KR20180069832A - 유도 cas 시스템을 통한 비기능성 유전자 산물에 대한 기능 회복 및 이용 방법 - Google Patents

유도 cas 시스템을 통한 비기능성 유전자 산물에 대한 기능 회복 및 이용 방법 Download PDF

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앤드류 마크 시간
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파이어니어 하이 부렛드 인터내쇼날 인코포레이팃드
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Abstract

세포의 게놈 내 비기능성 유전자 산물에 대한 기능을 복원하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 상기 방법 및 조성물은 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 시스템을 이용하여 비기능성 유전자 산물에 대한 기능을 복원하고, 식물, 식물 세포 또는 종자의 게놈 내 표적 부위를 변형하거나 변경하기 위한 효과적인 시스템을 제공한다. 본 발명은 또한, 복원된 기능성 선택 마커를 이용하여 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법뿐만 아니라, 세포에 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 도입하지 않고 상기 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 편집하는 방법을 기술한다. Cas 엔도뉴클레아제, sgRNA 및 가이드 RNA/Cas 복합체를 DNA 없이 전달하기 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다.

Description

유도 CAS 시스템을 통한 비기능성 유전자 산물에 대한 기능 회복 및 이용 방법
본 출원은 2015년 10월 20일 출원된 미국 가출원 62/243719호, 2016년 3월 16일 출원된 미국 가출원 62/309033호 및 2016년 7월 7일 출원된 미국 가출원 62/359254호의 이익을 주장하며, 이들은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 분자 생물학 분야에 관한 것으로서, 특히 세포의 게놈을 변경하는 방법에 관한 것이다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 서열 목록의 공식 사본은 2016년 10월 11일 작성되고 크기가 185 킬로바이트이며 본 명세서와 동시에 제출된 파일명 20161011_BB2533PCT_SeqLst.txt의 ASCII 형식의 서열 목록으로서 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출되었다. 이러한 ASCII 형식의 서류에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
재조합 DNA 기술은 표적화된 게놈 위치에서의 DNA 서열 삽입 및/또는 특정 내인성 염색체 서열의 변형(편집)을 가능하게 함으로써 생물의 표현형을 변화시킬 수 있었다. 부위 특이적 재조합 시스템을 이용한 부위 특이적 통합 기술뿐만 아니라 다른 방식의 재조합 기술이 다양한 생물에서 관심 유전자의 표적화된 삽입을 생성하는 데 이용되어 왔다. 게놈 편집 기술, 예컨대, 디자이너 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 전사 활성물질 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 호밍 메가뉴클레아제가 표적화된 게놈 섭동을 생성하는 데 이용 가능하지만, 이들 시스템은 특이성이 낮고 각각의 표적 부위에 대해 재설계되어야 하는 설계된 뉴클레아제를 사용하는 경향이 있어, 제조에 많은 비용과 시간이 소요된다.
생물의 게놈에서 변형을 위한 특정 부위를 표적화 하기 위해 여러 접근법이 개발되었지만, 저렴하고, 설정이 용이하고, 확장 가능하며, 생물의 게놈 내 여러 위치를 표적화할 수 있는 새로운 게놈 조작 기술이 여전히 필요하다.
세포의 게놈 내 비기능성 유전자 산물에 대한 기능을 복원하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 상기 방법 및 조성물은 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 시스템을 이용하여 비기능성 유전자 산물에 대한 기능을 복원하고, 식물, 식물 세포 또는 종자의 게놈 내 표적 부위를 변형하거나 변경하기 위한 효과적인 시스템을 제공한다. 본 발명은 또한, 복원된 기능성 선택 마커를 이용하여 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법뿐만 아니라, 세포에 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 도입하지 않고 상기 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 편집하는 방법을 기술한다. mRNA 분자(가이드 RNA, Cas 엔도뉴클레아제) 또는 단백질 분자(Cas 엔도뉴클레아제)를 통해 복합체의 성분을 도입하거나, 가이드 RNA/Cas 리보뉴클레오티드-단백질 복합체(RGEN) 자체를 직접 도입함으로써, Cas 엔도뉴클레아제, 가이드 RNA 및 가이드 RNA/Cas 복합체를 DNA 없이 세포 내에 전달하기 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 세포의 게놈 내 비기능성 유전자 산물에 대한 기능을 복원하는 방법으로서, 게놈 내 파괴된 유전자를 포함하는 세포에 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 도입하는 단계를 포함하되, 상기 복합체는 이중 가닥 절단을 생성하고, 상기 파괴된 유전자는 기능성 유전자 산물을 암호화하지 않고, 상기 파괴된 유전자는 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 상기 기능성 유전자 산물을 암호화할 수 있는 비파괴 유전자로 복원되는 방법을 포함한다. 파괴된 유전자는 해당 비파괴 유전자와 비교할 때 PAM 서열의 상류(5') 네 번째 뉴클레오티드의 염기쌍 결실을 포함하고, 상기 염기쌍 결실은 파괴된 유전자의 유전자 산물에서 아미노산 프레임이동을 생성함으로써, 파괴된 유전자의 유전자 산물을 비기능적 상태로 만든다. 염기쌍 결실은 코돈 서열의 제1, 제2 또는 제3 뉴클레오티드에 위치할 수 있다. 복원은 이중 가닥 절단 부위에 단일 염기를 삽입시키는 비상동 말단 연결(NHEJ)에 의해 달성될 수 있거나, 상동 재조합 또는 상동성 유도 복구를 이용하지 않고 이중 가닥 절단 부위에 단일 염기를 삽입하여 달성될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법으로서, 표적 부위 및 파괴된 선택 마커 유전자를 포함하는 적어도 하나의 세포에 제1 가이드 RNA, Cas 엔도뉴클레아제, 및 적어도 제2 가이드 RNA를 도입하되, 상기 제1 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 파괴된 선택 마커 유전자에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 제1 복합체를 형성할 수 있고, 상기 파괴된 선택 마커 유전자는 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 기능성 선택 마커 단백질을 암호화할 수 있는 비파괴 선택 마커 유전자로 복원되고, 상기 제2 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 위치한 상기 표적 부위를 인식하고, 거기에 결합하고, 닉킹 또는 절단할 수 있는 제2 복합체를 형성할 수 있는 단계; 및 상기 뉴클레오티드 서열의 변형을 갖는 세포를 상기 기능성 선택 마커 단백질에 의해 선택하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 도입 및 선택 단계는 선택 마커 유전자를 포함하는 재조합 DNA 작제물과 같은 선택 마커 유전자의 도입을 포함하지 않는다. 파괴된 선택 마커 유전자는 파괴된 시각적 마커 유전자를 비롯한 임의의 파괴된 마커 유전자일 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열의 변형은 상기 표적 부위에서의 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 또는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 방법은 상기 세포에 폴리뉴클레오티드 변형 주형 또는 공여 DNA를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드 변형 주형은 상기 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형을 포함하고, 상기 공여 DNA는 상기 표적 부위에 삽입될 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 편집하는 방법으로서, a) 적어도 하나의 세포에 적어도 하나의 가이드 RNA 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제를 도입하되, 상기 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 복합체를 형성할 수 있는 단계; b) 상기 뉴클레오티드 서열에 적어도 하나의 단일 뉴클레오티드 결실을 포함하는 세포를 (a)로부터 선택하되, 상기 뉴클레오티드 결실은 편집될 위치에 위치하는 단계; 및 c) (b)의 세포에 적어도 하나의 가이드 RNA 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제를 도입하되, 상기 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 복합체를 형성할 수 있고, 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 (b)의 뉴클레오티드 결실과 동일한 위치에 단일 뉴클레오티드를 삽입할 수 있는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드 변형 주형 또는 공여 DNA를 사용하지 않고 식물의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 편집하는 방법으로서, a) 적어도 하나의 식물 세포에 적어도 하나의 가이드 RNA 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제를 도입하되, 상기 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 복합체를 형성할 수 있는 단계; b) 상기 뉴클레오티드 서열에 적어도 하나의 단일 뉴클레오티드 결실을 포함하는 식물 세포를 (a)로부터 선택하되, 상기 뉴클레오티드 결실은 편집될 위치에 위치하는 단계; c) (b)의 식물 세포로부터 식물을 재생시키는 단계; d) (c)의 식물로부터의 세포에 적어도 하나의 가이드 RNA 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제를 도입하되, 상기 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있고, 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 (b)의 뉴클레오티드 결실과 동일한 위치에 단일 뉴클레오티드를 삽입할 수 있는 복합체를 형성할 수 있는 단계; 및 e) 최적으로는, (d)의 뉴클레오티드 삽입을 포함하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 형성하는 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질은 각각 RNA 및 단백질로서 직접 세포에 도입되거나, 리보뉴클레오티드-단백질 복합체로서 세포에 도입될 수 있다. 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체의 성분은 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 mRNA 분자로서, 그리고 가이드 RNA를 포함하는 RNA로서 도입되거나, 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자로서 도입될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 세포 내에 전달하는 DNA 프리 방법으로서, 적어도 하나의 가이드 RNA 분자와 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 결합하여 리보뉴클레오티드-단백질을 형성하는 단계 및 상기 리보뉴클레오티드-단백질을 입자 전달 매트릭스와 결합하여 상기 리보뉴클레오티드-단백질과 매트릭스가 결합될 수 있도록 하여 리보뉴클레오티드-단백질-매트릭스 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 리보뉴클레오티드-단백질-매트릭스 복합체를 상기 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 성분을 세포 내에 전달하는 DNA 프리 방법으로서, 적어도 하나의 가이드 RNA 분자 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 세포에 도입하는 단계, 및 상기 가이드 RNA 및 상기 Cas 엔도뉴클레아제 단백질이 상기 세포 내에 복합체를 형성할 수 있도록 적절한 조건 하에서 상기 세포를 성장시키는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
DNA 프리 방법은 폴리뉴클레오티드 주형을 도입하는 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 폴리뉴클레오티드 변형 주형은 상기 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형을 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드 변형 주형의 상기 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형은 (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, (ii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, (iii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 및 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. DNA 프리 방법은 또한 공여 DNA를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 공여 DNA는 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 세포 내로의 도입은 입자 매개 전달, 휘스커 매개 전달, 세포 침투성 펩티드 매개 전달, 전기천공, PEP 매개 형질감염 및 나노입자 매개 전달로 이루어진 군으로부터 선택되는 전달 시스템을 통해 이루어질 수 있다.
세포는 인간, 비인간, 동물, 고세균, 박테리아, 진균, 곤충, 효모, 비통상적 효모, 및 식물 세포를 포함한다.
또한, 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 핵산 작제물, 세포, 식물, 자손 식물, 미생물, 외식편, 종자 및 곡물이 제공된다. 본 발명의 방법 및 조성물의 추가적인 구현예가 본원에 제시된다.
도면의 간단한 설명 및 서열 목록
본 발명은 본 출원의 일부를 구성하는 첨부 도면 및 서열 목록 및 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 완전하게 이해될 수 있다. 본원에 첨부된 서열 설명 및 서열 목록은 37 C.F.R. §§1.821-1.825에 명시된 바와 같이 특허 출원에서 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 공개를 규율하는 규칙을 따른다. 서열 설명은 본원에 참조로 포함되는 37 C.F.R. §§ 1.821-1.825에 정의된 아미노산에 대한 세 문자의 코드를 포함한다.
도면
도 1은 본원에 기술된 옥수수 최적화된 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 의해 유도된 상위 10개의 가장 빈번한 NHEJ 돌연변이의 배열 및 개수를 나타낸다. 돌연변이는 심층 시퀀싱에 의해 동정되었다. 기준 서열(SEQ ID NO: 48)은 변형되지 않은 유전자좌를 각각의 표적 부위를 볼드체로 표시하여 나타낸다. PAM 서열(회색) 및 예상 절단 부위(화살표)도 표시되어 있다. 불완전한 NHEJ 결과로 인한 결실 또는 삽입은 "-" 또는 밑줄 친 이탤릭체 뉴클레오티드로 각각 표시된다. 기준 및 표적 부위의 돌연변이 1 내지 10은 각각 SEQ ID NO: 49 내지 58에 해당한다. 옥수수에서, 대부분의 표적 부위의 경우, Cas9-gRNA 시스템에 의해 생성된 가장 일반적인 유형의 돌연변이는 단일 뉴클레오티드 삽입(60% 이상)(개수는 16,861로 표시됨)이다.
도 2는 ALS2 유전자 및 2개의 편집 복구 주형(Oligo1 및 Oligo2)의 부분적 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 59, 61, 63) 및 부분적 아미노산 서열(SEQ ID NO: 60, 62, 64)을 나타내며; 변형된 뉴클레오티드는 밑줄 처리되어 있고 (Pro에서 Ser로의) 유전자 편집 대상 코돈 서열은 박스 처리되어 있다.
도 3은 클로르설푸론에 대한 저항성을 위해 편집된 ALS2 대립 유전자를 갖는 옥수수 식물(좌) 및 야생형 식물(우)을 나타낸다. 4주령의 식물에 클로르설푸론(100 mg/L)을 살포했다. 처치 3주 후의 식물이 표시된다.
도 4a 내지 4c는 변형을 위해 선택된 ALS2 유전자(SEQ ID NO: 65, 67, 69) 단편의 개략도 및 선택 마커로서 ALS2의 사용을 나타낸다. 암호화된 아미노산 서열은 각각의 뉴클레오티드 서열 아래에 표시되어 있다(SEQ ID NO: 66, 68). 도 4a: 위치 165의 단일 뉴클레오티드 (G)(밑줄 친 볼드체)는 클로르설푸론 저항성을 위해 편집된 ALS2 유전자의 특정 녹아웃 버전을 생성하기 위해 제거될 수 있다. 도 4b는 단일 뉴클레오티드 결실(G 제거)로 인해 번역 프레임이 이동되고 ALS2 유전자가 녹아웃된 새로운 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 도 4c: ALS2 유전자 기능 및 클로르설푸론 저항성은 NHEJ 경로를 통한 DSB 복구 과정 중에 단일 뉴클레오티드(N, 밑줄 친 볼드체)의 삽입을 통해 복원된다.
도 5a 내지 5b. 불활성화된 ALS2P 165S의 선택 마커로서의 재활성화. 도 5a(SEQ ID NO: 70). PAM의 5' 3개의 뉴클레오티드에 위치한 상류의 아웃 오브 프레임 번역 개시 코돈을 함유하는 ALS 2P165S 유전자의 설계. 첫 AUG에서의 번역의 개시(서열 아래에 화살표로 표시)는 ALS2의 번역 개시 코돈의 개시를 방지하는 4개 아미노산의 폴리펩티드를 암호화한다(회색 문자). 도 5b(SEQ ID NO: 71). 상류 AUG의 손실을 초래하는 단일 뉴클레오티드 삽입(C, A 또는 T) 또는 결실(또는 임의의 조합)은 ALS2의 개시 코돈에서의 번역의 개시(서열 아래에 화살표로 표시)를 가능하게 하여 전체 길이의 ALS2P165S 제초제 저항성 유전자의 번역을 복원한다.
도 6a 내지 6c는 변형을 위해 선택된 내인성 표적 부위를 포함하는 관심 폴리뉴클레오티드(SEQ ID NO: 72) 단편의 개략도를 나타낸다. 암호화된 아미노산 서열은 각각의 뉴클레오티드 서열 아래에 표시되어 있다(SEQ ID NO: 73, 75, 77). 도 6a는 엔도뉴클레아제 절단 부위(화살표로 표시) 다음에 위치한 단일 뉴클레오티드(이 예에서는 밑줄 친 볼드체로 표시한 C)가 NHEJ를 통해 제거될 수 있음을 나타낸다. 도 6b는 단일 염기가 결실됨으로 인해 새로운 절단 부위가 생성되고(화살표로 표시) 번역 프레임이 이동된 결과적인 관심 폴리뉴클레오티드(SEQ ID NO: 74)를 나타낸다. 도 4c: 엔도뉴클레아제 절단 부위 다음에 위치한 단일 뉴클레오티드(이 예에서는 밑줄 친 볼드체로 표시한 T)는 폴리뉴클레오티드 변형(복구) 주형을 사용하지 않고 NHEJ를 통해 삽입되어, 관심 폴리뉴클레오티드(SEQ ID NO: 76)의 단일 뉴클레오티드 편집 결과를 가져올 수 있다. PAM 서열은 회색으로 강조 표시되어 있다.
도 7. 위: UBI:Cas9을 옥수수 게놈 내에 안정적으로 통합하기 위한 아그로박테리움 벡터. 아래: MDH:Cas9을 옥수수 게놈 내에 안정적으로 통합하기 위한 아그로박테리움 벡터. MDH는 Cas9의 발현을 조절하는 온도 조절된 프로모터이다. 이들 벡터는 또한 시각적 마커 유전자(END2:AmCYAN)를 포함하며, 이는 안정적으로 형질전환된 캘러스 섹터의 선택에 사용되었다. 포함된 적색 형광 단백질(DsRED)의 서열은 343-bp 스페이서에 의해 분리된 정방향 369 bp 단편에 복제되었고, 이는 2개의 gRNA 및 LIG3:4 메가뉴클레아제에 의한 인식 및 표적화를 위한 서열을 포함하였다. H2B는 히스톤 H2B 유전자 프로모터를 지칭한다.
서열
핵산 및 단백질 서열 번호의 요약
설명 핵산
SEQ ID NO.		 단백질
SEQ ID NO.
Cas9 코딩 서열 1
감자 ST-LS1 인트론 2
SV40 NLS 3
VirD2 NLS 4
옥수수 최적화된 Cas9 발현 카세트 5
Lig-CR3 가이드 RNA 발현 벡터 6
옥수수 게놈 표적 부위 MS26Cas-1 및 PAM 서열 7
옥수수 게놈 표적 부위 MS26Cas-2 및 PAM 서열 8
옥수수 게놈 표적 부위 MS26Cas-3 및 PAM 서열 9
옥수수 게놈 표적 부위 LIGCas-1 및 PAM 서열 10
옥수수 게놈 표적 부위 LIGCas-2 및 PAM 서열 11
옥수수 게놈 표적 부위 LIGCas-3 및 PAM 서열 12
옥수수 게놈 표적 부위 MS45Cas-1 및 PAM 서열 13
옥수수 게놈 표적 부위 MS45Cas-2 및 PAM 서열 14
옥수수 게놈 표적 부위 MS45Cas-3 및 PAM 서열 15
옥수수 게놈 표적 부위 ALSCas-1 및 PAM 서열 16
옥수수 게놈 표적 부위 ALSCas-2 및 PAM 서열 17
옥수수 게놈 표적 부위 ALSCas-3 및 PAM 서열 18
프라이머 서열 19~38
ALS1-DNA 서열 39
ALS2-DNA 서열 40
전체 길이 Zm-ALS2 단백질 41
옥수수 게놈 표적 부위 ALSCas-4 및 PAM 서열 42
794 bp 폴리뉴클레오티드 변형 주형 43
127 bp 폴리뉴클레오티드 변형 주형, oligo1 44
127 bp 폴리뉴클레오티드 변형 주형, oligo2 45
옥수수 코돈 최적화된 Cas9 및 옥수수 UBI 프로모터를 포함하는 아그로박테리움 벡터 46
옥수수 코돈 최적화된 Cas9 및 옥수수 MDH 프로모터를 포함하는 아그로박테리움 벡터 47
도 1에 표시된 서열 48~58
도 2에 표시된 서열 59, 61, 63 60, 62, 64
도 4a 내지 4c에 표시된 서열 65, 67, 69 66,68
도 5a 내지 5b에 표시된 서열 70~71
도 6a 내지 6c에 표시된 서열 72, 74, 76 73, 75,77
IN2 프로모터 78
ALSCas7 표적 부위 79
변형된 ALSCas7 표적 부위인 ALSCas7-1 표적 부위 80
옥수수 표적 이탈 부위 81
세포의 게놈 내 비기능성 유전자 산물에 대한 기능을 복원하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 상기 방법 및 조성물은 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 시스템을 이용하여 비기능성 유전자 산물에 대한 기능을 복원하고, 식물, 식물 세포 또는 종자의 게놈 내 표적 부위를 변형하거나 변경하기 위한 효과적인 시스템을 제공한다. 본 발명은 또한, 복원된 기능성 선택 마커를 이용하여 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법뿐만 아니라, 세포에 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 도입하지 않고 상기 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 편집하는 방법을 기술한다. mRNA 분자(가이드 RNA, Cas 엔도뉴클레아제) 또는 단백질 분자(Cas 엔도뉴클레아제)를 통해 복합체의 성분(가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제)을 도입하거나, 가이드 RNA/Cas 리보뉴클레오티드-단백질 복합체(RGEN) 자체를 직접 도입함으로써, 뉴클레오티드-단백질 복합체를 직접 도입함으로써, Cas9 엔도뉴클레아제, sgRNA 및 가이드 RNA/Cas 복합체를 DNA 없이 세포 내에 전달하기 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다.
CRISPR 유전자좌(규칙적으로 사이 간격을 두고 분포하는 짧은 회문구조 반복 서열)(SPIDR(SPacer Interspersed Direct Repeat)로도 알려짐)는 DNA 유전자좌의 군을 구성한다. CRISPR 유전자좌는 부분적으로 회문구조인 짧고 고도로 보존된 DNA 반복 서열(일반적으로 24 내지 40 bp, 1~140회 반복됨, CRISPR 반복 서열이라고도 함)로 구성된다. (일반적으로 종에 특이적인) 반복된 서열이 일정한 길이(CRISPR 유전자좌에 따라 일반적으로 20 내지 58)의 가변 서열을 사이에 두고 분포된다(2007년 3월 1일 공개된 WO2007/025097). 박테리아 및 고세균은, 짧은 RNA를 이용하여 외래 핵산의 분해를 유도하는, 규칙적으로 사이 간격을 두고 분포하는 짧은 회문구조 반복 서열(CRISPR)/CRISPR-결합(Cas) 시스템이라고 하는 적응 면역 방어를 진화시켰다(2007년 3월 1일 공개된 WO2007/025097). 멀티서브유닛 이펙터 복합체를 가진 클래스 1 시스템, 및 단일 단백질 이펙터(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3)를 가진 클래스 2 시스템을 포함하여 여러 CRISPR-Cas 시스템이 기술되었다(Zetsche et al., 2015, Cell 163, 1-13; Shmakov et al., 2015, Molecular_Cell 60, 1-13; Makarova et al. 2015, Nature Reviews Microbiology Vol. 13:1-15, 2013년 11월 23일 공개되고 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO 2013/176772 A1).
박테리아로부터의 II형 CRISPR/Cas 시스템은 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(트랜스-활성화 CRISPR RNA)를 사용하여 Cas 엔도뉴클레아제를 DNA 표적으로 유도한다. crRNA는 이중 가닥 DNA 표적의 한 가닥에 상보적인 스페이서 영역 및 Cas 엔도뉴클레아제가 DNA 표적을 절단하도록 유도하는 RNA 듀플렉스를 형성하는 tracrRNA(트랜스-활성화 CRISPR RNA)와 염기쌍을 이루는 영역을 포함한다. 스페이서는 Cas1 및 Cas2 단백질과 관련된 완전히 이해되지 않은 프로세스를 통해 획득된다. 모든 II형 CRISPR-Cas 유전자좌는 cas9 유전자 이외에 cas1 및 cas2 유전자를 포함한다(Makarova et al. 2015, Nature Reviews Microbiology Vol. 13:1-15). Cas 유전자는 일반적으로 플랭킹 CRISPR 유전자좌에 커플링되거나 결합되거나 가까이 있거나, 또는 그 부근에 있는 유전자를 포함한다. 용어 "Cas 유전자", "CRISPR-결합(Cas) 유전자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. Cas 단백질 군에 대한 포괄적인 리뷰는 문헌[Haft et al. (2005) Computational Biology, PLoS Comput Biol 1(6): e60. doi:10.1371/journal.pcbi.0010060]에 제공된다. 거기에 기술된 바와 같이, 4개의 이전에 알려진 유전자 군 이외에, 41개의 CRISPR-결합(Cas) 유전자 군이 기술되어 있다. 이는 CRISPR 시스템이 상이한 반복 패턴, 유전자 세트, 및 종 범위를 갖는 상이한 클래스에 속함을 나타낸다. 주어진 CRISPR 유전자좌에서 Cas 유전자의 수는 종들 사이에 다를 수 있다(Haft et al., 2005, Computational Biology, PLoS Comput Biol 1(6): e60. doi:10.1371/journal.pcbi.0010060; Makarova et al. 2015, Nature Reviews Microbiology Vol. 13 :1-15; 2013년 11월 23일 공개되고 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO 2013/176772 A1).
본원의 용어 "Cas 엔도뉴클레아제"는 Cas(CRISPR-결합) 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 지칭한다. Cas 엔도뉴클레아제는, 적합한 폴리뉴클레오티드 성분과의 복합체인 경우, 특정 DNA 표적 서열의 전부 또는 일부를 인식하고 거기에 결합하고, 선택적으로 닉킹 또는 절단할 수 있다. 본원에 기술된 Cas 엔도뉴클레아제는 하나 이상의 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 본 발명의 Cas 엔도뉴클레아제는 HNH 또는 HNH 유사 뉴클레아제 도메인 및/또는 RuvC 또는 RuvC 유사 뉴클레아제 도메인을 갖는 것들을 포함한다(Makarova et al. 2015, Nature Reviews Microbiology Vol. 13:1-15). Cas는 Cas9 단백질, Cpf1 단백질, C2c1 단백질, C2c2 단백질, C2c3 단백질, Cas3, Cas3-HD, Cas5, Cas7, Cas8, Cas10, 또는 이들의 복합체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체", "가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 시스템", "가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 복합체", "가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 시스템", "유도 Cas 시스템", "PGEN"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 폴리뉴클레오티드-단백질 복합체를 형성할 수 있는 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 지칭하며, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 Cas 엔도뉴클레아제를 DNA 표적 부위로 유도하여 Cas 엔도뉴클레아제가 DNA 표적 부위를 인식하고 거기에 결합하고, 선택적으로 닉킹 또는 절단(단일 또는 이중 가닥 절단의 도입)할 수 있게 할 수 있다. 본원의 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 4개의 알려진 CRISPR 시스템(Horvath and Barrangou, Science 327:167-170), 예컨대, I형, II형 또는 III형 CRISPR 시스템 중 임의의 것의 적합한 폴리뉴클레오티드 성분(들) 및 Cas 단백질(들)을 포함할 수 있다. Cas 엔도뉴클레아제는 표적 서열에서 DNA 듀플렉스를 풀고, Cas 단백질과의 복합체인 폴리뉴클레오티드(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, crRNA 또는 가이드 RNA)에 의한 표적 서열의 인식에 의해 매개되는 바와 같이, 적어도 하나의 DNA 가닥을 선택적으로 절단한다. 일반적으로 Cas 엔도뉴클레아제에 의한 이러한 표적 서열의 인식 및 절단은 정확한 프로토스페이서-인접 모티프(PAM)가 DNA 표적 서열의 3' 말단에 위치하거나 인접한 경우 발생한다. 대안적으로, 본원에서 Cas 단백질은 DNA 절단 또는 닉킹 활성이 부족할 수 있지만, 적합한 RNA 성분과 복합체를 형성한 경우 여전히 DNA 표적 서열에 특이적으로 결합할 수 있다(그 전체가 본원에 참조로 포함되는, 2015년 3월 19일 공개된 미국 특허 출원 US 2015-0082478 A1 및 2015년 2월 26일 공개된 US 2015-0059010 A1을 또한 참조.)
가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 DNA 표적 서열의 한 가닥 또는 두 가닥을 절단할 수 있다. DNA 표적 서열의 두 가닥을 절단할 수 있는 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 일반적으로 이의 엔도뉴클레아제 도메인 모두를 기능적 상태(functional state)로 가지는 Cas 단백질을 포함한다(예를 들어, 야생형 엔도뉴클레아제 도메인 또는 각각의 엔도뉴클레아제 도메인에서 일부 또는 모든 활성을 보유하는 이들의 변이체). 따라서, 야생형 Cas 단백질(예를 들어, 본원에 개시된 Cas9 단백질) 또는 Cas 단백질의 각각의 엔도뉴클레아제 도메인에서 일부 또는 모든 활성을 보유하는 이의 변이체는 DNA 표적 서열의 두 가닥을 절단할 수 있는 Cas 엔도뉴클레아제의 적절한 예이다. 기능적 RuvC 및 HNH 뉴클레아제 도메인을 포함하는 Cas9 단백질은 DNA 표적 서열의 두 가닥을 절단할 수 있는 Cas 단백질의 예이다. DNA 표적 서열의 한 가닥을 절단할 수 있는 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 본원에서 닉카아제 활성(예를 들어, 부분 절단 능력)을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. Cas 닉카아제는 일반적으로, Cas가 DNA 표적 서열 중 한 가닥만 절단하도록 하는(즉, 닉을 형성하도록 하는) 하나의 기능적 엔도뉴클레아제 도메인을 포함한다. 예를 들어, Cas9 닉카아제는 (i) 돌연변이 기능장애 RuvC 도메인 및 (ii) 기능적 HNH 도메인(예를 들어, 야생형 HNH 도메인)을 포함할 수 있다. 다른 예로서, Cas9 닉카아제는 (i) 기능적 RuvC 도메인(예를 들어, 야생형 RuvC 도메인) 및 (ii) 돌연변이 기능장애 HNH 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서 사용하기에 적합한 Cas9 닉카아제의 비제한적인 예는 본원에 참조로 포함되는 Gasiunas et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109:E2579-E2586), Jinek et al. (Science 337:816-821), Sapranauskas et al. (Nucleic Acids Res. 39:9275-9282) 및 미국 특허 출원 공개 2014/0189896호에 개시되어 있다.
DNA 표적화의 특이성을 증가시키기 위해 한 쌍의 Cas9 닉카아제가 사용될 수 있다. 일반적으로, 이는, 상이한 가이드 서열을 갖는 RNA 성분들과 결합되어 있기 때문에, 원하는 표적화를 위한 영역에서 반대 가닥 상의 가까운 DNA 서열을 표적화하고 닉을 형성하는 2개의 Cas9 닉카아제를 도입함으로써 수행될 수 있다. 각각의 DNA 가닥의 이러한 가까운 절단은 이중 가닥 절단(즉, 단일-가닥 돌출부를 갖는 DSB)를 생성하고, 이는 이어서 비상동 말단 연결, NHEJ(돌연변이로 이어지는 불완전한 복구 경향이 있음) 또는 상동 재결합, HR을 위한 기질로서 인정된다. 이러한 구현예에서 각각의 닉은, 예를 들어, 서로 적어도 약 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100(또는 5와 100 사이의 임의의 정수)개의 염기만큼 이격될 수 있다. 본원의 하나 또는 두 개의 Cas9 닉카아제 단백질이 Cas9 닉카아제 쌍에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 RuvC 도메인을 가지나 작동 HNH 도메인을 갖는 Cas9 닉카아제(즉, Cas9 HNH+/RuvC-)(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 HNH+/RuvC-)가 사용될 수 있다. 각각의 Cas9 닉카아제(예를 들어, Cas9 HNH+/RuvC-)는 각각의 닉카아제를 각각의 특정 DNA 부위로 표적화하는 가이드 RNA 서열을 갖는 본원의 적합한 RNA 성분들을 사용하여, 서로 가까운(100개 이하의 염기쌍만큼 이격된) 특정 DNA 부위로 유도될 것이다.
Cas 단백질은 하나 이상의 이종 단백질 도메인(예를 들어, Cas 단백질 외에도 1개, 2개, 3개 이상의 도메인)을 포함하는 융합 단백질의 일부일 수 있다. 이러한 융합 단백질은 임의의 추가적인 단백질 서열, 및 선택적으로 임의의 두 도메인 사이, 예컨대, Cas와 제1 이종 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. 본원의 Cas 단백질에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는 에피토프 태그(예를 들어, 히스티딘 [His], V5, FLAG, 인플루엔자 혈구응집소 [HA], myc, VSV-G, 티오레독신 [Trx]), 리포터(예를 들어, 글루타티온-5-트랜스퍼라아제 [GST], 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 [HRP], 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 [CAT], 베타-갈락토시다아제, 베타-글루쿠로니다아제 [GUS], 루시퍼라아제, 녹색 형광 단백질 [GFP], HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질[CFP], 황색 형광 단백질 [YFP], 청색 형광 단백질 [BFP]) 및 메틸라아제 활성, 디메틸라아제 활성, 전사 활성화 활성(예를 들어, VP16 또는 VP64), 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성 중 하나 이상을 갖는 도메인을 제한 없이 포함한다. Cas 단백질은 DNA 분자 또는 다른 분자, 예컨대, 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인(DBD), GAL4A DNA 결합 도메인 및 단순 헤르페스 바이러스(HSV) VP16에 결합하는 단백질과 융합될 수도 있다.
본원의 Cas 단백질은 다음 속들 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다: 아에로피룸(Aeropyrum), 피로바쿨룸(Pyrobaculum), 술폴로부스(Sulfolobus), 아캐오글로부스(Archaeoglobus), 할로아르쿨라(Haloarcula), 메타노박테리움(Methanobacteriumn), 메타노코커스(Methanococcus), 메타노사르시나(Methanosarcina), 메타노피러스(Methanopyrus), 피로코커스(Pyrococcus), 피크로필러스(Picrophilus), 써니오플라스니아(Thernioplasnia), 코리네박테리움(Corynebacterium), 마이코박테리움(Mycobacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 아퀴펙스(Aquifex), 포르피로모나스(Porphyromonas), 클로로비움(Chlorobium), 써머스(Thermus), 바실러스(Bacillus), 리스테리아(Listeria), 스타필로코커스(Staphylococcus), 클로스트리디움(Clostridium), 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter), 마이코플라스마(Mycoplasma), 푸소박테리움(Fusobacterium), 아자쿠스(Azarcus), 크로모박테리움(Chromobacterium), 네이세리아(Neisseria), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 디설포비브리오(Desulfovibrio), 게오박터(Geobacter), 미로코커스(Myrococcus), 캄필로박터(Campylobacter), 볼리넬라(Wolinella), 아시네토박터(Acinetobacter), 에르위니아(Erwinia), 에스케리챠(Escherichia), 레지오넬라(Legionella), 메틸로코커스(Methylococcus), 파스퇴렐라(Pasteurella), 포토박테리움(Photobacterium), 살모넬라(Salmonella), 잔토모나스(Xanthomonas), 예시니아(Yersinia), 스트렙토코커스(Streptococcus), 트레포네마(Treponema), 프란시셀라(Francisella) 또는 써모토가(Thermotoga). 대안적으로, 본원의 Cas 단백질은, 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 출원 공개 2010/0093617호에 개시된 바와 같이, SEQ ID NO: 462 내지 465, 467 내지 472, 474 내지 477, 479 내지 487, 489 내지 492, 494 내지 497, 499 내지 503, 505 내지 508, 510 내지 516 또는 517 내지 521 중 임의의 것에 의해 암호화될 수 있다.
특정 구현예에서 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 DNA 표적 부위 서열에 결합할 수 있지만, 표적 부위 서열에서 임의의 가닥을 절단하지 않는다. 이러한 복합체는 모든 뉴클레아제 도메인이 돌연변이 기능장애인 Cas 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, DNA 표적 부위 서열에 결합할 수 있지만, 표적 부위 서열에서 임의의 가닥을 절단하지 않는 본원의 Cas9 단백질은 돌연변이 기능장애 RuvC 도메인 및 돌연변이 기능장애 HNH 도메인을 모두 포함할 수 있다. 표적 DNA 서열에 결합하지만 절단하지 않는 본원의 Cas 단백질은 유전자 발현을 조절하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 이 경우 Cas 단백질은 전사 인자(또는 이의 일부)(예를 들어, 억제물질 또는 활성물질, 예컨대, 본원에 개시된 것들 중 임의의 것)와 융합될 수 있다.
Cas 엔도뉴클레아제 유전자는 II형 Cas9 엔도뉴클레아제 예컨대, 2007년 3월 1일 공개되고 본원에 참조로 포함되는 WO2007/025097의 SEQ ID NO: 462, 474, 489, 494, 499, 505, 및 518에 열거된 Cas9 유전자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 구현예에서, Cas 엔도뉴클레아제 유전자는 식물, 옥수수 또는 대두 최적화된 Cas9 엔도뉴클레아제 유전자이다. 본원의 Cas 엔도뉴클레아제 유전자는 식물 또는 미생물 코돈 최적화된 Cas9 엔도뉴클레아제 유전자일 수 있다. Cas 엔도뉴클레아제 유전자는 Cas 코돈 영역 상류의 SV40 핵 표적화 신호 및 Cas 코돈 영역 하류의 2부분 VirD2 핵 국재화 신호(Tinland et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7442-6)에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본원의 "Cas9" (이전에는 Cas5, Csn1 또는 Csx12로 지칭됨)는 DNA 표적 서열의 전부 또는 일부를 특이적으로 인식하고 절단하기 위해, cr뉴클레오티드 및 tracr뉴클레오티드와, 또는 단일 가이드 폴리뉴클레오티드와 복합체를 형성하는 II형 CRISPR 시스템의 Cas 엔도뉴클레아제를 지칭한다. Cas9 단백질은 RuvC 뉴클레아제 도메인 및 HNH(H-N-H) 뉴클레아제 도메인을 포함하며, 이들 각각은 표적 서열에서 단일 DNA 가닥을 절단할 수 있다(두 도메인의 공동 작용은 DNA 이중 가닥 절단을 유도하는 반면, 하나의 도메인의 활성은 닉을 유도함). 일반적으로, RuvC 도메인은 서브도메인 I, II 및 III을 포함하며, 여기서 도메인 I은 Cas9의 N 말단 근처에 위치하고, 서브도메인 II 및 III은 HNH 도메인에 플랭킹한 단백질의 중간에 위치한다(Hsu et al, Cell 157:1262-1278). II형 CIRSPR 시스템은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 성분과의 복합체로 Cas9 엔도뉴클레아제를 활용하는 DNA 절단 시스템을 포함한다. 예를 들어, Cas9는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)와의 복합체일 수 있다. 다른 예에서, Cas9는 단일 가이드 RNA와의 복합체일 수 있다.
본원에 기술된 Cas9 단백질뿐만 아니라 본원의 기타 특정 Cas 단백질의 아미노산 서열은 예를 들어, 스트렙토코커스(예를 들어, S. 피오게네스(pyogenes), S. 뉴모니애(pneumoniae), S. 써모필러스(thermophilus), S. 아갈락티아(agalactiae), S. 파라상귀니스(parasanguinis), S. 오랄리스(oralis), S. 살리바리우스(salivarius), S. 마카카(macacae), S. 디스갈락티애(dysgalactiae), S. 안지노서스(anginosus), S. 콘스텔라투스(constellatus), S. 슈도포르시누스(pseudoporcinus), S. 뮤탄스(mutans)), 리스테리아(예를 들어, L. 인노쿠아(innocua)), 스피로플라즈마(Spiroplasma) (예를 들어, S. 아피스(apis), S. 시르피디콜라(syrphidicola)), 펩토스트렙토코카세(Peptostreptococcaceae), 아토포비움(Atopobium), 포르피로모나스(Porphyromonas) (예를 들어, P. 카토니아(catoniae)), 프레보텔라(Prevotella) (예를 들어, P. 인테르메디아(intermedia)), 베일로넬라(Veillonella), 트레포네마(Treponema)(예를 들어, T. 소크란스키(socranskii), T. 덴티콜라(denticola)), 카프노사이토파가(Capnocytophaga), 피네골디아(Finegoldia)(예를 들어, F. 마그나(magna)), 코리오박테리아세아에(Coriobacteriaceae)(예를 들어, C. 박테리움(bacterium)), 올스넬라(Olsenella)(예를 들어, O. 프로푸사(profusa)), 헤모필루스(Haemophilus)(예를 들어, H. 스푸토룸(sputorum), H. 피트마니아에(pittmaniae)), 파스퇴렐라(Pasteurella)(예를 들어, P. 베티아에(bettyae)), 올리비박터(Olivibacter)(예를 들어, O. 시티엔시스(sitiensis)), 에필리토니모나스(Epilithonimonas)(예를 들어, E. 테낙스(tenax)), 메소니아(Mesonia)(예를 들어, M. 모빌리스(mobilis)), 락토바실루스(Lactobacillus)(예를 들어, L. 플란타룸(plantarum)), 바실루스(예를 들어, B. 세레우스(cereus)), 아퀴마리나(Aquimarina)(예를 들어, A. 무엘레리(muelleri)), 크리세오박테리움(Chryseobacterium)(예를 들어, C. 파루스트레(palustre)), 박테로이데스(Bacteroides)(예를 들어, B. 그라미니솔벤스(graminisolvens)), 네이세리아(예를 들어, N. 메닝기티디스(meningitidis)), 프란시셀라(Francisella)(예를 들어, F. 노비시다(novicida)) 또는 플라보박테리움(Flavobacterium)(예를 들어, F. 프리기다리움(frigidarium), F. 솔리(soli)) 종으로부터 유래될 수 있다. 다른 예로서, Cas9 단백질은 본원에 참조로 포함되는 문헌[Chylinski et al. (RNA Biology 10:726-737 및 2015년 5월 15일 출원된 미국 특허 출원 62/162377)]에 개시된 Cas9 단백질 중 임의의 것일 수 있다.
따라서, 본원의 Cas9 단백질의 서열은, 예를 들어, 참조로 포함되는 진뱅크(GenBank) 등록번호 G3ECR1 (S. 써모필러스), WP_026709422, WP_027202655, WP_027318179, WP_027347504, WP_027376815, WP_027414302, WP_027821588, WP_027886314, WP_027963583, WP_028123848, WP_028298935, Q03JI6 (S. 써모필러스), EGP66723, EGS38969, EGV05092, EHI65578 (S. 슈도포르시누스), EIC75614 (S. 오랄리스), EID22027 (S. 콘스텔라투스), EIJ69711, EJP22331 (S. 오랄리스), EJP26004 (S. 안지노서스), EJP30321, EPZ44001 (S. 피오게네스), EPZ46028 (S. 피오게네스), EQL78043 (S. 피오게네스), EQL78548 (S. 피오게네스), ERL10511, ERL12345, ERL19088 (S. 피오게네스), ESA57807 (S. 피오게네스), ESA59254 (S. 피오게네스), ESU85303 (S. 피오게네스), ETS96804, UC75522, EGR87316 (S. 디스갈락티애), EGS33732, EGV01468 (S. 오랄리스), EHJ52063 (S. 마카카), EID26207 (S. 오랄리스), EID33364, EIG27013 (S. 파라상귀니스), EJF37476, EJO19166 (스트렙토코커스 종 BS35b), EJU16049, EJU32481, YP_006298249, ERF61304, ERK04546, ETJ95568 (S. 아갈락티아), TS89875, ETS90967 (스트렙토코커스 종 SR4), ETS92439, EUB27844 (스트렙토코커스 종 BS21), AFJ08616, EUC82735 (스트렙토코커스 종 CM6), EWC92088, EWC94390, EJP25691, YP_008027038, YP_008868573, AGM26527, AHK22391, AHB36273, Q927P4, G3ECR1 또는 Q99ZW2 (S. 피오게네스)에 개시된 Cas9 아미노산 서열 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 이들 Cas9 단백질 서열 중 임의의 것의 변이체가 사용될 수 있지만, 본원의 RNA 성분과 결합할 경우 DNA에 대한 특이적 결합 활성 및 선택적으로 엔도뉴클레오리틱 활성을 가져야 한다. 이러한 변이체는 기준 Cas9의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
대안적으로, 본원의 Cas9 단백질은, 예를 들어, (본원에 참조로 포함되는) 미국 출원 공개 2010/0093617호에 개시된 바와 같은 SEQ ID NO: 462(S. 써모필러스), 474(S. 써모필러스), 489(S. 아갈락티아), 494(S. 아갈락티아), 499(S. 뮤탄스), 505(S. 피오게네스) 또는 518(S. 피오게네스) 중 임의의 것에 의해 암호화될 수 있다. 또한, 대안적으로, Cas9 단백질은, 예를 들어, 전술한 아미노산 서열 중 임의의 것과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변이체인 Cas9 단백질은 본원의 RNA 성분과 결합할 경우 DNA에 대한 특이적 결합 활성, 및 선택적으로 절단 또는 닉킹 활성을 가져야 한다.
본원의 Cas 단백질, 예컨대, Cas9은 이종 핵 국재화 서열(NLS)을 포함할 수 있다. 본원의 이종 NLS 아미노산 서열은, 예를 들어, 본원의 효모 세포의 핵에서 검출 가능한 양으로 Cas 단백질의 축적을 유도하기에 충분한 강도를 나타낼 수 있다. NLS는 염기성의, 양으로 하전된 잔기(예를 들어, 라이신 및/또는 아르기닌)의 하나(1부분(monopartite)) 이상(예를 들어, 2부분(bipartite))의 짧은 서열(예를 들어, 2 내지 20개의 잔기)을 포함할 수 있으며, Cas 아미노산 서열 중 어디에도 위치할 수 있지만 단백질 표면 상에 노출되어야 한다. NLS는, 예를 들어, 본원의 Cas 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 둘 이상의 NLS 서열이, 예를 들어, Cas 단백질에 연결될 수 있는데, 예를 들어, Cas 단백질의 N 말단과 C 말단 모두에 연결될 수 있다. 본원의 적합한 NLS 서열의 비제한적인 예는 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 6660830호 및 7309576호(예를 들어 해당 문헌의 표 1)에 개시된 것들을 포함한다.
Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9 폴리펩티드의 변형된 형태를 포함할 수 있다. Cas9 폴리펩티드의 변형된 형태는 Cas9 단백질의 자연 발생적인 뉴클레아제 활성을 감소시키는 아미노산 변화(예를 들어, 결실, 삽입, 또는 치환)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우, Cas9 단백질의 변형된 형태는 해당 야생형 Cas9 폴리펩티드의 뉴클레아제 활성의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만을 갖는다(2014년 3월 6일 공개된 미국 특허 출원 US20140068797 A1). 일부 경우, Cas9 폴리펩티드의 변형된 형태는 실질적인 뉴클레아제 활성을 갖지 않으며, 촉매적으로 "불활성된 Cas9" 또는 "비활성된 cas9 (dCas9)"으로 지칭된다. 촉매적으로 불활성화된 Cas9 변이체는 HNH 및 RuvC 뉴클레아제 도메인에 돌연변이를 포함하는 Cas9 변이체를 포함한다. 이러한 촉매적으로 불활성화된 Cas9 변이체는 sgRNA와 상호작용할 수 있고 생체내에서 표적 부위에 결합할 수 있지만, 표적 DNA의 어느 가닥도 절단할 수 없다.
촉매적으로 불활성인 Cas9는 이종 서열에 융합될 수 있다(2014년 3월 6일 공개된 미국 특허 출원 US20140068797 A1). 적합한 융합 상대는 표적 DNA 상에 또는 표적 DNA와 결합된 폴리펩티드(예를 들어, 히스톤 또는 다른 DNA-결합 단백질) 상에 직접 작용하여 전사를 간접적으로 증가시키는 활성을 제공하는 폴리펩티드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가적인 적합한 융합 상대는 메틸트랜스퍼라아제 활성, 디메틸라아제 활성, 아세틸트랜스퍼라아제 활성, 디아세틸라아제 활성, 키나아제 활성, 포스파타아제 활성, 유비퀴틴 리가아제 활성, 디유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 디아데닐화 활성, SUMO화 활성, 디SUMO화 활성, 리보실화 활성, 디리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 또는 디미리스토일화 활성을 제공하는 폴리펩티드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 적합한 융합 상대는 표적 핵산의 증가된 전사를 직접적으로 제공하는 폴리펩티드(예를 들어, 전사 활성물질 또는 이의 단편, 전사 활성물질을 구성하는 단백질 또는 이의 단편, 작은 분자/약물 반응성 전사 조절물질 등)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 촉매적으로 불활성인 Cas9는 FokI 뉴클레아제에 융합되어 이중 가닥 절단을 생성할 수도 있다(Guilinger et al. Nature biotechnology, 32권, 6호, 2014년 6월).
용어 Cas 엔도뉴클레아제의 "기능적 단편", "기능적으로 동등한 단편" 및 "기능적 동등 단편"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 표적 부위를 인식하고 거기에 결합하고, 선택적으로 닉킹 또는 절단(단일 또는 이중 가닥 절단의 도입)하는 능력이 유지되는 Cas 엔도뉴클레아제 서열의 일부 또는 하위서열을 지칭한다.
용어 Cas 엔도뉴클레아제의 "기능적 변이체", "기능적으로 동등한 변이체" 및 "기능적 동등 변이체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 표적 부위를 인식하고 거기에 결합하고, 선택적으로 닉킹 또는 절단(단일 또는 이중 가닥 절단의 도입)하는 능력이 유지되는 Cas 엔도뉴클레아제의 변이체를 지칭한다. 단편 및 변이체는 부위 특이적 돌연변이유발 및 합성 제조와 같은 방법을 통해 얻을 수 있다.
Cas 엔도뉴클레아제 유전자는 원칙적으로 표적화될 수 있는 N(12~30)NGG 형태의 임의의 게놈 서열을 인식할 수 있는 식물 코돈 최적화된 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 유전자, 또는 브레비바실루스 라테로스포루스, 락토바실루스 루테리 Mlc3, 락토바실루스 로시애 DSM 15814, 페디오코커스 펜토사세우스 SL4, 락토바실루스 노덴시스 JCM 14932, 설푸로스피릴룸 종 SCADC, 비피도박테리움 써모필룸 DSM 20210, 록타넬라 베스트폴덴시스, 스핑고모나스 산자니게넨스 NX02, 에필리토니모나스 테낙스 DSM 16811, 스포로사이토파가 믹소코코이데스 및 사이크로플렉수스 토르퀴스 ATCC 700755로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물로부터 유래된 Cas9 엔도뉴클레아제를 포함하며, 상기 Cas9 엔도뉴클레아제는 DNA 표적 서열의 전부 또는 일부를 인식하고 거기에 결합하고, 선택적으로 닉킹 또는 절단할 수 있는 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 형성할 수 있다. 다른 Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 2015년 5월 15일 출원된 미국 특허 출원 62/162,377 및 2015년 5월 15일 출원된 62/162,353에 기술되었으며, 두 출원은 모두 본원에 참조로 포함된다.
Cas9 엔도뉴클레아제는 (단일 및 복합 이중 가닥 절단 및 닉킹을 통한) 표적화된 게놈 편집 및 (Cas9 또는 sgRNA로의 후성 이펙터 도메인의 테더링을 통한) 표적화된 게놈 조절에 이용될 수 있다. Cas9은 RNA-유도 재조합효소로서 기능하도록 유전자 조작될 수도 있으며, RNA 테더를 통해 다중 단백질과 핵산 복합체의 조립을 위한 스캐폴드의 역할을 할 수 있다(Mali et al. 2013 Nature Methods Vol. 10 : 957-963).
본원에 사용된 용어 "가이드 폴리뉴클레오티드"는 Cas 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있고, Cas 엔도뉴클레아제가 DNA 표적 부위를 인식하고 거기에 결합하고, 선택적으로 절단할 수 있게 하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 단일 분자 또는 이중 분자일 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드 서열은 RNA 서열(가이드 RNA, gRNA라고 함), DNA 서열, 또는 이의 조합(RNA-DNA 조합 서열)일 수 있다. 선택적으로, 가이드 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 뉴클레오티드, 포스포디에스테르 결합 또는 연결 변형, 예컨대, 고정 핵산(LNA), 5-메틸 dC, 2,6-디아미노퓨린, 2'-플루오로 A, 2'-플루오로 U, 2'-O-메틸 RNA, 포스포로티오에이트 결합, 콜레스테롤 분자에 대한 연결, 폴리에틸렌 글리콜 분자에 대한 연결, 스페이서 18(헥사에틸렌 글리콜 사슬) 분자에 대한 연결, 또는 고리화를 초래하는 5'에서 3'으로의 공유 연결을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 단독으로 리보핵산을 포함하는 가이드 폴리뉴클레오티드는 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"라고도 지칭된다(그 전체가 본원에 참조로 포함되는, 2015년 3월 19일 공개된 미국 특허 출원 US 2015-0082478 A1 및 2015년 2월 26일 공개된 US 2015-0059010 A1을 또한 참조).
가이드 폴리뉴클레오티드는 cr뉴클레오티드 서열 및 tracr뉴클레오티드 서열을 포함하는 이중 분자(듀플렉스 가이드 폴리뉴클레오티드라고도 함)일 수 있다. cr뉴클레오티드는 표적 DNA의 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 제1 뉴클레오티드 서열 도메인(가변 표적화 도메인 또는 VT 도메인이라고 함) 및 Cas 엔도뉴클레아제 인식(CER) 도메인의 일부인 제2 뉴클레오티드 서열(tracr 메이트 서열이라고도 함)을 포함한다. tracr 메이트 서열은 상보성 영역을 따라 tracr뉴클레오티드에 혼성화될 수 있고, 함께 Cas 엔도뉴클레아제 인식 도메인 또는 CER 도메인을 형성할 수 있다. CER 도메인은 Cas 엔도뉴클레아제 폴리펩티드와 상호작용할 수 있다. 듀플렉스 가이드 폴리뉴클레오티드의 cr뉴클레오티드 및 tracr뉴클레오티드는 RNA, DNA, 및/또는 RNA-DNA-조합 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 듀플렉스 가이드 폴리뉴클레오티드의 cr뉴클레오티드 분자는 "crDNA"(연속된 DNA 뉴클레오티드들로 구성되는 경우) 또는 "crRNA"(연속된 RNA 뉴클레오티드들로 구성되는 경우) 또는 "crDNA-RNA"(DNA와 RNA 뉴클레오티드의 조합으로 구성되는 경우)로 지칭된다. cr뉴클레오티드는 박테리아 및 고세균에서 자연적으로 발생하는 crRNA의 단편을 포함할 수 있다. 박테리아 및 고세균에서 자연적으로 발생하고 본원에 개시된 cr뉴클레오티드에 존재할 수 있는 crRNA의 단편의 크기는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 뉴클레오티드 범위를 가질 수 있지만, 이들 범위에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, tracr뉴클레오티드는 "tracrRNA"(연속된 RNA 뉴클레오티드들로 구성되는 경우) 또는 "tracrDNA"(연속된 DNA 뉴클레오티드들로 구성되는 경우) 또는 "tracrDNA-RNA"(DNA와 RNA 뉴클레오티드의 조합으로 구성되는 경우)로 지칭된다. 일 구현예에서, RNA/Cas9 엔도뉴클레아제 복합체를 가이드하는 RNA는 듀플렉스 crRNA-tracrRNA를 포함하는 듀플렉스 RNA이다. tracrRNA(트랜스-활성화 CRISPR RNA)는 5'에서 3' 방향으로 (i) CRISPR II형 crRNA의 반복 영역과 어닐링하는 서열 및 (ii) 스템 루프 수용부를 포함한다(Deltcheva et al., Nature 471:602-607). 듀플렉스 가이드 폴리뉴클레오티드는 Cas 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있으며, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체(가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 시스템이라고도 함)는 Cas 엔도뉴클레아제를 게놈 표적 부위로 유도하여 Cas 엔도뉴클레아제가 표적 부위를 인식하고 거기에 결합하고, 선택적으로 닉킹 또는 절단(단일 또는 이중 가닥 절단의 도입)할 수 있게 할 수 있다(그 전체가 본원에 참조로 포함되는, 2015년 3월 19일 공개된 미국 특허 출원 US 2015-0082478 A1 및 2015년 2월 26일 공개된 US 2015-0059010 A1을 또한 참조).
가이드 폴리뉴클레오티드는 tracr뉴클레오티드 서열에 연결된 cr뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 분자(단일 가이드 폴리뉴클레오티드라고도 함)일 수도 있다. 단일 가이드 폴리뉴클레오티드는 표적 DNA의 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 제1 뉴클레오티드 서열 도메인(가변 표적화 도메인 또는 VT 도메인이라고 함) 및 Cas 엔도뉴클레아제 폴리펩티드와 상호작용하는 Cas 엔도뉴클레아제 인식 도메인(CER 도메인)을 포함한다. "도메인"은 RNA, DNA, 및/또는 RNA-DNA 조합 서열일 수 있는 뉴클레오티드들이 연속되어 있는 것을 의미한다. 단일 가이드 폴리뉴클레오티드의 VT 도메인 및/또는 CER 도메인은 RNA 서열, DNA 서열, 또는 RNA-DNA-조합 서열을 포함할 수 있다. cr뉴클레오티드 및 tracr뉴클레오티드로부터의 서열들로 구성되는 단일 가이드 폴리뉴클레오티드는 "단일 가이드 RNA"(연속된 RNA 뉴클레오티드들로 구성되는 경우) 또는 "단일 가이드 DNA"(연속된 DNA 뉴클레오티드들로 구성되는 경우) 또는 "단일 가이드 RNA-DNA"(RNA와 DNA 뉴클레오티드의 조합으로 구성되는 경우)로 지칭될 수 있다. 단일 가이드 폴리뉴클레오티드는 Cas 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있으며, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체(가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 시스템이라고도 함)는 Cas 엔도뉴클레아제를 게놈 표적 부위로 유도하여 Cas 엔도뉴클레아제가 표적 부위를 인식하고 거기에 결합하고, 선택적으로 닉킹 또는 절단(단일 또는 이중 가닥 절단의 도입)할 수 있게 할 수 있다(그 전체가 본원에 참조로 포함되는, 2015년 3월 19일 공개된 미국 특허 출원 US 2015-0082478 A1 및 2015년 2월 26일 공개된 US 2015-0059010 A1을 또한 참조).
용어 "가변 표적화 도메인" 또는 "VT 도메인"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이중 가닥 DNA 표적 부위의 한 가닥(뉴클레오티드 서열)에 혼성화될 수 있는(상보적인) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제1 뉴클레오티드 서열 도메인(VT 도메인)과 표적 서열 사이의 백분율 상보성은 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 가변 표적화 도메인은 적어도 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 가변 표적화 도메인은 연속된 12개 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 가변 표적화 도메인은 DNA 서열, RNA 서열, 변형된 DNA 서열, 변형된 RNA 서열, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성될 수 있다.
용어 (가이드 폴리뉴클레오티드의) "Cas 엔도뉴클레아제 인식 도메인" 또는 "CER 도메인"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, Cas 엔도뉴클레아제 폴리펩티드와 상호작용하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. CER 도메인은 tracr뉴클레오티드 메이트 서열 다음에 tracr뉴클레오티드 서열을 포함한다. CER 도메인은 DNA 서열, RNA 서열, 변형된 DNA 서열, 변형된 RNA 서열(예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는, 2015년 2월 26일 공개된 US 2015-0059010 A1 참조), 또는 이의 임의의 조합으로 구성될 수 있다.
단일 가이드 폴리뉴클레오티드의 cr뉴클레오티드 및 tracr뉴클레오티드를 연결하는 뉴클레오티드 서열은 RNA 서열, DNA 서열, 또는 RNA-DNA 조합 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 단일 가이드 폴리뉴클레오티드의 cr뉴클레오티드 및 tracr뉴클레오티드를 연결하는 뉴클레오티드 서열은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 다른 구현예에서, 단일 가이드 폴리뉴클레오티드의 cr뉴클레오티드 및 tracr뉴클레오티드를 연결하는 뉴클레오티드 서열은 테트라루프 서열, 예컨대, GAAA 테트라루프 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
가이드 폴리뉴클레오티드, VT 도메인 및/또는 CER 도메인의 뉴클레오티드 서열 변형은 5' 캡, 3' 폴리아데닐화 테일, 리보스위치 서열, 안정성 조절 서열, dsRNA 듀플렉스를 형성하는 서열, 가이드 폴리뉴클레오티드를 세포내 위치에 표적화하는 변형 또는 서열, 트랙킹을 제공하는 변형 또는 서열, 단백질을 위한 결합 부위를 제공하는 변형 또는 서열, 잠김 핵산(Locked Nucleic Acid, LNA), 5-메틸 dC 뉴클레오티드, 2,6-디아미노퓨린 뉴클레오티드, 2'-플루오로 A 뉴클레오티드, 2'-플루오로 U 뉴클레오티드; 2'-O-메틸 RNA 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 결합, 콜레스테롤 분자에 대한 연결, 폴리에틸렌 글리콜 분자에 대한 연결, 스페이서 18 분자에 대한 연결, 5'에서 3'으로의 공유 연결, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 변형은 적어도 하나의 추가적인 유익한 특징을 가져올 수 있고, 여기서 추가적인 유익한 특징은 변형 또는 조절된 안정성, 세포 내 표적화, 추적, 형광 표지, 단백질 또는 단백질 복합체에 대한 결합 부위, 상보적인 표적 서열에 대한 변형된 결합 친화도, 세포 분해에 대한 변형된 저항성, 및 증가된 세포 투과성의 군으로부터 선택된다.
용어 가이드 RNA, crRNA 또는 tracrRNA의 "기능적 단편", "기능적으로 동등한 단편" 및 "기능적 동등 단편"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 각각 가이드 RNA, crRNA 또는 tracrRNA로서 기능하는 능력이 유지되는 가이드 RNA, crRNA 또는 tracrRNA의 일부 또는 하위서열을 각각 지칭한다.
용어 가이드 RNA, crRNA 또는 tracrRNA의 "기능적 변이체", "기능적으로 동등한 변이체" 및 "기능적 동등 변이체"는 (각각) 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 각각 가이드 RNA, crRNA 또는 tracrRNA로서 기능하는 능력이 유지되는 가이드 RNA, crRNA 또는 tracrRNA의 변이체를 각각 지칭한다.
용어 "단일 가이드 RNA", "gRNA" 및 "sgRNA"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, tracrRNA(트랜스-활성화 CRISPR RNA)에 융합된, (tracrRNA에 혼성화하는 tracr 메이트 서열에 연결된) 가변 표적화 도메인을 포함하는 crRNA(CRISPR RNA)인, 2개의 RNA 분자의 합성 융합에 관한 것이다. 단일 가이드 RNA는 II형 Cas 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있는 II형 CRISPR/Cas 시스템의 crRNA 또는 crRNA 단편 및 tracrRNA 또는 tracrRNA 단편을 포함할 수 있고, 상기 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 Cas 엔도뉴클레아제를 DNA 표적 부위로 유도하여 Cas 엔도뉴클레아제가 DNA 표적 부위를 인식하고 거기에 결합하고, 선택적으로 닉킹 또는 절단(단일 또는 이중 가닥 절단의 도입)할 수 있게 할 수 있다.
용어 "가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체", "가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 시스템", "가이드 RNA/Cas 복합체", "가이드 RNA/Cas 시스템", "gRNA/Cas 복합체", "gRNA/Cas 시스템", "RNA-유도 엔도뉴클레아제", "RGEN"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 복합체를 형성할 수 있는 적어도 하나의 RNA 성분 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 지칭하며, 상기 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 Cas 엔도뉴클레아제를 DNA 표적 부위로 유도하여 Cas 엔도뉴클레아제가 DNA 표적 부위를 인식하고 거기에 결합하고, 선택적으로 닉킹 또는 절단(단일 또는 이중 가닥 절단의 도입)할 수 있게 할 수 있다. 본원의 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 알려진 CRISPR 시스템(Zetsche et al., 2015, Cell 163, 1-13; Shmakov et al., 2015, Molecular_Cell 60, 1-13; Makarova et al. 2015, Nature Reviews Microbiology Vol. 13:1-15; Horvath and Barrangou, Science 327:167-170), 예컨대 I형, II형, 또는 III형 CRISPR 시스템 중 임의의 것의 적합한 RNA 성분(들) 및 Cas 단백질(들)을 포함할 수 있다. 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 II형 Cas9 엔도뉴클레아제 및 적어도 하나의 RNA 성분(예컨대, crRNA 및 tracrRNA, 또는 gRNA)을 포함할 수 있다(그 전체가 본원에 참조로 포함되는, 2015년 3월 19일 공개된 미국 특허 출원 US 2015-0082478 A1 및 2015년 2월 26일 공개된 US 2015-0059010 A1을 또한 참조).
Cas 엔도뉴클레아제는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 일시적 도입 방법, 형질감염, 미세주입, 및/또는 국소 처리법에 의해 또는 재조합효소를 통해 간접적으로 세포에 도입(제공)될 수 있다. 식물 세포는 식물 세포로의 Cas9 엔도뉴클레아제의 직접 전달에 대한 장벽으로 작용할 수 있는 식물 세포벽을 포함한다는 점에서 인간 및 동물 세포와 다르다. Cas9 엔도뉴클레아제를 암호화하는 재조합 DNA 작제물은 식물 세포에 성공적으로 도입되어(Svitashev et al., Plant Physiology, 2015, Vol. 169, pp. 931-945) 표적 부위에서의 게놈 편집을 가능하게 하였다. 식물 세포에 재조합 DNA 작제물을 안정적으로 도입하는 데 있어 하나의 가능한 단점은 Cas9 엔도뉴클레아제의 지속적인 존재가 표적 이탈 효과를 증가시킬 수 있다는 점이다.
본원에 기술된 바와 같이, 식물 세포로의 Cas 엔도뉴클레아제의 직접 전달은 입자 매개 전달을 통해 달성될 수 있다. 본원에 기술된 실험에 기초하여, 당업자는 이제 임의의 다른 직접적인 전달 방법, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개 원형질체로의 형질감염, 휘스커 매개 전달, 전기천공, 유전자총, 세포 침투성 펩티드, 또는 메조포러스 실리카 나노입자(MSN) 매개 직접 단백질 전달이 식물 세포에서 Cas9 엔도뉴클레아제를 전달하기 위해 성공적으로 이용될 수 있음을 구상할 수 있다.
Cas 엔도뉴클레아제의 직접 전달(Cas 엔도뉴클레아제의 DNA 프리 전달이라고도 함)은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 Cas 단백질, Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 mRNA, 및/또는 (리보뉴클레오티드-단백질 복합체로서) RNA 유도 엔도뉴클레아제 리보뉴클레오티드-단백질 복합체(RGEN) 자체를 세포에 도입함으로써 달성될 수 있다. Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 mRNA를 통한 또는 폴리펩티드 분자를 통한 Cas 엔도뉴클레아제의 직접 전달은 어떤 DNA 분자도 Cas 엔도뉴클레아제 단백질의 생산에 관여하지 않기 때문에 본원에서 Cas 엔도뉴클레아제의 DNA 프리 전달로도 지칭된다. 마찬가지로, RNA 분자로서 가이드 RNA의 직접 전달은 본원에서 가이드 RNA의 DNA 프리 전달로도 지칭된다. 마찬가지로, 리보뉴클레오티드-단백질 복합체로서 가이드 RNA/엔도뉴클레아제 복합체 자체(RGEN)의 직접 전달은 본원에서 RGEN의 DNA 프리 전달로도 지칭된다.
단백질로서, 또는 gRNA와 함께 mRNA 분자로서, 또는 RGEN 리보뉴클레오티드-단백질 자체로서 Cas 엔도뉴클레아제를 직접 도입하는 것은 표적 부위에서의 게놈 편집 후 RGEN 복합체가 빠르게 분해되고, 복합체가 세포에 일시적으로만 존재할 수 있게 하며, 이는 (실시예 12에 기술된 바와 같이) 표적 이탈 효과의 감소로 이어진다.
이러한 성분들의 직접 전달은 RGEN 성분을 수용하는 세포의 강화 및/또는 시각화를 촉진할 수 있는 다른 mRNA의 직접 전달(공동 전달)에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 형광 단백질(예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 적색, 녹색, 황색, 청색 또는 이들의 조합)과 같은 선별 가능한 시각적 마커를 암호화하는 mRNA의 전달은 파괴된 비기능성 유전자의 복구 산물의 직접 선택 대신에, 또는 그와 결합하여 사용될 수도 있다.
복원된 뉴클레오티드 서열이 기능성 유전자 산물을 암호화하도록 파괴 유전자의 뉴클레오티드 서열을 복원하여 비기능성 유전자 산물의 기능을 복원하는 방법이 본원에 기술된다.
파괴된 유전자는 그 유전자 산물이 그 기능을 상실하도록(비기능성 유전자 산물이라고 함) 또는 파괴되지 않은 해당 유전자(비파괴 유전자라고도 함)의 산물에 비해 감소된 기능을 갖도록 변형(파괴)된 유전자를 지칭한다. 예를 들어, 기능성 폴리펩티드 또는 단백질을 위해 암호화하는 유전자는 파괴된 유전자의 번역 산물이 그 기능을 상실했거나 감소된 기능을 갖는 폴리펩티드를 생성하도록 파괴(변형)될 수 있다.
기능성 유전자 산물은 생물학적 또는 비생물학적 기능을 갖는 기능성 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다.
비기능성 유전자 산물은 파괴된 유전자의 유전자 산물에 대한 언급을 포함한다. 비기능성 유전자 산물은 그 기능을 상실했거나(기능의 부재) 해당 비파괴 유전자의 유전자 산물에 비해 감소된 기능을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 세포의 게놈 내 비기능성 유전자 산물에 대한 기능을 복원하는 방법으로서, 게놈 내 파괴된 유전자를 포함하는 세포에 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 도입하는 단계를 포함하되, 상기 복합체는 이중 가닥 절단을 생성하고, 상기 파괴된 유전자는 기능성 유전자 산물을 암호화하지 않고, 상기 파괴된 유전자는 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 상기 기능성 유전자 산물을 암호화할 수 있는 비파괴 유전자로 복원되는 방법을 포함한다. 파괴된 유전자는 해당 비파괴 유전자와 비교할 때 PAM 서열의 상류(5') 네 번째 뉴클레오티드의 염기쌍 결실을 포함하고, 상기 염기쌍 결실은 파괴된 유전자의 유전자 산물에서 아미노산 프레임이동을 생성함으로써, 파괴된 유전자의 유전자 산물을 비기능적 상태로 만든다. 염기쌍 결실은 코돈 서열의 제1, 제2 또는 제3 뉴클레오티드일 수 있다. 복원은 이중 가닥 절단 부위에 단일 염기를 삽입시키는 비상동 말단 연결(NHEJ)에 의해 달성될 수 있거나, 상동 재조합 또는 상동성 유도 복구를 이용하지 않고 이중 가닥 절단 부위에 단일 염기를 삽입하여 달성될 수 있다.
(예를 들어, RGEN 성분 또는 RGEN 복합체 자체를 세포에 전달함으로써) NHEJ에 의해 유전자 기능을 복원하는 것과 동시에, 다른 가이드-폴리뉴클레오티드를 동시 첨가함으로써 다른 표적의 변형이 달성될 수 있다. (NHEJ에 의한 유전자 기능의 복원을 위한 표적 외에) 이러한 다른 표적은 유전자이식 유전자좌를 포함하는 게놈 내 임의의 표적일 수 있다. 하나의 gRNA가 (예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 제초제 내성을 부여하는) NHEJ를 통해 선택 마커를 표적화 및 활성화하고, 다른 gRNA(들)가 표적화된 돌연변이유발, 결실, 유전자 편집, 또는 부위 특이적 형질 유전자 삽입을 용이하게 할 수 있고 선택 마커와 다른 표적 부위(들)에서 DSB(들)를 촉진할 경우, 둘 이상의 gRNA의 동시 전달 접근법은 다른 모든 필요한 성분(Cas9, gRNA)이 단백질 및/또는 시험관내 전사 RNA 분자의 형태로 전달될 수 있기 때문에 완전히 일시적인 표적화 게놈 변형을 가능하게 할 수 있다.
파괴된 유전자는 그 유전자 산물이 그 기능을 상실하도록(예를 들어, 제초제 파괴 선택 마커 유전자의 경우, 파괴된 유전자는 더 이상 제초제 저항성을 부여하지 않음) 변형(파괴)된 마커 유전자(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 표현형 마커 유전자 및 선택 마커 유전자)에 대한 언급을 포함한다.
선택 마커 또는 선별 마커는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 종종 특정 조건 하에서, 이를 포함하는 분자 또는 세포를 동정할 수 있게 하거나, 그 분자 또는 세포를 선택할 수 있게 하거나, 그 분자 또는 세포에 대해 선택할 수 있게 하는 DNA 분절(예컨대, 선택 마커 유전자)에 대한 언급을 포함한다. 이들 마커는 활성, 예컨대, RNA, 펩티드, 또는 단백질의 생산(그러나 이에 한정되는 것은 아님)을 인코딩할 수 있거나, RNA, 펩티드, 단백질, 무기 및 유기 화합물 또는 조성물 등에 대한 결합 부위를 제공할 수 있다. 선택 마커는, 유전자가 변형되거나 녹아웃되었을 때 세포에 속성을 생성하여 해당 속성을 포함하는 세포를 동정하거나, 그 세포를(또는 그 세포에 대해) 선택할 수 있게 하는 유전자를 더 포함한다.
일 양태에서, 선택 마커는, 예를 들어, 선택 마커를 포함하지 않는 세포 또는 조직을 억제하거나 죽이기 위해 선택적 제제(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 항생제 또는 제초제)가 사용되고, 선택 마커 유전자를 포함하는 세포 또는 조직이 선택 마커 유전자의 발현으로 인해 계속 성장하는, 선택 설계를 적용함으로써 세포의 선택을 가능하게 한다.
일 양태에서, 선택 마커는, 예를 들어, 시각적 마커를 포함하는 세포를 선택하기 위해 시각적 마커(예컨대, 형광 분자)가 사용되는 선택 설계를 적용함으로써 세포의 시각적 선택을 가능하게 한다.
선택 마커 유전자는 클로르설푸론 저항성 유전자, 포스포만노오스 이소머라아제 유전자(PMI), 비알라포스 저항성 유전자(BAR), 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제(PAT) 유전자, 히그로마이신 저항성 유전자(NPTII), 글리포세이트 저항성 유전자, 제한 효소 부위를 포함하는 DNA 분절; 스펙티노마이신, 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 바스타, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II(NEO) 및 히그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(HPT)와 같은 항생제를 포함하는 독성 화합물에 대해 저항성을 제공하는 생성물을 암호화하는 DNA 분절; 수용 세포에서 결여되어 있는 생성물을 암호화하는 DNA 분절(예를 들어, tRNA 유전자, 영양요구성 마커); 용이하게 동정될 수 있는 생성물을 암호화하는 DNA 분절(시각적 마커 유전자라고 함. 시각적 마커 유전자는 형광 마커 유전자, 예컨대, 적색 형광 마커 유전자, 청색 형광 마커 유전자, 녹색 형광 마커 유전자, 황색 형광 마커 유전자에 대한 언급을 포함함), DsRED, RFP, 적색 형광 단백질, CFP, GFP, 녹색 형광 단백질을 암호화하는 유전자, 및 β-갈락토시다아제, GUS와 같은 표현형 마커; 녹색 형광 단백질(GFP), 시안(CFP), 황색(YFP), 적색(RFP), 및 세포 표면 단백질과 같은 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 선택 마커 유전자는 PCR을 위한 새로운 프라이머 부위의 생성(예컨대, 이전에는 나란히 놓여있지 않았던 두 DNA 서열의 병치), 제한 엔도뉴클레아제 또는 기타 DNA 변형 효소, 화학물질 등에 의해 영향 받지 않거나 영향 받는 DNA 서열의 포함; 및 동정을 가능하게 하는 특이적인 변형(예컨대, 메틸화)에 필요한 DNA 서열의 포함을 더 포함한다.
추가적인 선택 마커는 제초제 화합물, 예컨대, 글루포시네이트 암모늄, 브로목시닐, 이미다졸리논 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트(2,4-D)에 대해 저항성을 부여하는 유전자를 포함한다. 예를 들어, Yarranton, (1992) Curr Opin Biotech 3:506-11; Christopherson et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-8; Yao et al., (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff, (1992) Mol Microbiol 6:2419-22; Hu et al., (1987) Cell 48:555-66; Brown et al., (1987) Cell 49:603-12; Figge et al., (1988) Cell 52:713-22; Deuschle et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-4; Fuerst et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-53; Deuschle et al., (1990) Science 248:480-3; Gossen, (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-21; Labow et al., (1990) Mol Cell Biol 10:3343-56; Zambretti et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-6; Baim et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-6; Wyborski et al., (1991) Nucleic Acids Res 19:4647-53; Hillen and Wissman, (1989) Topics Mol Struc Biol 10:143-62; Degenkolb et al., (1991) Antimicrob Agents Chemother 35:1591-5; Kleinschnidt et al., (1988) Biochemistry 27:1094-104; Bonin, (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-51; Oliva et al., (1992) Antimicrob Agents Chemother 36:913-9; Hlavka et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al., (1988) Nature 334:721-4 참조.
표현형 마커 유전자는, 양성의 선택 마커든 음성의 선택 마커든 시각적 마커를 포함하는 선별 또는 선택 마커를 암호화하는 유전자를 포함한다. 임의의 표현형 마커가 사용될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 표현형 및 선택 마커 유전자는 비기능성 유전자 산물을 암호화하는 파괴된 유전자로서 식물 세포에 도입되도록 변형될 수 있고, 가이드 RNA 도입 및 DNA 복구에 의해, 기능성 유전자 산물을 암호화하는 비파괴 유전자로 복원하기 위한 엔도뉴클레아제를 유도하는 이중 가닥 절단에 의해 표적으로서 이용될 수 있다.
파괴될 표현형 또는 선택 마커 유전자는 이전에 세포에 도입되어 세포의 게놈에 안정적으로 통합된 마커 유전자일 수 있다. 이러한 미리 통합된 선택 마커 유전자는 다른 유전자, 예를 들어, 세포 발육 강화 유전자(ZmODP2 및 ZmWUS, 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는, 2016년 8월 26일 출원된 PCT/US16/49144 및 2016년 8월 26일 출원된 PCT/US16/49128 참조)로 보완될 수도 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 표현형 및 선택 마커 유전자는 식물 세포에 파괴된 유전자(불활성 형태)로서 도입되도록 변형될 수 있고, 가이드 RNA 도입 및 복구에 의한 복원(재활성화)을 위해 엔도뉴클레아제를 도입하는 이중 가닥 절단에 의해 표적으로서 사용될 수 있다.
화합물에 대한 저항성을 부여하거나, 내인성 또는 이전에 통합된 마커 유전자 또는 그 유전자 산물이 마커로서 사용되도록 할 수 있는 표현 마커 유전자(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만 ALS, EPSPS, BAR)가 본원에 기술되고, 이는 본원에 기술된 바와 같이 불활성 형태로 변형된 다음 가이드 RNA 도입 및 복구에 의한 재활성화를 위한 표적으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법으로서, 표적 부위 및 파괴된 선택 마커 유전자를 포함하는 적어도 하나의 세포에 제1 가이드 RNA, Cas 엔도뉴클레아제, 및 적어도 제2 가이드 RNA를 도입하되, 상기 제1 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 파괴된 선택 마커 유전자에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 제1 복합체를 형성할 수 있고, 상기 파괴된 선택 마커 유전자는 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 기능성 선택 마커 단백질을 암호화할 수 있는 비파괴 선택 마커 유전자로 복원되고, 상기 제2 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 위치한 상기 표적 부위를 인식하고, 거기에 결합하고, 닉킹 또는 절단할 수 있는 제2 복합체를 형성할 수 있는 단계; 및 상기 뉴클레오티드 서열의 변형을 갖는 세포를 상기 기능성 선택 마커 단백질에 의해 또는 그에 기초하여 선택하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 선택은 상기 기능성 선택 마커 단백질을 발현하는 세포(예컨대, 식물 세포, 또는 상기 식물 세포로부터 유래된 식물)에 화학물질을 제공하는 것을 포함할 수 있고, 상기 기능성 선택 마커 단백질은 세포(예컨대 식물 세포, 또는 상기 식물 세포로부터 유래된 식물)가 상기 화학물질에 대해 저항성을 갖도록 한다. 게놈 내 원하는 변형을 포함하는 세포 또는 생물을 선택하기 위해 화학물질은 세포의 임의의 발육 단계 동안(식물 세포의 경우, 식물 세포 또는 식물의 발육의 임의의 단계 동안) 제공될 수 있다. 또한, 선택은 상기 기능성 선택 마커 단백질의 발현으로부터 유래하는 시각적 마커의 존재에 대한 세포(예컨대, 식물 세포, 또는 상기 식물 세포로부터 유래된 식물)의 선별을 포함한다.
예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 상기 방법은 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법으로서, 표적 부위 및 파괴된 저항성 ALS 마커 유전자를 포함하는 적어도 하나의 세포에 제1 가이드 RNA, Cas 엔도뉴클레아제, 및 적어도 제2 가이드 RNA를 도입하되, 상기 제1 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 파괴된 저항성 ALS 마커 유전자에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 제1 복합체를 형성할 수 있고, 상기 파괴된 저항성 ALS 마커 유전는 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 클로르설푸론에 대한 저항성을 부여하는 기능적 저항성 ALS 단백질 단백질을 암호화할 수 있는 비파괴 저항성 ALS 마커 유전자로 복원되고, 상기 제2 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 위치한 상기 표적 부위를 인식하고, 거기에 결합하고, 닉킹 또는 절단할 수 있는 제2 복합체를 형성할 수 있는 단계; 및 상기 뉴클레오티드 서열의 변형을 갖는 세포를 클로르설푸론에 대한 저항성을 부여하는 상기 저항성 ALS 단백질에 의해 또는 그에 기초하여 선택하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다. 게놈 내 원하는 변형을 포함하는 식물 세포 또는 식물을 선택하기 위해 선택 단계는 식물 세포 또는 식물의 발육 중의 임의의 단계에 식물 세포 또는 상기 식물 세포로부터 유래된 식물에 클로르설푸론을 제공하는 단계를 포함할 수 있다.
도입 및 선택 단계는 선택 마커 유전자를 포함하는 재조합 DNA 작제물과 같은 선택 마커 유전자의 도입을 포함하지 않는다. 파괴된 선택 마커 유전자는 파괴된 시각적 마커 유전자를 비롯한 임의의 파괴된 마커 유전자일 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열의 변형은 상기 표적 부위에서의 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 또는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 방법은 상기 세포에 폴리뉴클레오티드 변형 주형 또는 공여 DNA를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드 변형 주형은 상기 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형을 포함하고, 상기 공여 DNA는 상기 표적 부위에 삽입될 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
임의의 유도 엔도뉴클레아제가 본원에 개시된 방법에 이용될 수 있다. 이러한 엔도뉴클레아제는 Cas 및 Cpf1 엔도뉴클레아제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 PAM 서열을 인식할 수 있고(예를 들어, 2015년 5월 15일 출원된 미국 특허 출원 62/162377 및 2015년 5월 15일 출원된 62/162353 및 Zetsche B et al. 2015. Cell 163, 1013 참조), 특정 위치에서 표적 DNA를 절단할 수 있는 많은 엔도뉴클레아제가 지금까지 기술되었다. 유도 Cas 시스템을 활용하는 본원에 기술된 방법 및 구현예를 기초로, 이제는 임의의 유도 엔도뉴클레아제 시스템을 활용할 수 있도록 이들 방법을 조정할 수 있다는 것이 이해된다. 예를 들어, 본원에 기술된 세포의 게놈 내 비기능성 유전자 산물에 대한 기능을 복원하는 방법을, 유도 Cas 엔도뉴클레아제 복합체 대신 유도 Cpf1 엔도뉴클레아제 복합체를 도입하여 파괴된 유전자를 복원하는 단계 및 기능성 유전자 산물을 생성하는 단계를 포함하는 방법에 응용하는 것을 구상할 수 있다. 본원에 개시된 방법에 사용되는 다른 유도 엔도뉴클레아제 및 뉴클레오티드-단백질 복합체는 WO 2013/088446에 기술된 것들을 포함한다.
엔도뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드 사슬 내 포스포디에스테르 결합을 절단하는 효소로서, 염기를 손상시키지 않고 특정 부위에서 DNA를 절단하는 제한 엔도뉴클레아제를 포함한다. 제한 엔도뉴클레아제는 I형, II형, III형, 및 IV형 엔도뉴클레아제를 포함하고, 이들은 하위유형을 더 포함한다. I형 및 III형 시스템에서는, 메틸라아제 활성과 제한 활성 모두 단일 복합체에 포함된다. 엔도뉴클레아제는 호밍 엔도뉴클레아제(HEase)로도 알려진 메가뉴클레아제도 포함하는데, 이는 제한 엔도뉴클레아제처럼 특정 인식 부위에서 결합하고 절단하지만, 메가뉴클레아제에 대한 인식 부위는 약 18 bp 이상으로 일반적으로 더 길다(2012년 3월 22일 출원된 특허 출원 WO-PCT PCT/US12/30061). 메가뉴클레아제는 보존된 서열 모티프에 기초하여 4개의 계열로 분류되었는데, 그 계열은 LAGLIDADG, GIY-YIG, H-N-H, 및 His-Cys 박스 계열이다. 이들 모티프는 금속 이온의 조정 및 포스포디에스테르 결합의 가수분해에 관여한다. HEase는 긴 인식 부위, 및 DNA 기질에서 일부 서열 다형성에 내성이 있는 것으로 유명하다. 메가뉴클레아제에 대한 명명 규칙은 다른 제한 엔도뉴클레아제에 대한 규칙과 유사하다. 메가뉴클레아제는 또한, 독립형 ORF, 인트론, 및 인테인에 의해 각각 암호화되는 효소에 대한 접두사 F-, I-, 또는 PI-를 특징으로 한다. 재조합 프로세스에서 하나의 단계는 인식 부위 또는 그 근처에서의 폴리뉴클레오티드 절단을 포함한다. 이 절단 활성은 이중 가닥 절단을 생성하는 데 이용될 수 있다. 부위 특이적 재조합효소 및 그 인식 부위에 대한 검토를 위해서는 Sauer (1994) Curr Op Biotechnol 5:521-7; 및 Sadowski (1993) FASEB 7:760-7을 참조. 일부 예에서, 재조합효소는 인테그라아제 또는 레솔바아제 계열에 속한다.
TAL 이펙터 뉴클레아제는 식물 또는 다른 생물의 게놈 내 특정 표적 서열에서 이중 가닥 절단을 만들기 위해 사용될 수 있는 새로운 클래스의 서열 특이적 뉴클레아제이다(Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143-148). 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)는 징크 핑거 DNA 결합 도메인 및 이중 가닥 절단 유도제 도메인으로 이루어진 유전자 조작된 이중 가닥 절단 유도제이다. 인식 부위 특이성은 징크 핑커 도메인에 의해 부여되며, 이는 일반적으로 2, 3, 또는 4개의 징크 핑거를 포함하고, 예를 들어, C2H2 구조를 갖지만, 다른 징크 핑거 구조는 알려져 있고 유전자 조작되었다. 징크 핑거 도메인은 선택된 폴리뉴클레오티드 인식 서열에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 설계할 수 있다. ZFN은 비특이적 엔도뉴클레아제 도메인, 예를 들어, FokI와 같은 II형 엔도뉴클레아제로부터의 뉴클레아제 도메인에 연결된 유전자 조작된 DNA-결합 징크 핑거 도메인을 포함한다. 전사 활성물질 도메인, 전사 억제물질 도메인, 및 메틸라아제를 포함하여, 추가 기능이 징크 핑거 결합 도메인에 융합될 수 있다. 일부 예에서, 절단 활성을 위해 뉴클레아제 도메인의 이합체화가 요구된다. 각각의 징크 핑거는 표적 DNA에서 3개의 연속 염기쌍을 인식한다. 예를 들어, 뉴클레아제의 이합체화 요건 하에, 3-핑거 도메인은 9개 연속 뉴클레오티드의 서열을 인식하고, 18-뉴클레오티드 인식 서열을 결합시키는 데 두 세트의 징크 핑거 트리플렛이 사용된다.
DNA 이중 가닥 절단(DSB) 기술(ZFN, TALEN 및 CRISPR-Cas)은 학술 연구, 유전자 치료, 및 동물 및 식물 육종 프로그램에 폭넓게 응용된다. 이러한 기술은 옥수수, 밀, 대두 및 벼와 같은 주요 작물을 비롯한, 여러 식물 종에서 게놈 변형을 도입하는 데 성공적으로 이용되어 왔다. 식물 게놈 편집은 현재의 형질전환 및 게놈 변형 방법, DNA 전달 효율, 및 낮은 빈도의 식물 재생에 의해 제한된다. 인간 및 동물 시스템과 달리, 모든 식물 세포를 둘러싼 두꺼운 벽의 존재는 근본적으로 식물 형질전환 및 식물 유전자 변형 프로토콜에 영향을 미친다. 이 세포벽은 포유류 게놈 편집 실험에서 핵산 및/또는 단백질 전달에 광범위하게 사용되는 형질감염 또는 전기천공을 사용할 수 없게 한다. 이러한 이유로 인해, 식물 형질전환 및 식물 게놈 변형은 주로 DNA 벡터 상의 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 시약의 아그로박테리움 매개 전달 및 바이올리스틱 전달(탄도 전달)에 의존한다. 그 결과, gRNA 및 Cas9 발현 카세트는 종종 게놈에 통합되고, 잠재적으로 유전자 파괴, 식물 모자이크 현상, 및 잠재적인 부위 이탈 절단으로 이어진다. 이러한 원치 않는 2차 변화는 야생형 모체 식물에 대한 몇 차례의 여교배(backcrossing)에 의해 분리될 수 있지만, 이 과정은 특히, 배수체 게놈이 복잡하고 번식 주기가 긴, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 대두 및 밀과 같은 작물의 경우 시간 소모적일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, Cas 엔도뉴클레아제 및 gRNA를 RGEN 복합체 형태로 식물 세포 내에 전달하면 이러한 부작용들을 많이 완화할 수 있다(실시예 11 내지 12). 식물에서 RGEN 복합체의 전달에 의해 촉진되는 예기치 않은 높은 빈도의 NHEJ 매개 돌연변이유발은 실시예 10에 기술되어 있다. RGEN 복합체를 이용한 이러한 높은 빈도의 돌연변이유발을 감안할 때, DNA-프리 및 선택 마커-프리 유전자 변형은 유전자 녹아웃을 생성하는 실용적인 접근법이 될 수 있다. 이러한 DNA-프리 및 선택 마커-프리 접근법은 식물 체세포에서의 낮은 빈도의 HDR 경로로 인해, (NHEJ에 의한 유전자 돌연변이에 비해) 유전자 편집 및 유전자 삽입에 덜 실용적일 수 있다. 또한, DNA 분자는 종종 표적 DSB 부위에 통합되어, 유전자 편집, 특히 유전자 삽입의 효율을 감소시킨다. 식물 세포 내에 전달된 유전자(예를 들어, Cas9, gRNA, 선택 마커 유전자 및 형질 유전자)를 암호화하는 DNA 벡터는 동일한 DSB 부위에 공동으로 통합되는 경향이 있어, 부위 특이적 형질 유전자 삽입을 가진 이용 가능한 사건의 빈도를 급격히 줄이는 것으로 입증되었다. 전달 DNA 분자를 공여 DNA(예를 들어, 상동성 암을 가진 형질 유전자)로 제한하면 바람직한 유전자형을 가진 사건의 확률을 증가시킬 수 있다. 따라서, RGEN 전달시 활성화될 수 있는 파괴된(불활성) 내인성 또는 미리 통합된 선택 마커 유전자의 본원에 기술된 개념은 유전자 편집 및 유전자 삽입을 위한 DNA-프리 및 선택 마커-프리 접근법을 매우 실용적이 되도록 할 수 있다.
가이드 폴리뉴클레오티드는 당업계에 알려진 임의의 방법, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 유전자총, 휘스커 매개 형질전환, 아그로박테리움 형질전환 또는 국소 처리법을 이용하여 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드로서 세포에 직접 도입될 수 있다. 가이드 RNA는 세포에서 가이드 RNA를 전사시킬 수 있는 특정 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 가이드 RNA를 암호화하는 이종 핵산 단편을 포함하는 재조합 DNA 분자를 (이에 한정되는 것은 아니지만, 유전자총 또는 아그로박테리움 형질전환과 같은 방법을 통해) 도입함으로써 세포에 간접적으로 도입될 수도 있다. 특정 프로모터는 정확하게 정의된 변형되지 않은 5'-말단 및 3'-말단을 갖는 RNA의 전사를 가능하게 하는 RNA 중합효소 III 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다(DiCarlo et al., Nucleic Acids Res. 41: 4336-4343; Ma et al., Mol. Ther. Nucleic Acids 3:e161). 본원에 기술된 바와 같이, 식물 세포로의 sgRNA의 직접 전달은 입자 매개 전달을 통해 달성될 수 있다. 본원에 기술된 실험에 기초하여, 당업자는 이제 임의의 다른 직접적인 전달 방법, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개 원형질체로의 형질감염, 휘스커 매개 형질전환, 전기천공, 유전자총, 세포 침투성 펩티드, 또는 메조포러스 실리카 나노입자(MSN) 매개 직접 단백질 전달이 식물 세포에서 gRNA를 전달하기 위해 성공적으로 이용될 수 있음을 구상할 수 있다.
가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 폴리뉴클레오티드의 화학적 합성(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, Hendel et al. 2015, Nature Biotechnology 33, 985-989), 시험관내 생성 가이드 폴리뉴클레오티드, 및/또는 자가 스플라이싱 가이드 RNA(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, Xie et al. 2015, PNAS 112:3570-3575)를 비롯하여, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다.
용어 "표적 부위", "표적 서열", "표적 부위 서열", "표적 DNA", "표적 유전자좌", "게놈 표적 부위", "게놈 표적 서열", "게놈 표적 유전자좌" 및 "프로토스페이서"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체가 인식하고 결합하고 선택적으로 닉킹 또는 절단할 수 있는 세포 게놈 내 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 염색체, 에피솜, 유전자이식 유전자좌, 또는 임의의 다른 DNA 분자(염색체 DNA, 엽록체 DNA, 미토콘드리아 DNA, 플라스미드 DNA를 포함) 상의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 표적 부위는 세포 게놈 내의 내인성 부위일 수 있거나, 또는 대안적으로, 표적 부위가 세포에 이종이어서 세포의 게놈에서 자연 발생하지 않을 수 있거나, 또는 자연에서 일어나는 경우에 비해 이종 게놈 위치에서 표적 부위가 발견될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "내인성 표적 서열" 및 "고유 표적 서열"은 세포의 게놈에 내인성이거나 고유한 표적 서열로서, 세포 게놈 내 표적 서열의 내인성 또는 고유 위치에 있는 표적 서열을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 세포는 인간, 비인간, 동물, 박테리아, 진균, 곤충, 효모, 비통상적 효모 및 식물의 세포뿐만 아니라 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 식물 및 종자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. "인공 표적 부위" 또는 "인공 표적 서열"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 세포 게놈에 도입된 표적 서열을 지칭한다. 이러한 인공 표적 서열은 세포 게놈 내의 내인성 또는 고유 표적 서열과 동일한 서열일 수 있지만, 세포 게놈에서 상이한 위치(즉, 비내인성 또는 비고유한 위치)에 위치할 수 있다.
"변경된 표적 부위", "변경된 표적 서열", "변형된 표적 부위", "변형된 표적 서열"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 변경되지 않은 표적 서열에 비해 적어도 하나의 변경을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 표적 서열을 지칭한다. 이러한 "변경"은, 예를 들어, (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, (ii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, (iii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 또는 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합을 포함한다.
표적 DNA 서열(표적 부위)의 길이는 변할 수 있으며, 예를 들어, 길이가 적어도 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상 뉴클레오티드인 표적 부위를 포함한다. 표적 부위는 회문구조(palindromic)일 수도 있다. 즉, 한 가닥 상에 있는 서열은 상보적 가닥에서 반대 방향으로 동일하게 해독된다. 닉/절단 부위는 표적 서열 내에 존재할 수 있거나, 닉/절단 부위가 표적 서열 외부에 존재할 수 있다. 다른 변형예에서, 절단은 서로 바로 마주 보는 뉴클레오티드 위치에서 발생하여 블런트 엔드 컷을 생성할 수 있거나, 또는 다른 경우, 절개가 틀어져 5' 오버행 또는 3' 오버행일 수 있는, "접착성 말단"(sticky ends)이라고도 불리는, 단일 가닥 오버행을 생성할 수 있다. 게놈 표적 부위의 활성 변이체가 사용될 수도 있다. 이러한 활성 변이체는 주어진 표적 부위와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있고, 활성 변이체는 생물학적 활성을 보유함으로써 Cas 엔도뉴클레아제에 의해 인식되고 절단될 수 있다. 엔도뉴클레아제에 의한 표적 부위의 단일 또는 이중 가닥 절단을 측정하기 위한 분석법은 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 인식 부위를 포함하는 DNA 기질 상에서 작용제의 전체 활성 및 특이성을 측정한다.
본원의 "프로토스페이서 인접 모티프"(PAM)는 본원에 기술된 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 의해 인식(표적화)되는 표적 서열(프로토스페이서)에 인접한 짧은 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 표적 DNA 서열 다음에 PAM 서열이 없는 경우 Cas 엔도뉴클레아제는 표적 DNA 서열을 성공적으로 인식하지 않을 수 있다. 본원의 PAM의 서열과 길이는 사용되는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질 복합체에 따라 다를 수 있다. PAM 서열은 임의의 길이일 수 있지만, 일반적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드의 길이이다.
용어 "표적화", "유전자 표적화" 및 "DNA 표적화"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원의 DNA 표적화는 세포의 염색체 또는 플라스미드에서와 같은 특정 DNA 서열에서의 녹아웃, 편집, 또는 녹인의 특이적 도입일 수 있다. 일반적으로, DNA 표적화는 본원에서 Cas 단백질이 적합한 폴리뉴클레오티드 성분과 결합된 세포의 특정 DNA 서열에서 하나 또는 두 가닥을 절단함으로써 수행될 수 있다. 이러한 DNA 절단은, 이중 가닥 절단(DSB)의 경우 표적 부위에서 변형을 초래할 수 있는 NHEJ 또는 HDR 프로세스를 유도할 수 있다.
용어 "녹아웃", "유전자 녹아웃" 및 "유전적 녹아웃"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 녹아웃은 Cas 단백질로 표적화함으로써 부분적으로 또는 완전히 작동하지 않게 된 세포의 DNA 서열을 나타내며, 녹아웃 이전의 이러한 DNA 서열은, 예를 들어, 아미노산 서열을 암호화할 수 있었거나 조절 기능(예를 들어, 프로모터)을 가졌을 수 있다. 녹아웃은 삽입-결실(NHEJ를 통한 표적 DNA 서열에서의 뉴클레오티드 염기의 삽입 또는 결실)에 의해, 또는 표적화 부위 또는 그 근처에서 서열의 기능을 감소시키거나 완전히 파괴하는 서열의 특이적 제거에 의해 생성될 수 있다.
가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 공동으로 전달된 폴리뉴클레오티드 변형 주형과 조합하여 사용되어 관심 게놈 뉴클레오티드 서열의 편집(변형)을 가능하게 한다(그 전체가 본원에 참조로 포함되는, 2015년 3월 19일 공개된 미국 특허 출원 US 2015-0082478 A1 및 2015년 2월 26일 공개된 WO2015/026886 A1을 또한 참조).
"변형된 뉴클레오티드" 또는 "편집된 뉴클레오티드"는 변형되지 않은 뉴클레오티드 서열에 비해 적어도 하나의 변경을 포함하는 관심 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이러한 "변경"은, 예를 들어, (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, (ii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, (iii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 또는 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합을 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오티드 변형 주형"은 편집될 뉴클레오티드 서열에 비해 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드 변형은 적어도 하나의 뉴클레오티드 치환, 추가 또는 결실일 수 있다. 선택적으로, 폴리뉴클레오티드 변형 주형은 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형에 플랭킹한 상동 뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있고, 플랭킹한 상동 뉴클레오티드 서열은 편집될 원하는 뉴클레오티드 서열에 충분한 상동성을 제공한다.
폴리뉴클레오티드 변형 주형은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 일시적 도입 방법, 형질감염, 전기천공, 미세주입, 입자 매개 전달, 국소 처리법, 휘스커 매개 전달, 세포 침투성 펩티드를 통한 전달, 또는 메조포러스 실리카 나노입자(MSN) 매개 직접 전달에 의해 세포에 도입될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 변형 주형은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 분자로서, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자로서, 또는 원형 DNA(벡터 DNA)의 일부로서 세포에 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변형 주형은 또한 가이드 RNA 및/또는 Cas 엔도뉴클레아제에 테더링될 수 있다. 테더링된 DNA는, 게놈 편집 및 표적화된 게놈 조절에 유용한, 표적과 주형 DNA의 공동 국재화를 가능하게 할 수 있고, 내인성 HR 기구의 기능이 매우 약해질 것으로 예상되는 유사분열후 세포를 표적화하는 데에도 유용할 수 있다(Mali et al. 2013 Nature Methods Vol. 10 : 957-963). 폴리뉴클레오티드 변형 주형은 세포에 일시적으로 존재할 수 있거나, 바이러스성 레플리콘을 통해 도입될 수 있다.
편집될 뉴클레오티드는 Cas 엔도뉴클레아제에 의해 인식되고 절단되는 표적 부위 내에 또는 외부에 위치할 수 있다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형은 Cas 엔도뉴클레아제에 의해 인식되고 절단되는 표적 부위에서의 변형이 아니다. 다른 구현예에서, 편집될 적어도 하나의 뉴클레오티드와 게놈 표적 부위 사이에는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 900 또는 1000개의 뉴클레오티드가 존재한다.
게놈 편집은 이용 가능한 임의의 유전자 편집 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 유전자 편집은 숙주 세포의 게놈 내 유전자에 표적화된 변형을 포함하는 폴리뉴클레오티드 변형 주형(때로는 유전자 복구 올리고뉴클레오티드라고도 함)을 숙주 세포에 도입함으로써 수행될 수 있다. 이러한 방법에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드 변형 주형은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이러한 방법의 예는, 예를 들어, US 공개 2013/0019349호에 일반적으로 기술되어 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법으로서, 표적 부위 및 파괴된 선택 마커 유전자를 포함하는 적어도 하나의 세포에 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변형 주형, 제1 가이드 RNA, Cas 엔도뉴클레아제, 및 적어도 제2 가이드 RNA를 도입하되, 상기 제1 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 파괴된 선택 마커 유전자에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 제1 복합체를 형성할 수 있고, 상기 파괴된 선택 마커 유전자는 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 기능성 선택 마커 단백질을 암호화할 수 있는 비파괴 선택 마커 유전자로 복원되고, 상기 폴리뉴클레오티드 변형 주형은 상기 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형을 포함하고, 상기 제2 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 위치한 상기 표적 부위를 인식하고, 거기에 결합하고, 닉킹 또는 절단할 수 있는 제2 복합체를 형성할 수 있는 단계; 및 상기 뉴클레오티드 서열의 변형을 갖는 세포를 상기 기능성 선택 마커 단백질에 의해 선택하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 도입 및 선택 단계는 선택 마커 유전자를 포함하는 재조합 DNA 작제물과 같은 선택 마커 유전자의 도입을 포함하지 않는다. 파괴된 선택 마커 유전자는 파괴된 시각적 마커 유전자를 비롯한 임의의 파괴된 마커 유전자일 수 있다.
본원에 기술된 실험에 기초하여, 당업자는 이제 임의의 다른 직접적인 전달 방법, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개 원형질체로의 형질감염, 휘스커 매개 형질전환, 전기천공, 유전자총, 세포 침투성 펩티드, 또는 메조포러스 실리카 나노입자(MSN) 매개 직접 단백질 전달이 식물 세포에서 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 전달하기 위해 성공적으로 이용될 수 있음을 구상할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 편집은 원하는 변경에 가까운 게놈 내 정의된 위치에서 이중 가닥 절단(DSB)을 유도함으로써 용이하게 될 수 있다. DSB는, 이에 한정되는 것은 아니지만, TALEN, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 핵산 유도-엔도뉴클레아제 시스템, 예를 들어, Cas9-gRNA 시스템(박테리아 CRISPR-Cas 시스템 기반) 등을 포함하여 이용 가능한 임의의 DSB 유도제를 사용하여 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, DSB의 도입은 폴리뉴클레오티드 변형 주형의 도입과 결합될 수 있다.
DSB와 변형 주형을 결합한 게놈 서열 편집 방법은 일반적으로, 염색체 서열 내 표적 서열을 인식하고 게놈 서열에서 DSB를 유도할 수 있는 DSB 유도제, 또는 DSB 유도제를 암호화하는 핵산, 및 편집될 뉴클레오티드 서열에 비해 적어도 하나의 뉴클레오티드 변경을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 변형 주형은 적어도 하나의 뉴클레오티드 변경에 플랭킹한 뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있고, 플랭킹한 서열은 DSB에 플랭킹한 염색체 영역과 실질적으로 상동성이다. Cas9-gRNA 복합체와 같은 DSB 유도제를 이용한 게놈 편집은, 예를 들어, 2015년 3월 19일 공개된 미국 특허 출원 US 2015-0082478 A1, 2015년 2월 26일 공개된 WO2015/026886 A1, 2014년 7월 7일 출원된 미국 출원 62/023246, 및 2014년 8월 13일 출원된 미국 출원 62/036,652에 기술되었으며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다.
폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 편집하는 방법이 본원에 기술된다.
유도 Cas 엔도뉴클레아제 시스템 및 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 이용해 표적 서열 또는 표적 서열 근처의 관심 뉴클레오티드를 변형하는 유전자 편집은 비상동 말단 연결(NHEJ)의 빈도에 비해 식물 세포에서 더 낮은 빈도로 일어나는 상동 재조합/상동성 유도 복구(HDR) 메커니즘에 의존한다. HDR 유형의 메커니즘에 의존할 필요 없이 유전자 편집의 빈도를 증가시키는 것이 바람직할 것이다. 파괴된 유전자의 복원에 의존함으로써 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 유전자 편집을 가능하게 하는 방법으로서, 이중 가닥 절단 부위에 적어도 단일 염기를 삽입시키는 비상동 말단 연결(NHEJ)에 의해 복원이 달성되거나, 상동 재조합 또는 상동성 유도 복구를 이용하지 않고 이중 가닥 절단 부위에 적어도 단일 염기를 삽입하여 복원이 달성되는 방법이 본원에 기술된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 편집하는 방법으로서, a) 적어도 하나의 세포에 적어도 하나의 가이드 RNA 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제를 도입하되, 상기 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 복합체를 형성할 수 있는 단계; b) 상기 뉴클레오티드 서열에 적어도 하나의 단일 뉴클레오티드 결실을 포함하는 세포를 (a)로부터 선택하되, 상기 뉴클레오티드 결실은 편집될 위치에 위치하는 단계; 및 c) (b)의 세포에 적어도 하나의 가이드 RNA 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제를 도입하되, 상기 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 복합체를 형성할 수 있고, 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 (b)의 뉴클레오티드 결실과 동일한 위치에 단일 뉴클레오티드를 삽입할 수 있는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드 변형 주형 또는 공여 DNA를 사용하지 않고 식물의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 편집하는 방법으로서, a) 적어도 하나의 식물 세포에 적어도 하나의 가이드 RNA 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제를 도입하되, 상기 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 복합체를 형성할 수 있는 단계; b) 상기 뉴클레오티드 서열에 적어도 하나의 단일 뉴클레오티드 결실을 포함하는 식물 세포를 (a)로부터 선택하되, 상기 뉴클레오티드 결실은 편집될 위치에 위치하는 단계; c) (b)의 식물 세포로부터 식물을 재생시키는 단계; d) (c)의 식물로부터의 세포에 적어도 하나의 가이드 RNA 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제를 도입하되, 상기 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있고, 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 (b)의 뉴클레오티드 결실과 동일한 위치에 단일 뉴클레오티드를 삽입할 수 있는 복합체를 형성할 수 있는 단계; 및 e) 최적으로는, (d)의 뉴클레오티드 삽입을 포함하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
용어 "녹인", "유전자 녹인" 및 "유전적 삽입" 및 "유전적 녹인"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 녹인은 (적절한 공여 DNA 폴리뉴클레오티드도 사용되는 경우, HR에 의해) Cas 단백질로 표적화함으로써 세포의 특정 DNA 서열에서 DNA 서열을 치환하거나 삽입하는 것을 나타낸다. 녹인의 예는 유전자의 암호화 영역에 이종 아미노산 코딩 서열의 특이적 삽입, 또는 유전자좌에 전사 조절 요소의 특이적 삽입이다.
Cas 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위에 삽입되는 관심 폴리뉴클레오티드를 갖는 세포 또는 생물을 얻기 위해 다양한 방법 및 조성을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 상동 재조합을 이용하여 표적 부위에서 관심 폴리뉴클레오티드의 통합을 제공할 수 있다. 제공되는 하나의 방법에서, 관심 폴리뉴클레오티드는 공여 DNA 작제물로 생물 세포에 제공된다.
본원에 사용된 "공여 DNA"는 Cas 엔도뉴클레아제의 표적 부위에 삽입될 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 작제물에 대한 언급을 포함한다. 공여 DNA 작제물은 관심 폴리뉴클레오티드에 플랭킹한 제1 상동 영역 및 제2 상동 영역을 더 포함할 수 있다. 공여 DNA의 제1 상동 영역 및 제2 상동 영역은 세포 또는 생물 게놈의 표적 부위에 존재하거나 거기에 플랭킹한 제1 게놈 영역 및 제2 게놈 영역에 대해 각각 상동성을 공유한다. 공여 DNA는 가이드 폴리뉴클레오티드 및/또는 Cas 엔도뉴클레아제에 테더링될 수 있다. 테더링된 공여 DNA는, 게놈 편집 및 표적화된 게놈 조절에 유용한, 표적과 공여 DNA의 공동 국재화를 가능하게 할 수 있고, 내인성 HR 기구의 기능이 매우 약해질 것으로 예상되는 유사분열후 세포를 표적화하는 데에도 유용할 수 있다(Mali et al. 2013 Nature Methods Vol. 10 : 957-963).
"상동성"이란 유사한 DNA 서열을 의미한다. 예를 들어, 공여 DNA에서 발견되는 "게놈 영역에 대한 상동 영역"은 세포 또는 생물 게놈의 주어진 "게놈 영역"과 유사한 서열을 갖는 DNA 영역이다. 상동 영역은 절단된 표적 부위에서 상동 재조합을 촉진시키기에 충분한 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 상동 영역이 해당 게놈 영역과 상동 재조합을 겪기에 충분한 상동성을 갖도록, 상동 영역은 적어도 5~10, 5~15, 5~20, 5~25, 5~30, 5~35, 5~40, 5~45, 5~50, 5~55, 5~60, 5~65, 5~70, 5~75, 5~80, 5~85, 5~90, 5~95, 5~100, 5~200, 5~300, 5~400, 5~500, 5~600, 5~700, 5~800, 5~900, 5~1000, 5~1100, 5~1200, 5~1300, 5~1400, 5~1500, 5~1600, 5~1700, 5~1800, 5~1900, 5~2000, 5~2100, 5~2200, 5~2300, 5~2400, 5~2500, 5~2600, 5~2700, 5~2800, 5~2900, 5~3000, 5~3100개 이상 염기의 길이를 포함할 수 있다. "충분한 상동성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 서열이 상동 재조합 반응을 위한 기질로서 작용하기에 충분한 구조적 유사성을 갖는다는 것을 나타낸다. 구조적 유사성은 각 폴리뉴클레오티드 단편의 전체 길이뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드의 서열 유사성을 포함한다. 서열 유사성은, 서열의 전체 길이에 걸친 백분율 서열 동일성, 및/또는 100% 서열 동일성을 갖는 연속된 뉴클레오티드와 같은 국부적 유사성을 포함하는 보존 영역, 및 서열의 일부 길이에 걸친 백분율 서열 동일성에 의해 설명될 수 있다.
표적 및 공여 폴리뉴클레오티드가 공유하는 상동성 또는 서열 동일성의 양은 변할 수 있으며, 약 1~20 bp, 20~50 bp, 50~100 bp, 75~150 bp, 100~250 bp, 150~300 bp, 200~400 bp, 250~500 bp, 300~600 bp, 350~750 bp, 400~800 bp, 450~900 bp, 500~1000 bp, 600~1250 bp, 700~1500 bp, 800~1750 bp, 900~2000 bp, 1~2.5 kb, 1.5~3 kb, 2~4 kb, 2.5~5 kb, 3~6 kb, 3.5~7 kb, 4~8 kb, 5~10 kb, 또는 표적 부위의 전체 길이까지를 포함하는 범위의 단위 적분 값을 갖는 총 길이 및/또는 영역을 포함한다. 이 범위에는 범위 내의 모든 정수가 포함되고, 예를 들어, 1~20 bp 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 bp를 포함한다. 상동성의 양은 2개의 폴리뉴클레오티드의 전체 정렬 길이에 걸친 백분율 서열 동일성에 의해 설명될 수도 있는데, 이는 약 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 백분율 서열 동일성을 포함한다. 충분한 상동성은 폴리뉴클레오티드 길이, 전체 백분율 서열 동일성, 및 선택적으로, 연속된 뉴클레오티드의 보존 영역 또는 국소 백분율 서열 동일성의 임의의 조합을 포함하며, 예를 들어, 충분한 상동성은 표적 유전자좌의 영역과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 75~150 bp의 영역으로써 설명될 수 있다. 충분한 상동성은 매우 엄격한 조건 하에서 2개의 폴리뉴클레오티드의 특이적 혼성화 능력 예측에 의해 설명될 수도 있다(예를 들어, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Eds (1994) Current Protocols, (Greene Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley & Sons, Inc.); 및 Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, (Elsevier, New York) 참조).
본원에서 사용된 "게놈 영역"은 표적 부위의 어느 한 면에 존재하거나 대안적으로 표적 부위의 일부도 포함하는 세포 게놈 내 염색체의 분절이다. 게놈 영역이 해당 상동 영역과 상동 재조합을 겪기에 충분한 상동성을 갖도록, 게놈 영역은 적어도 5~10, 5~15, 5~20, 5~25, 5~30, 5~35, 5~40, 5~45, 5~50, 5~55, 5~60, 5~65, 5~70, 5~75, 5~80, 5~85, 5~90, 5~95, 5~100, 5~200, 5~300, 5~400, 5~500, 5~600, 5~700, 5~800, 5~900, 5~1000, 5~1100, 5~1200, 5~1300, 5~1400, 5~1500, 5~1600, 5~1700, 5~1800, 5~1900, 5~2000, 5~2100, 5~2200, 5~2300, 5~2400, 5~2500, 5~2600, 5~2700, 5~2800, 5~2900, 5~3000, 5~3100 이상의 염기를 포함할 수 있다.
관심 폴리뉴클레오티드 및/또는 형질은, 본원에 참조로 포함되는 2013년 10월 3일 공개된 US-2013-0263324-A1 및 2013년 1월 24일 공개된 PCT/US13/22891에 기재된 바와 같이, 복합 형질 유전자좌에 함께 쌓일 수 있다. 본원에 기술된 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas9 엔도뉴클레아제 시스템은 이중 가닥 절단을 생성하는 데 효율적인 시스템을 제공하고, 복합 형질 유전자좌에 형질이 쌓이도록 할 수 있다.
가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드, 하나의 Cas 엔도뉴클레아제, 및 선택적으로 하나 이상의 공여 DNA를 식물 세포에 도입함으로써, 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드 또는 하나 이상의 관심 형질을 하나 이상의 표적 부위에 도입하는 데 사용될 수 있다(본원에 참조로 포함되는 2015년 3월 19일 공개된 미국 특허 출원 US-2015-0082478-A1에 기재된 바와 같음). 상기 하나 이상의 표적 부위에서 변경을 포함하는 식물 세포로부터 가임성 식물이 생성될 수 있고, 변경은 (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, (ii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, (iii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 및 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 변경된 표적 부위를 포함하는 식물은 동일한 복합 형질 유전자좌에 적어도 하나의 관심 유전자 또는 형질을 포함하는 식물과 교배됨으로써 상기 복합 형질 유전자좌에 형질을 더 쌓을 수 있다(본원에 참조로 포함되는, 2013년 10월 3일 공개된 US-2013-0263324-A1 및 2013년 1월 24일 공개된 PCT/US13/22891을 또한 참조).
주어진 게놈 영역과 공여 DNA에서 발견되는 해당 상동 영역 사이의 구조적 유사성은 상동 재조합이 일어날 수 있게 하는 임의의 서열 동일성의 정도가 될 수 있다. 예를 들어, 공여 DNA의 "상동 영역"과 생물 게놈의 "게놈 영역"이 공유하는 상동성 또는 서열 동일성의 양은 서열이 상동 재조합을 겪도록 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
공여 DNA상의 상동 영역은 표적 부위에 플랭킹한 임의 서열과 상동성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서 상동 영역들은 표적 부위 바로 옆의 게놈 서열과 상당한 서열 상동성을 공유하지만, 상동 영역은 표적 부위에 추가로 5' 또는 3'일 수 있는 영역에 충분한 상동성을 갖도록 설계될 수 있는 것으로 인정된다. 또 다른 구현예에서, 상동 영역은 하류 게놈 영역과 함께 표적 부위의 단편과 상동성을 가질 수도 있다. 하나의 구현예에서, 제1 상동 영역은 표적 부위의 제1 단편을 추가로 포함하고, 제2 상동 영역은 표적 부위의 제2 단편을 포함하며, 제1 단편 및 제 2 단편은 상이하다.
이중 가닥 절단이 DNA에 유도되면, 세포의 DNA 복구 메커니즘이 활성화되어 절단을 복구한다. 비상동 말단 연결(NHEJ) 경로는 절단 말단을 합치는 가장 일반적인 복구 메커니즘이다(Bleuyard et al., (2006) DNA Repair 5:1-12). 염색체의 구조적 완전성은 복구에 의해 일반적으로 보존되지만, 결실, 삽입, 또는 다른 재배열이 일어날 수 있다. 하나의 이중 가닥 절단의 두 말단이 NHEJ의 가장 일반적인 기질이지만(Kirik et al., (2000) EMBO J 19:5562-6), 두 개의 상이한 이중 가닥 절단이 발생하는 경우, 상이한 절단의 자유 말단이 연결되어 염색체 결실(Siebert and Puchta, (2002) Plant Cell 14:1121-31), 또는 상이한 염색체 간의 염색체 전좌(Pacher et al., (2007) Genetics 175:21-9)초래할 수 있다. 오류가 발생하기 쉬운 DNA 복구 메커니즘은 이중 가닥 절단 부위에서 돌연변이를 일으킬 수 있다. 비상동 말단 연결(NHEJ) 경로는 절단 말단을 합치는 가장 일반적인 복구 메커니즘이다(Bleuyard et al., (2006) DNA Repair 5:1-12).
대안적으로, 이중 가닥 절단은 상동 DNA 서열들 간의 상동 재조합(HR)에 의해 복구될 수 있다. 예를 들어, 이중 가닥 절단의 성숙과 관련된 엑소뉴클레아제 활성에 의해 이중 가닥 절단 주위의 서열이 일단 변경되면, 비분열 체세포에서의 상동 염색체, 또는 DNA 복제 후 자매 염색분체와 같은 상동 서열이 이용 가능하다면 유전자 전환 경로는 원래의 구조를 복원할 수 있다(Molinier et al., (2004) Plant Cell 16:342-52). 이소성 및/또는 후성적 DNA 서열이 상동 재조합을 위한 DNA 복구 주형으로서 작용할 수도 있다(Puchta, (1999) Genetics 152:1173-81). 에피솜 DNA 분자가 이중 가닥 절단에 연결될 수도 있다(예컨대, 염색체 이중 가닥 절단에의 T-DNA의 통합)(Chilton and Que, (2003) Plant Physiol 133:956-65; Salomon and Puchta, (1998) EMBO J 17:6086-95).
본원에 사용된 "상동 재조합(HR)"은 상동 부위에서 2개의 DNA 분자 간의 DNA 단편의 교체를 포함한다. 상동 재조합의 빈도는 여러 인자에 영향을 받는다. 서로 다른 생물은 상동 재조합의 양 및 상동 재조합과 비상동 재조합의 상대 비율이 다르다. 일반적으로, 상동 영역의 길이는 상동 재조합 사건의 빈도에 영향을 미친다: 상동 영역이 길수록 빈도는 더 커진다. 상동 재조합을 관찰하는 데 필요한 상동 영역의 길이도 종에 따라 다르다. 많은 경우에, 적어도 5 kb의 상동성이 이용되었지만, 상동 재조합은 25~50 bp만큼의 적은 상동성으로 관찰되었다. 예를 들어, Singer et al., (1982) Cell 31:25-33; Shen and Huang, (1986) Genetics 112:441-57; Watt et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4768-72, Sugawara and Haber, (1992) Mol Cell Biol 12:563-75, Rubnitz and Subramani, (1984) Mol Cell Biol 4:2253-8; Ayares et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5199-203; Liskay et al., (1987) Genetics 115:161-7 참조.
상동성-유도 복구(homology-directed repair, HDR)는 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA 절단을 복구하는 세포의 메커니즘이다. 상동성-유도 복구는 상동 재조합(HR) 및 단일 가닥 어닐링(SSA)을 포함한다(Lieber. 2010 Annu. Rev. Biochem. 79:181-211). 가장 일반적인 형태의 HDR은 상동 재조합(HR)이라고 하며, 공여 DNA와 수용 DNA 간의 가장 긴 서열 상동성 요건을 갖는다. 다른 형태의 HDR은 단일 가닥 어닐링(SSA) 및 절단 유도 복제를 포함하며, 이들은 HR에 비해 더 짧은 서열 상동성을 필요로 한다. 닉(단일 가닥 절단)에서의 상동성-유도 복구는 이중 가닥 절단에서의 HDR과 구별되는 메커니즘을 통해 일어날 수 있다(Davis and Maizels. PNAS (0027-8424), 111 (10), p. E924-E932).
예를 들어, 상동-유도 복구(HDR)을 통한 식물 세포 게놈의 변경은 유전자 조작을 위한 강력한 도구이다. 고등 식물에서 상동 재조합 빈도가 낮음에도 불구하고, 식물 내인성 유전자의 성공적인 상동 재조합의 몇 가지 예가 있다. 식물에서의 상동 재조합에 대한 파라미터는 도입된 절단된 선택 마커 유전자를 구조하여 주로 조사되었다. 이 실험들에서, 상동 DNA 단편은 일반적으로 0.3 kb 내지 2 kb이었다. 관찰된 상동 재조합 빈도는 10-4 내지 10-5 정도였다. 예를 들어, Halfter et al., (1992) Mol Gen Genet 231:186-93; Offringa et al., (1990) EMBO J 9:3077-84; Offringa et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7346-50; Paszkowski et al., (1988) EMBO J 7:4021-6; Hourda and Paszkowski, (1994) Mol Gen Genet 243:106-11; 및 Risseeuw et al., (1995) Plant J 7:109-19 참조.
DNA 이중 가닥 절단은 상동 재조합 경로를 활발하게 하는 효과적인 인자일 것으로 보인다(Puchta et al., (1995) Plant Mol Biol 28:281-92; Tzfira and White, (2005) Trends Biotechnol 23:567-9; Puchta, (2005) J Exp Bot 56:1-14). DNA 절단제를 사용하여, 식물의 인공 작제 상동 DNA 반복 서열들 사이에서 상동 재조합의 2배 내지 9배 증가가 관찰되었다(Puchta et al., (1995) Plant Mol Biol 28:281-92). 옥수수 원형질체에서, 선형 DNA 분자를 이용한 실험을 통해 플라스미드들 간의 향상된 상동 재조합이 입증되었다(Lyznik et al., (1991) Mol Gen Genet 230:209-18).
공여 DNA는 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 도입될 수 있다. 예를 들어, 표적 부위를 가진 식물이 제공된다. 공여 DNA는, 예를 들어, 아그로박테리움 매개 형질전환, 휘스커 매개 형질전환, 또는 바이올리스틱 유전자총을 포함하여, 당업계에 알려진 임의의 전달 방법에 의해 제공될 수 있다. 공여 DNA는 세포에 일시적으로 존재할 수 있거나, 바이러스성 레플리콘을 통해 도입될 수 있다. Cas 엔도뉴클레아제 및 표적 부위의 존재 하에, 공여 DNA가 식물의 게놈에 삽입된다.
본원에 기술된 바와 같이, 식물 세포로의 공여 DNA의 직접 전달은 입자 매개 전달을 통해 달성될 수 있다. 본원에 기술된 실험에 기초하여, 당업자는 이제 임의의 다른 직접적인 전달 방법, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개 원형질체로의 형질감염, 전기천공, 유전자총, 휘스커 매개 전달, 세포 침투성 펩티드, 또는 메조포러스 실리카 나노입자(MSN) 매개 직접 단백질 전달이 식물 세포에서 공여 DNA를 전달하기 위해 성공적으로 이용될 수 있음을 구상할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법으로서, 표적 부위 및 파괴된 선택 마커 유전자를 포함하는 적어도 하나의 세포에 적어도 하나의 공여 DNA, 제1 가이드 RNA, Cas 엔도뉴클레아제, 및 적어도 제2 가이드 RNA를 도입하되, 상기 제1 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 파괴된 선택 마커 유전자에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 제1 복합체를 형성할 수 있고, 상기 파괴된 선택 마커 유전자는 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 기능성 선택 마커 단백질을 암호화할 수 있는 비파괴 선택 마커 유전자로 복원되고, 상기 공여 DNA는 상기 표적 부위에 삽입될 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 제2 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 위치한 상기 표적 부위를 인식하고, 거기에 결합하고, 닉킹 또는 절단할 수 있는 제2 복합체를 형성할 수 있는 단계; 및 상기 뉴클레오티드 서열의 변형을 갖는 세포를 상기 기능성 선택 마커 단백질에 의해 선택하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 도입 및 선택 단계는 선택 마커 유전자를 포함하는 재조합 DNA 작제물과 같은 선택 마커 유전자의 도입을 포함하지 않는다. 파괴된 선택 마커 유전자는 파괴된 시각적 마커 유전자를 비롯한 임의의 파괴된 마커 유전자일 수 있다.
가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 대한 추가 용도는 기술되어 있고(본원에 참조로 포함되는 2015년 3월 19일 공개된 미국 특허 출원 US 2015-0082478 A1, 2015년 2월 26일 공개된 WO2015/026886 A1, 2015년 2월 26일 공개된 US 2015-0059010 A1, 2014년 7월 7일 출원된 미국 출원 62/023246, 및 2014년 8월 13일 출원된 미국 출원 62/036,652 참조), 관심 뉴클레오티드 서열(예컨대, 조절 요소)의 변형 또는 치환, 관심 폴리뉴클레오티드의 삽입, 유전자 녹아웃, 유전자 녹인, 스플라이싱 부위의 변형 및/또는 대체 스플라이싱 부위의 도입, 관심 단백질, 아미노산 및/또는 단백질 융합체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 변형, 및 관심 유전자 내 역위 반복 서열 발현에 의한 유전자 침묵화를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
관심 폴리뉴클레오티드는 본원에 더 기술되어 있으며, 상업 시장 및 작물 개발에 관여하는 자들의 이익을 반영하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 관심 작물 및 시장은 변화하며, 개발 도상국이 세계 시장을 개방함에 따라 새로운 작물과 기술 또한 등장할 것이다. 또한, 수확량과 잡종 강세와 같은 작물학적 형질 및 특성에 대한 이해가 높아짐에 따라 유전자 조작을 위한 유전자의 선택은 그에 따라 변할 것이다.
또한, 표적 부위에 통합된 관심 폴리뉴클레오티드를 게놈에 포함하는 하나 이상의 식물 세포를 동정하는 방법이 제공된다. 선별 마커 표현형을 사용하지 않고 표적 부위 또는 그 근처에서 게놈 내 삽입을 가진 식물 세포를 동정하기 위해 다양한 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 PCR 방법, 시퀀싱 방법, 뉴클레아제 분해, 서던 블롯, 및 이들의 임의의 조합을 비제한적으로 포함하여, 표적 서열을 직접 분석하여 표적 서열에서 임의의 변화를 감지하는 것으로 볼 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법에 필요한 정도로 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 12/147,834를 참조. 상기 방법은 또한, 게놈에 통합된 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포로부터 식물을 복원하는 단계를 포함한다. 식물은 불임성 또는 가임성일 수 있다. 표적 부위에서 식물 게놈에 통합되고 식물에서 발현되는 임의의 관심 폴리뉴클레오티드가 제공될 수 있는 것으로 인정된다.
관심 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드는 제초제 저항성 코딩 서열, 살충 코딩 서열, 살선충 코딩 서열, 항균 코딩 서열, 항진균 코딩 서열, 항바이러스성 코딩 서열, 무생물적 및 생물적 스트레스 내성 코딩 서열, 또는 수확량, 곡물 품질, 양분 함량, 전분 품질 및 양, 질소 고정 및/또는 활용, 지방산, 및 기름 함량 및/또는 조성과 같은 식물 형질을 변형하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적인 관심 폴리뉴클레오티드는 작물 수확량을 개선하는 유전자, 작물의 바람직성을 개선하는 폴리펩티드, 가뭄, 질소, 온도, 염분, 독성 금속 또는 미량 원소와 같은 무생물적 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 암호화하는 유전자, 살충제 및 제초제와 같은 독소에 대한 저항성, 또는 진균, 바이러스, 박테리아, 곤충 및 선충에 의한 공격, 이러한 생물과 관련된 질병의 발달과 같은 생물적 스트레스에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 관심 유전자의 일반적인 범주는, 예를 들어, 징크 핑거와 같은 정보 관련 유전자, 키나아제와 같은 전달 관련 유전자, 및 열충격 단백질과 같은 하우스키핑 관련 유전자를 포함한다. 보다 구체적인 이식유전자의 범주는, 예를 들어, 작물학적 특성, 곤충 저항성, 질병 저항성, 제초제 저항성, 가임성 또는 불임성, 곡물 특성 및 상업적 제품에 대한 중요한 형질을 암호화하는 유전자를 포함한다. 관심 유전자는 일반적으로, 기름, 전분, 탄수화물 또는 영양 물질 대사 관련 유전자뿐만 아니라 본원에 기재된 다른 형질, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 제초제 저항성과 조합하여 쌓이거나 사용될 수 있는 커널 크기, 수크로오스 로딩 등에 영향을 미치는 유전자를 포함한다.
기름, 전분, 및 단백질 함량과 같은 작물학적으로 중요한 형질은 전통적인 육종 방법을 이용하는 것 외에도 유전적으로 변형될 수 있다. 변형은 올레산, 포화 및 불포화 기름 함량 증가, 라이신과 황 수준 증가, 필수 아미노산 도입, 및 전분의 변형도 포함한다. 호르도티오닌 단백질 변형은 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,703,049호, 5,885,801호, 5,885,802호, 및 5,990,389호에 기재되어 있다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열은 질병 저항성 또는 해충 저항성 도입에 관여하는 단백질을 암호화할 수 있다. "질병 저항성" 또는 "해충 저항성"은 식물이 식물 병원균 상호작용의 결과인 유해한 증상을 피한다는 의미이다. 해충 저항성 유전자는 근충, 거세미, 유럽옥수수좀 등과 같이 수확량에 큰 방해가 되는 해충에 대한 저항성을 암호화할 수 있다. 질병 저항성 및 곤충 저항성 유전자, 예컨대, 항균성 보호를 위한 리소자임 또는 세크로핀, 또는 항진균성 보호를 위한 디펜신, 글루카나아제 또는 키티나아제와 같은 단백질, 또는 선충류 또는 곤충 방제를 위한 바실러스 튜링겐시스 내독소, 프로테아제 저해제, 콜라게나아제, 렉틴, 또는 글리코시다아제는 모두 유용한 유전자 산물의 예이다. 질병 저항성 형질을 암호화하는 유전자는, 예컨대, 후모니신에 대한 독소제거 유전자(미국 특허 5,792,931호); 약독성(avr) 및 질병 저항성(R) 유전자(Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; 및 Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089) 등을 포함한다. 곤충 저항성 유전자는 근충, 거세미, 유럽옥수수좀 등과 같이 수확량에 큰 방해가 되는 해충에 대한 저항성을 암호화할 수 있다. 이러한 유전자는, 예를 들어, 바실러스 튜링겐시스 독성 단백질 유전자(미국 특허 5,366,892호; 5,747,450호; 5,736,514호; 5,723,756호; 5,593,881호; 및 Geiser et al. (1986) Gene 48:109) 등을 포함한다.
"제초제 저항성 단백질" 또는 "제초제 저항성 암호화 핵산 분자"의 발현으로 생성되는 단백질은 이러한 단백질을 발현하지 않는 세포보다 더 높은 농도의 제초제를 견디는 능력, 또는 이러한 단백질을 발현하지 않는 세포보다 더 오랜 기간 동안 특정 농도의 제초제를 견디는 능력을 세포에 부여하는 단백질을 포함한다. 아세토락테이트 합성효소(ALS, AHAS라고도 함)의 작용을 저해하는 작용을 하는 제초제, 특히 설포닐우레아형(영국: sulphonylurea) 제초제에 대한 저항성을 코딩하는 유전자, 글루타민 합성효소의 작용을 저해하는 작용을 하는 제초제에 대한 저항성을 코딩하는 유전자, 예컨대, 포스피노트리신 또는 바스타(예컨대, 바 유전자), 글리포세이트(예컨대, EPSP 합성효소 유전자 및 GAT 유전자), HPPD 저해제(예컨대, HPPD 유전자) 또는 당업계에 알려진 다른 이러한 유전자에 의해 식물에 도입될 수 있다. 예를 들어, 본원에 각각 참조로 포함되는, 미국 특허 7,626,077호, 5,310,667호, 5,866,775호, 6,225,114호, 6,248,876호, 7,169,970호, 6,867,293호, 및 미국 가출원 61/401,456호 참조. 바 유전자는 제초제 바스타에 대한 저항성을 암호화하고, nptII 유전자는 항생제 카나마이신 및 제네티신에 대한 저항성을 암호화하고, ALS 유전자 돌연변이는 제초제 클로르설푸론에 대한 저항성을 암호화한다.
본원에 사용된 "설포닐우레아 내성 폴리펩티드"는 식물에서 발현될 때 적어도 하나의 설포닐우레아에 대한 내성을 부여하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 설포닐우레아 제초제는 아세토하이드록시산 합성효소(AHAS)로도 알려진 아세토락테이트 합성효소(ALS)를 차단함으로써 고등 식물의 성장을 억제한다. ALS에 특정 돌연변이(예를 들어, S4 및/또는 HRA 돌연변이)가 있는 식물은 설포닐우레아 제초제에 내성이 있다. 설포닐우레아 내성 식물의 제조는, 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함되는, 미국 특허 5,605,011호; 5,013,659호; 5,141,870호; 5,767,361호; 5,731,180호; 5,304,732호; 4,761,373호; 5,331,107호; 5,928,937호; 및 5,378,824호; 및 국제 공개 WO 96/33270, 및 Tan et al. 2005. Imidazolinone-tolerant crops: history, current status and future. Pest Manag Sci 61:246-257에 보다 상세히 설명되어 있다. 설포닐우레아 저항성 폴리펩티드는, 예를 들어 ALS의 SuRA 또는 SuRB 유전자좌에 의해 암호화될 수 있다. 특정 구현예에서, ALS 저해제 저항성 폴리펩티드는 C3 ALS 돌연변이, HRA ALS 돌연변이, S4 돌연변이 또는 S4/HRA 돌연변이 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. ALS에서의 상이한 돌연변이는 상이한 제초제 및 제초제의 군(및/또는 하위군)에 내성을 부여하는 것으로 알려져 있다; 예를 들어, Tranel and Wright (2002) Weed Science 50:700-712 참조. 또한, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,605,011호, 5,378,824호, 5,141,870호, 5,013,659호 참조. ALS에서의 HRA 돌연변이는 일 구현예에서 특정 용도를 갖는다. 돌연변이는 적어도 하나의 설포닐우레아 화합물에 저항성이 있는 아세토락테이트 합성효소 폴리펩티드의 생성을 야기한다.
설포닐우레아 내성 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 설포닐 내성 유전자 또는 설포닐 저항성 유전자라고 한다. 용어 설포닐 내성 유전자 또는 설포닐 저항성 유전자는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
파괴된 설포닐우레아 저항성(ALS) 유전자는 그 해당 비파괴 유전자가 설포닐우레아 내성 폴리펩티드를 암호화하는 파괴 유전자로서, 그 유전자 산물이 기능성 설포닐우레아 내성 폴리펩티드를 더 이상 암호화하지 않도록 변형된 파괴 유전자를 지칭한다.
일 구현예에서, 상기 방법은 변형된 표적 부위를 포함하는 설포닐우레아 저항성 식물을 생산하는 방법으로서, a) 파괴된 설포닐우레아 저항성(ALS) 유전자를 포함하는 식물 세포에 제1 가이드 RNA, Cas9 엔도뉴클레아제, 적어도 제2 가이드 RNA를 도입하되, 상기 제1 가이드 RNA 및 Cas9 엔도뉴클레아제는 상기 파괴된 설포닐우레아 저항성(ALS) 유전자에 이중 가닥을 도입할 수 있는 제1 복합체를 형성할 수 있고, 상기 제2 가이드 RNA 및 Cas9 엔도뉴클레아제는 상기 표적 부위에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 제2 복합체를 형성할 수 있는 단계; 및 b) 상기 식물 세포로부터 설포닐우레아 저항성 식물을 얻되, 상기 설포닐우레아 저항성 식물은 상기 표적에 변형을 포함하고, 상기 변형은 (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, (ii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, (iii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 또는 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
(2012년 9월 4일 발행된 US 8,257,956에 기술된 바와 같은) 설포닐우레아 반응성 억제물질 시스템의 성분이 또한 식물 게놈에 도입되어 상기 식물 내에 폴리펩티드가 작동물질에 특이적으로 결합할 수 있는 억제물질/작동물질/유도물질 시스템을 생성할 수 있고, 특이적 결합은 설포닐우레아 화합물에 의해 조절된다.
불임성 유전자는 발현 카세트에서 암호화될 수도 있고, 물리적 제웅(detasseling)에 대한 대안을 제공한다. 이러한 방식에 사용되는 유전자의 예는 웅성 가임성 유전자, 예컨대, MS26(예를 들어, 미국 특허 7,098,388, 7,517,975, 7,612,251 참조), MS45(예를 들어, 미국 특허 5,478,369, 6,265,640 참조) 또는 MSCA1(예를 들어, 미국 특허 7,919,676 참조)을 포함한다. 옥수수 식물(Zea mays L.)은 자가 수분 및 타가 수분 기술에 의해 자랄 수 있다. 옥수수는 동일 식물에서, 수술에 위치한 수꽃 및 이삭에 위치한 암꽃을 가지고 있다. 옥수수는 자가 수분("자가생식") 하거나 타가 수분할 수 있다. 옥수수에서 자연 수분은 수술의 꽃가루가 바람에 의해 초기 이삭의 맨 위에 튀어 나온 수염으로 날릴 때 일어난다. 수분은 당업자에게 알려진 기술에 의해 용이하게 제어될 수 있다. 옥수수 잡종의 개발은 동형접합 근친교배 계통의 개발, 이러한 계통의 교배, 및 교배의 평가를 필요로 한다. 계통 육종 및 순환 선발은 개체군으로부터 근친교배 계통을 개발하는 데 이용되는 두 가지 육종 방법이다. 육종 프로그램은 자가생식 및 원하는 표현형의 선택에 의해 새로운 근친교배 계통이 개발되는 육종 풀(breeding pool)에 둘 이상의 근친교배 계통 또는 다양한 광범위한 공급원으로부터의 원하는 형질을 결합한다. 잡종 옥수수 품종은 이러한 두 가지 근친교배 계통의 교배이며, 각각의 근친교배 계통은 다른 하나에 부족한 하나 이상의 바람직한 특성을 갖거나 다른 하나를 보완할 수 있다. 새로운 근친교배종은 다른 근친교배 계통과 교배되고, 이들 교배로부터의 잡종을 평가하여 어느 것이 상업성이 있는지 판단한다. 제1 세대의 잡종 자손은 F1으로 지정된다. F1 잡종은 근친교배된 모체보다 더 잘 자란다. 이러한 잡종 활력 또는 잡종 강세는 식물 성장의 증가 및 수확량 증가를 포함하여 여러 방식으로 증명될 수 있다.
잡종 옥수수 종자는 수동 제웅을 포함하는 웅성 불임성 시스템에 의해 생산될 수 있다. 잡종 종자를 생산하기 위해, 성장하는 자성 근친교배 모체로부터 웅성 수술이 제거되고, 웅성 근친교배 모체와 함께 다양한 교대 행 패턴으로 심을 수 있다. 결과적으로, 외래의 옥수수 꽃가루 공급원으로부터 충분히 단리되어 있다면, 자성 근친교배종의 이삭은 웅성 근친교배종으로부터의 꽃가루로만 수정될 것이다. 따라서, 얻어진 종자는 잡종(F1)이고, 잡종 식물을 형성할 것이다.
식물 발육에 영향을 미치는 필드 변화는 자성 모체의 수동 제웅이 완료된 후 식물 태슬링을 초래할 수 있다. 또는, 제웅 과정 동안 자성 근친교배 식물 수술이 완전히 제거되지 않을 수 있다. 어느 경우든, 결과적으로 자성 식물은 성공적으로 꽃가루를 뿌릴 것이고, 일부 자성 식물은 자가 수분될 것이다. 이는 결과적으로 정상적으로 생산되는 잡종 종자와 함께 자성 근친교배종의 종자가 수확되도록 할 것이다. 자성 근친교배 종자는 잡종 강세를 나타내지 않으므로 F1 종자만큼 생산적이지 않다. 또한, 자성 근친교배 종자의 존재는 잡종을 생산하는 회사에 대한 생식질 보안 위험을 나타낼 수 있다.
대안적으로, 자성 근친교배종은 기계에 의해 기계적으로 제웅될 수 있다. 기계적 제웅은 대략 수동 제웅만큼 신뢰할 수 있지만 더 빠르고 비용이 적게 든다. 그러나, 대부분의 제웅 기계는 수동 제웅보다 식물에 더 많은 피해를 준다. 따라서, 현재 어떠한 형태의 제웅도 완전히 만족스럽지는 않고, 생산 비용을 더 낮추고 잡종 종자의 생산에서 자성 모체의 자가 수분을 제거할 필요성이 계속 존재한다.
식물에서 웅성 불임성을 야기하는 돌연변이는 옥수수와 같은 경작 식물에 대한 잡종 종자 생산 방법에 유용할 잠재력을 가지고 있으며, 잡종 모체로서 사용되는 모계 모체 식물로부터 많은 노동력을 요하는 수꽃 제거(제웅으로도 알려짐)의 필요성을 제거함으로써 생산 비용을 낮출 수 있다. 옥수수에서 웅성 불임성을 야기하는 돌연변이는 X선 또는 자외선 조사, 화학 처리 또는 전이 요소 삽입과 같은 다양한 방법에 의해 생산되었다(ms23, ms25, ms26, ms32) (Chaubal et al. (2000) Am J Bot 87:1193-1201). 가임성/불임성 "분자 스위치"를 통한 가임성 유전자의 조건부 조절은 작물 개선을 위한 새로운 웅성 불임성 시스템 설계 옵션을 향상시킬 수 있다(Unger et al. (2002) Transgenic Res 11:455-465).
또한, 관심 폴리뉴클레오티드는 표적화된 관심 유전자 서열에 대한 전령 RNA(mRNA)의 적어도 일부에 상보적인 안티센스 서열을 포함할 수도 있는 것으로 인정된다. 안티센스 뉴클레오티드는 해당 mRNA와 혼성화되도록 구성된다. 안티센스 서열의 변형은 서열이 해당 mRNA와 혼성화되고 그 발현을 방해하는 한 이루어질 수 있다. 이러한 방식으로, 해당 안티센스 서열과 70%, 80%, 또는 85%의 서열 동일성을 갖는 안티센스 작제물이 사용될 수 있다. 또한, 안티센스 뉴클레오티드의 일부는 표적 유전자의 발현을 방해하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 적어도 50개 뉴클레오티드, 100개 뉴클레오티드, 200개 뉴클레오티드 이상의 서열이 사용될 수 있다.
또한, 관심 폴리뉴클레오티드는 식물의 내인성 유전자 발현을 억제하기 위해 센스 방향으로 사용될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드를 센스 방향으로 사용하여 식물의 유전자 발현을 억제하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 이 방법은 일반적으로 내인성 유전자의 전사체에 해당하는 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부에 작동 가능하게 연결되어 식물에서 발현을 유도하는 프로모터를 포함하는 DNA 작제물로 식물을 형질전환시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 이러한 뉴클레오티드 서열은 내인성 유전자의 전사체의 서열에 대해 일반적으로 약 65% 서열 동일성, 약 85% 서열 동일성보다 크거나, 약 95% 서열 동일성보다 큰 실질적인 서열 동일성을 갖는다. 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,283,184호 및 5,034,323호 참조.
관심 폴리뉴클레오티드는 표현형 마커일 수도 있다.
재조합 DNA 분자, 관심 DNA 서열, 및 관심 폴리뉴클레오티드는 유전자 침묵을 위한 하나 이상의 DNA 서열을 포함할 수 있다. 식물에서 DNA 서열의 발현을 포함하는 유전자 침묵 방법은 당업계에 알려져 있으며, 공동억제, 안티센스 억제, 이중 가닥 RNA(dsRNA) 간섭, 헤어핀 RNA(hpRNA) 간섭, 인트론 함유 헤어핀 RNA(ihp RNA) 간섭, 전사 유전자 침묵, 및 마이크로 RNA(miRNA) 간섭을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 "핵산"은 폴리뉴클레오티드를 의미하고 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 가닥 폴리머 또는 이중 가닥 폴리머를 포함한다. 핵산은 단편 및 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. 따라서, 용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산 서열", "뉴클레오티드 서열" 및 "핵산 단편"은 단일 또는 이중 가닥인 RNA 및/또는 DNA의 폴리머를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용되며, 선택적으로 합성, 비천연 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 포함한다. (보통 5'-모노포스페이트 형태로 발견되는) 뉴클레오티드는 다음과 같이 단일 문자 표시에 의해 지칭된다: "A"는 (RNA 또는 DNA에 대해 각각) 아데노신 또는 디옥시아데노신, "C"는 시토신 또는 디옥시시토신, "G"는 구아노신 또는 디옥시구아노신, "U"는 우리딘, "T"는 디옥시티미딘, "R"은 푸린 (A 또는 G), "Y"는 피리미딘 (C 또는 T), "K"는 G 또는 T, "H"는 A 또는 C 또는 T, "I"는 이노신, 및 "N"은 임의의 뉴클레오티드.
"오픈 리딩 프레임"은 ORF로 약칭된다.
용어 "기능적으로 동등한 하위단편" 및 "기능적 동등 하위 단편"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 단편 또는 하위단편이 활성 효소를 암호화하는지 여부에 관계없이 유전자 발현을 변경하거나 특정 표현형을 생성하는 능력이 유지되는 단리된 핵산 단편의 일부 또는 하위서열을 지칭한다. 예를 들어, 단편 또는 하위단편은 형질전환된 식물에서 원하는 표현형을 생성하기 위한 유전자 설계에 사용될 수 있다. 유전자는 활성 효소를 암호화하는지에 관계없이 그 핵산 단편 또는 하위단편을 식물 프로모터 서열에 대해 센스 방향 또는 안티센스 방향으로 연결함으로써 억제에 사용하도록 설계될 수 있다.
용어 "보존 도메인" 또는 "모티프"는 진화론적 관련 단백질의 정렬된 서열을 따라 특정 위치에 보존된 아미노산 세트를 의미한다. 다른 위치의 아미노산은 상동 단백질 간에 다양할 수 있는 반면, 특정 위치에 고도로 보존된 아미노산은 단백질의 구조, 안정성, 또는 활성에 필수적인 아미노산을 나타낸다. 이들은 단백질 상동체 군의 정렬된 서열에서 높은 보존 정도에 의해 동정되기 때문에, 새로 결정된 서열을 가진 단백질이 이전에 동정된 단백질 군에 속하는지를 판단하기 위해 식별자, 또는 "서명"으로서 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열, 이들의 변이체, 및 이 서열들의 구조적 관계는 본원에서 상호교환적으로 사용되는 "상동성", "상동", "실질적으로 동일한", "실질적으로 유사한" 및 "실질적으로 대응하는"이란 용어에 의해 기술될 수 있다. 이들은 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 염기에서의 변화가 분자의 기능, 예컨대, 유전자 발현을 매개하거나 특정 표현형을 생성하는 능력에 영향을 미치지 않는 폴리펩티드 또는 핵산 단편을 지칭한다. 이들 용어는 또한, 초기의 변형되지 않은 단편에 비해 얻어진 핵산 단편의 기능적 특성을 실질적으로 변경하지 않는 핵산 단편의 변형(들)을 지칭한다. 이들 변형은 핵산 단편에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환, 및/또는 삽입을 포함한다.
포함되는 실질적으로 유사한 핵산 서열은 (적당히 엄격한 조건, 예컨대, 0.5X SSC, 0.1% SDS, 60℃에서) 본원에 예시된 서열과 혼성화하는 능력, 또는 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열의 임의의 일부에 혼성화하는 능력에 의해 정의될 수 있고, 본원에 개시된 임의의 핵산 서열과 기능적으로 동등하다. 엄격 조건은 원연(distantly-related) 생물로부터의 상동 서열과 같은 적당히 유사한 단편을 매우 유사한 단편, 예컨대, 근연(closely-related) 생물로부터 기능적 효소를 복제하는 유전자로 선별하도록 조정될 수 있다. 혼성화 후 세척은 엄격 조건을 결정한다.
"선택적으로 혼성화한다"라는 용어는 엄격한 혼성화 조건 하에서, 비표적 핵산 서열에의 혼성화보다 감지 가능하게 더 큰 정도(예를 들어, 백그라운드에 비해 적어도 2배)의 핵산 서열의 특정 핵산 표적 서열에의 혼성화 및 비표적 핵산의 실질적 배제에 대한 언급을 포함한다. 선택적으로 혼성화하는 서열은 일반적으로 서로 약 적어도 80% 서열 동일성, 또는 90% 서열 동일성을 가지며, 100% 서열 동일성(즉, 완전히 상보적)까지를 포함한다.
용어 "엄격한 조건" 또는 "엄격한 혼성화 조건"은 시험관내 혼성화 분석에서 프로브가 그 표적 서열에 선택적으로 혼성화될 조건에 대한 언급을 포함한다. 엄격한 조건은 서열에 의존적이며 상황에 따라 다를 것이다. 혼성화 및/또는 세척 조건의 엄격성을 제어함으로써, 프로브에 100% 상보적인 표적 서열을 동정할 수 있다(상동성 프로빙). 대안적으로, 엄격 조건은 서열에서 일부 불일치를 허용하여 더 낮은 정도의 유사도가 검출되도록 조정될 수 있다(이종 프로빙). 일반적으로 프로브는 약 1000개 뉴클레오티드 미만의 길이, 선택적으로 500개 뉴클레오티드 미만의 길이이다.
일반적으로, 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 그리고 짧은 프로브(예컨대, 10 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우 적어도 약 30℃에서, 긴 프로브(예컨대, 50개 뉴클레오티드 초과)의 경우 적어도 약 60℃에서 염 농도가 약 1.5 M Na 이온 미만, 일반적으로는 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도(또는 다른 염(들))인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 불안정화제의 첨가로 달성될 수도 있다. 예시적인 낮은 엄격 조건은 37℃에서 30 내지 35% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS(나트륨 도데실 설페이트)의 완충액을 이용한 혼성화, 및 50 내지 55℃에서 1X 내지 2X SSC(20X SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M 시트르산삼나트륨)에서의 세척을 포함한다. 예시적인 적당한 엄격 조건은 37℃에서 40 내지 45% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS에서의 혼성화, 및 55 내지 60℃에서 0.5X 내지 1X SSC에서의 세척을 포함한다. 예시적인 높은 엄격 조건은 37℃에서 50% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS에서의 혼성화, 및 60 내지 65℃에서 0.1X SSC에서의 세척을 포함한다.
핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은, 특정 비교창에 걸쳐 최대 일치를 위해 정렬될 때, 동일한 두 서열 내의 핵산 염기 또는 아미노산 잔기를 지칭한다.
용어 "서열 동일성 백분율"은 비교창에서 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교하여 결정된 값을 지칭하며, 이때, 비교창 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위한 (삽입 또는 결실을 포함하지 않는) 기준 서열과 비교하여 삽입 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 나타나는 위치의 개수를 결정하여 일치하는 위치의 개수를 산출하고, 일치하는 위치의 개수를 비교창 내의 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산한다. 백분율 서열 동일성의 유용한 예는 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%, 또는 50% 내지 100%의 임의 정수 백분율을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 동일성은 본원에 기재된 프로그램 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다.
서열 정렬 및 백분율 동일성 또는 유사성 계산은 LASERGENE 생물정보학 컴퓨팅 세트(DNASTAR Inc., Madison, WI)의 MegAlignTM 프로그램을 비제한적으로 포함하는 상동 서열을 검출하도록 설계된 다양한 비교 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 본 출원의 문맥 내에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석에 사용되는 경우, 달리 명시되지 않는 한, 분석 결과는 언급된 프로그램의 "디폴트 값"에 기초할 것이라는 것을 이해할 것이다. 본원에서 사용된 "디폴트 값"은 최초로 초기화 될 때, 원래 소프트웨어와 함께 로딩되는 임의 세트의 값 또는 파라미터를 의미할 것이다.
"클러스탈 V 정렬 방법"은 클러스탈 V(Higgins and Sharp, (1989) CABIOS 5:151-153; Higgins et al., (1992) Comput Appl Biosci 8:189-191에 기재)로 명명되고 LASERGENE 생물정보학 컴퓨팅 세트(DNASTAR Inc., Madison, WI)의 MegAlignTM 프로그램에서 발견되는 정렬 방법에 해당한다. 다중 정렬의 경우, 디폴트 값은 GAP PENALTY=10 및 GAP LENGTH PENALTY=10에 해당한다. 클러스탈 방법을 사용하는 단백질 서열의 백분율 동일성의 계산 및 쌍 정렬을 위한 디폴트 파라미터는 KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5이다. 핵산의 경우, 이들 파라미터는 KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 및 DIAGONALS SAVED=4이다. 클러스탈 V 프로그램을 사용하여 서열을 정렬한 후에는, 동일한 프로그램에서 "서열 거리"표를 보고 "백분율 동일성"을 얻을 수 있다.
"클러스탈 W 정렬 방법"은 클러스탈 W(Higgins and Sharp, (1989) CABIOS 5 : 151-153, Higgins 등, (1992) Comput Appl Biosci 8 : 189-191에 기재)로 명명되고 LASERGENE 생물정보학 컴퓨팅 세트(DNASTAR Inc., Madison, WI)의 MegAlignTM v6.1 프로그램에서 발견되는 정렬 방법에 해당한다. 다중 정렬을 위한 디폴트 파라미터(GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.2, 지연 발산 서열(%)=30, DNA 전이 가중치=0.5, 단백질 가중치 매트릭스=Gonnet 시리즈, DNA 가중치 매트릭스=IUB). 클러스탈 W 프로그램을 사용하여 서열을 정렬한 후에는, 동일한 프로그램에서 "서열 거리"표를 보고 "백분율 동일성"을 얻을 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 제공된 서열 동일성/유사성 값은 하기 파라미터를 사용하여, GAP 버전 10(GCG, Accelrys, San Diego, CA)을 사용하여 얻은 값을 지칭한다: 뉴클레오티드 서열에 대한 % 동일성 및 % 유사성은 갭 생성 페널티 가중치 50 및 갭 길이 연장 페널티 가중치 3, 및 nwsgapdna.cmp 점수 매트릭스를 사용; 아미노산 서열에 대한 % 동일성 및 % 유사성은 GAP 생성 페널티 가중치 8 및 갭 길이 연장 페널티 2, 및 BLOSUM62 점수 매트릭스를 사용(Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915). GAP는 Needleman and Wunsch, (1970) J Mol Biol 48:443-53의 알고리즘을 사용하여 일치의 수를 최대화하고 갭의 수를 최소화하는 두 개의 완전한 서열의 정렬을 찾는다. GAP는 가능한 모든 정렬 및 갭 위치를 고려하고, 일치 염기 단위로 갭 생성 페널티 및 갭 연장 페널티를 사용하여 가장 많은 수의 일치 염기와 가장 적은 갭으로 정렬을 생성한다.
"BLAST"는 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)에서 제공하는, 생물학적 서열 간의 유사성 영역을 찾는 데 사용되는 검색 알고리즘이다. 이 프로그램은 뉴클레오티드 또는 단백질 서열을 서열 데이터베이스와 비교하고 일치의 통계적 유의성을 계산하여 유사성이 무작위로 발생한 것으로 예측되지 않도록 쿼리 서열과 충분한 유사성을 갖는 서열을 동정한다. BLAST는 동정된 서열 및 이들의 쿼리 서열에 대한 로컬 정렬을 보고한다.
여러 수준의 서열 동일성은 다른 종 또는 천연적 또는 합성적으로 변형된 종으로부터 폴리펩티드를 동정하는 데 유용하고, 이러한 폴리펩티드는 동일하거나 유사한 기능 또는 활성을 갖는다는 것은 당업자가 잘 이해한다. 백분율 동일성의 유용한 예는 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%, 또는 50% 내지 100%의 임의 정수 백분율을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 실제로, 50% 내지 100%, 예컨대, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 임의 정수의 아미노산 동일성은 본 발명을 설명하는 데 유용할 수 있다.
"유전자"는 코딩 서열 앞의 조절 서열(5' 비코딩 서열) 및 뒤의 코딩 서열(3' 비코딩 서열)을 포함하여, 이에 한정되는 것은 아니지만, 특이 단백질과 같은 기능성 분자를 발현하는 핵산 단편을 포함한다. "고유 유전자"는 자신의 조절 서열과 함께 자연에서 발견되는 유전자를 지칭한다.
"돌연변이 유전자"는 인간 개입을 통해 변경된 유전자이다. 이러한 "돌연변이 유전자"는 적어도 하나의 뉴클레오티드 삽입, 결실, 또는 치환에 의해 해당 비돌연변이 유전자의 서열과 다른 서열을 갖는다. 본 발명의 특정 구현예에서, 돌연변이 유전자는 본원에 개시된 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 시스템에 기인하는 변경을 포함한다. 돌연변이 식물은 돌연변이 유전자를 포함하는 식물이다.
본원에 사용된 "표적 돌연변이"는, 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 바와 같이, 표적 서열의 DNA에서 이중 가닥 절단을 유도할 수 있는 이중 가닥 절단 유도제를 포함하는 방법을 사용하여 고유 유전자 내에서 표적 서열을 변경함으로써 만들어진 고유 유전자의 돌연변이이다.
가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 유도 표적 돌연변이는 Cas 엔도뉴클레아제에 의해 인식되고 절단되는 게놈 표적 부위 내에 또는 외부에 위치하는 뉴클레오티드 서열에서 발생할 수 있다.
식물 세포에 적용시 용어 "게놈"은 핵 내에서 발견되는 염색체 DNA뿐만 아니라 세포의 세포내 성분(예컨대, 미토콘드리아, 또는 색소체) 내에서 발견되는 세포소기관 DNA를 포함한다.
"코돈 변형 유전자" 또는 "코돈 선호 유전자" 또는 "코돈 최적화 유전자"는 숙주 세포의 선호되는 코돈 사용의 빈도를 모방하도록 설계된 코돈 사용의 빈도를 갖는 유전자이다.
"대립 유전자"는 염색체 상의 주어진 유전자좌를 차지하는 유전자의 몇 가지 다른 형태 중 하나이다. 염색체 상의 주어진 유전자좌에 존재하는 모든 대립 유전자가 동일한 경우, 그 식물은 그 유전자좌에서 동형접합적이다. 염색체 상의 주어진 유전자좌에 존재하는 대립 유전자가 상이한 경우, 그 식물은 그 유전자좌에서 이형접합적이다.
"코딩 서열"은 특정 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. "조절 서열"은 코딩 서열의 상류에(5' 비코딩 서열), 내에, 또는 하류(3' 비코딩 서열)에 위치하여 관련 코딩 서열의 전사, RNA 가공 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, 5' 미번역 서열, 3' 미번역 서열, 인트론, 폴리아데닐화 표적 서열, RNA 가공 부위, 이펙터 결합 부위, 및 스템-루프(stem-loop) 구조를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"식물 최적화된 뉴클레오티드 서열"은 식물에서 증가된 발현에 최적화된 뉴클레오티드 서열이다. 예를 들어, 식물 최적화된 뉴클레오티드 서열은 개선된 발현을 위한 하나 이상의 식물 선호 코돈을 사용하여, 예를 들어, 본원에 개시된 이중 가닥 절단 유도제(예컨대, 엔도뉴클레아제)와 같은 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 변형시켜 합성될 수 있다. 예를 들어, 숙주 선호 코돈 사용에 대한 논의를 위해서는 Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 참조.
식물 선호 유전자를 합성하는 방법들은 당업계에서 이용 가능하다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,380,831호, 및 5,436,391호, 및 Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498 참조. 추가적인 서열 변형은 식물 숙주에서 유전자 발현을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 이들은, 예를 들어, 가짜 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 하나 이상의 서열, 하나 이상의 엑손-인트론 스플라이스 부위 신호, 하나 이상의 전이인자 유사 반복서열, 및 유전자 발현에 유해할 수 있는 기타 이러한 잘 특성화된 서열의 제거를 포함한다. 서열의 G-C 함량은 숙주 식물 세포에서 발현되는 공지된 유전자를 참조하여 계산되는 주어진 식물 숙주에 대한 평균을 고르게 하도록 조정될 수 있다. 가능한 경우, 서열은 하나 이상의 예측된 헤어핀 2차 mRNA 구조를 피하도록 변형된다. 따라서, 본 발명의 "식물 최적화된 뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 이러한 서열 변형을 포함한다.
프로모터는 RNA 중합효소 및 기타 전사 개시 단백질의 인식 및 결합에 관여하는 DNA의 영역이다. 프로모터 서열은 근위 상류 요소 및 더 원위의 상류 요소로 구성되고, 후자는 종종 인헨서(enhancer)로 지칭된다. "인헨서"는 프로모터 활성을 자극할 수 있는 DNA 서열이고, 프로모터 고유의 요소 또는 프로모터의 수준 또는 조직 특이성을 향상시키기 위해 삽입된 이종 요소일 수 있다. 프로모터는 고유 유전자로부터 그 전체가 유래될 수 있거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터들로부터 유래된 상이한 요소들로 구성될 수 있고/있거나, 합성 DNA 분절을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형으로, 또는 발육의 상이한 단계에서 또는 상이한 환경 조건에 반응하여 유전자의 발현을 유도할 수 있음은 당업자가 이해한다. 또한, 대부분의 경우, 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에, 일부 변이체의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있는 것으로 인정된다. 대부분의 시점에 대부분의 세포 유형에서 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 일반적으로 "항시성 프로모터"(constitutive promoter)로 지칭된다.
특정 프로모터는 다른 것들보다 더 빠른 속도로 RNA 합성을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이들은 "강력한 프로모터"라고 한다. 일부 다른 프로모터는 특정 유형의 세포 또는 조직에서만 높은 수준으로 RNA 합성을 유도하는 것으로 밝혀졌고, 프로모터가 바람직하게는 특정 조직에서 RNA 합성을 유도할 뿐만 아니라 다른 조직에서 감소된 수준으로 RNA 합성을 유도할 경우 종종 "조직 특이적 프로모터" 또는 "조직 선호 프로모터"라고 한다. 식물에 도입된 키메라 유전자(또는 유전자들)의 발현 패턴은 프로모터를 사용하여 제어되므로, 특정 조직 유형에서 또는 특정 식물 발육 단계에서 특정 수준으로 키메라 유전자(또는 유전자들)의 발현을 제어할 수 있는 신규 프로모터의 단리에 대한 관심이 지속되고 있다.
식물 프로모터는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터를 포함할 수 있다(식물 프로모터에 대한 검토는 Potenza et al., (2004) In Vitro Cell Dev Biol 40:1-22를 참조). 항시성 프로모터는, 예를 들어, Rsyn7 프로모터의 코어 프로모터 및 WO99/43838 및 미국 특허 6,072,050호에 개시된 기타 항시성 프로모터; 코어 CaMV 35S 프로모터 (Odell et al., (1985) Nature 313:810-2); 벼 액틴(McElroy et al., (1990) Plant Cell 2:163-71); 유비퀴틴(Christensen et al., (1989) Plant Mol Biol 12:619-32; Christensen et al., (1992) Plant Mol Biol 18:675-89); pEMU(Last et al., (1991) Theor Appl Genet 81:581-8); MAS(Velten et al., (1984) EMBO J 3:2723-30); ALS 프로모터(미국 특허 5,659,026호) 등을 포함한다. 기타 항시성 프로모터는, 예를 들어, 미국 특허 5,608,149호; 5,608,144호; 5,604,121호; 5,569,597호; 5,466,785호; 5,399,680호; 5,268,463호; 5,608,142호 및 6,177,611호에 기술되어 있다. 일부 예에서는 유도성 프로모터가 사용될 수 있다. 병원균에 의한 감염 후에 유도되는 병원균 유도성 프로모터는 PR 단백질, SAR 단백질, 베타-1,3-글루카나아제, 키티나아제 등의 발현을 조절하는 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
화학적으로 조절되는 프로모터는 외인성 화학적 조절자의 적용을 통해 식물에서 유전자의 발현을 조절하는 데 이용될 수 있다. 이러한 프로모터는 화학물질의 적용이 유전자 발현을 유도하는 화학물질 유도성 프로모터, 또는 화학물질의 적용이 유전자 발현을 억제하는 화학물질 억제성 프로모터일 수 있다. 화학물질 유도성 프로모터는 벤젠 설폰아미드 제초제 약해경감제에 의해 활성화되는 옥수수 In2-2 프로모터(De Veylder et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:568-77), 잡초 발아 전에 사용하는 제초제로서 사용되는 소수성 친전자성 화합물에 의해 활성화되는 옥수수 GST 프로모터(GST-II-27, WO93/01294) 및 살리실산에 의해 활성화되는 담배 PR-1a 프로모터(Ono et al., (2004) Biosci Biotechnol Biochem 68:803-7)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 기타 화학적으로 조절되는 프로모터는 스테로이드 반응성 프로모터(예를 들어, 글루코코르티코이드 유도성 프로모터(Schena et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-5; McNellis et al., (1998) Plant J 14:247-257); 테트라사이클린 유도성 및 테트라사이클린 억제성 프로모터(Gatz et al., (1991) Mol Gen Genet 227:229-37; 미국 특허 5,814,618호 및 5,789,156호 참조)를 포함한다.
조직 선호 프로모터는 특정 식물 조직 내에서 발현 증진을 목표로 하는 데 활용될 수 있다. 조직 선호 프로모터로는, 예를 들어, Kawamata et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:792-803; Hansen et al., (1997) Mol Gen Genet 254:337-43; Russell et al., (1997) Transgenic Res 6:157-68; Rinehart et al., (1996) Plant Physiol 112:1331-41; Van Camp et al., (1996) Plant Physiol 112:525-35; Canevascini et al., (1996) Plant Physiol 112:513-524; Lam, (1994) Results Probl Cell Differ 20:181-96; 및 Guevara-Garcia et al., (1993) Plant J 4:495-505를 들 수 있다. 잎 선호 프로모터로는, 예를 들어, Yamamoto et al., (1997) Plant J 12:255-65; Kwon et al., (1994) Plant Physiol 105:357-67; Yamamoto et al., (1994) Plant Cell Physiol 35:773-8; Gotor et al., (1993) Plant J 3:509-18; Orozco et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1129-38; Matsuoka et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9586-90; Simpson et al., (1958) EMBO J 4:2723-9; Timko et al., (1988) Nature 318:57-8을 들 수 있다. 뿌리 선호 프로모터로는, 예를 들어, Hire et al., (1992) Plant Mol Biol 20:207-18(대두 뿌리 특이적 글루타민 합성효소 유전자); Miao et al., (1991) Plant Cell 3:11-22(시토졸 글루타민 합성효소(GS)); Keller 및 Baumgartner, (1991) Plant Cell 3:1051-61(강낭콩의 GRP 1.8 유전자의 뿌리 특이적 조절 요소); Sanger et al., (1990) Plant Mol Biol 14:433-43(A. 투메파시엔스(tumefaciens) 만노파인(mannopine) 합성효소(MAS)의 뿌리 특이적 프로모터); Bogusz et al., (1990) Plant Cell 2:633-41 (파라스포니아 안데르소니(Parasponia andersonii) 및 트레마 토멘토사(Trema tomentosa)로부터 단리된 뿌리 특이적 프로모터); Leach 및 Aoyagi, (1991) Plant Sci 79:69-76 (A. 리조게네스(rhizogenes) rolC 및 rolD 뿌리 유도 유전자); Teeri et al., (1989) EMBO J 8:343-50(아그로박테리움(Agrobacterium) 상처 유도 TR1' 및 TR2' 유전자); VfENOD-GRP3 유전자 프로모터(Kuster et al., (1995) Plant Mol Biol 29:759-72); 및 rolB 프로모터(Capana et al., (1994) Plant Mol Biol 25:681-91; 파세올린 유전자(Murai et al., (1983) Science 23:476-82; Sengopta-Gopalen et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3320-4)를 들 수 있다. 또한, 미국 특허 5,837,876호; 5,750,386호; 5,633,363호; 5,459,252호; 5,401,836호; 5,110,732호 및 5,023,179호 참조.
종자 선호 프로모터는 종자 발육 중에 활성을 나타내는 종자 특이적 프로모터뿐만 아니라, 종자 발아 중에 활성을 나타내는 종자 발아 프로모터를 포함한다. Thompson et al., (1989) BioEssays 10:108 참조. 종자 선호 프로모터는 Cim1(사이토키닌 유도 메세지); cZ19B1(옥수수 19 kDa 제인); 및 milps(미오-이노시톨-1-포스페이트 합성효소); (WO00/11177; 및 미국 특허 6,225,529)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 쌍떡잎식물의 경우, 종자 선호 프로모터는 콩류 β-파세올린, 나핀, β-콘글리시닌, 대두 렉틴, 크루시페린 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 외떡잎식물의 경우, 종자 선호 프로모터는 옥수수 15 kDa 제인, 22 kDa 제인, 27 kDa 감마 제인, 왁시, 슈렁큰(shrunken) 1, 슈렁큰 2, 글로불린 1, 올레오신, 및 nuc1을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, END1 및 END2 유전자로부터의 종자 선호 프로모터가 개시된 WO00/12733 참조.
용어 "유도성 프로모터"는, 예를 들어, 화학적 화합물(화학적 유도물질)에 의해 내인성 또는 외인성 자극의 존재에 반응하여, 또는 환경, 호르몬, 화학물질, 및/또는 발육 신호에 반응하여 코딩 서열 또는 기능성 RNA를 선택적으로 발현시키는 프로모터를 지칭한다. 유도성 또는 조절 프로모터는, 예를 들어, 빛, 열, 스트레스, 홍수 또는 가뭄, 염 스트레스, 삼투압 스트레스, 식물 호르몬, 상처, 또는 화학물질, 예컨대, 에탄올, 아브시스산(ABA), 자스모네이트, 살리실산, 또는 약해경감제에 의해 유도되거나 조절되는 프로모터를 포함한다.
스트레스 유도성의 예로는 RD29A 프로모터(Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:287-91)가 있다. 당업자는 가뭄 조건을 시뮬레이션하고 모의 또는 자연 발생 가뭄 조건에 노출되었던 식물의 가뭄 내성을 평가하기 위한 프로토콜을 잘 알고 있다. 예를 들어, 당업자는 일정 기간에 걸쳐 식물에 정상적으로 필요한 것보다 적은 물을 주거나 물을 주지 않음으로써 가뭄 조건을 시뮬레이션할 수 있고, 활력, 성장, 크기, 또는 뿌리 길이, 또는 특히, 잎 색깔 또는 잎 면적 크기를 포함한(이에 한정되는 것은 아님) 생리 및/또는 건강 상태의 차이를 조사하여 가뭄 내성을 평가할 수 있다. 가뭄 내성을 평가하기 위한 다른 기술은 엽록소 형광, 광합성 속도 및 가스 교환율의 측정을 포함한다. 또한, 당업자는 삼투압 스트레스, 염 스트레스 및 온도 스트레스와 같은 스트레스 조건을 시뮬레이션하고 모의 또는 자연 발생 스트레스 조건에 노출되었던 식물의 스트레스 내성을 평가하기 위한 프로토콜을 잘 알고 있다.
식물 세포에 유용한 유도성 프로모터의 다른 예는 본원에 참조로 포함되는, 2013년 11월 21일 공개된 미국 특허 출원 US 2013-0312137A1에 기술되어 있다. 미국 특허 출원 US 2013-0312137A1에는 옥수수로부터의 만니톨 탈수소효소를 암호화하는 CBSU-Anther_Subtraction 라이브러리(CAS1) 유전자로부터의 ZmCAS1 프로모터, 및 이의 기능적 단편이 기술되어 있다. ZmCAS1 프로모터("CAS1 프로모터", "만니톨 탈수소효소 프로모터", "mdh 프로모터"라고도 함)는 화학물질 또는 스트레스 처리에 의해 유도될 수 있다. 화학물질은, 이에 한정되는 것은 아니지만, N-(아미노카보닐)-2-클로로벤젠설폰아미드(2-CBSU)와 같은 약해경감제일 수 있다. 스트레스 처리는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 열충격 처리와 같은 열처리일 수 있다(또한, 본원에 참조로 포함되고, 2015년 2월 25일 출원된 미국 가특허출원 62/120421 참조).
식물 세포에 유용한 여러 유형의 새로운 프로모터가 지속적으로 발견되고 있고; 많은 예들을 The Biochemistry of Plants, Vol. 115, Stumpf and Conn, eds (New York, NY: Academic Press), pp. 1-82에 있는 Okamuro and Goldberg(1989)에 의한 편집에서 찾을 수 있다.
"번역 리더 서열"은 유전자의 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 위치한 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 번역 리더 서열은 번역 시작 서열의 상류 mRNA에 존재한다. 번역 리더 서열은 mRNA에 대한 1차 전사체의 가공, mRNA 안정성 또는 번역 효율에 영향을 미칠 수 있다. 번역 리더 서열의 예는 기술되어 있다(예를 들어, Turner and Foster, (1995) Mol Biotechnol 3:225-236).
"3' 비코딩 서열", "전사 종결자" 또는 "종결 서열"은 코딩 서열의 하류에 위치한 DNA 서열을 지칭하며, 폴리아데닐화 인식 서열, 및 mRNA 가공 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 신호를 암호화하는 다른 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 일반적으로, mRNA 전구체 3' 말단에의 폴리아데닐산 영역 추가에 영향을 주는 것을 특징으로 한다. 다른 3' 비코딩 서열의 사용은 Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-680에 예시되어 있다.
"RNA 전사체"는 DNA 서열의 RNA 중합효소-촉매화 전사로부터 만들어지는 생성물을 지칭한다. RNA 전사체가 DNA 서열의 완전한 상보적인 카피인 경우, 이를 1차 전사체 또는 pre-mRNA라고 한다. RNA 전사체가 1차 전사체 pre mRNA의 전사후 가공으로부터 유래된 RNA 서열인 경우, 이를 성숙 RNA 또는 mRNA라고 한다. "전령 RNA" 또는 "mRNA"는, 인트론이 없고 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 지칭한다. "crDNA"는 효소 역전사효소를 이용하는 mRNA 주형에 상보적이고 그로부터 합성되는 DNA를 지칭한다. cDNA는 단일 가닥이거나 DNA 중합효소 I의 클레노브(Klenow) 단편을 사용하여 이중 가닥 형태로 변환될 수 있다. "센스" RNA는, mRNA를 포함하고 세포내에서 또는 시험관내에서 단백질로 번역될 수 있는 RNA 전사체를 지칭한다. "안티센스 RNA"는, 표적 1차 전사체 또는 mRNA의 전부 또는 일부에 상보적이고 표적 유전자의 발현을 차단하는 RNA 전사체를 지칭한다(예를 들어, 미국 특허 5,107,065호 참조). 안티센스 RNA의 상보성은 특정 유전자 전사체의 임의의 부분, 즉 5' 비코딩 서열, 3' 비코딩 서열, 인트론 또는 코딩 서열과 함께 있을 수 있다. "기능성 RNA"는 번역되지 않을 수 있지만 세포 프로세스에 영향을 미치는 안티센스 RNA, 리보자임 RNA 또는 기타 RNA를 지칭한다. 용어 "보체"(complement) 및 "역보체"(reverse complement)는 mRNA 전사체에 대하여 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 메시지의 안티센스 RNA를 정의하기 위한 것이다.
"작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 하나의 기능이 다른 하나에 의해 조절되도록 된 단일 핵산 단편 상에서의 핵산 서열들의 결합을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는, 코딩 서열의 발현을 조절할 수 있는 경우(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 조절 하에 있을 때), 코딩 서열과 작동 가능하게 연결된다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 방향으로 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다른 예에서, 상보적 RNA 영역은 표적 mRNA의 5', 또는 표적 mRNA의 3', 또는 표적 mRNA 내에, 직접 또는 간접적으로, 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 제1 상보적 영역은 표적 mRNA의 5'이고 그 보체는 표적 mRNA의 3'이다.
본원에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 복제 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989)에 더 자세히 기술되어 있다. 형질전환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고 아래에 설명된다.
"PCR" 또는 "중합효소 연쇄 반응"(polymerase chain reaction)은 특정 DNA 분절의 합성을 위한 기술이며, 일련의 반복적인 변성, 어닐링 및 확장 사이클로 구성된다. 일반적으로, 이중 가닥 DNA는 열 변성되고, 표적 분절의 3' 경계에 상보적인 두 개의 프라이머는 저온에서 DNA에 어닐링된 후 중간 온도에서 확장된다. 이러한 3개의 연속 단계의 한 세트를 "사이클"이라고 한다.
용어 "재조합"은, 예를 들어, 유전자 조작 기술에 의해 단리된 핵산 분절의 조작, 또는 화학적 합성에 의한, 그렇지 않았다면 분리된 2개의 서열 분절의 인공 조합을 지칭한다.
용어 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"는 세포의 중심 물질대사의 일부가 아닌 유전자를 종종 운반하는, 일반적으로 이중 가닥 DNA 형태의 염색체외 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래된 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의, 선형 또는 원형 형태의, 자율적 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있고, 다수의 뉴클레오티드 서열은 세포에 관심 폴리뉴클레오티드를 도입할 수 있는 고유의 구조로 결합되거나 재조합되어 있다. "형질전환 카세트"는 유전자를 포함하면서 유전자 이외에 특정 숙주 세포의 형질전환을 촉진하는 요소를 갖는 특정 벡터를 지칭한다. "발현 카세트"는 유전자를 포함하면서 유전자 이외에 숙주에서 그 유전자의 발현을 가능하게 하는 요소를 갖는 특정 벡터를 지칭한다.
용어 "재조합 DNA 분자", "재조합 작제물", "발현 작제물", "작제물", "작제물", 및 "재조합 DNA 작제물"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 재조합 작제물은 핵산 단편, 예를 들어, 자연계에서 모두가 함께 발견되지는 않는 조절 서열 및 코딩 서열의 인공 조합을 포함한다. 예를 들어, 작제물은 상이한 공급원으로부터 유래된 조절 서열과 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되었지만 자연계에서 발견되는 것과는 다른 방식으로 배열된 조절 서열과 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이러한 작제물은 단독으로 사용되거나 벡터와 함께 사용될 수 있다. 벡터가 사용되는 경우, 벡터의 선택은 당업자에게 잘 알려진 바와 같이 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용될 방법에 의존한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다. 당업자는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환시키고 선택하고 증식시키기 위해 벡터에 존재해야 하는 유전 요소를 잘 알고 있다. 당업자는 또한, 서로 다른 독립적인 형질전환 사건이 상이한 발현 수준 및 패턴을 초래할 수 있으므로(Jones et al., (1985) EMBO J 4:2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol Gen Genetics 218:78-86), 원하는 발현 수준 및 패턴을 나타내는 계통을 얻기 위해 일반적으로 여러 사건이 스크리닝된다는 것을 인식할 것이다. 이러한 스크리닝은 표준 분자 생물학적, 생화학적 분석, 및 DNA의 서던 분석, mRNA 발현의 노던 분석, PCR, 실시간 정량 PCR(qPCR), 역전사 PCR(RT-PCR), 단백질 발현의 면역블로팅 분석, 효소 또는 활성 분석, 및/또는 표현형 분석을 비롯한 기타 분석법에 의해 달성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 전구체 또는 성숙한 형태의 기능적 최종 생성물(예컨대, mRNA, 가이드 RNA 또는 단백질)의 생산을 지칭한다.
용어 "도입"은 화합물, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 핵산(예를 들어, 발현 작제물) 또는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 세포에 도입, 제공, 접촉하는 것에 대한 언급을 포함한다. 도입은 폴리뉴클레오티드(예컨대, RNA, DNA, RNA-DNA 하이브리드, 단일 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 선형 또는 원형 폴리뉴클레오티드)의 직접 전달 및/또는 단백질(폴리펩티드)의 직접 전달을 포함한다. 도입은 핵산이 세포의 게놈에 혼입될 수 있는 진핵 또는 원핵 세포 내로의 핵산 또는 폴리펩티드의 혼입에 대한 언급을 포함하며, 핵산 또는 단백질을 세포에 일시적으로 도입하는 것에 대한 언급을 포함한다. 도입은 안정적이거나 일시적인 형질전환 방법, 형질감염, 형질도입, 미세주입, 전기천공, 바이러스성 방법, 아그로박테리움 매개 형질전환, 탄도 입자 가속, 휘스커 매개 형질전환, 뿐만 아니라 유성 교배에 대한 언급을 포함한다. 따라서, 핵산 단편(예를 들어, 재조합 DNA 작제물/발현 작제물, 가이드 RNA, 가이드 DNA, 주형 DNA, 공여 DNA)을 세포에 삽입하는 맥락에서의 "도입"은 "형질감염" 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"을 포함하며, 핵산 단편이 세포의 게놈(예를 들어, 염색체, 플라스미드, 색소체, 또는 미토콘드리아 DNA)에 혼입되거나, 자율적 레플리콘으로 변환되거나, 또는 일시적으로 발현될 수 있는(예를 들어, 형질감염된 mRNA) 진핵 또는 원핵 세포 내로의 핵산 단편의 혼입에 대한 언급을 포함한다.
안정적 형질전환 방법, 일시적 형질전환 방법, 바이러스 매개 방법, 유성 교배 및 유성 번식을 비롯하여, 조성물을 생물에 도입, 접촉 및/또는 제공하는 다양한 방법이 공지되어 있다. 안정적 형질전환은 도입된 폴리뉴클레오티드가 생물의 게놈에 통합되고 그의 자손에 의해 유전될 수 있음을 나타낸다. 일시적 형질전환은 도입된 조성물이 단지 일시적으로 생물에서 발현되거나 존재함을 나타낸다.
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 세포 또는 생물에 접촉, 제공, 도입하기 위한 프로토콜은 알려져 있으며, 미세주입(Crossway et al., (1986) Biotechniques 4:320-34 및 미국 특허. 6,300,543호), 분열조직 형질전환(미국 특허 5,736,369호), 전기천공(Riggs et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-6, 아그로박테리움 매개 형질전환(미국 특허 5,563,055호 및 5,981,840호), 휘스커 매개 형질전환(Ainley et al. 2013, Plant Biotechnology Journal 11:1126-1134; Shaheen A. and M. Arshad 2011 Properties and Applications of Silicon Carbide (2011), 345-358 Editor(s): Gerhardt, Rosario. Publisher: InTech, Rijeka, Croatia. CODEN: 69PQBP; ISBN: 978-953-307-201-2), 직접 유전자 전달(Paszkowski et al., (1984) EMBO J 3:2717-22), 및 탄도 입자 가속(미국 특허 4,945,050호; 5,879,918호; 5,886,244호; 5,932,782호; Tomes et al., (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment" in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg & Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al., (1988) Biotechnology 6:923-6; Weissinger et al., (1988) Ann Rev Genet 22:421-77; Sanford et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (양파); Christou et al., (1988) Plant Physiol 87:671-4 (대두); Finer and McMullen, (1991) In Vitro Cell Dev Biol 27P:175-82 (대두); Singh et al., (1998) Theor Appl Genet 96:319-24 (대두); Datta et al., (1990) Biotechnology 8:736-40 (벼); Klein et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-9 (옥수수); Klein et al., (1988) Biotechnology 6:559-63 (옥수수); 미국 특허 5,240,855호; 5,322,783호 및 5,324,646호; Klein et al., (1988) Plant Physiol 91:440-4 (옥수수); Fromm et al., (1990) Biotechnology 8:833-9 (옥수수); Hooykaas-Van Slogteren et al., (1984) Nature 311:763-4; 미국 특허 5,736,369호 (곡물); Bytebier et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-9 (백합과); De Wet et al., (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al., (Longman, New York), pp. 197-209 (꽃가루); Kaeppler et al., (1990) Plant Cell Rep 9:415-8) 및 Kaeppler et al., (1992) Theor Appl Genet 84:560-6 (휘스커 매개 형질전환); D'Halluin et al., (1992) Plant Cell 4:1495-505 (전기천공); Li et al., (1993) Plant Cell Rep 12:250-5; Christou and Ford (1995) Annals Botany 75:407-13 (벼) 및 Osjoda et al., (1996) Nat Biotechnol 14:745-50 (아그로박테리움 투메파시엔스를 통한 옥수수)를 포함한다.
대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 세포 또는 생물을 바이러스 또는 바이러스성 핵산과 접촉시켜 세포 또는 생물에 도입될 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 바이러스성 DNA 또는 RNA 분자 내에 폴리뉴클레오티드를 혼입시키는 것을 포함한다. 일부 예에서, 관심 폴리펩티드는 처음에 바이러스성 폴리단백질의 일부로서 합성될 수 있고, 후에 생체내 또는 시험관내에서 단백질분해에 의해 처리되어 원하는 재조합 단백질을 생성한다. 바이러스성 DNA 또는 RNA 분자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 식물에 도입하고 거기에서 암호화된 단백질을 발현시키는 방법은 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 5,889,191호, 5,889,190호, 5,866,785호, 5,589,367호 및 5,316,931호를 참조). 일시적 형질전환 방법은 이중 가닥 절단 유도제와 같은 폴리펩티드를 생물에 직접 도입하는 것, 생물에 DNA 및/또는 RNA 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것, 및 이중 가닥 절단 유도제를 암호화하는 mRNA와 같은 RNA 전사체를 도입하는 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 방법은, 예를 들어, 미세주입 또는 유전자총을 포함한다. 예를 들어, Crossway et al., (1986) Mol Gen Genet 202:179-85; Nomura et al., (1986) Plant Sci 44:53-8; Hepler et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2176-80; 및, Hush et al., (1994) J Cell Sci 107:775-84 참조.
핵산 및 단백질은 유도 Cas 시스템의 어느 한 성분 또는 모든 성분(단백질 및/또는 핵산)의 흡수를 촉진하기 위해 분자, 예컨대 세포 침투성 펩티드 및 나노캐리어를 이용하는 방법을 비롯한 임의의 방법에 의해 세포에 제공될 수 있다. 또한, 본원에 참조로 포함되는, US20110035836 Nanocarier based plant transfection and transduction, 및 EP 2821486 A1 Method of introducing nucleic acid into plant cells를 참조.
가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 세포에 도입하는 것은 상기 복합체의 개별 성분을 개별적으로 또는 결합하여, 직접(가이드를 위한 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제를 위한 단백질로서 직접 전달) 또는 그 성분(가이드 RNA, Cas 엔도뉴클레아제)을 발현하는 재조합 작제물을 통해 세포에 도입하는 것을 포함한다. 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 세포에 도입하는 것은 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 리보뉴클레오티드-단백질로서 세포에 도입하는 것을 포함한다. 리보뉴클레오티드-단백질은 본원에 기술된 바와 같이 세포에 도입되기 전에 조립될 수 있다.
식물 세포는 RGEN 리보핵산단백질의 직접 전달 및/또는 RGEN 성분의 직접 전달에 대한 장벽으로 작용할 수 있는 식물 세포벽을 포함한다는 점에서 인간 및 동물 세포와 다르다.
본원에 기술된 바와 같이, 식물 세포로의 RGEN 리보핵산단백질의 직접 전달은 입자 매개 전달(유전자총)을 통해 달성될 수 있다. 본원에 기술된 실험에 기초하여, 당업자는 이제 임의의 다른 직접적인 전달 방법, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개 원형질체로의 형질감염, 전기천공, 세포 침투성 펩티드, 또는 메조포러스 실리카 나노입자(MSN) 매개 직접 단백질 전달이 식물 세포에 RGEN 리보핵산단백질을 전달하기 위해 성공적으로 이용될 수 있음을 구상할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, RGEN 리보핵산단백질의 직접 전달은 세포의 게놈 내 표적 부위에서의 게놈 편집 후 복합체가 빠르게 분해되고, 복합체가 세포에 일시적으로만 존재할 수 있게 한다. 이러한 RGEN 복합체의 일시적 존재는 표적 이탈 효과의 감소로 이어질 수 있다. 반면, 플라스미드 DNA 서열을 통한 RGEN 성분(가이드 RNA, Cas9 엔도뉴클레아제)의 전달은 표적 이탈 효과를 가중시킬 수 있는 이러한 플라스미드로부터 RGEN의 일정한 발현을 초래할 수 있다(Cradick, T. J. et al (2013) Nucleic Acids Res 41:9584-9592; Fu, Y et al (2014) Nat. Biotechnol. 31:822-826).
직접 전달은, RNA 유도 엔도뉴클레아제(가이드 RNA, Cas 단백질, gRNA 또는 Cas 엔도뉴클레아제를 암호화하는 mRNA)의 어느 한 성분 또는 RGEN 복합체 자체를 미립자, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 금 입자, 텅스텐 입자, 및 탄화규소 휘스커 입자를 포함하는 입자 전달 매트릭스와 결합시킴으로써 달성될 수 있다. 미립자를 플라스미드 DNA 및 관심 DNA에 결합시키는 본원에 기술된 결합 방법의 예는 미립자에 가이드 RNA 분자, mRNA 분자, Cas 단백질 및 RGEN 복합체를 코팅하는 데 이용될 수도 있다.
이러한 코팅된 미립자는 실시예 8에 기술된 유전자총 방법과 같이 당업계에 공지된 임의의 직접적인 방법에 의해 세포에 도입될 수 있다. RGEN 성분을 미립자에 코팅할 수 있도록 하기 위해 미립자 및 RGEN 성분 또는 RGEN 복합체는 임의의 물질로 결합(혼합)될 수 있다. 예를 들어, RGEN 성분은 임의의 적절한 완충액(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 수용성 양이온성 지질, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만 TransIT-2020 형질감염 시약(Cat# MIR 5404, Mirus, USA))을 사용하여 적어도 0.1 ㎛, 0.2 ㎛, 0.3 ㎛, 0.4 ㎛, 0.5 ㎛, 0.6 ㎛, 0.7 ㎛, 0.8 ㎛, 0.9 ㎛ 또는 1.0 ㎛ 직경 범위의 직경을 갖는 금 펠렛 상에 침전될 수 있다. RGEN 성분 용액은 적어도 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.6 ㎍, 0.7 ㎍, 0.8 ㎍, 0.9 ㎍, 1.0 ㎍, 2.0 ㎍, 3.0 ㎍, 4.0 ㎍, 5.0 ㎍, 6.0 ㎍, 7.0 ㎍, 8.0 ㎍, 9.0 ㎍ 또는 10 ㎍의 RNA(유도 RNA 또는 mRNA) 또는 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 사용하여 얼음 위에서(또는 미립자 결합을 가능하게 하는 데 적합한 임의의 온도에서) 제조될 수 있다. RGEN 복합체의 미리 혼합된 RGEN 성분에, 적어도 1 ㎕ 내지 20 ㎕의 제조된 미립자를 조심스럽게 첨가하고 혼합할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 세포 내에 전달하는 방법으로서, 적어도 하나의 가이드 RNA 분자와 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 결합하여 리보뉴클레오티드-단백질을 형성하는 단계 및 상기 리보뉴클레오티드-단백질을 입자 전달 매트릭스와 결합하여 상기 리보뉴클레오티드-단백질과 매트릭스가 결합될 수 있도록 하여 리보뉴클레오티드-단백질-매트릭스 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 리보뉴클레오티드-단백질-매트릭스 복합체를 상기 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 입자 전달 매트릭스는 양이온성 지질과 결합된 미립자를 포함할 수 있다.
용어 "양이온성 지질"은 수용성 양이온성 지질, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, TransIT-2020, 또는 양이온성 지질 용액, 예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, N,N,N',N'-테트라메틸-N, N'-비스(2-하이드록시에틸)-2,3-디(올레오일옥시)-1,4-부탄디암모늄 요오드화물, 및 L-디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)을 포함하는 양이온성 지질 용액에 대한 언급을 포함한다(또한, 본원에 참조로 포함되는, 2007년 8월 2일 공개된 US2007/0178593 참조).
입자 전달 매트릭스는 금 입자, 텅스텐 입자, 및 탄화규소 휘스커 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 미립자를 포함할 수 있다.
입자 전달 매트릭스는 Tfx-10™, Tfx-20™, Tfx-50™, Lipofectin™, Lipofectamine™, Cellfectin™, Effectene™, Cytofectin GSV™, Perfect Lipids™, DOTAP™, DMRIE-C™, FuGENE-6™, Superfect™, Polyfeet™, 폴리에틸렌이민, 키토산, 프로타민 Cl, 히스톤 H1, 히스톤 CENH3, 폴리-L 라이신, 및 DMSA로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 더 포함할 수 있다(본원에 참조로 포함되는, 2007년 8월 2일 공개된 US2007/0178593).
RGEN 성분들은 또한, 복합체를 형성할 수 있는 임의의 온도, 예컨대 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃ ,10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23.0℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33.0℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃ 및 40℃ 범위의 온도에서, 복합체 형성을 가능하게 하는 데 적합한 용액(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, Cas9 완충액(NEB))에서, 적어도 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.6 ㎍, 0.7 ㎍, 0.8 ㎍, 0.9 ㎍, 1.0 ㎍, 2.0 ㎍, 3.0 ㎍, 4.0 ㎍, 5.0 ㎍, 6.0 ㎍, 7.0 ㎍, 8.0 ㎍, 9.0 ㎍ 또는 10 ㎍의 가이드 RNA를 적어도 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.6 ㎍, 0.7 ㎍, 0.8 ㎍, 0.9 ㎍, 1.0 ㎍, 2.0 ㎍, 3.0 ㎍, 4.0 ㎍, 5.0 ㎍, 6.0 ㎍, 7.0 ㎍, 8.0 ㎍, 9.0 ㎍ 또는 10 ㎍의 Cas 엔도뉴클레아제와 결합함으로써 미립자에 코팅되기 전에 결합될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 성분을 세포 내에 전달하는 방법으로서, 적어도 하나의 가이드 RNA 분자 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 세포에 도입하는 단계, 및 상기 가이드 RNA 및 상기 Cas 엔도뉴클레아제 단백질이 상기 세포 내에 복합체를 형성할 수 있도록 적절한 조건 하에서 상기 세포를 성장시키는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 성분을 세포 내에 전달하는 방법으로서, 적어도 하나의 가이드 RNA 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA를 세포에 도입하는 단계, 및 상기 mRNA가 상기 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 번역하고 상기 가이드 RNA와 복합체를 형성할 수 있도록 적절한 조건 하에서 상기 세포를 성장시키는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 세포 내에 전달하는 방법으로서, 적어도 하나의 가이드 RNA 분자와 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 결합하여 리보뉴클레오티드-단백질을 형성하고, 상기 리보뉴클레오티드-단백질을 입자 전달 매트릭스와 결합하여 상기 리보뉴클레오티드-단백질과 매트릭스가 결합될 수 있도록 하여 리보뉴클레오티드-단백질-매트릭스 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 리보뉴클레오티드-단백질-매트릭스 복합체를 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 주형과 함께 상기 세포에 도입하되, 상기 폴리뉴클레오티드 변형 주형은 상기 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드 변형 주형의 상기 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형은 (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, (ii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, (iii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 및 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 세포 내에 전달하는 방법으로서, 적어도 하나의 가이드 RNA 분자와 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 결합하여 리보뉴클레오티드-단백질을 형성하고, 상기 리보뉴클레오티드-단백질을 입자 전달 매트릭스와 결합하여 상기 리보뉴클레오티드-단백질과 매트릭스가 결합될 수 있도록 하여 리보뉴클레오티드-단백질-매트릭스 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 리보뉴클레오티드-단백질-매트릭스 복합체를 공여 DNA와 함께 상기 세포에 도입하되, 상기 공여 DNA는 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
세포 성장에 적합한 조건은 당업계에 잘 알려져 있고, 당업자는 세포의 유형에 기초하여 임의의 성장 조건(예컨대, 식물 세포에 적합한 조건)을 사용할 수 있다. 실시예 8에 기술된 바와 같이, 식물 배아 또는 세포는 당업계에 공지된 임의의 식물 유지 배지(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 560P, 실시예 8)에서 26℃ 내지 37℃ 범위의 온도에서 12 내지 48시간 동안 배양되고 나서, 26℃에 배치될 수 있다. 5 내지 7일 후, 배아/세포는 당업계에 공지된 임의의 선택 배지(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, 560R, 실시예 8)로 옮겨지고, 그 후에 계대배양된다.
RGEN 성분(가이드 RNA, Cas 엔도뉴클레아제 단백질 포함)은, 복합체를 형성할 수 있는 임의의 온도, 예컨대 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃ ,10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃ 및 40℃ 범위의 온도에서, 복합체 형성을 가능하게 하는 데 적합한 용액(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, Cas9 완충액(NEB))에서, 적어도 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.6 ㎍, 0.7 ㎍, 0.8 ㎍, 0.9 ㎍, 1.0 ㎍, 2.0 ㎍, 3.0 ㎍, 4.0 ㎍, 5.0 ㎍, 6.0 ㎍, 7.0 ㎍, 8.0 ㎍, 9.0 ㎍ 또는 10 ㎍의 가이드 RNA를 적어도 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.6 ㎍, 0.7 ㎍, 0.8 ㎍, 0.9 ㎍, 1.0 ㎍, 2.0 ㎍, 3.0 ㎍, 4.0 ㎍, 5.0 ㎍, 6.0 ㎍, 7.0 ㎍, 8.0 ㎍, 9.0 ㎍ 또는 10 ㎍의 Cas 엔도뉴클레아제와 결합함으로써 미립자에 코팅되기 전(미립자와 결합되기 전)에 결합되어 리보뉴클레오티드-단백질 복합체(RNP)를 형성할 수 있다.
"성숙" 단백질은 번역후 가공된 폴리펩티드(즉, 1차 번역 생성물에 존재하는 임의의 프리펩티드 또는 프로펩티드가 제거된 것)를 지칭한다. "전구체" 단백질은 mRNA 번역의 1차 생성물(즉, 프리펩티드 및 프로펩티드가 여전히 존재함)을 지칭한다. 프리펩티드 및 프로펩티드는 세포내 국재화 신호일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"안정적 형질전환"은 핵 및 세포소기관 게놈을 비롯한 숙주 생물의 게놈 내로 핵산 단편이 전달되어 유전적으로 안정한 유전(inheritance)을 야기하는 것을 지칭한다. 한편, "일시적 형질전환"은 숙주 생물의 핵 또는 기타 DNA 함유 세포소기관 내에 핵산 단편이 전달되어 통합 또는 안정적 유전 없이 유전자 발현을 야기하는 것을 지칭한다. 형질전환된 핵산 단편을 포함하는 숙주 생물은 "유전자이식 생물"로 지칭된다.
유전적으로 개선된 생식질의 상업적 개발은 또한, 종종 유전자 스태킹 접근법이라고 하는, 경작 식물에 다양한 형질을 도입하는 단계까지 진전되었다. 이러한 접근법에서, 상이한 관심 특성을 부여하는 다양한 유전자가 식물에 도입될 수 있다. 유전자 스태킹은 동시 형질전환, 재형질전환, 및 관심 유전자가 상이한 세포주 교차를 비제한적으로 포함하는 많은 수단에 의해 달성될 수 있다.
세포는 인간, 비인간, 동물, 박테리아, 진균, 곤충, 효모 및 식물의 세포뿐만 아니라 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 식물 및 종자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 식물 세포는 옥수수, 벼, 수수, 호밀, 보리, 밀, 밀렛, 귀리, 사탕 수수, 잔디, 또는 스위치그래스, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 목화, 담배, 땅콩, 감자, 담배, 애기장대, 및 잇꽃 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 포함한다.
"식물"은 전체 식물, 식물 기관, 식물 조직, 종자, 및 식물 세포, 및 그 자손에 대한 언급을 포함한다. 식물 세포는 종자로부터의 세포, 현탁액 배양물, 배아, 분열부, 캘러스 조직, 잎, 뿌리, 어린 싹, 배우체, 포자체, 꽃가루 및 미포자를 제한 없이 포함한다. 식물 부분은 뿌리, 줄기, 어린 싹, 잎, 꽃가루, 종자, 종양 조직 및 다양한 형태의 세포 및 배양물(예컨대, 단일 세포, 원형질체, 배아 및 캘러스 조직)을 비제한적으로 포함하는 분화 및 미분화 조직을 포함한다. 식물 조직은 식물에, 또는 식물 기관, 조직, 또는 세포 배양물에 있을 수 있다. 용어 "식물 기관"은 형태학적 및 기능적으로 구별되는 식물의 부분을 구성하는 식물 조직 또는 조직들의 집합을 지칭한다. 용어 "게놈"은 생물 또는 바이러스의 각각의 세포 또는 세포소기관에 존재하는 유전 물질(유전자 및 비코딩 서열)의 전체 보체; 및/또는 한쪽 모체로부터 (반수체) 단위로서 유전된 완전한 염색체 세트를 지칭한다. "자손"은 식물의 임의의 후속 세대를 포함한다.
유전자이식 식물은, 예를 들어, 형질전환 단계에 의해 도입된 이종 폴리뉴클레오티드를 게놈 내에 포함하는 식물을 포함한다. 이종 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 대대로 전달되도록 게놈에 안정적으로 통합될 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드는 단독으로 또는 재조합 DNA 작제물의 일부로서 게놈에 통합될 수 있다. 유전자이식 식물은 게놈 내에 하나보다 많은 이종 폴리뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. 각각의 이종 폴리뉴클레오티드는 유전자이식 식물에 상이한 형질을 부여할 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드는 외래종으로부터 유래하는 서열, 또는 동일 종으로부터 유래하는 경우, 고유의 형태로부터 실질적으로 변형될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 유전자이식체는 초기에 그렇게 변경된 유전자이식체뿐만 아니라 초기의 유전자이식체로부터 유성 교배 또는 무성 번식에 의해 생성된 것들을 비롯하여, 이종 핵산의 존재에 의해 유전형이 변경된 임의의 세포, 세포주, 캘러스, 조직, 식물 부분 또는 식물을 포함할 수 있다. 종래의 식물 육종법, 외래 폴리뉴클레오티드의 삽입을 초래하지 않는 본원에 기술된 게놈 편집 절차, 또는 자연적으로 발생하는 사건, 예컨대, 무작위 타가 수정, 비재조합 바이러스 감염, 비재조합 박테리아 형질변형, 비재조합 전위, 또는 자연 돌연변이에 의한 (염색체 또는 염색체외) 게놈의 변경은 유전자이식체로 간주되지 않는다.
본 발명의 특정 구현예에서, 가임성 식물은 생존 가능한 웅성 및 자성 생식세포를 생산하는 식물이며, 자가 수정한다. 이러한 자가 수정 식물은 임의의 다른 생식세포 식물 및 그 안에 포함된 유전 물질의 기여 없이 자손 식물을 생산할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예는 식물이 생존 가능하거나 달리 수정할 수 있는 웅성 생식세포, 또는 자성 생식세포, 또는 둘 다를 생산하지 않기 때문에 자가 수정하지 않는 식물의 사용을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "웅성 불임성 식물"은 생존 가능하거나 달리 수정할 수 있는 웅성 생식세포를 생산하지 않는 식물이다. 본원에 사용된 "자성 불임성 식물"은 생존 가능하거나 달리 수정할 수 있는 자성 생식세포를 생산하지 않는 식물이다. 웅성 불임성 및 자성 불임성 식물은 각각 자성 가임성 및 웅성 가임성일 수 있는 것으로 인정된다. 또한, 웅성 가임성(이지만, 자성 불임성) 식물은 자성 가임성 식물과 교배될 때 생존 가능한 자손을 생산할 수 있고, 자성 가임성(이지만, 웅성 불임성) 식물은 웅성 가임성 식물과 교배될 때 생존 가능한 자손을 생산할 수 있는 것으로 인정된다.
본원에서 "비통상적 효모"는 사카로마이세스(예컨대, S. 세레비시애) 또는 스키조사카로마이세스 효모 종이 아닌 임의의 효모를 지칭한다. 비통상적 효모는, 본원에 참조로 포함되는 Non-Conventional Yeasts in Genetics, Biochemistry and Biotechnology: Practical Protocols (K. Wolf, K.D. Breunig, G. Barth, Eds., Springer-Verlag, Berlin, Germany, 2003)에 기술되어 있다. 특정 구현예에서 비통상적인 효모는 추가적으로(또는 대안적으로) 상동 재조합(HR)에 의해 매개되는 복구 프로세스보다 비상동 말단 연결(NHEJ) DNA 복구 프로세스를 선호하는 효모일 수 있다. 이러한 맥락에서(HR보다 NHEJ를 선호) 비통상적인 효모의 정의는 본원에 참조로 포함되는 Chen et al. (PLoS ONE 8:e57952)에 더 개시되어 있다. 본원에서 바람직한 비통상적인 효모는 야로위아 속(예를 들어, 야로위아 리폴리티카)의 것들이다. 본원의 용어 "효모"는 주로 단세포 형태로 존재하는 진균 종을 지칭한다. 효모는 본원에서 선택적으로 "효모 세포"로 지칭될 수 있다(또한, 본원에 참조로 포함되는, 2014년 8월 13일 출원된 미국 가출원 62/036,652 참조).
"센티모건" (cM) 또는 "지도 단위"는 두 개의 연결된 유전자, 마커, 표적 부위, 유전자좌, 또는 이들의 임의의 쌍 간의 거리이고, 감수분열 생성물의 1%는 재조합이다. 따라서, 센티모건은 두 개의 연결된 유전자, 마커, 표적 부위, 유전자좌, 또는 이들의 임의의 쌍 간의 1% 평균 재조합 빈도와 동일한 거리에 해당한다.
본 발명은 하나 이상의 도입된 형질을 포함하는 식물의 육종에 유용하다. 가장 일반적으로, 유전자이식 형질은 아그로박테리움, 바이올리스틱, 또는 기타 일반적으로 사용되는 절차를 기반으로 한 형질전환 시스템의 결과로서 식물 게놈 전체에 무작위로 삽입된다. 최근에는, 유도된 이식유전자 삽입이 가능한 유전자 표적화 프로토콜이 개발되었다. 하나의 중요한 기술인 부위 특이적 통합(SSI)은 이전에 삽입된 이식유전자와 동일한 염색체 위치에 이식유전자를 표적화할 수 있다. 맞춤 설계된 메가뉴클레아제 및 맞춤 설계된 징크 핑거 메가뉴클레아제로 인해 연구자들은 특정 염색체 위치를 표적화하도록 뉴클레아제를 설계할 수 있으며, 이들 시약은 이러한 뉴클레아제에 의해 절단된 염색체 위치에 이식유전자를 표적화할 수 있도록 한다.
진핵 게놈, 예컨대, 식물 게놈의 정밀 유전자 조작을 위해 현재 사용되는 시스템은 호밍 엔도뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 및 전사 활성물질-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)에 의존하며, 이들은 모든 새로운 표적 유전자좌에 대해 다시 새로운 단백질 조작을 필요로 한다. 본원에 기술된 매우 특이적인, RNA-유도 DNA 뉴클레아제, 가이드 RNA/Cas9 엔도뉴클레아제 시스템은 보다 용이하게 맞춤 설계될 수 있으므로, 많은 상이한 표적 서열의 변형이 목표인 경우 더욱 유용하다.
본원에 기술된 가이드 RNA/Cas 시스템은 뉴클레아제 표적 이탈 절단이 표적 세포에 독성을 나타낼 수 있는 환경에서 게놈 조작, 특히 식물 게놈 조작에 특히 유용하다. 본원에 기술된 가이드 RNA/Cas 시스템의 일 구현예에서, 발현 최적화된 Cas9 유전자는 표적 게놈, 예를 들어, 식물 게놈에 안정적으로 통합된다. Cas9 유전자의 발현은 프로모터, 예를 들어, 항시성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 유도성 프로모터, 예를 들어, 온도 유도성, 스트레스 유도성, 발육 단계 유도성, 또는 화학적 유도성 프로모터일 수 있는 식물 프로모터의 제어 하에 있다. 가이드 RNA 또는 crRNA의 부재시, Cas9 단백질은 DNA를 자를 수 없으므로 식물 세포에서 그 존재는 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않을 것이다. 따라서, 본원에 기술된 가이드 RNA/Cas 시스템의 주요 장점은 세포 생존력에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 Cas9 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있는 세포주 또는 유전자이식 생물을 생성하고 유지하는 능력이다. 원하는 게놈 부위에서 절단을 유도하여 표적화된 유전자 변형을 달성하기 위해, 가이드 RNA 또는 crRNA는 안정적으로 통합되고 발현된 cas9 유전자를 포함하는 세포에 다양한 방법으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA 또는 crRNA는 화학적 또는 효소적으로 합성되어, 유전자총 또는 전기천공과 같은 직접 전달 방법을 통해 Cas9 발현 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, 표적 세포에서 가이드 RNA 또는 crRNA를 효율적으로 발현시킬 수 있는 유전자가 화학적으로, 효소적으로, 또는 생물학적 시스템에서 합성될 수 있고, 이러한 유전자는 유전자총, 전기천공과 같은 직접 전달 방법 또는 아그로박테리움 매개 DNA 전달과 같은 생물학적 전달 방법을 통해 Cas9 발현 세포에 도입될 수 있다.
가이드 RNA/Cas 시스템 매개 유전자 표적화는 관심 유전자를 도입하기 위해 이중 가닥 절단 유도제를 사용하는 대신, 본원에 개시된 것과 같은 가이드 RNA/Cas 시스템을 사용하는 WO2013/0198888(2013년 8월 1일 공개)에 개시된 것과 유사한 방식으로 이식유전자 삽입을 유도하는 방법 및/또는 여러 이식유전자를 포함하는 복잡한 유전자이식 형질 유전자좌를 생성하는 방법에 사용될 수 있다. 복잡한 형질 유전자좌는 유전자적으로 서로 연결된 여러 이식유전자를 갖는 게놈 유전자좌를 포함한다. 서로로부터 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 2, 또는 심지어 5 센티모건(cM) 내에 독립적 이식유전자를 삽입함으로써, 이식유전자들은 단일 유전자좌로서 증식될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 출원 13/427,138 또는 PCT 출원 PCT/US2012/030061 참조). 이식유전자를 포함하는 식물을 선택한 후, (적어도) 하나의 이식유전자를 포함하는 식물들을 교배하여 양쪽 이식유전자를 모두 포함하는 F1을 형성할 수 있다. 이러한 F1으로부터의 자손(F2 또는 BC1)에서, 1/500의 자손이 동일한 염색체에 재조합된 두 개의 서로 다른 이식유전자를 가질 것이다. 이후, 복잡한 유전자좌는 양쪽 이식유전자 형질을 갖는 단일 유전자좌로 증식될 수 있다. 이 프로세스를 반복하여 원하는 만큼 많은 형질을 쌓을 수 있다.
관심 표현형 또는 형질과 상관 관계가 있는 염색체 간격은 동정될 수 있다. 염색체 간격을 동정하기 위해 당업계에 잘 알려진 다양한 방법을 이용할 수 있다. 이러한 염색체 간격의 경계는 관심 형질을 제어하는 유전자에 연결될 마커를 포함하도록 정해진다. 다시 말해, 염색체 간격은 그 간격 내에 있는 임의의 마커(간격의 경계를 정의하는 말단 마커를 포함)가 노던 잎마름병 저항성을 위한 마커로서 사용될 수 있도록 정해진다. 일 구현예에서, 염색체 간격은 적어도 하나의 QTL을 포함하고, 또한 실제로 하나보다 많은 QTL을 포함할 수 있다. 하나의 마커는 하나보다 많은 QTL에 연결될 수 있으므로, 동일한 간격에서 여러 QTL의 근접성은 특정 마커와 특정 QTL과의 상관 관계를 모호하게 할 수 있다. 반대로, 예를 들어, 근접한 두 개의 마커가 원하는 표현형 형질과 공동 분리를 보이는 경우, 이들 각각의 마커가 동일한 QTL을 동정하는지 두 개의 서로 다른 QTL을 동정하는지 때로는 불분명하다. 용어 "양적 형질 유전자좌" 또는 "QTL"은 적어도 하나의 유전적 배경, 예를 들어, 적어도 하나의 육종 개체군에서 양적 표현형 형질의 차별적 발현과 관련된 DNA의 영역을 지칭한다. QTL의 영역은 문제의 형질에 영향을 미치는 유전자 또는 유전자들을 포함하거나 이들에 밀접하게 연결되어 있다. "QTL의 대립 유전자"는 일배체형과 같은 연속된 게놈 영역 또는 연결 그룹 내에 여러 유전자 또는 기타 유전적 인자를 포함할 수 있다. QTL의 대립 유전자는 특정 창 내의 일배체형을 나타낼 수 있으며, 상기 창은 하나 이상의 다형성 마커의 세트로 정의되고 추적될 수 있는 연속된 게놈 영역이다. 일배체형은 특정 창 내 각각의 마커에서 대립 유전자의 고유의 지문에 의해 정의될 수 있다.
선별 마커 표현형을 사용하지 않고 표적 부위 또는 그 근처에서 변경된 게놈을 가진 세포를 동정하기 위해 다양한 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 PCR 방법, 시퀀싱 방법, 뉴클레아제 분해, 서던 블롯, 및 이들의 임의의 조합을 비제한적으로 포함하여, 표적 서열을 직접 분석하여 표적 서열에서 임의의 변화를 감지하는 것으로 볼 수 있다.
단백질은 아미노산 치환, 결실, 절단, 및 삽입을 비롯한 다양한 방식으로 변경될 수 있다. 이러한 조작 방법은 일반적으로 알려져 있다. 예를 들어, 단백질(들)의 아미노산 서열 변이체는 DNA의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발 및 뉴클레오티드 서열 변경 방법으로는, 예를 들어, Kunkel, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92; Kunkel et al., (1987) Meth Enzymol 154:367-82; 미국 특허 4,873,192호; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) 및 거기에 인용된 참고문헌을 들 수 있다. 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않을 것 같은 아미노산 치환에 관한 지침은, 예를 들어, Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl Biomed Res Found, Washington, D.C.)의 모델에서 찾을 수 있다. 하나의 아미노산을 유사한 성질을 갖는 다른 아미노산과 교환하는 것과 같은 보존적 치환이 바람직할 수 있다. 보존적 결실, 삽입 및 아미노산 치환은 단백질의 특성에 근본적인 변화를 일으킬 것으로 예상되지 않으며, 임의의 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 조합의 효과는 통상적인 스크리닝 분석법에 의해 평가될 수 있다. 이중 가닥 절단 유도 활성에 대한 분석법은 알려져 있고, 일반적으로 표적 부위를 포함하는 DNA 기질 상에서 작용제의 전체 활성 및 특이성을 측정한다.
용어 "쌍떡잎 식물"(dicot)은 "dicotyledoneae"로도 알려진 속씨 식물의 하위강을 지칭하며, 전체 식물, 식물 기관(예컨대, 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자, 식물 세포, 및 그 자손에 대한 언급을 포함한다. 식물 세포는, 본원에 사용된 바와 같이, 종자, 현탁액 배양물, 배아, 분열부, 캘러스 조직, 잎, 뿌리, 어린 싹, 배우체, 포자체, 꽃가루 및 미포자를 제한 없이 포함한다.
본 명세서의 문맥에서 용어 "교배"(crossed, cross, 또는 crossing)는 자손(즉, 세포, 종자, 또는 식물)을 생산하기 위한 수분을 통한 생식세포의 융합을 의미한다. 이 용어는 유성 교배(다른 식물에 의한 식물의 수분) 및 자가생식(자기 수분, 즉, 꽃가루 및 밑씨(또는 소포자 및 대포자)가 동일 식물 또는 유전적으로 동일한 식물로부터 유래된 경우)을 모두 포함한다.
용어 "이입"(introgression)은 유전자좌의 원하는 대립 유전자가 하나의 유전적 배경으로부터 다른 유전적 배경으로 유전되는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 유전자좌에서의 원하는 대립 유전자의 이입은, 적어도 하나의 모체 식물이 그 게놈 내에 원하는 대립 유전자를 갖는 두 모체 식물 간의 유성 교배를 통해 적어도 하나의 자손 식물에 유전될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 대립 유전자의 유전은, 예를 들어, 적어도 하나의 공여 원형질체가 그 게놈 내에 원하는 대립 유전자를 갖는 융합된 원형질체에서, 두 공여 게놈 간의 재조합에 의해 일어날 수 있다. 원하는 대립 유전자는, 예를 들어, 이식유전자, 변형된(돌연변이되거나 편집된) 고유의 대립 유전자, 또는 마커 또는 QTL의 선택된 대립 유전자일 수 있다.
표준 DNA 단리, 정제, 분자 복제, 벡터 작제 및 검증/특성화 방법은 잘 확립되어 있다(예를 들어, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) 참조). 벡터 및 작제물은 원형 플라스미드, 및 관심 폴리뉴클레오티드와 선택적으로 링커, 어댑터, 조절 또는 분석을 비롯한 다른 성분을 포함하는 선형 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서, 인식 부위 및/또는 표적 부위는 인트론, 코딩 서열, 5' UTR, 3' UTR, 및/또는 조절 영역 내에 포함될 수 있다.
본 발명은 또한, 표적 부위 내 이중 가닥 절단에 결합할 수 있고 이를 생성할 수 있는 가이드 RNA/Cas 시스템을 식물, 식물 세포, 또는 식물 부분에서 발현시키기 위한 발현 작제물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명의 발현 작제물은 Cas 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 본 발명의 가이드 RNA에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 프로모터는 식물 세포에서 작동 가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도할 수 있다.
외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물을 비롯한 임의의 식물이 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 외떡잎 식물의 예는 옥수수(제아 메이스(Zea mays)), 벼(오리자 사티바(Oryza sativa)), 호밀(세칼레 세레알레(Secale cereale)), 수수(소르검 비칼라(Sorghum bicolor), 소르검 불가레(Sorghum vulgare)), 밀렛(예컨대, 펄 밀렛(페니세툼 글라쿰(Pennisetum glaucum)), 프로소 밀렛(파니쿰 밀리아세움(Panicum miliaceum)), 조(세타리아 이탈리카(Setaria italica)), 손가락조(엘류신 코라카나(Eleusine coracana))), 밀(트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum), 사탕수수(사카룸(Saccharum) 종), 귀리(아베나(Avena)), 보리(호르데움(Hordeum)), 스위치그래스(파니쿰 비르가툼(Panicum virgatum), 파인애플(아나나스 코모수스(Ananas comosus)), 바나나(무사(Musa) 종), 야자, 관상용 식물, 잔디, 및 기타 풀을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 쌍떡잎 식물의 예는 대두(글리신 맥스(Glycine max)), 카놀라(브라시카 나푸스(Brassica napus) 및 브라시카 캠페스트리스(B. campestris)), 알팔파(메디카고 사티바(Medicago sativa)), 담배(니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)), 아라비돕시스(아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)), 해바라기(헬리안투스 안누스(Helianthus annuus)), 목화(고시피움 아르보레움(Gossypium arboreum)), 땅콩(아라키스 하이포개아(Arachis hypogaea)), 토마토(솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum)) 및 감자(솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum)) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
약어의 의미는 다음과 같다: "sec"는 초, "min"은 분, "h"는 시간, "d"는 일, "μL"는 마이크로리터, "mL"은 밀리리터, "L"은 리터, "μM"은 마이크로몰, "mM"은 밀리몰, "M"은 몰, "mmol"은 밀리몰, "μmole"은 마이크로몰, "g"는 그램, "㎍"는 마이크로그램, "ng"는 나노그램, "U"는 단위, "bp"는 염기쌍, "kb"는 킬로염기를 의미한다.
본원에 개시된 조성물 및 방법의 비제한적인 예는 다음과 같다:
1. 세포의 게놈 내 비기능성 유전자 산물에 대한 기능을 복원하는 방법으로서, 게놈 내 파괴된 유전자를 포함하는 세포에 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 도입하는 단계를 포함하되, 상기 복합체는 이중 가닥 절단을 생성하고, 상기 파괴된 유전자는 기능성 유전자 산물을 암호화하지 않고, 상기 파괴된 유전자는 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 상기 기능성 유전자 산물을 암호화할 수 있는 비파괴 유전자로 복원되는 방법.
2. 구현예 1에 있어서, 상기 파괴된 유전자는 해당 비파괴 유전자와 비교할 때 PAM 서열의 상류(5') 네 번째 뉴클레오티드의 염기쌍 결실을 포함하고, 상기 염기쌍 결실은 파괴된 유전자의 유전자 산물에서 아미노산 프레임이동을 생성함으로써, 파괴된 유전자의 유전자 산물을 비기능적 상태로 만드는 방법.
3. 구현예 2에 있어서, 염기쌍 결실은 코돈 서열의 첫 번째 뉴클레오티드인 방법.
4. 제2항에 있어서, 염기쌍 결실은 코돈 서열의 두 번째 뉴클레오티드인 방법.
5. 구현예 2에 있어서, 염기쌍 결실은 코돈 서열의 세 번째 뉴클레오티드인 방법.
6. 구현예 1에 있어서, 복원은 이중 가닥 절단 부위에 단일 염기를 삽입시키는 비상동 말단 연결(NHEJ)에 의해 달성되는 방법.
7. 구현예 1에 있어서, 복원은 상동 재조합 또는 상동성 유도 복구를 이용하지 않고 이중 가닥 절단 부위에 단일 염기를 삽입하여 달성되는 방법.
8. 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법으로서,
표적 부위 및 파괴된 선택 마커 유전자를 포함하는 적어도 하나의 세포에 제1 가이드 RNA, Cas 엔도뉴클레아제, 및 적어도 제2 가이드 RNA를 도입하되, 상기 제1 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 파괴된 선택 마커 유전자에 이중 가닥을 도입할 수 있는 제1 복합체를 형성할 수 있고, 상기 파괴된 선택 마커 유전자는 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 기능성 선택 마커 단백질을 암호화할 수 있는 비파괴 선택 마커 유전자로 복원되고, 상기 제2 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 위치한 상기 표적 부위를 인식하고, 거기에 결합하고, 닉킹 또는 절단할 수 있는 제2 복합체를 형성할 수 있는 단계; 및
상기 뉴클레오티드 서열의 변형을 갖는 세포를 상기 기능성 선택 단백질에 의해 선택하는 단계를 포함하는 방법.
9. 구현예 8에 있어서, 변형은 상기 표적 부위에서의 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 또는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
10. 구현예 8에 있어서, 상기 세포에 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 도입하는 단계를 더 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드 변형 주형은 상기 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형을 포함하는 방법.
11. 구현예 8에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 변형 주형의 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형은 (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, (ii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, (iii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 및 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
12. 구현예 8에 있어서, 세포에 공여 DNA를 도입하는 단계를 더 포함하되, 상기 공여 DNA는 상기 표적 부위에 삽입될 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
13. 구현예 8에 있어서, 세포는 인간, 비인간, 동물, 고세균, 박테리아, 진균, 곤충, 효모, 비통상적 효모, 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
14. 구현예 13에 있어서, 식물 세포는 외떡잎식물 및 쌍떡잎식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
15. 구현예 14에 있어서, 식물 세포는 옥수수, 벼, 수수, 호밀, 보리, 밀, 밀렛, 귀리, 사탕 수수, 잔디, 또는 스위치그래스, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 목화, 담배, 땅콩, 감자, 토마토, 담배, 애기장대, 및 잇꽃 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
16. 구현예 13에 있어서, 상기 식물 세포로부터 식물 또는 자손 식물을 생산하는 단계를 더 포함하는 방법.
17. 임의의 하나의 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제가 결여된, 구현예 16의 방법에 의해 생산된 식물 또는 자손 식물.
18. 구현예 8에 있어서, 파괴된 선택 마커 유전자는 파괴된 ALS-저항성 유전자인 방법.
19. 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 편집하는 방법으로서,
a) 적어도 하나의 세포에 적어도 하나의 가이드 RNA 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제를 도입하되, 상기 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 복합체를 형성할 수 있는 단계;
b) 상기 뉴클레오티드 서열에 적어도 하나의 단일 뉴클레오티드 결실을 포함하는 세포를 (a)로부터 선택하되, 상기 뉴클레오티드 결실은 편집될 위치에 위치하는 단계; 및
c) (b)의 세포에 적어도 하나의 가이드 RNA 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제를 도입하되, 상기 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 복합체를 형성할 수 있고, 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 (b)의 뉴클레오티드 결실과 동일한 위치에 단일 뉴클레오티드를 삽입할 수 있는 단계를 포함하는 방법.
20. 폴리뉴클레오티드 변형 주형 또는 공여 DNA를 사용하지 않고 식물의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 편집하는 방법으로서,
a) 적어도 하나의 식물 세포에 적어도 하나의 가이드 RNA 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제를 도입하되, 상기 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 복합체를 형성할 수 있는 단계;
b) 상기 뉴클레오티드 서열에 적어도 하나의 단일 뉴클레오티드 결실을 포함하는 식물 세포를 (a)로부터 선택하되, 상기 뉴클레오티드 결실은 편집될 위치에 위치하는 단계;
c) (b)의 식물 세포로부터 식물을 재생시키는 단계;
d) (c)의 식물로부터의 세포에 적어도 하나의 가이드 RNA 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제를 도입하되, 상기 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있고, 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 (b)의 뉴클레오티드 결실과 동일한 위치에 단일 뉴클레오티드를 삽입할 수 있는 복합체를 형성할 수 있는 단계; 및
e) 최적으로는, (d)의 뉴클레오티드 삽입을 포함하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
21. 구현예 1, 8, 18 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 형성하는 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질은 각각 RNA 및 단백질로서 세포에 도입되는 방법.
22. 구현예 1, 8, 18 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 식물 세포에 도입되기 전에 시험관내 조립되어 리보뉴클레오티드-단백질 복합체로서 세포에 도입되는 방법.
23. 구현예 1, 8, 18 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체의 성분은 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 mRNA로서, 그리고 가이드 RNA를 포함하는 RNA로서 도입되는 방법.
24. 구현예 1, 8, 18 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체의 성분은 가이드 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자로서 도입되는 방법.
25. 구현예 1, 8, 18 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 세포 내에서 조립되는 방법.
26. 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 세포 내에 전달하는 방법으로서, 적어도 하나의 가이드 RNA 분자와 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 결합하여 리보뉴클레오티드-단백질을 형성하는 단계 및 상기 리보뉴클레오티드-단백질을 입자 전달 매트릭스와 결합하여 상기 리보뉴클레오티드-단백질과 매트릭스가 결합될 수 있도록 하여 리보뉴클레오티드-단백질-매트릭스 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 리보뉴클레오티드-단백질-매트릭스 복합체를 상기 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법.
27. 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 세포 내에 전달하는 방법으로서, 적어도 하나의 가이드 RNA 분자 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 세포에 도입하는 단계, 및 상기 가이드 RNA 및 상기 Cas 엔도뉴클레아제 단백질이 상기 세포 내에 복합체를 형성할 수 있도록 적절한 조건 하에서 상기 세포를 성장시키는 단계를 포함하는 방법.
28. 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 세포 내에 전달하는 방법으로서, 적어도 하나의 가이드 RNA 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA를 세포에 도입하는 단계, 및 상기 mRNA가 상기 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 번역하고 상기 가이드 RNA와 복합체를 형성할 수 있도록 적절한 조건 하에서 상기 세포를 성장시키는 단계를 포함하는 방법.
29. 구현예 26 내지 28에 있어서, 폴리뉴클레오티드 주형을 도입하는 단계를 더 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드 변형 주형은 상기 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형을 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드 변형 주형의 상기 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형은 (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, (ii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, (iii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 및 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
30. 구현예 26 내지 28에 있어서, 공여 DNA를 도입하는 단계를 더 포함하되, 상기 공여 DNA는 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
31. 구현예 26 내지 28에 있어서, 상기 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 상기 세포의 게놈 내 표적 부위에 이중 가닥 절단을 도입하는 방법.
32. 구현예 1 내지 31에 있어서, 상기 Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질, Cpf1 단백질, C2c1 단백질, C2c2 단백질, C2c3 단백질, Cas3, Cas3-H, Cas5, Cas7, Cas8, Cas10, 또는 이들의 복합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
33. 구현예 26 내지 28에 있어서, 도입은 입자 매개 전달, 휘스커 매개 전달, 세포 침투성 펩티드 매개 전달, 전기천공, PEP 매개 형질감염 및 나노입자 매개 전달로 이루어진 군으로부터 선택되는 전달 시스템을 통한 것인 방법.
34. 구현예 29에 있어서, 폴리뉴클레오티드 변형 주형은 단일 가닥 또는 이중 가닥 분자인 방법.
35. 구현예 30에 있어서, 공여 DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥 분자인 방법.
36. 구현예 26 내지 28에 있어서, 세포는 세포 발육을 자극할 수 있는 미리 통합된 발육 유전자를 포함하는 식물 세포인 방법.
37. 구현예 26 내지 28에 있어서, 세포는 인간, 비인간, 동물, 고세균, 박테리아, 진균, 곤충, 효모, 비통상적 효모, 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
38. 구현예 37에 있어서, 식물 세포는 외떡잎식물 및 쌍떡잎식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
39. 구현예 38에 있어서, 식물 세포는 옥수수, 벼, 수수, 호밀, 보리, 밀, 밀렛, 귀리, 사탕 수수, 잔디, 또는 스위치그래스, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 목화, 담배, 땅콩, 감자, 토마토, 담배, 애기장대, 및 잇꽃 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
40. 구현예 36에 있어서, 상기 식물은 상기 식물 세포의 게놈 내 상기 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형을 포함하고, 상기 식물은 상기 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체 또는 이의 임의의 조합을 포함하지 않는 방법.
41. 구현예 37의 식물 세포로부터 생산된 식물로서, 그 게놈에 통합된 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물.
42. 구현예 26에 있어서, 상기 입자 전달 매트릭스는 미립자를 포함하는 방법.
43. 구현예 42에 있어서, 상기 미립자는 금 입자, 텅스텐 입자, 및 탄화규소 휘스커 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
44. 구현예 26에 있어서, 입자 전달 매트릭스는 양이온성 지질과 결합된 미립자를 포함하는 방법.
45. 구현예 44에 있어서, 양이온성 지질은 수용성 양이온성 지질인 방법.
46. 구현예 45에 있어서, 수용성 양이온성 지질은 TransIT-2020인 방법.
47. 변형된 표적 부위를 포함하는 설포닐우레아 저항성 식물을 생산하는 방법으로서, a) 파괴된 설포닐우레아 저항성(ALS) 유전자를 포함하는 식물 세포에 제1 가이드 RNA, Cas9 엔도뉴클레아제, 적어도 제2 가이드 RNA를 도입하되, 상기 제1 가이드 RNA 및 Cas9 엔도뉴클레아제는 상기 파괴된 설포닐우레아 저항성(ALS) 유전자에 위치한 코돈 서열의 제2 뉴클레오티드의 바로 하류(3')에서 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 제1 복합체를 형성할 수 있고, 상기 제2 가이드 RNA 및 Cas9 엔도뉴클레아제는 상기 표적 부위에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 제2 복합체를 형성할 수 있는 단계; 및 b) 상기 식물 세포로부터 설포닐우레아 저항성 식물을 얻되, 상기 설포닐우레아 저항성 식물은 상기 표적에 변형을 포함하고, 상기 변형은 (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, (ii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, (iii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 또는 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계를 포함하는 방법.
48. 세포의 게놈 내 비기능성 유전자 산물에 대한 기능을 복원하는 방법으로서, 게놈 내 파괴된 유전자를 포함하는 세포에 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 도입하는 단계를 포함하되, 상기 복합체는 이중 가닥 절단을 생성하고, 상기 파괴된 유전자는 기능성 유전자 산물을 암호화하지 않고, 상기 파괴된 유전자는 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 상기 기능성 유전자 산물을 암호화할 수 있는 비파괴 유전자로 복원되는 방법.
49. 구현예 46에 있어서, 상기 파괴된 유전자는 해당 비파괴 유전자와 비교할 때 PAM 서열의 상류(5') 네 번째 뉴클레오티드의 염기쌍 결실을 포함하고, 상기 염기쌍 결실은 파괴된 유전자의 유전자 산물에서 아미노산 프레임이동을 생성함으로써, 파괴된 유전자의 유전자 산물을 비기능적 상태로 만드는 방법.
48. 식물 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법으로서,
표적 부위 및 파괴된 선택 마커 유전자를 포함하는 적어도 하나의 세포에 제1 가이드 폴리뉴클레오티드, Cas 엔도뉴클레아제, 및 적어도 제2 가이드 폴리뉴클레오티드를 도입하되, 상기 제1 가이드 폴리뉴클레오티드 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 파괴된 선택 마커 유전자에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 제1 복합체를 형성할 수 있고, 상기 파괴된 선택 마커 유전자는 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 기능성 선택 마커 단백질을 암호화할 수 있는 비파괴 선택 마커 유전자로 복원되고, 상기 제2 가이드 폴리뉴클레오티드 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 위치한 상기 표적 부위를 인식하고, 거기에 결합하고, 닉킹 또는 절단할 수 있는 제2 복합체를 형성할 수 있는 단계; 및
상기 뉴클레오티드 서열의 변형을 갖는 세포를 상기 기능성 선택 마커 단백질에 의해 선택하는 단계를 포함하는 방법.
50. 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 편집하는 방법으로서,
a) 적어도 하나의 세포에 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제를 도입하되, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 복합체를 형성할 수 있는 단계;
b) 상기 뉴클레오티드 서열에 적어도 하나의 단일 뉴클레오티드 결실을 포함하는 세포를 (a)로부터 선택하되, 상기 뉴클레오티드 결실은 편집될 위치에 위치하는 단계; 및
c) (b)의 세포에 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제를 도입하되, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 복합체를 형성할 수 있고, 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 (b)의 뉴클레오티드 결실과 동일한 위치에 단일 뉴클레오티드를 삽입할 수 있는 단계를 포함하는 방법.
51. 가이드 폴리뉴클레오티드/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 세포 내에 전달하는 방법으로서, 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드 분자와 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 결합하여 리보뉴클레오티드-단백질을 형성하는 단계 및 상기 리보뉴클레오티드-단백질을 입자 전달 매트릭스와 결합하여 상기 리보뉴클레오티드-단백질과 매트릭스가 결합될 수 있도록 하여 리보뉴클레오티드-단백질-매트릭스 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 리보뉴클레오티드-단백질-매트릭스 복합체를 상기 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법.
실시예
다음 실시예들에서, 달리 언급되지 않는 한, 부(parts) 및 백분율은 중량 기준이고 도(degree)는 섭씨이다. 이 실시예들은 본 발명의 구현예들을 나타내면서 단지 예시로 제공되는 것임을 이해해야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 다양한 용도 및 조건에 맞도록 본 발명을 다양하게 변경하고 변형할 수 있다. 이러한 변형은 또한, 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
실시예 1
Cas9 엔도뉴클레아제 및 가이드 RNA 발현 카세트의 전달에 의한 식물 세포의 게놈 내 표적 DNA 서열의 변형
스트렙토코커스 피오게네스 M1 GAS(SF370)로부터의 Cas9 유전자(SEQ ID NO: 1)를 당업계에 공지된 표준 기술을 이용하여 옥수수 코돈 최적화하고, 대장균 및 아그로박테리움에서의 발현을 제거하기 위해 감자 ST-LS1 인트론(SEQ ID NO: 2)을 도입하였다. 옥수수 세포에서 Cas9 단백질의 핵 국재화를 용이하게 하기 위해, 유인원 바이러스 40(SV40) 1부분 아미노 말단 핵 국재화 신호(MAPKKKRKV, SEQ ID NO: 3) 및 아그로박테리움 투메파시엔스 2부분 VirD2 T-DNA 경계 엔도뉴클레아제 카복실 말단 핵 국재화 신호(KRPRDRHDGELGGRKRAR, SEQ ID NO: 4)를 Cas9 오픈 리딩 프레임의 아미노 말단 및 카복실 말단에 각각 포함시켰다. 옥수수 최적화된 Cas9 유전자를 표준 분자 생물학 기술에 의해 옥수수 항시성 프로모터(유비퀴틴)에 작동 가능하게 연결하였다. 전사는 감자 프로테이나아제 저해제 II 유전자(PinII)로부터의 3' 서열의 첨가에 의해 종결되어 UBI:Cas9:PinII 벡터를 생성한다. 유비퀴틴에 의해 유도된 옥수수 최적화된 Cas9 발현 카세트의 서열을 SEQ ID NO: 5에 나타내었다.
문헌[Mali et al., 2013 (Science 339:823-26)]에 기술된 방법을 이용하여 단일 가이드 RNA(gRNA)를 설계하였다. 옥수수 U6 중합효소 III 프로모터 및 종결자를 분리하여 gRNA의 개시 및 종결을 지시하는 데 각각 사용하였다. 문헌[Cong et al., 2013 (Science 339:819-23)]에 기술된 바와 같이 절단이 바깥 방향으로 배향된 역 탠덤 배향으로 2개의 BbsI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 도입하여 옥수수 게놈 DNA 표적 서열을 gRNA 발현 작제물에 빠르게 도입하는 것을 용이하게 하였다. G 뉴클레오티드로 시작하는 표적 서열만을 사용하여 gRNA의 바람직한 중합효소 III 발현을 촉진시켰다. gRNA 발현 카세트를 Bluescript SK 벡터(SEQ ID NO: 6)에 서브클로닝하였다.
옥수수 최적화된 Cas9-gRNA 복합체가 비상동 말단 연결(NHEJ) 복구 경로를 통해 옥수수 염색체 DNA에서 표적 돌연변이를 인식, 절단, 및 촉진할 수 있는지를 검정하기 위해, 5개 옥수수 유전자좌(각각의 유전자좌에서 3개의 상이한 게놈 서열)를 절단 표적으로 하고(표 2 참조), 돌연변이의 존재에 대해 앰플리콘 심층 시퀀싱으로 조사하였다.
Figure pct00001
특정 옥수수 가변 표적화 도메인을 포함하는 옥수수 최적화된 Cas9 엔도뉴클레아제 및 gRNA 발현 카세트를 시각적 선택 마커(UBI:MoPAT:DsRED 융합) 및 발육 유전자 ZmODP-2(BBM) 및 ZmWUS2(WUS)(실시예 9 참조)와 함께 유전자총에 의해(실시예 8 참조) 60-90 Hi-II 미성숙 옥수수 배아에 공동으로 전달하였다. Cas9 또는 gRNA 발현 카세트만으로 형질전환된 Hi-II 옥수수 배아는 음성 대조군으로서 사용되었다. 7일 후, 각각의 처리로부터 가장 균일하게 형질전환된 20~30개 배아(DsRED 형광 단백질의 일시적 발현에 기초)를 모으고 전체 게놈 DNA를 추출하였다. 의도된 표적 부위를 둘러싼 영역을, 두 차례의 PCR을 통해 "꼬리"(tailed) 프라이머를 사용해 앰플리콘 특이적 바코드 및 일루미나 시퀀싱에 필요한 서열을 추가하는 Phusion® High Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs, M0531L)로 PCR 증폭시켰다. 1차 PCR 반응에 사용된 프라이머를 표 3에 나타내었다.
PCR 프라이머 서열
표적 부위 프라이머 1차 PCR 프라이머 서열 SEQ ID NO:
MS26Cas-1 포워드 CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGGACCGGAAGCTCGCCGCGT 19
MS26Cas-1 리버스 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTTCCTGGAGGACGACGTGCTG 20
MS26Cas-2 포워드 CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAGGTCCTGGAGGACGACGTGCTG 21
MS26Cas-2 리버스 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCCGGAAGCTCGCCGCGT 22
MS26Cas-3 포워드 CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCCTCCGGAAGCTCGCCGCGT 23
MS26Cas-3 리버스 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTTCCTGGAGGACGACGTGCTG 20
LIGCas-1 포워드 CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGGACTGTAACGATTTACGCACCTGCTG 24
LIGCas-1 리버스 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGCAAATGAGTAGCAGCGCACGTAT 25
LIGCas-2 포워드 CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCCTCTGTAACGATTTACGCACCTGCTG 26
LIGCas-2 리버스 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGCAAATGAGTAGCAGCGCACGTAT 25
LIGCas-3 포워드 CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAGGCGCAAATGAGTAGCAGCGCAC 27
LIGCas-3 리버스 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTCACCTGCTGGGAATTGTACCGTA 28
MS45Cas-1 포워드 CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGGAGGACCCGTTCGGCCTCAGT 29
MS45Cas-1 리버스 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGCCGGCTGGCATTGTCTCTG 30
MS45Cas-2 포워드 CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCCTGGACCCGTTCGGCCTCAGT 31
MS45Cas-2 리버스 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGCCGGCTGGCATTGTCTCTG 30
MS45Cas-3 포워드 CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGAAGGGACCCGTTCGGCCTCAGT 32
MS45Cas-3 리버스 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGCCGGCTGGCATTGTCTCTG 30
ALSCas-1 포워드 CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAGGCGACGATGGGCGTCTCCTG 33
ALSCas-1 리버스 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGCGTCTGCATCGCCACCTC 34
ALSCas-2 포워드 CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTCCCGACGATGGGCGTCTCCTG 35
ALSCas-2 리버스 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGCGTCTGCATCGCCACCTC 34
ALSCas-3 포워드 CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGAACGACGATGGGCGTCTCCTG 36
ALSCas-3 리버스 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGCGTCTGCATCGCCACCTC 34
2차 PCR 반응에 사용된 프라이머는 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACG(포워드, SEQ ID NO: 37) 및 CAAGCAGAAGACGGCATA(리버스, SEQ ID NO: 38)였다.
얻어진 PCR 증폭을 Qiagen PCR 정제 스핀 컬럼으로 정제하고, Hoechst 염료계 형광 분석법으로 농도를 측정하고, 등몰 비로 합치고, 30~40% (v/v) 스파이크의 PhiX 제어 v3(일루미나, FC-110-3001)로 일루미나의 MiSeq Personal Sequencer에서 단일 해독 100개 뉴클레오티드 길이의 심층 시퀀싱을 수행하여 서열 바이어스를 상쇄시켰다. 음성 대조군에서 유사한 수준으로 발견되지 않고 예상 절단 부위를 중심으로 10 뉴클레오티드 윈도우 내에서 발생한 1개 이상의 뉴클레오티드 삽입-결실을 가진 해독만을 돌연변이로 분류하였다. 동일한 돌연변이를 가진 돌연변이 해독을 계수하고 하나의 군으로 분리하였고, 상위 10개의 가장 일반적인 돌연변이는 예상 절단 부위 내에서 발생하는 것으로 시각적으로 확인되었다. 이어서, 돌연변이의 총 수를 사용하여 바코드 및 포워드 프라이머와의 완벽한 일치를 포함하는 적절한 길이의 총 해독 수를 기초로 돌연변이 해독의 백분율을 계산하였다.
모든 15개 부위를 표적화하는 Cas9-gRNA 시스템에 대한 앰플리콘 심층 시퀀싱에 의해 밝혀진 돌연변이 빈도를 표 4에 나타내었다.
5개의 표적 유전자좌(15개 표적 부위)에서 돌연변이 해독의 백분율
표적 DSB 시약 총 해독 수 돌연변이 표적 유전자 해독의 수 표적 유전자에서 돌연변이 해독의 백분율
LIG (Chr. 2) LIG-CR1 gRNA+Cas9 716,854 33,050 4.61%
LIG-CR2 gRNA+Cas9 711,047 16,675 2.35%
LIG-CR3 gRNA+Cas9 713,183 27,959 3.92%
MS26 (Chr. 1) MS26-CR1 gRNA+Cas9 575,671 10,073 1.75%
MS26-CR2 gRNA+Cas9 543,856 16,930 3.11%
MS26-CR3 gRNA+Cas9 538,141 13,879 2.58%
MS45 (Chr. 9) MS45-CR1 gRNA+Cas9 812,644 3,795 0.47%
MS45-CR2 gRNA+Cas9 785,183 14,704 1.87%
MS45-CR3 gRNA+Cas9 728,023 9,203 1.26%
ALS1 (Chr. 4) 및 ALS2 (Chr. 5) ALS-CR1 gRNA+Cas9 434,452 9,669 2.23%
ALS-CR2 gRNA+Cas9 472,351 6,352 1.35%
ALS-CR3 gRNA+Cas9 497,786 8,535 1.72%
대조군 Cas9만 640,063 1 0.00%
LIG-CR1 gRNA만 646,774 1 0.00%
추가 분석 결과, Cas9-gRNA 시스템에 의해 촉진된 가장 일반적인 유형의 돌연변이는 단일 뉴클레오티드 삽입인 것으로 나타났다(예를 들어, 도 1, SEQ ID NO: 49 내지 58 참조). 검정된 대부분의 gRNA에서 유사한 결과가 관찰되었다(표 5).
Figure pct00002
본 실시예는 RNA 유도 Cas9이 돌연변이의 빈도가 높은 이중 가닥 절단을 생성함을 보여준다. 여러 표적 부위에서의 돌연변이 분석 결과, 다양한 크기의 결실 및/또는 삽입이 관찰되었지만, 단일 뉴클레오티드 삽입 및 단일 뉴클레오티드 결실이 옥수수에서 검정된 대부분의 표적 부위에 있어서 Cas9-gRNA 기술에 의해 생성되는 가장 일반적인 유형의 돌연변이인 것으로 나타났다.
실시예 2
편집된 아세토락테이트 합성효소 유전자는 클로르설푸론에 대한 저항성을 부여함
본 실시예는 천연 옥수수 아세토락테이트 합성효소(ALS) 유전자의 뉴클레오티드 서열에 도입된 특이적 변화(들)가 설포닐우레아계 제초제, 특히 클로르설푸론에 대한 저항성을 유발함을 보여준다.
옥수수에는 DNA 수준에서 94% 서열 동일성을 갖는, 염색체 4 및 5에 각각 위치한 2개의 ALS 유전자, ALS1(SEQ ID NO: 39) 및 ALS2(SEQ ID NO: 40)가 존재한다.
ALS 단백질은 N 말단 운반체를 포함하며, 성숙 단백질은 엽록체로의 운반에 이어 운반 펩티드의 절단 후에 형성된다. 성숙 단백질은 잔기 S41에서 시작하여, 예측 분자량이 65 kDa인 598개 아미노산의 성숙 단백질(SEQ ID NO: 41)을 생성한다.
내인성 옥수수 아세토락테이트 합성효소 단백질과 비교하여 단일 아미노산 잔기(P165A 또는 P165S, 회색 박스) 변화를 야기하는 ALS1 또는 ALS2의 뉴클레오티드 서열의 변형은 옥수수에서 제초제에 대한 저항성을 제공한다.
아세토락테이트 합성효소는 식물의 세포 기능에 매우 중요한 효소이므로, ALS1 및 ALS2 유전자의 동시 이대립유전자(bi-allelic) 녹아웃은 생존할 것으로 기대되지 않는다. 따라서, ALS1 뉴클레오티드 서열과 ALS2 뉴클레오티드 서열 간의 다형성에 기초하여, ALS2 특이적 ALSCas-4 표적 부위를 동정하고 검정하였다. ALS1 및 ALS2 유전자를 모두 표적화하는 ALSCas-1 가이드 RNA 발현 작제물을 대조군으로서 사용하였다. 표 6은 ALSCas-1 및 ALSCas-4 표적 부위에 대한 정보를 보여준다.
Figure pct00003
실시예 1에 기술되고 표 7에 나타낸 바와 같이 앰플리콘 심층 시퀀싱에 의해 ALSCas-1 및 ALSCas-4에서의 돌연변이 빈도를 결정하였다.
Figure pct00004
이 결과들은 ALSCas-4 gRNA/Cas9 시스템이 ALS1 유전자보다 약 90배 높은 효율로 ALS2 유전자를 돌연변이시켰음을 입증하였다. 따라서, ALS 유전자 편집 실험을 위해 ALSCas-4 표적 부위 및 해당 ALS-CR4 gRNA를 선택하였다.
ALS2 편집된 대립 유전자를 생성하기 위해, 상동성의 단편을 포함하는 794 bp 폴리뉴클레오티드 변형 주형(SEQ ID NO: 43)을 플라스미드 벡터에 복제하였고, 2개의 127 nt 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 변형 주형(DNA 올리고라고도 함, Oligo1, SEQ ID NO: 44, 및 Oligo2, SEQ ID NO: 45)을 폴리뉴클레오티드 변형 주형으로서 검정하였다(도 2). 794 bp 단편은 Oligo 1과 동일한 서열 변형을 가졌다. 폴리뉴클레오티드 변형 주형(복구 주형)은 고유 서열과 비교하여 몇 가지 뉴클레오티드 변화를 포함하였다. 단일 가닥 Oligo1 및 794 bp 복구 주형은 아미노산 위치 165의 프롤린에 해당하는 DNA 서열을 세린으로 편집하도록 할 단일 뉴클레오티드 변화(P165S), 뿐만 아니라 ALS-CR4 표적 부위 및 PAM 서열 내 3개의 추가 변화를 포함하였다. 복구 주형 내 PAM 서열의 변형은 메티오닌 코돈(AUG)을 이소류신(AUU)으로 변경하였고, 이는 ALS1 유전자에서 자연적으로 발생한다. 제2 127 nt 단일 가닥 올리고 복구 주형(Oligo2)도 검정하였는데, 이는 위치 157의 메티오닌을 보존하였지만, ALS-CR4 gRNA와의 염기 짝짓기에 영향을 미칠 서열 내 3개의 추가 단일 뉴클레오티드 변화를 포함하였다(도 2).
처리당 약 1,000개의 미성숙 배아를 DNA 발현 카세트에서 2개의 올리고 또는 단일 플라스마 복구 주형, Cas9, ALS-CR4 gRNA, 및 MoPAT-DsRED로 입자 충돌시켰고, PAT가 부여하는 비알라포스 저항성을 선택하기 위해 배지에 두었다. 형질전환 5주 후, 선택 배지에서 성장하는 (처리당) 2백개의 무작위로 선택된 독립적인 신생 캘러스 섹터를 배아로부터 분리하여 새로운 비알라포스 플레이트로 옮겼다. 발육 중인 캘러스 사건을 가진 나머지 배아(처리당 800개 초과)를 편집된 ALS2 유전자의 직접 선택으로서 100 ppm의 클로르설푸론을 함유한 플레이트로 옮겼다. 1개월 후, 비알라포스에서 성장하는 총 384개의 무작위로 고른 캘러스 섹터(각각의 복구 주형에 대해 약 130 사건) 및 클로르설푸론이 있는 배지에서 계속 성장한 7개의 캘러스 섹터를 PCR 증폭 및 시퀀싱으로 분석하였다. 편집된 ALS2 대립 유전자는 9개의 캘러스 섹터에서 검출되었다: 2개는 비알라포스에서 성장하는 캘러스 섹터로부터 파생되었고 794 bp 복구 DNA 주형을 사용하여 생성되었으며, 나머지 7개는 127 nt 단일 가닥 올리고를 사용하여(3개는 Oligo1에 의해, 4개는 Oligo2에 의해) 편집된 클로르설푸론 저항성 캘러스 섹터로부터 파생되었다. 이들 캘러스 섹터의 제2 ALS2 대립 유전자를 NHEJ 복구의 결과로서 돌연변이시켰다. ALS1 유전자 분석 결과, 야생형 서열만이 ALS-CR4 gRNA의 높은 특이성을 확인시켜 주는 것으로 밝혀졌다.
추가 분자 분석 및 후대 검정을 위해, 편집된 ALS2 대립 유전자를 포함하는 9개의 캘러스 섹터 중 7개에서 식물을 재생하였다. ALS2 대립 유전자의 DNA 서열 분석 결과, P165S 변형(ALS2-P165S)의 존재, 뿐만 아니라 각각의 복구 주형과 관련된 다른 뉴클레오티드 변화가 확인되었다. 편집된 ALS2 대립 유전자의 유전(inheritance)을 평가하기 위해, 상이한 캘러스 사건(794 bp 복구 DNA 및 Oligo2)으로부터 생성된 2개의 T0 식물의 T1 및 T2 자손을 분석하였다. 야생형 Hi-II 식물의 꽃가루를 이용한 교배로부터 유래된 자손 식물을 시퀀싱으로 분석하였고, 이들은 예상 분리 비율이 1:1(각각 57:56 및 47:49)인 모체 식물에서 관찰된 편집된 대립 유전자의 유성 유전을 보여주었다. 편집된 ALS 서열이 제초제 저항성을 부여하는지를 검정하기 위해, 편집된 야생형 ALS2 대립 유전자를 가진 선택된 4주령의 분리 T1 식물에 네 가지 다른 농도의 클로르설푸론(50, 100 (1x), 200, 및 400 mg/리터)을 살포하였다. 처리 3주 후, 편집된 대립 유전자를 가진 식물은 정상적인 표현형을 나타낸 반면(도 3, 좌), 야생형 대립 유전자만을 가진 식물은 세포노화 징후가 강하게 나타났다(도 3, 우).
설포닐우레아계 제초제(구체적으로, 클로르설푸론)에 대한 저항성 외에도, ALS 유전자는 트리아졸로피리미딘, 피리미디닐티오-벤조에이트, 및 이미다졸리논 제초제를 비롯한 다른 종류의 AHAS 저해제에 대한 저항성을 부여하도록 변형될 수 있다(Tan S, Evans RR, Dahmer ML, Singh BK, Shaner DL (2005) Imidazolinone-tolerant crops: history, current status and future. Pest Management Science 61: 246-257). 따라서, ALS 유전자에 대한 변형은 본원에 기술된 변화 및 클로르설푸론 저항성을 부여하는 변화에 국한되어서는 안 된다.
이들 실험은 Cas9-gRNA가 옥수수에서 HDR-의존적 표적 서열 변형을 자극하여, 후대에 적절히 유전되는 편집된 내인성 유전자를 갖는 식물을 생성할 수 있음을 입증한다. 데이터는 또한, 내인성 프로모터 하에서 편집된 단일 ALS2 대립 유전자가 옥수수에서 제초제 저항성을 제공함을 나타낸다.
실시예 3
내인성 선택 마커 유전자로서의 ALS2
본 실시예는 특이적으로 편집된 ALS2 유전자가 현재 식물 형질전환에 이용되는 외인성 마커 유전자의 전달을 대체하는 세포 내 선택 마커를 생성하기 위해 어떻게 이용될 수 있는지를 보여준다.
식물 형질전환(유전자이식 사건 복원)의 빈도가 비교적 낮기 때문에, 다양한 제초제에 대한 저항성을 제공하는 선택 마커 유전자는 통상적으로 형질 유전자와 함께 공동으로 전달된다. 저항성을 부여하기 위해, 이러한 선택 마커 유전자는 식물 게놈에 안정적으로 통합될 필요가 있고 연속 세대에서 절제되거나 품종 개량을 통해 제거되어야 한다. 일부 고유의 식물 유전자는 특이적으로 변형(편집)되어 제초제에 대한 저항성을 부여할 수 있다. 실시예 2에 기술된 바와 같이, 단일 아미노산 변화가 있는 ALS2 유전자는 클로르설푸론에 대한 저항성을 제공한다. 따라서, 유전자 돌연변이유발, 유전자 편집 또는 형질 유전자의 공동 전달, 및 동시 ALS2 유전자 편집은 외인성으로 공급된 마커 유전자 없이 이용될 수 있을 것으로 예상될 수 있다. Cas9-gRNA 시스템에 의해 생성된 DSB의 NHEJ 복구 결과로서 높은 돌연변이 빈도를 고려할 때(실시예 1), 이 접근법은 유전자 돌연변이유발에 유용할 수 있다. 이 경우, 돌연변이 사건의 빈도는 HDR 매개 ALS 유전자 편집에 의존할 것으로 예상된다. 유전자 편집과 관련하여, 식물 세포에서 2개의 낮은 빈도 HDR-의존적 게놈 편집 과정(하나는 선택을 위한 ALS 유전자 복구를 위한 것이고 다른 하나는 내인성 유전자 편집 또는 형질 유전자 통합을 위한 것임)의 조합은 동시 ALS2 유전자 편집을 이용한 접근법을 다소 비현실적으로 만들 가능성이 높다.
다음의 예는 이러한 낮은 효율(및 비현실성)을 극복하고 선택적 제제에 저항성이 있는 식물 세포를 선택할 가능성을 향상시킬 수 있는 방법을 기술한다. 이 방법은 HDR-의존적 유전자 편집에 의존하는 것이 아니라 식물 체세포에서 (HDR보다) 더 일반적인 NHEJ DNA 복구를 통한 표적 돌연변이유발에 의한 유전자 기능의 복원에 의존한다. 실시예 2에 기술된 바와 같이, 옥수수에는 염색체 4 및 5에 각각 위치한 2개의 ALS 유전자, ALS1 및 ALS2가 존재한다. 2개의 ALS 유전자 중 어느 하나의 특이적 편집은 제초제 저항성을 부여할 것이다. 이 유전자들은 식물 대사에 필수적인 역할을 하여, 결과적으로, 두 유전자를 모두 표적화하고 돌연변이시키면 세포 사멸을 초래한다. 따라서, 본 실시예에서, 변형은 ALS1 유전자를 표적화하지 않는 ALS2 특이적 gRNA를 이용하여 ALS2 유전자만을 포함하므로, ALS1은 야생형으로 남아있다. 구체적으로, ALS2 유전자에 두 가지 변형이 도입된다; 첫째, 클로르설푸론에 대한 저항성을 부여하는 특이적 뉴클레오티드(들) 변화, 예를 들어, 아미노산 위치 165에서 프롤린을 세린으로 변환하기 위한(ALS2-P165S라고 함) 뉴클레오티드 위치 493에서 C에서 T로의 변화(도 2, oligo1) 또는 뉴클레오티드 위치 493 및 495에서 각각 C에서 T로의 변화 및 C에서 G로의 변화(도 2, oligo2)(자세한 내용은 실시예 2 참조). 둘째, 단일 뉴클레오티드의 제거, 예를 들어 뉴클레오티드 위치 165에서 G의 제거(도 4a 내지 4b)로 인한 번역 프레임이동(도 4b), 및 그에 따른 ALS2 매개 클로르설푸론 저항성의 상실(ALS2-P165S-CCΔ라고 함). 많은 설계가 예상되지만, 가장 높은 빈도의 ALS2 유전자 복구의 경우, 단일 뉴클레오티드 위치(도 4a 내지 4c에 도시된 예)는 바람직하게 i) gRNA/Cas 엔도뉴클레아제 표적 부위에서 PAM 서열로부터 상류(5') 네 번째 뉴클레오티드, 및 ii) 코돈에서 세 번째 뉴클레오티드(도 4a)이어야 한다. 이 세 번째 위치는 대부분의 아미노산에 대해 유연하며, 20개 아미노산 중 8개 아미노산에서 4개의 뉴클레오티드 중 어느 것에 의해 점유될 수 있다(표 8). 이러한 유연성을 고려할 때, 첫 번째 또는 두 번째 위치에 비해, 세 번째 위치에서 더 높은 빈도의 적절한 복구가 예상된다.
Figure pct00005
상기 기준을 만족하는 4개의 상이한 표적 부위 및 해당 gRNA를 선택하였다. 전술한 바람직한 단일 뉴클레오티드 위치 외에도, 해당 gRNA는 절단 부위에서 단일 뉴클레오티드 삽입을 나타내는 돌연변이 비율이 높은 돌연변이의 빈도를 높여야 한다. 설명된 모든 선호도를 만족하고, 따라서 본 실험에 적합했던 검정된 4개의 표적 부위 중 하나만을 동정하였다(ALSCas-7이라 함; 표 9).
Figure pct00006
이어서, 클로르설푸론에 대한 저항성을 부여하는 ALS2-P165S 유전자를 더 변형시켰다(파괴된 유전자를 생성): 동요 위치(코돈의 세 번째 뉴클레오티드 위치)에서 G 뉴클레오티드를 제거하여 ALSCas-7 표적 부위에서 (표 9에서 밑줄 친) CCG에 의해 암호화된 프롤린 코돈을 변경함으로써 번역 프레임이동 및 파괴된 유전자를 생성하였다(ALS2-P165S-CCΔ라고 함; 도 4a 내지 4b). 실시예 1에서 입증된 바와 같이, 옥수수에서 Cas9-gRNA 시스템에 의해 생성되고 NHEJ를 통해 복구된 DSB의 복구는 대개 절단 부위에서 단일 뉴클레오티드 삽입을 야기한다. 따라서, ALSCas-7-1(GCTCCCCCGGCCACCCCCTC; SEQ ID NO: 80)이라고 하는, 변형된 ALSCas-7 부위에서의 이중 가닥 절단(DSB)의 생성 및 NHEJ를 통한 그 복구에 의해 ALS2-P165S-CCΔ 유전자의 기능, 및 연속적으로, 클로르설푸론에 대한 세포 저항성이 복원될 수 있다(도 4b 내지 4c 참조).
본 발명에 기초하여, 하나의 gRNA가 NHEJ를 통해 파괴된 ALS2-P165S-CCΔ 유전자를 표적화 및 활성화(따라서 제초제 저항성을 부여)하고, 다른 gRNA(들)가 ALS2와 다른 부위(들)에서 DSB(들)를 촉진하고 원하는 게놈 변형, 예를 들어, 표적화된 돌연변이유발, 결실, 유전자 편집, 또는 부위 특이적 형질 유전자 삽입을 용이하게 할 경우, 둘 이상의 gRNA의 동시 전달을 구상할 수 있다. 이 접근법은 다른 모든 필요한 성분(Cas9, gRNA)이 단백질 및/또는 시험관내 전사 RNA 분자의 형태로 전달될 수 있기 때문에 완전히 일시적인 표적화 게놈 변형을 가능하게 할 수 있다.
이 접근법을 검정하기 위해, 전술한 ALS2 유전자가 특이적으로 변형된 옥수수 식물(Hi-II 유전자형)을 생성시켰다. 우선, 실시예 2에 기술한 바와 같이 클로르설푸론에 대한 저항성을 부여하기 위해 아미노산 위치 165에서 ALS2 서열을 변형시켰다. 이어서, 편집에 대해 동형접합인 식물로부터의 미성숙 배아를 ALSCas-7 표적 부위를 표적화하는 Cas9 및 ALS-CR7 gRNA, 선택 마커(UBI:MoPAT-DSRED 융합) 및 세포 발육 강화 유전자로 입자 충돌시켰다(자세한 내용은 실시예 8 및 9 참조). 비알라포스 저항성 캘러스 섹터로부터의 재생제를 시퀀싱으로 분석하였다. 단일 뉴클레오티드(뉴클레오티드 위치 165의 G) 결실을 가진 여러 T0 식물을 동정하였다(도 4a 내지 4b). 이 결실은 번역 프레임이동(도 4b) 및 ALS2-P165S 매개 클로르설푸론 저항성의 상실을 초래하였다. 두 편집(ALS2-P165S-CCΔ) 모두에 대해 동형접합인 식물을 재생시키고, 시퀀싱으로 확인하고, 클로르설푸론으로 살포하여 제초제 저항성의 상실에 대해 검정하였다.
특이적으로 변형된 내인성 ALS2 유전자(ALS2-P165S-CCΔ)를 가진 동형접합 식물로부터의 배아를 개념 검증 실험에 사용했다. 편집된 파괴 ALS2-P165S-CCΔ 유전자가 전술한 바와 같이 복구될 수 있고(따라서 기능성 단백질을 암호화함) 선택 마커로서 작동할 수 있음을 입증하기 위해, Cas9을 암호화하는 DNA 벡터, ALSCas-7-1 부위를 표적화하는 gRNA(ALS-CR7-1이라고 함), 세포 발육 강화 유전자(ZmODP2 및 ZmWUS), 및 MS45-CR2 gRNA를 옥수수(Hi-II) 미성숙 배아 세포 내에 공동으로 전달하였다. 입자 충돌 1주일 후, 선택을 위해 100 ppm의 클로르설푸론이 있는 배지로 배아를 옮겼다. 약 30%의 배아(290개 중 84개)에서 제초제 저항성 캘러스 사건이 발생되었고, 이는 시퀀싱으로 분석되었다. 대다수의 사건(79 사건)이 예상 ALSCas-7-1 DSB 부위에서의 단일 뉴클레오티드 삽입(도 4c) 및 ALS2-P165S 유전자의 완전한 복원을 보였다. 4개의 사건은 삽입이 없었지만 2 또는 5 bp의 결실이 있어 프레임에서 유전자를 다시 제자리에 두었고, 하나의 사건은 야생화된 것처럼 보였다. 83개의 사건 중 50개(60%)는 또한 MS45Cas-2 표적 부위에서 돌연변이를 보여주었다.
본 실시예는 유도 Cas 엔도뉴클레아제 시스템의 사용에 의한 특이적으로 변형된 불활성 ALS2의 내인성 선택 마커 유전자로서의 유용성 및 개념 검증을 보여준다. 본원에 기술된 결과에 기초하여, 당업자는 기술된 접근법을 현재 식물 게놈 편집 실험에 이용되는 선택 마커 유전자의 공동 전달을 대체하는 임의의 유사하게 변형된 내인성 또는 미리 통합된 외인성 유전자(들)에 대해 사용하고 확장할 수 있다.
실시예 4
파괴된 유전자에 의해 암호화된 비기능성 단백질에 기능을 복원하는 대안적 설계
이전 실시예에서, 서열 변경은 코딩 영역 또는 ALS2-P165S 내에 통합되었다. (기능성 단백질을 암호화하지 않는) 파괴된 유전자를 생성하는 다른 서열 변화도 재활성화 서열로서 사용되도록 설계될 수 있을 것으로 예상된다. 본 실시예는 코딩 서열 내 코돈의 복원에 의존하는 것이 아니라 ALS2-P165S의 1차 번역 개시 코돈의 상류의 아웃 오브 프레임인 개시 코돈의 제거에 의존하는 재활성화 서열의 생성을 기술한다.
진핵 번역 개시의 스캐닝 모델에 따르면, mRNA의 5' 캡에 대한 제1 AUG 코돈이 단백질 합성을 시작하는 데 사용된다(Kozak M. 1989. The scanning model for translation: an update. The Journal of Cell Biology 108: 229-241). 따라서, 15개 RNA 전사체의 비코딩 리더 내 AUG 코돈이 1차 개시 코돈의 상류의 아웃 오브 프레임인 경우, mRNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단백질 합성은 파괴된다. 이 규칙을 이용하고 유전자 발현 또는 기능의 재활성화 전략에 적용하기 위해, 내인성 ALS2-P165S 대립 유전자가 상류의 아웃 오브 프레임 번역 개시 코돈을 포함하도록 생성될 수 있다(도 5a 내지 5b). 이 대립 유전자는 Cas9 PAM 인식 부위 및 ALS-CRX 표적화 스페이서를 포함한다. 본 실시예에서 PAM 부위의 5'에 위치한 뉴클레오티드 3과 4 사이의 Cas9에 의한 절단은 ATG 코돈의 손실을 초래할 수 있는 뉴클레오티드 결실(들) 또는 삽입(들)을 촉진할 수 있다. NHEJ 복구로 인한 결실 또는 삽입의 임의의 조합에 의한 이러한 상류의 아웃 오브 프레임 ATG의 손실은 제초제 저항성을 부여하는 1차 ALS2-P165S 개시 코돈에서의 번역 개시를 야기할 수 있다.
상류의 아웃 오브 프레임 ATG를 이용한 재활성화 전략은 도 5a 내지 5b의 설계에 국한되지 않을 것으로 예상된다. Cas9에 의한 표적화된 절단이 이러한 개시 코돈의 손실을 초래하는 한, PAM 및 표적화 스페이서는 상류의 아웃 오브 프레임 ATG에 대해 다양한 위치에 배치될 수도 있다. 예를 들어, PAM은 개시 코돈의 5', 안티센스 가닥에 존재할 수 있다. 다른 설계가 고려될 수 있는데; 아웃 오브 프레임 ATG 개시 코돈은 5' 리더 서열 내 다른 위치에 배치될 수도 있다. PAM 서열은 nGG PAM 또는 비-nGG PAM 서열을 인식하는 스트렙토코커스 피오게네스와 같은 다른 Cas9 단백질, 예를 들어 스트렙토코커스 써모필러스 CR1(PAM 서열 인식 nnAGAAn) 및 PAM 서열을 갖는 다른 것들에 의해 인식될 수 있다. 다른 Cas9 단백질의 유용성은 본 실시예뿐만 아니라 전술한 실시예 3의 재활성화 설계를 만족할 것이다.
유전자 활성화를 위한 다른 설계가 예상된다. 앞서 언급한 바와 같이, 클로르설푸론 저항성 외에도, 다른 제초제에 대한 저항성을 부여하는 ALS 유전자에 대한 변형이 재활성화에 이용될 수 있다. 또한, 포스포만노오스 이소머라아제 유전자(PMI), 비알라포스 저항성 유전자(BAR), 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제(PAT), 히그로마이신 저항성 유전자(NPTII), 선택 마커 유전자, 형광 마커 유전자(예컨대, 이에 한정되는 것은 아니지만, RFP, 적색 형광 단백질, CFP, GFP, 녹색 형광 단백질) 및 글리포세이트 저항성 유전자가 실시예 3에 기술된 바와 같이 불활성 형태로 식물 세포에 도입되도록 변형되어 가이드 RNA 도입에 의한 재활성화 및 NHEJ에 의한 복구를 위한 표적으로서 사용될 수 있다. 또한 다수의 불활성 유전자를 갖는 것이 표적 역할을 할 수 있을 것으로 예상된다. 예를 들어, 가이드 RNA 멀티플렉싱은 단일 실험에서 여러 유전자를 동시에 변형시키는 것으로 입증되었으므로, 이 유전자들에 한정되는 것은 아니지만, 클로르설푸론 및 비알라포스 저항성 유전자의 표적화된 재활성화가 이러한 접근법을 위해 추가로 설계될 수 있다. 전술한 바와 같이, NHEJ에 의해 유전자 기능을 복원하는 것과 동시에, 다른 가이드-폴리뉴클레오티드를 첨가함으로써 다른 표적의 변형이 동시에 달성될 것이다.
또한, 유사한 접근법이 임의의 고유의 또는 도입된 유전자 서열에 적용될 수 있고 효율적인 유전자 스위칭 메커니즘으로서 이용될 수 있다.
실시예 5
상동성 유도 복구를 위한 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 도입하지 않고 특이적 유전자 편집
실시예 2는 특별히 설계된 폴리뉴클레오티드 변형 주형(복구 주형)을 이용한 ALS2 유전자의 코딩 영역 내 서열 변경(P165S)을 기술하였다. 이하 실시예는 HDR 메커니즘에 의존하는 것이 아니라 NHEJ에 의존하는 관심있는 편집된 유전자를 생성하는 다른 접근법을 기술한다.
실시예 1에 기술된 바와 같이, Cas9 뉴클레아제에 의해 생성된 DSB의 NHEJ 복구에 의해 촉진되는 가장 일반적인 돌연변이 유형의 두 가지는 1 bp 삽입 및 1 bp 결실이다(표 4). 본원에 기술된 이러한 관찰들에 기초하여, 이하 기술되는 바와 같이, 2개의 연속 단계 또는 단일 단계로 달성될 수 있는 유전자 편집을 위한 방법이 개발되었다.
제1 단계는 본원에 기술된 RNA 유도 Cas 뉴클레아제 시스템을 이용하여, Cas 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 부위를 포함하는 관심 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 표적화하여, (도 6a에 도시된) 절단된 DNA의 NHEJ 복구로 인한 특정 뉴클레오티드 결실을 가진 세포 또는 생물을 생성하는 것을 포함한다. 제2 단계는 돌연변이된 부위를 재표적화하고, (폴리뉴클레오티드 변형 주형(복구 주형)을 사용하지 않고) 원하는 뉴클레오티드의 삽입이 있는 사건을 선택하여, 해당 아미노산 및 유전자 기능을 특이적으로 변경하는 것을 필요로 한다. 일반적으로, 아이디어는 도 6a 내지 6c에 도시되어 있다. 이 방법은 비코딩 DNA 단편을 편집하는 데 이용될 수도 있다.
대안적으로, 두 단계가 하나의 단계로 결합될 수 있다. 하나는 원래의 표적 부위를 인식하고 두 번째 것은 동일한 부위이지만 1 bp 결실이 있는 부위를 인식하는 2개의 상이한 gRNA가 사용될 수 있다. 이 경우, 1 bp 결실 후 변경 부위를 절단하고 1 bp 삽입으로 이를 복구하는 내인성 부위의 연속적인 절단 및 복구를 구상할 수 있다. 이어서, 원하는 뉴클레오티드의 삽입이 있는 사건이 선택될 수 있다. 코딩 DNA 서열을 편집하는 경우, 이 과정은 두 가지 목표(번역 해독 프레임의 복원 및 관심 아미노산의 치환)를 달성한다. 상이한 엔도뉴클레아제의 조합이 이러한 2단계 또는 1단계 시스템에 사용될 수 있을 것으로 예상된다. 예를 들어, 관심 폴리뉴클레오티드의 단일 염기 결실을 유도하는 제1 이중 가닥 절단의 도입이 제1 엔도뉴클레아제에 의해 달성될 수 있는 한편, 단일 염기 삽입을 유도하는 제2 이중 가닥 절단의 도입(및 관심 폴리뉴클레오티드의 편집)이 제1 엔도뉴클레아제와 다른 제2 엔도뉴클레아제에 의해 달성될 수 있다. 엔도뉴클레아제 간의 차이는 상이한 생물로부터 유래하는, 상이한 PAM 인식 서열, 상이한 표적 인식 서열, 상이한 절단 활성(평활 말단, 5' 또는 3' 오버행, 단일 가닥, 이중 가닥), 상이한 DNA 또는 아미노산 서열, 또는 이들의 임의의 한 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
관심 게놈 내 특정 뉴클레오티드를 편집하는 능력은 선택의 엔도뉴클레아제 시스템 및 특정한 표적 부위를 인식하고 절단하는 능력에 의존할 수 있다. 신규 유도 엔도뉴클레아제의 발견(예를 들어 2015년 5월 15일 출원된 미국 특허 출원 62/162377 참조), 및/또는 다양한 PAM 서열을 갖는 유도 엔도뉴클레아제의 변형은 이러한 엔도뉴클레아제에 의해 인식 및/또는 절단될 수 있는 표적 부위의 밀도를 더 증가시켜, 궁극적으로 본원에 기술된 방법을 이용하여 게놈 내 임의의 주어진 뉴클레오티드 위치를 표적화하는 능력을 갖게 할 것이다.
실시예 6
안정적으로 통합된 Cas9 엔도뉴클레아제를 가진 옥수수 계통
본 실시예는 안정적으로 통합된 Cas9 발현 카세트를 가진 옥수수 계통의 생성 및 검증을 기술한다.
항시성(옥수수 UBI, SEQ ID NO: 46) 또는 온도 조절(옥수수 MDH, SEQ ID NO: 47) 프로모터의 전사 제어 하에 옥수수 코돈 최적화된 Cas9을 포함하는 2개의 아그로박테리움 벡터(도 7)를 Hi-II 배아 세포에 도입하여 Cas9 엔도뉴클레아제의 미리 통합된 게놈 카피를 포함하는 계통을 확립하였다. 또한 이 벡터들은 시각적 마커로서 청색 형광 유전자(AmCYAN)의 발현을 조절하는 배아 선호 END2 프로모터 및 옥수수 히스톤 2B 프로모터에 의해 전사 조절되는 DsRED 유전자의 불연속 카피를 포함하였다. DsRED 서열의 일부는 정방향으로 복제되었고(369 bp 단편), gRNA에 의해 표적화될 수 있는 347 bp 스페이서에 의해 분리된 DsRED(RF-FP) 유전자의 2개의 단편으로 구성되었다. 스페이서 영역 내 DSB는 적색 형광 세포를 생성하는 파괴된 DsRED 유전자에 기능을 복원하는 분자내 재조합을 촉진한다. UBI:Cas9 또는 MDH:Cas9를 포함하는 단일 카피 T-DNA 인서트를 가진 옥수수 식물을 미성숙 배아의 공급원으로서 사용하였다. 미리 통합된 Cas9을 포함하는 청색 형광 배아를 절제하고 28℃(UBI:Cas9) 또는 37℃(MDH:Cas9)에서 24시간 동안 배양하였다. 입자 충돌 후, MDH:Cas9을 가진 배아를 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 28℃로 옮겼다. 대조군(gRNA 없음)과 달리, 347 bp 스페이서 내 서열을 표적화하는 2개의 DNA 발현 gRNA로 입자 충돌시킨 배아를 포함하는 UBI:Cas9 및 MDH:Cas9은 용이하게 적색 형광 응집을 생성하였다.
이 결과들은 전술한 옥수수 계통이 기능성 Cas9 엔도뉴클레아제의 단일 카피를 가짐을 입증한다.
실시예 7
미리 통합된 Cas9을 가진 배아 세포 내 일시적 gRNA 전달은 옥수수에서 돌연변이를 생성함
본 실시예는 미리 통합된 Cas9을 가진 옥수수 미성숙 배아 세포 내에 시험관내 전사 RNA 분자 형태의 gRNA를 전달하면 표적 부위에서 돌연변이를 생성함을 보여준다.
UBI:Cas9 또는 MDH:Cas9을 포함하는 실시예 6에 기술된 옥수수 식물을 대조군으로서의 DNA 발현 카세트로서 또는 시험관내 전사 RNA로서의 gRNA를 전달하기 위한 미성숙 배아의 공급원으로서 사용하였다. LIG 및 MS26 내인성 표적 부위에서의 돌연변이 빈도를 측정하기 위해, 실시예 6에 기술된 온도 처리로 배아 세포를 포함하는 UBI:Cas9 및 MDH:Cas9 내에 RNA 분자로서(100 ng/shot) 또는 DNA 벡터로서(25 ng/shot) LIG-CR3 및 MS26-CR2 gRNA를 전달하였다. 이들 실험에서, 입자 충돌 2일 후 배아를 회수하여 앰플리콘 심층 시퀀싱으로 분석하였다. 특히 유비퀴틴 프로모터에 의해 조절된 Cas9의 경우, DNA 벡터로서 그리고 RNA 분자로서 전달된 gRNA에 대해 유사한 빈도가 발견되었다(표 10).
항시성(UBI) 또는 조절된(MDH) 프로모터 하에서 미리 통합된 Cas9을 가진 배아 내 일시적 gRNA의 전달에 의해 생성된 옥수수 LIG 및 MS26 표적 부위에서 돌연변이 해독의 백분율
표적 부위 배아 형질전환 돌연변이 해독의 백분율
(입자 충돌 2일 후)
LIG UBI:Cas9 gRNA (DNA) 1.22%
gRNA (RNA) 1.86%
MDH:Cas9
사건 1		 gRNA (DNA) 0.25%
gRNA (RNA) 0.12%
MDH:Cas9
사건 2		 gRNA (DNA) 0.57%
gRNA (RNA) 0.26%
MDH:Cas9
사건 3		 gRNA (DNA) 0.46%
gRNA (RNA) 0.35%
MS26 MDH:Cas9
사건 2		 gRNA (DNA) 0.58%
gRNA (RNA) 0.17%
종합하여, 이 데이터들은 미리 통합된 Cas9을 포함하는 옥수수 세포 내에 직접 RNA 형태로 gRNA를 전달하는 것이 식물 세포에서 돌연변이를 생성하기 위한 DNA 전달에 대한 실행 가능한 대안임을 보여준다.
실시예 8
옥수수 미성숙 배아의 형질전환
형질전환은 입자 매개 전달, 아그로박테리움 매개 형질전환, PEG 매개 전달, 및 전기천공을 비롯하여, 식물에 효과적이라고 알려진 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다.
a. 입자 매개 전달
입자 전달을 이용한 옥수수 미성숙 배아의 형질전환은 다음과 같이 수행된다. 배지 제조법은 다음과 같다.
귀를 껍질을 벗기고 30% Clorox 표백제와 0.5% Micro 세제로 20분간 표면 살균하고 멸균수로 2회 헹군다. 미성숙 배아를 분리하고, 560Y 배지에서 4시간 동안 플레이트당 25개 배아를 배아 축 측을 아래로(배반 측을 위로) 두고 나서 입자 충돌을 준비하기 위해 2.5 cm 표적 구역 내에 정렬시킨다. 대안적으로, 분리된 배아를 560L(개시 배지)에 두고, 전술한 바와 같이 입자 충돌 전 26℃에서 560Y에 4시간 동안 두기 전에 26℃ 내지 37℃ 범위의 온도에서 8 내지 24시간 동안 암실에 둔다.
이중 가닥 절단 유도제 및 주형 또는 공여 DNA를 포함하는 플라스미드를 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 작제하고, 발육 유전자 ODP2(AP2 도메인 전사 인자 ODP2(밑씨 발육 단백질 2); US20090328252 A1) 및 WUSCHEL(US2011/0167516)을 포함하는 플라스미드와 공동으로 입자 충돌시킨다.
플라스미드 및 관심 DNA를 다음과 같이 수용성 양이온성 지질 TransIT-2020 형질감염 시약(Cat# MIR 5404, Mirus, USA)을 사용하여 0.6 ㎛(평균 직경) 금 펠렛 상에 침전시킨다. 총 1 ㎍의 DNA 및/또는 RNA 작제물(10 shot)을 사용하여 얼음 위에서 DNA 또는 DNA와 RNA 용액을 제조한다. 미리 혼합된 DNA에, 20 ㎕의 제조된 금 입자(15 mg/ml) 및 1 ㎕의 TransIT-2020을 조심스럽게 첨가하고 혼합한다. 금 입자를 마이크로 원심분리기에서 10,000 rpm으로 1분 동안 펠렛화하고 상청액을 제거한다. 100% EtOH를 105 ㎕ 첨가하고 짧은 시간 동안 초음파로 재현탁시킨다. 이어서, 각각의 매크로캐리어의 중앙에 10 ㎕를 묻히고 입자 충돌 전에 건조시킨다. Biorad Helium Gun(shelf #3)을 이용해 425 PSI에서 샘플 플레이트를 입자 충돌시킨다.
입자 충돌 후, 배아를 26℃ 내지 37℃ 범위의 온도에서 12 내지 48시간 동안 560P(유지 배지)에서 배양한 다음 26℃에 둔다. 5 내지 7일 후, 배아를 3 mg/리터의 비알라포스를 함유한 560R 선택 배지로 옮기고, 26℃에서 2주마다 계대배양한다. 선택하고 약 10주 후, 선택 저항성 캘러스 클론을 288J 배지로 옮겨 식물 재생을 개시한다. 체세포 배아 성숙(2~4주) 후, 잘 발육된 체세포 배아를 발아용 배지로 옮기고 조명이 있는 배양실로 옮긴다. 약 7~10일 후, 발육 중인 식물체를 식물체가 잘 정착될 때까지 7~10일 동안 튜브 내 호르몬 없는 배지 272V로 옮긴다. 이어서, 식물을 화분용 영양토를 함유한 (2.5" 화분에 해당하는) 플랫의 인서트로 옮기고, 성장 챔버에서 1주일 동안 성장시킨 후 온실에서 추가로 1~2주 더 성장시킨 다음, 클래식 600 화분(1.6 갤런)으로 옮기고 성장 성숙시킨다. 식물을 모니터링하고 형질전환 효율, 및/또는 재생 능력의 변경에 대해 점수를 매긴다.
개시 배지(560L)는 4.0 g/l의 N6 기저염(SIGMA C-1416), 1.0 ml/l의 Eriksson’s Vitamin Mix(1000X SIGMA-1511), 0.5 mg/l의 티아민 HCl, 20.0 g/l의 수크로오스, 1.0 mg/l의 2,4-D, 및 2.88 g/l의 L-프롤린(KOH로 pH 5.8로 조절 후 D-I H2O로 부피를 맞춤); 2.0 g/l의 겔라이트(D-I H2O로 부피를 맞춘 후 첨가); 및 8.5 mg/l의 질산은(배지를 멸균하고 실온까지 냉각한 후 첨가)을 포함한다.
유지 배지(560P)는 4.0 g/l의 N6 기저염(SIGMA C-1416), 1.0 ml/l의 Eriksson’s Vitamin Mix(1000X SIGMA-1511), 0.5 mg/l의 티아민 HCl, 30.0 g/l의 수크로오스, 2.0 mg/l의 2,4-D, 및 0.69 g/l의 L-프롤린(KOH로 pH 5.8로 조절 후 D-I H2O로 부피를 맞춤); 3.0 g/l의 겔라이트(D-I H2O로 부피를 맞춘 후 첨가); 및 0.85 mg/l의 질산은(배지를 멸균하고 실온까지 냉각한 후 첨가)을 포함한다.
입자 충돌 배지(560Y)는 4.0 g/l의 N6 기저염(SIGMA C-1416), 1.0 ml/l의 Eriksson’s Vitamin Mix(1000X SIGMA-1511), 0.5 mg/l의 티아민 HCl, 120.0 g/l의 수크로오스, 1.0 mg/l의 2,4-D, 및 2.88 g/l의 L-프롤린(KOH로 pH 5.8로 조절 후 D-I H2O로 부피를 맞춤); 2.0 g/l의 겔라이트(D-I H2O로 부피를 맞춘 후 첨가); 및 8.5 mg/l의 질산은(배지를 멸균하고 실온까지 냉각한 후 첨가)을 포함한다.
선택 배지(560R)는 4.0 g/l의 N6 기저염(SIGMA C-1416), 1.0 ml/l의 Eriksson’s Vitamin Mix(1000X SIGMA-1511), 0.5 mg/l의 티아민 HCl, 30.0 g/l의 수크로오스, 및 2.0 mg/l의 2,4-D(KOH로 pH 5.8로 조절 후 D-I H2O로 부피를 맞춤); 3.0 g/l의 겔라이트(D-I H2O로 부피를 맞춘 후 첨가); 및 0.85 mg/l의 질산은 및 3.0 mg/l의 비알라포스(질산은과 비알라포스는 배지를 멸균하고 실온까지 냉각한 후 첨가)를 포함한다.
식물 재생 배지(288J)는 4.3 g/l의 MS염(GIBCO 11117-074), 5.0 ml/l의 MS 비타민 원액(정제된 D-I H2O로 부피를 맞춘 0.100 g 니코틴산, 0.02 g/l 티아민 HCL, 0.10 g/l 피리독신 HCL, 및 0.40 g/l 글리신)(Murashige and Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/l의 미오-이노시톨, 0.5 mg/l의 제아틴, 60 g/l의 수크로오스, 및 0.1 mM 아브시스산 1.0 ml/l(pH 5.6으로 조절 후 정제된 D-I H2O로 부피를 맞춤); 3.0 g/l의 겔라이트(D-I H2O로 부피를 맞춘 후 첨가); 및 1.0 mg/l의 인돌아세트산 및 3.0 mg/l의 비알라포스(인돌아세트산과 비알라포스는 배지를 멸균하고 60℃까지 냉각한 후 첨가)를 포함한다.
호르몬 없는 배지(272V)는 4.3 g/l의 MS염(GIBCO 11117-074), 5.0 ml/l의 MS 비타민 원액(정제된 D-I H2O로 부피를 맞춘 0.100 g/l 니코틴산, 0.02 g/l 티아민 HCL, 0.10 g/l 피리독신 HCL, 및 0.40 g/l 글리신), 0.1 g/l의 미오-이노시톨, 및 40.0 g/l의 수크로오스(pH를 5.6으로 조절한 후 정제된 D-I H2O로 부피를 맞춤); 및 6 g/l의 박토 한천(정제된 D-I H2O로 부피를 맞춘 후 첨가되고, 멸균되고, 60℃까지 냉각됨)을 포함한다.
b. 아그로박테리움 매개 형질전환
본질적으로 Djukanovic et al. (2006) Plant Biotech J 4:345-57에 기술된 바와 같이 아그로박테리움 매개 형질전환을 수행하였다. 간단히 말해, 10~12일 지난 미성숙 배아(0.8~2.5 mm의 크기)를 멸균 커널에서 절개하고 액체 배지(4.0 g/L의 N6 기저염(Sigma C-1416), 1.0 ml/L의 Eriksson's Vitamin Mix(Sigma E-1511), 1.0 mg/L의 티아민 HCl, 1.5 mg/L의 2,4-D, 0.690 g/L의 L-프롤린, 68.5 g/L의 수크로오스, 36.0 g/L의 글루코오스, pH 5.2)에 넣었다. 배아를 모은 후, 배지를 0.35~0.45 OD550의 농도에서 1 ml의 아그로박테리움으로 대체하였다. 옥수수 배아를 아그로박테리움으로 실온에서 5분 동안 배양한 다음, 혼합물을 배지 플레이트(4.0 g/L의 N6 기저염(Sigma C-1416), 1.0 ml/L의 Eriksson's Vitamin Mix(Sigma E-1511), 1.0 mg/L의 티아민 HCl, 1.5 mg/L의 2,4-D, 0.690 g/L의 L-프롤린, 30.0 g/L의 수크로오스, 0.85 mg/L의 질산은, 0.1 nM 아세토시린곤, 및 3.0 g/L의 겔라이트를 함유, pH 5.8)에 부었다. 배아를 축을 아래로 하여 20℃ 암실에서 3일 동안 배양하고 나서, 28℃ 암실에서 4일 배양한 다음, 4.0 g/L의 N6 기저염(Sigma C-1416), 1.0 ml/L의 Eriksson's Vitamin Mix(Sigma E-1511), 1.0 mg/L의 티아민 HCl, 1.5 mg/L의 2,4-D, 0.69 g/L의 L-프롤린, 30.0 g/L의 수크로오스, 0.5 g/L의 MES 완충액, 0.85 mg/L의 질산은, 3.0 mg/L의 비알라포스, 100 mg/L의 카베니실린, 및 6.0 g/L의 한천을 함유한 pH 5.8의 새로운 배지 플레이트로 옮겼다. 유전자이식 사건이 확인될 때까지 배아를 3주마다 계대배양한다. 소량의 조직을 재생 배지(4.3 g/L의 MS염(Gibco 11117), 5.0 ml/L의 MS 비타민 원액, 100 mg/L의 미오-이노시톨, 0.1 μM의 ABA, 1 mg/L의 IAA, 0.5 mg/L의 제아틴, 60.0 g/L의 수크로오스, 1.5 mg/L의 비알라포스, 100 mg/L의 카베니실린, 3.0 g/L의 겔라이트, pH 5.6)로 옮기고 28℃ 암실에서 2주 동안 배양하여 체세포 배아발생을 유도하였다. 싹과 뿌리가 보이는 모든 물질을 4.3 g/L의 MS염(Gibco 11117), 5.0 ml/L의 MS 비타민 원액, 100 mg/L의 미오-이노시톨, 40.0 g/L의 수크로오스, 1.5 g/L의 겔라이트를 함유한 pH 5.6의 배지로 옮기고, 28℃의 인공 조명 하에서 배양하였다. 1주일 후, 식물체를 동일한 배지를 포함하는 유리 튜브로 옮기고, 식물체를 샘플링하고/하거나 토양에 이식할 때까지 성장시켰다.
실시예 9
ZmODP-2 및 ZmWUS의 일시적 발현은 형질전환을 강화함
형질전환 프로토콜의 파라미터는 BBM 활성이 일시적인지 확인하기 위해 수정될 수 있다. 이러한 한 가지 방법은, 예를 들어 화학적 PEI를 사용하여, 전사와 발현을 허용하지만 DNA의 후속적인 방출을 배제하는 방식으로 BBM 함유 플라스미드를 침전시키는 것을 포함한다.
일례로, PEI가 있는 금 입자 위에 BBM 플라스미드가 침전되는 반면, 통합될 유전자이식 발현 카세트(UBI:MoPAT-GFPm:PinII; MoPAT는 옥수수 최적화된 PAT 유전자임)는 표준 염화칼슘 방법을 이용하여 금 입자 위에 침전된다.
간단히 말해, 금 입자를 다음과 같이 PEI로 코팅하였다. 우선, 금 입자를 세척하였다. 평균 직경이 1.0(A.S.I. #162-0010)인 금 입자 35 mg을 마이크로 원심분리기 튜브에서 칭량하고, 1.2 ml의 무수 EtOH를 첨가하고 1분 동안 볼텍싱하였다. 튜브를 실온에서 15분 동안 배양한 다음, 마이크로 원심분리기를 이용하여 4℃에서 15분 동안 고속으로 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 새로운 1.2 ml의 에탄올(EtOH) 분액을 첨가하고, 1분 동안 볼텍싱하고, 1분 동안 원심분리하고, 상청액을 다시 버렸다(이를 2회 반복함). 새로운 1.2 ml의 EtOH 분액을 첨가하고, 이 현탁액(EtOH 중 금 입자)을 -20℃에서 1주일 동안 보관하였다. 입자를 폴리에틸이민(PEI; Sigma #P3143)으로 코팅하기 위해, 세척된 금 입자/EtOH 혼합물 250 ㎕를 원심분리하고 EtOH를 버렸다. 입자를 100 ㎕의 ddH2O에서 1회 세척하여 잔류 에탄올을 제거하고, 250 ㎕의 PEI(0.25 mM)를 첨가한 후, 펄스 초음파 처리하여 입자를 현탁시키고 나서, 튜브를 드라이아이스/EtOH 조에 넣어 현탁액을 급속 냉각한 다음, 이를 밤새 동결 건조하였다. 이 시점에서, 건조되고 코팅된 입자는 -80℃에서 적어도 3주 동안 보관될 수 있다. 사용하기 전에, 입자를 pH 7.1의 2.5 mM HEPES 완충액의 분액 250 ㎕로 3회 세정하고, 1x 펄스 초음파 처리한 다음, 각각의 원심분리 전에 빠르게 볼텍싱하였다. 이어서, 입자를 최종 부피 250 ㎕의 HEPES 완충액에 현탁시켰다. DNA를 부착하기 전에 입자의 분액 25 ㎕를 새로운 튜브에 첨가하였다. 코팅되지 않은 DNA를 부착하기 위해, 입자를 펄스 초음파 처리하고 나서, (5 ㎕ 물 중의) 1 ㎍의 DNA를 첨가한 후 피펫맨(Pipetteman)으로 몇 차례 위아래로 피펫팅하여 혼합하고, 10분 동안 배양하였다. 입자를 잠깐(즉, 10초) 회전시키고, 상청액을 제거하고, 60 ㎕의 EtOH를 첨가하였다. PEI-침전된 DNA-1을 가진 입자를 60 ㎕의 EtOH에서 2회 세척하였다. 입자를 원심분리하고, 상청액을 버리고, 입자를 45 ㎕의 물에 재현탁시켰다. 제2 DNA(DNA-2)를 부착하기 위해, TransIT-2020을 이용한 침전을 사용하였다. 입자/DNA-1 현탁액 45 ㎕를 짧게 초음파 처리한 다음, 5 ㎕의 DNA-2(100 ng/㎕) 및 1 ㎕의 TransIT-2020을 첨가하였다. 용액을 회전 진탕기에 10분 동안 두고, 1분 동안 10,000g로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 입자를 60 ㎕의 EtOH에 재현탁시켰다. 용액을 매크로캐리어 위에 묻히고, DNA-1 및 DNA-2가 순차적으로 부착된 금 입자를 PDS-1000의 표준 프로토콜을 사용하여 10개 DAP Hi-II 미성숙 배아의 배반 세포 내에 전달하였다. 이 실험에 있어서, DAN-1플라스미드는 UBI:RFP:PinII 발현 카세트를 포함하였고, DNA-2는 UBI:CFP:PinII 발현 카세트를 포함하였다. 입자 충돌 2일 후, CFP 및 RFP 형광 마커 모두의 일시적 발현이 미성숙 배아 표면의 수많은 적색 및 청색 세포로서 관찰되었다. 이어서, 배아를 비선택 배양 배지에 두고, 안정된 콜로니에 대해 점수를 매기기 전에 3주 동안 성장시켰다. 이 3주의 기간 후, 단 하나의 적색 콜로니와 비교하여, 10개의 안정적으로 발현하는 다세포 청색 콜로니가 관찰되었다. 이는 PEI-침전이 PEI-도입 DNA의 통합을 현저히 감소시키고 이에 따라 RFP-발현 유전자이식 사건의 복원을 감소시키면서 일시적 발현을 위한 DNA를 효과적으로 도입하는 데 사용될 수 있음을 보여주었다. 이러한 방식으로, PEI-침전은 BBM 및/또는 WUS2의 일시적 발현을 전달하는 데 이용될 수 있다.
예를 들어, 입자를 우선 PEI를 사용하여 UBI:BBM:PinII로 코팅하고 나서, TransIT-2020을 사용하여 UBI:MoPAT-YFP로 코팅한 다음, 미성숙 배아 표면의 배반 세포 내에 입자 충돌시킬 수 있다. PEI 매개 침전은 (TransIT-2020 방법에 비해) 미성숙 배아 표면에서의 일시적 발현 세포의 빈도를 높이고, 안정된 형질전환체의 복원 빈도를 매우 낮춘다. 따라서, PEI-침전 BBM 카세트는 일시적으로 발현하여 입자 충돌된 조직 표면(즉, 배반 표면)에서의 폭발적인 배발생 성장을 자극하지만, 이 플라스미드는 통합되지 않을 것으로 예상된다. Ca++/금 입자로부터 방출된 MoPAT-GFP 플라스미드는 유전자이식 사건의 복원을 실질적으로 향상시키는 빈도로 선택 마커를 통합하고 발현할 것으로 예상된다. 대조군 처리로서, (BBM 대신) UBI:GUS:PinII를 함유한 PEI-침전 입자를 MoPAT-GFP/Ca++ 입자와 혼합한다. 두 처리로부터의 미성숙 배아를 3 mg/l의 비알라포스를 함유한 배양 배지로 옮긴다. 6~8주 후, PEI/BBM 처리에서 대조군 처리(PEI/GUS)에 비해 훨씬 더 높은 빈도로 GFP+, 비알라포스 저항성 캘러스가 관찰될 것으로 예상된다.
대안적 방법으로서, BBM 플라스미드가 PEI가 있는 금 입자 위에 침전되고 나서, 미성숙 배아 표면의 배반 세포에 도입되고, 이후 BBM 유전자의 일시적인 발현이 배발생 성장의 급속한 증식을 유도한다. 이러한 유도 성장 기간 동안, 외식편이 옥수수에 대한 표준 방법을 이용하여 아그로박테리움으로 처리되고(실시예 1 참조), 세포 내로의 T-DNA 전달이 UBI:MoPAT-GFPm:PinII와 같은 유전자이식 발현 카세트를 도입한다. 공동 배양 후, 외식편을 정상 배양 배지에서 복원시킨 다음, 3 mg/l의 비알라포스를 함유한 배양 배지로 옮긴다. 6~8주 후, PEI/BBM 처리에서 대조군 처리(PEI/GUS)에 비해 훨씬 더 높은 빈도로 GFP+, 비알라포스 저항성 캘러스가 관찰될 것으로 예상된다.
BBM 및/또는 WUS2 폴리뉴클레오티드 생성물을 일시적으로 발현시킴으로써 캘러스 성장을 "시작"하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 BBM 및 WUS2 5'-캡핑된 폴리아데닐화 RNA, BBM 및 WUS2 DNA를 포함하는 발현 카세트, 또는 BBM 및/또는 WUS2 단백질을 전달함으로써 이루어질 수 있다. 이러한 분자는 모두 바이올리스틱 입자 총을 사용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, 5'-캡핑된 폴리아데닐화 BBM 및/또는 WUS2 RNA는 Ambion’s mMessage mMachine 키트를 이용하여 시험관 내에서 쉽게 제조될 수 있다. RNA는 UBI:MoPAT-GFPm:PinII와 같은 선택/선별에 사용되는 마커 및 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA와 함께 공동으로 전달된다. RNA를 수용하는 세포는 즉시 더 빠르게 분열되기 시작할 것이고 이들 중 많은 부분이 통합된 작물학적 유전자를 가질 것으로 예상된다. 이러한 사건들은 PAT~GFP 융합 단백질을 또한 발현할 (이에 따라 적절한 조명 하에서 녹색 형광을 나타낼) 것이기 때문에 유전자이식 클론 콜로니인 것으로 추가로 확인될 수 있다. 이어서, 이러한 배아로부터 재생된 식물을 관심 폴리뉴클레오티드의 존재에 대해 검사할 수 있다.
실시예 10
가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 리보뉴클레오티드-단백질 복합체(RGEN)로서 gRNA 및 Cas9을 배아 세포 내에 직접 전달하면 옥수수에서 돌연변이를 생성함
본 실시예는 단백질 형태의 Cas9 및 시험관내 전사되거나 화학적 합성된 RNA 분자 형태의 gRNA를 옥수수 미성숙 배아 세포 내에 직접 전달하면 해당 표적 부위에서 돌연변이를 생성함을 보여준다.
RNA 분자 형태의 gRNA를 생성하기 위해, 옥수수 최적화된 U6 중합효소 III gRNA 발현 카세트를, 유전자에 대한 스페이서의 정확히 5'에 전사 개시 신호 및 T7 중합효소 프로모터의 서열을 또한 포함하는 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 제조사의 권고에 따라 AmpliScribe T7-Flash 키트(Epicenter)로 T7 시험관내 전사를 수행하였고, 생성물을 NucAway Spin Columns(Invitrogen; Life Technologies Inc)을 이용한 후 에탄올 침전으로 정제하였다.
가이드 RNA/Cas9 엔도뉴클레아제 단백질 복합체(RGEN)(가이드 RNA/Cas9 엔도뉴클레아제 리보뉴클레오티드-단백질이라고도 함)를 생성하기 위해, 7 ㎍의 Cas9(스트렙토코커스 피오게네스 Cas9) 단백질과 3 ㎍의 gRNA 분자(1:2 몰비)를 1x Cas9 완충액(NEB)에서 총 20 ㎕의 부피로 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양하였다. RGEN과 함께, 유비퀴틴 프로모터 조절 시각적 선택 마커(MoPAT-DsRed 융합), 유비퀴틴 프로모터 조절 메이스 밑씨 발육 단백질 2, ZmODP2(2009년 12월 31일 공개된US20090328252 참조) 및 옥수수 IN2 프로모터(Hershey et al. 1991, Plant Mol. Biol 17:679-690) 조절 WUSCHEL, ZmWUS(2011년 7월 7일 공개된 US20110167516 참조)를 포함하는 플라스미드를, 상업적으로 입수 가능한 금 입자(0.6 ㎛, Bio-Rad) 및 수용성 양이온성 지질 TransIT-2020(Mirus, USA)을 포함하는 입자 전달 매트릭스와 혼합하였다. 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 리보뉴클레오티드-단백질 복합체를 포함하는 입자 전달 매트릭스를 입자 매개 전달(실시예 8에 기술된 입자 매개 전달 참조)을 약간 수정하여 이용해서 옥수수 배아 세포 내에 전달하였다. 구체적으로, 금 입자를 마이크로 원심분리기에서 10,000 rpm으로 1분 동안 펠렛화하고 상청액을 제거한 후, 입자를 100% 에탄올 대신 105 ㎕의 멸균수에 재현탁시켰다. 이어서, 각각의 매크로캐리어의 중앙에 10 ㎕를 묻히고 입자 충돌 전에 건조시켰다.
시각적 선택 마커(UBI:MoPAT-DsRED) 및 발육 유전자(UBI:ZmODP2 및 IN2:ZmWUS)와 함께 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 리보뉴클레오티드-단백질 복합체(RGEN)의 형태로 Cas9 및 gRNA를 공동으로 전달하기 위한 미성숙 배아의 공급원으로서 야생형 옥수수 식물을 사용하였다. LIGCas-3, MS26Cas-2, MS45Cas-2 및 ALSCas-4 내인성 표적 부위에서의 돌연변이 빈도를 측정하기 위해, 입자 충돌 2일 후 배아를 회수하여 앰플리콘 심층 시퀀싱으로 분석하였다. 미처리 배아 및 Cas9 단백질만으로 입자 충돌시킨 배아를 음성 대조군으로 사용한 한편, Cas9 및 gRNA를 발현하는 DNA 벡터로 입자 충돌시킨 배아를 양성 대조군으로 사용하였다. DNA 벡터로서 전달된 Cas9-gRNA 성분 및 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 리보뉴클레오티드-단백질 복합체로서 전달된 Cas9-gRNA 성분에 대해 유사한 빈도가 발견되었다(표 11).
RGEN 복합체를 옥수수 배아 세포 내에 직접 전달하여 생성된 LIG, MS26, MS45, 및 ALS 표적 부위에서의 돌연변이 해독의 백분율
표적 부위 전달된 분자 총 해독 수 돌연변이 해독 수 돌연변이 해독의 백분율
LIGCas-3 (Chr. 2) 미처리 배아(대조군 1) 915,198 38 0.004%
Cas9 단백질만(대조군 2) 408,348 17 0.004%
Cas9-Lig-CR3 RGEN 439,827 2,510 0.57%
Cas9 (DNA)+Lig-CR3 (DNA) 369,443 2,058 0.56%
MS26Cas-2 (Chr. 1) 미처리 배아(대조군 1) 245,476 8 0.003%
Cas9 단백질만(대조군 2) 429,388 20 0.004%
Cas9-MS26-CR2 RGEN 252,519 533 0.21%
Cas9 (DNA)+MS26-CR2 (DNA) 186,857 812 0.43%
MS45Cas-2 (Chr. 9) 미처리 배아(대조군 1) 255,877 12 0.005%
Cas9 단백질만(대조군 2) 487,876 12 0.002%
Cas9-MS45-CR2 RGEN 241,287 2,075 0.86%
Cas9 (DNA)+MS45-CR2 (DNA) 304,622 1591 0.52%
ALS2Cas-4 (Chr. 5) Cas9 단백질만(대조군 2) 807,014 125 0.02%
Cas9-ALS-CR4 RGEN 791,084 3,613 0.45%
Cas9 (DNA)+ALS-CR4 (DNA) 833,130 4251 0.51%
식물 수준에서 돌연변이 빈도를 측정하기 위해, Cas9-MS45-gRNA 복합체, ZmODP2, ZmWUS 및 MOPAT-DSRED로 공동으로 입자 충돌시킨 60개 배아를, 선택적 제제로서 비알라포스를 함유한 배지에 두었다. 36개의 제초제 저항성 캘러스 섹터 각각으로부터 다수의 식물을 재생하여 돌연변이에 대해 검사하였다. 36개 사건 중, 17개(47%)가 돌연변이 대립 유전자(10개의 단일대립 및 7개의 이대립)를 포함한 반면 19개(53%)는 야생형 MS45 대립 유전자만을 나타냈다. 돌연변이가 있는 식물 중, 각각의 대립 유전자에 대한 시퀀싱 해독의 수는 유사하여 식물이 키메라 식물이 아님을 나타냈다.
직접 RGEN 전달도 식물에서 내인성 유전자의 특이적 편집을 생성하기에 충분함을 입증하기 위해, 옥수수 ALS2 유전자를 실시예 2에 기술된 바와 같이 표적화하였다(ALS2 특이적 ALSCas-4 표적 부위). 복구 주형으로서 127 nt 단일 가닥 DNA Oligo2(SEQ ID NO: 45)를 전술한 바와 유사한 방식으로 Cas9/ALS-CR4 RGEN 복합체와 공동으로 전달하였다. 입자 충돌 2일 후 배아를 회수하여 앰플리콘 심층 시퀀싱으로 분석하였다(표 12).
RGEN 복합체 및 공여 DNA 주형을 옥수수 배아 세포 내에 전달하여 생성된 ALS 표적 부위에서의 돌연변이 해독 및 편집된 해독의 백분율
표적 부위 전달된 분자 총 해독 수 돌연변이 해독 수 돌연변이 해독의 % 편집된 해독 수 편집된 해독의 %
ALS2 Cas9 단백질만 807,014 105 0.01% - -
Cas9-ALS-CR4 RGEN + ss Oligo2 791,084 3,613 0.45% 209 0.02%
또한, 두 가지 독립적 실험에서, 입자 충돌된 40 내지 50개 배아를 편집된 ALS2 유전자에 대한 직접 선택으로서 100 ppm의 클로르설푸론을 함유한 플레이트로 옮겼다. 6주 후, 클로르설푸론이 있는 배지에서 계속 성장한 2개의 캘러스 섹터(각각의 실험으로부터 하나)를 시퀀싱으로 분석하였다. 두 사건 모두에서, 하나의 ALS2 대립 유전자는 특이적으로 편집된 반면 두 번째 대립 유전자는 야생형으로 남아있었다. 이 캘러스 섹터들로부터 재생된 식물은 편집된 ALS2 대립 유전자를 포함하였고, 제초제를 살포했을 때 클로르설푸론에 대한 저항성이 있었다.
이 데이터들은 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 리보뉴클레오티드-단백질 복합체(폴리뉴클레오티드 변형 주형 DNA를 갖거나 갖지 않음)의 형태로 Cas9 및 gRNA를 옥수수 미성숙 배아 세포 내에 직접 전달하는 것이 식물에서 표적 돌연변이유발 및 유전자 편집을 위한 (재조합 DNA, 플라스미드 DNA와 같은) DNA 전달에 대한 실행 가능한 대안임을 보여준다.
실시예 11
mRNA 형태의 Cas9 및 gRNA를 배아 세포 내에 직접 전달하면 옥수수에서 돌연변이를 생성함
본 실시예는 mRNA 분자 형태의 Cas9 및 시험관내 전사되거나 화학적 합성된 RNA 분자 형태의 gRNA를 옥수수 미성숙 배아 세포 내에 직접 전달하면 해당 표적 부위에서 돌연변이를 생성함을 보여준다.
이전의 실험에서(Svitashev et al., Plant Physiology, 2015, Vol. 169, pp. 931-945), 시험관내 합성된 RNA 분자 형태의 gRNA를 DNA 벡터를 발현하는 Cas9과 공동으로 전달하면 Cas9과 gRNA가 모두 DNA 벡터로서 전달된 실험에서보다 돌연변이 빈도가 약 100배 더 낮았다. 이러한 차이에 대한 한 가지 가능한 설명은, gRNA가 RNA로서 전달되고 Cas9이 DNA 벡터로서 전달되었을 때 Cas9 및 gRNA의 동시 기능에 대한 요건이 충족되지 않았다는 것일 수 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해, Cas9은 기능성 Cas9 단백질 발현에 전달되는 순간부터의 시간을 단축시킬 mRNA 분자로서 전달될 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 Cas9 mRNA(TriLink Biotechnologies)를 실험에 사용하였다.
이 아이디어를 검정하기 위해, 옥수수 배아 세포를 shot 당 Cas9 mRNA(200 ng), 시험관내 합성된 RNA 분자 형태의 gRNA(100 ng), 유비퀴틴 조절 MoPAT-DsRED 융합(25 ng) 및 발육 유전자, 유비퀴틴 프로모터 조절 ODP2 및 IN2 프로모터 조절 WUS(각 12 ng)를 포함하는 DNA 벡터와 함께 공동으로 입자 충돌시켰다. 상업적으로 입수 가능한 Cas9 mRNA(TriLink Biotechnologies) 및 전술한 바와 같이 시험관내 합성된 RNA 분자를 실험에 사용하였다. 형질전환 2일 후 모은 배아에 대해 앰플리콘 심층 시퀀싱으로 돌연변이 빈도 분석을 수행하였다(표 13).
mRNA로서 Cas9 및 RNA 분자로서 gRNA를 옥수수 배아 세포 내에 일시적으로 전달하여 생성된 MS45 표적 부위에서의 돌연변이 해독의 백분율
표적 부위 전달된 분자 총 해독 수 돌연변이 해독 수 돌연변이 해독의 백분율
MS45 Cas9 mRNA만 1,097,279 799 0.07%
Cas9 mRNA+Ms45 CR2 gRNA 1,260,332 2,304 0.18%
Cas9 (DNA)+Ms45 CR2 (DNA) 1,106,125 3,490 0.31%
이 데이터들은 Cas9 및 gRNA를 모두 RNA 분자 형태로 전달하면 표적 돌연변이의 빈도를 향상시키고, RGEN 복합체로서의 Cas9-gRNA 전달과 함께, 식물에서 표적 돌연변이유발 및 유전자 편집을 위한 DNA 전달에 대한 실행 가능한 대안임을 보여준다.
실시예 12
선택 마커를 사용하지 않고 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 리보뉴클레오티드-단백질 복합체(RGEN)로서 Cas9 및 gRNA를 배아 세포 내에 직접 전달하면 옥수수에서 돌연변이를 생성함
본 실시예는 단백질 형태의 Cas9 및 시험관내 전사되거나 화학적 합성된 RNA 분자 형태의 gRNA를 선택 마커 유전자(들)의 공동 전달 없이 옥수수 미성숙 배아 세포 내에 전달하는 것이 실용적인 빈도로 해당 표적 부위에서 돌연변이를 가진 식물을 재생하기에 충분함을 보여준다.
형질전환되거나 변형된 세포에 성장 이점을 제공하기 위한 선택 마커의 필요성은 식물 형질전환 및 게놈 변형 프로토콜에서 오랜 패러다임이었다. 따라서, 모든 돌연변이, 유전자 편집 및 유전자 통합 실험에서, 게놈 편집 사건을 선택하기 위해 선택 마커가 사용된다. 실시예 10에 기술된 실험에서 RGEN 복합체의 예기치 않은 높은 활성(돌연변이 빈도)을 고려하여, 선택 마커 없는 완전히 DNA가 없는(벡터가 없는) 게놈 편집을 시도하였다. 옥수수 배아 세포를 3개의 다른 유전자(liguleless1 (LIG), MS26 및 MS45)를 표적화하는 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 리보뉴클레오티드-단백질(RGEN) 복합체로 입자 충돌시켰다. DNA 벡터 상의 Cas9 엔도뉴클레아제 및 MS45-gRNA를 대조군으로 사용한 병행 실험에 전달하였다. 식물을 재생시키고 표적 돌연변이에 대해 시퀀싱으로 분석하였다. 모든 실험에서, 돌연변이 식물은 2.4 내지 9.7% 범위의 놀라울 정도로 높은 빈도로 복원되었다(표 14).
옥수수 미성숙 배아 세포 내에 Cas9 및 gRNA를 DNA 벡터 형태로 전달할 때와 RGEN 복합체를 직접 전달할 때 LIG, MS26 및 MS45 표적 부위에서의 돌연변이 빈도. 선택 없이(선택 마커를 사용하지 않고) 재생된 T0 식물에 대해 분석을 수행하였다
표적 부위 Cas9 및 gRNA 전달 방법 분석 식물 돌연변이 대립 유전자를 가진 식물
 SEQ ID NO:
LIGCas-3 RGEN 756 73 (9.7%) 12
MS26Cas-2 RGEN 756 18 (2.4%) 14
MS45 Cas-2 RGEN 1,880 70 (3.7%) 8
MS45 Cas-2 벡터 DNA 940 38 (4.0%) 8
또한, 재생된 T0 식물을 야생형 Hi-II 식물과 교배하고 자손 식물을 분리 분석에 사용하였다. 분석된 모든 자손 식물에서 예상된 멘델의 분리(1:1)의 돌연변이 ms45 대립 유전자의 유성 유전이 입증되었다.
옥수수에서 표적 이탈 절단을 감소시키는 RGEN 전달의 잠재성을 평가하기 위해, DNA 벡터 및 RGEN 전달을 이용하여 부위 이탈 MS45에서의 돌연변이 빈도를 평가하였다. 정확한 표적 서열과 최대 2개의 불일치를 허용하는 Bowtie 서열 정렬자(Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, S.L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10:R25, 2009)를 이용하여 MS45Cas-2 표적 부위의 프로토스페이서 영역(가이드 RNA 스페이서와 염기쌍을 이루는 표적 부위의 영역)을 옥수수 B73 기준 게놈(B73 RefGen_v3, Maize Genetics and Genomics Database)과 정렬시킴으로써 정확한 표적 부위에 가까운 상동성을 갖는 부위에 대한 조사를 수행하였다. 이어서, 식별된 표적 이탈 프로토스페이서의 바로 3'에서 NGG 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열의 존재에 대해 잠재적 표적 이탈 부위를 검색하였다. 이러한 검색 기준을 사용하여 단 하나의 표적 이탈 부위(5’-CGCCGAGGGCGACTACCGGC-3’, SEQ ID NO:81)가 식별되었다. 이는 MS45 프로토스페이서 표적 및 AGG PAM과 2 bp의 불일치를 포함하였다(표 15). 부위가 생체내 절단되었는지 확인하기 위해, Cas9 및 MS45-CR2 gRNA를 발현하는 DNA 벡터로 형질전환된 옥수수 배아에서의 돌연변이 존재에 대해 심층 시퀀싱으로 분석하였다. 표 15에 나타낸 바와 같이, 표적 이탈 부위의 돌연변이 활성은 정확한 표적 부위에서 관찰된 4%의 빈도와 비교하여 2%의 빈도였다. 표 15에 나타낸 바와 같이, RGEN 표적 이탈 활성은 DNA 벡터 상의 Cas9 및 gRNA 전달에 비해 크게 감소되었다(2%에서 0%로).
Figure pct00007
본 실시예는 RNA-유도 엔도뉴클레아제를 이용한 표적 돌연변이를 가진 식물의 생성은 선택 또는 선별 마커 유전자의 공동 전달을 필요로 하지 않으므로, 도입된 변형의 특이성 및 정확성을 증가시킴을 보여준다. 재생된 식물은 DNA 벡터의 무작위 통합 없이 표적 돌연변이 또는 표적 유전자 편집(DNA 서열을 변형하기 위해 복구 주형이 포함된 경우)만을 포함하였다. 이러한 전달 방법은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 옥수수, 대두, 밀, 벼, 밀렛, 수수 및 카놀라를 비롯한 주요 작물 종의 식물 세포 내 유전자 돌연변이유발에 대한 완전히 DNA가 없는 접근법을 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> Pioneer Hi-Bred International Inc. Cigan, Andrew Mark Svitashev, Sergei <120> RESTORING FUNCTION TO A NON-FUNCTIONAL GENE PRODUCT VIA GUIDED CAS SYSTEMS AND METHODS OF USE <130> BB2533 PCT <150> 62/243719 <151> 2015-10-20 <150> 62/309033 <151> 2016-03-16 <150> 62/359254 <151> 2016-07-07 <160> 82 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4107 <212> DNA <213> Streptococcus pyogenes M1 GAS (SF370) <400> 1 atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60 atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120 cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180 gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240 tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300 cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360 aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420 aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480 atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540 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ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 2280 attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 2340 atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 2400 gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 2460 gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac 2520 attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580 gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640 aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700 acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 2760 ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820 actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880 aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940 taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000 tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060 atgattgcta 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agtgcagttt atctatcttt 120 atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca 180 gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt 240 ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg 300 caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta 360 gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct 420 ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt agatataaaa 480 tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta 540 aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt 600 ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca 660 cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg 720 ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag 780 gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc 840 ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctctttccc 900 caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa 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catcccactg tcgggaacag accggatcat tcacgaggcg aaagtcgtca acacatgcgt 52980 tataggcatc ttcccttgaa ggatgatctt gttgctgcca atctggaggt gcggcagccg 53040 caggcagatg cgatctcagc gcaacttgcg gcaaaacatc tcactcacct gaaaaccact 53100 agcgagtctc gcgatcagac gaaggccttt tacttaacga cacaatatcc gatgtctgca 53160 tcacaggcgt cgctatccca gtcaatacta aagcggtgca ggaactaaag attactgatg 53220 acttaggcgt gccacgaggc ctgagacgac gcgcgtagac agttttttga aatcattatc 53280 aaagtgatgg cctccgctga agcctatcac ctctgcgccg gtctgtcgga gagatgggca 53340 agcattatta cggtcttcgc gcccgtacat gcattggacg attgcagggt caatggatct 53400 gagatcatcc agaggattgc cgcccttacc ttccgtttcg agttggagcc agcccctaaa 53460 tgagacgaca tagtcgactt gatgtgacaa tgccaagaga gagatttgct taacccgatt 53520 tttttgctca agcgtaagcc tattgaagct tgccggcatg acgtccgcgc cgaaagaata 53580 tcctacaagt aaaacattct gcacaccgaa atgcttggtg tagacatcga ttatgtgacc 53640 aagatcctta gcagtttcgc ttggggaccg ctccgaccag aaataccgaa gtgaactgac 53700 gccaatgaca ggaatccctt ccgtctgcag ataggtacca tcgatagatc tgctgcctcg 53760 cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag 53820 cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg 53880 gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg tatactggct 53940 taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc 54000 gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga 54060 ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 54120 acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 54180 aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 54240 tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 54300 aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 54360 gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 54420 acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 54480 accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 54540 ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 54600 gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 54660 gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 54720 ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 54780 gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 54840 cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 54900 cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 54960 gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 55020 tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 55080 gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 55140 agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 55200 tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 55260 agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggg gggggggggg gggggttcca 55320 ttgttcattc cacggacaaa aacagagaaa ggaaacgaca gaggccaaaa agctcgcttt 55380 cagcacctgt cgtttccttt cttttcagag ggtattttaa ataaaaacat taagttatga 55440 cgaagaagaa cggaaacgcc ttaaaccgga aaattttcat aaatagcgaa aacccgcgag 55500 gtcgccgccc cgtaacct 55518 <210> 48 <211> 61 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> reference sequence <400> 48 cacgtatata tacgcgtacg cgtacgtgtg aggtatatat atcctccgcc ggggcacgta 60 c 61 <210> 49 <211> 62 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 1 <400> 49 cacgtatata tacgcgtacg cgtacgttgt gaggtatata tatcctccgc cggggcacgt 60 ac 62 <210> 50 <211> 60 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 1 <400> 50 cacgtatata tacgcgtacg cgtacggtga ggtatatata tcctccgccg gggcacgtac 60 <210> 51 <211> 60 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 1 <400> 51 cacgtatata tacgcgtacg cgtactgtga ggtatatata tcctccgccg gggcacgtac 60 <210> 52 <211> 59 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 1 <400> 52 cacgtatata tacgcgtacg cgtacgtgag gtatatatat cctccgccgg ggcacgtac 59 <210> 53 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 1 <400> 53 cacgtatata tatcctccgc cggggcacgt ac 32 <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 1 <400> 54 cacgtatata tacgcgtac 19 <210> 55 <211> 57 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 1 <400> 55 cacgtatata tacgcgtacg cgtgtgaggt atatatatcc tccgccgggg cacgtac 57 <210> 56 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 1 <400> 56 cacgtatata tacgcgtacg ccggggcacg tac 33 <210> 57 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 1 <400> 57 cacgtatata tcctccgccg gggcacgtac 30 <210> 58 <211> 59 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 1 <400> 58 cacgtatata tacgcgtacg cgtatgtgag gtatatatat cctccgccgg ggcacgtac 59 <210> 59 <211> 54 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 2 <400> 59 gcgctgctcg attccgtccc catggtcgcc atcacgggac aggtgccgcg acgc 54 <210> 60 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 2 <400> 60 Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro 1 5 10 15 Arg Arg <210> 61 <211> 54 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 2 <400> 61 gcgttgctcg actccgtccc cattgtcgcc atcacgggac aggtgtcgcg acgc 54 <210> 62 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 2 <400> 62 Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Ile Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Ser 1 5 10 15 Arg Arg <210> 63 <211> 54 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 2 <400> 63 gcgttgctgg actccgtgcc gatggtcgcc atcacgggac aggtgtcccg acgc 54 <210> 64 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 2 <400> 64 Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Ser 1 5 10 15 Arg Arg <210> 65 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 4 <400> 65 atggctcccc cggccacccc gctccggccg t 31 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 4 <400> 66 Met Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro 1 5 10 <210> 67 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 4 <400> 67 atggctcccc cggccacccc ctccggccgt 30 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 4 <400> 68 Met Ala Pro Pro Ala Thr Pro Ser Gly Arg 1 5 10 <210> 69 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 4 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 69 atggctcccc cggccacccc nctccggccg t 31 <210> 70 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 5 <400> 70 tcgactcgct caccatgtcc ggcccatgac caccgccgcc 40 <210> 71 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 5 <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 71 tcgactcgct caccatngtc cggcccatga ctcccccggc c 41 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 6 <400> 72 attcccccgg ccaccccgtc ggcc 24 <210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 6 <400> 73 Ile Pro Pro Ala Thr Pro Ser Ala 1 5 <210> 74 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 6 <400> 74 attcccccgg ccacccgtcg gcc 23 <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 6 <400> 75 Ile Pro Pro Ala Thr Arg Arg 1 5 <210> 76 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 6 <400> 76 attcccccgg ccacctcgtc ggcc 24 <210> 77 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> sequence on Fig. 6 <400> 77 Ile Pro Pro Ala Thr Ser Ser Ala 1 5 <210> 78 <211> 441 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IN2 promoter <400> 78 atccctggcc accaaacatc cctaatcatc cccaaatttt ataggaacta ctaatttctc 60 taacttaaaa aaaatctaaa atagtatact ttagcagcct ctcaatctga tttgttcccc 120 aaatttgaat cctggcttcg ctctgtcacc tgttgtactc tacatggtgc gcagggggag 180 agcctaatct ttcacgactt tgtttgtaac tgttagccag accggcgtat ttgtcaatgt 240 ataaacacgt aataaaattt acgtaccata tagtaagact ttgtatataa gacgtcacct 300 cttacgtgca tggttatatg cgacatgtgc agtgacgtta tcagatatag ctcaccctat 360 atatatagct ctgtccggtg tcagtagcaa tcaccattca tcagcacccc ggcaggtcga 420 ccccgagctc cctgcacctg c 441 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Zea mays <400> 79 gctcccccgg ccaccccgct c 21 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Zea mays <400> 80 gctcccccgg ccaccccctc 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Zea mays <400> 81 cgccgagggc gactaccggc 20 <210> 82 <211> 23 <212> DNA <213> Zea mays <400> 82 cgccgagggc gactaccggc agg 23

Claims (24)

  1. 세포의 게놈 내 비기능성 유전자 산물에 대한 기능을 복원하는 방법으로서, 게놈 내 파괴된 유전자를 포함하는 세포에 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 도입하는 단계를 포함하되, 상기 복합체는 이중 가닥 절단을 생성하고, 상기 파괴된 유전자는 기능성 유전자 산물을 암호화하지 않고, 상기 파괴된 유전자는 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 상기 기능성 유전자 산물을 암호화할 수 있는 비파괴 유전자로 복원되는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 파괴된 유전자는 해당 비파괴 유전자와 비교할 때 PAM 서열의 상류(5') 네 번째 뉴클레오티드의 염기쌍 결실을 포함하고, 상기 염기쌍 결실은 파괴된 유전자의 유전자 산물에서 아미노산 프레임이동을 생성함으로써, 파괴된 유전자의 유전자 산물을 비기능적 상태로 만드는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 염기쌍 결실은 코돈 서열의 첫 번째, 두 번째, 또는 세 번째 뉴클레오티드인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 복원은 이중 가닥 절단에 단일 염기를 삽입시키는 비상동 말단 연결(NHEJ)에 의해 달성되는 방법.
  5. 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법으로서,
    표적 부위 및 파괴된 선택 마커 유전자를 포함하는 적어도 하나의 세포에 제1 가이드 RNA, Cas 엔도뉴클레아제, 및 적어도 제2 가이드 RNA를 도입하되, 상기 제1 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 파괴된 선택 마커 유전자에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 제1 복합체를 형성할 수 있고, 상기 파괴된 선택 마커 유전자는 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 기능성 선택 마커 단백질을 암호화할 수 있는 비파괴 선택 마커 유전자로 복원되고, 상기 제2 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 위치한 상기 표적 부위를 인식하고, 거기에 결합하고, 닉킹 또는 절단할 수 있는 제2 복합체를 형성할 수 있는 단계; 및
    상기 뉴클레오티드 서열의 변형을 갖는 세포를 상기 기능성 선택 마커 단백질에 의해 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 도입 및 선택 단계는 선택 마커 유전자의 도입을 포함하지 않는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 변형은 상기 표적 부위에서의 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 및 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 세포에 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 도입하는 단계를 더 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드 변형 주형은 상기 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형을 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 변형 주형의 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형은 (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, (ii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, (iii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 및 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 세포에 공여 DNA를 도입하는 단계를 더 포함하되, 상기 공여 DNA는 상기 표적 부위에 삽입될 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  11. 제5항에 있어서, 세포는 인간, 비인간, 동물, 고세균, 박테리아, 진균, 곤충, 효모, 비통상적 효모, 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 식물 세포는 외떡잎식물 및 쌍떡잎식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 식물 세포는 옥수수, 벼, 수수, 호밀, 보리, 밀, 밀렛, 귀리, 사탕 수수, 잔디, 또는 스위치그래스, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 목화, 담배, 땅콩, 감자, 토마토, 담배, 애기장대, 및 잇꽃 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 식물 세포로부터 식물 또는 자손 식물을 생산하는 단계를 더 포함하는 방법.
  15. 임의의 하나의 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제가 결여된, 제14항의 방법에 의해 생산된 식물 또는 자손 식물.
  16. 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 편집하는 방법으로서,
    a) 적어도 하나의 세포에 적어도 하나의 가이드 RNA 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제를 도입하되, 상기 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 복합체를 형성할 수 있는 단계;
    b) 상기 뉴클레오티드 서열에 적어도 하나의 단일 뉴클레오티드 결실을 포함하는 세포를 (a)로부터 선택하되, 상기 뉴클레오티드 결실은 편집될 위치에 위치하는 단계; 및
    c) (b)의 세포에 적어도 하나의 가이드 RNA 및 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제를 도입하되, 상기 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드 서열에 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 복합체를 형성할 수 있고, 폴리뉴클레오티드 변형 주형을 사용하지 않고 (b)의 뉴클레오티드 결실과 동일한 위치에 단일 뉴클레오티드를 삽입할 수 있는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 형성하는 가이드 RNA 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질은 각각 RNA 및 단백질로서 세포에 도입되는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체는 리보뉴클레오티드-단백질 복합체로서 세포에 도입되는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체의 성분은 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 mRNA로서, 그리고 가이드 RNA를 포함하는 RNA로서 도입되는 방법.
  20. 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 복합체를 세포 내에 전달하는 방법으로서,
    적어도 하나의 가이드 RNA 분자와 적어도 하나의 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 결합하여 리보뉴클레오티드-단백질을 형성하는 단계 및 상기 리보뉴클레오티드-단백질을 입자 전달 매트릭스와 결합하여 상기 리보뉴클레오티드-단백질과 매트릭스가 결합될 수 있도록 하여 리보뉴클레오티드-단백질-매트릭스 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 리보뉴클레오티드-단백질-매트릭스 복합체를 상기 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 주형을 도입하는 단계를 더 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드 변형 주형은 상기 세포의 게놈 내 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형을 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드 변형 주형의 상기 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형은 (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, (ii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, (iii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 및 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  22. 제20항에 있어서, 공여 DNA를 도입하는 단계를 더 포함하되, 상기 공여 DNA는 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  23. 제20항에 있어서, 입자 전달 매트릭스는 양이온성 지질과 결합된 미립자를 포함하는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질, Cpf1 단백질, C2c1 단백질, C2c2 단백질, C2c3 단백질, Cas3, Cas3-H, Cas5, Cas7, Cas8, Cas10, 또는 이들의 복합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
KR1020187012259A 2015-10-20 2016-10-17 유도 cas 시스템을 통한 비기능성 유전자 산물에 대한 기능 회복 및 이용 방법 KR20180069832A (ko)

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