SGGS(GGS)n (서열식별번호: 612), SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 605) 또는 (XP)n (서열식별번호: 611) 모티프 또는 이들 중 임의의 것의 조합을 포함하며, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 30의 정수이다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 1-50개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 1-40개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 1-35개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 1-30개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 1-20개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 10-20개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 30-40개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 14, 16 또는 18개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 16개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 30, 32 또는 34개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 32개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604) 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 605) 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 1-50개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 1-40개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 1-35개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 1-30개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 1-20개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 2-20개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 2-10개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 10-20개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 2, 4 또는 6개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 7, 9 또는 11개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 14, 16 또는 18개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 4개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 9개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 16개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 (SGGS)n (서열식별번호: 606) 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 30 (양끝값 포함)의 정수이다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 (SGGS)n (서열식별번호: 606) 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1이다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 SGGS(GGS)n (서열식별번호: 612) 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 30 (양끝값 포함)의 정수이다. 일부 실시양태에서, 제2 링커는 SGGS(GGS)n (서열식별번호: 612) 모티프를 포함하며, 여기서 n은 2이다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 포함하고 1-50개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 1-40개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 1-35개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 1-30개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 1-20개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 2-20개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 2-10개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 10-20개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 2, 4 또는 6개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 7, 9 또는 11개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 14, 16 또는 18개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 4개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 9개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 16개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 (SGGS)n (서열식별번호: 606) 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 30 (양끝값 포함)의 정수이다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 (SGGS)n (서열식별번호: 606) 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1이다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 SGGS(GGS)n (서열식별번호: 612) 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 30 (양끝값 포함)의 정수이다. 일부 실시양태에서, 제3 링커는 SGGS(GGS)n (서열식별번호: 612) 모티프를 포함하며, 여기서 n은 2이다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 하기 구조:
[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[dCas9]-[임의적인 링커 서열]-[제1 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[제2 UGI];
[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[Cas9 니카제]-[임의적인 링커 서열]-[제1 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[제2 UGI]; 또는
[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[Cas9]-[임의적인 링커 서열]-[제1 UGI]-[임의적인 링커 서열]-[제2 UGI]
를 포함한다.
또 다른 측면에서, 융합 단백질은 (i) Cas9 효소 또는 도메인; (ii) 핵산-편집 효소 또는 도메인 (예를 들어, 제2 단백질) (예를 들어, 시티딘 데아미나제 도메인); (iii) 2개 초과의 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 링커 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 임의적인 링커 서열 중 하나 또는 둘 다가 존재한다. 일부 실시양태에서, 임의적인 링커 서열 중 1, 2, 또는 3개가 존재한다.
일부 실시양태에서, 상기 일반적 아키텍처에 사용된 "-"는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, UGI를 포함하는 융합 단백질은 핵 표적화 서열, 예를 들어 핵 국재화 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 핵 국재화 서열 (NLS)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, NLS는 융합 단백질의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 융합 단백질의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 UGI 단백질의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 UGI 단백질의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 Cas9 단백질의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 Cas9 단백질의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 데아미나제의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 데아미나제의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 제2 Cas9의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 제2 Cas9의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 1종 이상의 링커를 통해 융합 단백질에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 링커 없이 융합 단백질에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 본원에 제공되거나 언급된 NLS 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, NLS는 서열식별번호: 614 또는 서열식별번호: 615에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, UGI 도메인은 야생형 UGI 또는 서열식별번호: 134에 제시된 바와 같은 UGI를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 UGI 단백질은 UGI의 단편 및 UGI 또는 UGI 단편에 상동인 단백질을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, UGI 도메인은 서열식별번호: 134에 제시된 아미노산 서열의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI 단편은 서열식별번호: 134에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI는 서열식별번호: 134에 제시된 아미노산 서열에 상동인 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 134에 제시된 아미노산 서열의 단편에 상동인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI 또는 UGI의 단편 또는 UGI 또는 UGI 단편의 상동체를 포함하는 단백질은 "UGI 변이체"로 지칭된다. UGI 변이체는 UGI, 또는 그의 단편과 상동성을 공유한다. 예를 들어 UGI 변이체는 야생형 UGI 또는 서열식별번호: 134에 제시된 바와 같은 UGI와 적어도 70% 동일하거나, 적어도 75% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 85% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하거나, 적어도 99.9% 동일하다. 일부 실시양태에서, UGI 변이체는 단편이 야생형 UGI 또는 서열식별번호: 134에 제시된 바와 같은 UGI의 상응하는 단편과 적어도 70% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하거나, 적어도 99.9% 동일하도록 UGI의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
>sp|P14739|UNGI_BPPB2 우라실-DNA 글리코실라제 억제제
Figure pct00102
적합한 UGI 단백질 및 뉴클레오티드 서열은 본원에 제공되며, 추가의 적합한 UGI 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Wang et al., Uracil-DNA glycosylase inhibitor gene of bacteriophage PBS2 encodes a binding protein specific for uracil-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. 264:1163-1171(1989); Lundquist et al., Site-directed mutagenesis and characterization of uracil-DNA glycosylase inhibitor protein. Role of specific carboxylic amino acids in complex formation with Escherichia coli uracil-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. 272:21408-21419(1997); Ravishankar et al., X-ray analysis of a complex of Escherichia coli uracil DNA glycosylase (EcUDG) with a proteinaceous inhibitor. The structure elucidation of a prokaryotic UDG. Nucleic Acids Res. 26:4880-4887(1998); 및 Putnam et al., Protein mimicry of DNA from crystal structures of the uracil-DNA glycosylase inhibitor protein and its complex with Escherichia coli uracil-DNA glycosylase. J. Mol. Biol. 287:331-346(1999)]에 공개된 것들을 포함하며, 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
추가의 단백질은 우라실 글리코실라제 억제제일 수 있다는 것이 인지되어야 한다. 예를 들어, 우라실-DNA 글리코실라제 염기-절제 복구 효소를 억제할 (예를 들어, 입체적으로 차단할) 수 있는 다른 단백질은 본 개시내용의 범주 내에 있다. 추가적으로, 염기-절제 복구를 차단하거나 억제하는 임의의 단백질은 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 1개의 UGI 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 1개 초과의 UGI 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 2개의 UGI 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 2개 초과의 UGI 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA에 결합하는 단백질이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, UGI에 대한 치환이 사용된다. 일부 실시양태에서, 우라실 글리코실라제 억제제는 단일-가닥 DNA에 결합하는 단백질이다. 예를 들어, 우라실 글리코실라제 억제제는 에르위니아 타스마니엔시스(Erwinia tasmaniensis) 단일-가닥 결합 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일-가닥 결합 단백질은 아미노산 서열 (서열식별번호: 135)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 우라실 글리코실라제 억제제는 우라실에 결합하는 단백질이다. 일부 실시양태에서, 우라실 글리코실라제 억제제는 DNA에서 우라실에 결합하는 단백질이다. 일부 실시양태에서, 우라실 글리코실라제 억제제는 촉매적으로 불활성인 우라실 DNA-글리코실라제 단백질이다. 일부 실시양태에서, 우라실 글리코실라제 억제제는 DNA로부터 우라실을 절제하지 않는 촉매적으로 불활성인 우라실 DNA-글리코실라제 단백질이다. 예를 들어, 우라실 글리코실라제 억제제는 UdgX이다. 일부 실시양태에서, UdgX는 아미노산 서열 (서열식별번호: 136)을 포함한다. 또 다른 예로서, 우라실 글리코실라제 억제제는 촉매적으로 불활성인 UDG이다. 일부 실시양태에서, 촉매적으로 불활성인 UDG는 아미노산 서열 (서열식별번호: 137)을 포함한다. 다른 우라실 글리코실라제 억제제는 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 본 개시내용의 범위 내에 있다는 것이 인지되어야 한다. 일부 실시양태에서, 우라실 글리코실라제 억제제는 서열식별번호: 135-137 또는 143-148 중 어느 하나와 상동인 단백질이다. 일부 실시양태에서, 우라실 글리코실라제 억제제는 서열식별번호: 135-137 또는 143-148 중 어느 하나와 적어도 50% 동일하거나, 적어도 55% 동일하거나, 적어도 60% 동일하거나, 적어도 65% 동일하거나, 적어도 70% 동일하거나, 적어도 75% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 85% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일한 단백질이다.
에르위니아 타스마니엔시스 SSB (열안정성 단일-가닥 DNA 결합 단백질)
Figure pct00103
UdgX (DNA에서 우라실에 결합하지만 절제하지 않음)
Figure pct00104
UDG (촉매적으로 불활성인 인간 UDG, DNA에서 우라실에 결합하지만, 절제하지 않음)
Figure pct00105
UGI로서 사용될 수 있는 추가의 단일-가닥 DNA 결합 단백질이 하기 제시된다. 다른 단일-가닥 결합 단백질, 예를 들어 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Dickey TH, Altschuler SE, Wuttke DS. Single-stranded DNA-binding proteins:multiple domains for multiple functions. Structure. 2013 Jul 2;21(7):1074-84. doi: 10.1016/j.str.2013.05.013. Review.; Marceau AH. Functions of single-strand DNA-binding proteins in DNA replication, recombination, and repair. Methods Mol Biol. 2012;922:1-21. doi: 10.1007/978-1-62703-032-8_1.; Mijakovic, Ivan, et al.; Bacterial single-stranded DNA-binding proteins are phosphorylated on tyrosine. Nucleic Acids Res 2006; 34 (5): 1588-1596. doi: 10.1093/nar/gkj514; Mumtsidu E, Makhov AM, Konarev PV, Svergun DI, Griffith JD, Tucker PA. Structural features of the single-stranded DNA-binding protein of Epstein-Barrvirus. J Struct Biol. 2008 Feb;161(2):172-87. Epub 2007 Nov 1; Nowak M, Olszewski M, Spibida M, Kur J. Characterization of single-strandedDNA-binding proteins from the psychrophilic bacteria Desulfotalea psychrophila, Flavobacterium psychrophilum, Psychrobacter arcticus, Psychrobactercryohalolentis, Psychromonas ingrahamii, Psychroflexus torquis, and Photobacterium profundum. BMC Microbiol. 2014 Apr 14;14:91. doi: 10.1186/1471-2180-14-91; Tone T, Takeuchi A, Makino O. Single-stranded DNA binding protein Gp5 of Bacillus subtilis phage Φ29 is required for viral DNA replication in growth-temperature dependent fashion. Biosci Biotechnol Biochem. 2012;76(12):2351-3. Epub 2012 Dec 7; Wold. REPLICATION PROTEIN A:A Heterotrimeric, Single-Stranded DNA-Binding Protein Required for Eukaryotic DNA Metabolism. Annual Review of Biochem. 1997; 66:61-92. doi: 10.1146/annurev.biochem.66.1.61; Wu Y, Lu J, Kang T. Human single-stranded DNA binding proteins: guardians of genome stability. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2016 Jul;48(7):671-7. doi: 10.1093/abbs/gmw044. Epub 2016 May 23. Review]에 기재된 것들이 UGI로서 사용될 수 있다는 것이 인지되어야 한다.
mtSSB - SSBP1 단일 가닥 DNA 결합 단백질 1 [ 호모 사피엔스 (인간) ] (유니프롯KB: Q04837; NP_001243439.1)
Figure pct00106
단일-가닥 DNA 결합 단백질 3 이소형 A [무스 무스쿨루스] (유니프롯KB - Q9D032-1; NCBI Ref: NP_076161.2)
Figure pct00107
RPA 1 - 복제 단백질 A 70 kDa DNA 결합 서브유닛 (유니프롯KB: P27694; NCBI Ref: NM_002945.3)
Figure pct00108
RPA 2 - 복제 단백질 A 32 kDa 서브유닛 (유니프롯KB: P15927; NCBI Ref: NM_002946)
Figure pct00109
RPA 3 - 복제 단백질 A 14 kDa 서브유닛 (유니프롯KB: P35244; NCBI Ref: NM_002947.4)
Figure pct00110
박테리아 단일-가닥 DNA 결합 단백질:
ssbA - 단일-가닥 DNA-결합 단백질 [바실루스 서브틸리스 아종 서브틸리스 균주 168] (유니프롯KB: P37455; NCBI Ref: )
Figure pct00111
단일-가닥 DNA 결합 단백질 2 [스트렙토미세스 코엘리콜로르 A3(2)] (유니프롯KB: Q9X8U3; NCBI Ref: NP_628093.1)
Figure pct00112
단일-가닥 DNA 결합 단백질 [스트렙토코쿠스 뉴모니아에 R6] (유니프롯KB: P66855; NCBI Ref: NP_358988.1)
Figure pct00113
바이러스 단일-가닥 DNA 결합 단백질:
단일-가닥 DNA 결합 단백질 [인간 알파헤르페스바이러스 1] (유니프롯KB: P04296; NCBI Ref: YP_009137104.1)
Figure pct00114
바실루스 바이러스 phi29로부터의 단일-가닥 DNA 결합 단백질 (유니프롯KB: Q38504.1; NCBI Ref: YP_002004532.1)
Figure pct00115
단일 가닥 DNA 결합 단백질 [부르크홀데리아 바이러스 DC1] (유니프롯KB: I6NRL7; NCBI Ref: YP_006589943.1)
Figure pct00116
일부 실시양태에서, 핵산 편집 도메인은 데아미나제 도메인이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 시토신 데아미나제 또는 시티딘 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 패밀리 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC1 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC2 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3A 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3B 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3C 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3D 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3E 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3F 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3G 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3H 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC4 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 활성화-유도된 데아미나제 (AID)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 래트 APOBEC1 (서열식별번호: 74)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간 APOBEC1 (서열식별번호: 76)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 페트로미존 마리누스 시티딘 데아미나제 1 (pmCDA1)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간 APOBEC3G (서열식별번호: 60)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간 APOBEC3G의 단편 (서열식별번호: 83)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 D316R_D317R 돌연변이를 포함하는 인간 APOBEC3G 변이체 (서열식별번호: 82)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 인간 APOBEC3G 및 서열식별번호: 60에서의 D316R_D317R 돌연변이에 상응하는 돌연변이를 포함하는 단편 (서열식별번호: 84)이다.
일부 실시양태에서, 링커는 (GGGS)n (서열식별번호: 613), (GGGGS)n (서열식별번호: 607), (G)n (서열식별번호: 608), (EAAAK)n (서열식별번호: 609), (GGS)n (서열식별번호: 610), SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604), 또는 (XP)n (서열식별번호: 611) 모티프, 또는 이들 중 임의의 것의 조합을 포함하며, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 30의 정수이다.
적합한 UGI 단백질 및 뉴클레오티드 서열은 본원에 제공되며, 추가의 적합한 UGI 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Wang et al., Uracil-DNA glycosylase inhibitor gene of bacteriophage PBS2 encodes a binding protein specific for uracil-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. 264:1163-1171(1989)]; [Lundquist et al., Site-directed mutagenesis and characterization of uracil-DNA glycosylase inhibitor protein. Role of specific carboxylic amino acids in complex formation with Escherichia coli uracil-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. 272:21408-21419(1997)]; [Ravishankar et al., X-ray analysis of a complex of Escherichia coli uracil DNA glycosylase (EcUDG) with a proteinaceous inhibitor. The structure elucidation of a prokaryotic UDG. Nucleic Acids Res. 26:4880-4887(1998)]; 및 [Putnam et al., Protein mimicry of DNA from crystal structures of the uracil-DNA glycosylase inhibitor protein and its complex with Escherichia coli uracil-DNA glycosylase. J. Mol. Biol. 287:331-346(1999)]에 공개된 것들을 포함하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 임의적 링커는 (GGS)n (서열식별번호: 610) 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 19, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20이다. 일부 실시양태에서, 임의적 링커는 (GGS)n (서열식별번호: 610) 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1, 3, 또는 7이다. 일부 실시양태에서, 임의적 링커는 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604)를 포함하며, 이는 또한 실시예에서 XTEN 링커로 지칭된다.
일부 실시양태에서, Cas9 니카제는 그의 게놈이 생체내에서 편집되는 유기체에서 비-편집된 가닥 상의 염기의 제거를 추가로 용이하게 할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 Cas9 니카제는 서열식별번호: 6에서의 D10A 돌연변이, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 Cas9 니카제는 서열식별번호: 6의 돌연변이 840, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 잔기에 히스티딘을 포함할 수 있다. Cas9 니카제를 포함하는 이러한 융합 단백질은 표적 DNA 서열의 단일 가닥, 예를 들어, 편집되지 않는 가닥을 절단할 수 있다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이 절단은 데아미나제에 의해 생성된 C에서 U로의 편집을 역전시키는 미스-매치 복구 매커니즘을 억제할 수 있다.
가이드 RNA와의 Cas9 복합체
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것, 및 융합 단백질의 Cas9 도메인 (예를 들어, dCas9, 뉴클레아제 활성 Cas9, 또는 Cas9 니카제)에 결합된 가이드 RNA를 포함하는 복합체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 15 내지 100개 뉴클레오티드 길이이고, 표적 서열에 상보적인 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 표적 서열에 상보적인 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 DNA 서열이다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 포유동물의 게놈에서의 서열이다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 인간의 게놈에서의 서열이다. 일부 실시양태에서, 표적 서열의 3' 말단은 정규 PAM 서열 (NGG)에 바로 인접한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 질환 또는 장애와 연관된 서열에 상보적이다.
Cas9 융합 단백질을 사용하는 방법
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 Cas9 단백질, 융합 단백질, 또는 복합체를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용의 일부 측면은 DNA 분자를 (a) 본원에 제공된 Cas9 단백질 또는 융합 단백질과, 및 적어도 1종의 가이드 RNA와 (여기서, 가이드 RNA는 약 15 내지 100개 뉴클레오티드 길이이고, 표적 서열에 상보적인 적어도 10개의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함함); 또는 (b) 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 단백질, Cas9 융합 단백질, 또는 적어도 1종의 gRNA를 갖는 Cas9 단백질 또는 융합 단백질 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 표적 서열의 3' 말단은 정규 PAM 서열 (NGG)에 바로 인접하지 않는다. 일부 실시양태에서, 표적 서열의 3' 말단은 AGC, GAG, TTT, GTG, 또는 CAA 서열에 바로 인접한다.
일부 실시양태에서, 표적 DNA 서열은 질환 또는 장애와 연관된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 DNA 서열은 질환 또는 장애와 연관된 점 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질, Cas9 융합 단백질, 또는 복합체의 활성은 점 돌연변이의 교정을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 표적 DNA 서열은 질환 또는 장애와 연관된 T→C 점 돌연변이를 포함하고, 여기서, 돌연변이체 C 염기의 탈아미노화는 질환 또는 장애와 연관되지 않은 서열을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 표적 DNA 서열은 단백질을 코딩하고, 여기서, 점 돌연변이는 코돈에 있으며, 야생형 코돈에 비해 돌연변이체 코돈에 의해 코딩되는 아미노산의 변화를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C의 탈아미노화는 돌연변이체 코돈에 의해 코딩되는 아미노산의 변화를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C의 탈아미노화는 야생형 아미노산을 코딩하는 코돈을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 접촉은 대상체의 생체내에서 이루어진다. 일부 실시양태에서, 대상체는 질환 또는 장애를 갖거나, 이로 진단되었다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 낭성 섬유증, 페닐케톤뇨, 표피박리성 과다각화증 (EHK), 샤르코-마리-투스병 유형 4J, 신경모세포종 (NB), 폰 빌레브란트병 (vWD), 선천성 근긴장증, 유전성 신장 아밀로이드증, 확장성 심근병증 (DCM), 유전성 림프부종, 가족성 알츠하이머병, HIV, 프리온 질환, 만성 영아 신경학적 피부 관절 증후군 (CINCA), 데스민-관련 근병증 (DRM), 돌연변이체 PI3KCA 단백질, 돌연변이체 CTNNB1 단백질, 돌연변이체 HRAS 단백질, 또는 돌연변이체 p53 단백질과 연관된 신생물성 질환이다.
일부 실시양태는 본원에 제공된 Cas9 DNA 편집 융합 단백질을 사용하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 표적 핵염기, 예를 들어, C 잔기를 탈아미노화함으로써 점 돌연변이를 핵산 내로 도입하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 표적 핵염기의 탈아미노화는 유전적 결함의 교정, 예를 들어, 유전자 생성물에서의 기능의 상실을 발생시키는 점 돌연변이의 교정을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 유전적 결함은 질환 또는 장애, 예를 들어, 리소솜 축적 장애 또는 대사 질환, 예컨대, 예를 들어, 유형 I 당뇨병과 연관된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 탈활성화 점 돌연변이를 질환 또는 장애와 연관된 유전자 생성물을 코딩하는 유전자 또는 대립유전자 내로 도입하는 데 사용된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, (예를 들어, 증식성 질환의 치료에서) Cas9 DNA 편집 융합 단백질을 사용하여 탈활성화 점 돌연변이를 종양유전자 내로 도입하는 방법이 본원에 제공된다. 탈활성화 돌연변이는 일부 실시양태에서, 코딩 서열에서의 조기 정지 코돈을 생성할 수 있으며, 이는 말단절단된 유전자 산물, 예를 들어, 전장 단백질의 기능이 결여된 말단절단된 단백질의 발현을 발생시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법의 목적은 게놈 편집을 통해 기능이상 유전자의 기능을 복원하는 것이다. 본원에 제공된 Cas9 데아미나제 융합 단백질은 예를 들어, 인간 세포 배양물에서 질환-연관된 돌연변이를 교정함으로써, 시험관내에서 유전자 편집-기반 인간 치료제에 대해 확인될 수 있다. 본원에 제공된 융합 단백질, 예를 들어, Cas9 도메인 및 핵산 데아미나제 도메인을 포함하는 융합 단백질은 임의의 단일 점 T　->　C 또는 A -> G 돌연변이를 교정하는 데 사용될 수 있다는 것이 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 첫번째 경우, 돌연변이체 C에서 다시 U로의 탈아미노화는 돌연변이를 교정하고, 후자의 경우, 돌연변이체 G와 염기-쌍형성된 C의 탈아미노화, 그 후 반복 라운드는 돌연변이를 교정한다.
제공된 융합 단백질에 의해 시험관내에서 또는 생체내에서 교정될 수 있는 예시적인 질환-관련 돌연변이는 PI3KCA 단백질에서의 H1047R (A3140G) 다형성이다. 포스포이노시티드-3-키나제, 즉, 촉매 알파 서브유닛 (PI3KCA) 단백질은 포스파티딜이노시톨의 이노시톨 고리의 3-OH 기를 인산화하는 작용을 한다. PI3KCA 유전자는 많은 상이한 암종에서 돌연변이되는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 이는 강력한 종양유전자인 것으로 간주된다.37 사실, A3140G 돌연변이는 몇몇 NCI-60 암 세포주, 예컨대, 예를 들어, HCT116, SKOV3, 및 T47D 세포주에 존재하며, 이들은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)으로부터 용이하게 입수가능하다.38
일부 실시양태에서, 교정되는 돌연변이를 운반하는 세포, 예를 들어, PI3KCA 유전자의 엑손 20에서 점 돌연변이, 예를 들어, A3140G 점 돌연변이를 운반하는 세포 (PI3KCA 단백질에서의 H1047R 치환을 발생시킴)는 Cas9 데아미나제 융합 단백질 및 융합 단백질을 표적화하는 적절하게 설계된 sgRNA를 코딩 PI3KCA 유전자에서의 각각의 돌연변이 부위에 코딩하는 발현 구축물과 접촉된다. sgRNA가 융합 효소를 PI3KCA 유전자 내에 있는 비-C 잔기에 표적화하도록 설계된 대조 실험이 수행될 수 있다. 처리된 세포의 게놈 DNA를 추출하고, PI3KCA 유전자의 관련 서열을 PCR 증폭시키고, 서열분석하여 인간 세포 배양물에서의 융합 단백질의 활성을 평가할 수 있다.
PI3KCA에서의 점 돌연변이를 교정하는 실시예는 예시 목적으로 제공되며, 본 개시내용을 제한하는 것을 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다. 통상의 기술자는 본원에 개시된 DNA-편집 융합 단백질이 다른 점 돌연변이 및 다른 암과, 및 다른 증식성 질환을 포함한 암 이외의 질환과 연관된 돌연변이를 교정하는 데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
질환-연관된 유전자 및 대립유전자에서의 점 돌연변이의 성공적인 교정은 치료제 및 기본적 연구에서의 적용과 함께 유전자 교정을 위한 새로운 전략을 열고 있다. Cas9 및 데아미나제 효소 또는 도메인의 개시된 융합물과 같은 부위-특이적 단일-염기 변형 시스템은 또한 "역" 유전자 요법에서의 적용을 가지며, 여기서, 특정 유전자 기능은 고의로 억제되거나 폐지된다. 이들 경우에, Trp (TGG), Gln (CAA 및 CAG), 또는 Arg (CGA) 잔기를 조기 정지 코돈 (TAA, TAG, TGA)으로 부위-특이적으로 돌연변이시키는 것은 시험관내에서, 생체외에서, 또는 생체내에서 단백질 기능을 폐지하는 데 사용될 수 있다.
본 개시내용은 본원에 제공된 Cas9 DNA 편집 융합 단백질에 의해 교정될 수 있는 점 돌연변이와 연관되거나 그에 의해 유발되는 질환으로 진단된 대상체의 치료 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이러한 질환, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 PI3KCA 점 돌연변이와 연관된 암을 갖는 대상체에게, 점 돌연변이를 교정하거나, 탈활성화 돌연변이를 질환-연관된 유전자 내로 도입하는 Cas9 데아미나제 융합 단백질의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 질환은 증식성 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 유전 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 신생물성 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 대사 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 리소솜 축적 질환이다. 점 돌연변이를 교정하거나, 탈활성화 돌연변이를 질환-연관된 유전자 내로 도입함으로써 치료될 수 있는 다른 질환은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이며, 본 개시내용은 이와 관련하여 제한되지 않는다.
본 개시내용은 추가의 질환 또는 장애, 예를 들어, 데아미나제-매개된 유전자 편집에 의해 교정될 수 있는 점 돌연변이와 연관되거나 그에 의해 유발되는 질환 또는 장애의 치료 방법을 제공한다. 일부 이러한 질환은 본원에 기재되어 있으며, 본원에 제공된 전략 및 융합 단백질로 치료될 수 있는 추가의 적합한 질환은 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예시적인 적합한 질환 및 장애는 하기에 열거된다. 각각의 서열에서의 특정 위치 또는 잔기의 넘버링은 특정한 단백질 및 사용되는 넘버링 스킴에 따라 달라지는 것으로 이해될 것이다. 넘버링은 예를 들어, 성숙 단백질의 전구체 및 성숙 단백질 그 자체에서 상이할 수 있으며, 종에서 종까지의 서열의 차이는 넘버링에 영향을 미칠 수 있다. 관련 기술분야이 통상의 기술자는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어 서열 정렬 및 상동 잔기의 측정에 의해 임의의 상동 단백질에서 및 각각의 코딩 핵산에서 각각의 잔기를 확인할 수 있을 것이다. 예시적인 적합한 질환 및 장애로는 비제한적으로 낭성 섬유증 (예를 들어, 문헌 [Schwank et al., Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell. 2013; 13: 653-658; 및 Wu et al., Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell stem cell. 2013; 13: 659-662] 참조, 이들 중 어느 것도 유전적 결한다는 것을 교정하기 위해 데아미나제 융합 단백질을 사용하지 않음); 페닐케톤뇨 - 예를 들어, 페닐알라닌 히드록실라제 유전자에서의 위치 835 (마우스) 또는 240 (인간) 또는 상동 잔기에서 페닐알라닌에서 세린으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [McDonald et al., Genomics. 1997; 39:402-405] 참조; 버나드-술리에 증후군 (BSS) - 예를 들어, 혈소판 막 당단백질 IX에서의 위치 55 또는 상동 잔기에서 페닐알라닌에서 세린으로의 돌연변이, 또는 잔기 24 또는 상동 잔기에서 시스테인에서 아르기닌으로의 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Noris et al., British Journal of Haematology. 1997; 97: 312-320, 및 Ali et al., Hematol. 2014; 93: 381-384] 참조; 표피박리성 과다각화증 (EHK) - 예를 들어, 케라틴 1에서의 위치 160 또는 161 (개시제 메티오닌을 카운팅하는 경우) 또는 상동 잔기에서 류신에서 프롤린으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Chipev et al., Cell. 1992; 70: 821-828] 참조, 또한 www[dot]uniprot[dot]org에서 유니프롯 데이터베이스에서 수탁 번호 P04264 참조; 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) - 예를 들어, α1-항티로신의 프로세싱된 형태에서의 위치 54 또는 55 (개시제 메티오닌을 카운팅하는 경우) 또는 상동 잔기에서, 또는 비프로세싱된 형태에서의 잔기 78 또는 상동 잔기에서 류신에서 프롤린으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Poller et al., Genomics. 1993; 17: 740-743] 참조, 또한 유니프롯 데이터베이스에서 수탁 번호 P01011 참조; 샤르코-마리-투스병 유형 4J - 예를 들어, FIG4에서의 위치 41 또는 상동 잔기에서 이소류신에서 트레오닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Lenk et al., PLoS Genetics. 2011; 7: e1002104] 참조; 신경모세포종 (NB) - 예를 들어, 카스파제-9에서의 위치 197 또는 상동 잔기에서 류신의 프롤린으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Kundu et al., 3 Biotech. 2013, 3:225-234] 참조; 폰 빌레브란트병 (vWD) - 예를 들어, 폰 빌레브란트 인자의 프로세싱된 형태에서의 위치 509 또는 상동 잔기에서, 또는 폰 빌레브란트 인자의 비프로세싱된 형태에서의 위치 1272 또는 상동 잔기에서 시스테인에서 아르기닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Lavergne et al., Br. J. Haematol. 1992; 82: 66-72] 참조, 또한 유니프롯 데이터베이스에서 수탁 번호 P04275 참조; 선천성 근긴장증 - 예를 들어, 근육 클로라이드 채널 유전자 CLCN1에서의 위치 277 또는 상동 잔기에서 시스테인에서 아르기닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Weinberger et al., The J. of Physiology. 2012; 590: 3449-3464] 참조; 유전성 신장 아밀로이드증 - 예를 들어, 아포지단백질 AII의 프로세싱된 형태에서의 위치 78 또는 상동 잔기에서, 또는 비프로세싱된 형태에서의 위치 101 또는 상동 잔기에서 정지 코돈에서 아르기닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Yazaki et al., Kidney Int. 2003; 64: 11-16] 참조; 확장성 심근병증 (DCM) - 예를 들어, FOXD4 유전자에서의 위치 148 또는 상동 잔기에서 트립토판에서 아르기닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이), 예를 들어, 문헌 [Minoretti et al., Int. J. of Mol. Med. 2007; 19: 369-372] 참조; 유전성 림프부종 - 예를 들어, VEGFR3 티로신 키나제에서의 위치 1035 또는 상동 잔기에서 히스티딘에서 아르기닌으로의 돌연변이 (A>G 돌연변이), 예를 들어, 문헌 [Irrthum et al., Am. J. Hum. Genet. 2000; 67: 295-301] 참조; 가족성 알츠하이머병 - 예를 들어, 프레세닐린1에서의 위치 143 또는 상동 잔기에서 이소류신에서 발린으로의 돌연변이 (A>G 돌연변이), 예를 들어, 문헌 [Gallo et al., J. Alzheimer's disease. 2011; 25: 425-431] 참조; 프리온 질환 - 예를 들어, 프리온 단백질에서의 위치 129 또는 상동 잔기에서 메티오닌에서 발린으로의 돌연변이 (A>G 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Lewis et al., J. of General Virology. 2006; 87: 2443-2449] 참조; 만성 영아 신경학적 피부 관절 증후군 (CINCA) - 예를 들어, 크리오피린에서의 위치 570 또는 상동 잔기에서 티로신에서 시스테인으로의 돌연변이 (A>G 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Fujisawa et al. Blood. 2007; 109: 2903-2911] 참조; 및 데스민-관련 근병증 (DRM) - 예를 들어, αβ 크리스탈린에서의 위치 120 또는 상동 잔기에서 아르기닌에서 글리신으로의 돌연변이 (A>G 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Kumar et al., J. Biol. Chem. 1999; 274: 24137-24141] 참조를 포함한다. 모든 참고문헌 및 데이터베이스 엔트리의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원에 개시된 바와 같은 Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질을 표적 부위, 예를 들어, 편집되는 점 돌연변이를 포함하는 부위에 표적화하기 위해, 전형적으로 Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질을 가이드 RNA, 예를 들어, sgRNA와 함께 공동-발현시킬 필요가 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본원의 다른 곳에서 보다 상세히 설명된 바와 같이, 가이드 RNA는 전형적으로 Cas9 결합을 허용하는 tracrRNA 프레임워크, 및 가이드 서열을 포함하며, 이는 Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질에 서열 특이성을 부여한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 구조 5'-[가이드 서열]-guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuu-3' (서열식별번호: 618)를 포함하고, 여기서, 가이드 서열은 표적 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 가이드 서열은 전형적으로 20개 뉴클레오티드 길이이다. Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질을 특이적 게놈 표적 부위에 표적화하는 데 적합한 가이드 RNA의 서열은 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이러한 적합한 가이드 RNA 서열은 전형적으로 편집되는 표적 뉴클레오티드의 50개 뉴클레오티드 상류 또는 하류 내의 핵산 서열에 상보적인 가이드 서열을 포함한다. Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질을 특이적 표적 서열에 표적화하는 데 적합한 일부 예시적인 가이드 RNA 서열은 하기에 제공된다.
염기 편집제 효율
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 염기 편집제 중 임의의 것이 유의한 비율의 indel을 생성하지 않고 특이적 뉴클레오티드 염기를 변형시킬 수 있다는 인식에 기초한다. 본원에 사용된 "indel"은 핵산 내의 뉴클레오티드 염기의 삽입 또는 결실을 지칭한다. 이러한 삽입 또는 결실은 유전자의 코딩 영역 내의 격자 이동 돌연변이를 발생시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산에서 다수의 삽입 또는 결실 (즉, indel)을 생성하지 않고, 핵산 내의 특이적 뉴클레오티드를 효율적으로 변형시키는 (예를 들어 돌연변이시키거나 탈아미노화하는) 염기 편집제를 생성하는 것이 바람직하다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 편집제 중 임의의 것은 보다 큰 비율의 의도된 변형 (예를 들어, 점 돌연변이 또는 탈아미노화) 대 indel을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 편집제는 1:1 초과인 의도된 점 돌연변이 대 indel의 비를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 편집제는 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 2.5:1, 적어도 3:1, 적어도 3.5:1, 적어도 4:1, 적어도 4.5:1, 적어도 5:1, 적어도 5.5:1, 적어도 6:1, 적어도 6.5:1, 적어도 7:1, 적어도 7.5:1, 적어도 8:1, 적어도 10:1, 적어도 12:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 30:1, 적어도 40:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 200:1, 적어도 300:1, 적어도 400:1, 적어도 500:1, 적어도 600:1, 적어도 700:1, 적어도 800:1, 적어도 900:1, 또는 적어도 1000:1, 또는 그보다 큰 의도된 점 돌연변이 대 indel의 비를 생성할 수 있다. 의도된 돌연변이 및 indel의 수는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 하기 실시예에서 사용된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 편집제는 핵산의 영역에서의 indel의 형성을 제한할 수 있다. 일부 실시양태에서, 영역은 염기 편집제에 의해 표적화된 뉴클레오티드, 또는 염기 편집제에 의해 표적화된 뉴클레오티드의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 뉴클레오티드 내의 영역에 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 편집제 중 임의의 것은 핵산의 영역에서의 indel의 형성을 1% 미만, 1.5% 미만, 2% 미만, 2.5% 미만, 3% 미만, 3.5% 미만, 4% 미만, 4.5% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 10% 미만, 12% 미만, 15% 미만, 또는 20% 미만으로 제한할 수 있다. 핵산 영역에서 형성된 indel의 수는 핵산 (예를 들어, 세포의 게놈 내의 핵산)이 염기 편집제에 노출된 시간의 양에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, indel의 수 또는 비율은 핵산 (예를 들어, 세포의 게놈 내의 핵산)을 염기 편집제에 노출시킨 후 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 6시간, 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 7일, 적어도 10일, 또는 적어도 14일에 측정된다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 염기 편집제 중 임의의 것이 유의한 수의 비의도된 돌연변이, 예컨대 비의도된 점 돌연변이를 생성하지 않고 핵산 (예를 들어 대상체의 게놈 내의 핵산)에서 의도된 돌연변이, 예컨대 점 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있다는 인식에 기초한다. 일부 실시양태에서, 의도된 돌연변이는 의도된 돌연변이를 생성하도록 특이적으로 설계된 gRNA에 결합된 특이적 염기 편집제에 의해 생성된 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 의도된 돌연변이는 질환 또는 장애와 연관된 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 의도된 돌연변이는 질환 또는 장애와 연관된 시토신 (C)에서 티민 (T)으로의 점 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 의도된 돌연변이는 질환 또는 장애와 연관된 구아닌 (G)에서 아데닌 (A)으로의 점 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 의도된 돌연변이는 유전자의 코딩 영역 내의 시토신 (C)에서 티민 (T)으로의 점 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 의도된 돌연변이는 유전자의 코딩 영역 내의 구아닌 (G)에서 아데닌 (A)으로의 점 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 의도된 돌연변이는 정지 코돈, 예를 들어, 유전자의 코딩 영역 내의 조기 정지 코돈을 생성하는 점 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 의도된 돌연변이는 정지 코돈을 제거하는 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 의도된 돌연변이는 유전자의 스플라이싱을 변경시키는 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 의도된 돌연변이는 유전자의 조절 서열 (예를 들어, 유전자 프로모터 또는 유전자 리프레서)을 변경시키는 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 편집제 중 임의의 것은 1:1 초과인 의도된 돌연변이 대 비의도된 돌연변이의 비 (예를 들어, 의도된 점 돌연변이:비의도된 점 돌연변이)를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 편집제 중 임의의 것은 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 2.5:1, 적어도 3:1, 적어도 3.5:1, 적어도 4:1, 적어도 4.5:1, 적어도 5:1, 적어도 5.5:1, 적어도 6:1, 적어도 6.5:1, 적어도 7:1, 적어도 7.5:1, 적어도 8:1, 적어도 10:1, 적어도 12:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 30:1, 적어도 40:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 150:1, 적어도 200:1, 적어도 250:1, 적어도 500:1, 또는 적어도 1000:1, 또는 그보다 큰 의도된 돌연변이 대 비의도된 돌연변이의 비 (예를 들어, 의도된 점 돌연변이:비의도된 점 돌연변이)를 생성할 수 있다. 본원에서 "염기 편집제 효율" 섹션에 기재된 염기 편집제의 특징은 본원에 제공된 융합 단백질, 또는 융합 단백질을 사용하는 방법 중 임의의 것에 적용될 수 있다는 것이 인지되어야 한다.
핵산을 편집하는 방법
본 개시내용의 일부 측면은 핵산을 편집하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 핵산의 핵염기 (예를 들어, 이중-가닥 DNA 서열의 염기 쌍)를 편집하는 방법이다. 일부 실시양태에서, 방법은 a) 핵산의 표적 영역 (예를 들어, 이중-가닥 DNA 서열)을 염기 편집제 (예를 들어, 시티딘 데아미나제 도메인에 융합된 Cas9 도메인) 및 가이드 핵산 (예를 들어, gRNA)을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계이며, 여기서 표적 영역은 표적화된 핵염기 쌍을 포함하는 것인 단계, b) 상기 표적 영역의 가닥 분리를 유도하는 단계, c) 표적 영역의 단일 가닥에서의 상기 표적 핵염기 쌍의 제1 핵염기를 제2 핵염기로 전환시키는 단계, 및 d) 상기 표적 영역의 1개 이하의 가닥을 절단하는 단계이며, 여기서 제1 핵염기 염기에 상보적인 제3 핵염기는 제2 핵염기에 상보적인 제4 핵염기에 의해 대체된 것인 단계를 포함하고; 방법은 핵산에서 20% 미만의 indel 형성을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 단계 b는 생략됨이 인지되어야 한다. 일부 실시양태에서, 제1 핵염기는 시토신이다. 일부 실시양태에서, 제2 핵염기는 탈아미노화된 시토신, 또는 우라실이다. 일부 실시양태에서, 제3 핵염기는 구아닌이다. 일부 실시양태에서, 제4 핵염기는 아데닌이다. 일부 실시양태에서, 제1 핵염기는 시토신이고, 제2 핵염기는 탈아미노화된 시토신, 또는 우라실이고, 제3 핵염기는 구아닌이고, 제4 핵염기는 아데닌이다. 일부 실시양태에서, 방법은 19%, 18%, 16%, 14%, 12%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 미만, 또는 0.1% 미만의 indel 형성을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 제2 핵염기를 제4 핵염기에 상보적인 제5 핵염기로 대체함으로써, 의도된 편집된 염기 쌍 (예를 들어, C:G -> T:A)을 생성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제5 핵염기는 티민이다. 일부 실시양태에서, 의도된 염기 쌍의 적어도 5%가 편집된다. 일부 실시양태에서, 의도된 염기 쌍의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%가 편집된다.
일부 실시양태에서, 표적 뉴클레오티드에서의 의도된 생성물 대 비의도된 생성물의 비는 적어도 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 또는 200:1, 또는 그보다 크다. 일부 실시양태에서, 의도된 점 돌연변이 대 indel 형성의 비는 1:1, 10:1, 50:1, 100:1, 500:1, 또는 1000:1 초과, 또는 그보다 크다. 일부 실시양태에서, 절단된 단일 가닥 (니킹된 가닥)은 가이드 핵산에 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 절단된 단일 가닥은 제1 핵염기를 포함하는 가닥에 대향한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 Cas9 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 염기는 시토신이고, 제2 염기는 G, C, A, 또는 T가 아니다. 일부 실시양태에서, 제2 염기는 우라실이다. 일부 실시양태에서, 제1 염기는 시토신이다. 일부 실시양태에서, 제2 염기는 G, C, A, 또는 T가 아니다. 일부 실시양태에서, 제2 염기는 우라실이다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 편집된 가닥의 염기 절제 복구를 억제한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 비-편집된 가닥을 보호하거나 그에 결합한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 UGI 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 니카제 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 상류이다. 일부 실시양태에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드 상류이다. 일부 실시양태에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 하류이다. 일부 실시양태에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드 하류 스트림이다. 일부 실시양태에서, 방법은 정규 (예를 들어, NGG) PAM 부위를 요구하지 않는다. 일부 실시양태에서, 핵염기 편집제는 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 1 내지 25개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 5 내지 20개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 표적 영역은 표적 윈도우를 포함하고, 표적 윈도우는 표적 핵염기 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 윈도우는 1 내지 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 윈도우는 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 표적 윈도우는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 표적 윈도우 내에 있다. 일부 실시양태에서, 표적 윈도우는 의도된 편집된 염기 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 제공된 염기 편집제 중 임의의 것을 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 표적 윈도우는 탈아미노화 윈도우이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 뉴클레오티드를 편집하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 이중-가닥 DNA 서열의 핵염기 쌍을 편집하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 a) 이중-가닥 DNA 서열의 표적 영역을 염기 편집제 및 가이드 핵산 (예를 들어, gRNA)을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계이며, 여기서 표적 영역은 표적 핵염기 쌍을 포함하는 것인 단계, b) 상기 표적 영역의 가닥 분리를 유도하는 단계, c) 표적 영역의 단일 가닥에서의 상기 표적 핵염기 쌍의 제1 핵염기를 제2 핵염기로 전환시키는 단계, d) 상기 표적 영역의 1개 이하의 가닥을 절단하는 단계를 포함하고, 제1 핵염기 염기에 상보적인 제3 핵염기는 제2 핵염기에 상보적인 제4 핵염기에 의해 대체되고, 제2 핵염기는 제4 핵염기에 상보적인 제5 핵염기로 대체됨으로써, 의도된 편집된 염기 쌍을 생성하고, 의도된 편집된 염기 쌍을 생성하는 효율은 적어도 5%이다. 일부 실시양태에서, 단계 b는 생략됨이 인지되어야 한다. 일부 실시양태에서, 의도된 염기 쌍의 적어도 5%가 편집된다. 일부 실시양태에서, 의도된 염기 쌍의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%가 편집된다. 일부 실시양태에서, 방법은 19%, 18%, 16%, 14%, 12%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 미만, 또는 0.1% 미만의 indel 형성을 유발한다. 일부 실시양태에서, 표적 뉴클레오티드에서의 의도된 생성물 대 비의도된 생성물의 비는 적어도 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 또는 200:1, 또는 그보다 크다. 일부 실시양태에서, 의도된 점 돌연변이 대 indel 형성의 비는 1:1, 10:1, 50:1, 100:1, 500:1, 또는 1000:1 초과, 또는 그보다 크다. 일부 실시양태에서, 절단된 단일 가닥은 가이드 핵산에 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 절단된 단일 가닥은 제1 핵염기를 포함하는 가닥에 대향한다. 일부 실시양태에서, 제1 염기는 시토신이다. 일부 실시양태에서, 제2 핵염기는 G, C, A, 또는 T가 아니다. 일부 실시양태에서, 제2 염기는 우라실이다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 편집된 가닥의 염기 절제 복구를 억제한다. 일부 실시양태에서, 염기 편집제는 비-편집된 가닥을 보호하거나 그에 결합한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 편집제는 UGI 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 편집제는 니카제 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 상류이다. 일부 실시양태에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드 상류이다. 일부 실시양태에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 하류이다. 일부 실시양태에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 PAM 부위의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드 하류 스트림이다. 일부 실시양태에서, 방법은 정규 (예를 들어, NGG) PAM 부위를 요구하지 않는다. 일부 실시양태에서, 핵염기 편집제는 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 1 내지 25개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 5 내지 20개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 표적 영역은 표적 윈도우를 포함하고, 표적 윈도우는 표적 핵염기 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 윈도우는 1 내지 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 윈도우는 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 표적 윈도우는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 의도된 편집된 염기 쌍은 표적 윈도우 내에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 표적 윈도우는 의도된 편집된 염기 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 편집제는 본원에 제공된 염기 편집제 중 어느 하나이다.
제약 조성물
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 융합 단백질, gRNA, 및/또는 복합체 중 임의의 것은 제약 조성물의 일부로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 제공된 복합체 중 임의의 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 gRNA 및 양이온성 지질과의 복합체를 형성하는 RNA-가이드된 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)를 포함하는 리보핵단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서 제약 조성물은 gRNA, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질, 양이온성 지질, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 제약 조성물은 1종 이상의 추가의 치료 활성 물질을 임의로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 대상체 내에서 표적화된 게놈 변형을 실시하기 위해 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체로부터 수득되고 본원에 제공된 제약 조성물 중 임의의 것과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터 제거되고, 생체외에서 제약 조성물과 접촉된 세포는 임의로 목적하는 게놈 변형이 세포에서 실시되거나 검출된 후, 대상체 내로 재-도입된다. 뉴클레아제를 포함하는 제약 조성물을 전달하는 방법은 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824에 기재되며, 이들 모두의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 제공된 제약 조성물의 설명은 원칙적으로 인간에의 투여에 적합한 제약 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물은 일반적으로 모든 종류의 동물 또는 유기체에의 투여에 적합하다는 것이 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 인간에 대한 투여에 적합한 제약 조성물을 다양한 동물에게 투여하기에 적합하게 만들기 위해 조성물을 변형시키는 것은 널리 이해되며, 통상의 숙련된 수의학 약리학자는, 존재하는 경우, 단지 통상의 실험에 의해 이러한 변형을 설계하고/거나 수행할 수 있다. 제약 조성물이 투여되는 것으로 고려되는 대상체는 인간 및/또는 다른 영장류; 포유동물, 가축, 애완용 동물, 및 상업적으로 관련된 포유동물, 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스, 및/또는 래트; 및/또는 조류 (상업적으로 관련된 조류, 예컨대 치킨, 오리, 거위 및/또는 칠면조 포함)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 제약 조성물의 제제는 약리학 기술분야에 공지되어 있거나 또는 이후에 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분(들)을 부형제 및/또는 1종 이상의 보조 성분과 회합시킨 후, 필요할 경우 및/또는 바람직할 경우, 생성물을 목적하는 단일- 또는 다중-투여 단위로 성형 및/또는 패키징하는 단계를 포함한다.
제약 제제는 추가로 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있고, 이는 본원에 사용된 바와 같은, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 희석제, 또는 다른 액체 비히클, 분산액 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제 등을 목적하는 특정한 투여에 적합한 것으로서 포함한다. 그 전문이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)]에는 제약 조성물을 제형화하는 데 사용된 각종 부형제 및 그의 제조를 위한 공지된 기술이 개시되어 있다. 또한, 뉴클레아제를 포함하는 제약 조성물을 제조하기 위한 추가의 적합한 방법, 시약, 부형제 및 용매에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함된 PCT 출원 PCT/US2010/055131 (공개 번호 WO2011053982 A8, 2010년 11월 2일에 출원됨)을 참조한다. 임의의 통상적인 부형제 매질이, 예컨대 임의의 목적하지 않은 생물학적 효과를 생성하거나 또는 달리 제약 조성물의 임의의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용함으로써 물질 또는 그의 유도체와 비상용성인 경우를 제외하고, 그의 사용은 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 고려된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따르는 조성물은 하기 중 1종 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 질환, 장애 및/또는 상태 중 임의의 것을 치료하는 데 사용될 수 있다: 자가면역 장애 (예를 들어, 당뇨병, 루푸스, 다발성 경화증, 건선, 류마티스성 관절염); 염증성 장애 (예를 들어, 관절염, 골반 염증성 질환); 감염성 질환 (예를 들어, 바이러스 감염 (예를 들어, HIV, HCV, RSV), 박테리아 감염, 진균 감염, 패혈증); 신경계 장애 (예를 들어, 알츠하이머병, 헌팅턴병; 자폐증; 뒤시엔느 근육 이영양증); 심혈관 장애 (예를 들어, 아테롬성동맥경화증, 고콜레스테롤혈증, 혈전증, 응고 장애, 혈관신생 장애, 예컨대 황반 변성); 증식성 장애 (예를 들어, 암, 양성 신생물); 호흡기 장애 (예를 들어, 만성 폐쇄성 폐 질환); 소화 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환, 궤양); 근골격 장애 (예를 들어, 섬유근육통, 관절염); 내분비, 대사 및 영양 장애 (예를 들어, 당뇨병, 골다공증); 비뇨기 장애 (예를 들어, 신질환); 심리 장애 (예를 들어, 우울증, 정신분열증); 피부 장애 (예를 들어, 상처, 습진); 혈액 및 림프성 장애 (예를 들어, 빈혈, 혈우병) 등.
키트, 벡터, 세포
본 개시내용의 일부 측면은 (a) 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 단백질 또는 Cas9 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 (b) (a)의 서열의 발현을 유도하는 이종 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 가이드 RNA 백본을 코딩하는 발현 구축물을 추가로 포함하고, 구축물은 표적 서열과 동일하거나 그에 상보적인 핵산 서열의 가이드 RNA 백본 내로의 클로닝을 허용하도록 위치된 클로닝 부위를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 바와 같은 융합 단백질의 Cas9 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 개시내용의 일부 측면은 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 이종 프로모터를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 단백질, 융합 단백질, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자, Cas9 단백질 및 gRNA를 포함하는 복합체, 및/또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
상기 리포터 시스템의 예시적인 실시양태의 설명은 단지 예시 목적으로 제공되며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 추가의 리포터 시스템, 예를 들어, 상기 상세히 기재된 예시적인 시스템의 변형이 또한 본 개시내용에 의해 포함된다.
실시예
실시예 1: Cas9 데아미나제 융합 단백질
다수의 Cas9:데아미나제 융합 단백질을 생성하고, 생성된 융합물의 데아미나제 활성을 특징화하였다. 하기 데아미나제를 시험하였다:
인간 AID (hAID):
Figure pct00117
인간 AID-DC (hAID-DC, 7-배 증가된 활성을 갖는 hAID의 말단절단된 버전):
Figure pct00118
래트 APOBEC1 (rAPOBEC1):
Figure pct00119
인간 APOBEC1 (hAPOBEC1)
Figure pct00120
페트로미존 마리누스 (칠성장어) CDA1 (pmCDA1):
Figure pct00121
인간 APOBEC3G (hAPOBEC3G):
Figure pct00122
ssDNA에 대한 데아미나제 활성. 탈아미노화를 위한 USER (우라실-특이적 절제 시약) 효소-기반 검정을 사용하여 단일-가닥 DNA (ssDNA) 기질에 대한 다양한 데아미나제의 활성을 시험하였다. USER 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터 입수하였다. 상이한 위치에 표적 시토신 잔기를 갖는 ssDNA 기질을 제공받았다. ssDNA 시토신 표적 잔기의 탈아미노화는 표적 시토신의 우라실로의 전환을 발생시킨다. USER 효소는 우라실 염기를 절제하고, 그 위치에서 ssDNA 백본을 절단하며, 이는 ssDNA 기질을 DNA의 2개의 보다 짧은 단편으로 절단한다. 일부 검정에서, ssDNA 기질은 한 말단 상에 염료로, 예를 들어, 5' Cy3 표지 (하기 식에서 *)로 표지된다. 탈아미노화, 절제, 및 가닥의 절단시, 기질은 전기영동으로 처리될 수 있으며, 기질 및 그로부터 방출된 임의의 단편은 표지를 검출함으로써 가시화될 수 있다. Cy5가 영상인 경우, 단지 표지를 갖는 단편만이 영상화를 통해 가시적일 것이다.
한 USER 효소 검정에서, 시험된 다양한 데아미나제의 표적 서열을 매칭시킨 ssDNA 기질을 사용하였다. 시험되는 데아미나제를 코딩하는 발현 카세트를 실험실에서 이전에 사용된 CMV 백본 플라스미드 (애드진(Addgene) 플라스미드 52970) 내로 삽입하였다. 데아미나제 단백질을 TNT 퀵 커플드(Quick Coupled) 전사/번역 시스템 (프로메가(Promega))을 제조업체의 권장사항에 따라 사용하여 발현시켰다. 90분의 인큐베이션 후, 5 mL의 용해물을 5' Cy3-표지된 ssDNA 기질 및 1 단위의 USER 효소 (NEB)와 함께 3시간 동안 인큐베이션하였다. DNA를 10% TBE PAGE 겔 상에서 분해하고, DNA를 Cy-염료 영상화를 사용하여 영상화하였다. USER 효소 검정의 개략적 표현이 도 41에 나타나 있다.
도 1은 ssDNA 기질, 예컨대 도엔치(Doench) 1, 도엔치 2, G7' 및 VEGF 표적 2에 대한 시험된 데아미나제의 데아미나제 활성을 나타낸다. rAPOBEC1 효소는 정규 NGG PAM으로는 단일-가닥 DNA 기질에 대해 실질적인 양의 탈아미노화를 나타내었지만, 음성 대조군 비-정규 NNN PAM으로는 그렇지 않았다. APOBEC 패밀리 데아미나제를 갖는 Cas9 융합 단백질을 생성하였다. 하기 융합 아키텍처를 구축하고, ssDNA에 대해 시험하였다:
Figure pct00123
Figure pct00124
Figure pct00125
Figure pct00126
도 2는 N-말단 데아미나제 융합물이 단일 가닥 DNA 기질에 대해 유의한 활성을 나타내었음을 나타낸다. 이러한 이유로, 단지 N-말단 아키텍처만을 추가의 실험을 위해 선택하였다.
도 3은 데아미나제-dCas9:sgRNA 복합체에 의한 이중 가닥 DNA 기질 결합을 예시한다. 다수의 이중 가닥 데아미나제 기질 서열을 생성하였다. 서열은 하기에 제공된다. 도 3에 따른 구조는 이들 서열에서 확인된다 (36bp: 밑줄표시됨, sgRNA 표적 서열: 볼드체; PAM: 박스표시됨; 21bp: 이탤릭체). 모든 기질은 5'-Cy3 표지로 표지하였다:
Figure pct00127
*"8U"를 제외한 모든 기질에서, 도 3에서의 상부 가닥은 여기에 특정된 서열의 보체이다. "8U"의 경우, U 반대편에는 "G"가 있다.
도 4는 이중 가닥 DNA 탈아미노화 검정의 결과를 나타낸다. 융합물을 발현시키고, Ni-NTA 및 세파로스 크로마토그래피 둘 다를 통해 N-말단 His6 태그로 정제하였다. dsDNA 기질에 대한 탈아미노화를 평가하기 위해, 이전의 슬라이드 상에 나타난 다양한 dsDNA 기질을 1:8 dsDNA:융합 단백질 비로 인큐베이션하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 융합물의 dCas9 부분이 DNA에 결합하면, 이는 DNA에의 USER 효소의 접근을 차단한다. 따라서, 융합 단백질을 인큐베이션 후에 변성시키고, dsDNA를 스핀 칼럼 상에서 정제한 후, USER 효소와 함께 45분 동안 인큐베이션하고, 생성된 DNA 기질 및 기질 단편을 10% TBE-우레아 겔 상에서 분해하였다.
도 5는 Cas9 융합물이 이중-가닥 DNA 표적 서열의 위치 3 내지 11 (도 3에서의 개략도에 따라 넘버링됨)을 표적화할 수 있다는 것을 입증한다. 상부 겔: 1 μM rAPOBEC1-GGS-dCas9, 125 nM dsDNA, 1 당량 sgRNA. 중간 겔: 1 μM rAPOBEC1-(GGS)3-dCas9, 125 nM dsDNA, 1 당량 sgRNA. 하부 겔: 1.85 μM rAPOBEC1-XTEN-dCas9, 125 nM dsDNA, 1 당량 sgRNA. 이들 겔로부터의 데이터에 기초하여, 위치 3 내지 11 (도 3에서의 넘버링에 따름)은 시험된 융합 단백질에 의해 표적화되는 데아미나제의 활성에 충분히 노출된다. 다른 위치에의 데아미나제의 접근은 가장 가능성 있게는 dCas9 단백질에 의해 차단된다.
데이터는 추가로 단지 3개 아미노산의 링커 (GGS)가 데아미나제가 DNA의 단일 가닥 부분에 접근하는 것을 허용하는 데 최적이지 않다는 것을 나타낸다. 9개 아미노산 링커 [(GGS)3] (서열식별번호: 610) 및 보다 구조화된 16개 아미노산 링커 (XTEN)는 보다 효율적인 탈아미노화를 허용한다.
도 6은 교정 가이드 RNA, 예를 들어, 교정 sgRNA가 데아미나제 활성에 요구된다는 것을 입증한다. 겔은 데아미나제를 dCas9, 데아미나제 효소에 융합시키는 것이 서열 특이적이 되고 (예를 들어, eGFP sgRNA와의 융합물을 사용하는 것이 탈아미노화를 발생시키지 않음), 또한 dsDNA를 탈아미노화하는 능력을 데아미나제에 부여한다는 것을 나타낸다. 데아미나제 효소의 천연 기질은 ssDNA이고, sgRNA가 첨가되지 않았을 경우 탈아미노화는 발생하지 않았다. 이는 APOBEC 데아미나제 단독은 dsDNA를 탈아미노화하지 않는다는 보고된 지식과 일치한다. 데이터는 Cas9가 짧은 윈도우 내의 이중-가닥 DNA 나선을 개방하고, 이는 그 후, 시티딘 탈아미노화를 위해 APOBEC 데아미나제에 접근가능한 단일-가닥 DNA를 노출시킨다는 것을 나타낸다. 사용된 sgRNA 서열은 하기에 제공된다. 서열 (36bp: 밑줄표시됨, sgRNA 표적 서열: 볼드체; PAM: 박스표시됨; 21bp: 이탤릭체)
DNA 서열 8:
Figure pct00128
교정 sgRNA 서열 (부분적 3' 서열):
Figure pct00129
eGFP sgRNA 서열 (부분적 3'-서열):
Figure pct00130
실시예 2: DNA 표적 서열의 탈아미노화
예시적인 탈아미노화 표적. 본원에 기재된 dCas9:데아미나제 융합 단백질은 시험관내에서 또는 생체외에서 세포에, 또는 생체내에서 대상체에 전달될 수 있으며, 표적 뉴클레오티드가 PAM에 관하여 위치 3 내지 11에 있는 경우, C에서 T로의 또는 G에서 A로의 전위를 실시하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 탈아미노화 표적은 비제한적으로 하기를 포함한다: CCR5 말단절단: CCR5의 Q93, Q102, Q186, R225, W86, 또는 Q261을 코딩하는 코돈 중 임의의 것은 탈아미노화되어 정지 코돈을 생성할 수 있으며, 이는 HIV 치료에서 적용되는 CCR5의 비관능적 말단절단을 발생시킨다. APOE4 돌연변이: C11R 및 C57R 돌연변이체 APOE4 단백질을 코딩하는 돌연변이체 코돈은 탈아미노화되어 알츠하이머 치료에서 적용되는 야생형 아미노산으로 복귀될 수 있다. eGFP 말단절단: Q158, Q184, Q185를 코딩하는 코돈 중 임의의 것은 탈아미노화되어 정지 코돈을 생성할 수 있거나, M1을 코딩하는 코돈은 탈아미노화되어 I을 코딩할 수 있으며, 이들 모두는 eGFP 형광의 상실을 발생시키고, 리포터 시스템에서 적용된다. eGFP 복원: 실질적 형광을 나타내지 않는 T65A 또는 Y66C 돌연변이체 GFP를 코딩하는 돌연변이체 코돈은 탈아미노화되어 야생형 아미노산을 복원하고, 형광을 부여할 수 있다. PIK3CA 돌연변이: K111E 돌연변이체 PIK3CA를 코딩하는 돌연변이체 코돈은 탈아미노화되어 암에서 적용되는 야생형 아미노산 잔기를 복원할 수 있다. CTNNB1 돌연변이: T41A 돌연변이체 CTNNB1을 코딩하는 돌연변이체 코돈은 탈아미노화되어 암에서 적용되는 야생형 아미노산 잔기를 복원할 수 있다. HRAS 돌연변이: Q61R 돌연변이체 HRAS를 코딩하는 돌연변이체 코돈은 탈아미노화되어 암에서 적용되는 야생형 아미노산 잔기를 복원할 수 있다. P53 돌연변이: Y163C, Y236C, 또는 N239D 돌연변이체 p53을 코딩하는 돌연변이체 코돈 중 임의의 것은 탈아미노화되어 암에서 적용되는 야생형 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 이중-가닥 DNA에서의 이들 표적 서열을 탈아미노화하는 것의 실시가능성은 도 7 및 8에서 입증된다. 도 7은 데아미나제-dCas9:sgRNA 복합체에 의한 생체내 표적 서열의 표적 DNA 결합의 메카니즘을 예시한다.
도 8은 예시적인 질환-연관된 표적 서열의 성공적인 탈아미노화를 나타낸다. 상부 겔: CCR5 Q93: 위치 10에서의 코딩 가닥 표적 (위치 2, 5, 6, 8, 9에서의 잠재적 오프-타겟); CCR5 Q102: 위치 9에서의 코딩 가닥 표적 (위치 1, 12, 14에서의 잠재적 오프-타겟); CCR5 Q186: 위치 9에서의 코딩 가닥 표적 (위치 1, 5, 15에서의 잠재적 오프-타겟); CCR5 R225: 위치 6에서의 코딩 가닥 표적 (잠재적 오프-타겟 없음); eGFP Q158: 위치 5에서의 코딩 가닥 표적 (위치 1, 13, 16에서의 잠재적 오프-타겟); eGFP Q184 /185: 위치 4 및 7에서의 코딩 가닥 표적 (위치 3, 12, 14, 15, 16, 17, 18에서의 잠재적 오프-타겟); eGFP M1: 위치 12에서의 주형 가닥 표적 (위치 2, 3, 7, 9, 11에서의 잠재적 오프-타겟) (표적 위치 7 및 9를 작은 정도로 표적화함); eGFP T65A: 위치 7에서의 주형 가닥 표적 (위치 1, 8, 17에서의 잠재적 오프-타겟); PIK3CA K111E: 위치 2에서의 주형 가닥 표적 (위치 5, 8, 10, 16, 17에서의 잠재적 오프-타겟); PIK3CA K111E: 위치 13에서의 주형 가닥 표적 (위치 11, 16, 19에서의 잠재적 오프-타겟) X. 하부 겔: CCR5 W86: 위치 2 및 3에서의 주형 가닥 표적 (위치 1, 13에서의 잠재적 오프-타겟) X; APOE4 C11R: 위치 11에서의 코딩 가닥 표적 (위치 7, 13, 16, 17에서의 잠재적 오프-타겟); APOE4 C57R: 위치 5에서의 코딩 가닥 표적) (위치 7, 8, 12에서의 잠재적 오프-타겟); eGFP Y66C: 위치 11에서의 주형 가닥 표적 (위치 1, 4 ,6, 8, 9, 16에서의 잠재적 오프-타겟); eGFP Y66C: 위치 3에서의 주형 가닥 표적 (위치 1, 8, 17에서의 잠재적 오프-타겟); CCR5 Q261: 위치 10에서의 코딩 가닥 표적 (위치 3, 5, 6, 9, 18에서의 잠재적 오프-타겟); CTNNB1 T41A: 위치 7에서의 주형 가닥 표적 (위치 1, 13, 15, 16에서의 잠재적 오프-타겟) X; HRAS Q61R: 위치 6에서의 주형 가닥 표적 (위치 1, 2, 4, 5, 9, 10, 13에서의 잠재적 오프-타겟); p53 Y163C: 위치 6에서의 주형 가닥 표적 (위치 2, 13, 14에서의 잠재적 오프-타겟); p53 Y236C: 위치 8에서의 주형 가닥 표적 (위치 2, 4에서의 잠재적 오프-타겟); p53 N239D: 위치 4에서의 주형 가닥 표적 (위치 6, 8에서의 잠재적 오프-타겟). 질환 표적의 예시적인 DNA 서열은 하기에 제공된다 (PAM (5'-NGG-3') 및 표적 위치는 박스표시됨):
Figure pct00131
Figure pct00132
실시예 3: 우라실 글리코실라제 억제제 융합물은 탈아미노화 효율을 개선시킨다
dCas9:데아미나제 융합 단백질에 의한 포유동물 세포에서의 직접적 프로그램가능한 핵염기 편집 효율은 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI)를 dCas9:데아미나제 융합 단백질에 융합시킴으로써 유의하게 개선될 수 있다.
도 9는 rAPOBEC1-XTEN-dCas9를 사용한 인간 HEK293 세포에서의 시험관내 C→T 편집 효율을 나타낸다:
Figure pct00133
프로토스페이서 서열은 하기와 같았다:
Figure pct00134
*PAM은 박스표시되어 있고, 표적 윈도우 (위치 3 내지 11) 내의 C 잔기는 넘버링되고, 볼드체이다.
도 10은 HEK293T 세포에서의 동일한 프로토스페이서 서열에 대한 C→T 편집 효율이 UGI 도메인이 rAPOBEC1:dCas9 융합 단백질에 융합되는 경우 크게 증진된다는 것을 입증한다.
Figure pct00135
도 9 및 10에서의 백분율은 표적 서열의 둘 다의 가닥의 서열분석으로부터 제시된다. 가닥 중 단지 1개만이 탈아미노화를 위한 기질이기 때문에, 이 검정에서 최대 가능한 탈아미노화 값은 50%이다. 따라서, 탈아미노화 효율은 표에 제시된 백분율의 2배이다. 예를 들어, 50%의 값은 이중-가닥 표적 서열의 100%의 탈아미노화와 관련된다. 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI)가 dCas9:데아미나제 융합 단백질 (예를 들어, rAPOBEC1-XTEN-dCas9-[UGI]-NLS)에 융합된 경우, 세포에서의 편집 효율의 유의한 증가가 관찰되었다. 이 결과는 포유동물 세포에서, U:G 염기 쌍에서 우라실 염기를 절단해 내는 DNA 복구 기구가 DNA 편집에서의 속도-제한적 과정이라는 것을 나타낸다. UGI를 dVas9:데아미나제 융합 단백질에 테더링하는 것은 편집 수율을 크게 증가시킨다.
UGI 없이, 인간 세포에서의 전형적인 편집 효율은 ~2-14% 수율 범위였다 (도 9 및 도 10, "XTEN" 엔트리). UGI (도 10, "UGI" 엔트리)로는, 편집은 ~6-40% 범위에서 관찰되었다. 따라서, UGI 융합을 사용하는 것은 HDR을 통해 점 돌연변이를 교정하는 현재의 대안적인 방법보다 더 효율적이며, 이는 또한 점 돌연변이를 교정하는 것 이외에 과량의 indel을 생성한다. cas9:데아미나제:UGI 융합물로의 처리로부터 생성되는 indel은 관찰되지 않았다.
실시예 4: 이중-가닥 DNA 절단 없는 게놈 DNA에서의 표적 뉴클레오티드의 직접적, 프로그램가능한 전환
현재의 게놈-편집 기술은 유전자 교정에 대한 제1 단계로서 이중-가닥 DNA 파괴를 관심 표적 유전자좌에서 도입한다.39,40 대부분의 유전 질환은 단일 핵염기의 상이한 핵염기로의 돌연변이로부터 발생하지만, 이러한 변화를 복귀시키기 위한 현재의 접근법은 매우 비효율적이며, 전형적으로 이중-가닥 DNA 파괴에 대한 세포의 반응의 결과로서 표적 유전자좌에서 풍부한 무작위 삽입 및 결실 (indel)을 유도한다.39,40 핵염기 편집, 즉, 이중-가닥 DNA 백본 절단을 요구하지 않고, 프로그램가능한 방식으로 하나의 표적 핵염기의 또 다른 것으로의 직접적 전환을 가능하게 하는 게놈 편집을 위한 새로운 전략의 개발이 본원에 보고된다. CRISPR/Cas9의 융합물을 조작하였으며, 가이드 RNA로 프로그램되는 능력을 보유하는 시티딘 데아미나제 효소 APOBEC1은 이중-가닥 DNA 파괴를 유도하지 않고, 시티딘의 우라실로의 직접적 전환을 매개함으로써, 주형 가닥이 표적화되는 경우, DNA 복제, DNA 복구, 또는 전사 후의 C→T (또는 G→A) 치환을 실시한다. 생성된 "핵염기 편집제"는 대략 5개 뉴클레오티드의 윈도우 내에서 시티딘을 전환시키며, 시험관내에서 인간 질환과 관련된 다양한 점 돌연변이를 효율적으로 교정할 수 있다. 4가지 형질전환된 인간 및 뮤린 세포주에서, 각각 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI)를 융합시키고, 비-편집된 가닥을 표적화하는 Cas9 니카제를 사용하는 제2- 및 제3-세대 핵염기 편집제는 핵염기 편집에 대한 세포의 DNA 복구 반응을 극복할 수 있으며, 이는 최소 (전형적으로 1% 이하) indel 형성으로 인간 세포에서 총 세포의 DNA의 37% 이하 또는 (약 15 내지 75%)의 영구적 교정을 발생시킨다. 대조적으로, 동일한 표적 상의 정규 Cas9-매개된 HDR은 4% indel 형성으로 평균 0.7% 교정을 수득하였다. 핵염기 편집제를 사용하여 인간 유방암 및 림프종 세포에서 2가지 종양형성 p53 돌연변이를 야생형 대립유전자로 복귀시켰으며, 마우스 성상세포에서 ApoE4에서의 알츠하이머병 연관된 Arg 코돈을 비-질환-연관된 Cys 코돈으로 전환시켰다. 염기 편집은 점 돌연변이의 게놈 편집의 범위 및 효율을 확장시킨다.
클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 시스템은 다양한 유기체 및 세포주에서 게놈 조작을 매개하도록 적응된 원핵생물 적응 면역계이다.41 CRISPR/Cas9 단백질-RNA 복합체는 가이드 RNA와의 염기 쌍형성을 통해 표적 DNA 서열에 국재화하며, 가이드 RNA에 의해 특정된 유전자좌에서 자연적으로 DNA 이중-가닥 파괴 (DSB)를 생성한다. DSB에 대한 반응에서, 내인성 DNA 복구 과정은 주로 비-상동 말단 연결 (NHEJ)을 통해 DNA 절단의 부위에서 무작위 삽입 또는 결실 (indel)을 발생시킨다. 상동 DNA 주형의 존재 하에서, 절단 부위 주위의 DNA는 상동성-지정 복구 (HDR)를 통해 대체될 수 있다. 질환-연관된 유전자의 간단한 교란이 충분한 경우 (예를 들어, 일부 기능 획득 질환을 치료하기 위해), 표적화된 DNA 절단, 그 후 indel 형성은 효과적일 수 있다. 그러나, 대부분의 공지된 유전 질환에 대해, 유전자의 확률적 교란이라기 보다 표적 유전자좌에서의 점 돌연변이의 교정은 질환의 기저를 이루는 원인을 다루거나 연구하는 데 필요하다.68
이 필요에 의해 동기부여되어, 연구자들은 HDR의 효율을 증가시키고, NHEJ를 억제하기 위해 깊은 노력을 투자하였다. 예를 들어, NHEJ 경로에서 필수적 효소인 리가제 IV의 소분자 억제제는 HDR 효율을 증가시키는 것으로 나타났다.42,43 그러나, 이 전략은 유사분열후 세포에서 도전중이며, 이는 전형적으로 HDR을 하향-조절하고, 그의 치료적 타당성은 비-표적 세포에서의 리가제 IV를 억제하는 것의 잠재적 위험에 의해 제한된다. 증진된 HDR 효율은 또한 화학적으로 동기화된 세포 내로의 Cas9-가이드 RNA 복합체의 시의적절한 전달에 의해 달성될 수 있으며, 이는 HDR 효율이 매우 세포-주기 의존성이기 때문이다.44 그러나, 이러한 접근법은 세포를 동기화하는 것이 매우 방해적이기 때문에 세포 배양물에서의 연구 적용에 제한된다. 이들 개발에도 불구하고, 대부분의 맥락에서 HDR을 사용하여 점 돌연변이를 대체하는 현재의 전략은 특히 비변형된, 비-분열하는 세포에서 매우 비효율적이다 (전형적으로 약 0.1 내지 5%).42,43,45,46,75 또한, HDR은 이중-가닥 파괴의 해결 동안 NHEJ와 경쟁하며, indel은 일반적으로 유전자 대체보다 더 풍부한 결과물이다. 이들 관찰은 이중-가닥 DNA 파괴를 생성하는 것에 의존하지 않는 게놈 DNA에서의 특이적 변형을 설치하는 대안적인 접근법을 개발할 필요를 강조한다. NHEJ 경로에서 필수적인 효소인 리가제 IV의 소분자 억제제는 HDR 효율을 증가시키는 것으로 나타났다.42,43 그러나, 이 전략은 유사분열후 세포에서 도전중이며, 이는 전형적으로 HDR을 하향-조절하고, 그의 치료적 타당성은 비-표적 세포에서 리가제 IV를 억제하는 것의 잠재적 위험에 의해 제한된다. 증진된 HDR 효율은 또한 화학적으로 동기화된 세포 내로의 Cas9-가이드 RNA 복합체의 시의적절한 전달에 의해 달성될 수 있으며, 이는 HDR 효율이 매우 세포-주기 의존성이기 때문이다.44 그러나, 이러한 접근법은 세포를 동기화하는 것이 매우 방해적이기 때문에 세포 배양물에서의 연구 적용에 제한된다. 일부의 경우, 성공적인 HDR의 생성물이 PAM 서열에서의 돌연변이를 함유하고, 따라서 더 이상 후속의 Cas9 변형을 위한 기질이 아니도록 HDR 주형을 설계하는 것이 가능하며, 이는 이러한 접근법이 생성물 서열에 대한 제약을 부과하긴 하지만, HDR 생성물의 전반적 수율을 증가시킨다.75 최근, 이 전략은 비-표적 가닥에 상보적인 ssDNA 공여자의 사용 및 HDR의 효율을 실질적으로 증가시키는 고-효율 리보핵단백질 (RNP) 전달에 결합되었지만, 심지어 이들 경우에도, HDR 대 NHEJ 결과의 비는 상대적으로 낮다 (< 2).83
DNA 백본 절단을 요구하지 않는 프로그램가능한 표적 유전자좌에서 하나의 핵염기의 또 다른 것으로의 전환의 직접적 촉매작용은 관심 유전자좌에서 목적하지 않은 무작위 indel을 도입하지 않는 HDR에 비한 유전자 교정의 효율을 증가시킬 수 있는 것으로 고려되었다. 그의 뉴클레아제 활성을 불활성화시키는 Asp10Ala 및 His840Ala 돌연변이를 함유하는 촉매적 데드 Cas9 (dCas9)는 가이드 RNA-프로그램된 방식으로 DNA에 결합하는 그의 능력을 보유하지만, DNA 백본을 절단하지 않는다.16,47 원칙적으로, 하나의 핵염기의 또 다른 것으로의 직접적 전환을 매개하는 효소적 또는 화학적 촉매와의 dCas9의 접합은 RNA-프로그램된 핵염기 편집을 가능하게 할 수 있다. 시토신 (C)의 탈아미노화는 시티딘 데아미나제에 의해 촉매되고29, 우라실 (U)을 발생시키며, 이는 티민 (T)의 염기 쌍형성 특성을 갖는다. 가이드 RNA-특정된 DNA 유전자좌에서 C를 U로 전환시키는 그의 능력을 시험하기 위해, dCas9를 시티딘 데아미나제 효소에 융합시켰다. 대부분의 공지된 시티딘 데아미나제는 RNA 상에서 작동하며, DNA를 수용하는 것으로 공지된 소수의 예는 단일-가닥 DNA를 요구한다.48 dCas9-표적 DNA 복합체에 대한 최근의 연구는 대체된 DNA 가닥의 적어도 9개의 뉴클레오티드가 Cas9:가이드 RNA:DNA "R-루프" 복합체의 형성시 쌍형성되지 않는다는 것을 밝혀낸다.12 사실, Cas9 R-루프 복합체의 구조에서, 대체된 DNA 가닥 상의 프로토스페이서의 최초 11개의 뉴클레오티드는 무질서하며, 이는 그의 이동이 매우 제한되지 않음을 시사한다.76 또한, 비-주형 가닥에서의 시토신에서 Cas9 니카제-유도된 돌연변이는 세포의 시티딘 데아미나제 효소에 의한 그의 접근가능성으로부터 발생할 수 있다고 추측되었다.77 dCas9-표적 DNA 복합체에 대한 최근의 연구는 비-주형 가닥 상의 적어도 26개의 염기가 Cas9가 그의 표적 DNA 서열에 결합하는 경우 쌍형성되지 않음을 밝혀내었다.49 R-루프에서의 단일-가닥 DNA의 이 스트레치의 하위세트는 dCas9-테더링된 시티딘 데아미나제가 DNA에서 C의 U로의 직접적, 프로그램가능한 전환을 실시하기 위한 기질로서 기능할 수 있다고 추론되었다 (도 11a).
4가지 상이한 시티딘 데아미나제 효소 (hAID, hAPOBEC3G, rAPOBEC1, 및 pmCDA1)를 포유동물 세포 용해물-유래된 시험관내 전사-번역 시스템에서 발현시키고, ssDNA 탈아미노화에 대해 평가하였다. 4가지 효소 중에서, rAPOBEC1은 시험된 조건 하에서 가장 높은 데아미나제 활성을 나타내었으며, dCas9 융합 실험을 위해 선택되었다 (도 36a). rAPOBEC1을 dCas9의 C-말단에 첨부하는 것은 데아미나제 활성을 폐지하지만, dCas9의 N-말단에의 융합은 ssDNA에 대한 데아미나제 활성을 비융합된 효소의 것과 대등한 수준에서 보존한다. 4가지 rAPOBEC1-dCas9 융합물을 발현시키고, 상이한 길이 및 조성의 링커로 정제하고 (도 36b), 각각의 융합물을 단일 가이드 RNA (sgRNA)-프로그램된 dsDNA 탈아미노화에 대해 시험관내에서 평가하였다 (도 11a 내지 11c 및 도 15a 내지 15d).
효율적인, 서열-특이적, sgRNA-의존성 C에서 U로의 전환이 시험관내에서 관찰되었다 (도 11a 내지 11c). 전환 효율은 9개 아미노산 길이에 걸친 rAPOBEC1-dCas9 링커를 사용한 것이 가장 컸다. 탈아미노화에 감수성인 위치 (탈아미노화 "활성 윈도우")의 수는 링커 길이가 3에서 21개 아미노산으로 확장됨에 따라 증가한다 (도 36c 내지 36f, 15a 내지 15d). 16-잔기 XTEN 링커50는 이들 2가지 특징 사이의 유망한 균형을 제공하는 것으로 밝혀졌으며, 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)에 원위인 말단을 위치 1로서 카운팅하여 프로토스페이서 내의 위치 4 내지 8에서 대략 5개의 뉴클레오티드의 효율적인 탈아미노화 윈도우를 갖는다. rAPOBEC1-XTEN-dCas9 단백질은 제1-세대 핵염기 편집제 (NBE1)로서 기능하였다.
이론적으로 C에서 T로의 핵염기 편집에 의해 교정될 수 있는 인간 질환과 관련된 7가지 돌연변이를 선택하고, 상응하는 서열의 이중-가닥 DNA 80량체를 합성하고, 시험관내에서 이들 돌연변이를 교정하는 NBE1의 능력을 평가하였다 (도 16a 내지 16b). NBE1은 시험관내에서 이들 7개의 표적 중 6개에서, 표적 C의, 또는 다중 C가 존재한 경우 활성 윈도우 내의 적어도 1개의 C의 효율적인 편집과 일치하는 생성물을 수득하였으며, 평균 겉보기 편집 효율은 44%였다 (도 16a 내지 16b). 다중 C가 탈아미노화 윈도우 내에 존재한 3가지 경우에, 이들 시토신의 일부 또는 전부의 탈아미노화의 증거가 관찰되었다. 시험된 7가지 경우 중 단지 1가지에서, 편집된 생성물의 실질적인 수율이 관찰되었다 (도 16a 내지 16b). APOBEC1 기질에 대한 바람직한 서열 컨텍스트는 CC 또는 TC인 것으로 보고되어 있지만,51 표적 유전자좌에 결합하는 dCas9에 의해 매개되는 데아미나제 및 그의 단일-가닥 DNA 기질의 증가된 유효 몰농도는 이 제한을 완화시킬 수 있는 것으로 예상되었다. NBE1의 서열 컨텍스트 일반성을 조명하기 위해, 프로토스페이서 내의 위치 7에 단일 고정된 C를 함유하는 60량체 이중-가닥 DNA 올리고뉴클레오티드, 뿐만 아니라 프로토스페이서 염기 1 내지 6 및 8 내지 13이 다른 3개의 염기의 각각으로 개별적으로 다양화된 모든 36개의 단일 돌연변이된 변이체를 편집하는 그의 능력을 검정하였다. 이들 37개의 서열의 각각을 1.9 μM NBE1, 1.9 μM의 상응하는 sgRNA, 및 125 nM DNA로 2시간 동안, 시험관내 Cas9 검정에 대한 표준 조건과 유사하게 처리하였다52. 고처리량 DNA 서열분석 (HTS)은 표적화된 가닥의 50 내지 80% C에서 U로의 전환을 밝혀내었다 (둘 다의 DNA 가닥 (이들 중 하나는 NBE1에 대한 기질이 아님)으로부터 발생한 총 서열 판독물의 25 내지 40%) (도 12a). 표적 C 주위의 뉴클레오티드는 표적 C의 바로 5'의 염기가 G가 아니라면 서열 컨텍스트에 독립적인 편집 효율에 거의 효과를 갖지 않았으며, 이 경우, 편집 효율은 실질적으로 더 낮았다 (도 12a 내지 12b). 시험관내에서의 NBE1 활성을 프로토스페이서 내의 위치 1 내지 8에서 모든 4개의 NC 모티프에 대해 평가하였다 (도 12a 내지 12b). 일반적으로, 기질에 대한 NBE1 활성은 순서 TC ≥ CC ≥ AC >GC를 따르는 것으로 관찰되었으며, 최대 편집 효율은 표적 C가 위치 7에 또는 부근에 있는 경우 달성되었다. 또한, 핵염기 편집제는 매우 혁신적인 것으로 관찰되었으며, 5-염기 활성 윈도우 내에서 동일한 DNA 가닥 상에서 모든 C의 대부분을 U로 효율적으로 전환시킬 것이다 (도 17).
BE1은 시험 튜브에서 기질을 효율적으로 프로세싱하는 반면, 세포에서, 가능한 DNA 복구 결과물의 트리는 염기 편집의 초기 U:G 생성물의 운명을 결정한다 (도 29a). 인간 세포에서의 핵염기 편집의 유효성을 시험하기 위해, NBE1 코돈 용법을 포유동물 발현에 대해 최적화하고, C-말단 핵 국재화 서열 (NLS)을 첨부하고,53 인간 게놈 전반에 걸쳐 6개의 널리 연구된 표적 부위에서 14개의 C 상의 인간 세포에서 C를 T로 전환시키는 그의 능력을 검정하였다 (도 37a).54 NBE1을 6개의 상이한 게놈 부위에 상응하는 합성 80량체와 함께 인큐베이션한 후, HTS함으로써 편집가능한 C를 시험관내에서 각각의 프로토스페이서 내에서 확인하였다 (도 13a 내지 13c, 도 29b 및 도 25). 다음으로, HEK293T 세포를 NBE1 및 6개의 표적 sgRNA 중 1개를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시키고, 3일 동안 핵염기 편집이 일어나게 하고, 게놈 DNA를 세포로부터 추출하고, 유전자좌를 HTS에 의해 분석하였다. 표적 유전자좌에서 세포에서의 C에서 T로의 편집은 모든 6가지 경우에 대해 관찰되었지만, 핵염기 편집의 효율은 총 DNA 서열의 1.1% 내지 6.3% 또는 0.8% 내지 7.7% (표적화된 가닥의 2.2% 내지 12.6%에 상응함)이며, 시험관내 핵염기 편집의 그것에 비해 효율의 6.3-배 내지 37-배 또는 5-배 내지 36-배 감소였다 (도 13a 내지 13c, 도 29b 및 도 25). T가 기질 C에 선행하는 경우 위치 4 내지 8의 전형적인 윈도우의 외부의 일부 염기 편집이 관찰되었으며, 본 발명자들은 이를 TC 기질에 대한 APOBEC1의 비통상적으로 높은 활성에 기인한다고 본다.48
U:G 헤테로듀플렉스 DNA의 존재에 대한 세포의 DNA 복구 반응이 세포에서의 핵염기 편집 효율의 큰 감소의 원인인지 질문하였다 (도 29a). 우라실 DNA 글리코실라제 (UDG)는 세포에서 DNA로부터 U의 제거를 촉매하며, 염기 절제 복구 (BER)를 개시하고, U:G 쌍의 C:G 쌍으로의 복귀가 가장 통상적인 결과물이다 (도 29a).55 비. 서브틸리스 박테리오파지 PBS1로부터의 83-잔기 단백질인 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 (UGI)는 인간 UDG 활성을 강력하게 차단한다 (IC50 = 12 pM).56 UGI를 NBE1의 C-말단에 융합시켜 제2-세대 핵염기 편집제 NBE2를 생성하고, 모든 6개의 게놈 유전자좌에 대한 편집 검정을 반복하였다. 인간 세포에서의 편집 효율은 NBE1에서보다 NBE2에서 평균 3-배 더 높았으며, 이는 서열분석된 총 DNA의 22.8% 이하 (표적화된 가닥의 45.6% 이하)의 유전자 전환 효율을 발생시킨다 (도 13a 내지 13c 및 도 29b). 인간 세포에서의 염기 편집을 시험하기 위해, BE1 코돈 용법을 포유동물 발현에 대해 최적화하고, C-말단 핵 국재화 서열 (NLS)을 첨부하였다.53
UGI를 과다발현하는 별개의 플라스미드를 NBE1과 공동-형질감염시켰을 경우, 유사한 편집 효율이 관찰되었다 (도 18a 내지 18h). 그러나, NBE1에의 UGI의 직접적 융합은 모니터링된 비-표적화된 게놈 위치에서 C에서 T로의 돌연변이의 유의한 증가를 발생시키지 않은 반면, 비융합된 UGI의 과다발현은 게놈의 다른 곳에서 C에서 T로의 돌연변이의 빈도를 검출가능하게 증가시켰다 (도 18a 내지 18h). NBE2-매개된 핵염기 편집의 일반성을 U2OS 세포에서의 동일한 6개의 게놈 표적에 대한 편집 효율을 평가함으로써 확인하고, HEK293T 세포에서의 것들과 유사한 결과를 관찰하였다 (도 19). 중요하게는, NBE2는 전형적으로 임의의 검출가능한 indel을 발생시키지 않았으며 (도 13c 및 도 29c), 이는 이중-가닥 DNA 파괴에 대한 NHEJ의 공지된 기계론적 의존성과 일치한다.57,78 함께, 이들 결과는 UGI를 NBE1에 접합시키는 것이 인간 세포에서의 핵염기 편집의 효율을 크게 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
인간 세포에서의 핵염기 편집의 영구성을, 시험된 게놈 유전자좌 중 2개에서 HEK293T 세포에서의 다중 세포 분열에 걸친 편집 효율을 모니터링함으로써 확인하였다. 게놈 DNA를 2개의 시점에서 수거하였다: NBE2 및 적절한 sgRNA를 발현하는 플라스미드로의 형질감염 후 3일, 및 세포를 계대하고, 그들을 추가의 4일 동안 성장시킨 (대략 5회의 후속적 세포 분열) 후. 비-계대된 세포 (편집은 3개의 상이한 표적 C에 대한 표적화된 가닥의 4.6% 내지 6.6%에서 관찰됨) 및 계대된 세포 (편집은 동일한 3개의 표적 C에 대한 표적화된 가닥의 4.6% 내지 6.4%에서 관찰됨) 사이에 편집 효율의 유의한 변화는 관찰되지 않았으며, 이는 핵염기 편집이 세포 분열 후 영구적이 된다는 것을 확인시켜 준다 (도 20). indel은 드문 경우에 세포의 복구 과정에 의한 U:G 병변의 프로세싱으로부터 발생할 것이며, 이는 indel을 발생시키는 것으로 공지된 단일-가닥 파괴 중간체를 포함한다.84 수백개의 내인성 U:G 병변이 자발적 시티딘 데아미나제로부터 인간 세포당 매일 생성된다는 것을 고려할 때,85 U:G 병변 복구로부터의 총 indel 빈도는 단일 표적 유전자좌에서 BE1 또는 BE2 활성을 증가시킬 가능성이 적을 것으로 예상되었다.
세포에서의 핵염기 편집의 효율을 추가로 증가시키기 위해, 비-편집된 가닥을 니킹시키는 것은, 진핵생물 미스매치 복구 기구가 미스매칭된 듀플렉스의 임의의 파괴된 가닥에 대한 직접적 DNA 복구에 대한 가닥 불연속성을 사용하기 때문에, 세포에 의해 제거되는 보다 작은 분율의 편집된 U를 발생시킬 수 있을 것으로 예상되었다 (도 29a).58, 79, 80 촉매 His 잔기는 Cas9 HNH 도메인에서의 위치 840에서 복원되었으며,47,59 이는 표적화된 C에 대향하는 G를 함유하는 비-편집된 가닥을 니킹하지만, C를 함유하는 표적 가닥을 절단하지 않는 제3-세대 핵염기 편집제 NBE3을 발생시킨다. NBE3은 Cas9에서의 Asp10Ala 돌연변이를 여전히 함유하기 때문에, 이는 이중-가닥 DNA 절단을 유도하지 않는다. 비-편집된 가닥을 니킹하는 이 전략은 인간 세포에서의 핵염기 편집 효율을 NBE2에 비해 추가의 1.4- 내지 4.8-배 증강시켰으며, 이는 HEK293T 세포에서의 동일한 6개의 인간 게놈 표적 상에 표적화된 C에서 T로의 전환을 함유하는 총 DNA 서열의 36.3% 이하를 발생시킨다 (도 13a 내지 13c 및 도 29b). 중요하게는, 평균 0.8% (6개의 상이한 유전자좌에 대해 0.2% 내지 1.6%의 범위)의 단지 작은 빈도의 indel이 NBE3 처리로부터 관찰되었다 (도 13c, 도 29c, 및 도 34). 대조적으로, 세포를 야생형 Cas9, sgRNA, 및 단일-가닥 DNA 공여자 주형으로 처리하여 이들 유전자좌 중 3개에서 HDR을 매개한 경우, 평균 단지 0.7%의 C에서 T로의 전환 효율이 관찰되었으며, 평균 3.9%의 indel 형성에 비해 훨씬 더 높았다 (도 13a 내지 13c 및 도 29c). 대립유전자 전환 대 NHEJ 결과물의 비는 BE2에 대해 평균 >1,000, BE3에 대해 23, 및 야생형 Cas9에 대해 0.17 초과였다 (도 3c). 본 발명자들은 HEK293 부위 3 및 4 게놈 유전자좌에서 HEK293T 세포에서의 다중 세포 분열에 걸친 편집 효율을 모니터링함으로써 인간 세포에서의 염기 편집의 영구성을 확인하였다 (도 38). 이들 결과는 집합적으로 핵염기 편집이 Cas9-매개된 HDR보다 인간 세포에서 훨씬 더 효율적인 표적화된 단일-염기 편집을 실시할 수 있으며, 훨씬 적거나 (NBE3), 없는 (NBE2) indel 형성을 갖는다는 것을 확립한다.
다음으로, 인간 세포에서의 NBE1, NBE2, 및 NBE3의 오프-타겟 활성을 평가하였다. Cas9, dCas9, 및 Cas9 니카제의 오프-타겟 활성은 광범위하게 연구되었다 (도 23 내지 24 및 31 내지 33).54,60-62 rAPOBEC1의 서열 선호도는 도 12a 내지 12b에서 관찰된 서열 컨텍스트 독립성과 일치하는 표적 C로부터 1개 초과의 염기의 DNA 염기에 독립적인 것으로 나타났기 때문에,63 핵염기 편집제의 잠재적 오프-타겟 활성은 오프-타겟 Cas9 결합으로부터 발생하는 것으로 가정되었다. 단지 한 부분의 Cas9 오프-타겟 부위만이 핵염기 편집을 위한 활성 윈도우 내에 C를 가질 것이기 때문에, 오프-타겟 핵염기 편집 부위는 정규 Cas9 변이체의 오프-타겟 부위의 하위세트이어야 한다. 연구된 6개의 부위의 각각에 대해, GUIDE-seq 방법을 사용하여 이전에 측정된 인간 세포에서의 상부 10개의 공지된 Cas9 오프-타겟 유전자좌를 서열분석하였다 (도 23 내지 27 및 31 내지 33).54, 61 공지된 dCas9 오프-타겟 유전자좌의 단지 하위세트에서의 검출가능한 오프-타겟 핵염기 편집 (NBE1 및 NBE2에 대해 16/34, 47%, 및 NBE3에 대해 17/34, 50%)이 관찰되었다. 모든 경우, 오프-타겟 염기-편집 기질은 5-염기 표적 윈도우 내에 C를 함유하였다. 일반적으로, 오프-타겟 C에서 T로의 전환은 오프-타겟 Cas9 뉴클레아제-매개된 게놈 변형 빈도와 평행하였다 (도 23 내지 27). 또한, 시험된 6개의 온-타겟 및 34개의 오프-타겟 유전자좌 주위의 2,500개의 별개의 시토신에서 C에서 T로의 전환을 모니터링하였으며, 이는 대략 1.8x106개의 세포로부터 유래된 총 14,700,000개의 서열 판독물을 나타내고, 비처리된 세포의 것에 비해 NBE1, NBE2, 또는 NBE3 처리시 이들 다른 부위 중 임의의 것에서 C에서 T로의 전환의 검출가능한 증가는 관찰되지 않았다 (도 28). 종합하면, 이들 발견은 핵염기 편집제의 오프-타겟 기질이 Cas9 오프-타겟 기질의 하위세트를 포함하고, 인간 세포에서의 핵염기 편집제가 여기서 사용된 방법에 의해 검출될 수 있는 수준에서 게놈 전반에 걸쳐 비표적화된 C에서 T로의 전환을 유도하지 않음을 시사한다. 비-계대된 HEK293T 세포 (편집은 BE2로는 3개의 표적 C에 대해 서열분석된 가닥의 1.8% 내지 2.6%, 및 BE3으로는 6.2% 내지 14.3%에서 관찰됨) 및 염기 편집 후 대략 5회의 세포 분열을 겪은 세포 (편집은 BE2로는 동일한 표적 C에 대해 서열분석된 가닥의 1.9% 내지 2.3%, 및 BE3으로는 6.4% 내지 14.5%에서 관찰됨) 사이에 편집 효율의 실질적인 변화는 관찰되지 않았으며, 이는 이들 세포에서의 염기 편집이 내구성이 있다는 것을 확인시켜 준다 (확장된 데이터 도 6).
마지막으로, 포유동물 세포에서의 3가지 질환-관련 돌연변이를 교정하는 핵염기 편집의 잠재력을 시험하였다. 아포지단백질 E 유전자 변이체 APOE4는 아미노산 위치 112 및 158에서 2개의 Arg 잔기를 코딩하며, 후기-발병 알츠하이머병에 대한 가장 크고 가장 통상적인 유전적 위험 인자이다.64 APOE2 (Cys112/Cys158), APOE3 (Cys112/Arg158), 및 APOE3' (Arg112/Cys158)를 포함한 위치 112 또는 158에 Cys 잔기를 갖는 ApoE 변이체는 APOE4보다 실질적으로 더 낮은 알츠하이머병 위험을 부여하는 것으로 나타났거나,65 그렇게 추정되었다.81 시험관내에서 APOE4를 APOE3'로 전환시키는 NBE1의 능력에 의해 고무되어 (도 16a 내지 16b), 이 전환은 내인성 뮤린 APOE 유전자가 인간 APOE4에 의해 대체된 불멸화 마우스 성상세포 (타코닉(Taconic))에서 시도되었다. NBE3 및 적절한 sgRNA를 코딩하는 DNA를 뉴클레오펙션에 의해 이들 성상세포 내로 전달하고 (25%의 뉴클레오펙션 효율), 게놈 DNA를 2일 후 모든 처리된 세포로부터 추출하고, 편집 효율을 HTS에 의해 측정하였다. Arg158의 Cys158로의 전환이 총 DNA 서열분석 판독물의 58 내지 75% (뉴클레오펙션된 성상세포의 44%)에서 관찰되었다 (도 14a 내지 14c 및 도 30a). 또한, 이들 C 중 모든 3개가 활성 핵염기 편집 윈도우 내에 있기 때문에 예상된 바와 같이, 코돈 158의 제3 위치에서 총 DNA의 36 내지 50% 편집 및 Leu159의 제1 위치에서 총 DNA의 38 내지 55% 편집이 관찰되었다. 그러나, 다른 2개의 C→T 전환 중 어느 것도 ApoE3' 단백질의 아미노산 서열의 변화를 발생시키지 않는데, 이는 TGC 및 TGT 둘 다가 Cys를 코딩하고, CTG 및 TTG 둘 다가 Leu를 코딩하기 때문이다. 1x106개의 세포로부터 유래된 1,500,000개 초과의 서열분석 판독물로부터, NBE3 처리 후 표적화된 유전자좌에서 1.7% indel의 증거가 관찰되었다 (도 35). 대조적으로, 야생형 Cas9 및 공여자 ssDNA로의 성상세포의 동일한 처리는 표적화된 유전자좌에서 0.1 내지 0.3% APOE4 교정 및 26 내지 40% indel을 발생시켰으며, 이는 Cas9 및 HDR을 사용한 단일-염기 교정의 이전의 보고와 일치하는 효율이다45,75 (도 30a 및 도 40a). 동일하게 처리되었지만 VEGFA 유전자좌를 표적화하는 sgRNA를 갖는 성상세포는 APOE4 염기 편집의 증거를 나타내지 않았다 (도 34 및 도 40a). 이들 결과는 어떻게 핵염기 편집제가, 심지어 그의 프로세싱성이 게놈 DNA에서 1개 초과의 뉴클레오티드 변화를 발생시키는 경우에도, 편집의 주요 생성물로서 단백질의 코딩 서열의 정확한, 단일-아미노산 변화를 실시할 수 있는 지를 입증한다. Cas9, dCas9, 및 Cas9 니카제의 오프-타겟 활성은 광범위하게 연구되었다.54, 60-62 일반적으로, BE1, BE2, 및 BE3에 의한 오프-타겟 C에서 T로의 전환은 오프-타겟 Cas9 뉴클레아제-매개된 게놈 변형 빈도와 평행하였다.
우성-음성 p53 돌연변이 Tyr163Cys 및 Asn239Asp는 여러 유형의 암과 강하게 연관된다.66-67 이들 돌연변이 둘 다는 주형 가닥 상에서 C에서 T로의 전환에 의해 교정될 수 있다 (도 16a 내지 16b). p53 Tyr163Cys 돌연변이에 대해 동형접합성인 인간 유방암 세포주 (HCC1954 세포)를 Tyr163Cys를 교정하도록 프로그램된 NBE3 및 sgRNA을 코딩하는 DNA로 뉴클레오펙션시켰다. HCC1954 세포의 뉴클레오펙션 효율은 10% 미만이었기 때문에, IRFP를 발현하는 플라스미드를 이들 세포 내로 공동-뉴클레오펙션시켜, 처리 2일 후에 형광-활성화된 세포 분류에 의해 뉴클레오펙션된 세포의 단리를 가능하게 하였다. 게놈 DNA의 HTS는 뉴클레오펙션된 HCC1954 세포의 7.6%에서 Tyr163Cys 돌연변이의 교정을 밝혀내었다 (도 30b 및 도 40a 내지 40b). 또한, p53 Asn239Asp에 대해 이형접합성인 인간 림프종 세포주 (ST486 세포)를 Asn239Asp를 교정하도록 프로그램된 NBE2 및 sgRNA를 코딩하는 DNA로 92% 뉴클레오펙션 효율로 뉴클레오펙션시켰다. Asn239Asp 돌연변이의 교정은 처리된 ST486 세포의 11% (뉴클레오펙션된 ST486 세포의 12%)에서 관찰되었다. HEK 세포에서의 발견과 일치하게, ST486 세포의 NBE2로의 처리로부터 indel이 관찰되지 않았으며, HCC1954 세포의 NBE3으로의 처리로부터 0.6% indel 형성이 관찰되었다. 프로토스페이서의 양 측의 적어도 50개 염기 쌍 내에 다른 DNA 변화는 2x105개의 세포로부터 유래된 2,000,000개 초과의 서열분석 판독물 중에서 비처리된 대조군의 것 초과의 빈도에서 검출되지 않았다 (도 14a 내지 14c, 도 30b). 이들 결과는 집합적으로, 본 발명자들의 지식으로, 다른 방법을 사용하여 현재 달성가능하지 않은 효율 및 다른 게놈 변형 사건의 결여를 갖는, 게놈 DNA에서의 3가지 질환-연관된 대립유전자의 그의 야생형 형태로의 전환을 나타낸다.
인간 유전 질환을 다루기 위한 핵염기 편집제의 잠재적 타당성을 조명하기 위해, NCBI 클린바 데이터베이스68를 원칙적으로 이 접근법에 의해 교정될 수 있는 공지된 유전 질환에 대해 조사하였다. 클린바를, 먼저 단지 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 조사한 후, 임의의 비병원성 변이체를 제거함으로써 필터링하였다. 24,670개의 병원성 SNP 중에서, 3,956개는 T에서 C로의, 또는 A에서 G로의 치환 중 어느 하나에 의해 유발된다. 이 목록을, SNP를 탈아미노화 활성 윈도우 내에 위치시킬 인근의 NGG PAM을 갖는 변이체만을 포함하도록 필터링하였으며, 이는 원칙적으로 여기에 기재된 핵염기 편집제에 의해 교정될 수 있는 1,089개의 임상적으로 관련된 병원성 유전자 변이체를 발생시킨다 (도 21).
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 편집제 중 임의의 것은 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 임의의 염기 편집제는 본원에 제공된 질환 또는 장애 중 임의의 것과 연관된 1개 이상의 돌연변이를 교정하는 데 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 예시적인 질환 또는 장애는 비제한적으로 3-메틸글루타콘산 산뇨 유형 2, 46,XY 생식선 이발생증, 4-알파-히드록시페닐피루베이트 히드록실라제 결핍, 6-피루보일-테트라하이드로프테린 신타제 결핍, 완전색맹, 산-불안정성 서브유닛 결핍, 선단이골증, 말단홍색각피증, ACTH 저항성, ACTH-독립성 대결절성 부신 증식증, 활성화 PI3K-델타 증후군, 급성 간헐성 포르피린증, 급성 골수성 백혈병, 아담스-올리버 증후군 1/5/6, 아데닐로숙시네이트 리아제 결핍, 부신백질이영양증, 성인 신경 세로이드 리포푸신증, 안구운동 실시증을 갖는 성인 발병 운동실조, 전진성 수면 위상 증후군, 연령-관련 황반 변성, 알라질 증후군, 알렉산더병, 알란-헌던-더들리 증후군, X-연관 열성 알포트 증후군, 소아기 교대 편마비, 폐정맥의 오정렬을 갖는 폐포 모세관 이형성증, 불완전 법랑질형성, 아밀로이드생성 트랜스티레틴 아밀로이드증, 근위축성 측삭 경화증, 빈혈 (G6PD 결핍으로 인한 비구형 용혈성), 빈혈 (상염색체 열성 피리독신-불응성 철적아구성), 무조증, 항트롬빈 III 결핍, 대동맥류, 재생불량성 빈혈, 아포지단백질 C2 결핍, 겉보기 미네랄로코르티코이드 과잉, 아로마타제 결핍, 부정맥유발성 우심실 심근병증, 가족성 비대성 심근병증, 비대성 심근병증, 선천성 다발성 관절구축, 아스파르틸글라이코사민뇨, 질식형 가슴 이영양증, 비타민 E 결핍을 갖는 운동실조, 운동실조 (경직성), 심방 세동, 심방 중격 결손, 비정형 용혈성-요독성 증후군, 상염색체 우성 CD11C+/CD1C+ 수지상 세포 결핍, 미토콘드리아 DNA 결실을 갖는 상염색체 우성 진행성 외안근마비, 바라이트서-윈터 증후군, 바터 증후군, 기저 신경절 석회화, 베크위드-위드만 증후군, 양성 가족성 신생아 발작, 양성 견갑골 비골 근육 이영양증, 버나드 술리에 증후군, 베타 중간성 지중해빈혈, 베타-D-만노시드축적증, 비에티 결정질 각막망막 이영양증, 담즙산 흡수장애, 바이오티니다제 결핍, 보제슨-포스만-레만 증후군, 부셰 노이하우저 증후군, 보언-콘라디 증후군, 단지증, 브라운-비알레토-반 라에레 증후군, 브루가다 증후군, 심장 부정맥, 심장얼굴피부 증후군, 심근병증, 카르네발레 증후군, 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제 II 결핍, 카펜터 증후군, 백내장, 카테콜아민 다형성 심실성 빈맥, 중심핵병, 염색체 1,9 및 16의 중심립 불안정성 및 면역결핍, 뇌 상염색체 우성 동맥병증, 뇌-눈-얼굴-골격 증후군, 세로이드 리포푸신증, 샤르코-마리-투스병, 콜레스타놀 축적 질환, 연골석회증, 연골영양장애, 만성 진행성 다발성 경화증, 조효소 Q10 결핍, 코헨 증후군, 인자 V 및 인자 VIII의 복합 결핍, 복합 면역결핍, 복합 산화성 인산화 결핍, 복합 부분적 17-알파-히드록실라제/17,20-리아제 결핍, 보체 인자 d 결핍, 완전 복합 17-알파-히드록실라제/17,20-리아제 결핍, 추체-간체 이영양증, 선천성 구축성 거미가락증, 글리코실화의 선천성 장애, 선천성 지방종증성 과도성장, 난소의 신생물, PIK3CA 관련된 과도성장 스펙트럼, 선천성 긴 QT 증후군, 선천성 근육 이영양증, 선천성 근육 비대-뇌 증후군, 선천성 근무력 증후군, 섬유 유형 불균형을 갖는 선천성 근병증, 아이쉬펠트 유형 선천성 근육 이영양증, 선천성 비진행성 야맹증, 각막 이영양증, 코넬리아 드 랑쥐 증후군, 두개골골간단 이형성증, 크리글러 나자르 증후군, 크루존 증후군, 골이영양증을 갖는 이완성 피부증, 청색증, 낭성 섬유증, 시스틴축적증, 시토크롬-c 옥시다제 결핍, 미토콘드리아 복합체 I 결핍, D-2-히드록시글루타르산 산뇨, 다논병, 미로 무형성 작은귀증 및 작은치아증을 갖는 난청 (LAMM), 난청, 아세틸-코에이 아세틸트랜스퍼라제의 결핍, 페록시다제의 결핍, UDP글루코스-헥소스-1-포스페이트 유리딜일트랜스퍼라아제의 결핍, 데제린-소타스 질환, 데스부쿠오이스 증후군, DFNA, 당뇨병 유형 2, 당뇨병-난청 증후군, 다이아몬드-블랙판 빈혈, 이영양성 이형성증, 디하이드로프테리딘 리덕타제 결핍, 디하이드로피리미디나제 결핍, 확장성 심근병증, 파종성 비정형 미코박테리아 감염, 원위 관절구축, 원위 유전성 운동신경 뉴런병증, 돈나이 바로우 증후군, 뒤시엔느 근육 이영양증, 베커 근육 이영양증, 전신성 유전 색소이상, 선천성 이상각화증, 이상긴장증, 조기 영아 간질성 뇌병증, 엘러스-단로스 증후군, 아이쉬펠트 유형 선천성 근육 이영양증, 에머리-드레이퓨스 근육 이영양증, 에나멜-신장 증후군, 역성 위축성 수포성 표피박리증, 포진성 수포성 표피박리증, 간질, 간헐성 운동실조, 가변성 홍반각피증, 적혈구생성 프로토포르피린증, 운동 불내성, 삼출성 유리체망막병증, 파브리병, 인자 V 결핍, 인자 VII 결핍, 인자 xiii 결핍, 가족성 선종성 폴립증, 유방암, 난소암, 한랭 두드러기, 만성 영아 신경학적 피부 관절 증후군, 편마비성 편두통, 고콜레스테롤혈증, 비대성 심근병증, 저알파지단백혈증, 저칼륨혈증-저마그네슘혈증, 소아 통풍, 고지단백혈증, 내장 아밀로이드증, 저인산혈증 비타민 D 불응성 구루병, FG 증후군, 외안근의 섬유증, 핀란드 선천성 신증후군, 초점성 간질, 초점성 분절성 사구체경화증, 이마코 이형성증, 전두측두엽 치매, 프룩토스-바이포스파타제 결핍, 감스토르프-볼파르트 증후군, 강글리오시드 시알리다제 결핍, GATA-1-관련 혈소판감소증, 고셔병, 거대 축삭 신경병증, 글라즈만 혈소판무력증, 사구체낭성 신장 질환, 사구체병증, 글루코코르티코이드 저항성, 글루코스-6-포스페이트 수송 결손, 글루타르산 산뇨, 글리코겐 축적 질환, 골린 증후군, 완전전뇌증, 그라실 증후군, 출혈성 모세혈관확장증, 혈색소증, 헤모글로빈 H 질환, 용혈성 빈혈, 혈구포식성 림프조직구증식증, 결장의 암종, 미레 증후군, 백질뇌병증, 유전성 인자 IX 결핍 질환, 유전성 인자 VIII 결핍 질환, 유전성 인자 XI 결핍 질환, 유전성 프룩토스뇨증, 유전성 비용종증 결장직장 신생물, 유전성 췌장염, 유전성 열변형 적혈구증, 타원적혈구증, 내장위치이상증, 이소증, 조직구성 수질성 망상세포증다증, 조직구증-림프절병증 플러스 증후군, 알돌라제 A 결핍으로 인한 HNSHA, 호로카르복실라제 신테타제 결핍, 호모시스테인증, 호웰-에반스 증후군, 포상 기태, 고칼슘뇨성 고칼슘혈증, 과면역글로불린 D, 메발론산 산뇨, 고인슐린성 저혈당증, 고칼륨혈증성 주기성 마비, 폰 오일렌부르크의 선천성 이상근긴장증, 고지단백혈증, 고망간혈증, 고메티오닌혈증, 고포스파타제혈증, 고혈압, 저마그네슘혈증, 저베타지단백혈증, 저칼슘혈증, 저생식선자극성 생식선기능저하증, 저생식선자극성 생식선기능저하증, 땀저하 외배엽 이형성증, 고-IgM 면역결핍, 땀저하 X-연관 외배엽 이형성증, 저마그네슘혈증, 부갑상선기능저하증, 특발성 섬유화 폐포염, 면역결핍, 이뮤노글로불린 A 결핍, 영아 저포스파타제증, 영아 파킨슨증-이상긴장증, 인슐린 의존성 당뇨병, 중간성 메이플 시럽뇨 질환, 좌골슬개 이형성증, 도세포 증식증, 분리성 성장 호르몬 결핍, 분리성 루트로핀 결핍, 이소발레르산 산혈증, 주버트 증후군, 소아 폴립증 증후군, 소아 망막층간분리, 칼만 증후군, 카르타게너 증후군, 쿠겔베르그-벨란더 질환, 레티스 각막 이영양증, 레베르 선천성 흑암시, 레베르 시신경 위축, 좌심실 비조밀, 라이병, 미토콘드리아 복합체 I 결핍, 요정증 증후군, 관절구축, 전각 세포 질환, 백혈구 부착 결핍, 백질이영양증, 백질뇌병증, 난소백질이영양증, L-페리틴 결핍, 리-프라우메니 증후군, 지대형 근육 이영양증-디스트로글리칸병증, 로에이스-디에쯔 증후군, 긴 QT 증후군, 대두증/자폐 증후군, 황반 각막 이영양증, 황반 이영양증, 악성 고체온 민감성, 전립선의 악성 종양, 메이플 시럽뇨 질환, 마르덴 워커 유사 증후군, 마르팡 증후군, 마리 운나 유전성 털감소증, 비만 세포 질환, 태변성 장폐쇄증, 중간-쇄 아실-코엔자임 A 데히드로게나제 결핍, 멜닉-프레이저 증후군, 정신 지체, 메로신 결함성 선천성 근육 이영양증, 중피종, 이염성 백질이영양증, 골간단 연골영양장애, 메트헤모글로빈혈증, 메틸말론산 산뇨, 호모시스틴뇨증, 소두증, 맥락망막병증, 림프부종, 소안구증, 경도 비-PKU 고페닐알라닌혈증, 미첼-릴리 증후군, 미토콘드리아 3-히드록시-3-메틸글루타릴-코에이 신타제 결핍, 미토콘드리아 복합체 I 결핍, 미토콘드리아 복합체 III 결핍, 미토콘드리아 근병증, 점액지질증 III, 뮤코폴리사카라이드증, 다중 술파타제 결핍, 근무력 증후군, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 미엘로퍼옥시다제 결핍, 미레 증후군, 근간대성 간질, 근원섬유성 근병증, 미오글로빈뇨증, 근병증, 근시, 선천성 근긴장증, 나바조 신경간병증, 네말린 근병증, 위의 신생물, 신원성 요붕증, 신결석증, 신증후군, 신경섬유종증, 중성 지질 축적 질환, 니만-피크 질환, 비-케톤성 고글라이신혈증, 누난 증후군, 누난 증후군-유사 장애, 노룸병, 황반 변성, N-말단 아세틸트랜스퍼라제 결핍, 눈피부 백색증, 눈코치아골격 이형성증, 오도 증후군, 시신경 무형성증, 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 결핍, 입얼굴손발가락 증후군, 골형성 부전증, 골화석증, 난소 이상발육, 손발톱비대증, 비표피박리성 수장족저 각피증, 파피용-르페브르 증후군, 하임-멍크 증후군, 치주염, 피부 박피 증후군, 펜드레드 증후군, 퍼옥시솜 지방 아실-코에이 리덕타제 1 장애, 퍼옥시솜 생물발생 장애, 파이퍼 증후군, 페닐케톤뇨, 페닐케톤뇨, 비-PKU 고페닐알라닌혈증, 뇌하수체 호르몬 결핍, 모공성 홍색 비강진, 결절성 다발동맥염, 다낭성 신장 질환, 다낭성 지방막형성 골발육부전, 다왜소뇌회증, 교뇌소뇌 저형성증, 한공각화증, 후측 칼럼 운동실조, 원발성 지단홍통증, 과옥살산뇨증, 진행성 가족성 간내 담즙정체, 진행성 가성 류마티스 이형성증, 프로피온산 산혈증, 가성반음양증, 가성저알도스테론증, 가성황색종 탄성섬유-유사 장애, 퓨린-뉴클레오시드 포스포릴라제 결핍, 피리독살 5-포스페이트-의존성 간질, 신장 이형성증, 망막 색소형 이영양증, 소뇌 운동실조, 골격 이형성증, 망상 이발생증, 색소성 망막염, 어셔 증후군, 망막모세포종, 망막병증, RRM2B-관련 미토콘드리아 질환, 루빈스타인-타이비 증후군, 신더 결정질 각막 이영양증, 피지 종양, 중증 선천성 호중구감소증, 중증 영아기 근간대성 간질, 중증 X-연관 근세관성 근병증, 손발톱이형성증, 얼굴 이형증, 털감소증, 단락-늑골 가슴 이형성증, 시알산 축적 질환, 시알리다제결핍증, 철적혈모구성 빈혈, 소섬유 신경병증, 스미스-마제니스 증후군, 소르스비 안저 이영양증, 경직성 운동실조, 경직성 하반신마비, 정자발생 부전, 구상적혈구증, 스핑고미엘린/콜레스테롤 지질증, 척수소뇌성 운동실조, 갈림-손/발 기형, 척추골단골간단 이형성증, 편평추 치사성 골격 이형성증, 두경부의 편평 세포 암종, 스타르가르트병, 수크라제-이소말타제 결핍, 영아 돌연사 증후군, 판상부 대동맥 협착, 계면활성제 대사 기능장애, 탄지에르병, 타톤-브라운-라아만 증후군, 가슴 대동맥류 및 대동맥 박리, 혈전성향증, 갑상선 호르몬 저항성, TNF 수용체-연관 주기성 발열 증후군 (TRAPS), 치아 무발생증, 토르사드 드 포인트, 대동맥의 전위, 트리처 콜린스 증후군, 결절성 경화증 증후군, 티로시나제-음성 눈피부 백색증, 티로시나제-양성 눈피부 백색증, 티로신혈증, UDP글루코스-4-에피머라제 결핍, 울리히 선천성 근육 이영양증, 베스렘 근병증 어셔 증후군, UV-민감성 증후군, 반 데르 우드 증후군, 슬와 익상편 증후군, 초장쇄 아실-코에이 데히드로게나제 결핍, 방광요관 역류, 유리망막맥락막증, 폰 히펠-린다우 증후군, 폰 빌레브란트병, 바르덴부르크 증후군, 바르샤바 손상 증후군, WFS1-관련 장애, 윌슨병, 색소성 건피증, X-연관 무감마글로불린혈증, X-연관 유전성 운동 및 감각 신경병증, X-연관 중증 복합 면역결핍, 및 젤베거 증후군을 포함한다.
핵염기 편집의 개발은 게놈 편집의 범위 및 유효성 둘 다를 진전시킨다. 여기에 기재된 핵염기 편집제는 연구자들에게 사실상 indel 형성을 갖지 않는 편집 (NBE2), 또는 낮은 빈도 (여기서, 전형적으로 1% 이하)의 indel 형성을 갖는 보다 효율적인 편집 (NBE3)의 선택을 제공한다. 염기 편집의 생성물이 정의상 더 이상 기질이 아닌 것은 전통적인 Cas9 적용을 방해할 수 있는 후속의 생성물 형질전환을 방지함으로써 편집 효율에 기여할 가능성이 있다. 세포 상태 및 세포 유형에 의해 크게 다양한 이중-가닥 DNA 절단 및 확률적 DNA 복구 과정에 대한 의존성을 제거함으로써, 핵염기 편집은 깨끗하게 설치될 수 있는 게놈 변형의 유형, 및 이들 변형의 효율, 편집을 잘 받아들이는 세포의 유형을 확장하는 잠재력을 갖는다. 개선된 DNA 특이성을 갖는 최근의 조작된 Cas9 변이체69,70, 82 또는 전달 방법71, 뿐만 아니라 변경된 PAM 특이성을 갖는 Cas9 변이체72는 추가의 핵염기 편집제에게 개선된 DNA 특이성을 제공하는 이 전략 내로 통합될 수 있거나, 훨씬 더 넓은 범위의 질환-연관된 돌연변이를 표적화할 수 있는 가능성이 있다. 이들 발견은 또한 추가의 핵염기 형질전환을 촉매하는 효소로 dCas9의 추가의 융합물을 조작하는 것이 핵염기 편집을 통해 생성될 수 있는 가능한 DNA 염기 변화의 분율을 증가시킬 것임을 시사한다. 이들 결과는 또한 추가의 유형의 프로그램가능한 게놈 및 에피게놈 염기 편집을 가능하게 할 수 있는 메틸라제 및 데메틸라제를 포함한 다른 DNA-변형 효소의 융합을 위한 아키텍처를 시사한다.
물질 및 방법
클로닝. 이 명세서에 사용된 모든 구축물의 DNA 서열 및 프라이머는 보충적 서열에 열거된다. NBE1, NBE2, 및 NBE3을 코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드는 애드진으로부터 입수가능할 것이다. PCR을 베라섹 울트라(VeraSeq ULtra) DNA 폴리머라제 (엔지매틱스), 또는 Q5 핫 스타트(Hot Start) 고-충실도 DNA 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여 수행하였다. NBE 플라스미드를 USER 클로닝 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)을 사용하여 구축하였다. 데아미나제 유전자를 g블록스(gBlocks) 유전자 단편 (인테그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies))로서 합성하고, Cas9 유전자를 이전에 보고된 플라스미드로부터 수득하였다.18 데아미나제 및 융합 유전자를 pCMV (포유동물 코돈-최적화된) 또는 pET28b (이. 콜라이 코돈-최적화된) 백본 내로 클로닝하였다. sgRNA 발현 플라스미드를 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 구축하였다. 간략하게, 보충적 서열에 열거된 프라이머를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 5' 인산화하였다. 다음으로, PCR을, 인산화된 프라이머 및 주형으로서 플라스미드 pFYF1320 (EGFP sgRNA 발현 플라스미드)을 갖는 Q5 핫 스타트 고-충실도 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 수행하였다. PCR 생성물을 DpnI (20 U, 뉴 잉글랜드 바이오랩스)과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 퀴아프렙(QIAprep) 스핀 칼럼 (퀴아젠 (Qiagen)) 상에서 정제하고, 퀵리가제(QuickLigase) (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 라이게이션하였다. DNA 벡터 증폭을 Mach1 적격 세포 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))를 사용하여 수행하였다.
ssDNA에 대한 시험관내 데아미나제 검정. 모든 ssDNA 기질의 서열은 보충적 서열에 열거된다. 모든 Cy3-표지된 기질은 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스 (IDT)로부터 얻었다. 데아미나제를 TNT T7 퀵 커플드 전사/번역 키트 (프로메가)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 1 μg의 플라스미드를 사용하여 시험관내에서 발현시켰다. 단백질 발현 후, 5 μL의 용해물을 컷스마트(CutSmart) 완충제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스) (50 mM 아세트산칼륨, 29 mM 트리스아세테이트, 10 mM 아세트산마그네슘, 100 ug/mL BSA, pH 7.9) 중 35 μL의 ssDNA (1.8 μM) 및 USER 효소 (1 유닛)와 합하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 절단된 U-함유 기질을 10% TBE-우레아 겔 (바이오-라드(Bio-Rad)) 상의 전장 비변형된 기질로부터 분할하였다.
His6-rAPOBEC1-링커-dCas9 융합물의 발현 및 정제. 이. 콜라이 BL21 STAR (DE3)-적격 세포 (써모피셔 사이언티픽)를 GGS, (GGS)3, (서열식별번호: 610) XTEN, 또는 (GGS)7 (서열식별번호: 610) 링커를 갖는 pET28b-His6-rAPOBEC-링커-dCas9를 코딩하는 플라스미드로 형질전환시켰다. 생성된 발현 균주를 밤새 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 루리아-베르타니 (LB) 브로쓰에서 37℃에서 성장시켰다. 세포를 동일한 성장 배지 내로 1:100 희석하고, 37℃에서 OD600 = 약 0.6으로 성장시켰다. 배양물을 2시간의 기간에 걸쳐 4℃로 냉각시키고, 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 0.5 mM에서 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 약 16시간 후, 세포를 4,000 g에서의 원심분리에 의해 수집하고, 용해 완충제 (50 mM 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄 (트리스 (Tris))-HCl, pH 7.0, 1 M NaCl, 20% 글리세롤, 10 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP, 솔텍 벤처스(Soltec Ventures)))에 재현탁시켰다. 세포를 초음파처리 (20초 펄스-온, 20초 펄스-오프, 6 W 출력에서 총 8분 동안)에 의해 용해시키고, 용해물 상청액을 25,000 g에서 15분 동안의 원심분리 후 단리하였다. 용해물을 His-Pur 니켈-니트릴로아세트산 (니켈-NTA) 수지 (써모피셔 사이언티픽)와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 His-태그부착된 융합 단백질을 포획하였다. 수지를 칼럼에 옮기고, 40 mL의 용해 완충제로 세척하였다. His-태그부착된 융합 단백질을 285 mM 이미다졸로 보충된 용해 완충제에서 용리시키고, 한외여과 (아미콘-밀리포어(Amicon-Millipore), 100-kDa 분자량 컷-오프)에 의해 1 mL 총 부피로 농축시켰다. 단백질을 50 mM 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄 (트리스)-HCl, pH 7.0, 0.1 M NaCl, 20% 글리세롤, 10 mM TCEP를 함유하는 저염 정제 완충제에 20 mL로 희석하고, SP 세파로스 고속 유동 수지 (지이 라이프 사이언시스(GE Life Sciences)) 상에 로딩하였다. 수지를 40 mL의 이 저염 완충제로 세척하고, 단백질을 50 mM 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄 (트리스)-HCl, pH 7.0, 0.5 M NaCl, 20% 글리세롤, 10 mM TCEP를 함유하는 활성 완충제 5 mL로 용리시켰다. 용리된 단백질을 SDSPAGE 겔 상에서 정량화하였다.
sgRNA의 시험관내 전사. 20-bp sgRNA 표적 서열에 이어진 T7 프로모터를 함유하는 선형 DNA 단편을 보충적 서열에 열거된 프라이머를 사용하여 트랜스크립트에이드(TranscriptAid) T7 고 수율 전사 키트 (써모피셔 사이언티픽)로 제조업체의 지침에 따라 시험관내에서 전사하였다. sgRNA 생성물을 메가클리어(MEGAclear) 키트 (써모피셔 사이언티픽)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 정제하고, UV 흡광도에 의해 정량화하였다.
Cy3-접합된 dsDNA 기질의 제조. 80-뉴클레오티드 비표지된 가닥의 서열은 보충적 서열에 열거되며, IDT로부터 PAGE-정제된 올리고뉴클레오티드로서 주문하였다. 보충적 서열에 열거된 25-nt Cy3-표지된 프라이머는 각각의 80-nt 기질의 3' 말단에 상보적이다. 이 프라이머는 IDT로부터 HPLC-정제된 올리고뉴클레오티드로서 주문하였다. Cy3-표지된 dsDNA 기질을 생성하기 위해, 80-nt 가닥 (5 μL의 100 μM 용액)을 dNTP (0.75 μL의 100 mM 용액)를 갖는 NE완충제 2 (38.25 μL의 50 mM NaCl, 10 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7.9 용액, 뉴 잉글랜드 바이오랩스) 중 Cy3-표지된 프라이머 (5 μL의 100 μM 용액)와 합하고, 95℃로 5분 동안 가열한 후, 0.1℃/초의 속도로 45℃로 점차 냉각시켰다. 이 어닐링 기간 후, 클레노브(Klenow) 엑소- (5 U, 뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 첨가하고, 반응물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 용액을 완충제 PB (250 μL, 퀴아젠) 및 이소프로판올 (50 μL)로 희석하고, 50 μL의 트리스 완충제로 용리시키는 퀴아프렙 스핀 칼럼 (퀴아젠) 상에서 정제하였다.
dsDNA에 대한 데아미나제 검정. 정제된 융합 단백질 (활성 완충제 중 1.9 μM 20 μL)을 1 당량의 적절한 sgRNA와 합하고, 주위 온도에서 5분 동안 인큐베이션하였다. Cy3-표지된 dsDNA 기질을 125 nM의 최종 농도로 첨가하고, 생성된 용액을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. dsDNA를 완충제 PB (100 μL, 퀴아젠) 및 이소프로판올 (25 μL)의 첨가에 의해 융합물로부터 분리하고, 20 μL의 컷스마트 완충제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 용리시키는 이코노스핀(EconoSpin) 마이크로 스핀 칼럼 (에포치 라이프 사이언스(Epoch Life Science)) 상에서 정제하였다. USER 효소 (1 U, 뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 정제된, 편집된 dsDNA에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. Cy3-표지된 가닥을, 5 μL의 반응 용액을 15 μL의 DMSO-기반 로딩 완충제 (5 mM 트리스, 0.5 mM EDTA, 12.5% 글리세롤, 0.02% 브로모페놀 블루, 0.02% 크실렌 시안, 80% DMSO)와 합함으로써 그의 보체로부터 완전히 변성시켰다. 전장 C-함유 기질을 10% TBE-우레아 겔 (바이오-라드) 상의 임의의 절단된, U-함유 편집된 기질로부터 분리하고, 지이 아머샴 타이푼(GE Amersham Typhoon) 영상화기 상에서 영상화하였다.
고처리량 서열분석 (HTS)을 위한 시험관내-편집된 dsDNA의 제조. 보충적 서열에 열거된 올리고뉴클레오티드는 IDT로부터 수득하였다. 상보적 서열을 트리스 완충제 중에서 합하고 (5 μL의 100 μM 용액), 95℃로 5분 동안 가열함으로써 어닐링한 후, 0.1℃/초의 속도로 45℃로 점차 냉각시켜 60-bp dsDNA 기질을 생성하였다. 정제된 융합 단백질 (활성 완충제 중 1.9 μM 20 μL)을 1 당량의 적절한 sgRNA와 합하고, 주위 온도에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 60량체 dsDNA 기질을 125 nM의 최종 농도로 첨가하고, 생성된 용액을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. dsDNA를 완충제 PB (100 μL, 퀴아젠) 및 이소프로판올 (25 μL)의 첨가에 의해 융합물로부터 분리하고, 20 μL의 트리스 완충제로 용리시키는 이코노스핀 마이크로 스핀 칼럼 (에포치 라이프 사이언스) 상에서 정제하였다. 생성된 편집된 DNA (1 μL는 주형으로서 사용됨)를 보충적 서열로 특정된 HTS 프라이머 쌍 및 베라섹 울트라 (엔지매틱스)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 13 주기의 증폭으로 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 반응 생성물을 래피드팁스(RapidTips) (디피니티 게노믹스(Diffinity Genomics))를 사용하여 정제하고, 정제된 DNA를 서열분석 어댑터를 함유하는 프라이머로 PCR에 의해 증폭시키고, 정제하고, 이전에 기재된 바와 같이 MiSeq 고처리량 DNA 시퀀서 (일루미나(Illumina)) 상에서 서열분석하였다.73
세포 배양. HEK293T (ATCC CRL-3216), U2OS (ATCC-HTB-96) 및 ST486 세포 (ATCC)를 10% (v/v) 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신 (1x, 암레스코(Amresco))으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 플러스 글루타맥스(GlutaMax) (써모피셔)에서 37℃에서 5% CO2로 유지하였다. HCC1954 세포 (ATCC CRL-2338)를 상기 기재된 바와 같이 보충된 RPMI-1640 배지 (써모피셔 사이언티픽)에서 유지하였다. APOE 유전자의 ApoE4 이소형을 함유하는 불멸화 래트 성상세포 (타코닉 바이오사이언시스(Taconic Biosciences))를 10% (v/v) 소 태아 혈청 (FBS) 및 200 μg/mL 제네티신 (써모피셔 사이언티픽)으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 플러스 글루타맥스 (써모피셔 사이언티픽)에서 배양하였다.
형질감염. HEK293T 세포를 48-웰 콜라겐-코팅된 바이오코트(BioCoat) 플레이트 (코닝(Corning)) 상에 시딩하고, 대략 85% 융합도에서 형질감염시켰다. 간략하게, 750 ng의 NBE 및 250 ng의 sgRNA 발현 플라스미드를 웰당 1.5 μL의 리포펙타민 2000 (써모피셔 사이언티픽)을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 형질감염시켰다. 성상세포, U2OS, HCC1954, HEK293T 및 ST486 세포를 적절한 아막사 뉴클레오펙터(AMAXA NUCLEOFECTOR)™ II 프로그램을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 형질감염시켰다. 40 ng의 적외선 RFP (애드진 플라스미드 45457)74를 뉴클레오펙션 용액에 첨가하여 이들 세포주에서의 뉴클레오펙션 효율을 평가하였다. 성상세포, U2OS, 및 ST486 세포에 대해, 뉴클레오펙션 효율은 각각 25%, 74%, 및 92%였다. HCC1954 세포에 대해, 뉴클레오펙션 효율은 10% 미만이었다. 따라서, 트립신화 후, HCC1954 세포를 40 마이크로미터 여과기 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))를 통해 여과하고, 뉴클레오펙션된 HCC1954 세포를 iRFP 신호 (흡수 643 nm, 방출 670 nm)를 사용하여 베크만 쿨터(Beckman Coulter) 모플로 XDP 세포 분류기 상에서 수집하였다. 다른 세포는 뉴클레오펙션된 세포의 풍부화 없이 사용하였다.
게놈 DNA 샘플의 고처리량 DNA 서열분석. 형질감염된 세포를 3일 후에 수거하고, 게놈 DNA를 아젠코트(Agencourt) DNAdvance 게놈 DNA 단리 키트 (베크만 쿨터)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 단리하였다. 관심 온-타겟 및 오프-타겟 게놈 영역을 보충적 서열에 열거된 플랭킹 HTS 프라이머 쌍으로 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 증폭은 푸션(Phusion) 고-충실도 DNA 폴리머라제 (써모피셔)로 제조업체의 지침에 따라 5 ng의 게놈 DNA를 주형으로서 사용하여 수행하였다. 주기 수는 각각의 프라이머 쌍에 대해 별개로 측정하여, 반응이 선형 범위의 증폭에서 중단되도록 하였다 (EMX1, FANCF, HEK293 부위 2, HEK293 부위 3, HEK293 부위 4, 및 RNF2 프라이머에 대해 각각 30, 28, 28, 28, 32, 및 32 주기). PCR 생성물을 래피드팁스 (디피니티 게노믹스)를 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 서열분석 어댑터를 함유하는 프라이머로 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성물을 겔-정제하고, 퀀트-잇(QUANT-IT)™ 피코그린 dsDNA 검정 키트 (써모피셔) 및 카파 라이브러리 정량화 키트-일루미나 (카파 바이오시스템즈(KAPA Biosystems))를 사용하여 정량화하였다. 샘플을 이전에 기재된 바와 같이 일루미나 MiSeq 상에서 서열분석하였다.73
데이터 분석. 서열분석 판독물을 MiSeq 리포터 (일루미나)를 사용하여 자동으로 역다중화하고, 개별 FASTQ 파일을 보충 노트에 제공된 주문제작 매트랩 스크립트로 분석하였다. 각각의 판독물을 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘을 사용하여 적절한 참조 서열에 대해 쌍별로 정렬하였다. 31 미만의 Q-점수를 갖는 염기 호출을 N으로 대체하고, 따라서 뉴클레오티드 빈도를 계산하는 데 있어서 제외하였다. 이 처리는 1,000 중 대략 1의 예상된 MiSeq 염기-호출 오차율을 생성한다. 판독물 및 참조 서열이 갭을 함유하지 않은 정렬된 서열을 염기 빈도가 각각의 유전자좌에 대해 표로 제시될 수 있는 정렬 표에 저장하였다.
indel 빈도를 이전에 기재된 기준71을 사용하여 보충 노트에 제시된 주문제작 매트랩 스크립트로 정량화하였다. 서열분석 판독물을 indel이 일어날 수 있는 윈도우의 양 측에 플랭킹된 2개의 10-bp 서열에의 정확한 매치를 위해 스캐닝하였다. 정확한 매치가 위치하지 않은 경우, 판독물을 분석으로부터 제외하였다. 이 indel 윈도우의 길이가 참조 서열을 정확하게 매칭시킨 경우, 판독물을 indel을 함유하지 않는 것으로서 분류하였다. indel 윈도우가 참조 서열보다 더 길거나 더 짧은 2개 이상의 염기인 경우, 서열분석 판독물을 각각 삽입 또는 결실로서 분류하였다.
본원에, 예를 들어, 배경기술, 요약, 상세한 설명, 실시예, 및/또는 참고문헌 섹션에 언급된 모든 공개, 특허, 특허 출원, 공개, 및 데이터베이스 엔트리 (예를 들어, 서열 데이터베이스 엔트리)는 각각의 개별 공개, 특허, 특허 출원, 공개, 및 데이터베이스 엔트리가 구체적으로 및 개별적으로 본원에 참조로 포함되는 것처럼 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상충하는 경우, 본원의 임의의 정의를 포함하여 본 출원이 우선할 것이다.
보충 서열
sgRNA 형질감염 플라스미드를 생성하는 데 사용된 프라이머. rev_sgRNA_플라스미드를 모든 경우에 사용하였다. pFYF1320 플라스미드를 물질 및 방법 섹션에 언급된 바와 같이 주형으로서 사용하였다. 서열식별번호: 187-196은 각각 하기에 위에서 아래로 나타난다.
Figure pct00136
시험관내 데아미나제 검정에 사용된 모든 ssDNA 기질의 서열. 서열식별번호: 197-199는 각각 하기에 위에서 아래로 나타난다.
Figure pct00137
겔-기반 데아미나제 검정을 위한 sgRNA의 T7 전사를 위한 기질로서 기능하는 PCR 생성물을 생성하는 데 사용된 프라이머. rev_gRNA_T7을 모든 경우에 사용하였다. pFYF1320 플라스미드를 물질 및 방법 섹션에 언급된 바와 같이 주형으로서 사용하였다. 서열식별번호: 200-223은 각각 하기에 위에서 아래로 나타난다.
Figure pct00138
겔-기반 dsDNA 데아미나제 검정에 사용된 80-뉴클레오티드 비표지된 가닥 및 Cy3-표지된 유니버셜 프라이머의 서열. 서열식별번호: 224-248은 각각 하기에 위에서 아래로 나타난다.
Figure pct00139
고처리량 서열분석을 위한 sgRNA의 T7 전사를 위한 기질로서 기능하는 PCR 생성물을 생성하는 데 사용된 프라이머. rev_gRNA_T7 (상기)을 모든 경우에 사용하였다. pFYF1320 플라스미드를 물질 및 방법 섹션에 언급된 바와 같이 주형으로서 사용하였다. 서열식별번호: 249-300은 각각 하기에 위에서 아래로 나타낸다.
Figure pct00140
Figure pct00141
고처리량 서열분석 (HTS)을 위한 시험관내-편집된 dsDNA의 서열. 편집된 가닥의 서열이 제시된다. 제시된 모든 서열의 역방향 보체를 또한 얻었다. dsDNA 기질을 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 상보적 가닥을 어닐링함으로써 얻었다. EMX1, FANCF, HEK293 부위 2, HEK293 부위 3, HEK293 부위 4, 및 RNF2 유전자좌를 나타내는 올리고뉴클레오티드는 원래 겔-기반 데아미나제 검정에 사용하기 위해 설계되었으며, 따라서 그의 5'-말단 상에 동일한 25-nt 서열을 갖는다 (Cy3-프라이머의 것과 매칭시킴). 서열식별번호: 301-352는 각각 하기에 위에서 아래로 나타난다.
Figure pct00142
Figure pct00143
시험관내 편집된 dsDNA의 HTS를 위한 프라이머. 서열식별번호: 353-361은 각각 하기에 위에서 아래로 나타난다.
Figure pct00144
모든 포유동물 세포 배양 실험으로부터의 온-타겟 및 오프-타겟 부위의 HTS를 위한 프라이머. 서열식별번호: 362-469는 각각 하기에 위에서 아래로 나타난다.
Figure pct00145
Figure pct00146
Figure pct00147
Figure pct00148
HDR 연구에 사용된 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 공여자 주형 (ssODN)의 서열.
EMX1 센스 (서열식별번호: 470)
Figure pct00149
EMX1 안티센스 (서열식별번호: 471)
Figure pct00150
HEK293 부위 3 센스 (서열식별번호: 472)
Figure pct00151
HEK293 부위 3 안티센스 (서열식별번호: 473)
Figure pct00152
HEK 부위 4 센스 (서열식별번호: 474)
Figure pct00153
HEK 부위 4 안티센스 (서열식별번호: 475)
Figure pct00154
APOE4 센스 (서열식별번호: 476)
Figure pct00155
APOE4 안티센스 (서열식별번호: 477)
Figure pct00156
p53 Y163C 센스 (서열식별번호: 478)
Figure pct00157
p53 Y163C 안티센스 (서열식별번호: 479)
Figure pct00158
데아미나제 유전자 g블록스 유전자 단편
hAID (서열식별번호: 169)
rAPOBEC1 (포유동물)(서열식별번호: 170)
Figure pct00159
pmCDA1 (서열식별번호: 171)
Figure pct00160
haPOBEC3G (서열식별번호: 172)
Figure pct00161
rAPOBEC1(이. 콜라이) (서열식별번호: 173)
Figure pct00162
NBE1, NBE2 및 NBE3의 아미노산 서열.
이. 콜라이 발현을 위한 NBE1 (His6-rAPOBEC1-XTEN-dCas9) (서열식별번호: 154)
Figure pct00163
포유동물 발현을 위한 NBE1 (rAPOBEC1-XTEN-dCas9-NLS) (서열식별번호: 155)
Figure pct00164
인간 APOBEC1로의 포유동물 발현을 위한 대안적인 NBE1 (hAPOBEC1-XTEN-dCas9-NLS) (서열식별번호: 158)
Figure pct00165
Figure pct00166
NBE2 (rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI-NLS) (서열식별번호: 156)
Figure pct00167
NBE3 (rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS) (서열식별번호: 157)
Figure pct00168
pmCDA1-XTEN-dCas9-UGI (박테리아) (서열식별번호: 159)
Figure pct00169
pmCDA1-XTEN-nCas9-UGI-NLS (포유동물 구축물) (서열식별번호: 160)
Figure pct00170
huAPOBEC3G-XTEN-dCas9-UGI (박테리아) (서열식별번호: 161)
Figure pct00171
Figure pct00172
huAPOBEC3G-XTEN-nCas9-UGI-NLS (포유동물 구축물) (서열식별번호: 162)
Figure pct00173
huAPOBEC3G (D316R_D317R)-XTEN-nCas9-UGI-NLS (포유동물 구축물) (서열식별번호: 163)
Figure pct00174
염기 호출 매트랩 스크립트
Figure pct00175
Figure pct00176
Figure pct00177
INDEL 검출 매트랩 스크립트
Figure pct00178
Figure pct00179
Figure pct00180
실시예 5: Cas9 변이체 서열
본 개시내용은 1개 이상의 돌연변이 (예를 들어, dCas9 또는 Cas9 니카제를 생성하기 위한)를 포함할 수 있는 1종 이상의 유기체로부터의 Cas9 변이체, 예를 들어 Cas9 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질의 별표에 의해 하기 확인되는 아미노산 잔기 중 1개 이상은 돌연변이될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 6에 제공된 아미노산 서열의 D10 및/또는 H840 잔기, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이는 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 6에 제공된 아미노산 서열의 D10 잔기, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이는 D를 제외한 임의의 아미노산 잔기로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 6에 제공된 아미노산 서열의 D10 잔기, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이는 A로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 6에 제공된 아미노산 서열의 H840 잔기, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 잔기는 H이다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 6에 제공된 아미노산 서열의 H840 잔기, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이는 H를 제외한 임의의 아미노산 잔기로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 6에 제공된 아미노산 서열의 H840 잔기, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 돌연변이는 A로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 6에 제공된 아미노산 서열의 D10 잔기, 또는 임의의 Cas9 단백질, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 Cas9 아미노산 서열 중 어느 하나에서의 상응하는 잔기는 D이다.
다양한 종으로부터의 다수의 Cas9 서열을 정렬하여 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 567의 D10 및 H840의 상응하는 상동 아미노산 잔기가 다른 Cas9 단백질에서 확인되어, 상동 아미노산 잔기의 상응하는 돌연변이를 갖는 Cas9 변이체의 생성을 허용할 수 있는지 측정하였다. 정렬은 NCBI 제약-기반 다중 정렬 도구(Constraint-based Multiple Alignment Tool) (COBALT (st-va.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt에서 접근가능함))를 사용하여 하기 파라미터로 수행하였다. 정렬 파라미터: 갭 패널티 -11,-1; 말단-갭 패널티 -5,-1. CDD 파라미터: RPS BLAST 온을 사용; 블라스트 E-값 0.003; 보존된 칼럼 발견 및 리컴퓨트 온. 쿼리 클러스터링 파라미터: 쿼리 클러스터 온 사용; 워드 크기 4; 최대 클러스터 거리 0.8; 알파벳 규칙적.
4가지 Cas9 서열의 예시적인 정렬이 하기에 제공된다. 정렬에서 Cas9 서열은 서열 1 (S1): 서열식별번호: 567 | WP_010922251| gi 499224711 | 유형 II CRISPR RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 Cas9 [스트렙토코쿠스 피오게네스]; 서열 2 (S2): 서열식별번호: 568 | WP_039695303 | gi 746743737 | 유형 II CRISPR RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 Cas9 [스트렙토코쿠스 갈롤리티쿠스 (Streptococcus gallolyticus)]; 서열 3 (S3): 서열식별번호: 569 | WP_045635197 | gi 782887988 | 유형 II CRISPR RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 Cas9 [스트렙토코쿠스 미티스 (Streptococcus mitis)]; 서열 4 (S4): 서열식별번호: 570 | 5AXW_A | gi 924443546 | 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9이다. HNH 도메인 (볼드체 및 밑줄표시됨) 및 RuvC 도메인 (박스표시됨)은 4가지 서열의 각각에 대해 확인된다. S1에서의 아미노산 잔기 10 및 840 및 정렬된 서열에서의 상동 아미노산은 하기 각각의 아미노산 잔기에서 별표로 확인된다.
Figure pct00181
Figure pct00182
Figure pct00183
정렬은 참조 Cas9 아미노산 서열 또는 아미노산 잔기에 상동인 아미노산 서열 및 아미노산 잔기가, 정렬되는 아미노산 서열 또는 잔기를 관련 기술분야에 공지된 정렬 프로그램 및 알고리즘을 사용하여 참조 서열 또는 참조 잔기로 확인함으로써, 상이한 종으로부터의 Cas9 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는 Cas9 서열 변이체에 걸쳐 확인될 수 있다는 것을 입증한다. 본 개시내용은 서열식별번호: 567-570에서 별표에 의해 확인되는 아미노산 잔기 중 1개 이상 (예를 들어, 각각 S1, S2, S3, 및 S4)이 본원에 기재된 바와 같이 돌연변이된 Cas9 변이체를 제공한다. 서열식별번호: 567-570에서 별표에 의해 확인되는 잔기에 상응하는 서열식별번호: 6의 Cas9에서의 잔기 D10 및 H840은 본원에서 "상동" 또는 "상응하는" 잔기로 지칭된다. 이러한 상동 잔기는 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 서열 정렬에 의해, 및 정렬되는 서열 또는 잔기를 참조 서열 또는 잔기로 확인함으로써 확인될 수 있다. 유사하게, 본원에서 서열식별번호: 6에서 확인되는 돌연변이, 예를 들어, 서열식별번호: 6에서의 잔기 10, 및 840의 돌연변이에 상응하는 Cas9 서열에서의 돌연변이는 본원에서 "상동" 또는 "상응하는" 돌연변이로 지칭된다. 예를 들어, 상기 4개의 정렬된 서열에 대해 서열식별번호: 6 또는 S1 (서열식별번호: 567)에서의 D10A 돌연변이에 상응하는 돌연변이는 S2에 대해 D11A, S3에 대해 D10A, 및 S4에 대해 D13A이고; 서열식별번호: 6 또는 S1 (서열식별번호: 567)에서의 H840A에 대한 상응하는 돌연변이는 S2에 대해 H850A, S3에 대해 H842A, 및 S4에 대해 H560A이다.
실시예 6: 차세대 C에서 T로의 편집제
염기 편집제 3 (BE3) 구축물에 대한 대안으로서 시티딘 데아미나제의 다른 패밀리를 조사하였다. 좁거나 상이한 편집 윈도우, 표적화가능한 기질을 확장하는 대안의 서열 특이성을 갖고, 보다 높은 활성을 갖는 상이한 C에서 T로의 편집제를 개발하였다.
실시예 4에 기재된 방법을 사용하여, HeK-3 부위에서의 pmCDA1 (페트로미존 마리누스로부터의 시티딘 데아미나제 1) 활성을 평가한다 (도 42). pmCDA1-nCas9-UGI-NLS (nCas9는 본원에 기재된 Cas9 니카제를 지시함) 구축물은 rAPOBEC1 (BE3)로 접근가능하지 않은 일부 부위 (예를 들어, 위치 9, 5, 4, 및 3에서 상보적 가닥 상의 C 염기) 상에서 활성이다.
HeK-2 부위에서의 pmCDA1 활성은 도 43에 주어진다. pmCDA1-XTEN-nCas9-UGI-NLS 구축물은 "G"에 인접한 부위 상에서 활성인 반면, rAPOBEC1 유사체 (BE3 구축물)는 "G"에 인접한 "C", 예를 들어, 상보적 가닥 상의 위치 11에서의 C 염기 상에서 낮은 활성을 갖는다.
T로 전환된 표적 C (도 44), A로 전환된 C (도 45), 및 G로 전환된 C (도 46)를 갖는 총 서열분석 판독물의 퍼센트가 CDA 및 APOBEC1 (BE3 구축물)에 대해 나타나 있다.
HeK-2 부위에서의 huAPOBEC3G 활성은 도 47에 나타나 있다. 2가지 구축물을 사용하였다: huAPOBEC3G-XTEN-nCas9-UGI-NLS 및 huAPOBEC3G*(D316R_D317R)-XTEN-nCas9-UGI-NLS. huAPOBEC3G-XTEN-nCas9-UGI-NLS 구축물은 도 47에 나타난 바와 같이 rAPOBEC1 (BE3)과 상이한 서열 특이성을 가지며, 편집 윈도우는 APOBEC1에 비해 위치 4에서 APOBEC3G의 감소된 활성에 의해 지시된 바와 같이 좁게 나타난다. huAPOBEC3G에서 생성된 돌연변이 (D316R 및 D317R)는 ssDNA 결합을 증가시켰으며, 편집된 부위를 확장하는 데 대해 관찰가능한 효과를 발생시켰다 (도 47에서 APOBEC3G를 APOBEC3G_RR과 비교함). 돌연변이는 APOBEC3G 결정 구조에 기초하여 선택하였고, 문헌 [Holden et al., Crystal structure of the anti-viral APOBEC3G catalytic domain and functional implication. Nature. (2008); 121-4]을 참조하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
실시예 7: 이. 콜라이에서의 pmCDA1/huAPOBEC3G/rAPOBEC1 연구
A에서 I로의 전환을 위한 LacZ 선택 최적화를 F 플라스미드 상에서 코딩된 lacZ를 갖는 박테리아 균주를 사용하여 수행하였다. 중요한 글루탐산 잔기를, 시티딘 데아미나제에 의한 G에서 A로가 lacZ 활성을 복원하도록 돌연변이시켰다 (예를 들어, GAG에서 GGG로의, Glu에서 Gly로의 돌연변이) (도 48). 균주 CC102를 선택 검정을 위해 선택하였다. APOBEC1 및 CDA 구축물을 G에서 A로의 전환을 최적화하기 위해 선택 검정에 사용하였다.
lacZ 복귀 빈도에 대한 데아미나제 구축물을 코딩하는 플라스미드의 카피 수의 효과를 평가하기 위해, CDA 및 APOBEC1 데아미나제를 상이한 복제 원점 (따라서 상이한 카피 수)을 갖는 4가지의 플라스미드, 즉 SC101, CloDF3, RSF1030, 및 PUC (카피 수: PUC>RSF1030>CloDF3>SC101) 내로 클로닝하고, 유도성 프로모터 아래에 정치하였다. 플라스미드를 돌연변이된 LacZ 유전자를 함유하는 F 플라스미드를 갖는 이. 콜라이 세포 내로 개별적으로 형질전환시켰다. 데아미나제의 발현을 유도하고, LacZ 활성을 각각의 구축물에 대해 검출하였다 (도 49). 도 49에 나타난 바와 같이, CDA는 데아미나제가 클로닝된 플라스미드 카피 수와 무관하게, 모든 예에서 APOBEC1보다 유의하게 더 높은 활성을 나타내었다. 또한, 카피 수의 관점에서, 데아미나제 활성은 클로닝되는 플라스미드의 카피 수와 양의 상관관계가 있었다 (즉, PUC> CloDF3>SC101).
LacZ 복귀를 lacZ 유전자좌에서 게놈 DNA의 서열분석에 의해 확인하였다. 교정된 LacZ 유전자를 함유하는 게놈 DNA를 얻기 위해, 세포를 X-gal을 함유하는 배지에서 성장시켰으며, 여기서, LacZ 활성을 갖는 세포는 청색 콜로니를 형성한다. 청색 콜로니를 선택하고, 락토스를 함유하는 최소 배지에서 성장시켰다. 세포를 스핀 다운시키고, 세척하고, 최소 배지 플레이트 (락토스) 상에 재-플레이팅하였다. 그 후, 최고 희석에서의 청색 콜로니를 선택하고, 그의 게놈 DNA를 lacZ 유전자좌에서 서열분석하였다 (도 50).
상이한 시티딘 데아미나제 (예를 들어, CDA, 및 APOBEC1)의 활성을 시험하기 위한 클로람페니콜 복귀 검정을 설계하였다. 박테라아에 대한 클로람페니콜 저항성을 부여하는 돌연변이체 CAT1 유전자를 갖는 플라스미드를 복제 원점으로서 RSF1030으로 구축하였다. 돌연변이체 CAT1 유전자는 단백질 불활성을 제공하는 H195R (CAC에서 CGC로의) 돌연변이를 갖는 CAT1 단백질을 코딩한다 (도 51). CGC 코돈에서의 G 염기에 염기-쌍형성된 C의 탈아미노화는 코돈을 다시 CAC 코돈으로 전환시킬 것이며, 이는 단백질의 활성을 복원한다. 도 52에 나타난 바와 같이, CDA는 이. 콜라이에서 클로람페니콜 저항성 유전자의 활성을 복원하는 데 있어서 rAPOBEC를 능가한다. 선택 플라스미드 (pNMG_ch_5)를 갖는 S1030에서의 chlor의 최소 억제 농도 (MIC)는 대략 1 μg/mL였다. rAPOBEC-XTEN-dCas9-UGI 및 CDA-XTEN-dCas9-UGI 둘 다는 선택 플라스미드 상에서 DNA 교정을 유도하였다 (도 53).
다음으로, huAPOBEC3G-XTEN-dCas9-UGI 단백질을 동일한 검정에서 시험하였다. 흥미롭게도, huAPOBEC3G-XTEN-dCas9-UGI는 rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI 융합 단백질과 상이한 서열 특이성을 나타내었다. rAPOBEC11-XTEN-dCas9-UGI 융합물 (여기서, 위치 3, 6, 및 8이 편집되었음)에 비해, 단지 위치 8만을 APOBEC3G-XTEN-dCas9-UGI 융합물로 편집하였다 (도 54).
실시예 8: 더 적은 오프 타겟 편집을 갖는 C에서 T로의 염기 편집제
현재의 염기 편집 기술은 게놈 DNA에서 C:G 염기 쌍의 T:A 염기 쌍으로의 서열-특이적 전환을 허용한다. 이는 시티딘 데아미나제 효소에 의한 시토신의 우라실로의 직접적 촉매 전환을 통해 수행되며, 따라서, 전통적인 게놈 편집 기술과는 달리 제1 단계로서 DNA 내로 이중-가닥 DNA 파괴 (DSB)를 도입하지 않는다. 문헌 [Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A., and Liu, D.R. (2016), "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage." Nature 533, 420-424]을 참조하며; 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 대신, 촉매적으로 사멸된 SpCas9 (dCas9) 또는 SpCas9 니카제 (dCas9(A840H))를 시티딘 데아미나제 효소, 예컨대 rAPOBEC1, pmCDA1, 또는 hAPOBEC3G에 테더링한다. 관심 게놈 유전자좌는 sgRNA에 의해 코딩되며, DNA 결합 및 국부 변성은 융합물의 dCas9 부분에 의해 용이해진다. 그러나, 야생형 dCas9 및 야생형 Cas9는 오프-타겟 DNA 결합 및 절단을 나타내는 것처럼, 현재의 염기 편집제는 또한 Cas9 오프-타겟 유전자좌에서 C에서 T로의 편집을 나타내며, 이는 그의 치료적 유용성을 제한한다.
그의 표적 DNA의 단백질 및 당-포스페이트 백본 사이의 비특이적 정전기적 상호작용을 중화시키는 단지 3 내지 4개의 돌연변이의 SpCas9 내로의 도입은 SpCas9의 DNA 결합 특이성을 증가시키는 것으로 보고되었다. 문헌 [Kleinstiver, B.P., Pattanayak, V., Prew, M.S., Tsai, S.Q., Nguyen, N.T., Zheng, Z., and Joung, J.K. (2016) "High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects." Nature 529, 490-495]; 및 [Slaymaker, I.M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D.A., Yan, W.X., and Zhang, F. (2015) "Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science 351, 84-88]을 참조하며; 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 4가지 보고된 중화 돌연변이를 초기에 보고된 염기 편집제 BE3 (서열식별번호: 48) 내로 혼입하였고, 이 효소의 오프-타겟 C에서 T로의 편집은 또한 극적으로 감소되는 것으로 밝혀졌으며 (도 55), 온-타겟 편집의 감소는 없었다 (도 56).
도 55에 나타난 바와 같이, HEK293T 세포를 BE3 또는 HF-BE3 및 EMX1 서열을 매칭시키는 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 리포펙타민 2000을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고, PCR에 의해 증폭시키고, GUIDE-seq 방법을 사용하여 종 및 동료들에 의해 이전에 측정된 바와 같이 EMX1 sgRNA에 대한 온-타겟 유전자좌, 플러스 상부 10개의 공지된 Cas9 오프-타겟 유전자좌에서 고처리량 DNA 서열분석에 의해 분석하였다. 문헌 [Tsai, S.Q., Zheng, Z., Nguyen, N.T., Liebers, M., Topkar, V.V., Thapar, V., Wyvekens, N., Khayter, C., Iafrate, A.J., Le, L.P., et al. (2015) "GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases." Nat Biotech 33, 187-197]을 참조하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. EMX1 오프-타겟 5 유전자좌는 증폭하지 않았으며, 나타내지 않는다. 온-타겟 및 오프-타겟 프로토스페이서 및 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)의 서열이 제시된다 (도 55). 프로토스페이서 내의 원래 C의 각각의 위치에 T를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율로서 정의되는 세포의 C에서 T로의 전환 백분율이 BE3 및 HF-BE3에 대해 나타나 있다.
도 56에서, HEK293T 세포를 BE3 또는 HF-BE3 및 지시된 게놈 유전자좌를 매칭시키는 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 리포펙타민 2000을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고, PCR에 의해 증폭시키고, 온-타겟 유전자좌에서 고처리량 DNA 서열분석에 의해 분석하였다. 각각의 프로토스페이서 내의 표적 C에 모든 4개의 염기를 갖는 총 DNA 서열분석 판독물의 백분율이 BE3 또는 HF-BE3으로의 처리에 대해 나타나 있다 (도 56). indel 형성의 빈도가 또한 나타나 있다.
HF-BE3의 1차 단백질 서열 (서열식별번호: 48):
Figure pct00184
실시예 9: Cas9 변이체를 사용하는 염기 편집제의 개발 및 염기 편집 기술의 표적 범위 및 정확성을 증가시키기 위한 염기 편집제 프로세싱성의 조정
전통적인 게놈 편집 플랫폼과는 달리, 염기 편집 기술은 이중-가닥 파괴 (DSB)를 유도하지 않고 DNA에서의 정확한 단일 뉴클레오티드 변화를 허용한다. 문헌 [Komor, A. C. et al. Nature 533, 420-424 (2016)]을 참조한다. 현세대의 염기 편집제는 NGG PAM을 배타적으로 사용한다. 이는 게놈 내에서 목적하는 염기를 편집하는 그의 능력을 제한하는데, 이는 염기 편집제가 표적 염기가 PAM의 대략 15 염기 상류의 4-염기 영역 ('탈아미노화 윈도우') 내에 놓이는 정확한 위치에 놓일 필요가 있기 때문이다. 문헌 [Komor, A. C. et al. Nature 533, 420-424 (2016)]을 참조한다. 더욱이, 시티딘 데아미나제의 높은 프로세싱성으로 인해, 염기 편집제는 그의 탈아미노화 윈도우 내에서 모든 시티딘을 티미딘으로 전환시킬 수 있으며, 이는 연구자에 의해 목적하는 것 외의 아미노산 변화를 유도할 수 있다. 문헌 [Komor, A. C. et al. Nature 533, 420-424 (2016)]을 참조한다.
Cas9 변이체를 갖는 염기 편집제의 개발을 통한 염기 편집의 범위의 확장
상이한 PAM 특이성을 갖는 Cas9 상동체 및 다른 RNA-가이드된 DNA 결합제를 염기 편집제 아키텍처 내로 혼입하였다. 문헌 [Kleinstiver, B. P. et al. Nature 523, 481-485 (2015)]; [Kleinstiver, B. P. et al. Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)]; 및 [Zetsche, B. et al. Cell 163, 759-771 (2015)]을 참조하며; 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 더욱이, 다양한 Cas9 단백질의 PAM 특이성을 넓힌 혁신을 또한 도입하여 염기 편집제의 표적 도달을 훨씬 더 확장시켰다. 문헌 [Kleinstiver, B. P. et al. Nature 523, 481-485 (2015)]; 및 [Kleinstiver, B. P. et al. Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)]을 참조한다. 염기 편집제의 현재의 팔레트는 표 4에 요약된다.
표 4. Cas9 변이체로부터 제조된 새로운 염기 편집제
Figure pct00185
rAPOBEC1의 부위-지정 돌연변이유발을 통한 염기 편집제의 프로세싱성의 조정
염기 편집제의 프로세싱성은 데아미나제 효소에서 점 돌연변이를 생성함으로써 조정될 수 있다. 염기 편집제가 여전히 평균 1 라운드의 시티딘 탈아미노화를 촉매할 수 있었지만, 관련 기간 내에 또 다른 탈아미노화를 접근하고 촉매할 가능성은 적었던 데아미나제의 촉매 활성을 약간 감소시키는 돌연변이의 혼입이 추구되었다. 사실상, 생성된 염기 편집제는 보다 좁은 탈아미노화 윈도우를 가질 것이다.
이 연구에서 탐색된 rAPOBEC1 돌연변이는 표 5에 열거된다. 돌연변이의 일부는 rAPOBEC1 촉매작용의 약간 명백한 손상을 발생시켰으며, 이는 다중 시티딘이 탈아미노화 윈도우 내에서 발견되는 경우, 한 시티딘의 또 다른 것에 비한 우선적 편집으로서 분명해졌다. 이들 돌연변이의 일부를 조합하는 것은 상가 효과를 가졌으며, 이는 염기 편집제가 보다 높은 엄격성으로 기질 시티딘을 식별하는 것을 허용한다. 이중 돌연변이체 및 삼중 돌연변이체의 일부는 서로에 대해 바로 옆에 있는 다중 시티딘 중에서 1개의 시티딘의 선택적 편집을 허용하였다 (도 57).
표 5. 조사된 rAPOBEC1 점 돌연변이
Figure pct00186
염기 편집제 PAM 확장 및 프로세싱성 조정
다른 RNA-가이드된 DNA 결합제를 사용함으로써 게놈에서 편집가능한 시티딘을 확장하기 위해 차세대의 염기 편집제를 설계하였다 (도 58). NGG PAM을 사용하는 것은 단지 "윈도우" 내에서 단일 표적을 허용하는 반면, 다중 상이한 PAM의 사용은 Cas9가 선택적 탈아미노화를 실시하기 위해 어디에도 위치되는 것을 허용한다. 다양한 새로운 염기 편집제를 Cas9 변이체로부터 생성하였다 (도 59 및 표 4). 상이한 PAM 부위 (NGA, 도 60; NGCG, 도 61; NNGRRT, 도 62; 및 NNHRRT, 도 63)를 탐구하였다. 선택적 탈아미노화는 시티딘 데아미나제 점 돌연변이유발의 동역학 조정을 통해 성공적으로 달성되었다 (도 65 및 표 5).
그 후, 탈아미노화 윈도우에 대한 다양한 돌연변이의 효과를 세포 배양물에서 다중 시티딘을 갖는 스페이서를 사용하여 조사하였다 (도 66 및 67).
또한, 제한된 수의 시티딘을 갖는 상이한 게놈 부위에 대한 다양한 돌연변이의 효과를 조사하였다 (도 68 내지 71). 대략 1개의 시티딘이 스페이서에서의 탈아미노화 윈도우 내에서 편집될 것인 반면, 나머지 시티딘은 무손상으로 남아 있을 것임이 밝혀졌다. 전체적으로, 편집에 대한 선호도는 하기와 같다: C6 > C5 >> C7
Figure pct00187
C4.
Cpf1을 사용한 염기 편집
Cas9 상동체인 Cpf1은 AsCpf1, LbCpf1로서, 또는 임의의 다른 종으로부터 얻을 수 있다. BE2 및 BE3 등가물을 포함한 융합 구축물의 개략도는 도 73에 나타나 있다. BE2 등가물은 Cas9 대신 촉매적으로 불활성인 Cpf2 효소 (dCpf1)를 사용하는 반면, BE3 등가물은 표적 가닥을 니킹하는 Cpf1 돌연변이체를 포함한다. 하부 개략도는 그것 위에 예시된 2가지 혁신을 조합하는 상이한 융합 아키텍처를 나타낸다 (도 73). Cpf1 BE2를 사용한 HEK293T 세포 TTTN PAM 부위의 염기 편집 결과를 상이한 스페이서로 조사하였다 (도 64a 내지 64c). 일부 실시양태에서, Cpf1은 본원에 제공된 염기 편집제 중 임의의 것에서의 Cas9 도메인 대신 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, Cpf1은 서열식별번호: 9와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 단백질이다.
Cpf1의 전체 단백질 서열 (서열식별번호: 9):
Figure pct00188
실시예 10: 염기 편집의 증가된 충실도
BE3 및 HF-BE3의 플라스미드 전달 사이의 차이를 조사하여, 2개가 대등한 효율로 온-타겟 유전자좌를 편집한다는 것을 밝혀내었다 (도 74 및 75). 그러나, HF-BE3은 오프-타겟 유전자좌를 BE3보다 훨씬 더 적게 편집하였으며, 이는 HF-BE3이 BE3보다 훨씬 더 높은 DNA 특이성을 갖는다는 것을 의미한다 (도 76). HEK 세포에의 데아미나제 단백질 리포펙션은 BE3의 단백질 전달이 BE3의 플라스미드 DNA 전달과 대등한 온-타겟 활성, 그러나 그보다 훨씬 더 양호한 특이성을 발생시킨다는 것을 입증하였다. 개선된 형질감염 절차 및 보다 양호한 플라스미드를 사용하여 (n=2), 실험은 하기 조건을 사용하였다: 단백질 전달은 125 nM Cas9:sgRNA 복합체였고, 플라스미드 전달은 750 ng BE3/HF-BE3 플라스미드 + 250 ng sgRNA 플라스미드였고, 리포펙션은 웰당 1.5μL의 리포펙타민 2000으로였다. EMX-1 오프 타겟 부위 2 및 FANCF 오프-타겟 부위 1은 검정된 모든 오프-타겟에 비해, BE3으로 가장 큰 오프-타겟 편집을 나타낸 반면 (도 77 및 78), HEK-3은 전달 방법 중 임의의 것에 대해 오프-타겟에서 유의한 편집을 나타내지 않았다 (도 79). HEK-4는 온-타겟 부위 상에서 일부 C에서 G로의 편집을 나타내는 반면, 그의 오프-타겟 부위 1, 3, 및 4는 모든 검정된 부위의 가장 큰 오프-타겟 편집을 나타내었다 (도 80).
제브라피시에의 미세-주사를 통한 BE3 단백질의 전달
TYR 가이드 RNA를 sgRNA 활성에 대해 시험관내 검정에서 시험하였다 (도 81 및 82). % HTS 판독물은 얼마나 많은 C 잔기가 정제된 BE3 단백질과의 2시간 인큐베이션 및 생성된 생성물의 PCR 동안 T 잔기로 전환되었는지를 나타낸다. 실험은 60bp의 그의 게놈 컨텍스트에서 표적 탈아미노화 부위를 갖는 80량체 합성 DNA 기질을 사용하였다. 이는 단지 1개의 가닥이 니킹되고, 따라서 생성물이 PCR에 의해 증폭되지 않기 때문에 % 편집된 DNA 가닥과 동일하지 않다. 편집된 HTS 판독물의 비율은 x/(2-x)와 동일하며, 여기서, x는 편집된 THS 판독물의 실제 비율이다. 60% 편집에 대해, 편집된 염기의 실제 비율은 75%이다. "오프 타겟"은 오프-타겟 sgRNA에 결합되는 동안 동일한 DNA 기질과 함께 인큐베이션된 BE3을 나타낸다. sgRNA sgRH_13, sgHR_17, 및 가능하게는 sgHR_16은 생체내 주사 실험을 위한 유망한 표적으로 나타난 것으로 밝혀졌다.
BE3 단백질의 전달을 제브라피쉬에서 생체내에서 시험하였다. 제브라피시 배아 (n=16 내지 24)를 스크램블링된 sgRNA, sgHR_13, sgHR_16, 또는 sgHR_17 중 어느 하나로 주사하고, BE3을 정제하였다. 각각의 조건으로부터의 3개의 배아를 독립적으로 분석하고 (단일 배아), 각각의 조건에 대해, 모든 주사된 배아를 풀링하고, 풀로서 서열분석하였다. 결과는 도 83 내지 85에 나타나 있다.
실시예 11: 질환을 치료하기 위한 염기 편집제의 용도
본원에 제공된 염기 편집제 또는 복합체 (예를 들어, BE3)는 핵산을 변형시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 염기 편집제는 핵산 (예를 들어, DNA)에서 시토신을 티민으로 변화시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 변화는 그 중에서도 단백질의 아미노산 서열을 변경시키거나, 출발 코돈을 파괴하거나 생성하거나, 정지 코돈을 생성하거나, 스플라이싱 공여자를 교란시키거나, 스플라이싱 수용자를 교란시키거나, 조절 서열을 편집하기 위해 생성될 수 있다. 가능한 뉴클레오티드 변화의 예는 도 86에 나타나 있다.
본원에 제공된 염기 편집제 또는 복합체 (예를 들어, BE3)는 대상체에서 아포지단백질 E의 이소형을 편집하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 아포지단백질 E 이소형은 알츠하이머병을 발달시킬 보다 낮은 위험과 연관된 이소형을 생성하도록 편집될 수 있다. 아포지단백질 E는 아미노산 112 및 158에서 상이한 4개의 이소형을 갖는다. APOE4는 후기-발병 알츠하이머병에 대한 가장 크고 가장 통상적인 유전적 위험 인자이다. 핵산 서열 CGC에 의해 코딩되는 APOE4의 아르기닌 잔기 158은 염기 편집제 (예를 들어, BE3)를 사용함으로써 시스테인으로 변화되어 CGC 핵산 서열을 TGC로 변화시킬 수 있으며, 이는 잔기 158에서 시스테인을 코딩한다. 이 변화는 보다 낮은 알츠하이머병 위험과 연관된 APOE3r 이소형을 생성한다. 도 87을 참조한다.
염기 편집제 BE3이 마우스 성상세포에서 APOE4를 APOE3r로 편집하는 데 사용될 수 있는지 시험하였다 (도 88). APOE4 마우스 성상세포를 APOE4의 아르기닌 158을 코딩하는 핵산을 표적화하는 Cas9 + 주형 또는 BE3으로 뉴클레오펙션시켰다. Cas9 + 주형은 26% indel로 단지 0.3% 편집을 수득한 반면, BE3은 5% indel로 75% 편집을 수득하였다. 2개의 추가의 염기-편집된 시토신은 침묵되고, 아미노산 서열에 대한 변화를 생성하지 않는다 (도 88).
본원에 제공된 염기 편집제 또는 복합체는 예를 들어, 돌연변이를 PRNP 유전자 내로 도입함으로써 프리온 단백질 질환, 예컨대 크로이츠펠트-야콥병 및 태아 가족성 불면증을 치료하는 데 사용될 수 있다. PRNP 돌연변이를 복귀시키는 것은 치료적 결과를 생성하지 않을 수 있으며, PRNP에서의 indel은 병원성일 수 있다. 따라서, PRNP를 염기 편집제 (예를 들어, BE3)를 사용하여 돌연변이시켜 PRNP 유전자에서 조기 정지 코돈을 도입할 수 있는지 시험하였다. 그의 가이드 RNA와 회합된 BE3을 HEK 세포 또는 교모세포종 세포 내로 도입하고, PRNP 유전자를 편집하여 잔기 37에서 코딩된 아르기닌을 정지 코돈으로 변화시킬 수 있었다. BE3은 41% 편집을 수득하였다 (도 89).
편집될 수 있는 추가의 유전자는 하기를 포함한다: 증가된 알츠하이머 위험을 치료하기 위한 Arg 112 및 Arg 158의 APOE 편집; 알츠하이머 위험을 감소시키기 위한 Ala 673의 APP 편집; 태아 가족성 불면증 및 다른 프리온 단백질 질환을 치료하기 위한 Arg 37의 PRNP 편집; 뒤시엔느 근육 이영양증을 치료하기 위한 엑손 23 및 51 스플라이스 부위의 DMD 편집; 비만 위험을 치료하기 위한 인트론 1의 FTO 편집; 펜드레드 증후군 (유전적 난청)을 치료하기 위한 엑손 8의 PDS 편집; 선천성 청력 상실을 치료하기 위한 엑손 8의 TMC1 편집; 만성 육아종 질환을 치료하기 위한 다양한 환자-관련 돌연변이의 CYBB 편집. 본원에 제공된 염기 편집제를 사용하여 치료될 수 있는 추가의 질환은 하기 표 6에 나타나 있다.
UGI는 또한 핵심적 역할을 한다. UDG (UGI가 억제하는)를 녹아웃시키는 것은 C에서 T로의 염기 편집의 청결도 및 효율을 극적으로 개선시키는 것으로 나타났다 (도 90). 게다가, 니카제를 갖고 UGI가 없는 염기 편집제는 매우 높은 indel 비율로 결과물의 혼합물을 생성하는 것으로 나타났다 (도 91).
실시예 12: 염기 편집의 표적화 범위의 확장
염기 편집은 이중-가닥 DNA 파괴를 생성하지 않고, 공여자 DNA 주형을 요구하지 않고, 과량의 확률적 삽입 및 결실을 유도하지 않고, DNA에서 프로그램가능한, 단일-뉴클레오티드 C→T (또는 G→A) 변화를 유도하는 촉매적으로 결함성 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9, 시티딘 데아미나제, 및 염기 절제 복구의 억제제를 함유하는 융합 단백질을 사용하는 게놈 편집에 대한 새로운 접근법이다1. 염기 편집에 의해 표적화될 수 있는 부위의 수를 2.5-배 확장시키기 위해 상이한 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM) 특이성을 갖는 천연 및 조작된 Cas9 변이체를 사용하는 5가지 새로운 C→T (또는 G→A) 염기 편집제의 개발이 본원에 기재되어 있다. 추가적으로, 대략 5 뉴클레오티드 내지 1 또는 2개 뉴클레오티드의 겉보기 편집 윈도우의 폭을 좁히는 돌연변이된 시티딘 데아미나제 도메인을 함유하는 새로운 염기 편집제를 조작하여, 이전에 대등한 효율로 편집되었을 이웃하는 C 뉴클레오티드의 식별을 가능하게 하였다. 함께, 이들 개발은 염기 편집의 표적화 범위를 실질적으로 증가시킨다.
CRISPR-Cas9 뉴클레아제는 표적화된 게놈 편집을 매개하는 데 광범위하게 사용되었다2. 대부분의 게놈 편집 적용에서, Cas9는 단일 가이드 RNA (sgRNA)와 복합체를 형성하며, sgRNA 서열에 의해 특정된 표적 부위에서 이중-가닥 DNA 파괴 (DSB)를 유도한다. 세포는 주로 비-상동 말단-연결 (NHEJ) 복구 경로를 통해 이 DSB에 반응하며, 이는 유전자를 교란시키는 격자이동 돌연변이를 유발할 수 있는 확률적 삽입 또는 결실 (indel)을 발생시킨다. DSB에 플랭킹된 서열과 높은 정도의 상동성을 갖는 공여자 DNA 주형의 존재 하에서, 유전자 교정은 상동성 지정 복구 (HDR)로 공지된 대안적인 경로를 통해 달성될 수 있다.3,4 불행하게도, 대부분의 비-섭동 조건 하에서, HDR은 비효율적이고, 세포 상태 및 세포 유형에 의존하며, 보다 큰 빈도의 indel에 의해 지배된다.3,4 인간 질환과 연관된 공지된 유전적 변이의 대부분은 점 돌연변이이기 때문에5, 정확한 점 돌연변이를 보다 효율적이고 명확하게 생성할 수 있는 방법이 필요하다.
DSB를 유도하지 않고 프로그램가능한 방식으로 C:G 염기 쌍의 T:A 염기 쌍으로의 표적화된 대체를 가능하게 하는 염기 편집1이 최근 기재되었다. 염기 편집은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (SpCas9)의 촉매적으로 불활성화된 (dCas9) 또는 니카제 형태, 시티딘 데아미나제, 예컨대 APOBEC1, 및 염기 절제 복구의 억제제, 예컨대 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 사이의 융합 단백질을 사용하여 sgRNA에 의해 특정된 5-뉴클레오티드 윈도우 내에서 시티딘을 우리딘으로 전환시킨다.1 제3-세대 염기 편집제인 BE3은 다른 게놈 편집 방법을 사용하여 달성될 수 있는 것보다 더 높은 효율 및 더 낮은 indel 빈도로 다양한 세포주에서 질환-관련 점 돌연변이를 포함하여 C:G 염기 쌍을 T:A 염기 쌍으로 전환시킨다1. 후속 연구는 다양한 설정에서의 데아미나제-dCas9 융합 접근법을 확인하였다6,7.
BE3에 의한 효율적인 편집은 표적 C를 프로토스페이서의 PAM-원위 말단 (위치 4 내지 8, PAM을 위치 21 내지 23으로서 카운팅함) 부근의 5-뉴클레오티드 윈도우 내에 정치시키는 NGG PAM의 존재를 요구한다1. 이 PAM 요구는 BE3에 의해 효율적으로 표적화될 수 있는 인간 게놈에서의 부위의 수를 실질적으로 제한하며, 이는 관심 많은 부위가 표적 C의 13- 내지 17- 뉴클레오티드 하류에 NGG가 결여되기 때문이다. 더욱이, BE3의 높은 활성 및 프로세싱성은 편집 윈도우 내의 모든 C의 T로의 전환을 발생시키며, 이는 표적 유전자좌에 대한 목적하지 않은 변화를 잠재적으로 도입할 수 있다. 본원에는, 이들 제한 둘 다를 다루는 새로운 C:G에서 T:A로의 염기 편집제가 기재되어 있다.
DNA에 결합하고, 단일-가닥 DNA 버블을 함유하는 "R-루프" 복합체8를 형성하는 임의의 Cas9 상동체는 원칙적으로 염기 편집제로 전환될 수 있는 것으로 생각되었다. 이들 새로운 염기 편집제는 비-NGG PAM 부위가 편집되는 것을 허용함으로써 표적화가능한 유전자좌의 수를 확장시킬 것이다. 스타필로코쿠스 아우레우스로부터의 Cas9 상동체 (SaCas9)는 SpCas9보다 상당히 더 작고 (1053 대 1368 잔기), 포유동물 세포에서 효율적인 게놈 편집을 매개할 수 있으며, NNGRRT PAM을 요구한다9. SpCas9를 BE3에서 SaCas9로 대체하여 SaBE3을 생성하고, HEK293T 세포를 SaBE3 및 6개의 인간 게놈 유전자좌를 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다 (도 92a 및 92b). 3일 후, 게놈 유전자좌를 고처리량 DNA 서열분석 (HTS)으로 처리하여 염기 편집 효율을 정량화하였다. SaBE3은 인간 세포에서의 다양한 게놈 부위에서 표적 C의 C에서 T로의 염기 편집을, 위치 6 내지 11에서의 C의 표적화로부터 발생한 매우 높은 전환 효율 (형질감염된 세포에 대한 풍부화 없이, C에서 T로 전환된 총 DNA 서열의 대략 50 내지 75%)로 가능하게 하였다. NNGRRT-함유 표적 부위에 대한 SaBE3의 효율은 일반적으로 NGG-함유 표적 부위에 대한 BE3의 것을 초과하였다1. 아마도 그의 보다 높은 평균 효율로 인해, SaBE3은 또한 정규 BE3 활성 윈도우의 외부의 위치에서의 표적 C에서 검출가능한 염기 편집을 발생시킬 수 있다 (도 92c). 이에 비해, BE3은 공지된 SpCas9 PAM 선호도에 따라, 동일한 조건 하에서 유의하게 감소된 편집을 나타내었다 (0 내지 11%) (도 106a)10. 이들 데이터는 SaBE3이 BE3에 접근가능하지 않은 부위에서 매우 효율적인 염기 편집을 용이하게 할 수 있다는 것을 나타낸다.
염기 편집제의 표적화 범위는 PAM 특이성을 확장하거나 변경시키는 최근에 조작된 Cas9 변이체를 적용함으로써 추가로 확장되었다. 종 및 동료들은 최근 NGA (VQR-Cas9), NGAG (EQR-Cas9), 또는 NGCG(VRER-Cas9) PAM 서열을 수용하는 3개의 SpCas9 돌연변이체를 보고하였다11. 또한, 종 및 동료들은 NNNRRT에 대한 그의 PAM 요건을 완화시키는 3개의 돌연변이를 함유하는 SaCas9 변이체 (SaKKH-Cas9)를 조작하였다12. BE3의 SpCas9 부분을 이들 4가지 Cas9 변이체로 대체하여 VQR-BE3, EQR-BE3, VRER-BE3, 및 SaKKH-BE3을 생성하였으며, 이는 각각 NNNRRT, NGA, NGAG, 및 NGCG PAM을 표적화한다. HEK293T 세포를 이들 구축물 및 각각의 새로운 염기 편집제에 대한 6개의 게놈 유전자좌를 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시키고, HTS를 사용하여 C에서 T로의 염기 전환을 측정하였다.
SaKKH-BE3은 처리된, 비-풍부화된 세포의 62% 이하의 효율로 NNNRRT PAM을 갖는 부위를 편집하였다 (도 92d). 예상된 바와 같이, SaBE3은 NNNHRRT (여기서, H = A, C, 또는 T)인 PAM을 함유하는 표적을 효율적으로 편집할 수 없었다 (도 92d). VQR-BE3, EQR-BE3, 및 VRER-BE3은 BE3의 것과 유사한 편집 윈도우를 갖는 예상된 PAM 요건을 갖는 게놈 유전자좌에서 처리된, 비-풍부화된 세포의 50% 이하의 보다 보통의, 그러나 여전히 실질적인 염기 편집 효율을 나타내었다 (도 92e 및 92f). VQR-BE3, EQR-BE3, 및 VRER-BE3의 염기 편집 효율은 일반적으로 상응하는 Cas9 뉴클레아제의 보고된 PAM 요구와 밀접하게 평행하며; 예를 들어, EQR-BE3은 NGAH PAM 서열을 함유하는 표적을 효율적으로 편집할 수 없었다 (도 92f). 대조적으로, BE3은 아마도 그의 PAM 제한으로 인해, NGA 또는 NGCG PAM을 갖는 부위를 효율적으로 편집할 수 없었다 (0 내지 3%) (도 106b).
집합적으로, SaBE3, SaKKH-BE3, VQR-BE3, EQR-BE3, 및 VRER-BE3의 특성은 Cas9 상동체 및 조작된 변이체를 이용하는 그의 능력을 용이하게 하는 조정성을 나타내는 염기 편집제를 확립한다.
다음으로, 변경된 활성 윈도우 폭을 갖는 염기 편집제를 개발하였다. BE3의 활성 윈도우 내의 모든 C는 T로 효율적으로 전환될 수 있다1. 이 윈도우의 폭을 조정하는 능력은 단지 BE3 활성 윈도우에 존재하는 C의 하위세트를 편집하는 것이 중요한 경우에 유용할 것이다.
APOBEC1 및 dCas9 사이의 링커의 길이는 시험관내에서 APOBEC1에 의해 접근가능한 염기의 수를 조정하는 것으로 이전에 관찰되었다1. 그러나, HEK293T 세포에서, 링커 길이를 다양화하는 것은 편집 윈도우의 폭을 유의하게 조정하지 않았으며, 이는 복잡한 세포 환경에서, dCas9 및 시티딘 데아미나제의 상대적 배향 및 유연성이 링커 길이에 의해 강하게 결정되지 않음을 시사한다 (도 96). 다음으로, sgRNA의 5' 말단을 말단절단하는 것은 RNA-DNA 헤테로듀플렉스의 형성시 데아미나제에 접근가능한 단일-가닥 DNA의 길이를 감소시킴으로써 염기 편집 윈도우를 좁힐 수 있는 것으로 생각되었다. HEK293T 세포를 BE3 및 편집 윈도우에서의 다중 C를 갖는 유전자좌를 표적화하는 상이한 스페이서 길이의 sgRNA를 코딩하는 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 17- 내지 19-염기 스페이서를 갖는 말단절단된 sgRNA를 사용하는 경우 염기 편집의 폭의 일치하는 변화는 관찰되지 않았다 (도 95a 내지 95c). sgRNA 스페이서를 17 염기 미만으로 말단절단하는 것은 활성의 큰 상실을 발생시켰다 (도 95a).
대안적인 접근법으로서, 데아미나제 도메인에 대한 돌연변이는 다중 가능한 메카니즘을 통해 편집 윈도우의 폭을 좁힐 수 있는 것으로 생각되었다. 첫째로, 일부 돌연변이는 기질 결합, 결합된 DNA의 형태, 또는 활성 부위에 대한 기질 접근성을 데아미나제 활성 부위에 대한 C의 비-최적 제시에 대한 내약성을 감소시키는 방식으로 변경시킬 수 있다. 둘째로, APOBEC1의 높은 활성은 DNA 결합 사건당 다중 C의 탈아미노화에 기여할 가능성이 있기 때문에,1,13,14 염기 편집제의 데아미나제 도메인의 촉매 효율을 감소시키는 돌연변이는 그것을 DNA로부터 해리되기 전에 연속적 라운드의 탈아미노화를 촉매하는 것으로부터 방지할 수 있다. 일단 임의의 C:G에서 T:A로의 편집 사건이 발생하면, sgRNA는 표적 DNA 서열을 더 이상 완벽하게 매칭시킬 수 없으며, 표적 유전자좌에의 염기 편집제의 재-결합은 덜 선호되어야 한다. 원래 편집 윈도우 내의 다중 시티딘 중에서 구별하는 새로운 염기 편집제를 개발하기 위한 노력으로 둘 다의 전략을 시험하였다.
이용가능한 APOBEC1 구조의 부재를 고려하여, APOBEC3G의 촉매 활성을 조정하는 몇몇 돌연변이가 이전에 보고되었으며, APOBEC1의 그것과 그의 활성 부위-함유 도메인의 42% 서열 유사성을 공유하는 동일한 패밀리로부터의 시티딘 데아미나제가 확인되었다15. 상응하는 APOBEC1 돌연변이를 BE3 내로 혼입하고, HEK293T 세포에서 위치 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 및 14 (부위 A)에 C를 함유하거나; 위치 5 ,6, 7, 8, 9, 10, 11, 및 13 (부위 B)에 C를 함유하는 2개의 C-풍부 게놈 부위에서 염기 편집 효율 및 편집 윈도우 폭에 대한 그의 효과를 평가하였다.
APOBEC1 돌연변이 R118A 및 W90A 각각은 염기 편집 효율의 극적인 상실을 발생시켰다 (도 97c). R132E는 편집 효율의 일반적 감소를 발생시켰지만, 편집 윈도우의 형상을 실질적으로 좁히도록 변화하지 않았다 (도 97c). 대조적으로, 실질적인 편집 효율을 유지하면서 편집 윈도우의 폭을 좁힌 몇몇 돌연변이가 밝혀졌다 (도 93a 및 97c). "편집 윈도우 폭"은 그 내에서 편집 효율이 그 표적에 대한 반수-최대 값을 초과하는 인위적으로 계산된 윈도우 폭을 나타나는 것으로 정의되었다. 시험된 2개의 C-풍부 게놈 부위에 대한 BE3의 편집 윈도우 폭은 5.0개 (부위 A) 및 6.1개 (부위 B) 뉴클레오티드였다.
APOBEC1에서의 R126은 ssDNA의 포스페이트 백본과 상호작용할 것으로 예측된다13. 이전의 연구는 APOBEC3G 내로 상응하는 돌연변이를 도입하는 것이 촉매작용을 적어도 5-배 감소시켰음을 보여주었다14. 흥미롭게도, BE3에서의 APOBEC1 내로 도입되는 경우, R126A 및 R126E는 다른 위치에서의 편집 활성을 감소시키면서, 가장 강하게 편집된 위치 (C5, C6, 및 C7)에서 BE3에 비해 활성을 증가시키거나 유지하였다 (도 93a 및 97c). 따라서, 이들 2가지 돌연변이의 각각은 부위 A 및 부위 B에서의 편집 윈도우의 폭을 각각 4.4 및 3.4개 뉴클레오티드 (R126A)로, 또는 4.2 및 3.1개 뉴클레오티드 (R126E)로 좁혔다 (도 93a 및 97c).
APOBEC1에서의 W90 (APOBEC3G에서의 W285에 상응함)은 APOBEC3G 활성 부위에서 소수성 포켓을 형성하고, 기질 결합에 보조할 것으로 예측된다13. 이 잔기를 Ala로 돌연변이시키는 것은 APOBEC3G의 촉매 활성을 폐지하였다13. BE3에서, W90A는 염기 편집 효율을 거의 완전히 폐지하였다 (도 97c). 대조적으로, W90Y는 부위 A 및 부위 B에서의 편집 윈도우 폭을 각각 3.8 및 4.9개 뉴클레오티드로 좁히면서 염기 편집 활성을 단지 보통으로 감소시킨 것으로 밝혀졌다 (도 93a). 이들 결과는 시티딘 데아미나제 도메인에 대한 돌연변이가 상응하는 염기 편집제의 활성 윈도우 폭을 좁힐 수 있다는 것을 입증한다.
염기 편집 활성을 대폭 감소시키지 않고 편집 윈도우를 좁힌 3가지 돌연변이인 W90Y, R126E, 및 R132E를 이중으로 및 삼중으로 돌연변이된 염기 편집제 내로 조합하였다. 이중 돌연변이체 W90Y+R126E는 BE3-유사 최대 편집 효율을 갖는 염기 편집제 (YE1-BE3)를 발생시켰지만, 편집 윈도우 폭을 실질적으로 좁혔다 (부위 A 및 부위 B에서의 폭 = 각각 2.9 및 3.0개 뉴클레오티드) (도 93a). W90Y+R132E 염기 편집제 (YE2-BE3)는 보통으로 더 낮은 편집 효율을 나타내었으며 (BE3에 비해 시험된 5개의 부위에 걸쳐 평균 1.4-배 더 낮은 최대 편집 수율), 또한 편집 윈도우 폭을 실질적으로 좁혔다 (부위 A 및 부위 B에서의 폭 = 각각 2.7 및 2.8개 뉴클레오티드) (도 97c). R126E+R132E 이중 돌연변이체 (EE-BE3)는 YE2-BE3과 유사한 최대 편집 효율 및 편집 윈도우 폭을 나타내었다 (도 97c). 삼중 돌연변이체 W90Y+R126E+R132E (YEE-BE3)는 2.0-배 더 낮은 평균 최대 편집 수율, 그러나 C6 위치 넘어 매우 적은 편집 및 부위 A 및 부위 B에 대해 각각 2.1 및 1.4개 뉴클레오티드의 편집 윈도우 폭을 나타내었다 (도 97c). 종합하면 이들 데이터는 시티딘 데아미나제 도메인에서의 돌연변이가, 일부의 경우 편집 효율에 대한 최소 또는 단지 보통의 효과로 편집 윈도우 폭에 강하게 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낸다.
BE3, YE1-BE3, YE2-BE3, EE-BE3, 및 YEE-BE3의 염기 편집 결과물을 BE3 활성 윈도우 내에 다중 C를 함유하는 4개의 널리-연구된 인간 게놈 부위를 표적화하는 HEK293T 세포에서 추가로 비교하였다1. 이들 표적 유전자좌는 위치 4 및 5 (HEK 부위 3), 위치 4 및 6 (HEK 부위 2), 위치 5 및 6 (EMX1), 또는 위치 6, 7, 8, 및 11 (FANCF)에 표적 C를 함유하였다. BE3은 위치 4 내지 8 활성 윈도우 내의 임의의 C를 편집하는 데 대해 거의 (1.2-배 미만) 선호도를 나타내지 않았다. 대조적으로, YE1-BE3은 C4에 비해 C5를 편집하는 데 1.3-배 선호도 (HEK 부위 3), C4에 비해 C6에 대해 2.6-배 선호도 (HEK 부위 2), C6에 비해 C5에 대해 2.0-배 선호도 (EMX1), 및 C7에 비해 C6에 대해 1.5-배 선호도 (FANCF)를 나타내었다 (도 93b). YE2-BE3 및 EE-BE3은 YE1-BE3보다 다소 더 큰 위치적 특이성 (더 좁은 활성 윈도우)을 나타내었으며, C4에 비해 C5를 편집하는 데 평균 2.4-배 선호도 (HEK 부위 3), C4에 비해 C6에 대해 9.5-배 선호도 (HEK 부위 2), C6에 비해 C5에 대해 2.9-배 선호도 (EMX1), 및 C6에 비해 C7에 대해 2.6-배 선호도 (FANCF)였다 (도 93b). YEE-BE3은 가장 큰 위치적 선택성을 나타내었으며, C4에 비해 C5를 편집하는 데 2.9-배 선호도 (HEK 부위 3), C4에 비해 C6에 대해 29.7-배 선호도 (HEK 부위 2), C6에 비해 C5에 대해 7.9-배 선호도 (EMX1), 및 C6에 비해 C7에 대해 7.9-배 선호도 (FANCF)를 가졌다 (도 93b). 상기 발견은 돌연변이체 염기 편집제가 둘 다의 뉴클레오티드가 BE3 편집 윈도우 내에 있는 경우에도 인접한 C 사이를 식별할 수 있다는 것을 확립한다.
이들 4가지 돌연변이체 및 BE3의 생성물 분포를 HTS에 의해 추가로 분석하여 그의 겉보기 프로세싱성을 평가하였다. BE3은 처리된 HEK293T 세포에서 현저하게 T4-T5 (HEK 부위 3), T4-T6 (HEK 부위 2), 및 T5-T6 (EMX1) 생성물을 생성하였으며, 이는 평균적으로 단일 T를 함유하는 생성물보다 7.4-배 더 많은 2개의 T를 함유하는 생성물을 발생시킨다. 대조적으로, YE1-BE3, YE2-BE3, EE-BE3, 및 YEE-BE3은 단독을 편집된 C4-T5, C4-T6, 및 T5-C6 생성물에 대해 실질적으로 더 높은 선호도를 나타내었다 (도 93c). YE1-BE3은 1.4의 평균 단일-T 대 이중-T 생성물 비를 갖는 생성물을 생성하였다. YE2-BE3 및 EE-BE3은 각각 4.3 및 5.1의 평균 단일-T 대 이중-T 생성물 비를 갖는 생성물을 생성하였다 (도 93c). 상기 결과와 일치하게, YEE-BE3 삼중 돌연변이체는 3개의 게놈 유전자좌에 걸쳐 단일-T 생성물을 평균 14.3-배 선호하였다 (도 93c). 단지 1개의 C가 표적 윈도우 내에 있는 표적 부위 (HEK 부위 4, 위치 C5에서)에 대해, 모든 4가지 돌연변이체는 BE3과 대등한 편집 효율을 나타내었다 (도 98). 이들 발견은 이들 BE3 돌연변이체가 감소된 겉보기 프로세싱성을 가지며, BE3 편집 윈도우 내에 다중 C를 함유하는 표적 부위에서의 단지 단일 C의 전환을 선호할 수 있다는 것을 나타낸다. 이들 데이터는 또한 이들 돌연변이체 염기 편집제에 대해 C5 > C6 > C7
Figure pct00189
C4의 위치적 선호도를 시사하지만, 이 선호도는 표적 서열에 따라 상이할 수 있다.
APOBEC1에서의 윈도우-조정 돌연변이를 VQR-BE3에 적용하였으며, 이는 NGA PAM에 의해 표적화된 부위에서 기질의 선택적 염기 편집을 허용하였다 (도 107a). 그러나, 이들 돌연변이를 SaKKH-BE3에 적용한 경우, 기질 선택성의 개선 없이 염기 편집 효율의 선형 감소가 관찰되었으며, 이는 BE3 및 그의 변이체의 것들과는 이 염기 편집제의 상이한 동역학적 평형 및 기질 접근성을 시사한다 (도 107b).
이 연구에 기재된 변경된 PAM 특이성을 갖는 5가지 염기 편집제는 함께, 원칙적으로 염기 편집에 의해 2.5-배 교정될 수 있는 클린바 데이터베이스에서의 질환-연관된 돌연변이의 수를 증가시킨다 (도 94a 및 94b). 유사하게, 좁혀진 편집 윈도우를 갖는 염기 편집제의 개발은 비-표적 C의 대등한 변형 없이 염기 편집에 의해 교정될 수 있는 적절하게 위치된 NGG PAM을 갖는 클린바 엔트리의 분율을 대략 배가시킨다 (BE3에 대해 31% 내지 YEE-BE3에 대해 59%) (도 94a 및 94b).
요약하면, 염기 편집의 표적화 범위는 상이한 PAM 특이성을 갖는 Cas9 변이체를 사용하는 염기 편집제를 개발함으로써, 및 다양한 편집 윈도우 폭을 갖는 데아미나제 돌연변이체의 집합을 개발함으로써 실질적으로 확장되었다. 이론적으로, 염기 편집은 단일-가닥-특이적 뉴클레오티드 데아미나제 효소에 대한 기질로서 기능할 수 있는 단일-가닥 DNA의 버블을 생성하는 다른 프로그램가능한 DNA-결합 단백질 (예컨대 Cpf116)을 사용하여 가능해야 할 것이다.
물질 및 방법
클로닝. PCR을 Q5 핫 스타트 고-충실도 DNA 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여 수행하였다. BE 및 sgRNA에 대한 플라스미드를 이전에 보고된 플라스미드1로부터 수득된 USER 클로닝 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)을 사용하여 구축하였다. DNA 벡터 증폭을 NEB 10베타 적격 세포 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여 수행하였다.
세포 배양. HEK293T (ATCC CRL-3216)를 10% (v/v) 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 플러스 글루타맥스 (써모피셔)에서 37℃에서 5% CO2로 배양하였다. APOE 유전자의 ApoE4 이소형을 함유하는 불멸화 래트 성상세포 (타코닉 바이오사이언시즈)를 10% (v/v) 소 태아 혈청 (FBS) 및 200 μg/mL 제네티신 (써모피셔 사이언티픽)으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 플러스 글루타맥스 (써모피셔 사이언티픽)에서 유지하였다.
형질감염. HEK293T 세포를 48-웰 콜라겐-코팅된 바이오코트 플레이트 (코닝) 상에 시딩하고, 대략 85% 융합도로 형질감염시켰다. 750 ng의 BE 및 250 ng의 sgRNA 발현 플라스미드를 웰당 1.5 μl의 리포펙타민 2000 (써모피셔 사이언티픽)을 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 형질감염시켰다.
게놈 DNA 샘플의 고처리량 DNA 서열분석. 형질감염된 세포를 3일 후에 수거하고, 게놈 DNA를 아젠코트 DN어드밴스 게놈 DNA 단리 키트 (베크만 쿨터)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 단리하였다. 관심 게놈 영역을 보충적 서열에 열거된 플랭킹 HTS 프라이머 쌍으로 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 증폭을 푸션 핫-스타트 II DNA 폴리머라제 (써모피셔)로 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. PCR 생성물을 래피드팁스 (디피니티 게노믹스)를 사용하여 정제하였다. 2차 PCR을 수행하여 서열분석 어댑터를 부착시켰다. 생성물을 겔-정제하고, 카파 라이브러리 정량화 키트-일루미나 (카파 바이오시스템즈)를 사용하여 정량화하였다. 샘플을 이전에 기재된 바와 같이 일루미나 MiSeq 상에서 서열분석하였다1.
데이터 분석. 뉴클레오티드 빈도를 이전에 기재된 매트랩 스크립트를 사용하여 평가하였다1. 간략하게, 판독물을 스미스-워터만 알고리즘을 통해 참조 서열에 대해 정렬하였다. 30 미만의 Q-점수를 갖는 염기 호출을 플레이스홀더 뉴클레오티드 (N)로 대체하였다. 이 품질 역치는 1000 중 1의 예상된 이론적 오차 비율을 갖는 뉴클레오티드 빈도를 발생시킨다.
염기 편집 프로세싱성의 분석을 주문제작 피톤 스크립트를 사용하여 수행하였다. 이 프로그램은 표적 부위에 플랭킹되어야 하는 7개 뉴클레오티드 서열에 대한 완벽한 매치에 의해 측정되는 바와 같이 서열분석 판독물을 20개 뉴클레오티드 프로토스페이서 서열에 대해 트리밍한다. 그 후, 이들 표적을 통합하고, 풍부도에 의해 분류하여 염기 편집 생성물의 빈도를 평가하였다.
인간 질환-연관된 돌연변이의 클린바 데이터베이스의 생물정보학적 분석을 작은 수정을 제외하고 이전에 기재된 것과 유사한 방식으로 수행하였다1. 이들 수정은 주문제작가능한 길이 및 서열의 PAM을 갖는 표적의 확인을 가능하게 한다. 또한, 이 개선된 스크립트는 표적 C 위치의 우선순위 랭킹 (C5 > C6 > C7 >C8
Figure pct00190
C4)을 포함하며, 따라서 온-타겟 C가 윈도우 내에서 단지 시토신이거나, 편집 윈도우 내에서 임의의 오프-타겟 C보다 더 높은 예측된 편집 효율을 갖는 위치에 놓이는 표적 부위의 확인을 가능하게 한다.
실시예 12에 대한 참고문헌
Figure pct00191
Figure pct00192
실시예 13
개선된 형질감염 절차 및 보다 양호한 플라스미드를 사용하여, 생물학적 반복 (n=3)을 사용하여 4가지 HF 돌연변이를 BE3의 Cas9 부분 내로 설치하였다. 돌연변이는 플라스미드 전달로 온-타겟팅 편집을 유의하게 실시하지 않는다 (도 99). 시험된 농도에서, BE3 단백질 전달은 작용하지만; 그러나, 온-타겟 편집은 플라스미드 전달에 대해서보다 더 낮다 (도 100). 설치된 HF 돌연변이를 갖는 BE3의 단백질 전달은 온-타겟팅 편집 효율을 감소시키지만, 여전히 일부 편집된 세포를 생성한다 (도 101).
리포펙션 및 HF 돌연변이의 설치 둘 다는 오프-타겟 탈아미노화 사건을 감소시키는 것으로 나타났다. 도 102에 제시된 4개의 부위에 대해, 가장 높은 GUIDE-Seq 판독물 및 탈아미노화 사건을 갖는 오프-타겟 부위 (OT)를 검정하였다 (Komor et al., Nature, 2016). 가장 가까운 상응하는 C에서의 오프-타겟 편집을 온-타겟 편집으로 나눔으로써 특이성 비를 계산하였다. 오프-타겟 편집이 검출가능하지 않은 경우, 비는 100으로 설정되었다. 따라서, 보다 높은 특이성 비는 보다 많은 특이적 구축물을 나타낸다. BE3 플라스미드 전달은 BE3의 단백질 전달, HF-BE3의 플라스미드 전달, 또는 HF-BE3의 단백질 전달보다 훨씬 더 높은 오프-타겟/온-타겟 편집을 나타내었다 (도 102 및 105).
정제된 단백질 HF-BE3 및 BE3을 가장 허용적인 모티프를 갖는 스페이서에서의 상이한 위치에서 C를 T 잔기로 전환시키는 그의 능력에 대해 시험관내에서 분석하였다. BE3 및 HF-BE3 단백질 둘 다는 염기 편집에 대해 동일한 "윈도우"을 갖는 것으로 밝혀졌다 (도 103 및 104).
질환 표적의 목록이 표 8에 주어진다. 표 8에서 편집되는 염기는 볼드체 및 밑줄표시로 지시된다.
표 8. 염기 편집제 질환 표적
Figure pct00193
표 6. 염기 편집제를 사용하여 치료될 수 있는 예시적인 질환. 프로토스페이서 및 PAM 서열 (서열식별번호: 577-589)은 sgRNA (PAM) 열에 나타나 있다. PAM 서열은 괄호 안에 및 밑줄표시됨으로써 지시되는 편집되는 염기와 함께 나타나 있다.
Figure pct00194
실시예 14: 염기 편집 구축물의 시험
BE3, BE4-pmCDA1, BE4-hAID, BE4-3G, BE4-N, BE4-SSB, BE4-(GGS)3, BE4-XTEN, BE4-32aa, BE4-2xUGI, 및 BE4를 포함한 여러 염기 편집 구축물을 상이한 표적 서열 (즉, EMX1, FANCF, HEK2, HEK3, HEK4, 및 RNF2) 내의 시토신 (C) 잔기를 편집하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 예를 들어, 이들 구축물이 C에서 T로의 돌연변이를 생성할 수 있는지 시험하였다. 염기 편집 구축물의 개략적 표현이 도 109에 제시된다. 시험된 표적 서열이 또한 도 109에 제시되고, 표적화된 시토신은 넘버링되고 적색으로 표시된다.
하기 아미노산 서열을 본 실시예의 염기 편집 구축물에서 사용하였다:
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Figure pct00196
도 109에 제시된 구축물의 아미노산 서열이 하기에 제시된다:
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EMX1, FANCF, HEK2, HEK3, HEK4, 및 RNF2의 표적 시토신 잔기를 돌연변이시키는 도 109의 염기 편집 구축물의 능력이 도 110-115에 제시된다. 편집된 표적 시토신의 백분율 (T, A 또는 G로 돌연변이된 C 잔기의 비율 포함), 뿐만 아니라 생성된 indel의 %가 도 110-115에 제시된다. 편집된 표적 시토신의 백분율을 하기 식을 사용하여 계산하였다: 100-[C를 갖는 서열분석 판독물의 %]. 도 110-115의 파이 차트는 표시된 다양한 염기를 갖는 판독물의 분포를 보여주며, 이는 모든 염기 편집된 판독물 (표시된 염기에서 C 이외의 뉴클레오티드를 갖는 판독물) 중 A, G, 또는 T를 갖는 것들의 백분율이 얼마인지 살펴보는 것을 의미한다. 하기 표 9 내지 표 14는 도 110-115의 파이 차트에 의해 표시되는 돌연변이 백분율의 값을 나타낸다.
관찰된 C에서 비-T로의 편집은 UDG (우라실 DNA 글리코실라제)로 인한 것일 가능성이 있다. 예를 들어, C가 우라실 중간체로 전환되면, UDG는 이를 무염기성 부위로 전환시킬 수 있다. 이어서, 이러한 무염기성 부위는 다른 내인성 효소에 의해 프로세싱되고, 결국 indel 또는 다른 염기 (예컨대 G 또는 A)가 C를 대체하는 것을 야기한다. 본 발명자들은 UDG 녹-아웃 세포주에서 indel을 거의 내지 전혀 갖지 않는 증가된 C에서 T로의 편집을 보여준다는 것을 밝혀냈다.
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실시예 15: 표적화된 가닥을 절단하는 Cpf1 니카제를 포함하는 염기 편집제.
상기 논의된 바와 같이, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것의 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 Cpf1 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, Cpf1 단백질은 Cpf1 니카제 (nCpf1)이다. Cpf1 니카제, 예를 들어 비-표적 가닥을 절단하는 Cpf1 니카제 (AsCpf1 내의 R1225A; 및 LbCpf1 내의 R1138A)는 문헌 [Yamano et al., "Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA." Cell (165) 2016, p. 949-962]에 기재되어 있으며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 그러나, 표적 가닥을 절단하는 니카제 (예를 들어, 염기 편집제 단백질의 Cpf1 니카제)는 염기 편집 효율을 개선시킬 것으로 예상된다.
형광 표지된 DNA를 사용하여 비-표적 가닥보다는 표적 가닥을 우선적으로 니킹하는 Cpf1 돌연변이체를 확인하였다 (도 116 참조). 도 116에서, DNA 구축물 1-3의 상부 가닥은 비-표적 가닥이고, 하부 가닥은 표적 가닥이다. 야생형 LbCpf1, R836A (LbCpf1), 및 R1138A (LbCpf1)를 사용하여 시험관내 검정을 수행한다. R836A (LbCpf1)는 "손상된" 니카제인 것으로 보이며, 이는 그것이 비-표적 가닥보다 더 효율적으로 표적 가닥을 절단한다는 것을 의미한다. 도 117에 제시된 바와 같이, 비-표적 가닥은 절단되지 않았고, 형광 350 조각이 관찰되지 않았다. 2시간 후, 가닥 둘 다를 절단하였다. 상이한 강도는 비-표적 가닥보다 더 많은 표적 가닥이 절단된다는 것을 시사한다.
AsCp1-BE3을 사용한 염기 편집 윈도우의 확립
napDNAbp로서 LbCpf1(R836A) 또는 AsCpf1(R912A)을 갖는 염기 편집 단백질 (예를 들어, BE3 (SpCas9-BE3))은 낮은 효율로 (0.1% 내지 0.4%) 염기를 편집하는 것으로 밝혀졌다. AsCpf1 (R912A) napDNAbp를 갖는 염기 편집제는 EMX1, FANCF, HEK3 및 HEK4 부위에서 표적 C를 더 효율적으로 돌연변이시켰다. 시험된 구축물의 편집 윈도우는 제7 염기에서 제11 염기인 것으로 보인다. 숫자는 가장 높은 수를 갖는 BE3 및 보다 낮은 수를 갖는 자기-무력화 BE (비-표적 가닥을 절단하는 APOBEC-AsCpf1(R1225A)-UGI)와 경향이 일치한다. 도 118 참조 EMX1 상에 Cas9-BE3를 갖는 양성 대조군: 5-6%. AsCpf1에 대한 indel 값: >20%. AsCpf1 내의 R912는 Cpf1 패밀리의 많은 구성원에 걸쳐 보존된다. LbCpf1 내의 상응하는 잔기는 R836이고, 이는 R이 A로 돌연변이되는 경우에 "손상된" 니카제인 것으로 여겨진다.
Cpf1-BE (링커)의 최적화
indel 데이터는 Cpf1이 DNA 표적 부위에 접근할 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, Cpf1 염기 편집 단백질의 최적화는 특정 APOBEC 단백질, 링커, 및/또는 UGI 도메인에 초점을 맞추었다. LbCpf1 (R836A) 및 AsCpf1 (R912A) 둘 다를 사용하여 다양한 링커를 사용하여 도 119에 제시된 구축물을 시험하였다. 간략하게, APOBEC와 Cpf1 도메인 (예를 들어, AsCpf1 또는 LbCpf1) 사이의 상이한 링커 서열 (즉, XTEN, GGS, (GGS)3 (서열식별번호: 610), (GGS)5 (서열식별번호: 610), 및 (GGS)7 (서열식별번호: 610))을 시험하였다. 도 120을 참조한다. 구축물을 TGCTTCTC8CAGCCCTGGCCTGG (서열식별번호: 592)인 HEK3 부위의 C8 잔기를 돌연변이시키는 그의 능력에 대해 시험하였다. AsCpf1을 사용한 염기 편집 단백질에 대한 편집 수준은 1% 초과에 도달한 반면, LbCpf1을 사용한 염기 편집 단백질은 염기 편집 효율의 상대 감소를 보여주었다. 도 121에 제시된 바와 같이, 통합 생물정보학 VU 센터에 의해 유지된 데이터베이스로부터의 링커는 AsCpf1-BE3에 대해 GGS-유형 링커만큼 유의한 개선을 보여주지 않았다. 도 121에 제시된 링커는 하기에 제시된다:
Figure pct00217
Cpf1-BE (배향)의 최적화
Cas9는 C와 N 말단 사이의 아미노산의 스트레치를 갖는 반면 (적색 사각형, 도 123 참조), AsCpf1은 그렇지 않다 (도 122 참조). 또한, AsCpf1은 N과 C 말단 사이의 거리가 더 짧다. 이러한 관찰은 UGI가 비-표적 가닥에 대한 APOBEC 접근을 방해할 수 있는 (N 말단 상의) APOBEC와 (C 말단 상의) UGI 사이의 잠재적 간섭을 나타낸다. 하나의 해결책은 APOBEC 및 UGI를 N 또는 C의, 동일한 말단 상으로 이동시키는 것이다. 따라서, 아키텍처 NLS-UGI-APOBEC-XTEN-AsCpf1; UGI-APOBEC-XTEN-AsCpf1-NLS; 및 AsCpf1-XTEN-APOBEC-NLS를 갖는 구축물이 시험될 것이다.
Cpf1-BE (내부 말단절단)의 최적화
비-표적 가닥이 풀려 있는 Cpf1의 공지된 결정 구조는 존재하지 않는다 (도 124, 시안색 참조). 편집 윈도우는 도 124에 제시된 바와 같은 적색 원 내에 있어야 한다고 여겨진다. APOBEC를 방해할 수 있는 나선 영역이 존재한다 (도 124의 정사각형 참조). 이러한 영역은 아미노산 서열 K(661)KTGDQK(667) (서열식별번호: 603)을 포함한다.
2, 4 또는 6개의 잔기의 제거가 염기 편집 효율을 개선시키는지 시험하기 위해, 표적 부위로서 HEK3을 사용하여 AsCpf1(R912A) napDNAbp를 갖는 염기 편집제로 실험을 수행하였다. 편집 수준은 T663 및 D665가 결실된 경우에 대조군 수준으로부터 대략 2.6%로 증가한다 (- 6배 증가) (하기 표 7 참조). 본 실험에서 사용된 구축물은 APOBEC-XTEN-AsCpf1(R912A)-SGGS-UGI였다.
표 7
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참고문헌
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Figure pct00223
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실시예 16: 단백질 조작 및 단백질 전달을 통한 염기 편집의 DNA 특이성 및 적용가능성 개선
염기 편집, 이중 가닥 DNA 절단이 없는 한 염기 쌍의 또 다른 것으로의 프로그램가능한 전환을 가능하게 하는 게놈 편집 접근법, 과도한 확률적 삽입 및 결실, 또는 상동성-지정 복구에 대한 의존이 개발되었다. 염기 편집의 적용은 오프-타겟 활성 및 세포내 DNA 전달에 대한 의존에 의해 제한된다. 여기서, 이러한 한계를 해결하는 2가지 진전이 기재된다. 먼저, 오프-타겟 염기 편집은 고충실도 염기 편집제 (HF-BE3)를 생성하기 위해 돌연변이를 제3 세대 염기 편집제 (BE3) 내에 설치함으로써 감소되었다. 다음으로, BE3 및 HF-BE3을 정제하고, 리보핵단백질 (RNP) 복합체로서 포유동물 세포 내로 전달하고, DNA-무함유 염기 편집을 확립한다. BE3의 RNP 전달은 대등한 온-타겟 편집 수준을 유지하면서 HF-BE3의 플라스미드 형질감염보다 훨씬 더 높은 특이성을 부여한다. 마지막으로, 이들 진전을 적용하여 BE3 RNP를 제브라피쉬 배아 및 살아있는 마우스의 내이 둘 다로 전달하여, 생체내에서 특이적인 DNA-무함유 염기 편집을 달성한다.
도입
전통적인 게놈 편집제는 게놈 편집의 제1 단계로서 이중-가닥 DNA 파괴 (DSB)를 도입한다1-4. 세포는 주로 비-상동 말단 연결 (NHEJ)을 통해 DSB에 반응하여, 절단 부위에서 확률적 삽입 또는 결실 (indel)을 발생시킨다1,5. 게놈 DNA에서 보다 정확한 변화를 생성하기 위해, 상동성-지정 복구 (HDR)는 절단 부위를 둘러싼 게놈 DNA를 외인성으로 공급된 DNA 공여자 주형의 것으로 대체하는 데 사용될 수 있다6-8. 불행히도, HDR은 전형적으로 NHEJ와 경쟁하여 생성된 과량의 indel을 동반하고, 이는 주로 유사분열 세포로 제한된다. 또한, 대부분의 게놈 편집 방법은 외인성 플라스미드 또는 바이러스 DNA의 포유동물 세포 내로의 전달에 이어서 작용제의 세포내 발현에 의존한다9-12. 이들 전달 방법은 온-타겟 유전자좌가 편집된 후에도 연속적인 제어되지 않은 Cas9 및 sgRNA 발현을 발생시켜, 오프-타겟 유전자좌에서의 게놈 편집의 기회를 증가시킨다1,13.
염기 편집, C:G 염기 쌍의 T:A 염기 쌍으로의 직접적 프로그램가능한 표적화된 전환을 가능하게 하는 게놈 편집에 대한 상이한 접근법이 최근에 기재되었다3,14. 제3 세대 염기 편집제 BE3은 단일 단백질 내에 (i) 가이드 RNA-특정된 유전자좌에서 소형 단일 가닥 DNA 버블을 개방하는 촉매적으로 손상된 Cas9, (ii) 단일 가닥 DNA 버블 내의 대략 5개 뉴클레오티드의 윈도우 내에서 C를 U로 전환시키는 테더링된 단일 가닥-특이적 시티딘 데아미나제, (iii) 염기 절제 복구를 억제함으로써 염기 편집의 효율 및 생성물 선택성을 개선시키는 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI), 및 (iv) G-함유 DNA 가닥을 대체하는 것으로 세포 미스매치 복구를 조작하기 위한 니카제 활성을 함유한다. 이들 성분의 조합은 최소의 indel을 형성하면서 포유동물 세포에서 효율적이고 영구적인 C에서 T로의 (또는 G에서 A로의) 전환을 가능하게 한다. 이전에 보고된 이후로14, 다른 연구자들이 포유동물 세포15-17 및 식물18에서의 Cas9-지정 C에서 T로의 전환을 용이하게 하는 이러한 전략 및 관련 접근법의 능력을 확인하였다.
여기서, 염기 편집의 DNA 특이성을 크게 개선시키고, 시험관내에서 및 생체내에서 외인성 DNA를 공급하지 않으면서, 숙주 게놈과의 재조합 및 세포독성의 위험과 연관된 염기 편집을 허용하는 2가지 진전이 기재된다18,19. 먼저, 온-타겟 편집 활성에서 오직 보통의 감소를 가지면서 오프-타겟 편집 사건을 감소시키는 Cas920의 DNA 친화도를 감소시키는 것으로 공지된 돌연변이를 혼입시키는 BE3의 돌연변이체 형태가 조작된다. 이어서, 가이드 RNA와 복합체화된 염기 편집제 단백질의 지질-매개 전달이 플라스미드 DNA 전달과 비교하여 온-타겟 염기 편집에서 명백한 감소 없이 훨씬 더 큰 특이성 증진을 발생시킨다는 것이 밝혀졌다. RNP로서의 염기 편집제의 전달은 전형적으로, 배양된 인간 및 마우스 세포에서 고도로 반복되는 게놈 DNA 서열을 표적화하는 상당히 혼재성인 가이드 RNA에 대해서도, 오프-타겟 편집을 측정가능한 수준 미만으로 감소시킨다. 이러한 진전은 마우스 및 제브라피쉬에서 고도로 특이적인 DNA-무함유 생체내 염기 편집이 입증되도록 한다.
결과
고충실도 염기 편집제의 조작
Cas9 뉴클레아제 및 그의 연관된 융합 구축물은 오프-타겟 게놈 유전자좌에서 DNA에 결합하고 그를 절단하는 것으로 밝혀졌다21-24. 종 및 동료들은 4개의 점 돌연변이 (N497A, R661A, Q695A, Q926A)를 함유하는 고충실도 SpCas9 변이체인 HF-Cas9을 개발하였으며, 이는 그의 DNA 절단 특이성을 크게 증가시킨 TALEN에서의 비-특이적 DNA 상호작용의 이전 폐기와 일치하는25, Cas9와 DNA 표적 가닥의 포스페이트 백본 사이의 비-특이적 상호작용을 제거하도록 설계되었다 (도 125a)20. 염기 편집제가 Cas9에 의해 생성되는 단일 가닥 DNA 버블 내에서 비-표적 가닥 상에 작용하기 때문에14, "HF-BE3"을 생성하기 위해 HF-Cas9에서 BE3으로 이들 4개의 점 돌연변이를 도입하는 것이 그의 염기 전환 능력을 변경시키지 않으면서 오프-타겟 염기 편집을 감소시킬 수 있는 것으로 가설화될 수 있다 (도 125a 및 125c).
His6-태그부착된 단백질로서의 BE3 및 HF-BE3을 코딩하는 플라스미드를 이. 콜라이에서 과다발현시키고, 먼저 니켈 친화도 크로마토그래피에 이어서 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (도 126a-126b). 발현 및 정제 조건의 광범위한 최적화 후에, BE3 및 HF-BE3 단백질은 상용적으로 배양 배지 리터당 ~2 mg의 수율로 생성될 수 있다 (도 126a-126c).
정제된 염기 편집제 단백질을 사용하여 염기 편집 효율 및 HF-BE3 및 BE3의 편집 윈도우의 폭을 생화학적으로 비교하였다. TC 반복부로 구성된 프로토스페이서를 갖는 합성 dsDNA 79량체에서 시험관내 C에서 U로의 전환 효율을 측정하였다. 표적 dsDNA (250 nM)를 30분 동안 37℃에서 BE3:sgRNA 또는 HF-BE3:sgRNA (2 μM)와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 편집된 DNA를 우라실-내성 폴리머라제를 사용하여 증폭시키고, 고처리량 DNA 서열분석 (HTS)에 의해 서열분석하였다. 시험관내에서 HF-BE3 및 BE3에 대한 비교 편집 효율 및 활성 윈도우 폭이 관찰되었다 (도 125b). 이러한 발견은 고충실도 돌연변이를 BE3에 도입하는 것이 내재된 온-타겟 염기 편집 효율을 손상시키지 않거나, 시험관내에서 생성된 HF-BE3 단백질의 편집 윈도우의 폭을 변화시킨다는 것을 나타낸다.
HF-BE3은 DNA 형질감염 후 편집 특이성을 증진시킨다
다음으로, 플라스미드 DNA 형질감염 후에 포유동물 세포에서의 BE3 및 HF-BE3의 염기 편집 효율, 특이성 및 편집 윈도우 폭을 비교하였다. 4개의 널리 연구된 내인성 게놈 유전자좌 (HEK293 부위 3, FANCF, EMX1 및 VEGFA 부위 2)를 포유동물 세포에서 온- 및 오프-타겟 염기 편집을 조사하기 위해 선택하였다14,24. VEGFA 부위 2는 20개의 프로토스페이서 뉴클레오티드 중 14개 C를 함유하여 고도로 반복적이고, 상당히 높은 비율의 공지된 오프-타겟 게놈 편집과 연관된다20,22,24,26. 이 부위는 그것이 강력한 특이성 문제를 제기하기 때문에 포함되도록 선택되었다. 대부분의 뉴클레아제-기반 게놈 편집 적용과는 대조적으로, 염기 편집은 프로토스페이서의 정확한 위치에 의존하여 편집 윈도우 내에 표적 뉴클레오티드를 위치시키고, 통상적으로 가이드 RNA의 선택에서 이용가능한 가요성이 거의 또는 전혀 없다. 따라서, 고도로 반복적인 혼재성 sgRNA 표적에 대해서도 증진된 특이성을 갖는 염기 편집제의 개발이 중요하다3,14.
온-타겟 유전자좌 및 공지된 오프-타겟 유전자좌를 PCR에 의해 증폭시키고, 4개의 염기 편집제:sgRNA 쌍 각각으로의 플라스미드 형질감염24 후 HTS에 의해 분석하였다. 이들 4개의 내인성 게놈 유전자좌에 대한 HEK293T 세포에서의 온-타겟 편집은 HF 돌연변이의 도입에 의해 약간 감소되었고; 편집은 BE3에서 29±5%, 및 HF-BE3에서 21±3%로 평균내어졌다 (n = 3개의 생물학적 반복에 대해 평균 ± s.e.m.) (도 127a-127d, 128a).
3개의 표준, 비-반복적 표적 부위 (HEK293 부위 3, FANCF, 및 EMX1) 각각에 대해, Cas9 및 동일한 가이드 RNA를 사용한 처리로부터 변형된 것으로 이전에 보고된 오프-타겟 유전자좌로부터의 편집 윈도우 내의 C를 함유하는 3개의 가장 빈번하게 변형된 오프-타겟 유전자좌를 시험하였다 (표 15)24. 세포를 BE3 플라스미드로 형질감염시킨 경우에, HEK293 부위 3, FANCF, 및 EMX1에 대한 9개의 가장 빈번하게 변형된 Cas9 오프-타겟 유전자좌에 걸친 C→T 전환은 1.1±0.3%로 평균내어졌다 (도 127a-c; n = 3개의 생물학적 반복에 대해 평균 ± s.d.). HF 돌연변이의 설치는 평균 오프-타겟 편집의 절대 수준을 0.03±0.005%로 37배만큼 감소시켰고, 단 1개의 경우의 측정가능한 오프-타겟 C→T 전환을 갖는다 (도 127a; 오프-타겟 1에서 EMX1 C5).
Figure pct00226
표 15: 본 작업에서 연구된 온- 및 오프-타겟 인간 게놈 유전자좌에 대한 프로토스페이서 및 PAM 서열. 오프-타겟 부위를 그의 GUIDE-Seq 판독 카운트에 기초하여 선택하였다45. 특정한 sgRNA에 대한 편집 윈도우 내의 시토신을 넘버링하였다. PAM 서열은 볼드체로 나타나 있다. 그의 각각의 온-타겟 유전자좌와 상이한 오프-타겟 유전자좌 내의 프로토스페이서 염기가 밑줄표시되어 있다. 게놈 서열에 대해 뮤린 샘플에서 조사하였다 (도 132e 참조).
극도로 어려운 부위에 대한 HF-BE3 특이성을 특징화하기 위해, 고도로 반복적인 VEGFA 부위 2 유전자좌를 표적화하는 경우에 BE3 및 HF-BE3 오프-타겟 활성을 비교하였다. BE3 처리는 이러한 sgRNA와 연관된 4개의 시험된 오프-타겟 부위의 활성 윈도우에 위치한 시토신의 평균 15±5% 편집을 야기한다 (이 단락에서 인용된 모든 평균 값은 n = 3개의 생물학적 반복에 대해 평균 ± s.d.를 나타냄). 대조적으로, HF-BE3은 동일한 오프-타겟 부위에서 절대 오프-타겟 편집 (5.0±2.3%)의 3배 감소를 생성한다 (도 127d). BE3의 형질감염과 비교한 경우에, HF-BE3은 유의하게 (p < 0.05, 양측 스튜던트 t 검정) 오프-타겟 유전자좌에 위치한 57개의 시토신 중 27개에서 오프-타겟 편집을 감소시킨 반면 (표 16), HF-BE3 처리는 16개의 조사된 온-타겟 시토신 잔기 중 오직 3개에서 온-타겟 편집의 유의한 감소 (p < 0.05 양측 스튜던트 t 검정)를 야기하였다.
Figure pct00227
표 16: 본 연구에서 평가된 모든 유전자좌에서의 상이한 처리 조건 하의 염기 편집의 차이에 대한 P-값. 물질 및 방법에 기재된 바와 같은 스튜던트 양측 t-검정을 사용하여 p-값을 계산하였다. p-값이 유의한 차이를 나타내는 경우에 (p < 0.05), 상응하는 엔트리가 강조되었다.
오프-타겟 유전자좌에서의 절대 편집 사이의 차이를 고려하는 것 이외에도, 관찰된 온-타겟 효율을 오프-타겟 효율로 나누어 온-타겟:오프-타겟 편집 특이성 비를 또한 계산하였다 (도 129a-129b). 이러한 메트릭은 HF-돌연변이의 설치와 연관된 온-타겟 편집의 임의의 감소를 고려하고, 염기 편집의 효율 및 특이성 둘 다에 대해 감수성인 적용에 유용하다. HF-BE3에 의한 오프-타겟 편집은 여러 오프-타겟 유전자좌에 대한 고처리량 서열분석의 검출 한계 미만이었다. 이들 경우에 대해, 검출 상한과 동일한 보존적 오프-타겟 편집 효율을 가정하였다 (0.025% C→T 전환; 방법 참조). 이러한 분석에 기초하여, 본원에서 조사된 모든 34개의 표적 시토신에 걸친 HF 돌연변이의 설치시 특이성 비율의 평균 개선은 2개의 구축물의 플라스미드 전달이 수행된 경우에 19배였다. 이러한 결과는 비-반복적 부위 (도 129a) 뿐만 아니라 고도로 반복적인 부위 (도 129b)에 대해, HF-BE3이 BE3과 비교하여 온-타겟 편집 효율의 보통의 감소만을 가지면서 실질적으로 증진된 염기 편집 특이성을 발생시킨다는 것을 집합적으로 확립한다.
BE3의 RNP 전달은 DNA-무함유 염기 편집을 가능하게 한다
다음으로, 배양된 인간 세포 내로 직접 전달된 경우에 염기 편집을 매개하는 DNA-무함유, RNP 형태의 BE3의 능력을 연구하였다. 최근에 양이온성 지질 시약이 음으로 하전된 단백질 또는 단백질:핵산 복합체를 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 포함하는 포유동물 세포 내로 강력하게 전달할 수 있고, RNP 전달은 오프-타겟 게놈 편집을 실질적으로 감소시킬 수 있는 것으로 확립되었다27-29.
상업적으로 입수가능한 양이온성 지질 리포펙타민 2000을 EMX1, HEK293 부위 3, FANCF, 또는 VEGFA 부위 2 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA와 사전-복합체화한 후 정제된 BE3 단백질 또는 HF-BE3 단백질과 조합하고, 생성된 지질:RNP 복합체를 HEK293T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 72시간 후, 게놈 DNA를 수거하고, 온-타겟 및 오프-타겟 염기 편집을 고처리량 DNA 서열분석에 의해 분석하였다. 모든 Cas9-기반 기술에서와 같이, 실질적인 변이가 상이한 게놈 유전자좌에서의 편집 효율에서 관찰되었다 (도 127 및 130). 상이한 처리 사이의 온-타겟 편집 효율과 연관된 경향을 나타내기 위해, 평균 온-타겟 염기 편집 효율을 4개의 시험된 유전자좌에서 계산하였다 (도 128a). BE3 (200nM)의 단백질 전달은 플라스미드 형질감염에서 관찰된 것과 대등한 온-타겟 편집 효율을 생성한다 (각각 26±4% 대 29±5%; n = 3개의 생물학적 반복에 대해 평균 ± s.e.m.; 도 128a).
대조적으로, HF-BE3의 단백질 전달은 연구된 4개의 게놈 유전자좌에서의 BE3의 단백질 전달과 비교하여 온-타겟 편집을 감소시켰다 (각각 13±3% 대 26±4%의 평균 편집 효율; n = 3의 생물학적 반복에 대해 평균 ± s.e.m.; 도 128a). HF-BE3 및 BE3은 시험 튜브에서 대등한 편집 효율을 갖고 (도 125b), 편집은 HF-BE3이 HEK293T 세포에서 플라스미드로부터 발현되는 경우에 단지 약간 감소되기 때문에 (도 127a-d), HF-BE3 단백질 전달로부터의 편집의 감소된 효율이 포유동물 세포에서의 감소된 HF-BE3 안정성의 결과일 수 있다는 것을 추측하는 것이 그럴듯하다. 보다 낮은 안정성은 플라스미드로부터의 연속적인 발현에 의해 오프셋될 수 있지만, 1회 단백질 전달 후에는 그렇지 않다. 이러한 관찰은 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포로 뉴클레오펙션된 경우에 정제된 Cas9와 비교하여 정제된 HF-Cas9를 사용한 감소된 온-타겟 indel 형성의 최근 보고와 일치하였다30. 본 연구를 검토하는 동안, 킴(Kim) 등은 전기천공법을 사용하여 BE3의 마우스 배아로의 RNP 전달을 입증하였다31. 본 발명자들의 지식이 미치는 한, 본 접근법은 전기천공 없이 포유동물 세포에서의 개별 뉴클레오티드에 대한 정확한 변화를 생성할 수 있는 제1 DNA-무함유 기술이고, 이는 제한된 생체내 치료적 관련성을 갖는다.
염기 편집제의 RNP 전달은 DNA 특이성을 크게 증진시킨다
중요하게는, BE3 및 HF-BE3의 RNP 전달이 실질적인 온-타겟 염기 편집을 야기하는 반면, 어떠한 경우의 측정가능한 염기 편집 (< 0.025%)도 EMX1, FANCF 및 HEK293 부위 3과 연관된 9개의 시험된 오프-타겟 유전자좌 중 임의의 것에서 관찰되지 않았다 (도 130a-130c). 대조적으로, BE3의 플라스미드 전달은 염기 편집 활성 윈도우 내의 모든 서열분석된 시토신에 걸쳐 평균 1.1±0.3% (n = 3개의 생물학적 반복에 대해 평균 ± s.d.) 오프-편집 및, 이들 9개의 오프-타겟 유전자좌에 위치한 16개 오프-타겟 시토신 중 11개에서 검출가능한 오프-타겟 편집을 야기한다 (도 127a-127d). 시험된 3개의 비-반복적 유전자좌의 오프-타겟 유전자좌에서, BE3 단백질 전달은 플라스미드 전달의 것보다 26배 더 높은 평균 특이성 비를 야기한다 (도 127a). 이러한 결과는 염기 편집제의 RNP 전달이 염기 편집의 DNA 특이성을 극적으로 증가시킨다는 것을 밝혀냈다.
BE3 또는 HF-BE3의 단백질 전달은 또한 BE3 또는 HF-BE3의 플라스미드 전달과 비교하여 고도로 혼재성인 VEGFA 부위 2 유전자좌에서 크게 개선된 염기 편집 특이성을 발생시켰다 (도 127 및 130 참조; 표 16 참조). 이러한 부위와 연관된 오프-타겟 유전자좌에서의 염기 편집의 절대 빈도는 BE3 (플라스미드 전달: 15±4% 오프-타겟 편집; 단백질 전달: 1.3±0.4% 오프-타겟 편집; 이 단락에서의 모든 값은 n = 3개의 생물학적 반복에 대해 평균 ± s.d.를 나타냄) 및 HF-BE3 (플라스미드 전달: 5±2% 오프-타겟 편집; 단백질 전달: 0.5±0.1% 오프-타겟 편집) 둘 다에 대해 단백질 전달시 적어도 10배 감소되었다. 모든 4개의 연구된 유전자좌에 걸쳐, 온-타겟:오프-타겟 편집에 대한 염기 편집 특이성 비는 BE3의 플라스미드 전달과 비교하여 BE3의 단백질 전달에 대해 평균 66배 증가하였다 (도 129). 집합적으로, 이들 결과는 반복적 및 비-반복적 표적 부위 둘 다에 대해, DNA 전달에 비해 RNP 전달이 고충실도 Cas9 돌연변이의 존재 또는 부재보다 염기 편집 특이성의 더 강한 결정인자라는 것을 밝혀냈다.
HF 돌연변이의 도입도 전달 방법도 염기 편집과 연관된 낮은 indel 비율을 실질적으로 변경시키지 않았다. 본 연구에서 모든 처리 조건에 걸친 모든 온-타겟 유전자좌에서의 indel 빈도는 낮게 유지되었고 (전형적으로 ≤ 5%; 도 131a), 편집:indel 비는 최적화된 HDR 프로토콜을 사용한 이전 연구에서보다 시험된 모든 경우에서 더 높게 유지되었다 (전형적으로 ≥ 10-배; 도 131b)30,32,33. 비-반복적 sgRNA의 경우, BE3의 플라스미드 전달이 VEGFA 부위 2와 연관된 오프-타겟 유전자좌에 대해 최대 5% indel을 생성하였다는 것에 주목하더라도 (도 131c), 매우 적은 indel이 오프-타겟 유전자좌에서 관찰되었다 (도 131c).
종합하면, 이들 결과는 염기 편집제의 단백질 전달이 온-타겟 염기 편집 효율을 유지하고 플라스미드 DNA의 전달에 비해 편집 특이성을 크게 증진시킨다는 것을 확립한다.
RNP 전달은 온- 및 오프-타겟 편집을 탈커플링시킨다
BE3의 단백질 전달과 연관된 염기 편집 특이성의 현저한 증진을 고려할 때, 이러한 개선이 세포 내로 전달된 활성 게놈 편집제의 총량을 감소시키는지 조사하였다. EMX1을 표적화하는 sgRNA를 사용하여, 플라스미드 (도 128b) 및 단백질 전달 (도 128c)에 대한 용량 반응 연구를 수행하였다. 처리 조건 사이의 형질감염 효율을 최대화하기 위해, 리포펙타민 2000의 부피는 모든 시험에 대해 1.5 μL였고, 염기 편집제 단백질:sgRNA 몰비는 단백질 전달을 위해 1:1.1로 유지하였다. 플라스미드 전달을 위해, 1:3 (몰비 ~1:1)의 sgRNA 플라스미드:BE3 플라스미드의 질량 비 및 1.5 μL의 리포펙타민 2000을 사용하였다. 오프-타겟 염기 편집은 플라스미드 전달에 대해 시험된 모든 조건 하에 관찰되었지만 (도 128b), 시험된 모든 단백질 전달 조건 하에서는 실질적으로 오프-타겟 편집이 관찰되지 않았다 (도 128c).
플라스미드 및 단백질 전달에 대한 온- 및 오프-타겟 편집 사이의 관계를 평가하기 위해 선형 회귀 분석을 수행하였다. 플라스미드 전달을 위해, 오프-타겟 편집은 온-타겟 편집 비율와 밀접하게 연관되었지만 (비-0 기울기, F-시험에 대해 R2 = 0.95, p = 0.0012), 단백질 전달을 사용한 오프-타겟과 온-타겟 편집 사이에 유의한 연관이 없었다 (비-0 기울기, F-시험에 대해 R2 = 0.078, p = 0.59).
이들 데이터는 염기 편집제의 단백질 전달이 투여량과는 독립적인 고유한 특이성 이점을 제공한다는 것을 나타낸다. 이전 관찰과 함께29,34, 이러한 발견은 DNA 전달과 비교하여 단백질 전달로부터의 염기 편집의 보다 높은 DNA 특이성이 염기 편집제에 대한 게놈의 연장된 노출을 피함으로써, 온-타겟 유전자좌가 이미 변형된 후에 오프-타겟 유전자좌를 프로세싱하는 염기 편집제의 기회를 최소화하는 단백질 전달의 능력으로부터 발생한다는 모델을 지지한다.
제브라피쉬 및 마우스에서의 DNA-무함유 염기 편집
상기 관찰은 검출가능한 오프-타겟 염기 편집을 제거하면서 온-타겟 염기 편집을 유지하기 위한 BE3의 단백질 전달의 가능성을 제안하였다. 따라서, BE3의 단백질 전달이 수정된 제브라피쉬 배아 내로 티로시나제 유전자좌를 표적화하는 BE3:sgRNA 복합체를 주사함으로써 제브라피쉬 내의 특정 점 돌연변이를 생성하는 데 사용될 수 있는지 시험하였다. 주사 4일 후에 생성된 제브라피쉬 유충으로부터 게놈 DNA를 수거하고, 고처리량 서열분석에 의해 염기 편집 및 indel 빈도를 측정하였다 (도 132a). 시험된 3개의 BE3:sgRNA 복합체 중 2개는 생체내에서 실질적인 점 돌연변이를 유도하였다 (TYR1: C3→T3 5.3±1.8%, TYR2: C4→T4 4.3±2.1%; n = 3개의 주사된 배아의 평균 ± s.d.; 도 132a). 제브라피쉬 유전자좌의 서열이 표 17에 열거되어 있다.
Figure pct00228
표 17: 참조 서열에 정렬되고 물질 및 방법에 기재된 품질 필터를 통과하는 HTS 판독물의 수.
마지막으로, 이러한 개발을 적용하여 마우스에서 DNA-무함유, 고-특이성 염기 편집을 달성하였다. 생체내에서 온- 및 오프-타겟 염기 편집을 관찰할 가능성을 최대화하기 위해, VEGFA 부위 2를 표적화하는 고도로 반복적인 sgRNA를 사용하였고; 편리하게는, 뮤린 및 인간 게놈은 이 표적 부위에서 동일하다.
배양된 뮤린 NIH/3T3 세포를 사용하여, BE3 단백질 전달이 이 유전자좌에서 효율적인 온-타겟 염기 편집 34±11%를 생성하였다는 것이 확인되었다 (도 133a; 본 단락에서의 모든 편집 백분율은 n = 3개의 생물학적 반복에 대해 평균 ± s.d.를 나타냄). 절단 빈도 결정인자 (CFD) 알고리즘29,34을 사용하여 VEGFA 부위 2 sgRNA와 연관된 마우스 게놈 내의 오프-타겟 유전자좌를 예측하였다 (표 18). 배양된 NIH/3T3 세포를 사용하여, 상위 4개의 예측된 오프-타겟 유전자좌 중 2개가 실제로 배양된 뮤린 세포에서의 BE3의 플라스미드 전달에 의해 변형된 것으로 확인되었다 (CFD 오프-타겟 유전자좌 1, 9±5% 편집; 및 CFD 오프-타겟 유전자좌 4, 3±2% 편집; 도 133b-133e). 인간 세포로부터의 결과와 일치하게, BE3의 단백질 전달은 오프-타겟 편집을 음성 대조군과 유사한 수준으로 감소시켰다 (도 133c 및 133e). CFD 오프-타겟 유전자좌 1 및 4에 대한 평균 염기 편집 특이성 비는 BE3의 플라스미드 전달의 경우 28±13에서 BE3의 단백질 전달의 경우 ≥ 780±300으로 증가하였다 (값은 평균 ± s.e.m.; n = 3개의 생물학적 반복을 나타냄).
Figure pct00229
표 18: VEGFA 부위 2 sgRNA와 연관된 마우스 게놈 내의 예측된 오프-타겟 유전자좌에 대한 프로토스페이서 및 PAM 서열. CFD 점수46는 CRISPOR를 사용하여 계산하였다47. 온-타겟 서열과 상이한 오프-타겟 프로토스페이서 내의 위치는 밑줄표시된다.
마우스에서 DNA-무함유 염기 편집을 확립하기 위해, BE3:sgRNA 복합체를 리포펙타민 2000과 조합하고 (도 132b), 와우내 주사를 P1-P2에서 마우스 새끼에게 수행하였다. 주사된 와우 조직을 주사 3-4일 후에 수거하고, 와우 영역당 5-7개의 샘플로 미세 해부하였다. 주사되지 않은 마우스로부터의 대조군 와우를 동시에 수거하였다. 수거된 조직으로부터 게놈 DNA를 추출하고, qPCR에 의해 후기-지수기로 증폭시키고, C→T 전환을 측정하기 위해 고처리량 DNA 서열분석에 적용하였다. 염기 편집제 단백질에 노출된 세포로부터 독점적으로 DNA를 회수하는 것이 가능하지 않기 때문에 처리된 세포 중에서 염기 편집 효율을 정량화하는 것은 불가능하지만, 와우의 3개 영역에서의 조직으로부터 명백한 염기 편집이 관찰되었다: 코르티 기관의 기저 말단, 혈관조 및 와우축 (도 132c-132d). 처리된 조직 샘플에서 유의한 indel 형성이 검출되지 않았다 (< 0.1% indel; 도 134b).
표적 C→T 전환을 함유하는 와우 세포의 백분율 (도 132c)은 배양물 내의 처리된 NIH/3T3 세포에서 관찰된 것보다 유의하게 더 낮았고 (도 133a), 이는 지질-기반 단백질 전달의 고도로 국재화된 성질 및 염기 편집제에 노출된 세포로부터 독점적으로 DNA를 단리할 수 없다는 것과 일치한다. 그럼에도 불구하고, 국부 전달은 세포 유형이 편집되는 제어, 및 제조 및 투여의 용이성을 포함한, 접근가능한 용도에 대한 주요 이점을 제공한다.
마지막으로, BE3:sgRNA:지질 복합체의 와우내 주사 후 오프-타겟 편집을 분석하였다. BE3:VEGFA 부위 2 sgRNA:지질 복합체를 주사한 마우스의 와우 조직으로부터의 게놈 DNA에서 확인된 오프-타겟 부위 CFD 유전자좌 1 및 CFD 유전자좌 4를 포함한 모든 4개의 예측된 오프-타겟 유전자좌의 분석은 시험된 오프-타겟 유전자좌 중 임의의 것에 대해 비처리 대조군 샘플에서 관찰된 것 초과의 검출가능한 C→T 전환 또는 indel 형성을 나타내지 않았다 (도 134a).
함께, 이들 생체내 염기 편집 결과는 높은 DNA 서열 특이성을 갖는 동물의 게놈 DNA에서의 개별 뉴클레오티드의 정확한 전환을 위한 바이러스-무함유, DNA-무함유 전략을 확립한다.
논의
본 연구에서 개발되고 실시되는 전략은 오프-타겟 염기 편집을 제거하거나 감소시키고, 생체내 염기 편집을 지지하는 DNA-무함유 전달 방법을 확립함으로써 염기 편집의 유용성 및 적용가능성을 확장시킨다. 단백질 전달은 동일한 구축물의 플라스미드 전달과 비교하여 인간 및 뮤린 세포에서 염기 편집 특이성을 개선시키고 (도 137,130, 및 133), 제브라피시 및 마우스 와우에서 특이적 염기 편집을 가능하게 한다 (도 132).
Cas9의 DNA 특이성을 증진시키는 것으로 공지된 BE3 돌연변이를 설치함으로써 고충실도 염기 편집제가 생성되었다20. 이러한 돌연변이의 Cas9 내로의 설치는, 여기서 조사된 EMX1 유전자좌를 포함한 비-반복적 sgRNA와 연관된 오프 타겟 유전자좌에에서 검출불가능한 indel 형성을 발생시키는 것으로 보고되었다 (도 127a)20. HF-BE3에서 관찰된 특이성 증진은 실질적이지만, 보다 보통이었고; HF-BE3은 플라스미드 DNA로서 포유동물 세포 내로 전달되는 경우에 반복적 및 비-반복적 유전자좌 둘 다에서 검출가능한 오프-타겟 염기 편집을 나타내었다 (도 127a, 127d, 133c 및 133e). 이러한 특이성 증진 차이는 염기 편집이 Cas9-매개 indel 형성과 달리 DNA 절단을 필요로 하지 않고, 단지 DNA-결합 및 R-루프 형성을 필요로 한다는 사실로부터 발생할 수 있고14, HF-Cas9의 증진된 특이성 중 일부가 이미-결합된 오프-타겟 유전자좌에서의 손상된 DNA 절단으로부터 발생할 수 있는 것으로 추측되는 것이 그럴듯하다.
오프-타겟 염기 편집을 감소시키기 위한 제2 시도에서, 염기 편집제의 RNP 전달은 온- 및 오프-타겟 편집의 탈커플링을 야기하는 것으로 입증되었다 (도 128b-128c). RNP 전달은 온-타겟 편집을 플라스미드 전달과 대등하게 유지하면서 비-반복적 부위에서의 오프-타겟 편집을 제거하였고 (도 130a-130c 및 128a), 고도로 반복적인 VEGFA 부위 2에서도 오프-타겟 편집을 크게 감소시켰다 (도 130d). 염기 편집제의 RNP 전달은 특히, 세포 투여량이 전형적으로 제어 또는 특징화되기 어려운 생체내 편집 용도에 유용할 수 있다.
공여자 DNA 주형의 전달과 커플링된 Cas9의 RNP 전달은 이전에 포유동물 세포에서 HDR-기반 게놈 편집을 수행하는 데 사용되었다. 그러나, 이들 접근법은 낮은 효율, 세포-상태 의존성, 및 전형적으로 특히 점 돌연변이 교정에 대해 목적하는 HDR 결과의 것을 초과하는 indel 형성 효율에 의해 제한되어 있다29,30,32,35. DNA-무함유 염기 편집은 대조적으로 생체내 및 세포 둘 다에서 확률적 indel에 비해 실질적인 과량의 편집된 생성물을 생성한다 (도 132a, 134a, 및 134b). 본 발명자들의 지식이 미치는 한, 염기 편집제의 RNP 전달은 외인성 DNA를 필요로 하지 않으면서 게놈 DNA에 대한 특이적이고 정확한 변형을 생성하기 위한 제1 전략을 나타낸다.
방법
플라스미드의 클로닝
본 연구에서 플라스미드는 USER 클로닝에 의해 생성되었다. 퓨션 U 핫 스타트 폴리머라제 (써모 피셔)를 사용하여 점 돌연변이를 설치하고, 이전에 보고된 구축물로부터 단백질 발현 플라스미드를 구축하였다36. 단백질 서열은 보충 정보에 열거되어 있고, BE3 및 HF-BE3의 발현을 위한 플라스미드는 애드진으로부터 입수가능하다.
BE3 및 HF-BE3의 발현 및 정제
BL21 스타 (DE3)-적격 이. 콜라이 세포를 His6 N-말단 정제 태그를 갖는 박테리아 코돈 최적화된 염기 편집제를 코딩하는 플라스미드로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 밤새 50 μg mL-1 카나마이신을 함유하는 루리아-베르타니 (LB) 브로쓰에서 37℃에서 성장시켰다. 세포를 2L의 동일 배지 내로 1:200 희석하고, OD600 = 0.70-0.75가 될 때까지 37℃에서 성장시켰다. 배양물을 얼음 상에서 60분 동안 인큐베이션하고, 단백질 발현을 0.5 mM 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG, 골드바이오(GoldBio))로 유도하였다. 18℃에서 진탕시키면서 14-16시간 동안 발현을 지속하였다. 후속 정제 단계를 4℃에서 수행하였다. 세포를 6,000 g에서 20분 동안 원심분리에 의해 수집하고, 세포 수집 완충제 (100 mM 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄 (트리스)-HCl, pH 8.0, 1M NaCl, 20% 글리세롤, 5 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP; 골드바이오), 0.4 mM 페닐메탄 술포닐 플루오라이드 (PMSF; 시그마 알드리치) 및 사용된 50 mL 완충제당 1개의 컴플리트(cOmplete) EDTA-무함유 프로테아제 억제제 펠릿 (로슈(Roche)) 중에 재현탁시켰다. 세포를 초음파처리에 의해 용해시키고 (총 6분, 3초 온, 3초 오프), 용해물을 25,000 g (20분)에서 원심분리에 의해 정화하였다.
정화한 용해물을 His-Pur 니켈 니트릴로아세트산 (니켈-NTA) 수지 (배양물 리터당 1 mL 수지, 써모 피셔)와 함께 60-90분 동안 4℃에서 회전시키면서 인큐베이션하였다. 수지를 20 칼럼 부피의 세포 수집 완충제로 세척한 후에 결합된 단백질을 용리 완충제 (100 mM 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄 (트리스)-HCl, pH 8.0, 0.5 M NaCl, 20% 글리세롤, 5 mM 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 (TCEP; 골드바이오), 200 mM 이미다졸)로 용리시켰다. 생성된 단백질 분획을 Akta 퓨어 FPLC를 사용하여 5 mL 하이-트랩(Hi-Trap) HP SP (지이 헬스케어(GE Healthcare)) 양이온 교환 칼럼 상에서 추가로 정제하였다. 단백질-함유 분획을 3,000 g에서 원심분리되는 100,000 kDa 컷오프를 갖는 칼럼 (밀리포어(Millipore))을 사용하여 농축시키고, 농축된 용액을 .22 μm PVDF 막 (밀리포어)을 통해 멸균 여과하였다.
멸균 여과 후, 단백질을 환원제 상용성 비신코닌산 (BCA) 검정 (피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology))으로 정량화하고, 액체 질소에서 급속 동결시키고, -80℃에서 분취액으로 저장하였다. 발현된 단백질의 서열은 보충 노트 2에 열거된다.
sgRNA의 시험관내 전사
sgRNA 백본 및 목적하는 20 bp sgRNA 프로토스페이서 상류에 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 함유하는 선형 DNA 단편을 보충 정보에 열거된 바와 같은 프라이머를 사용하여 PCR (Q5 핫 스타트 마스터믹스, 뉴 잉글랜드 바이오랩스)에 의해 생성하고, 민일루트(minelute) 칼럼 (퀴아젠) 상에서 농축시켰다. sgRNA를 20 μL 반응물당 1 μg의 선형 주형을 사용하여 14-16시간 동안 하이스크라이브(HiScribe) T7 고수율 RNA 합성 키트 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 16℃에서 전사하였다. sgRNA를 제조업체의 지침에 따라 메가클리어(MEGAClear) 전사 클린 업 키트 (써모 피셔)를 사용하여 정제하였다. 정제된 sgRNA를 -80℃에서 분취액으로 저장하였다.
시험관내 탈아미노화 검정
시험관내 탈아미노화 검정을 위한 주형으로서 사용된 DNA 올리고뉴클레오티드의 서열은 보충 노트 3에 제시된다. 모든 올리고뉴클레오티드는 IDT로부터 구입하였다. 상보적 서열을 사용하여 합성된 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 트리스 완충제 pH 8.0 내에서 합하고 (100 μM 용액 5 μL), 95℃로 5분 동안 가열함으로써 어닐링하고, 이어서 0.1℃/초-1의 속도로 37℃로 서서히 냉각시켜 79개 염기 쌍 (bp) dsDNA 기질을 생성하였다. 새로 해동된 염기-편집 단백질 (10 μL 반응 부피 중 2 μM 최종 농도)을 실온에서 5분 동안 반응 완충제 (20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 10 mM MgCl2)에서 지시된 sgRNA (2.2 μM 최종 농도)와 복합체화하였다37. 이어서, 어닐링된 dsDNA 기질을 250 nM의 최종 농도로 첨가하였다. 반응을 37℃에서 30분 동안 진행시킨 후, 단백질 변성을 99℃에서 5분 동안 가열함으로써 수행하였다. PB 완충제 (퀴아젠, 100 μL) 및 이소프로판올 (25 μL)을 첨가하여 단백질이 기질 DNA로부터 해리되도록 하였다. DNA를 민엘루트 칼럼 (퀴아젠)으로 정제하고, 생성된 생성물을 U-내성 폴리머라제 (퓨션 U 핫 스타트, 써모피셔) 및 보충 정보에 열거된 바와 같은 프라이머를 사용하여 15 사이클의 qPCR (12ng 투입 DNA, 50 μL 반응 부피)로 선형 범위의 상단으로 증폭시켰다. 증폭된 DNA를 래피드팁2 (디피니티 게노믹스)를 사용하여 정제하고, 하기 기재된 바와 같이 일루미나 MiSeq 상에서의 서열분석을 위해 제조하기 전에 제2 라운드의 PCR (8 사이클, 5 ng 투입)로 바코딩하였다.
게놈 DNA의 정제 및 서열분석
제조업체의 지침에 따라 아젠코트 DNAdvance 게놈 DNA 단리 키트 (베크만 쿨터)를 사용하여 게놈 DNA를 단리하였다. 제1 PCR을 위해, DNA를 제조업체의 지침에 따라, 그러나 3% DMSO 및 SYBR 골드 핵산 스테인 (써모 피셔)을 첨가하여 Q5 핫 스타트 DNA 폴리머라제 (NEB)를 사용하여 선형 범위의 상단으로 증폭시켰다. 모든 앰플리콘에 대해, 사용된 PCR 프로토콜은 98℃에서 2분의 초기 가열 단계에 이어서 최적화된 수의 증폭 사이클 (98℃에서 12초, 61℃에서 25초, 72℃에서 30초)이었다. 제브라피쉬 및 형질감염된 세포 샘플에 대해, 30 ng의 투입 DNA를 50 μL 반응물에 사용하였고, 와우 샘플에 대해 20 ng을 25 μL 반응물에 사용하였다. 각각의 앰플리콘에 대한 최적 사이클 수를 결정하기 위해 qPCR을 수행하였다. 증폭된 DNA를 래피드팁2 (디피니티 게노믹스)를 사용하여 정제하고, 추가의 PCR (8 사이클, 5ng 투입)로 바코딩하였다. 제1 라운드 PCR에 사용된 고유한 정방향 및 역방향 프라이머는 어닐링 영역의 5'에 불변 영역을 함유하였고 (정방향: 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNN-3' (서열식별번호: 502), 역방향: 5'-TGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3' (서열식별번호: 503)), 이는 제2 라운드 PCR을 위한 바코딩 프라이머의 증폭된 DNA에 대한 결합을 용이하게 한다.
제2 라운드 PCR은 3개 영역을 갖는 프라이머를 사용하였다: 앰플리콘이 일루미나 유동 세포 (이탤릭체)에 결합하도록 하는 5' 불변 영역, 8-염기 바코딩 영역 (X), 및 바코딩 프라이머가 제1 라운드 PCR 앰플리콘 (볼드체)에 결합하도록 하는 3' 불변 영역. 프라이머 서열의 예는 하기와 같다:
Figure pct00230
서열분석 어댑터 및 이중-바코딩 서열은 TruSeq 인덱싱 어댑터 (일루미나)에 기초한다. 바코딩된 샘플을 풀링하고, 겔 추출 (퀴아젠)에 의해 정제한 다음, 암퓨어(Ampure) 비드 (베크만 쿨터)를 사용하여 정제한 후, 큐비트(Qubit) dsDNA HS 키트 (써모 피셔) 및 qPCR (카파 바이오시스템즈)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 정량화하였다. 제조업자의 지침에 따라 MiSeq (일루미나) 상에서 180-250개 염기 (앰플리콘 크기에 따름)로부터의 단일-말단 판독물을 사용하여 풀링된 샘플의 서열분석을 수행하였다.
PCR 증폭에 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열은 보충 노트 3에 제시된다. 모든 올리고뉴클레오티드는 IDT로부터 입수하였다. 본 연구에서 각각의 앰플리콘에 대한 최적화된 수의 PCR 사이클은 하기와 같다: VEGFA 부위 2 인간 게놈 DNA (어닐링 온도는 모든 연장 단계에 대해 25초 동안 61℃임): 온-타겟: 29 사이클, 오프-타겟 #1: 32 사이클, 오프-타겟 #2: 28 사이클, 오프-타겟 #3: 27 사이클, 오프-타겟 #4: 27 사이클, VEGFA 부위 2 뮤린 게놈 DNA: 온-타겟: 31 사이클, 오프-타겟 #1, #2, #3 및 #4: 31 사이클. HEK293 부위 3: 오프-타겟 #1: 29 사이클, 오프-타겟 #2: 28 사이클, 오프-타겟 #3: 28 사이클. FANCF 오프-타겟 #1: 29 사이클, 오프-타겟 #2: 28 사이클, 오프-타겟 3: 28 사이클. EMX1 오프-타겟 #1, #2 및 #3: 28 사이클. 제브라피쉬 DNA의 증폭을 위한 TYR1, TYR2 및 TYR3 sgRNA: 32 사이클. EMX1, FANCF 및 HEK293 부위 3 유전자좌의 온-타겟 증폭을 위한 최적화된 프로토콜은 이전에 기재된 바와 같이 이어졌다14.
게놈 DNA 서열분석 판독물의 분석 및 정렬
서열분석 판독물을 이전에 기재된 바와 같이 분석하였다14. 간략하게, 서열분석 판독물을 MiSeq 리포터 (일루미나)를 사용하여 디멀티플렉싱하고, 개별 FASTQ 파일을 이전에 보고된 주문제작 매트랩 스크립트로 분석하였다14. 스미스-워터만 알고리즘을 사용하여 판독물을 참조 서열에 정렬시켰다. 30 미만의 Q-점수를 갖는 염기 호출을 플레이스홀더 뉴클레오티드 (N)로 대체하였다. 이러한 품질 역치는 1,000 중 1의 예상 오차율을 갖는 뉴클레오티드 빈도를 발생시킨다. indel 빈도는 nCas9 절단 부위 주위의 30-염기 윈도우에서 발생하고 최소 2-염기 삽입 또는 결실인 indel을 카운팅하는 이전에 공개된 주문제작 매트랩 스크립트로 정량화하였다14. indel은 처리된 샘플 및 비처리 대조군에서의 indel 형성 사이의 유의한 차이 (스튜던트 양측 t-검정, p < 0.05)가 존재하는 경우 검출가능한 것으로 정의하였다.
뮤린 게놈 내의 VEGFA 부위 2 sgRNA와 연관된 서열분석된 앰플리콘 중 하나인 CFD 오프-타겟 #3의 경우, indel 형성을 정확하게 측정하는 것이 가능하지 않았다. 이 유전자좌에서 프로토스페이서는 12개의 구아닌 염기에 직전에 선행하고, 이는 이 부위의 PCR 및 고처리량 서열분석을 무작위 삽입 또는 결실에 취약하게 만들고; 서열분석 판독물의 20%만큼 높은 결실 비율은 다중 독립적 비처리 대조군 샘플에서 관찰되었다. 어떠한 유의한 염기 편집도 임의의 처리 조건 하에 이 오프-타겟 유전자좌에서 검출되지 않았기 때문에 (도 132 및 133), indel 형성이 또한 이 유전자좌에서 무시할만한 것으로 의심된다.
phred.II Q30 점수는 염기호출에서 추정 99.9% 정확도에 상응한다38. 주어진 위치에서의 부정확한 염기 호출의 0.1% 확률은 염기 호출 오류가 4개의 염기에 걸쳐 무작위로 분포되는 것으로 가정되는 경우 0.1/4 = 0.025%의 염기 호출에 대한 하한에 상응한다. 이러한 역치 미만에 속하는 C→T 편집 백분율은 검출불가능한 것으로 분류되었다. PCR 동안의 자발적 탈아미노화39 또는 폴리머라제 오차는 또한 인공 C→T 편집을 도입할 수 있다. 염기 편집제-유도된 C→T 편집을 인공 C→T 편집 비율로부터 구별하기 위해, 비처리 대조군 세포를 각각의 앰플리콘에 대해 서열분석하였고, 특정한 조건 하에 C→T 편집이 역치로서 p < 0.05를 갖는 스튜던트 양측 t-검정을 사용하여 통계적으로 유의한지 계산하였다. 통계적으로 유의한 편집 비율이 >0.025%인 오프-타겟 부위를 측정가능한 것으로 간주하였다. 각각의 샘플에 대한 정렬된 및 품질 여과된 판독물의 수를 표 17에 포함시켰다.
게놈 DNA 서열 정렬의 통계적 분석
달리 언급되지 않는 한, 본문 전체에 걸쳐 언급된 평균 값은 n≥3개의 독립적인 생물학적 반복을 대표하고, 평균 ± 표준 편차가 언급되어 있다.
처리된 샘플에서 온- 및 오프-타겟 편집 백분율을 음성 대조군 샘플 (비처리)에서 측정된 임의의 편집과 비교함으로써 도 2 및 3에 나타낸 고처리량 서열분석 데이터의 통계적 분석을 수행하였다. 스튜던트 양측 t 검정이 사용되었고, 개별 p-값은 표 16에 제시된다. * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 및 *** p ≤ 0.001. 편집이 검출 한계 (0.025%) 미만인 경우, 유의성은 계산되지 않았고; 모든 비처리 대조군 샘플은 검출불가능한 편집을 보여주었다.
도 128a의 경우, 평균 온-타겟 염기 편집은 염기 편집 활성 윈도우 내의 시토신의 편집을 평균냄으로써 계산하였다 (HEK293 부위 3 및 EMX1에 대해 C4-C8, FANCF 및 VEGFA 부위 2에 대해 C4-C9).
염기 편집 활성에서의 sgRNA-의존성 차이를 설명하기 위해, 염기 편집:indel 비를 계산하였다 (도 130b). 이 비는 C→T 전환을 갖는 HTS 판독물의 백분율 (각각의 부위에 대해 염기 편집 윈도우에 걸쳐 평균냄)을 indel을 함유하는 HTS 판독물의 백분율로 나눔으로써 생성하였다. 상기 기재된 바와 같이, 특정한 유전자좌에 대한 오프-타겟 편집이 검출 한계 미만인 경우, 특이성 비율을 계산하기 위한 목적으로 검출 방법의 추정 상한 (0.025%)을 보존적으로 가정하였다.
시험관내 편집된 DNA의 데이터 분석
서열분석 판독물을 MiSeq 리포터 (일루미나)를 사용하여 자동으로 디멀티플렉싱하였다. 온라인 패키지 usegalaxy.org를 사용하여 품질 필터링을 수행하였다40. 30이하의 일루미나 품질 점수를 갖는 개별 염기를 FASTQ 그루머에 이어서 FASTA 마스커를 사용하여 플레이스홀더 뉴클레오티드 'N'으로 전환시켰다41. 생성된 품질-필터링된 FASTQ 파일을 후속적으로 보충 노트 1에 제공된 주문제작 피톤 스크립트로 분석하였다. 서열분석 판독물을 표적 DNA 서열의 양쪽 면에 플랭킹하는 2개의 14-염기 서열에 대한 정확한 매치에 대해 스캐닝하였다. 정확한 매치가 발견되지 않는 경우, 판독물을 분석에서 배제하였다. 14-염기 서열 둘 다가 위치하고 이들 사이의 서열 길이가 예상된 프로토스페이서 길이 (20개 염기)와 동일한 경우, 플랭킹 영역 사이에서 발견된 프로토스페이서 서열을 저장하고, 프로토스페이서 내 각각의 부위에서 고처리량 서열분석에 의해 호출된 염기를 집계하였다.
세포 배양
HEK293T (ATCC CRL-3216) 및 NIH/3T3 (ATCC CRL-1658) 둘 다를 10% (v/v) 소 태아 혈청 (FBS)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 + 글루타맥스 (써모피셔) 중에서 37℃에서 5% CO2 하에 유지시켰다. 세포는 ATCC로부터 입수하였고, 구매시 ATCC에 의해 미코플라스마가 없는 것으로 인증 및 검증되었다.
염기 편집제의 HEK293T 세포로의 플라스미드 형질감염
HEK293T 세포를 항생제 무함유 배지에서 48-웰 콜라겐-코팅된 바이오코트 플레이트 (코닝) 상에 시딩하고, 대략 70% 전면생장률로 형질감염시켰다. 달리 언급되지 않는 한, 750 ng의 BE 및 250 ng의 sgRNA 발현 플라스미드를 제조업체의 프로토콜에 따라 웰당 1.5 μl의 리포펙타민 2000 (써모 피셔)을 사용하여 형질감염시켰다.
염기 편집제의 HEK293T 세포로의 단백질 형질감염
HEK293T 세포를 250 μL 항생제 무함유 배지 중에서 48-웰 콜라겐-코팅된 바이오코트 플레이트 (코닝) 상에 시딩하고, 대략 70% 전면성장률로 형질감염시켰다. 염기 편집제 단백질을 실온에서 5분 동안 1.1X 몰 과량의 필요한 sgRNA와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 복합체를 1.5 μL 리포펙타민 2000 (써모 피셔)과 함께 인큐베이션하고, 플라스미드 전달을 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 달리 언급되지 않는 한, BE 단백질을 200 nM의 최종 농도로 첨가하였다 (275 μL의 총 웰 부피에 기초함).
염기 편집제의 NIH/3T3 세포로의 플라스미드 형질감염
NIH/3T3 세포를 항생제-무함유 DMEM 배지에서 48-웰 콜라겐-코팅된 바이오코트 플레이트 (코닝) 상에 시딩하고, 대략 75% 전면생장률로 형질감염시켰다. 달리 언급되지 않는 한, 600 ng의 BE 및 200 ng의 sgRNA 발현 플라스미드를 제조업체의 프로토콜에 따라 웰당 1.4 μL의 리포펙타민 3000과 1 μL의 P3000 시약 (써모 피셔)을 사용하여 형질감염시켰다.
염기 편집제의 NIH/3T3 세포로의 단백질 형질감염
NIH/3T3 세포를 항생제 무함유 DMEM 배지에서 48-웰 콜라겐-코팅된 바이오코트 플레이트 (코닝) 상에 시딩하고, 대략 75% 전면성장률로 형질감염시켰다. 염기 편집제 단백질을 1.1배 몰 과량의 지시된 sgRNA와 함께 25℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 복합체를 1.4 μL 리포펙타민 3000 (써모 피셔)과 함께 인큐베이션하고, 플라스미드 전달을 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. P3000 시약은 그의 첨가가 단백질 침전 및 염기 편집 효율의 감소를 야기하기 때문에 사용되지 않았다. 달리 언급되지 않는 한, BE 단백질을 400 nM의 최종 농도로 첨가하였다 (275 μL의 총 웰 부피에 기초함).
양이온성 지질 내에 캡슐화된 BE3 단백질:가이드 RNA의 와우내 전달
모든 동물 실험은 매사추세츠 안과 및 이과 병원의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 이전에 기재된 바와 같이 혼합 유전자 배경의 P1-P2 마우스에서 와우내 전달을 수행하였다42. 마우스를 수술 절차 전에 체온을 낮춤으로써 마취시켰다. 오른쪽 귀 근처에서 이후부 절개를 수행하고, 낭포를 들어올려 와우를 노출시켰다. BE3 단백질 (57.7 μM)을 1:1.1 몰비로 sgRNA (100 μM)와 사전-복합체화한 다음, 리포펙타민 2000 (써모 피셔)과 1:1 부피 비로 혼합하였다. 생성된 용액 (1.2-1.5 μL)을, 나노리터 마이크로펌프 (WPI, UMP3 + 마이크로4 + 나노필)에 250 nL/분-1의 속도로 부착된 와우 기저 회전에서, 와우 캡슐을 통해 유리 피펫 (말단 직경, 5 μm)을 사용하여 와우관 내로 주입하였다. 주사 후, 절개부를 닫고, 마우스를 가열 패드에 넣어 회복시켰다. 3-4일 후, 마우스의 와우를 코르티 기관, 혈관조 및 와우축으로 해부하였다. 각각의 조직을 5 내지 7개의 별개의 조각으로 추가로 미세-해부하고, DNA 추출을 각각의 샘플에 대해 개별적으로 수행하고, 이어서 상기 기재된 바와 같이 고처리량 서열분석을 수행하였다. 도 132 및 도 134에 제시된 데이터는 각각의 와우 영역에 대한 하나의 미세-해부된 샘플의 추출로부터 생성된 서열분석 데이터를 보여준다.
BE3 단백질:가이드 RNA의 제브라피쉬 배아 내로의 미세주사
제브라피쉬 (튀빙겐 계통)를 보스톤 아동 병원의 내부 규제 검토에 준하여 표준 조건 하에 유지하였다. 1-세포 단계 제브라피쉬 배아에 적절한 sgRNA 또는 비관련된 sgRNA 대조군과 사전-복합체화된 대략 2 nL의 BE3 단백질을 1:1 몰비 (4.5 μM 최종 농도)로 주사하였다. 수정 4일 후, DNA를 50 mM NaOH 중에서 30분 동안 95℃에서 이전에 기재된 바와 같은 유충으로부터 추출하고43, 생성된 용액을 트리스-HCl로 중화시켰다. 게놈 DNA를 상기 기재된 바와 같이 정량화하고, PCR에 의해 증폭시키고, 서열분석하였다.
단백질 겔 분석
제시된 모든 단백질 겔은 사전 성형된 4-12% 폴리아크릴아미드 비스-트리스 플러스 (써모 피셔)였다. 이들을 MOPS 완충제 (써모 피셔) 중에서 180 V에서 50분 동안 구동시켰다. 샘플을 변성을 위한 100mM DTT 및 1X 리튬 도데실 술페이트 (LDS) 샘플 완충제 중에서 99℃로 10분 동안 가열함으로써 로딩을 위해 제조하였다. 제조업체의 지침에 따라 인스턴트 블루 단백질 염색 (엑스페디온(Expedion))을 사용하여 겔을 염색하였다.
세포 용해물 분석을 위해, 2 mL의 유도후 밤샘 배양물을 15,000 g에서 펠릿화한 후, 제조업체의 지침에 따라 100 μL B-PER (써모 피셔)에서 용해시켰다.
데이터 이용가능성
본 연구의 발견을 지지하는 고처리량 서열분석 데이터를 수탁 번호 SRP097884 하에 NCBI 서열 판독 아카이브 데이터베이스에 기탁하였다. 단백질 발현을 위한 HF-BE3 및 BE3, 뿐만 아니라 포유동물 발현을 위한 HF-BE3을 코딩하는 플라스미드는 애드진으로부터 수탁 ID 87439 (pCMV-HF-BE3), 87438 (pET42b-HF-BE3), 87437 (pET42b-BE3)으로 입수가능하다.
참고문헌
Figure pct00232
Figure pct00233
보충 정보
보충 노트 1: 품질-필터링된 시험관내-편집된 DNA를 분석하는 데 사용된 피톤 스크립트.
Figure pct00234
Figure pct00235
보충 노트 2: 본 연구에 사용된 단백질의 서열
발현된 BE3의 단백질 서열
Figure pct00236
발현된 HF-BE3의 단백질 서열
Figure pct00237
Figure pct00238
보충 노트 3: 본 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열
Figure pct00239
Figure pct00240
Figure pct00241
Figure pct00242
보충 표 1. 본 연구에서 연구된 제브라피쉬 게놈 유전자좌에 대한 프로토스페이서 및 PAM 서열.
실시예 17: 보다 높은 효율 및 생성물 순도를 갖는 C:G에서 T:A로의 염기 편집제
염기 편집은 이중-가닥 DNA 파괴를 유도하거나 또는 Cas9 변이체 및 시티딘 데아미나제의 조작된 융합을 사용한 상동성-지정 복구를 필요로 하지 않으면서 표적 C:G 염기 쌍의 T:A 염기 쌍으로의 프로그램가능한 전환이다 (1). 제3 세대 염기 편집제 (BE3) 및 관련 기술은 광범위한 유기체에서 많은 연구자들에 의해 성공적으로 사용되었다 (2-13). 염기 편집의 생성물 분포-표적 C:G 염기 쌍이 목적하는 T:A 생성물과 함께 목적하지 않은 부산물의 혼합물로 전환되는 빈도-는 표적 부위-의존성 방식으로 달라진다 (2, 3, 6-8). 여기서 본 발명자들은 인간 세포에서의 염기 편집 결과의 결정인자를 특징화하고, 목적하지 않은 생성물의 형성이 우라실 N-글리코실라제 (UNG)에 의존성이고 염기 편집 활성 윈도우 내의 단일 C만을 함유하는 표적 부위에서 발생할 가능성이 더 크다는 것을 확립한다. 일부 서열에 대해 염기 편집 효율을 증가시키는 시티딘 데아미나제 상동체를 사용하는 구축물 CDA1-BE3 및 AID-BE3을 조작하였다. 추가적으로, 염기 편집된 중간체에 대한 UNG의 접근을 보다 효율적으로 차단하는 제4 세대 에스. 피오게네스 Cas9-유래 염기 편집제 (BE4)를 또한 조작하였다. BE3과 비교하여, BE4는 목적하지 않은 부산물의 빈도를 반으로 줄이면서 C:G에서 T:A로의 염기 편집의 효율을 대략 50%만큼 증가시킨다. 이러한 개선을 또한 적용하여, 에스. 아우레우스 Cas9-유래 BE4 (SaBE4)를 생성하였고, 이는 BE4보다 실질적으로 더 작고 대안적 표적화 범주를 갖는다.
도입
전통적인 게놈 편집 방법은 게놈 표적 유전자좌에서 이중 가닥 DNA 파괴 (DSB)를 도입한다 (14). DSB 병변에 대한 세포 반응은 주로 비-상동 말단 연결 (NHEJ) 및 관련 과정을 통해 진행된다 (15). NHEJ는 통상적으로 DSB에 플랭킹된 2개의 말단을 재연결하지만, 전형적인 게놈 편집 조건 하에 DSB는 연속적으로 재도입되어 결국 삽입 및 결실 (indel)의 축적 또는 DSB 부위에서의 전위 및 상응하는 게놈 유전자좌의 파괴를 발생시킨다 (16). 활발하게 분열하는 세포는 또한 DSB를 둘러싸는 영역에 대한 상동성을 함유하는 공여자 DNA 주형의 존재 하에 상동성-지정 복구 (HDR)를 개시함으로써 DSB에 반응할 수 있고, 이는 연구자가 NHEJ를 통해 가능한 것보다 더 정확하고 예측가능하게 게놈을 조작할 수 있게 한다 (17). HDR-의존성 게놈 편집은 NHEJ 결과와의 경쟁, 및 유사분열에 대한 HDR의 의존성으로부터 발생하는 낮은 효율에 의해 제한된다 (18).
HDR 또는 DSB의 도입을 필요로 하지 않으면서 프로그램가능한 방식으로 C:G 염기 쌍의 T:A 염기 쌍으로의 직접적인 비가역적 전환을 가능하게 하는 염기 편집의 개발이 보고되었다 (1). 염기 편집제는 촉매적으로 손상된 Cas9 단백질에 테더링된 단일-가닥 DNA-특이적 시티딘 데아미나제 효소 및 염기 절제 복구 억제제로 이루어진다 (1, 4, 9, 10). Cas9 변이체는 상응하는 가이드 RNA에 의해 프로그램된 관심 게놈 유전자좌에 결합한다. 단백질:RNA:DNA 3원 "R-루프" 복합체의 형성 (19)은 테더링된 시티딘 데아미나제 효소에 대한 기질로서의 역할을 하는 단일 가닥 DNA의 작은 (~5-nt) 윈도우를 노출시킨다. 이 윈도우 내의 임의의 시티딘은 우라실로 가수분해성으로 탈아미노화되어 G:U 중간체를 생성한다.
염기 절제 복구 (BER)는 G:U 미스매치에 대한 세포의 일차 반응이고 우라실 N-글리코실라제 (UNG)에 의한 우라실의 절제에 의해 개시된다 (20). UNG에 의한 절제로부터 편집된 G:U 중간체를 보호하기 위한 노력으로, 83-아미노산 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI)를 촉매적 데드 Cas9 (dCas9)의 C-말단에 직접 융합시켰다 (1). 세포 DNA 미스매치 복구 시스템을 G:U 미스매치 내의 G를 A로 우선적으로 대체하도록 조작하기 위해, dCas9 내의 Ala 840 아미노산을 His로 복귀시키고, 이로써 Cas9 단백질이 새로 형성된 우라실에 대향하는 DNA 가닥을 니킹하도록 하여, G:U 중간체의 목적하는 A:U 및 A:T 생성물로의 훨씬 더 효율적인 전환을 발생시켰다 (1). 이들 2가지 조작 노력을 조합하여 16-아미노산 링커를 통해 에스. 피오게네스 dCas9 (A840H)에 테더링된 APOBEC1 시티딘 데아미나제 효소의 3-부분 융합체로 이루어진 단일 단백질인 BE3을 생성하였고, 이는 4-아미노산 링커를 통해 UGI에 공유 연결된다 (1). BE3 및 관련 염기 편집제는 현재 식물 게놈 편집, 생체내 포유동물 게놈 편집, 표적화된 돌연변이유발 및 녹아웃 연구를 포함한 다양한 용도에 사용되어 왔다 (2-13). 염기 편집의 범주는 변경된 PAM 요건 (4), 좁아진 편집 윈도우 (4), 감소된 오프-타겟 편집 (10), 및 소분자 의존성 (21)을 갖는 BE3 변이체를 보고함으로써 최근에 확장되었다.
일부 유전자좌에서, 염기 편집제 예컨대 BE3은 표적 C:G 염기 쌍이 목적하는 T:A 생성물보다는 G:C 또는 A:T 염기 쌍으로 전환되는 목적하지 않은 부산물을 생성한다 (2, 3, 6-8). 여기서, 본 발명자들은 염기 편집 생성물 순도의 결정인자를 조명하고, UNG 활성이 목적하지 않은 부산물의 형성에 요구된다는 것을 확립한다. 우라실 중간체에 대한 UNG 접근을 차단하는 것은 목적하지 않은 생성물을 최소화하기 위해 단일 C가 편집 윈도우 내에 있는 표적 유전자좌에 특히 중요한 것으로 결정되었다. BE3을 포함한 이전에 기재된 염기 편집제와 비교하여 더 높은 효율 및 크게 개선된 생성물 순도를 갖는 염기 편집을 수행하는 제4-세대 염기 편집제인 BE4 및 SaBE4를조작하였다.
결과
UNG 활성은 부산물 형성에 요구된다
목적하지 않은 염기 편집 부산물은 우라실-함유 DNA 가닥 내의 무염기성 부위의 형성 및 오류-유발 분해로 인한 염기 절제 복구 동안 발생할 수 있다. 우라실 N-글리코실라제 (UNG)가 결여된 세포에서의 염기 편집의 생성물 순도가 개선되는지 결정하기 위해, HAP1 세포 (반수체 인간 세포주) 및 HAP1 UNG- 세포를 EMX1, FANCF, HEK2, HEK3, HEK4 또는 RNF2 유전자좌를 표적화하는 BE3 및 sgRNA를 코딩하는 플라스미드로 뉴클레오펙션하였다 (표적 서열에 대해서는 도 135b 참조). 뉴클레오펙션 3일 후, 게놈 DNA를 추출하고, 표적 유전자좌를 PCR에 의해 증폭시키고, 고처리량 DNA 서열분석 (HTS)에 의해 분석하였다. 염기 편집 생성물 순도는, 표적 C가 T로 편집된, 편집된 서열분석 판독물 (표적 C가 A, G 또는 T로 전환된 판독물)의 퍼센트로서 정의된다. BE3-처리된 HAP1 세포의 염기 편집 생성물 순도는 6개의 유전자좌에서 12개의 표적 C를 걸쳐 68 ± 6%로 평균되었다 (n = 3개의 생물학적 반복에 대해 평균 ± S.D.). HAP1 UNG- 세포에서, 시험된 모든 12개의 표적 C는 생성물 순도 > 98%로 염기 편집되었다 (도 135a). 또한, 모든 6개의 시험된 유전자좌에서의 indel 빈도는 UNG 녹아웃시 7 내지 100배 감소하였다 (도 135c). 이들 데이터는 UNG 활성이 염기 편집 동안 목적하지 않은 생성물 형성에 필요하다는 것을 강하게 암시하며, 이는 무염기성 부위 형성 및 오류-유발 폴리머라제를 사용한 후속 염기 절제 복구가 표적 뉴클레오티드의 무작위화 및 때때로 indel을 생성하는 가닥 파괴를 야기하는 모델과 일치한다.
다중 편집가능한 C를 갖는 표적은 보다 높은 생성물 순도를 나타낸다
BE3에 의한 염기 편집 효율은 G의 바로 하류인 일부 (전부는 아님) 표적 C에 대해 더 낮을 수 있고 (1), 이는 APOBEC1의 공지된 서열 선호도와 일치한다 (22) (도 136a). 이러한 표적을 효율적으로 편집하기 위한 노력으로, APOBEC1 데아미나제를 대체한 BE3 변이체를 CDA1 (CDA1-BE3을 생성하기 위함), AID (AID-BE3을 생성하기 위함), 또는 APOBEC3G (APOBEC3G-BE3을 생성하기 위함)로 대체하여, 상이한 서열 선호도를 갖는 3개의 단일 가닥 DNA-특이적 시티딘 데아미나제 효소를 생성하였다 (23). HEK293T 세포를 이들 BE3 변이체 및 EMX1, FANCF, HEK2, HEK3, HEK4, 또는 RNF2 유전자좌를 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후, 게놈 DNA를 추출하고, 표적 유전자좌를 PCR에 의해 증폭시키고, HTS를 사용하여 염기 편집에 대해 평가하였다. G에 바로 이어지는 표적 C의 보다 효율적인 편집이 BE3과 비교하여 CDA1-BE3 및 AID-BE3에서 관찰되었다 (도 136a, 도 140a-d, 및 도 146-151). 일반적으로, CDA1-BE3 및 AID-BE3은 G에 이어지지 않는 표적 C에서 BE3보다 더 낮은 편집 효율을 나타내었다 (도 140a-d). 대조적으로, APOBEC3G-BE3은 예측가능하지 않은 서열 선호도를 나타내었으며, 이때 전체적으로 BE3과 비교하여 더 낮은 C에서 T로의 편집의 수율을 가졌다. 이러한 발견은 CDA1-BE3 및 AID-BE3이 일부 표적 5'-GC-3' 서열에 대해 BE3에 비해 더 높은 편집 효율을 제공할 수 있다는 것을 시사한다.
이들 데이터를 분석하면서, CDA1-BE3 및 AID-BE3의 생성물 순도는 전형적으로 CDA1-BE3 및 AID-BE3이 BE3보다 더 많은 C를 편집하는 그러한 부위에서 BE3의 생성물 순도보다 더 높다는 것에 주목하였다 (도 136a-d). 예를 들어, HEK4 유전자좌에서, BE3은 단지 단일 C만을 효율적으로 편집하지만 (G가 C에 선행하지 않음), CDA1-BE3 및 AID-BE3 둘 다는 3개의 C를 편집한다 (도 140a-c). 이러한 유전자좌에서의 BE3의 생성물 순도는 50 ± 7% (n = 3개의 생물학적 반복에 대해 평균 ± S.D.)인 반면, CDA1-BE3 및 AID-BE3의 생성물 순도는 각각 97 ± 2% 및 93 ± 2%이다. 더욱이, 각각 84 ± 3% 및 91 ± 2%의 생성물 순도를 갖는, BE3에 의해 편집된 EMX1 및 FANCF는 대등한 효율로 편집된 다중 C를 함유하는 반면 (도 S2), 각각 28 ± 3% 및 64 ± 3%의 훨씬 더 낮은 생성물 순도를 갖는, BE3에 의해 편집된 HEK2 및 RNF2는 동일하지 않은 효율로 편집된 다중 C를 함유한다 (도 141a-c). 대등한 효율을 갖는, HEK2 유전자좌 내에서 두 C를 편집하는 CDA1-BE3 및 AID-BE3은 이 유전자좌에서 훨씬 더 높은 생성물 순도를 나타낸다 (각각 85 ± 5% 및 81 ± 4%) (도 136a-d 및 도 140c). HEK2 및 RNF2 부위에서 다중 C가 초기에 대등한 효율로 BE3에 의해 U로 전환된 다음, DNA 복구 시스템에 의해 상이한 효율로 프로세싱될 가능성이 배제되었다. 이를 고려할 때, 이들 부위가 CDA1-BE3 또는 AID-BE3에 비해 BE3으로 처리되는 경우에 상이한 생성물 분포가 관찰되기 보다는 유사한 생성물 분포가 예상될 것이다 (도 136b 및 도 146-151). 대신에, 단리된 G:U는 G:U 병변의 클러스터보다 UNG에 의해 보다 용이하게 프로세싱될 수 있다. BE3에서의 시티딘 데아미나제 도메인의 프로세싱성 (1, 24)은 다중 편집가능한 C를 함유하는 유전자좌에서의 BE3의 체류 시간을 증가시킴으로써, 단일 편집가능한 C를 함유하는 유전자좌에서보다 더 효과적으로 UNG에 의한 접근을 차단할 수 있다는 것이 가능하다.
생성물 순도, 개별 서열분석 판독물에서의 편집된 C의 수, 및 UNG 활성 사이의 관계를 추가로 분석하였다. 명백한 UNG 억제의 부재 하에 염기 편집된 DNA의 운명을 밝혀내기 위해, BE3의 UGI 성분을 제거하여 BE3B를 생성하였다. HEK293T 세포를 BE3 또는 BE3B 및 EMX1, FANCF, HEK2, HEK3, HEK4 또는 RNF2 유전자좌를 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 상기 확립된 염기 편집 결과를 다양화하는 데 있어서의 UNG의 역할을 고려할 때 예상되는 바와 같이, 모든 표적 C에서의 생성물 순도는 BE3-처리된 DNA와 비교하여 BE3B-처리된 DNA에서 크게 감소하였고, 비-T를 함유하는 편집 생성물의 분율은 평균 1.8 ± 0.4배만큼 증가하였다 (도 142b).
다중-C 부위 HEK2, HEK3, 및 RNF2를 표적화하는 sgRNA 및 BE3 또는 BE3B로 처리된 HEK293T 세포로부터의 개별 DNA 서열분석 판독물을 분석하였다. 각각의 부위에 대해, 1차 표적 C가 가장 효율적으로 변형된 뉴클레오티드로서 지정되었다. 모든 3개의 부위에 걸쳐, 1차 표적 C의 목적하지 않은 C에서 비-T로의 편집을 함유하는 서열분석 판독물의 평균 80 ± 10%는 단일 염기 편집 사건만을 나타내었다 (도 142a-d 및 도 143). 대조적으로, 동일한 3개의 다중-C 부위에 걸쳐, 1차 표적 C의 명확한 C에서 T로의 편집을 함유하는 서열분석 판독물의 훨씬 더 낮은 평균 32 ± 4%는 단일 명확한 염기 편집 사건만을 나타내었다 (도 142a-d 및 도 143). 또한, 편집 윈도우 내에서 오직 1개의 C를 함유하는 부위인 BE3B-처리된 HEK4 DNA에 대한 생성물의 분포는 대략적으로 A:G:T에 대해 1:3:1의 비를 따른다 (도 143d). 이러한 관찰은, 주어진 표적 내의 단일 시티딘이 UGI의 부재 하에 U로 전환되는 경우, 이는 UNG-개시된 BER에 의해 효율적으로 프로세싱되어 생성물의 혼합물을 제공한다는 것을 집합적으로 나타낸다.
이들 데이터는 클러스터링된 G:U 미스매치가 단리된 G:U 미스매치와는 상이하게 프로세싱되고, 명확한 C에서 T로의 편집을 생성할 가능성이 더 크다는 모델과 일치한다. 단지 단일 C에서 T로의 편집 사건을 목적하는 경우, 상기 관찰은 UNG 억제가 목적하지 않은 부산물을 최소화하는 데 중요하다는 것을 시사한다. 그러나, dCas9-데아미나제 융합체, 예컨대 TAM(8) 및 CRISPR-X(2)를 사용하여 표적화된 무작위 돌연변이유발을 수행하는 경우, 상기 관찰은 단지 단일 편집가능한 C를 갖는 표적 부위가 생성물 혼합물을 최대화할 것임을 시사한다.
개선된 생성물 순도를 위한 BE3 아키텍처의 최적화
SSB-BE3을 생성하기 위해 BE3의 UGI 성분을 단일-가닥 DNA 결합 (SSB) 단백질로 대체하여, SSB가 R-루프의 우라실-함유 ssDNA 부분에 UNG가 접근하는 것을 차단할 수 있도록 하였다. SSB-BE3에 의한 염기 편집 효율의 큰 감소가 관찰되었고, 여기서 4개의 부위에 걸쳐 모든 7개의 C가 단지 평균 1.9 ± 0.5% C에서 T로의 전환을 나타내었다 (도 137c).
염기 편집 결과를 결정하는 단계 동안 APOBEC, UGI, 및 UNG의 상대적인 배치가 공지되어 있지 않기 때문에, UGI는 UNG 억제를 개선시키기 위한 노력으로 BE3의 N-말단으로 재배치되었다 (N-UGI-BE3). UGI를 BE3의 N-말단으로 이동시켜, BE3과 비교하여 2.3 ± 0.6배의 모든 7개의 시험된 표적 C에 걸쳐 C에서 T로의 편집 백분율의 평균 감소 (도 137c), 및 BE3과 비교하여 평균 2.2 ± 0.5배의 4개의 모든 부위에서의 전체 생성물 순도의 감소가 생성되었다 (도 137b).
대조적으로, BE3의 C-말단에 UGI의 추가의 카피를 부가하여 (BE3-2xUGI), BE3에 비해 생성물 순도의 큰 증가 및 BE3의 것과 대등한 C에서 T로의 편집 백분율을 발생시켰다. 비-T 편집 생성물은 시험된 4개의 유전자좌에 걸쳐 평균 2.2 ± 0.8배 감소하였다 (도 137b). 이들 관찰은 UGI의 제2 카피의 부가가 G:U 염기 편집 중간체에 대한 UNG의 접근을 실질적으로 감소시킴으로써 생성물 순도를 크게 개선시킨다는 것을 시사한다.
상기 실험이 또한 성분의 아키텍처에 대한 염기 편집 결과의 감수성을 밝혀냈기 때문에, 다음으로 본 발명자들은 생성물 순도 및 편집 효율을 추가로 증가시키기 위해 BE3 성분 사이의 링커를 최적화하였다. 본 발명자들은 rAPOBEC1-dCas9(A840H) 링커를 16개의 아미노산 (BE3)에서 32개의 아미노산(BE3C)으로 다양화하고, dCas9(A840H)-UGI 링커를 4개 (BE3)에서 9개 (BE3D)에서 16개의 아미노산 (BE3E, 도 138a)으로 다양화하였다. dCas9(A840H)-UGI 링커가 4개 아미노산 (BE3) 대신에 9개 아미노산 잔기 길이 (BE3D)인 경우에 비-T 생성물 형성은 평균적으로 1.3 ± 0.1배 감소하였고 (도 138d), C에서 T로의 편집 효율에서의 명백한 차이는 없었다 (도 138c). rAPOBEC1-dCas9 (A840H) 링커를 16개의 아미노산 (BE3)에서 32개의 아미노산 (BE3C)으로 증가시키는 것은 C에서 T로의 편집 효율을 HEK2 유전자좌에서 평균 1.2 ± 0.1배 상승시켰다 (도 138c). 이러한 유전자좌는 이전에 가장 불균일하게 편집된 시험된 다중-C 부위였고 (도 141a-c), 이 링커를 확장시켜 C4에 비한 C6의 우선적인 편집을 2.6 ± 0.2배에서 1.8 ± 0.1배로 감소시켰다 (C6에서 편집된 서열분석 판독물의 백분율 대 C4의 것의 비). 본 발명자들은 이러한 보다 긴 링커가 데아미나제가 R-루프 내의 ssDNA에 보다 잘 접근할 수 있게 하고, 다중 표적 C가 염기 편집 윈도우 내에 존재하는 경우에 보다 균일한 탈아미노화를 발생시킬 수 있다는 것을 추론하였다. BE3C는 또한 시험된 다른 유전자좌에서 대등하거나 개선된 염기 편집 효율 및 생성물 순도를 나타내었다 (도 138c-d).
증진된 효율 및 생성물 순도를 갖는 C:G에서 T:A로의 염기 편집제인 BE4
염기 편집제 구축물 BE4는 모든 3가지 개선을 조합함으로써-rAPOBEC1-dCas9 링커를 32개의 아미노산으로 연장시키고, dCas9-UGI 링커를 9개의 아미노산으로 연장시키고, UGI의 제2 카피를 또 다른 9-아미노산 링커로 구축물의 C-말단에 부가함으로써 조작하였다. 문헌 [Nishida et al.]에 의해 보고된 대안적 염기 편집제 구축물인 표적-AID (9)를 또한 BE4와 동일한 플라스미드 백본 내로 클로닝하였다. HEK293T 세포를 BE3, BE4, 또는 표적-AID 및 EMX1, FANCF, HEK2, HEK3, HEK4, 또는 RNF2 유전자좌를 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후, 게놈 DNA를 추출하고, 표적 유전자좌를 PCR에 의해 증폭시키고, HTS에 의해 분석하였다. BE3에 비해 BE4에 대한 모든 12개의 편집된 C에 걸쳐 1.5 ± 0.3배의 C에서 T로의 편집 효율의 평균 증가가 관찰되었다 (도 139c). 분석된 동일한 위치에서의 표적-AID에 대한 C에서 T로의 편집의 평균 효율은 BE3의 것보다 1.5 ± 0.5배 더 낮았고, BE4의 것보다 2.1 ± 0.5배 더 낮았지만, CDA1 데아미나제를 사용하는 표적-AID는, 위치 C3 및 C4에 대해 최적의 편집을 가지면서 편집 윈도우가 BE3 및 BE4에 비해 이동하는 것으로 보이는 것으로 보인다는 것에 주목하는 것이 중요하다 (도 139c). 이러한 이동된 편집 윈도우는 표적-AID와 BE3 또는 BE4 사이의 효율 및 생성물 순도의 비교를 어렵게 하는데, 이는 주어진 표적 C가 동일한 가이드 RNA를 사용하는 경우에도 상이한 편집 윈도우 내의 더 최적인 또는 덜 최적인 위치에 놓일 수 있기 때문이다.
더 큰 C에서 T로의 편집 효율 이외에도, BE4는 또한 시험된 모든 게놈 유전자좌에서 BE3에 비해 실질적으로 개선된 생성물 순도를 나타내었고, 2.3 ± 0.3배의 비-T 생성물 형성에서의 평균 감소를 나타내었다 (도 139d). indel을 야기할 수 있는 염기 절제 복구를 추가로 방해하는 것에서 예상되는 바와 같이 (25), BE3과 비교하여 BE4 처리 후 모든 6개의 유전자좌에 걸쳐 평균 2.3 ± 1.1배의 indel 비율의 감소가 또한 관찰되었다 (도 144a-c). 종합하면, 이들 결과는 BE4가 시험된 모든 유전자좌에서 C에서 T로의 편집의 높은 효율, 높은 생성물 순도, 및 낮은 indel 형성 비율을 제공한다는 것을 나타낸다.
BE4 개선을 에스. 아우레우스 Cas9와 통합하여 (26) SaBE4를 생성하였고, 이는 에스. 피오게네스 dCas9(A840H)를 더 작은 에스. 아우레우스 dCas9(A580N)로 대체하고, 그의 대안적 PAM 요건으로 인해 상이한 표적에 접근할 수 있다. HEK293T 세포를 SaBE3 (4) 또는 SaBE4 및 FANCF, HEK3, 또는 HEK4 유전자좌를 표적화하는 sgRNA를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. BE4 및 BE3을 비교하는 결과와 일치하게, 본 발명자들은 SaBE3에 비해 SaBE4에 대한 모든 10개의 편집된 C에 걸쳐 1.4 ± 0.2배의 C에서 T로의 편집 효율의 평균 증가를 관찰하였고 (도 145a), 목적하지 않은 비-T 편집 생성물에서는 1.8 ± 0.5배 평균 감소를 관찰하였다 (도 145b). 이들 결과는 BE4 증진으로부터 발생하는 염기 편집 효율 및 생성물 순도의 이득이 또한 다른 Cas9 상동체로부터 유래된 염기 편집제에도 적용된다는 것을 나타낸다.
물질 및 방법
플라스미드의 클로닝
본 연구에서 모든 플라스미드는 퓨션 U 핫 스타트 폴리머라제 (써모 피셔)를 사용하여 USER 클로닝에 의해 생성하였다. 데아미나제 및 SSB 유전자를 g블록스 유전자 단편 (인테그레이티드 DNA 테크놀로지스)으로서 합성하고, 표적-AID를 애드진으로부터 입수하였다 (플라스미드 # 79620). 단백질 서열은 보충 노트에 열거된다.
세포 배양
HEK293T (ATCC CRL-3216) 세포를 10% (v/v) 소 태아 혈청 (FBS)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 + 글루타맥스 (써모피셔) 중에서 37℃에서 5% CO2 하에 유지하였다. HAP1 (호리즌 디스커버리(Horizon Discovery) C631) 및 HAP1 UNG- (호리즌 디스커버리 HZGHC001531c012)를 10% (v/v) 소 태아 혈청 (FBS)이 보충된 이스코브 변형 둘베코 배지 + 글루타맥스 (써모피셔 사이언티픽) 중에서 37℃에서 5% CO2 하에 유지하였다.
형질감염
HEK293T 세포를 48-웰 콜라겐-코팅된 바이오코트 플레이트 (코닝) 상에 시딩하고, 대략 75% 전면생장률로 형질감염시켰다. 간략하게, 750 ng의 BE 및 250 ng의 sgRNA 발현 플라스미드를 제조업체의 프로토콜에 따라 웰당 1.5 μL의 리포펙타민 2000 (써모피셔 사이언티픽)을 사용하여 형질감염시켰다.
HAP1 및 HAP1 UNG- 세포를 SE 세포주 4D뉴클레오펙터™ X 키트 S (론자(Lonza))를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 뉴클레오펙션시켰다. 간략하게, 4 x 105개의 세포를 4D뉴클레오펙터™ 프로그램 DZ-113을 사용하여 300 ng의 BE 및 100 ng의 sgRNA 발현 플라스미드로 뉴클레오펙션시켰다.
게놈 DNA 샘플의 고처리량 DNA 서열분석
형질감염된 세포를 3일 후에 수거하고, 세포를 용해 완충제 (10 mM 트리스-HCl pH 8.0, 0.05% SDS, 25 μg/mL 프로테이나제 K) 중에서 37℃에서 1시간 동안, 이어서 80℃에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 게놈 DNA를 단리하였다. 관심 게놈 영역을 이전에 기재된 바와 같이 플랭킹 HTS 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다 (6, 1). PCR 증폭을 제조업체의 지침에 따라, 및 이전에 기재된 바와 같이 퓨션 고충실도 DNA 폴리머라제 (써모피셔)를 사용하여 수행하였다. 정제된 DNA를 서열분석 어댑터를 함유하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성물을 겔-정제하고, 퀀티T™ 피코그린 dsDNA 검정 키트 (써모피셔) 및 카파 라이브러리 정량화 키트-일루미나 (카파 바이오시스템즈)를 사용하여 정량화하였다. 샘플을 이전에 기재된 바와 같이 일루미나 MiSeq 상에서 서열분석하였다.
데이터 분석
서열분석 판독물을 MiSeq 리포터 (일루미나)를 사용하여 자동으로 디멀티플렉싱하고, 개별 FASTQ 파일을 이전에 기재된 바와 같이 주문제작 매트랩 스크립트로 분석하였다 (1). 각각의 판독물을 스미스-워터만 알고리즘을 사용하여 적절한 참조 서열에 쌍별 정렬시켰다. 31 미만의 Q-점수를 갖는 염기 호출을 N으로 대체하고, 따라서 뉴클레오티드 빈도를 계산하는 것에서 제외하였다. 이러한 처리는 대략 1,000 중 1의 예상된 MiSeq 염기-호출 오류율을 생성한다. 판독 및 참조 서열이 갭을 함유하지 않는 정렬된 서열을, 염기 빈도가 각각의 유전자좌에 대해 표로 제시될 수 있는 정렬 표에 저장하였다.
indel 빈도는 이전에 기재된 매트랩 스크립트로 정량화하였다 (5, 6, 1). 간략하게, 서열분석 판독물을 indel이 발생할 수 있는 윈도우의 양 측에 플랭킹하는 2개의 10-bp 서열에 대한 정확한 매치에 대해 스캐닝하였다. 정확한 매치가 위치하지 않으면, 판독물을 분석으로부터 제외하였다. 이러한 indel 윈도우의 길이가 참조 서열과 정확하게 매칭되는 경우, 판독물을 indel을 함유하지 않는 것으로 분류하였다. indel 윈도우가 참조 서열보다 2개 이상의 염기가 더 길거나 또는 더 짧은 경우, 서열분석 판독물은 각각 삽입 또는 결실로서 분류되었다.
편집 윈도우 내의 다중 표적 시티딘에서의 염기 편집 결과 사이의 상호의존성 (연결 불균형)을 평가하기 위해, BE 처리된 세포로부터의 표적 부위 서열을 주문제작 피톤 스크립트에 의해 분석하였다 (보충 노트 1). 간략하게, 서열분석 판독물을 프로토스페이서의 각 측에 플랭킹하는 2개의 7-bp 서열에 대한 정확한 매치에 대해 스캐닝하였다. 개재 영역이 정확히 20-bp가 아닌 경우, 이를 추가의 분석에서 제외하였다. 프로토스페이서 서열을 가장 비-T 편집 결과 (1차 표적 C)를 갖는 위치에서 뉴클레오티드의 정체에 기초하여 4개의 군으로 추가로 필터링하였다. 이들 4개의 군 각각 뿐만 아니라 전체 풀에 대해, 프로토스페이서 내의 20개의 위치 각각에서 뉴클레오티드 존재비를 집계하였다.
실시예 18: LbCpf1 (뉴클레아제 데드, 뉴클레아제 활성 및 니카제)을 포함하는 염기 편집제.
상기 논의된 바와 같이, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것의 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 LbCpf1 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, LbCpf1 단백질은 뉴클레아제 불활성, 뉴클레아제 활성, 또는 LbCpf1 니카제이다. LbCpf1의 형태를 포함하는 융합 단백질의 여러 구축물을 상이한 표적 서열에서 C에서 T로의 편집을 생성하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 시험된 구축물의 개략적 표현이 도 152에 나타나 있다. 구축물 10은 [Apobec]-[LbCpf1]-[UGI]-[UGI]의 도메인 배열을 갖고; 구축물 11은 [Apobec]-[LbCpf1]-[UGI]의 도메인 배열을 갖고; 구축물 12는 [UGI]-[Apobec]-[LbCpf1]의 도메인 배열을 갖고; 구축물 13은 [Apobec]-[UGI]-[LbCpf1]의 도메인 배열을 갖고; 구축물 14는 [LbCpf1]-[UGI]-[Apobec]의 도메인 배열을 갖고; 구축물 15는 [LbCpf1]-[Apobec]-[UGI]의 도메인 배열을 갖는다. 각각의 구축물에 대해, 3개의 상이한 LbCpf1 단백질 (D/N/A, 이는 뉴클레아제 데드 LbCpf1 (D); LbCpf1 니카제 (N) 및 뉴클레아제 활성 LbCpf1 (A)을 지칭함)을 사용하였다. 각각의 이들 구축물에 대해, 도메인을 연결하는 링커가 하기에 제시되고, 여기서 XTEN은 서열 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604)를 갖는 XTEN 링커를 지칭하고, BPNLS는 서열 KRTADGSEFEPKKKRKV (서열식별번호: 740)를 갖는 핵 국재화 서열을 지칭한다. 구축물은 N-말단 (좌측)에서 C-말단 (우측)으로 제시된다.
Figure pct00243
실험에서 사용된 공통 가이드 백본 (sgRNA)은 GTAATTTCTACTAAGTGTAGAT (서열식별번호: 741)[가이드 서열]TTTTTTT이고, 여기서 서열식별번호: 741의 각각의 T는 우라실 (U)이고, 구축물을 특정 뉴클레오티드 서열로 표적화하는 가이드 서열은 괄호 사이에 제시된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 구축물 중 임의의 것은 GTAATTTCTACTAAGTGTAGAT (서열식별번호: 741)의 백본 서열을 포함하는 sgRNA와 복합체화되고, 여기서 서열식별번호: 741의 각각의 T는 우라실 (U)이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 가이드 RNA 중 임의의 것은 서열, 예를 들어 표적 DNA 서열에 완벽하게 상보적인 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오티드를 포함하는 가이드 서열을 포함한다. 수행된 실험에서, 시험된 가이드 서열이 하기에 제시된다:
Figure pct00244
다양한 구축물 및 표적 서열을 사용한 C에서 T로의 염기 쌍 편집 백분율을 입증하는 데이터가 도 153-159에 제시되고, 편집 백분율 값 (indel 카운트에 기초한 조정 후), 및 실험을 위한 indel의 백분율이 도 160-166에 제시된다.
보충 서열
CDA1-BE3, AID-BE3, BE4, 및 SaBE4 융합 단백질의 아미노산 서열.
Figure pct00245
Figure pct00246
Figure pct00247
Figure pct00248
실시예 17에 대한 참고문헌
Figure pct00249
Figure pct00250
Figure pct00251
등가물 및 범위
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험을 사용하여 본원에 기재된 실시양태의 많은 등가물을 인식하거나, 확인할 수 있을 것이다. 본 개시내용의 범주는 상기 설명에 제한되는 것으로 의도되지 않지만, 오히려 첨부된 청구범위에 제시된 바와 같다.
단수 형태는 달리 나타내거나 또는 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한 1개 또는 1개 초과를 의미할 수 있다. 군의 2개 이상의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구항 또는 설명은 달리 나타내거나 또는 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한 군 구성원 중 1개, 1개 초과, 또는 전부가 존재하는 경우 충족되는 것으로 간주된다. 2개 이상의 군 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 군의 개시내용은 군의 정확하게 1개의 구성원이 존재하는 실시양태, 군의 1개 초과의 구성원이 존재하는 실시양태, 및 군 구성원의 전부가 존재하는 실시양태를 제공한다. 간결성의 목적으로 이들 실시양태는 본원에 개별적으로 설명되지 않았지만, 이들 실시양태 각각은 본원에 제공되며, 구체적으로 청구되거나 비청구될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본 발명은 청구항 중 하나 이상으로부터 또는 설명의 하나 이상의 관련 부분으로부터, 하나 이상의 제한, 요소, 조항, 또는 설명적 용어가 또 다른 청구항 내로 도입되는 모든 변형, 조합, 및 순열을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 또 다른 청구항에 종속되는 청구항은 동일한 기초 청구항에 종속되는 임의의 다른 청구항에서 발견되는 제한 중 하나 이상을 포함하도록 변형될 수 있다. 게다가, 청구항이 조성물을 인용하는 경우, 달리 나타내거나 또는 모순 또는 불일치가 발생할 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하지 않는 한, 본원에 개시된 제조 또는 사용 방법 중 임의의 것에 따라 또는 존재하는 경우 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 조성물을 제조하거나 사용하는 방법이 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
요소가 목록으로서, 예를 들어 마쿠쉬 군 포맷으로 제공되는 경우, 요소의 모든 가능한 하위군이 또한 개시되고, 임의의 요소 또는 요소의 하위군은 군으로부터 제거될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 용어 "포함하는"은 개방적이며, 추가의 요소 또는 단계의 포한다는 것을 허용하는 것으로 의도되는 것에 주목한다. 일반적으로, 실시양태, 생성물, 또는 방법이 특정한 요소를 포함하는 것으로 언급되는 경우, 이러한 요소, 특색, 또는 단계로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어지는 특정한 요소, 특색, 또는 단계, 실시양태, 생성물, 또는 방법이 또한 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 간결성의 목적으로 이들 실시양태는 본원에 개별적으로 설명되지 않았지만, 이들 실시양태 각각은 본원에 제공되며, 구체적으로 청구되거나 비청구될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
범위가 주어지는 경우, 종점이 포함된다. 게다가, 달리 나타내거나 또는 달리 문맥 및/또는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해로부터 명백하지 않는 한, 범위로서 표현된 값은 일부 실시양태에서 언급된 범위 내의 임의의 특정 값을, 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 범위의 하한의 단위의 1/10까지 가정할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 간결성의 목적으로 각각의 범위 중의 값은 본원에 개별적으로 설명되지 않았지만, 이들 값 각각은 본원에 제공되며, 구체적으로 청구되거나 비청구될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 또한, 달리 나타내거나 또는 달리 문맥 및/또는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해로부터 명백하지 않는 한, 범위로서 표현된 값은 주어진 범위 내의 임의의 하위범위를 가정할 수 있으며, 여기서, 하위범위의 종점은 범위의 하한의 단위의 1/10만큼 동일한 정도의 정확성으로 표현되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 임의의 특정한 실시양태는 청구항 중 어느 하나 이상으로부터 명백히 제외될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 범위가 주어지는 경우, 범위 내의 임의의 값은 청구항 중 어느 하나 이상으로부터 명백히 제외될 수 있다. 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 임의의 실시양태, 요소, 특색, 적용, 또는 측면은 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 제외될 수 있다. 간결성의 목적으로, 하나 이상의 요소, 특색, 목적, 또는 측면이 제외되는 모든 실시양태는 본원에 명백하게 제시되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE <120> NUCLEOBASE EDITORS COMPRISING NUCLEIC ACID PROGRAMMABLE DNA BINDING PROTEINS <130> H0824.70257WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> 62/475,830 <151> 2017-03-23 <150> 62/490,587 <151> 2017-04-26 <150> 62/551,951 <151> 2017-08-30 <150> 62/511,934 <151> 2017-05-26 <160> 751 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4104 <212> DNA <213> Streptococcus pyogenes <400> 1 atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60 atcactgatg attataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120 cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg gcagtggaga gacagcggaa 180 gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240 tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300 cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360 aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420 aaattggcag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa 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tgagaagatt 1320 gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380 cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440 gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500 aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560 tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgagggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620 tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680 gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740 tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggcgcct accatgattt gctaaaaatt 1800 attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860 ttaacattga ccttatttga agataggggg atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920 cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980 cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040 gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100 agtttgacat ttaaagaaga tattcaaaaa gcacaggtgt ctggacaagg ccatagttta 2160 catgaacaga ttgctaactt agctggcagt cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220 gtaaaaattg ttgatgaact ggtcaaagta atggggcata agccagaaaa tatcgttatt 2280 gaaatggcac gtgaaaatca gacaactcaa aagggccaga aaaattcgcg agagcgtatg 2340 aaacgaatcg aagaaggtat caaagaatta ggaagtcaga ttcttaaaga gcatcctgtt 2400 gaaaatactc aattgcaaaa tgaaaagctc tatctctatt atctacaaaa tggaagagac 2460 atgtatgtgg accaagaatt agatattaat cgtttaagtg attatgatgt cgatcacatt 2520 gttccacaaa gtttcattaa agacgattca atagacaata aggtactaac gcgttctgat 2580 aaaaatcgtg gtaaatcgga taacgttcca agtgaagaag tagtcaaaaa gatgaaaaac 2640 tattggagac aacttctaaa cgccaagtta atcactcaac gtaagtttga taatttaacg 2700 aaagctgaac gtggaggttt gagtgaactt gataaagctg gttttatcaa acgccaattg 2760 gttgaaactc gccaaatcac taagcatgtg gcacaaattt tggatagtcg catgaatact 2820 aaatacgatg aaaatgataa acttattcga gaggttaaag tgattacctt aaaatctaaa 2880 ttagtttctg acttccgaaa agatttccaa ttctataaag tacgtgagat taacaattac 2940 catcatgccc atgatgcgta tctaaatgcc gtcgttggaa ctgctttgat 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gcgtgttatt 3840 ttagcagatg ccaatttaga taaagttctt agtgcatata acaaacatag agacaaacca 3900 atacgtgaac aagcagaaaa tattattcat ttatttacgt tgacgaatct tggagctccc 3960 gctgctttta aatattttga tacaacaatt gatcgtaaac gatatacgtc tacaaaagaa 4020 gttttagatg ccactcttat ccatcaatcc atcactggtc tttatgaaac acgcattgat 4080 ttgagtcagc taggaggtga ctga 4104 <210> 2 <211> 1367 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 2 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Asp Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Gly Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Ala Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Ile Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Arg Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Arg Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Ser Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Ala Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Gly Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly His Ser Leu 705 710 715 720 His Glu Gln Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Ile Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr 755 760 765 Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu 770 775 780 Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val 785 790 795 800 Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln 805 810 815 Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu 820 825 830 Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Ile Lys Asp 835 840 845 Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly 850 855 860 Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn 865 870 875 880 Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe 885 890 895 Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys 900 905 910 Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys 915 920 925 His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu 930 935 940 Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys 945 950 955 960 Leu Val Ser 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musculus <400> 78 Tyr Ser Ser Gly Arg Asn Lys Thr Phe Leu Cys Tyr Val Val Glu Ala 1 5 10 15 Gln Gly Lys Gly Gly Gln Val Gln Ala Ser Arg Gly Tyr Leu Glu Asp 20 25 30 Glu His Ala Ala Ala His Ala Glu Glu Ala Phe Phe Asn Thr Ile Leu 35 40 45 Pro Ala Phe Asp Pro Ala Leu Arg Tyr Asn Val Thr Trp Tyr Val Ser 50 55 60 Ser Ser Pro Cys Ala Ala Cys Ala Asp Arg Ile Ile Lys Thr Leu Ser 65 70 75 80 Lys Thr Lys Asn Leu Arg Leu Leu Ile Leu Val Gly Arg Leu Phe Met 85 90 95 Trp Glu Glu Pro Glu Ile Gln Ala Ala Leu Lys Lys Leu Lys Glu Ala 100 105 110 Gly Cys Lys Leu Arg Ile Met Lys Pro Gln Asp Phe Glu Tyr Val Trp 115 120 125 Gln Asn Phe Val Glu Gln Glu Glu Gly Glu Ser Lys Ala Phe Gln Pro 130 135 140 Trp Glu Asp Ile Gln Glu Asn Phe Leu Tyr Tyr Glu Glu Lys Leu Ala 145 150 155 160 Asp Ile Leu Lys <210> 79 <211> 224 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 79 Met Ala Gln Lys Glu Glu Ala Ala Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln 1 5 10 15 Asn Gly Asp Asp Leu Glu Asn Leu Glu Asp Pro Glu Lys Leu Lys Glu 20 25 30 Leu Ile 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 86 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atagcttccg cggatttatt tatttatgga 60 tgacctctgg atccatggac 80 <210> 87 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 87 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atagccttcc gcggatttat ttattatgga 60 tgacctctgg atccatggac 80 <210> 88 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 88 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atagccattc cgcggattta tttatttgga 60 tgacctctgg atccatggac 80 <210> 89 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 89 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atagcctatt ccgcggattt atttattgga 60 tgacctctgg atccatggac 80 <210> 90 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 90 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atagccttat tccgcggatt tatttatgga 60 tgacctctgg atccatggac 80 <210> 91 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 91 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atagccatta ttccgcggat ttattttgga 60 tgacctctgg atccatggac 80 <210> 92 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 92 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atagcctatt attccgcgga tttatttgga 60 tgacctctgg atccatggac 80 <210> 93 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 93 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atagccatta tattccgcgg atttattgga 60 tgacctctgg atccatggac 80 <210> 94 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 94 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atagcctatt atattccgcg gatttatgga 60 tgacctctgg atccatggac 80 <210> 95 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 95 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atagccttat tatattccgc ggattttgga 60 tgacctctgg atccatggac 80 <210> 96 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 96 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atagccatta ttatattccg cggatttgga 60 tgacctctgg atccatggac 80 <210> 97 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 97 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atagcctatt attatattcc gcggattgga 60 tgacctctgg atccatggac 80 <210> 98 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 98 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atagccatta ttattattac cgcggatgga 60 tgacctctgg atccatggac 80 <210> 99 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 99 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atagccatta ttattattat taccgctgga 60 tgacctctgg atccatggac 80 <210> 100 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 100 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atagtaatat taatttattt atttaatgga 60 tgacctctgg atccatggac 80 <210> 101 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 101 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt gtagattatt atctgcggat ttattggatg 60 acctctggat ccatggacat 80 <210> 102 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 102 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atagccatta ttccgcggat ttattttgga 60 tgacctctgg atccatggac 80 <210> 103 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 103 auuauuccgc ggauuuauuu guuuuagagc uag 33 <210> 104 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 104 cguaggccag gguggucacg guuuuagagc uag 33 <210> 105 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 105 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt aactatgctg ccgcccagtg ggactttgga 60 aatacaatgt gtcaactctt 80 <210> 106 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 106 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt aaaatacaat gtgtcaactc ttgacagggc 60 tctattttat aggcttcttc 80 <210> 107 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 107 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt attttccata cagtcagtat caattctgga 60 agaatttcca gacattaaag 80 <210> 108 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 108 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt agcttcggtg tcgaaatgag aagaagaggc 60 acagggctgt gaggcttatc 80 <210> 109 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 109 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt agtgagccca gaaggggaca gtaagaagga 60 aaaacaggtc agagatggcc 80 <210> 110 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 110 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atcctgaaca ccttccagga attctttggc 60 ctgaataatt gcagtagctc 80 <210> 111 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 111 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt agacatggag gacgtgcgcg gccgcctggt 60 gcagtaccgc ggcgaggtgc 80 <210> 112 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 112 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt actgcagaag cgcctggcag tgtaccaggc 60 cggggcccgc gagggcgccg 80 <210> 113 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 113 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt agccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 60 gaacttcaag atccgccaca 80 <210> 114 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 114 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt aaccactacc agcagaacac ccccatcggc 60 gacggccccg tgctgctgcc 80 <210> 115 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 115 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt acctcgccct tgctcaccat ctcgagtcgg 60 ccgccagtgt gatggatatc t 81 <210> 116 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 116 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt acacgcgtag gccagggtgg tcacgagggt 60 gggccagggc acgggcagc 79 <210> 117 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 117 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt aaagcactgc actccgcagg tcagggtggt 60 cacgagggtt ggccagggca 80 <210> 118 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 118 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt acactccgca ggtcagggtg gtcacgaggg 60 ttggccaggg cacgggcagg 80 <210> 119 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 119 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt aggatctctt cttcacggtt gcctactggt 60 tcaattactt ttaaaaatgg 80 <210> 120 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 120 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt attctcgatt gaggatctct tcttcacggt 60 tgcctactgg ttcaattact 80 <210> 121 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 121 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt aaggagctgt ggcagtggca ccagaatgga 60 ttccagagtc caggtaagac 80 <210> 122 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 122 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt agtactcctc ccggccggcg gtatccagga 60 tgtccaacag gcacgtctcc 80 <210> 123 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 123 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atgactgctt gcagatggcc atggcgcgga 60 cgcgggtgcc gggcgggggt 80 <210> 124 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 124 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt actgttacac atgcagttgt agtggatggt 60 ggtacagtca gagccaacct 80 <210> 125 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 125 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt aggaactgtc acacatgtag ttgtagtgga 60 tggtggtaca gtcagagcca 80 <210> 126 <211> 1623 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 126 Met Ser Ser Glu Thr Gly Pro Val Ala Val Asp Pro Thr Leu Arg Arg 1 5 10 15 Arg Ile Glu Pro His Glu Phe Glu Val Phe Phe Asp Pro Arg Glu Leu 20 25 30 Arg Lys Glu Thr Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Asn 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ccggctgtat 540 aagcggccgc tcgattggtt tggtgtggct ctaa 574 <210> 172 <211> 1045 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 172 catccttggt accgagctcg gatccagcca ccatggagct gaagtatcac cctgagatgc 60 ggtttttcca ctggtttagt aagtggcgca aacttcatcg ggatcaggag tatgaagtga 120 cctggtatat ctcttggtct ccctgcacaa aatgtacacg cgavatggaa acatttctgg 180 ccgaggatcc aaaggtgacg ctcacaaatc tttgtggccc gcctgtatta tttctgggac 240 ccggattatc aggaggcact taggtcattg tgccaaaagc gcgacggacc acgggcgact 300 atgaaaatca tgaattatga cgaattccag cattgctgga gtaagtttgt gtacagccag 360 cgggagctgt tcgagccctg gaacaatctt cccaagtact acatactgct tcacattatg 420 ttgggggaga tccttcggca ctctatggat cctcctaccc tttacgttta aactttaata 480 atgagccttg ggttcgcggg cgccatgaaa cctatttgtg ctacgaggtc gagcggatcc 540 ataatgatac gtgggtcctg ctgaatcaga ggagggggtt tctgtgtaac caggctccac 600 ataaagatgg atttctcgag gggcggcacg ccgaactgtg tttccttgat gtgatacctt 660 tctggaagct cgaccttgat caagattaca gggtgacgtg tttcacctcc tggtcaccct 720 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312 acgtaaacgg ccacaagttc ttacttcgtg gatttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 313 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 313 acgtaaacgg ccacaagttc ttagttcgtg gatttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 314 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 314 acgtaaacgg ccacaagttc ttatatcgtg gatttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 315 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 315 acgtaaacgg ccacaagttc ttatctcgtg gatttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 316 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 316 acgtaaacgg ccacaagttc ttatgtcgtg gatttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 317 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 317 acgtaaacgg ccacaagttc ttattacgtg gatttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 318 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 318 acgtaaacgg ccacaagttc ttattccgtg gatttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 319 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 319 acgtaaacgg ccacaagttc ttattgcgtg gatttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 320 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 320 acgtaaacgg ccacaagttc ttatttcatg gatttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 321 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 321 acgtaaacgg ccacaagttc ttatttcttg gatttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 322 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 322 acgtaaacgg ccacaagttc ttatttcctg gatttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 323 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 323 acgtaaacgg ccacaagttc ttatttcgaa gatttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 324 <211> 60 <212> DNA <213> 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<211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 330 acgtaaacgg ccacaagttc ttatttcgtg tatttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 331 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 331 acgtaaacgg ccacaagttc ttatttcgtg catttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 332 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 332 acgtaaacgg ccacaagttc ttatttcgtg gttttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 333 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 333 acgtaaacgg ccacaagttc ttatttcgtg gctttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 334 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 334 acgtaaacgg ccacaagttc ttatttcgtg ggtttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 335 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 335 acgtaaacgg ccacaagttc ttatttcgtg gaattattta 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ccacaagttg caccctcgtg gatttattta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 342 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 342 acgtaaacgg ccacaagtat tcgcacccgt ggatttatta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 343 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 343 acgtaaacgg ccacaagtat cctcgcacgt ggatttatta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 344 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 344 acgtaaacgg ccacaagtat accctcgcgt ggatttatta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 345 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 345 acgtaaacgg ccacaagtat gcaccctcgt ggatttatta tggcatcttc ttcaaggacg 60 <210> 346 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 346 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt aggcctgagt ccgagcagaa gaagaagggc 60 tcccatcaca tcaaccggtg 80 <210> 347 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Polynucleotide <400> 352 gtaggtagtt aggatgaatg gaaggttggt atggcagtca tcttagtcat taccttgagg 60 tgttcgttgt aactcatata a 81 <210> 353 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 353 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnacg taaacggcca caa 53 <210> 354 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 354 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc gtccttgaag aagatgc 47 <210> 355 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 355 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngta ggtagttagg atgaatggaa 60 <210> 356 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 356 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc accggttgat gtgatgg 47 <210> 357 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide 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tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg ctttcacaag gatgcagtct 50 <210> 384 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 384 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngag ctagactccg agggga 56 <210> 385 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 385 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctt cctcgtcctg ctctcactt 49 <210> 386 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 386 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnaga ggctgaagag gaagacca 58 <210> 387 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 387 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg gcccagctgt gcattctat 49 <210> 388 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 388 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnncca agagggccaa gtcctg 56 <210> 389 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 389 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc agcgaggagt gacagcc 47 <210> 390 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 390 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnncac tccacctgat ctcgggg 57 <210> 391 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 391 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc gaggagggag ggagcag 47 <210> 392 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 392 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnacc acaaatgccc aagagac 57 <210> 393 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 393 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg acacagtcaa gggccgg 47 <210> 394 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 394 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnccc acctttgagg aggcaaa 57 <210> 395 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 395 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctt tccatctgag aagagagtgg t 51 <210> 396 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 396 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngtc ataccttggc ccttcct 57 <210> 397 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 397 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctt ccctaggccc acaccag 47 <210> 398 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 398 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnaac ccactgaaga agcaggg 57 <210> 399 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 399 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg gtgcttaatc cggctccat 49 <210> 400 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 400 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnntcc agtgtttcca tcccgaa 57 <210> 401 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 401 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc ctctgacctc cacaactct 49 <210> 402 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 402 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnctg ggtacagttc tgcgtgt 57 <210> 403 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 403 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctt cactctgagc atcgccaag 49 <210> 404 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 404 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnggt ttagagccag tgaactagag 60 <210> 405 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 405 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg caagacaaaa tcctctttat actttg 56 <210> 406 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 406 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnggg aggggacggc cttac 55 <210> 407 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 407 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg cctctggcga acatggc 47 <210> 408 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 408 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnntcc tggttaagag catgggc 57 <210> 409 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 409 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg attgagtccc cacagcaca 49 <210> 410 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 410 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnncca gtgtttccca tccccaa 57 <210> 411 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 411 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctt gacctccaca actggaaaat 50 <210> 412 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 412 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngct tccagaccca cctgaag 57 <210> 413 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 413 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatcta ccgaggaaaa ttgcttgtcg 50 <210> 414 <211> 58 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cctgttgacc tggagaa 57 <210> 419 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 419 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc actgtacttg ccctgacca 49 <210> 420 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 420 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnttg gtgttgacag ggagcaa 57 <210> 421 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 421 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc tgagatgtgg gcagaaggg 49 <210> 422 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 422 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnntga gagggaacag aagggct 57 <210> 423 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 423 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatgtg tccaaaggcc caagaacct 49 <210> 424 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 424 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnntcc tagcactttg gaaggtcg 58 <210> 425 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 425 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg ctcatcttaa tctgctcagc c 51 <210> 426 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 426 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnaaa ggagcagctc ttcctgg 57 <210> 427 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 427 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg tctgcaccat ctcccacaa 49 <210> 428 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 428 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnggc atggcttctg agactca 57 <210> 429 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 429 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg tctcccttgc actccctgtc ttt 53 <210> 430 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 430 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnttt ggcaatggag gcattgg 57 <210> 431 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 431 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg aagaggctgc ccatgagag 49 <210> 432 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 432 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnggt ctgaggctcg aatcctg 57 <210> 433 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 433 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc tgtggcctcc atatccctg 49 <210> 434 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 434 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnttt ccaccagaac tcagccc 57 <210> 435 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 435 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc ctcggttcct ccacaacac 49 <210> 436 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 436 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnncac gggaaggaca ggagaag 57 <210> 437 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 437 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg caggggaggg ataaagcag 49 <210> 438 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 438 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngtc agtctcggcc cctca 55 <210> 439 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 439 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg ccactgtaaa gctcttggg 49 <210> 440 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (35)..(38) <223> n is a, c, g, or t <400> 440 acactctttc cctacacgaa cgctcttccg atctnnnnag ggtagaggga cagagctg 58 <210> 441 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 441 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg gaccccacat agtcagtgc 49 <210> 442 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 442 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngct gtcagcccta tctccatc 58 <210> 443 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 443 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctt gggcaattag gacagggac 49 <210> 444 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 444 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngca gcggaggagg tagattg 57 <210> 445 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 445 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc tcagtacctg gagtcccga 49 <210> 446 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 446 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngac aggctcagga aagctgt 57 <210> 447 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 447 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatcta cacaagcctt tctccaggg 49 <210> 448 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 448 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnaat agggggtgag actgggg 57 <210> 449 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 449 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctg cctcagacga gacttgagg 49 <210> 450 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 450 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnggc cagcaggaaa ggaatct 57 <210> 451 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 451 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctt gactgcacct gtagccatg 49 <210> 452 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 452 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnntca aggaaatcac cctgccc 57 <210> 453 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 453 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatcta acttccttgg tgtgcagct 49 <210> 454 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 454 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnatg ggctcagcta cgtcatg 57 <210> 455 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 455 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatcta atcgcagtgt ggtgggcaa 49 <210> 456 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 456 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnncgc acatcccttg tctctct 57 <210> 457 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 457 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc tactggagca caccccaag 49 <210> 458 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 458 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnntgg gtcacgtagc tttggtc 57 <210> 459 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 459 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctt gtggccatgt gcaactaa 48 <210> 460 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 460 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnncta ctacgtgcca gctcagg 57 <210> 461 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 461 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatcta cctcccctcc tcactaacc 49 <210> 462 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 462 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngcc tcagctccat ttcctgt 57 <210> 463 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 463 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatcta acctttatgg caccagggg 49 <210> 464 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 464 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngag ctcagcatta gcaggct 57 <210> 465 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 465 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctt tcctggcttt ccgattccc 49 <210> 466 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 466 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngtg caattggagg aggagct 57 <210> 467 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 467 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc accagctaca ggcagaaca 49 <210> 468 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 468 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnncct acccccaaca cagatgg 57 <210> 469 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 469 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctc cacacaactc aggtcctcc 49 <210> 470 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 470 tcatctgtgc ccctccctcc ctggcccagg tgaaggtgtg gttccagaac cggaggacaa 60 agtacaaacg gcagaagctg gaggaggaag ggcctgagtt tgagcagaag aagaagggct 120 cccatcacat caaccggtgg cgcattgcca cgaagcaggc caatggggag gacatcgatg 180 tcacctccaa tgactagggt 200 <210> 471 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 471 accctagtca ttggaggtga catcgatctc ctccccattg gcctgcttcg tggcaatgcg 60 ccaccggttg atgtgatggg agcccttctt cttctgctca aactcaggcc cttcctcctc 120 cagcttctgc cgtttgtact ttgtcctccg gttctggaac cacaccttca cctgggccag 180 ggagggaggg gcacagatga 200 <210> 472 <211> 201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 472 catgcaatta gtctatttct gctgcaagta agcatgcatt tgtaggcttg atgctttttt 60 tctgcttctc cagccctggc ctgggtcaat ccttggggct tagactgagc acgtgatggc 120 agaggaaagg aagccctgct tcctccagag ggcgtcgcag gacagctttt cctagacagg 180 gggctagtat gtgcagctcc t 201 <210> 473 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 473 aggagctgca catactagcc cctgtctagg aaaagctgtc ctgcgacgcc ctctggagga 60 agcagggctt cctttcctct gccatcacgt gctcagtcta agccccaagg attgacccag 120 gccagggctg gagaagcaga aaaaaagcat caagcctaca aatgcatgct tacttgcagc 180 agaaatagac taattgcatc 200 <210> 474 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 474 ggctgacaaa ggccgggctg ggtggaagga agggaggaag ggcgaggcag agggtccaaa 60 gcaggatgac aggcaggggc accgcggcgc cccggtggca ttgcggctgg aggtgggggt 120 taaagcggag actctggtgc tgtgtgacta cagtgggggc cctgccctct ctgagccccc 180 gcctccaggc ctgtgtgtgt 200 <210> 475 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 475 acacacacag gcctggaggc gggggctcag agagggcagg gcccccactg tagtcacaca 60 gcaccagagt ctccgcttta acccccacct ccagccgcaa tgccaccggg gcgccgcggt 120 gcccctgcct gtcatcctgc tttggaccct ctgcctcgcc cttcctccct tccttccacc 180 cagcccggcc tttgtcagcc 200 <210> 476 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 476 agcaccgagg agctgcgggt gcgcctcgcc tcccacctgc gcaagctgcg taagcggctc 60 ctccgcgatg ccgatgacct gcagaagtgc ctggcagtgt accaggccgg ggcccgcgag 120 ggcgccgagc gcggcctcag cgccatccgc gagcgcctgg ggcccctggt ggaacagggc 180 cgcgtgcggg ccgccactgt 200 <210> 477 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 477 acagtggcgg cccgcacgcg gccctgttcc accaggggcc ccaggcgctc gcggatggcg 60 ctgaggccgc gctcggcgcc ctcgcgggcc ccggcctggt acactgccag gcacttctgc 120 aggtcatcgg catcgcggag gagccgctta cgcagcttgc gcaggtggga ggcgaggcgc 180 acccgcagct cctcggtgct 200 <210> 478 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 478 actcccctgc cctcaacaag atgttttgcc aactggccaa gacctgccct gtgcagctgt 60 gggttgattc cacacccccg cccggcaccc gcgtccgcgc catggccatc tacaagcagt 120 cacagcacat gacggaggtt gtgaggcgct gcccccacca tgagcgctgc tcagatagcg 180 atggtgagca gctggggctg 200 <210> 479 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 479 cagccccagc tgctcaccat cgctatctga gcagcgctca tggtgggggc agcgcctcac 60 aacctccgtc atgtgctgtg actgcttgta gatggccatg gcgcggacgc gggtgccggg 120 cgggggtgtg gaatcaaccc acagctgcac agggcaggtc ttggccagtt ggcaaaacat 180 cttgttgagg gcaggggagt 200 <210> 480 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 480 gagtccgagc agaagaagaa ggg 23 <210> 481 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 481 gagtctaagc agaagaagaa gag 23 <210> 482 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 482 gaggccgagc agaagaaaga cgg 23 <210> 483 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 483 gagtcctagc aggagaagaa gag 23 <210> 484 <211> 23 <212> 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<220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 499 tgcccacctc accccgcctc tgg 23 <210> 500 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 500 gcccctccca accccacctc tgg 23 <210> 501 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 501 cacccccctc accccgcctc agg 23 <210> 502 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 502 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnn 37 <210> 503 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 503 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatct 29 <210> 504 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 504 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnnaca ctctttccct acacgac 57 <210> 505 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (25)..(31) <223> n is a, c, g, or t <400> 505 caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn ngtgactgga gttcagacgt gtgctcttc 59 <210> 506 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 506 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnntcc tacaagtaac agtccaagaa 60 <210> 507 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 507 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctt tctgcaactt aacttacgtg aaa 53 <210> 508 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (34)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 508 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnacc aagcccattt gtccagg 57 <210> 509 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 509 tggagttcag acgtgtgctc ttccgatctt ccttcttttt gagctttggg c 51 <210> 510 <211> 57 <212> DNA <213> 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cactataggg agtccgagca gaagaagaag ttttagagct agaaatagca 60 <210> 526 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 526 taatacgact cactataggg gaatcccttc tgcagcaccg ttttagagct agaaatagca 60 <210> 527 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 527 taatacgact cactataggg gcccagactg agcacgtgag ttttagagct agaaatagca 60 <210> 528 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 528 taatacgact cactatagga ccccctccac cccgcctcgt tttagagcta gaaatagca 59 <210> 529 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 529 taatacgact cactataggt ctctctctct ctctctctcg ttttagagct agaaatagca 60 <210> 530 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 530 ggtgtttcgt cctttccaca ag 22 <210> 531 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 531 gaccccctcc accccgcctc 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Polynucleotide <400> 639 gaggccgagc agaagaaaga cgg 23 <210> 640 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 640 gagtcctagc aggagaagaa gag 23 <210> 641 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 641 gagtccggga aggagaagaa agg 23 <210> 642 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 642 gagccggagc agaagaagga ggg 23 <210> 643 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 643 aagtccgagg agaggaagaa agg 23 <210> 644 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 644 gaatccaagc aggagaagaa gga 23 <210> 645 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 645 acgtctgagc agaagaagaa tgg 23 <210> 646 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 646 ggaaccccgt ctgcagcacc agg 23 <210> 647 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 647 ggagtccctc ctacagcacc agg 23 <210> 648 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 648 agaggcccct ctgcagcacc agg 23 <210> 649 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 649 accatccctc ctgcagcacc agg 23 <210> 650 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 650 ggattgccat ccgcagcacc tgg 23 <210> 651 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 651 tgaatcccat ctccagcacc agg 23 <210> 652 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 652 ggagtccctc ctacagcacc agg 23 <210> 653 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 653 ggagtccctc ctgcagcacc tga 23 <210> 654 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 654 gaacacaatg catagattgc cgg 23 <210> 655 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 655 aaacataaag catagactgc aaa 23 <210> 656 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 656 cacccagact gagcacgtgc tgg 23 <210> 657 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 657 gacacagact gggcacgtga ggg 23 <210> 658 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 658 agctcagact gagcaagtga ggg 23 <210> 659 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 659 agaccagact gagcaagaga ggg 23 <210> 660 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 660 gagccagaat gagcacgtga ggg 23 <210> 661 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 661 tgcactgcgg ccggaggagg tgg 23 <210> 662 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 662 ggctctgcgg ctggaggggg tgg 23 <210> 663 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 663 ggcacgacgg ctggaggtgg ggg 23 <210> 664 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 664 ggcatcacgg ctggaggtgg agg 23 <210> 665 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 665 ggcgctgcgg cgggaggtgg agg 23 <210> 666 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 666 ggcactgaga ctgggggtgg ggg 23 <210> 667 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 667 agcagtgcgg ctagaggtgg tgg 23 <210> 668 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 668 ggcactgcta ctgggggtgg tgg 23 <210> 669 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 669 ggcactgggg ctgggggagg ggg 23 <210> 670 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 670 ggcactgggg ttggaggtgg ggg 23 <210> 671 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 671 Lys Arg Leu Ala Val Tyr Gln 1 5 <210> 672 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 672 Arg Ala Met Ala Ile Cys Lys 1 5 <210> 673 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 673 tcagggtgag catagactgc cgg 23 <210> 674 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 674 gaatcgggag gggagactgc ggg 23 <210> 675 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 675 tgaagtgttg catagactgc agg 23 <210> 676 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 676 ggagagagag catagactgc tgg 23 <210> 677 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 677 ccaaacaaaa catagactgc tgg 23 <210> 678 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 678 caggaagctg gagcacgtga ggg 23 <210> 679 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 679 aaggctgagg gagcacgtga agg 23 <210> 680 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 680 gtcaggggaa gagcacgtga cgg 23 <210> 681 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 681 gttgtgaact gagcacgtga ggg 23 <210> 682 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 682 atatttgctg gagcacgtga agg 23 <210> 683 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 683 gtggctggag gtggaggtgg ggg 23 <210> 684 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 684 gagggaaggg ctggaggtgg agg 23 <210> 685 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 685 cacctgcgca agctgcgtaa gcggc 25 <210> 686 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 686 tcctccgcga tgccgatgac ctgca 25 <210> 687 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 687 aggccggggc ccgcgagggc gccga 25 <210> 688 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 688 gcgcggcctc agcgccatcc gcgag 25 <210> 689 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 689 cctgtgcagc tgtgggttga ttcca 25 <210> 690 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 690 cacccccgcc cggcacccgc gtccg 25 <210> 691 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 691 agtcacagca catgacggag gttgt 25 <210> 692 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 692 gaggcgctgc ccccaccatg agcgc 25 <210> 693 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 693 tgccatcacg tgctcaatcg gggcccca 28 <210> 694 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 694 cgccccgcag tctatgcttt gtgttccag 29 <210> 695 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 695 cccgcagtct atgctttgtg ttc 23 <210> 696 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 696 ctcccatcac atcaaccggt 20 <210> 697 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 697 tttcctcccc cccacaggta gaacat 26 <210> 698 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 698 tttccctctg tccacaccct catcctg 27 <210> 699 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 699 tttccccagt cctccacacc ctgaaac 27 <210> 700 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 700 tgcccctccc tccctggccc 20 <210> 701 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 701 agagcccccc ctcaaagaga 20 <210> 702 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 702 ggcccagact gagcacgtga tgg 23 <210> 703 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 703 gagtccgagc agaagaagaa ggg 23 <210> 704 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 704 gaacacaaag catagactgc ggg 23 <210> 705 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 705 gagtccgagc agaagaagaa g 21 <210> 706 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 706 ggaatccctt ctgcagcacc tgg 23 <210> 707 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 707 ggcccagact gagcacgtga 20 <210> 708 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 708 ggcactgcgg ctggaggtgg ggg 23 <210> 709 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 709 gtcaggtcga gggttctgtc 20 <210> 710 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 710 gggccgcagt atcctcactc 20 <210> 711 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 711 ccgccagtcc cagtacggga 20 <210> 712 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 712 caaccactgc tcaaagatgc 20 <210> 713 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 713 cttccaggat gagaacacag 20 <210> 714 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 714 Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Glu 1 5 <210> 715 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 715 tgcccctccc tccctggccc agg 23 <210> 716 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 716 ttttcctccc ccccacaggt aga 23 <210> 717 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 717 gccccccctc aaagagaggg tgg 23 <210> 718 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 718 agagcccccc ctcaaagaga ggg 23 <210> 719 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 719 ggcccagact gagcacgtga tgg 23 <210> 720 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 720 gaacacaaag catagactgc ggg 23 <210> 721 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 721 gagtccgagc agaagaagaa ggg 23 <210> 722 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 722 ggaatccctt ctgcagcacc tgg 23 <210> 723 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is a, c, g, or t <400> 723 nnnntctctc tctctctctc tctcngg 27 <210> 724 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 724 gcggatgttc caatcagtac gca 23 <210> 725 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 725 cgagcttctg gcggtctcaa gca 23 <210> 726 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 726 tgcttctcca gccctggcct gg 22 <210> 727 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 727 agactgagca cgtgatggca gag 23 <210> 728 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 728 gatgttccaa tcagtacgca gagagt 26 <210> 729 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 729 cttctccagc cctggcctgg gtcaat 26 <210> 730 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 730 gccgtctcca aggtgaaagc ggaa 24 <210> 731 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 731 gtcgccgtct ccaaggtgaa agcg 24 <210> 732 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 732 ggtgcatttt caggaggaag cgat 24 <210> 733 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 733 gccgtctcca aggtgaaagc ggaa 24 <210> 734 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 734 gccgtctcca aggtgaaagc ggaagt 26 <210> 735 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 735 ggcactgcgg ctggaggtgg ggg 23 <210> 736 <211> 83 <212> PRT <213> Bacillus phage PBS2 <400> 736 Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu Val 1 5 10 15 Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val Ile 20 25 30 Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp Glu 35 40 45 Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu Tyr 50 55 60 Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Lys Met Leu <210> 737 <211> 228 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 737 Ser Ser Glu Thr Gly Pro Val Ala Val Asp Pro Thr Leu Arg Arg Arg 1 5 10 15 Ile Glu Pro His Glu Phe Glu Val Phe Phe Asp Pro Arg Glu Leu Arg 20 25 30 Lys Glu Thr Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Asn Trp Gly Gly Arg His Ser 35 40 45 Ile Trp Arg His Thr Ser Gln Asn Thr Asn Lys His Val Glu Val Asn 50 55 60 Phe Ile Glu Lys Phe Thr Thr Glu Arg Tyr Phe Cys Pro Asn Thr Arg 65 70 75 80 Cys Ser Ile Thr Trp Phe Leu Ser Trp Ser Pro Cys Gly Glu Cys Ser 85 90 95 Arg Ala Ile Thr Glu Phe Leu Ser Arg Tyr Pro His Val Thr Leu Phe 100 105 110 Ile Tyr Ile Ala Arg Leu Tyr His His Ala Asp Pro Arg Asn Arg Gln 115 120 125 Gly Leu Arg Asp Leu Ile Ser Ser Gly Val Thr Ile Gln Ile Met Thr 130 135 140 Glu Gln Glu Ser Gly Tyr Cys Trp Arg Asn Phe Val Asn Tyr Ser Pro 145 150 155 160 Ser Asn Glu Ala His Trp Pro Arg Tyr Pro His Leu Trp Val Arg Leu 165 170 175 Tyr Val Leu Glu Leu Tyr Cys Ile Ile Leu Gly Leu Pro Pro Cys Leu 180 185 190 Asn Ile Leu Arg Arg Lys Gln Pro Gln Leu Thr Phe Phe Thr Ile Ala 195 200 205 Leu Gln Ser Cys His Tyr Gln Arg Leu Pro Pro His Ile Leu Trp Ala 210 215 220 Thr Gly Leu Lys 225 <210> 738 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 738 tttgtacttt gtcctccggt tctg 24 <210> 739 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 739 tttccagccc gctggccctg taaa 24 <210> 740 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 740 Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Pro Lys Lys Lys Arg Lys 1 5 10 15 Val <210> 741 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 741 gtaatttcta ctaagtgtag at 22 <210> 742 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 742 tactttgtcc tccggttctg gaa 23 <210> 743 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 743 tactttgtcc tccggttctg 20 <210> 744 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 744 tactttgtcc tccggttct 19 <210> 745 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 745 tactttgtcc tccggttc 18 <210> 746 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 746 tactttgtcc tccggtt 17 <210> 747 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 747 cagcccgctg gccctgtaaa gga 23 <210> 748 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 748 cagcccgctg gccctgtaaa 20 <210> 749 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 749 cagcccgctg gccctgtaa 19 <210> 750 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 750 cagcccgctg gccctgta 18 <210> 751 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 751 cagcccgctg gccctgt 17

Claims (207)

  1. (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp); (ii) 시티딘 데아미나제 도메인; 및 (iii) 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인을 포함하며, 여기서 napDNAbp는 CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3 또는 아르고노트 단백질인 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 2, 3, 4 또는 5개의 UGI 도메인을 포함하는 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)이 CasX 단백질인 융합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, CasX 단백질이
    (i) 서열식별번호: 29 또는 30과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열; 또는
    (ii) 서열식별번호: 29 또는 30의 아미노산 서열
    을 포함하는 것인 융합 단백질.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)이 CasY 단백질인 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, CasY 단백질이 서열식별번호: 31과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, CasY 단백질이 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)이 Cpf1 또는 Cpf1 돌연변이체 단백질인 융합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, Cpf1 또는 Cpf1 돌연변이체 단백질이 서열식별번호: 9-16 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, Cpf1 또는 Cpf1 돌연변이체 단백질이 서열식별번호: 9-16 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)이 C2c1 단백질인 융합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, C2c1 단백질이 서열식별번호: 26과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, C2c1 단백질이 서열식별번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)이 C2c2 단백질인 융합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, C2c2 단백질이 서열식별번호: 27과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, C2c2 단백질이 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)이 C2c3 단백질인 융합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, C2c3 단백질이 서열식별번호: 28과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, C2c3 단백질이 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)이 아르고노트 단백질인 융합 단백질.
  21. 제20항에 있어서, 아르고노트 단백질이 서열식별번호: 25와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 아르고노트 단백질이 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 시티딘 데아미나제 도메인이 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 패밀리 데아미나제로부터의 데아미나제인 융합 단백질.
  24. 제23항에 있어서, APOBEC 패밀리 데아미나제가 APOBEC1 데아미나제, APOBEC2 데아미나제, APOBEC3A 데아미나제, APOBEC3B 데아미나제, APOBEC3C 데아미나제, APOBEC3D 데아미나제, APOBEC3F 데아미나제, APOBEC3G 데아미나제 및 APOBEC3H 데아미나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 융합 단백질.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 시티딘 데아미나제 도메인이 서열식별번호: 49-84의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 시티딘 데아미나제 도메인이 서열식별번호: 49-84의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  27. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 시티딘 데아미나제 도메인이 서열식별번호: 76의 W90Y, R126E, 및 R132E로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 래트 APOBEC1 (rAPOBEC1) 데아미나제인 융합 단백질.
  28. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 시티딘 데아미나제 도메인이 서열식별번호: 74의 W90Y, Q126E, 및 R132E로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 인간 APOBEC1 (hAPOBEC1) 데아미나제인 융합 단백질.
  29. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 시티딘 데아미나제 도메인이 서열식별번호: 60의 W285Y, R320E, 및 R326E로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 돌연변이, 또는 또 다른 APOBEC 데아미나제에서의 1개 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하는 인간 APOBEC3G (hAPOBEC3G) 데아미나제인 융합 단백질.
  30. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 시티딘 데아미나제 도메인이 활성화-유도된 데아미나제 (AID)인 융합 단백질.
  31. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 시티딘 데아미나제 도메인이 페트로미존 마리누스(Petromyzon marinus)로부터의 시티딘 데아미나제 1 (pmCDA1)인 융합 단백질.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, UGI 도메인이 UDG 활성을 억제할 수 있는 도메인을 포함하는 것인 융합 단백질.
    [청구항 32]
    제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, UGI 도메인이 서열식별번호: 134와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  33. 제132항에 있어서, UGI 도메인이 서열식별번호: 134에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구조:
    NH2-[시티딘 데아미나제 도메인]-[napDNAbp]-[UGI 도메인]-COOH;
    NH2-[시티딘 데아미나제 도메인]-[napDNAbp]-[UGI]-[UGI]-COOH;
    NH2-[시티딘 데아미나제 도메인]-[napDNAbp]-[UGI]-COOH;
    NH2-[UGI]-[Apobec]-[napDNAbp]-COOH;
    NH2-[시티딘 데아미나제 도메인]-[UGI]-[napDNAbp]-COOH;
    NH2-[napDNAbp]-[UGI]-[시티딘 데아미나제 도메인]-COOH; 또는
    NH2-[napDNAbp]-[시티딘 데아미나제 도메인]-[UGI]-COOH
    를 포함하며;
    여기서 각 경우의 "-"는 임의적인 링커를 포함하는 것인
    융합 단백질.
  35. 제34항에 있어서, (ii)의 시티딘 데아미나제 도메인 및 (i)의 napDNAbp 도메인이 아미노산 서열 (GGGS)n (서열식별번호: 613), (GGGGS)n (서열식별번호: 607), (G)n (서열식별번호: 608), (EAAAK)n (서열식별번호: 609), (GGS)n (서열식별번호: 610), (SGGS)n (서열식별번호: 606), SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604), 또는 (XP)n (서열식별번호: 611) 모티프, 또는 그의 조합을 포함하는 링커를 통해 연결되며, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 30의 정수 (양끝값 포함)이고, X는 임의의 아미노산인 융합 단백질.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, (ii)의 시티딘 데아미나제 도메인 및 (i)의 napDNAbp가 아미노산 서열: SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604)를 포함하는 링커를 통해 연결된 것인 융합 단백질.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 핵 국재화 서열 (NLS)을 추가로 포함하는 융합 단백질.
  38. 제37항에 있어서, NLS가 아미노산 서열 PKKKRKV (서열식별번호: 614), MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC (서열식별번호: 615) 또는 KRTADGSEFEPKKKRKV (서열식별번호: 740)를 포함하는 것인 융합 단백질.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 융합 단백질이 하기 구조:
    NH2-[시티딘 데아미나제 도메인]-[napDNAbp]-[UGI 도메인]-[NLS]-COOH
    를 포함하며, 여기서 각 경우의 "-"는 임의적인 링커를 포함하는 것인
    융합 단백질
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, UGI 도메인 및 NLS가 아미노산 서열: SGGS (서열식별번호: 606)를 포함하는 링커를 통해 연결되거나, 또는 napDNAbp 및 UGI 도메인이 아미노산 서열: SGGS (서열식별번호: 606)를 포함하는 링커를 통해 연결된 것인 융합 단백질.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질 및 융합 단백질의 napDNAbp에 결합된 가이드 RNA를 포함하는 복합체.
  42. 핵산 분자를 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질 및 가이드 RNA와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 가이드 RNA는 유기체의 게놈에서의 표적 서열에 상보적인 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드의 서열을 포함하고, 표적 염기 쌍을 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 표적 염기 쌍이 질환 또는 장애와 연관된 T에서 C로의 점 돌연변이를 포함하고, 돌연변이체 C 염기의 탈아미노화가 질환 또는 장애와 연관되지 않은 서열을 발생시키는 것인 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 접촉이 염기 편집시 20% 미만의 indel 형성을 발생시키는 것인 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉이 염기 편집시 적어도 2:1의 의도된 대 비의도된 생성물을 발생시키는 것인 방법.
  46. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 및 napDNAbp에 결합된 RNA를 포함하는 복합체.
  47. 제46항에 있어서, RNA가 가이드 RNA (gRNA)인 복합체.
  48. 제46항에 있어서, RNA가 비-코딩 RNA이고/거나, RNA가 서열식별번호: 741의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열식별번호: 741의 각각의 T는 우라실 (U)인 복합체.
  49. 제46항에 있어서, RNA가 마이크로RNA (miRNA)인 복합체.
  50. 제46항에 있어서, RNA가 소형 간섭 RNA (siRNA)인 복합체.
  51. 제46항에 있어서, RNA가 Piwi-상호작용 RNA (piRNA)인 복합체.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, RNA가 10-100개 뉴클레오티드 길이이고, 표적 서열에 상보적인 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 것인 복합체.
  53. 제52항에 있어서, RNA가 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 뉴클레오티드 길이인 복합체.
  54. 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, RNA가 표적 서열에 상보적인 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 인접 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 것인 복합체.
  55. 제46항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 서열이 DNA 서열인 복합체.
  56. 제46항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 서열이 RNA 서열인 복합체.
  57. 제55항에 있어서, 표적 서열이 유기체의 게놈 내에 있는 것인 복합체.
  58. 제56항에 있어서, 표적 서열이 유기체의 게놈으로부터 전사되는 것인 복합체.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 유기체가 원핵생물인 복합체.
  60. 제59항에 있어서, 원핵생물이 박테리아인 복합체.
  61. 제57항 또는 제58항에 있어서, 유기체가 진핵생물인 복합체.
  62. 제61항에 있어서, 유기체가 식물인 복합체.
  63. 제61항에 있어서, 유기체가 척추동물인 복합체.
  64. 제63항에 있어서, 척추동물이 포유동물인 복합체.
  65. 제64항에 있어서, 포유동물이 마우스 또는 래트인 복합체.
  66. 제64항에 있어서, 포유동물이 인간인 복합체.
  67. 핵산 분자를 제46항 내지 제66항 중 어느 한 항의 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 핵산이 DNA인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 핵산이 이중-가닥 DNA인 방법.
  70. 제67항에 있어서, 핵산이 RNA인 방법.
  71. 제70항에 있어서, RNA가 mRNA인 방법.
  72. 제67항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 질환 또는 장애와 연관된 표적 서열을 포함하는 것인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 표적 서열이 질환 또는 장애와 연관된 점 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 융합 단백질 또는 복합체의 활성이 점 돌연변이의 교정을 발생시키는 것인 방법.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 표적 서열이 질환 또는 장애와 연관된 T에서 C로의 점 돌연변이를 포함하고, 돌연변이체 C 염기의 탈아미노화는 질환 또는 장애와 연관되지 않은 서열을 발생시키는 것인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 표적 서열이 단백질을 코딩하고, 점 돌연변이가 코돈 내에 있고, 야생형 코돈과 비교하여 돌연변이체 코돈에 의해 코딩된 아미노산의 변화를 발생시키는 것인 방법.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 돌연변이체 C의 탈아미노화가 돌연변이체 코돈에 의해 코딩된 아미노산의 변화를 발생시키는 것인 방법.
  78. 제75항 또는 제76항에 있어서, 돌연변이체 C의 탈아미노화가 야생형 아미노산을 코딩하는 코돈을 발생시키는 것인 방법.
  79. 제67항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉을 대상체의 생체내에서 수행하는 것인 방법.
  80. 제67항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉이 시험관내에서 수행하는 것인 방법.
  81. 제79항에 있어서, 대상체가 질환 또는 장애로 진단된 것인 방법.
  82. 제72항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애가 낭성 섬유증, 페닐케톤뇨, 표피박리성 과다각화증 (EHK), 샤르코-마리-투스병 유형 4J, 신경모세포종 (NB), 폰 빌레브란트병 (vWD), 선천성 근긴장증, 유전성 신장 아밀로이드증, 확장성 심근병증 (DCM), 유전성 림프부종, 가족성 알츠하이머병, HIV, 프리온 질환, 만성 영아 신경학적 피부 관절 증후군 (CINCA), 데스민-관련 근병증 (DRM), 돌연변이체 PI3KCA 단백질, 돌연변이체 CTNNB1 단백질, 돌연변이체 HRAS 단백질, 또는 돌연변이체 p53 단백질과 연관된 신생물성 질환인 방법.
  83. (a) 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열; 및
    (b) (a)의 서열의 발현을 유도하는 이종 프로모터
    를 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 키트.
  84. 제83항에 있어서, 가이드 RNA 백본을 코딩하는 발현 구축물을 추가로 포함하며, 여기서 구축물은 표적 서열과 동일하거나 그에 상보적인 핵산 서열의 가이드 RNA 백본 내로의 클로닝을 허용하도록 위치된 클로닝 부위를 포함하는 것인 키트.
  85. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  86. 제85항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  87. 제86항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 이종 프로모터를 포함하는 벡터.
  88. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 세포.
  89. 제46항 내지 제66항 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 세포.
  90. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 세포.
  91. (i) 수용액에서 염기 편집제 단백질을 RNA와 복합체화함으로써 수용액에서 염기 편집제 및 RNA를 포함하는 복합체를 형성하는 단계; 및
    (ii) (i)의 복합체를 양이온성 지질과 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 생산하는 방법.
  92. 제91항에 있어서, (i)의 염기 편집제 단백질 및 RNA를 1:1 내지 1:1.5의 몰비로 복합체화하는 것인 방법.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, (i)의 염기 편집제 단백질 및 RNA를 1:1.05 내지 1:1.2의 몰비로 복합체화하는 것인 방법.
  94. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, (i)의 염기 편집제 단백질 및 RNA를 약 1:1.1의 몰비로 복합체화하는 것인 방법.
  95. 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, (i)의 염기 편집제 단백질 및 RNA를 1:1.1의 몰비로 복합체화하는 것인 방법.
  96. 제91항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 염기 편집제 단백질이 10 μM 내지 100 μM의 농도로 수용액에 존재하는 것인 방법.
  97. 제91항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 염기 편집제 단백질이 20 μM 내지 50 μM의 농도로 수용액에 존재하는 것인 방법.
  98. 제91항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 염기 편집제 단백질이 30 μM 내지 40 μM의 농도로 수용액에 존재하는 것인 방법.
  99. 제91항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 염기 편집제 단백질이 11 μM 내지 110 μM의 농도로 수용액에 존재하는 것인 방법.
  100. 제91항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 염기 편집제 단백질이 22 μM 내지 55 μM의 농도로 수용액에 존재하는 것인 방법.
  101. 제91항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 염기 편집제 단백질이 33 μM 내지 44 μM의 농도로 수용액에 존재하는 것인 방법.
  102. 제91항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, RNA가 sgRNA인 방법.
  103. 제91항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, (i)의 수용액에서의 복합체를 1:2 내지 2:1의 부피비로 (ii)의 양이온성 지질과 접촉시키는 것인 방법.
  104. 제91항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, (i)의 수용액에서의 복합체를 1:1.5 내지 1.5:1의 부피비로 (ii)의 양이온성 지질과 접촉시키는 것인 방법.
  105. 제91항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, (i)의 수용액에서의 복합체를 1:1.2 내지 1.2:1의 부피비로 (ii)의 양이온성 지질과 접촉시키는 것인 방법.
  106. 제91항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, (i)의 수용액에서의 복합체를 1:1.1 내지 1.1:1의 부피비로 (ii)의 양이온성 지질과 접촉시키는 것인 방법.
  107. 제91항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, (i)의 수용액에서의 복합체를 약 1:1의 부피비로 (ii)의 양이온성 지질과 접촉시키는 것인 방법.
  108. 제91항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, (i)의 수용액에서의 복합체를 1:1의 부피비로 (ii)의 양이온성 지질과 접촉시키는 것인 방법.
  109. 제91항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 지질이 리포펙타민®인 방법.
  110. 제109항에 있어서, 리포펙타민®이 리포펙타민® 2000, 리포펙타민®3000, 리포펙타민® 메신저MAX, 리포펙타민® LTX 및 리포펙타민®RNAiMAX로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  111. 제91항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 염기 편집제가 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질인 방법.
  112. 제91항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, (i)의 복합체가 제46항 내지 제66항 중 어느 한 항의 복합체인 방법.
  113. 제91항 내지 제112항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산되는 제약 조성물.
  114. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물.
  115. 제41항의 복합체를 포함하는 제약 조성물.
  116. 제46항 내지 제66항 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 제약 조성물.
  117. 제113항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  118. (i) 세포에서 염기 편집제 단백질을 발현시키는 단계이며, 여기서 염기 편집제 단백질은 친화성 태그를 포함하는 것인 단계;
    (ii) (i)의 세포를 용해시킴으로써 용해물을 생성하는 단계; 및
    (iii) 용해물을 친화성 크로마토그래피에 적용함으로써 정제된 염기 편집제 단백질을 포함하는 용리액을 생산하는 단계
    를 포함하는, 염기 편집제 단백질을 정제하는 방법.
  119. 제118항에 있어서, 세포가 박테리아 세포인 방법.
  120. 제119항에 있어서, 박테리아 세포가 이. 콜라이(E. coli) 세포인 방법.
  121. 제120항에 있어서, 이. 콜라이 세포가 BL21 DE3 적격 세포인 방법.
  122. 제118항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 태그가 폴리히스티딘 태그인 방법.
  123. 제118항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)이 (ii)의 용해물을 니켈-NTA 수지와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 염기 편집제 단백질은 니켈-NTA 수지에 결합된 것인 방법.
  124. 제123항에 있어서,
    (iv) 니켈-NTA 수지로부터 염기 편집제 단백질을 용리시킴으로써 염기 편집제 단백질을 포함하는 용리액을 생성하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  125. 제118항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 염기 편집제 단백질을 포함하는 용리액을 양이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 것인 방법.
  126. 제125항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피가 염기 편집제 단백질을 포함하는 용리액을 양이온 교환 칼럼과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  127. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제41항의 복합체, 제46항 내지 제66항 중 어느 한 항의 복합체 또는 제113항 내지 제117항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 대상체의 내이로 전달하는 단계를 포함하는 방법.
  128. 제127항에 있어서, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제41항의 복합체, 제46항 내지 제66항 중 어느 한 항의 복합체 또는 제113항 내지 제117항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 대상체의 와우로 전달하는 단계를 포함하는 방법.
  129. 제127항 또는 제128항에 있어서, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제41항의 복합체, 제46항 내지 제66항 중 어느 한 항의 복합체 또는 제113항 내지 제117항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 대상체의 내이에 주사하는 것인 방법.
  130. 제127항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제41항의 복합체, 제46항 내지 제66항 중 어느 한 항의 복합체 또는 제113항 내지 제117항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 대상체의 와우에 주사하는 것인 방법.
  131. 제127항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 귀에 이후부절개를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  132. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제41항의 복합체, 제46항 내지 제66항 중 어느 한 항의 복합체 또는 제113항 내지 제117항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 제브라피쉬 배아로 전달하는 단계를 포함하는 방법.
  133. 제132항에 있어서, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제41항의 복합체, 제46항 내지 제66항 중 어느 한 항의 복합체 또는 제113항 내지 제117항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 1-세포 단계에서 제브라피쉬 배아에 주사하는 것인 방법.
  134. 제132항 또는 제133항에 있어서, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제41항의 복합체, 제46항 내지 제66항 중 어느 한 항의 복합체 또는 제113항 내지 제117항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 2-세포, 4-세포, 8-세포 또는 16-세포 단계에서 제브라피쉬 배아에 주사하는 것인 방법.
  135. 제132항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA와 복합체화된 염기 편집제 단백질의 0.5 nmol 내지 50 nmol을 제브라피쉬 배아에 주사하는 것인 방법.
  136. 제132항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA와 복합체화된 염기 편집제 단백질의 2 nmol 내지 30 nmol을 제브라피쉬 배아에 주사하는 것인 방법.
  137. (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp); (ii) 시티딘 데아미나제 도메인; (iii) 제1 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인; 및 (iv) 제2 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인을 포함하는 융합 단백질.
  138. 제137항에 있어서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)이 CasX, CasY, Cpf1, Cpf1 니카제, dCpf1, C2c1, C2c2, C2c3, Cas9, dCas9, Cas9 니카제 또는 아르고노트 단백질인 융합 단백질.
  139. 제138항에 있어서, dCas9 단백질이 서열식별번호: 6 또는 7과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  140. 제137항 또는 제138항에 있어서, dCas9 단백질이 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  141. 제138항에 있어서, dCas9 단백질이 뉴클레아제 불활성 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9 (SaCas9d) 단백질인 융합 단백질.
  142. 제141항에 있어서, SaCas9d 단백질이 서열식별번호: 33-36과 적어도 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  143. 제141항 또는 제142항에 있어서, SaCas9d 단백질이 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  144. 제137항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 시티딘 데아미나제 도메인이 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 패밀리 데아미나제로부터의 데아미나제인 융합 단백질.
  145. 제144항에 있어서, APOBEC 패밀리 데아미나제가 APOBEC1 데아미나제, APOBEC2 데아미나제, APOBEC3A 데아미나제, APOBEC3B 데아미나제, APOBEC3C 데아미나제, APOBEC3D 데아미나제, APOBEC3F 데아미나제, APOBEC3G 데아미나제 및 APOBEC3H 데아미나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 융합 단백질.
  146. 제137항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 시티딘 데아미나제 도메인이 서열식별번호: 49-84의 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  147. 제137항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 시티딘 데아미나제 도메인이 서열식별번호: 49-84의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  148. 제137항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 시티딘 데아미나제 도메인이 활성화-유도된 데아미나제 (AID)인 융합 단백질.
  149. 제137항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 시티딘 데아미나제 도메인이 시티딘 데아미나제 1 (CDA1)인 융합 단백질.
  150. 제137항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, UGI 도메인이 UDG 활성을 억제할 수 있는 도메인을 포함하는 것인 융합 단백질.
  151. 제137항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, UGI 도메인이 서열식별번호: 134와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  152. 제137항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, UGI 도메인이 서열식별번호: 134에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  153. 제137항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구조:
    NH2-[시티딘 데아미나제 도메인]-[napDNAbp]-[제1 UGI 도메인]-[제2 UGI 도메인]-COOH;
    NH2-[제1 UGI 도메인]-[제2 UGI 도메인]-[시티딘 데아미나제 도메인]-[napDNAbp]-COOH;
    NH2-[napDNAbp]-[시티딘 데아미나제 도메인]-[제1 UGI 도메인]-[제2 UGI 도메인]-COOH; 또는
    NH2-[제1 UGI 도메인]-[제2 UGI 도메인]-[napDNAbp]-[시티딘 데아미나제 도메인]-COOH
    를 포함하며;
    여기서 각 경우의 "-"는 임의적인 링커를 포함하는 것인
    융합 단백질.
  154. 제153항에 있어서, 시티딘 데아미나제 도메인 및 napDNAbp 도메인이 아미노산 서열 (GGGS)n (서열식별번호: 613), (GGGGS)n (서열식별번호: 607), (G)n (서열식별번호: 608), (EAAAK)n (서열식별번호: 609), (GGS)n (서열식별번호: 610), (SGGS)n (서열식별번호: 606), SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 604), SGGS(GGS)n (서열식별번호: 612), SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 605), 또는 (XP)n (서열식별번호: 611) 모티프, 또는 그의 조합을 포함하는 링커를 통해 연결되며, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 30의 정수 (양끝값 포함)이고, X는 임의의 아미노산인 융합 단백질.
  155. 제137항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 시티딘 데아미나제 도메인 및 napDNAbp가 아미노산 서열: SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 605)를 포함하는 링커를 통해 연결된 것인 융합 단백질.
  156. 제137항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, napDNAbp 및 제1 UGI 도메인이 아미노산 서열: SGGS(GGS)n (서열식별번호: 612)을 포함하는 링커를 통해 연결되며, 여기서 n은 2인 융합 단백질.
  157. 제137항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 UGI 도메인 및 제2 UGI 도메인이 아미노산 서열: SGGS(GGS)n (서열식별번호: 612)을 포함하는 링커를 통해 연결되며, 여기서 n은 2인 융합 단백질.
  158. 제137항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 핵 국재화 서열 (NLS)을 추가로 포함하는 융합 단백질.
  159. 제158항에 있어서, NLS가 아미노산 서열 PKKKRKV (서열식별번호: 614) 또는 KRTADGSEFEPKKKRKV (서열식별번호: 740)를 포함하는 것인 융합 단백질.
  160. 제158항 또는 제159항에 있어서, 하기 구조:
    [NH2]-[시티딘 데아미나제 도메인]-[napDNAbp]-[제1 UGI 도메인]-[제2 UGI 도메인]-[NLS]-[COOH]
    를 포함하고, 각 경우의 "-"는 임의적인 링커를 포함하는 것인
    융합 단백질.
  161. 제158항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구조:
    [시티딘 데아미나제 도메인]-[dCas9]-[제1 UGI 도메인]-[제2 UGI 도메인]-[NLS]
    를 포함하고, 각 경우의 "-"는 임의적인 링커를 포함하는 것인
    융합 단백질.
  162. 제160항 또는 제161항에 있어서, 제2 UGI 도메인 및 NLS가 아미노산 서열: SGGS (서열식별번호: 606)를 포함하는 링커를 통해 연결된 것인 융합 단백질.
  163. 제137항 내지 제162항 중 어느 한 항의 융합 단백질 및 융합 단백질의 napDNAbp에 결합된 가이드 RNA를 포함하는 복합체.
  164. 핵산 분자를 제137항 내지 제162항 중 어느 한 항의 융합 단백질 및 가이드 RNA와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 가이드 RNA는 유기체의 게놈에서의 표적 서열에 상보적인 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드의 서열을 포함하고, 표적 염기 쌍을 포함하는 것인 방법.
  165. 제164항에 있어서, 표적 염기 쌍이 질환 또는 장애와 연관된 T에서 C로의 점 돌연변이를 포함하고, 돌연변이체 C 염기의 탈아미노화가 질환 또는 장애와 연관되지 않은 서열을 발생시키는 것인 방법.
  166. 제164항 또는 제165항에 있어서, 접촉이 염기 편집 시 20% 미만의 indel 형성을 발생시키는 것인 방법.
  167. 제164항 또는 제165항에 있어서, 표적 서열이 질환 또는 장애와 연관된 점 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  168. 제164항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질 또는 복합체의 활성이 점 돌연변이의 교정을 발생시키는 것인 방법.
  169. 제164항 또는 제165항에 있어서, 표적 서열이 질환 또는 장애와 연관된 T에서 C로의 점 돌연변이를 포함하고, 돌연변이체 C 염기의 탈아미노화가 질환 또는 장애와 연관되지 않은 서열을 발생시키는 것인 방법.
  170. 제169항에 있어서, 표적 서열이 단백질을 코딩하고, 점 돌연변이가 코돈 내에 있고, 야생형 코돈과 비교하여 돌연변이체 코돈에 의해 코딩된 아미노산의 변화를 발생시키는 것인 방법.
  171. 제169항 또는 제170항에 있어서, 돌연변이체 C의 탈아미노화가 돌연변이체 코돈에 의해 코딩된 아미노산의 변화를 발생시키는 것인 방법.
  172. 제169항 또는 제170항에 있어서, 돌연변이체 C의 탈아미노화가 야생형 아미노산을 코딩하는 코돈을 발생시키는 것인 방법.
  173. 제164항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉을 대상체의 생체내에서 수행하는 것인 방법.
  174. 제164항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉을 시험관내에서 수행하는 것인 방법.
  175. 제173항에 있어서, 대상체가 질환 또는 장애로 진단된 것인 방법.
  176. 이중-가닥 DNA 서열의 표적 영역을 핵염기 편집제 및 가이드 핵산을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계이며, 여기서 표적 영역은 표적 핵염기 쌍을 포함하는 것인 단계;
    상기 표적 영역의 가닥 분리를 유도하는 단계;
    표적 영역의 단일 가닥에서의 상기 표적 핵염기 쌍의 제1 핵염기를 제2 핵염기로 전환시키는 단계; 및
    상기 표적 영역의 1개 이하의 가닥을 절단하는 단계
    를 포함하는, 이중-가닥 DNA 서열의 핵염기 쌍을 편집하는 방법이며;
    여기서 제1 핵염기 염기에 상보적인 제3 핵염기는 제2 핵염기에 상보적인 제4 핵염기에 의해 대체되고;
    여기서 방법은 이중-가닥 DNA 서열에서 20% 미만의 indel 형성을 유발하고;
    여기서 핵염기 편집제는 CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3 또는 아르고노트를 포함하는 것인 방법.
  177. 제176항에 있어서, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 indel 형성을 유발하는 방법.
  178. 제176항에 있어서, 제2 핵염기를 제4 핵염기에 상보적인 제5 핵염기로 대체함으로써 의도된 편집된 염기 쌍을 생성하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  179. 제178항에 있어서, 의도된 편집된 염기 쌍을 생성하는 효율이 적어도 5%인 방법.
  180. 제179항에 있어서, 효율이 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%인 방법.
  181. 제178항에 있어서, 의도된 편집된 염기 쌍 대 비의도된 편집된 염기 쌍의 비가 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1 또는 8:1인 방법.
  182. 제178항에 있어서, 의도된 편집된 염기 쌍 대 indel 형성의 비가 2:1 내지 1000:1인 방법.
  183. 제176항에 있어서, 절단된 단일 가닥이 가이드 핵산에 혼성화되는 것인 방법.
  184. 제176항에 있어서, 절단된 단일 가닥이 제1 핵염기를 포함하는 가닥에 대향하는 것인 방법.
  185. 제176항에 있어서, 상기 제1 염기가 시토신인 방법.
  186. 제176항에 있어서, 제2 핵염기가 비-표준 핵염기인 방법.
  187. 제176항에 있어서, 제2 핵염기가 G, C, A 또는 T 이외의 것인 방법.
  188. 제176항에 있어서, 상기 제2 염기가 우라실인 방법.
  189. 제176항에 있어서, 핵염기 편집제가 UGI 활성을 포함하는 것인 방법.
  190. 제176항에 있어서, 핵염기 편집제가 UGI 도메인을 포함하는 것인 방법.
  191. 제176항에 있어서, 핵염기 편집제가 2개의 UGI 도메인을 포함하는 것인 방법.
  192. 제176항에 있어서, 핵염기 편집제가 니카제 활성을 포함하는 것인 방법.
  193. 제178항에 있어서, 의도된 편집된 염기 쌍이 PAM 부위의 상류에 있는 것인 방법.
  194. 제193항에 있어서, 의도된 편집된 염기 쌍이 PAM 부위의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드 상류에 있는 것인 방법.
  195. 제178항에 있어서, 의도된 편집된 염기 쌍이 PAM 부위의 하류에 있는 것인 방법.
  196. 제195항에 있어서, 의도된 편집된 염기 쌍이 PAM 부위의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드 하류에 있는 것인 방법.
  197. 제176항에 있어서, 정규 PAM 부위를 필요로 하지 않는 방법.
  198. 제176항에 있어서, 핵염기 편집제가 링커를 포함하는 것인 방법.
  199. 제198항에 있어서, 링커가 1-25개 아미노산 길이인 방법.
  200. 제198항에 있어서, 링커가 5-20개 아미노산 길이인 방법.
  201. 제198항에 있어서, 링커가 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산 길이인 방법.
  202. 제178항에 있어서, 표적 영역이 표적 윈도우를 포함하며, 여기서 표적 윈도우는 표적 핵염기 쌍을 포함하는 것인 방법.
  203. 제202항에 있어서, 표적 윈도우가 1-10개 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  204. 제202항에 있어서, 표적 윈도우가 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 또는 1개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  205. 제202항에 있어서, 표적 윈도우가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  206. 제202항 내지 제205항 중 어느 한 항에 있어서, 의도된 편집된 염기 쌍이 표적 윈도우 내에서 발생하는 것인 방법.
  207. 제202항 내지 제206항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 윈도우가 의도된 편집된 염기 쌍을 포함하는 것인 방법.
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