KR20210149686A - 유전자 편집에 유용한 폴리펩티드 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20210149686A
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알렉산드라 브리너 크롤리
테드 디. 일리치
마크 무어
로돌페 바랭구
마이클 라스너
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라이프에디트 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

관심 표적 서열에 결합하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 조성물은 DNA 결합 단백질 또는 단백질 도메인과 핵산 변형 단백질 또는 단백질 도메인 사이의 융합 단백질을 포함한다. 조성물은 관심 표적 서열의 절단 또는 변형, 관심 표적 서열의 가시화, 및 관심 서열의 발현의 변형에 사용된다. 조성물은 RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드, CRISPR RNA, 트랜스-활성화 CRISPR RNA, 가이드 RNA, 데아미나제, 및 이를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포 또한 제공된다. 관심 표적 서열에 결합시키기 위한 CRISPR 시스템이 추가로 제공되며, CRISPR 시스템은 RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드 및 하나 이상의 가이드 RNA를 포함한다. DNA-결합 폴리펩티드에 융합될 수 있고 유전자 편집에 유용할 수 있는 데아미나제 또한 제공된다.

Description

유전자 편집에 유용한 폴리펩티드 및 사용 방법
본 발명은 분자 생물학 및 유전자 편집 분야에 관한 것이다.
표적화된 게놈 편집 또는 변형은 기본 및 응용 연구를 위한 중요한 도구가 되고 있다. 초기 방법은 뉴클레아제, 예컨대 메가뉴클레아제, 아연 핑거 융합 단백질 또는 TALEN의 조작을 수반하였고, 각각의 특정한 표적 서열에 대해 특이적인 조작된, 프로그래밍가능한, 서열-특이적인 DNA-결합 도메인을 갖는 키메라 뉴클레아제의 생성을 필요로 한다. RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN), 예컨대 CRISPR-cas 박테리아 시스템의 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-연관된 (cas) 단백질은 특정한 표적 서열과 특이적으로 혼성화하는 가이드 RNA와 뉴클레아제를 복합체화시킴으로써 특이적인 서열의 표적화를 가능하게 한다. 표적-특이적인 가이드 RNA의 생성은 각각의 표적 서열에 대한 키메라 뉴클레아제를 생성하는 것에 비해 비용이 적게 들고 더 효율적이다. 이러한 RNA-가이드된 뉴클레아제를 사용하여, 오류가 발생하기 쉬운 비상동성 말단-연결 (NHEJ)을 통해 복구되는 서열-특이적인 이중 가닥 파손에 의해 게놈을 편집하여, 특이적인 게놈 위치에 돌연변이를 도입시킬 수 있다. 대안적으로, 이종성 DNA는 상동성-지정된 복구를 통해 게놈 부위에 도입될 수 있다.
추가로, RGN은 DNA 편집 접근법에서 유용하다. 핵산 서열의 표적화된 편집, 예를 들어 게놈 DNA로 특이적인 변형의 도입을 가능하게 하는 표적화된 절단은 유전자 기능 및 유전자 발현을 연구하기 위한 고도로 미묘한 접근을 가능하게 한다. 이러한 표적화된 편집은 또한 인간에서 유전 질환을 표적화하기 위해 또는 농작물의 게놈에서 농경학적으로 유익한 돌연변이를 도입시키기 위해 배치될 수 있다. 게놈 편집 도구의 발달은 유전자 편집-기반 포유동물 치료제 및 농업 생명공학에 대한 새로운 접근법을 제공한다.
관심 표적 핵산 서열에 결합시키기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 조성물은 관심 표적 서열의 절단 또는 변형, 관심 표적 서열의 검출, 및 관심 서열의 발현의 변형에 사용될 수 있다. 조성물은 RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 폴리펩티드 및 그의 변이체, CRISPR RNA (crRNA), 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA), 가이드 RNA (gRNA), 데아미나제 폴리펩티드, 이를 코딩하는 핵산 분자, 및 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 포함한다. 관심 표적 서열과 결합하기 위한 CRISPR 시스템 또한 제공되며, CRISPR 시스템은 RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드 및 하나 이상의 가이드 RNA를 포함한다. RNA-가이드된 DNA 결합 폴리펩티드 및 데아미나제 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드 또한 제공된다. 본원에 개시된 방법은 관심 표적 핵산 서열의 결합, 일부 실시양태에서, 관심 표적 핵산 서열의 절단 또는 변형을 위해 도출된다. 관심 표적 서열은 예를 들어 도입된 공여자 서열에 의한 비상동성 말단 결합 또는 상동성-지정된 복구의 결과로서, 또는 염기 편집의 결과로서 변형될 수 있다.
본 발명의 여러 변형 및 다른 실시양태는 관련 기술분야의 기술자에 의해 이들 발명이 상기 설명 및 관련된 도면에 제시된 교시내용의 이익을 갖는 것으로 고려될 것이다. 따라서, 본 발명이 개시된 구체적인 실시양태로 제한되지 않고, 변형 및 다른 실시양태가 첨부된 실시양태의 범위 내에 포함되는 것으로 의도됨을 이해해야 한다. 특정한 용어들이 본원에서 사용되지만, 이들은 단지 일반적이고 설명적인 의미로만 사용되고, 제한하려는 목적이 아니다.
I. 개요
RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN)는 게놈 내의 단일 부위의 표적화된 조작을 가능하게 하고, 치료 및 연구 적용을 위해 유전자 표적화의 맥락에서 유용하다. 포유동물을 비롯한 다양한 유기체에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 예를 들어 비상동성 말단 결합 및 상동성 재조합을 자극함으로써 게놈 조작에 사용되었다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 폴리뉴클레오티드에서 단일 또는 이중 가닥 파손을 생성하거나, 폴리뉴클레오티드를 변형시키거나, 폴리뉴클레오티드 내의 특정한 부위를 검출하거나, 또는 특정한 유전자의 발현을 변형시키는데 유용하다.
본원에 개시된 RNA-가이드된 뉴클레아제는 표적 서열을 변형시킴으로써 유전자 발현을 변경시킬 수 있다. 구체적인 실시양태에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) RNA-가이드된 뉴클레아제 시스템의 일부로서 가이드 RNA (gRNA 또는 sgRNA로도 지칭됨)에 의해 표적 서열로 지시된다. 가이드 RNA는 RNA-가이드된 뉴클레아제와 복합체를 형성하여 RNA-가이드된 뉴클레아제가 표적 서열과 결합하도록, 일부 실시양태에서, 표적 서열에서 단일 가닥 또는 이중 가닥 파손을 도입하도록 지시한다. 표적 서열이 절단된 후에, 파손은 표적 서열의 DNA 서열이 복구 과정 동안에 변형되도록 복구될 수 있다. 따라서, 숙주 세포의 DNA에서 표적 서열을 변형시키기 위해 RNA-가이드된 뉴클레아제를 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, RNA-가이드된 뉴클레아제를 사용하여 진핵생물 세포 또는 원핵생물 세포의 게놈 유전자좌에서 표적 서열을 변형시킬 수 있다.
본 개시내용은 데아미나제 폴리펩티드, 및 이를 코딩하는 핵산 분자, 뿐만 아니라 DNA-결합 폴리펩티드 및 데아미나제 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, DNA-결합 폴리펩티드는 메가뉴클레아제, 아연 핑거 융합 단백질 또는 TALEN이거나 또는 그로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드 및 데아미나제 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드는 RGN이다. 일부 실시양태에서, RGN은 유형 II CRISPR-Cas 폴리펩티드이다. 다른 실시양태에서, RGN은 유형 V CRISPR-Cas 폴리펩티드이다. 추가의 실시양태에서, RGN은 gRNA에 결합하는 Cas9 폴리펩티드 도메인이며, 이는 가닥 혼성화를 통해 표적 핵산 서열에 결합한다.
데아미나제 폴리펩티드는 예를 들어 시티딘과 같은 핵염기를 탈아미노화시킬 수 있는 데아미나제 도메인을 포함한다. 데아미나제에 의한 핵염기의 탈아미노화는 각각의 잔기에서 점 돌연변이를 유도할 수 있으며, 이는 본원에서 "핵산 편집" 또는 "염기 편집"으로 지칭된다. 따라서, RGN 폴리펩티드 변이체 또는 도메인 및 데아미나제 도메인을 포함하는 융합 단백질은 핵산 서열의 표적화된 편집을 위해 사용될 수 있다.
이러한 융합 단백질은 예를 들어 돌연변이성 세포의 생성을 위해 시험관내에서 DNA의 표적화된 편집에 유용하다. 이들 돌연변이성 세포는 식물 또는 동물에 있을 수 있다. 이러한 융합 단백질은 또한 예를 들어 생체외에서 포유동물 세포에서, 예를 들어 동일한 또는 또 다른 대상체에게 후속적으로 재도입되는 대상체로부터 수득된 세포에서 유전적 결함의 수정을 위해 표적화된 돌연변이를 도입하는데; 및 예를 들어 포유동물 대상체에서 질환-연관된 유전자에서 유전적 결함의 수정 또는 불활성화 돌연변이의 도입을 위해 표적화된 돌연변이를 도입하는데 유용할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 또한 식물 세포에서 표적화된 돌연변이를 도입하는데, 예를 들어 유익한 또는 농경학적으로 가치있는 형질 또는 대립유전자를 도입하는데 유용할 수 있다.
용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 펩티드 (아미드) 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 임의의 크기, 구조 또는 기능을 갖는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 적어도 3개의 아미노산 길이일 것이다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 개별 단백질 또는 단백질 집합체를 지칭할 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 예를 들어 화학적 개체, 예컨대 탄수화물 기, 히드록실 기, 포스페이트 기, 파메실 기, 이소파메실 기, 지방산 기, 접합, 관능화 또는 다른 변형을 위한 링커 등의 부가에 의해 변형될 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 단일 분자일 수 있거나, 또는 다분자 복합체일 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 단지 천연 발생 단백질 또는 펩티드의 단편일 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 천연 발생, 재조합, 또는 합성, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "융합 단백질"은 적어도 2가지 상이한 단백질로부터의 단백질 도메인을 포함하는 혼성체 폴리펩티드를 지칭한다. 한 단백질은 융합 단백질의 아미노-말단 (N-말단) 부분에 또는 카르복시-말단 (C-말단) 단백질에 위치하여, 각각 "아미노-말단 융합 단백질" 또는 "카르복시-말단 융합 단백질"을 형성할 수 있다. 단백질은 상이한 도메인, 예를 들어 핵산 결합 도메인 (예를 들어, 표적 부위로 단백질의 결합을 지시하는 Cas9의 gRNA 결합 도메인) 및 핵산 절단 도메인 또는 재조합효소의 촉매적 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 단백질성 부분, 예를 들어 핵산 결합 도메인을 구성하는 아미노산 서열, 및 유기 화합물, 예를 들어 핵산 절단제로서 작용할 수 있는 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 핵산, 예를 들어 RNA와 복합체로 있거나 또는 그와 회합되어 있다. 본원에 제공된 임의의 단백질은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 단백질은 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질에 특히 적합한 재조합 단백질 발현 및 정제를 통해 생성될 수 있다. 재조합 단백질 발현 및 정제 방법은 널리 공지되어 있고, [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))] (그의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 의해 기재된 것들이 포함된다.
II. RNA-가이드된 뉴클레아제
RNA-가이드된 뉴클레아제가 본원에 제공된다. 용어 RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN)는 서열-특이적인 방식으로 특정한 표적 뉴클레오티드 서열에 결합하며, 폴리펩티드와 복합체화하고 표적 서열과 혼성화하는 가이드 RNA 분자에 의해 표적 뉴클레오티드 서열로 가이드되는 폴리펩티드를 지칭한다. RNA-가이드된 뉴클레아제가 결합시 표적 서열을 절단시킬 수 있지만, 용어 RNA-가이드된 뉴클레아제는 또한 표적 서열을 절단하지 않고 그에 결합할 수 있는 뉴클레아제-데드(nuclease-dead) RNA-가이드된 뉴클레아제를 포함한다. RNA-가이드된 뉴클레아제에 의한 표적 서열의 절단은 단일 또는 이중 가닥 파손을 일으킬 수 있다. 이중 가닥 핵산 분자의 단일 가닥만을 절단할 수 있는 RNA-가이드된 뉴클레아제는 본원에서 닉카제로 지칭된다.
본원에 개시된 RNA-가이드된 뉴클레아제에는 APG00969, APG03128, APG09748, APG00771 및 APG02789 RNA-가이드된 뉴클레아제 (이들의 아미노산 서열은 각각 서열식별번호((SEQ ID NO)): 1, 16, 24, 35, 43 또는 50으로 제시됨), 및 RNA-가이드된 서열-특이적인 방식으로 표적 뉴클레오티드 서열에 결합하는 능력을 보유하는 그의 활성 단편 또는 변이체가 포함된다. 이들 실시양태의 일부에서, APG00969, APG03128, APG09748, APG00771 및 APG02789 RGN의 활성 단편 또는 변이체는 단일- 또는 이중-가닥 표적 서열을 절단할 수 있다. 일부 실시양태에서, APG00969, APG03128, APG09748, APG00771 또는 APG02789 RGN의 활성 변이체는 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50에 제시된 아미노산 서열과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, APG00969, APG03128, APG09748, APG00771 또는 APG02789 RGN의 활성 단편은 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50에 제시된 아미노산 서열의 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050개 또는 그 초과의 연속 아미노산 잔기를 포함한다. 본원에 제공된 RNA-가이드된 뉴클레아제는 적어도 하나의 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, DNase, RNase 도메인), 및 가이드 RNA와 상호작용하기 위한 적어도 하나의 RNA 인식 및/또는 RNA 결합 도메인을 포함할 수 있다. 추가로, 본원에 제공된 RNA-가이드된 뉴클레아제에서 확인될 수 있는 도메인에는 다음이 포함되나 이로 제한되지 않는다: DNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 및 이합체화 도메인. 구체적인 실시양태에서, 본원에 제공된 RNA-가이드된 뉴클레아제는 DNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 및 이합체화 도메인 중 하나 이상과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%를 포함할 수 있다.
표적 뉴클레오티드 서열은 본원에 제공된 RNA-가이드된 뉴클레아제에 의해 결합되고, RNA-가이드된 뉴클레아제와 회합된 가이드 RNA와 혼성화한다. 이어서, 폴리펩티드가 뉴클레아제 활성을 갖는 경우에, 표적 서열은 후속적으로 RNA-가이드된 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있다. 용어 "절단하다" 또는 "절단"은 표적 서열 내에 단일 가닥 또는 이중 가닥 파손을 생성할 수 있는, 표적 뉴클레오티드 서열의 백본 내에서 적어도 하나의 포스포디에스테르 결합의 가수분해를 지칭한다. 본원에 개시된 RGN은 엔도뉴클레아제로서 기능하여 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드를 절단할 수 있거나, 또는 폴리뉴클레오티드의 말단 (5' 및/또는 3' 말단)으로부터 연속적인 뉴클레오티드를 제거하는 엑소뉴클레아제일 수 있다. 다른 실시양태에서, 개시된 RGN은 폴리뉴클레오티드의 임의의 위치 내에서 표적 서열의 뉴클레오티드를 절단할 수 있고, 따라서 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 둘 다로 기능할 수 있다. 본원에 개시된 RGN의 표적 폴리뉴클레오티드의 절단은 엇갈린 파손 또는 평활 말단을 생성할 수 있다.
본원에 개시된 RNA-가이드된 뉴클레아제는 박테리아 또는 고세균 종으로부터 유래된 야생형 서열일 수 있다. 대안적으로, RNA-가이드된 뉴클레아제는 야생형 폴리펩티드의 변이체 또는 단편일 수 있다. 야생형 RGN은 예를 들어 뉴클레아제 활성을 변경시키도록 또는 PAM 특이성을 변경시키도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 천연 발생이 아니다.
특정한 실시양태에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 닉카제로서 기능하여, 표적 뉴클레오티드 서열의 단일 가닥만을 절단한다. 이러한 RNA-가이드된 뉴클레아제는 단일 기능 뉴클레아제 도메인을 갖는다. 이들 일부 실시양태에서, 추가의 뉴클레아제 도메인은 뉴클레아제 활성이 감소되거나 또는 제거되도록 돌연변이되었다. 뉴클레아제 불활성 RGN 또는 닉카제 RGN은 융합 단백질의 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드, 또는 RNA-가이드된 DNA-결합 단백질, 또는 RNA-가이드된 DNA-결합 도메인으로 지칭될 수 있다.
다른 실시양태에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 뉴클레아제 활성이 완전히 결여되거나 또는 감소된 뉴클레아제 활성을 나타내고, 본원에서 뉴클레아제-데드로 지칭된다. 돌연변이를 아미노산 서열에 도입시키기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 PCR-매개된 돌연변이 유발 및 부위-지정된 돌연변이 유발은 닉카제 또는 뉴클레아제-데드 RGN을 생성하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 공개 번호 2014/0068797 및 미국 특허 번호 9,790,490을 참고하며; 이들 각각은 그의 전문이 참고로 포함된다.
뉴클레아제 활성이 결여된 RNA-가이드된 뉴클레아제는 융합된 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 소분자 페이로드를 특정한 게놈 위치로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이들 일부 실시양태에서, RGN 폴리펩티드 또는 가이드 RNA는 특정한 서열의 검출이 가능하도록 검출가능한 표지에 융합될 수 있다. 비제한적인 예로서, 뉴클레아제-데드 RGN은 검출가능한 표지 (예를 들어, 형광 단백질)에 융합될 수 있고, 질환-연관된 서열의 검출이 가능하도록 질환과 연관된 특정한 서열에 대해 표적화될 수 있다.
대안적으로, 뉴클레아제-데드 RGN은 원하는 서열의 발현을 변경시키도록 특정한 게놈 위치에 대해 표적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제-데드 RNA-가이드된 뉴클레아제와 표적 서열의 결합은 표적화된 게놈 영역 내에서 RNA 폴리머라제 또는 전사 인자의 결합을 방해함으로써 표적 서열, 또는 표적 서열에 의한 전사 조절하에 있는 유전자의 발현을 억제한다. 다른 실시양태에서, RGN (예를 들어, 뉴클레아제-데드 RGN) 또는 그의 복합체화된 가이드 RNA는 표적 서열과 결합시 표적 서열, 또는 표적 서열에 의한 전사 조절하에 있는 유전자의 발현을 억제하거나 또는 활성화시키는 작용을 하는 발현 조절인자를 추가로 포함한다. 이들 일부 실시양태에서, 발현 조절인자는 후성적인 메카니즘을 통해 표적 서열 또는 조절된 유전자의 발현을 조절한다.
다른 실시양태에서, 뉴클레아제-데드 RGN 또는 닉카제 활성만을 갖는 RGN은, 염기-편집 폴리펩티드, 예를 들어 뉴클레오티드 염기를 탈아미노화시키는 데아미나제 폴리펩티드 또는 그의 활성 변이체 또는 단편과의 융합을 통해 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 변형시켜, 하나의 뉴클레오티드 염기를 또 다른 염기로 전환시키도록, 특정한 게놈 위치에 대해 표적화될 수 있다. 염기-편집 폴리펩티드는 그의 N-말단 또는 C-말단에서 RGN에 융합될 수 있다. 추가로, 염기-편집 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 RGN에 융합될 수 있다. 이러한 조성물 및 방법에 유용한 데아미나제 폴리펩티드의 비제한적인 예에는 [Gaudelli et al. (2017) Nature 551:464-471], 미국 공개 번호 2017/0121693 및 2018/0073012, 및 국제 공개 번호 WO/2018/027078에 기재된 시티딘 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 염기 편집기가 포함되고, 이들 각각은 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
폴리펩티드 또는 도메인에 융합된 RNA-가이드된 뉴클레아제는 링커에 의해 분리되거나 또는 결합될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "링커"는 2개의 분자 또는 모이어티, 예를 들어 뉴클레아제의 결합 도메인 및 절단 도메인을 연결하는 화학적 기 또는 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커는 RNA 가이드된 뉴클레아제의 gRNA 결합 도메인 및 염기-편집 폴리펩티드, 예컨대 데아미나제를 결합시킨다. 일부 실시양태에서, 링커는 뉴클레아제-데드 RGN 및 데아미나제를 결합시킨다. 전형적으로, 링커는 2개의 기, 분자 또는 다른 모이어티 사이에 위치하거나 또는 그에 의해 플랭킹되고, 공유 결합을 통해 서로 연결되어 이들 둘을 연결시킨다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 또는 여러개의 아미노산 (예를 들어, 펩티드 또는 단백질)이다. 일부 실시양태에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학적 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 링커는 5-100개 아미노산 길이, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150 또는 150-200개 아미노산 길이이다. 더 길거나 또는 더 짧은 링커 또한 고려된다.
본원에 개시된 RNA-가이드된 뉴클레아제는 세포의 핵으로 RGN의 수송을 증강시키기 위해 적어도 하나의 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함할 수 있다. 핵 국재화 신호는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 일반적으로 염기성 아미노산의 스트레치를 포함한다 (예를 들어, [Lange et al., J. Biol. Chem. (2007) 282:5101-5105] 참고). 특정한 실시양태에서, RGN은 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 핵 국재화 신호를 포함한다. 핵 국재화 신호(들)은 이종성 NLS일 수 있다. 본원에 개시된 RGN에 대해 유용한 핵 국재화 신호의 비제한적인 예는 SV40 거대 T-항원, 뉴클레오파스민, 및 c-Myc의 핵 국재화 신호이다 (예를 들어, [Ray et al. (2015) Bioconjug Chem 26(6):1004-7] 참고). 특정한 실시양태에서, RGN은 서열식별번호: 10에 제시된 NLS 서열을 포함한다. RGN은 그의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 둘 다에 하나 이상의 NLS 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, RGN은 N-말단 영역에 2개의 NLS 서열 및 C-말단 영역에서 4개의 NLS 서열을 포함할 수 있다.
폴리펩티드를 특정한 세포하 위치(들)에 국재화시키는 관련 기술분야에 공지된 다른 국재화 신호 서열, 예컨대 비제한적으로 색소체 국재화 서열, 미토콘드리아 국재화 서열, 및 색소체 및 미토콘드리아 둘 다를 표적화하는 이중-표적화 신호 서열을 또한 사용하여, RGN을 표적화할 수 있다 (예를 들어, [Nassoury and Morse (2005) Biochim Biophys Acta 1743:5-19; Kunze and Berger (2015) Front Physiol dx.doi.org/10.3389/fphys.2015.00259; Herrmann and Neupert (2003) IUBMB Life 55:219-225; Soll (2002) Curr Opin Plant Biol 5:529-535; Carrie and Small (2013) Biochim Biophys Acta 1833:253-259; Carrie et al. (2009) FEBS J 276:1187-1195; Silva-Filho (2003) Curr Opin Plant Biol 6:589-595; Peeters and Small (2001) Biochim Biophys Acta 1541:54-63; Murcha et al. (2014) J Exp Bot 65:6301-6335; Mackenzie (2005) Trends Cell Biol 15:548-554; Glaser et al. (1998) Plant Mol Biol 38:311-338] 참고).
특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 RNA-가이드된 뉴클레아제는 RGN의 세포 흡수를 용이하게 하는 적어도 하나의 세포-투과 도메인을 포함한다. 세포-투과 도메인은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 일반적으로 양으로 하전된 아미노산 잔기 (즉, 다중양이온성 세포-투과 도메인), 교대하는 극성 아미노산 잔기 및 비-극성 아미노산 잔기 (즉, 양친매성 세포-투과 도메인), 또는 소수성 아미노산 잔기 (즉, 소수성 세포-투과 도메인)의 스트레치를 포함한다 (예를 들어, [Milletti F. (2012) Drug Discov Today 17:850-860] 참고). 세포-투과 도메인의 비제한적인 예는 인간 면역결핍 바이러스 1로부터의 트랜스-활성화 전사 활성화제 (TAT)이다.
핵 국재화 신호, 색소체 국재화 신호, 미토콘드리아 국재화 신호, 이중-표적화 국재화 신호, 및/또는 세포-투과 도메인은 RNA-가이드된 뉴클레아제의 아미노-말단 (N-말단), 카르복실-말단 (C-말단), 또는 내부 위치에 위치할 수 있다.
본원에 개시된 RGN은 이펙터 도메인, 예컨대 절단 도메인, 데아미나제 도메인, 또는 발현 조절인자 도메인에 직접적으로 또는 링커 펩티드를 통해 간접적으로 융합될 수 있다. 이러한 도메인은 RNA-가이드된 뉴클레아제의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 위치할 수 있다. 이들 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 RGN 성분은 뉴클레아제-데드 RGN이다.
일부 실시양태에서, RGN 융합 단백질은 절단 도메인을 포함하며, 이는 폴리뉴클레오티드 (즉, RNA, DNA, 또는 RNA/DNA 혼성체)를 절단할 수 있는 임의의 도메인이고, 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제, 예컨대 유형 IIS 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FokI)가 포함되나 이로 제한되지 않는다 (예를 들어, [Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993] 참고).
다른 실시양태에서, RGN 융합 단백질은 뉴클레오티드 염기를 탈아미노화시켜 하나의 뉴클레오티드 염기를 또 다른 염기로 전환시키는 데아미나제 도메인을 포함하며, 시티딘 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 염기 편집기가 포함되나 이로 제한되지 않는다 (예를 들어, [Gaudelli et al. (2017) Nature 551:464-471], 미국 공개 번호 2017/0121693 및 2018/0073012, 미국 특허 번호 9,840,699, 및 국제 공개 번호 WO/2018/027078 참고). 추가의 실시양태에서, RGN 융합 단백질은 서열식별번호: 374-545 또는 572-584 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 그의 활성 변이체를 포함하는 본 발명의 데아미나제를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 서열식별번호: 374-545 또는 572-584 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 그의 활성 변이체를 포함하는 본 발명의 데아미나제는 임의의 DNA-결합 단백질에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 본 발명의 RGN에 융합된다. 다른 실시양태에서, 데아미나제는 관련 기술분야에 공지된 RGN에 융합된다. 다른 실시양태에서, 데아미나제는 RGN이 아닌 DNA-결합 단백질, 예를 들어 메가뉴클레아제, TALEN, 또는 아연 핑거 뉴클레아제에 융합된다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 임의의 서열식별번호: 374-545 및 572-584의 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성인 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 데아미나제는 임의의 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416, 420, 514 및 572-584의 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성인 아미노산 서열을 갖는다. 이들 실시양태의 일부에서, 변이체 데아미나제 폴리펩티드는 서열식별번호: 572-584 중 어느 하나와 특정한 수준의 서열 동일성을 가지며, 특이적인 아미노산 잔기는 모 서열로부터 변하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 572는 서열식별번호: 572의 위치 102에 상응하는 위치에서 리신, 위치 104에 상응하는 위치에서 티로신, 및 위치 106에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 574는 서열식별번호: 574의 위치 101에 상응하는 위치에서 글루탐산, 위치 103에 상응하는 위치에서 세린, 및 위치 105에 상응하는 위치에서 리신을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 575는 서열식별번호: 575의 위치 101에 상응하는 위치에서 리신, 위치 103에 상응하는 위치에서 류신, 및 위치 105에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 576은 서열식별번호: 576의 위치 105에 상응하는 위치에서 알라닌 및 위치 107에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 577은 서열식별번호: 577의 위치 102에 상응하는 위치에서 글리신, 위치 104에 상응하는 위치에서 세린, 및 위치 106에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 578은 서열식별번호: 578의 위치 105에 상응하는 위치에서 세린 및 위치 107에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 579는 서열식별번호: 579의 위치 102에 상응하는 위치에서 세린, 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 및 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 580은 서열식별번호: 580의 위치 111에 상응하는 위치에서 글리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 581은 서열식별번호: 581의 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신, 및 위치 108에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 582는 서열식별번호: 582의 위치 102에 상응하는 위치에서 아르기닌, 위치 104에 상응하는 위치에서 트립토판, 및 위치 106에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 583은 서열식별번호: 583의 위치 104에 상응하는 위치에서 아르기닌 및 위치 106에 상응하는 위치에서 세린을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 584는 서열식별번호: 584의 위치 110에 상응하는 위치에서 페닐알라닌, 위치 112에 상응하는 위치에서 세린, 및 위치 114에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다.
용어 "데아미나제"는 탈아미노화 반응 (즉, 아미노산 또는 다른 화합물로부터 아미노 기의 제거)을 촉매하는 효소를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 각각 시티딘 또는 데옥시시티딘에서 우라실 또는 데옥시우라실로의 가수분해성 탈아미노화를 촉매하는 시티딘 데아미나제이다. 다른 실시양태에서, 데아미나제는 아데닌 데아미나제이다. 아데닌의 탈아미노화는 이노신을 생성하며, 이는 폴리머라제에 의해 구아닌으로 처리된다. 시티딘 데아미나제 및 아데닌 데아미나제는 DNA 또는 RNA에 대해 작용할 수 있지만, 지금까지 DNA에서 아데닌을 탈아미노화하는 천연 발생 아데닌 데아미나제는 공지되어 있지 않다. 그러나, DNA에 대해 유의한 아데노신 데아미나제 활성을 갖는 천연 발생 단백질인 APG07458 (서열식별번호: 514)이 본원에 개시된다. 본 발명의 데아미나제는 DNA 또는 RNA 분자의 편집을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 데아미나제는 그룹으로서 DNA 분자에서 4가지 모든 전이 (C에서 T로, A에서 G로, T에서 C로, 및 G에서 A로) 및 RNA 분자에서 C에서 U로, A에서 G로, 및 G에서 A로의 전이의 프로그래밍가능한 설치를 가능하게 한다.
본 발명의 데아미나제는 단일-가닥 핵산 분자에 대해 작동한다. 표적 가닥에 대해 닉카제 활성을 갖는 RGN은 표적 가닥을 닉킹시키는 반면에, 상보적인 비-표적 가닥은 데아미나제에 의해 변형된다. 세포성 DNA-복구 기구는 주형으로서 변형된 비-표적 가닥을 사용하여 닉킹된 표적 가닥을 복구시켜, DNA에서 돌연변이를 도입시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 데아미나제에 융합된 뉴클레아제 불활성 RGN 또는 닉카제 RGN은 원하는 서열의 발현을 변경시키기 위해 특정한 게놈 위치에 대해 표적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 불활성 RGN 또는 닉카제 RGN은 융합 단백질의 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드 또는 단백질 또는 단백질 도메인으로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 융합 단백질과 표적 서열의 결합은 뉴클레오티드 염기를 탈아미노화시켜, 한 뉴클레오티드 염기에서 또 다른 것으로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, RGN 융합 단백질의 이펙터 도메인은 발현 조절인자 도메인일 수 있고, 이는 전사를 상향조절하거나 또는 하향조절하는 도메인이다. 발현 조절인자 도메인은 후성적 변형 도메인, 전사 리프레서 도메인 또는 전사 활성화 도메인일 수 있다.
이들 일부 실시양태에서, RGN 융합 단백질의 발현 조절인자는 DNA 서열을 변경시키지 않고 히스톤 구조 및/또는 염색체 구조를 변경시키도록 DNA 또는 히스톤 단백질을 공유적으로 변형시켜, 유전자 발현에서의 변화 (즉, 상향조절 또는 하향조절)를 유도하는 후성적 변형 도메인을 포함한다. 후성적 변형의 비제한적인 예에는 DNA에서 리신 잔기의 아세틸화 또는 메틸화, 아르기닌 메틸화, 세린 및 트레오닌 인산화, 및 히스톤 단백질의 리신 유비퀴틴화 및 SUMO화, 및 시토신 잔기의 메틸화 및 히드록시메틸화가 포함된다. 후성적 변형 도메인의 비제한적인 예에는 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 도메인, 히스톤 데아세틸라제 도메인, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 도메인, 히스톤 데메틸라제 도메인, DNA 메틸트랜스퍼라제 도메인, 및 DNA 데메틸라제 도메인이 포함된다.
다른 실시양태에서, 융합 단백질의 발현 조절인자는 적어도 하나의 유전자의 전사를 감소시키거나 또는 종료시키기 위해, 전사 조절 요소 및/또는 전사 조절 단백질, 예컨대 RNA 폴리머라제 및 전사 인자와 상호작용하는 전사 리프레서 도메인을 포함한다. 전사 리프레서 도메인은 관련 기술분야에 공지되어 있고, Sp1-유사 리프레서, IκB, 및 크루펠(Kruppel) 연관된 박스 (KRAB) 도메인이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
여전히 다른 실시양태에서, 융합 단백질의 발현 조절인자는, 적어도 하나의 유전자의 전사를 증가시키거나 또는 활성화시키기 위해, 전사 조절 요소 및/또는 전사 조절 단백질, 예컨대 RNA 폴리머라제 및 전사 인자와 상호작용하는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 전사 활성화 도메인은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 단순 포진 바이러스 VP16 활성화 도메인 및 NFAT 활성화 도메인이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본원에 개시된 RGN 및 데아미나제 폴리펩티드, 또는 이들의 융합 폴리펩티드는 검출가능한 표지 또는 정제 태그를 포함할 수 있다. 검출가능한 표지 또는 정제 태그는 RNA-가이드된 뉴클레아제의 N-말단, C-말단 또는 내부 위치에 직접적으로 또는 링커 펩티드를 통해 간접적으로 위치할 수 있다. 이들 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 RGN 성분은 뉴클레아제-데드 RGN이다. 다른 실시양태에서, 융합 단백질의 RGN 성분은 닉카제 활성을 갖는 RGN이다.
검출가능한 표지는 가시화될 수 있거나 또는 달리 관찰될 수 있는 분자이다. 검출가능한 표지는 융합 단백질 (예를 들어, 형광 단백질)로서 RGN에 융합될 수 있거나, 또는 시각적으로 또는 다른 수단에 의해 검출될 수 있는 RGN 폴리펩티드에 접합된 소분자일 수 있다. 본원에 개시된 RGN 또는 데아미나제에 융합 단백질로서 융합될 수 있는 검출가능한 표지에는 임의의 검출가능한 단백질 도메인, 예컨대 비제한적으로 특이적인 항체에 의해 검출될 수 있는 형광 단백질 또는 단백질 도메인이 포함된다. 형광 단백질의 비제한적인 예에는 녹색 형광 단백질 (예를 들어, GFP, EGFP, ZsGreen1) 및 황색 형광 단백질 (예를 들어, YFP, EYFP, ZsYellow1)이 포함된다. 소분자 검출가능한 표지의 비제한적인 예에는 방사선 활성 표지, 예컨대 3H 및 35S가 포함된다.
본 발명의 RGN 및 데아미나제 폴리펩티드, 또는 이들의 융합 폴리펩티드는 또한 정제 태그를 포함할 수 있고, 이는 혼합물 (예를 들어, 생물학적 샘플, 배양 배지)로부터 단백질 또는 융합된 단백질을 단리하기 위해 사용될 수 있는 임의의 분자이다. 정제 태그의 비제한적인 예에는 비오틴, myc, 말토스 결합 단백질 (MBP), 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)가 포함된다.
II. 가이드 RNA
본 개시내용은 가이드 RNA, 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 용어 "가이드 RNA"는, 표적 서열과 혼성화하도록 표적 뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 가지며, 연관된 RNA-가이드된 뉴클레아제와 표적 뉴클레오티드 서열의 서열-특이적인 결합을 지시하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 따라서, RGN의 각각의 가이드 RNA는 RGN에 결합하여 RGN이 특정한 표적 뉴클레오티드 서열과 결합하도록 가이드하는 하나 이상의 RNA 분자 (일반적으로, 1개 또는 2개)이며, 이들 예에서 RGN은 닉카제 또는 뉴클레아제 활성을 갖고, 또한 표적 뉴클레오티드 서열을 절단한다. 일반적으로, 가이드 RNA는 CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 포함한다. crRNA 및 tracrRNA 둘 다를 포함하는 본래의 가이드 RNA는 일반적으로 crRNA의 반복 서열 및 tracrRNA의 안티-반복 서열을 통해 서로 혼성화하는 2가지 별도의 RNA 분자를 포함한다.
CRISPR 어레이 내의 본래의 직접적인 반복 서열은 일반적으로 28 내지 37개 염기쌍의 길이 범위를 갖지만, 상기 길이는 약 23 bp 내지 약 55 bp로 달라질 수 있다. CRISPR 어레이 내의 스페이서 서열은 일반적으로 약 32 내지 약 38 bp의 길이 범위를 갖지만, 상기 길이는 약 21 bp 내지 약 72 bp일 수 있다. 각각의 CRISPR 어레이는 일반적으로 CRISPR 반복-스페이서 서열의 50개 미만의 단위를 포함한다. CRISPR은 일차 CRISPR 전사체로 명명되는 긴 전사체의 일부로서 전사되며, 이는 CRISPR 어레이의 대부분을 포함한다. 일차 CRISPR 전사체는 Cas 단백질에 의해 절단되어, crRNA를 생성하거나 또는 일부 경우에는 추가의 Cas 단백질에 의해 성숙 crRNA로 추가로 가공되는 프리-crRNA를 생성한다. 성숙 crRNA는 스페이서 서열 및 CRISPR 반복 서열을 포함한다. 프리-crRNA가 성숙 (또는 가공된) crRNA로 가공되는 일부 실시양태에서, 성숙은 약 1 내지 약 6개 또는 그 초과의 5', 3', 또는 5' 및 3' 뉴클레오티드의 제거를 수반한다. 특정한 관심 표적 뉴클레오티드 서열의 게놈 편집 또는 표적화의 목적을 위해, 프리-crRNA 분자의 성숙 동안에 제거된 이들 뉴클레오티드가 반드시 가이드 RNA를 생성하거나 또는 설계할 필요는 없다.
CRISPR RNA (crRNA)는 스페이서 서열 및 CRISPR 반복 서열을 포함한다. "스페이서 서열"은 관심 표적 뉴클레오티드 서열과 직접적으로 혼성화하는 뉴클레오티드 서열이다. 스페이서 서열은 관심 표적 서열에 의해 완전히 또는 부분적으로 상보성이도록 조작된다. 다양한 실시양태에서, 스페이서 서열은 약 8개 뉴클레오티드 내지 약 30개 뉴클레오티드, 또는 그 초과를 포함할 수 있다. 예를 들어, 스페이서 서열은 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 약 10 내지 약 26개 뉴클레오티드 길이, 또는 약 12 내지 약 30개 뉴클레오티드 길이이다. 특정한 실시양태에서, 스페이서 서열은 약 30개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 적합한 정렬 알고리즘을 이용하여 최적으로 정렬하였을 때 스페이서 서열과 그의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 초과이거나, 또는 대략 상기 값 초과이다. 특정한 실시양태에서, 스페이서 서열은 이차 구조를 함유하지 않으며, 이는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘, 예컨대 비제한적으로 mFold (예를 들어, [Zuker and Stiegler (1981) Nucleic Acids Res. 9:133-148] 참고) 및 RNAfold (예를 들어, [Gruber et al. (2008) Cell 106(1):23-24] 참고)를 사용하여 예측될 수 있다.
RGN 단백질은 절단 효율에 영향을 미치는 gRNA에서의 스페이서 서열과 그의 표적 서열 사이의 미스매치에 대해 다양한 민감성을 가질 수 있다.
CRISPR RNA 반복 서열은 tracrRNA와 혼성화하도록 충분한 상보성을 갖는 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다양한 실시양태에서, CRISPR RNA 반복 서열은 약 8개 뉴클레오티드 내지 약 30개 뉴클레오티드, 또는 그 초과를 포함할 수 있다. 예를 들어, CRISPR 반복 서열은 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR 반복 서열은 약 21개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 적합한 정렬 알고리즘을 이용하여 최적으로 정렬될 때 CRISPR 반복 서열과 그의 상응하는 tracrRNA 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 초과, 또는 대략 상기 값 초과이다. 특정한 실시양태에서, CRISPR 반복 서열은, 가이드 RNA 내에 포함될 때 본원에 제공된 연관된 RNA-가이드된 뉴클레아제와 관심 표적 서열의 서열-특이적인 결합을 지시할 수 있는 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 야생형 서열의 활성 CRISPR 반복 서열 변이체는 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 야생형 서열의 활성 CRISPR 반복 서열 단편은 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 또는 51에 제시된 뉴클레오티드 서열의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
특정한 실시양태에서, crRNA는 천연 발생이 아니다. 이들 일부 실시양태에서, 특이적인 CRISPR 반복 서열은 본래 조작된 스페이서 서열에 연결되지 않고, CRISPR 반복 서열은 스페이서 서열에 대해 이종성인 것으로 고려된다. 특정한 실시양태에서, 스페이서 서열은 천연 발생이 아닌 조작된 서열이다.
트랜스-활성화 CRISPR RNA 또는 tracrRNA 분자는 crRNA의 CRISPR 반복 서열과 혼성화하도록 충분한 상보성을 갖는 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 본원에서 안티-반복 영역으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 분자는 이차 구조 (예를 들어, 스템-루프)를 갖는 영역을 추가로 포함하거나, 또는 그의 상응하는 crRNA와 혼성화시 이차 구조를 형성한다. 특정한 실시양태에서, CRISPR 반복 서열과 완전히 또는 부분적으로 상보성인 tracrRNA의 영역은 분자의 5' 말단에 있고, tracrRNA의 3' 말단은 이차 구조를 포함한다. 유형 II RGN의 경우, 이러한 이차 구조 영역은 일반적으로 안티-반복 서열과 인접하여 발견되는 몇몇 헤어핀 구조, 예컨대 넥서스 헤어핀을 포함한다. 넥서스 헤어핀은 종종 tracrRNA의 넥서스 헤어핀에서 발견되는 모티프 UNANNC (서열식별번호: 13; APG00969의 경우), ANGNNU (서열식별번호: 23; APG03128의 경우), 또는 UNANNA (서열식별번호: 42; APG00771의 경우)와 함께 헤어핀 스템의 염기에서 보존된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 종종 tracrRNA의 3' 말단에 구조 및 개수가 다양할 수 있지만 종종 GC-풍부 Rho-비의존성 전사 종결인자 헤어핀에 이어서 3' 말단에 U의 문자열을 포함하는 말단 헤어핀이 있다. 예를 들어, [Briner et al. (2014) Molecular Cell 56:333-339, Briner and Barrangou (2016) Cold Spring Harb Protoc; doi: 10.1101/pdb.top090902], 및 미국 공개 번호 2017/0275648을 참고하며, 이들 각각은 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
다양한 실시양태에서, CRISPR 반복 서열에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보성인 tracrRNA의 안티-반복 영역은 약 8개 뉴클레오티드 내지 약 30개 뉴클레오티드, 또는 그 초과를 포함한다. 예를 들어, tracrRNA 안티-반복 서열과 CRISPR 반복 서열 사이의 염기쌍 영역은 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정한 실시양태에서, CRISPR 반복 서열에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보성인 tracrRNA의 안티-반복 영역은 약 20개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 적합한 정렬 알고리즘을 이용하여 최적으로 정렬될 때 CRISPR 반복 서열과 그의 상응하는 tracrRNA 안티-반복 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 초과, 또는 대략 상기 값 초과이다.
다양한 실시양태에서, 전체 tracrRNA는 약 60개 뉴클레오티드 내지 약 140개 초과의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, tracrRNA는 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 105, 약 110, 약 115, 약 120, 약 125, 약 130, 약 135, 약 140개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정한 실시양태에서, tracrRNA는 약 80 내지 약 90개 뉴클레오티드 길이, 예컨대 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 및 약 90개 뉴클레오티드 길이이다. 특정한 실시양태에서, tracrRNA는 약 85개 뉴클레오티드 길이이다.
특정한 실시양태에서, tracrRNA는, 가이드 RNA 내에 포함될 때 본원에 제공된 연관된 RNA-가이드된 뉴클레아제와 관심 표적 서열의 서열-특이적인 결합을 지시할 수 있는 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 야생형 서열의 활성 tracrRNA 서열 변이체는 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 야생형 서열의 활성 tracrRNA 서열 단편은 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45 또는 52에 제시된 뉴클레오티드 서열의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80개 또는 그 초과의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
2개의 폴리뉴클레오티드 서열은 2개의 서열이 엄격도 조건하에 서로 혼성화할 때 실질적으로 상보성인 것으로 고려된다. 마찬가지로, RGN은 RGN에 결합된 가이드 RNA가 엄격도 조건하에 표적 서열에 결합하는 경우 서열-특이적인 방식 내에서 특정한 표적 서열에 결합하는 것으로 고려된다. "엄격도 조건" 또는 "엄격도 혼성화 조건"은 2개의 폴리뉴클레오티드 서열이 다른 서열에 비해 검출가능하게 더 큰 정도로 (예를 들어, 백그라운드에 비해 적어도 2배) 서로 혼성화하도록 하는 의도된 조건이다. 엄격도 조건은 서열-의존성이고, 상이한 환경에서 상이할 것이다. 전형적으로, 엄격도 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.5 M 미만의 Na 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 다른 염)이고 온도가 짧은 서열 (예를 들어, 10 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우 적어도 약 30℃ 및 긴 서열 (예를 들어, 50개 초과의 뉴클레오티드)의 경우 적어도 약 60℃인 조건일 것이다. 엄격도 조건은 또한 탈안정화제, 예컨대 포름아미드의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 저엄격도 조건에는 37℃에서 30 내지 35% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS (나트륨 도데실 술페이트)의 완충제 용액에 의한 혼성화, 및 50 내지 55℃에서 1X 내지 2X SSC (20X SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M 시트르산삼나트륨) 중에서 세척이 포함된다. 예시적인 중간 엄격도 조건에는 37℃에서 40 내지 45% 포름아미드, 1.0 M NaCl, 1% SDS 중에서 혼성화, 및 55 내지 60℃에서 0.5X 내지 1X SSC 중에서 세척이 포함된다. 예시적인 고엄격도 조건에는 37℃에서 50% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS 중에서 혼성화, 및 60 내지 65℃에서 0.1X SSC 중에서 세척이 포함된다. 임의적으로, 세척 완충제는 약 0.1% 내지 약 1% SDS를 포함할 수 있다. 혼성화 지속시간은 일반적으로 약 24 시간 미만, 보통 약 4 내지 약 12 시간이다. 세척 지속시간은 적어도 평형에 도달하기에 충분한 시간일 것이다.
Tm은 (정의된 이온 강도 및 pH하에) 상보성 표적 서열의 50%가 매칭된 서열과 완벽하게 혼성화하는 온도이다. DNA-DNA 혼성체의 경우, Tm은 [Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284]의 방정식으로부터 계산될 수 있으며: Tm = 81.5℃ + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; 여기서 M은 일가 양이온의 몰 농도이고, %GC는 DNA에서 구아노신 및 시토신 뉴클레오티드의 백분율이고, % form은 혼성화 용액 중에서 포름아미드의 백분율이고, L은 염기쌍에서 혼성체의 길이이다. 일반적으로, 엄격도 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특이적인 서열 및 그의 상보체에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 낮도록 선택된다. 그러나, 매우 엄격도 조건은 열 융점 (Tm)보다 1, 2, 3 또는 4℃ 낮은 온도에서 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있고; 중간 엄격도 조건은 열 융점 (Tm)보다 6, 7, 8, 9 또는 10℃ 낮은 온도에서 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있고; 저엄격도 조건은 열 융점 (Tm)보다 11, 12, 13, 14, 15 또는 20℃ 낮은 온도에서 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있다. 상기 방정식, 혼성화 및 세척 조성물, 및 원하는 Tm을 이용하여, 통상의 기술자는 혼성화 및/또는 세척 용액의 엄격도에서의 변동이 본질적으로 기재되어 있음을 이해할 것이다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 안내는 [Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); 및 Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)]에서 확인한다. [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)]을 참고한다.
가이드 RNA는 단일 가이드 RNA 또는 이중-가이드 RNA 시스템일 수 있다. 단일 가이드 RNA는 RNA의 단일 분자 상에 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 반면에, 이중-가이드 RNA 시스템은 2가지 별개의 RNA 분자 상에 존재하는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하며, 이들은 crRNA의 CRISPR 반복 서열의 적어도 일부분, 및 crRNA의 CRISPR 반복 서열에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보성일 수 있는 tracrRNA의 적어도 일부분을 통해 서로 혼성화된다. 가이드 RNA가 단일 가이드 RNA인 이들 일부 실시양태에서, crRNA 및 tracrRNA는 링커 뉴클레오티드 서열에 의해 분리된다. 일반적으로, 링커 뉴클레오티드 서열은 링커 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 내에서 또는 이를 포함하는 이차 구조의 형성을 피하기 위해 상보성 염기를 포함하지 않는 것이다. 일부 실시양태에서, crRNA와 tracrRNA 사이의 링커 뉴클레오티드 서열은 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 특정한 실시양태에서, 단일 가이드 RNA의 링커 뉴클레오티드 서열은 적어도 4개 뉴클레오티드 길이이다. 특정한 실시양태에서, 링커 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 8 또는 31에 제시된 뉴클레오티드 서열이다. 다른 실시양태에서, 링커 뉴클레오티드 서열은 적어도 6개 뉴클레오티드 길이이다.
단일 가이드 RNA 또는 이중-가이드 RNA는 화학적으로 또는 시험관내 전사를 통해 합성될 수 있다. RGN과 가이드 RNA 사이의 서열-특이적인 결합을 결정하기 위한 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 발현된 RGN과 가이드 RNA 사이의 시험관내 결합 검정이 포함되나 이로 제한되지 않으며, 이는 검출가능한 표지 (예를 들어, 비오틴)에 의해 태그 부착될 수 있고, 검출가능한 표지를 통해 (예를 들어, 스트렙타비딘 비드에 의해) 가이드 RNA:RGN 복합체를 포획하는 풀다운(pull-down) 검출 검정에서 이용될 수 있다. 가이드 RNA에 대해 관련이 없는 서열 또는 구조를 갖는 대조군 가이드 RNA는 RGN과 RNA의 비-특이적인 결합에 대한 음성 대조군으로서 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 가이드 RNA는 서열식별번호: 4, 19, 27, 38, 46, 53, 64, 65 또는 66이고, 스페이서 서열은 임의의 서열일 수 있고 폴리-N 서열로 표시된다.
특정한 실시양태에서, 가이드 RNA는 RNA 분자로서 표적 세포, 소기관 또는 배아에 도입될 수 있다. 가이드 RNA는 시험관내에서 전사될 수 있거나 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 다른 실시양태에서, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 세포, 소기관 또는 배아에 도입된다. 이들 일부 실시양태에서, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터 (예를 들어, RNA 폴리머라제 III 프로모터)에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 본래의 프로모터일 수 있거나 또는 가이드 RNA-코딩 뉴클레오티드 서열에 대해 이종성일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 가이드 RNA는 본원에 기재된 바와 같이 리보핵단백질 복합체로서 표적 세포, 소기관 또는 배아에 도입될 수 있으며, 가이드 RNA는 RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드에 결합된다.
가이드 RNA는 가이드 RNA와 표적 뉴클레오티드 서열의 혼성화를 통해 연관된 RNA-가이드된 뉴클레아제를 특정한 관심 표적 뉴클레오티드 서열로 지시한다. 표적 뉴클레오티드 서열은 DNA, RNA, 또는 이들 둘의 조합물을 포함할 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA (즉, 염색체 DNA), 플라스미드 DNA, 또는 RNA 분자 (예를 들어, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 전달 RNA, 마이크로 RNA, 소형 간섭 RNA)일 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열은 시험관내에서 또는 세포에서 RNA-가이드된 뉴클레아제에 의해 결합될 수 있다 (그리고 일부 실시양태에서 절단될 수 있다). RGN에 의해 표적화된 염색체 서열은 핵, 색소체 또는 미토콘드리아 염색체 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 표적 게놈에서 고유하다.
표적 뉴클레오티드 서열은 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM)에 인접해 있다. 프로토스페이서 인접한 모티프는 일반적으로 표적 뉴클레오티드 서열로부터 약 1 내지 약 10개 뉴클레오티드 이내에, 예컨대 표적 뉴클레오티드 서열로부터 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9 또는 약 10개 뉴클레오티드 이내에 있다. PAM은 표적 서열의 5' 또는 3'일 수 있다. 일부 실시양태에서, PAM은 본원에 개시된 RGN에 대한 표적 서열의 3'이다. 일반적으로, PAM은 약 3-4개 뉴클레오티드의 컨센서스 서열이지만, 특정한 실시양태에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 RGN에 의해 인식되는 PAM 서열은 서열식별번호: 7, 22, 30, 41 또는 49에 제시된 컨센서스 서열을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50을 갖는 RNA-가이드된 뉴클레아제, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편은 각각 서열식별번호: 7, 22, 30, 41 또는 49에 제시된 PAM 서열에 인접한 표적 뉴클레오티드 서열에 결합한다. 이들 일부 실시양태에서, RGN은 각각 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63에 제시된 CRISPR 반복 서열을 포함하는 가이드 서열, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편, 및 각각 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62에 제시된 tracrRNA 서열, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편에 결합한다. RGN 시스템은 본 명세서의 실시예 1 및 표 1에서 추가로 기재된다.
주어진 뉴클레아제 효소에 대한 PAM 서열 특이성이 효소 농도에 의해 영향을 받는다는 것은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 (예를 들어, [Karvelis et al. (2015) Genome Biol 16:253] 참고), 이는 RGN을 발현하기 위해 사용된 프로모터, 또는 세포, 소기관 또는 배아에 전달된 리보핵단백질 복합체의 양을 변경시킴으로써 변형될 수 있다.
그의 상응하는 PAM 서열을 인식할 때, RGN은 특이적인 절단 부위에서 표적 뉴클레오티드 서열을 절단할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 절단 부위는 표적 뉴클레오티드 서열 내의 2개의 특정한 뉴클레오티드로 구성되며, 이들 사이에서 뉴클레오티드 서열이 RGN에 의해 절단된다. 절단 부위는 5' 또는 3' 방향으로 PAM으로부터 1번째 및 2번째, 2번째 및 3번째, 3번째 및 4번째, 4번째 및 5번째, 5번째 및 6번째, 7번째 및 8번째, 또는 8번째 및 9번째 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단 부위는 5' 또는 3' 방향으로 PAM으로부터 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드에 걸쳐 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단 부위는 PAM으로부터 4개 뉴클레오티드 떨어져 있다. 다른 실시양태에서, 절단 부위는 PAM으로부터 적어도 15개 뉴클레오티드 떨어져 있다. RGN이 표적 뉴클레오티드 서열을 절단하여 엇갈린 말단을 생성할 수 있기 때문에, 일부 실시양태에서, 절단 부위는 폴리뉴클레오티드의 양성 (+) 가닥 상의 PAM으로부터 2개 뉴클레오티드의 거리 및 폴리뉴클레오티드의 음성 (-) 가닥 상의 PAM으로부터 2개 뉴클레오티드의 거리를 기반으로 하여 정의된다.
III. 융합 단백질
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "링커"는 2개의 분자 또는 모이어티, 예를 들어 뉴클레아제의 결합 도메인 및 절단 도메인을 연결하는 화학적 기 또는 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커는 RNA 가이드된 뉴클레아제 및 데아미나제를 결합시킨다. 일부 실시양태에서, 링커는 dCas9 및 데아미나제를 결합시킨다. 전형적으로, 링커는 2개의 기, 분자 또는 다른 모이어티 사이에 위치하거나 또는 그에 의해 플랭킹되고, 공유 결합을 통해 서로 연결되어 이들 둘을 연결시킨다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 또는 여러 개의 아미노산 (예를 들어, 펩티드 또는 단백질)이다. 일부 실시양태에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학적 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 링커는 5-100개 아미노산 길이, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150 또는 150-200개 아미노산 길이이다. 더 길거나 또는 더 짧은 링커 또한 고려된다.
본 개시내용의 일부 측면은 DNA-결합 폴리펩티드 및 데아미나제 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. DNA-결합 폴리펩티드는 DNA에 결합하는 임의의 단백질 또는 단백질 도메인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 DNA-결합 폴리펩티드는 메가뉴클레아제, 아연 핑거 융합 단백질, 또는 TALEN이다. 본 개시내용의 일부 측면은 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드 및 데아미나제 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드는 RNA-가이드된 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 본 발명의 RGN이다. 일부 실시양태에서, RGN은 본 발명의 RGN이 아니다. 추가의 실시양태에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 CRISPR-Cas 단백질이다. 여전히 추가의 실시양태에서, CRISPR-Cas 단백질은 유형 II CRISPR-Cas 단백질이다. 다른 실시양태에서, CRISPR-Cas 단백질은 유형 V CRISPR-Cas 단백질이다. 다른 실시양태에서, CRISPR-Cas 단백질은 유형 VI CRISPR-Cas 단백질이다. 일부 실시양태에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 가이드 RNA에 결합하는 Cas9 도메인이며, 이는 가닥 혼성화를 통해 표적 핵산 서열과 결합한다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 폴리펩티드는 예를 들어 시티딘 또는 아데닌과 같은 핵염기를 탈아미노화시킬 수 있는 데아미나제 도메인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 폴리펩티드는 임의의 서열식별번호: 374-545 또는 572-584로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그의 변이체를 포함한다. 이들 실시양태의 일부에서, 데아미나제 폴리펩티드는 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416, 420, 514 및 572-584 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그의 변이체를 포함한다. 데아미나제에 의한 핵염기의 탈아미노화는 각각의 잔기에서 점 돌연변이를 초래하여, DNA 분자를 변형시킨다. 이러한 변형 작용은 본원에서 핵산 편집, 또는 염기 편집으로도 지칭된다. 따라서, Cas9 변이체 또는 도메인 및 데아미나제 도메인을 포함하는 융합 단백질은 핵산 서열의 표적화된 편집을 위해 사용될 수 있다.
이러한 융합 단백질은 예를 들어 돌연변이성 세포의 생성을 위해 시험관내에서 DNA의 표적화된 편집에 유용하다. 이들 돌연변이성 세포는 식물 또는 동물에 있을 수 있다. 이러한 융합 단백질은 또한 예를 들어 생체 외에서 포유동물 세포에서, 예를 들어 동일한 또는 또 다른 대상체에게 후속적으로 재도입되는 대상체로부터 수득된 세포에서 유전적 결함의 수정을 위해 표적화된 돌연변이를 도입하는데; 및 예를 들어 포유동물 대상체에서 질환-연관된 유전자에서 유전적 결함의 수정 또는 불활성화 돌연변이의 도입을 위해 표적화된 돌연변이를 도입하는데 유용할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 또한 식물 세포에서 표적화된 돌연변이를 도입하는데, 예를 들어 유익한 또는 농경학적으로 가치있는 형질 또는 대립유전자를 도입하는데 유용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "우라실 글리코실라제 억제제" 또는 "UGI"는 우라실-DNA 글리코실라제 염기-절제 복구 효소를 억제할 수 있는 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 데아미나제에 융합된 뉴클레아제-불활성 RGN, 예컨대 Cas9 (dCas9)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 데아미나제에 융합된 닉카제 RGN, 예컨대 Cas9 (nCas9)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 데아미나제에 융합되고 추가로 UGI 도메인에 융합된 뉴클레아제 불활성 RGN 또는 닉카제 RGN을 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질의 닉카제 RGN은 RGN이 핵산 듀플렉스의 표적 가닥 (PAM을 포함하는 가닥)만을 절단할 수 있게 하는 D10A 돌연변이 또는 상동적으로 등가의 돌연변이 (서열식별번호: 569; 또는 유사하게 서열식별번호: 553)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 뉴클레아제-불활성 ("데드") RGN은 RGN이 DNA 표적을 절단할 수 없게 만드는 D10A 돌연변이 및 H840A 돌연변이 또는 상동적으로 등가의 돌연변이 (서열식별번호: 568; 또는 유사하게 서열식별번호: 547)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 닉카제 RGN은 RGN이 핵산 듀플렉스의 비-표적 가닥 (PAM을 포함하지 않는 가닥)만을 절단할 수 있게 하는 H840A 돌연변이를 포함한다. H840A 돌연변이 또는 등가의 돌연변이를 포함하는 닉카제 RGN은 불활성화된 HNH 도메인을 갖는다. D10A 돌연변이 또는 등가의 돌연변이를 포함하는 닉카제 RGN은 불활성화된 RuvC 도메인을 갖는다. 데아미나제는 비-표적 가닥에 대해 작용한다. D10A 돌연변이 또는 등가의 돌연변이를 포함하는 닉카제는 불활성 RuvC 뉴클레아제 도메인을 갖고, DNA의 비-표적화된 가닥, 즉, 염기 편집을 원하는 가닥을 절단할 수 없다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 융합 단백질의 RGN은 닉카제 활성을 가지며, 닉카제는 RGN의 단편 또는 RGN의 닉카제 변이체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 융합 단백질의 RGN 도메인은 적어도 부분적으로 불활성화된 뉴클레아제 활성을 가지며, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드로 지칭될 수 있다. 본원에 기재된 상기 융합 단백질의 사용 방법 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, RGN은 Cas9 단백질이다. 비제한적인 예시적인 뉴클레아제-불활성 및 닉카제 Cas9 도메인이 본원에서 제공된다. 한 예시적인 적합한 뉴클레아제-불활성 RGN 도메인은 D10A/H840A Cas9 도메인 돌연변이체이다 (예를 들어, [Qi et al., Cell. 2013; 152(5): 1173-83]을 참고하며, 그의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨). 추가의 적합한 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인은 본 개시내용을 기반으로 하여 관련 기술분야의 기술자에게 자명할 것이다. 이러한 추가의 예시적인 적합한 뉴클레아제 불활성 Cas9 도메인에는 D10A, D10A/D839A/H840A, 및 D10A/D839A/H840A/N863A 돌연변이성 도메인이 포함되나 이로 제한되지 않는다 (예를 들어, [Mali et al., Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838]을 참고하며, 그의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨). 추가로, 다른 공지된 RGN의 적합한 뉴클레아제-불활성 RGN 도메인이 결정될 수 있다 (예를 들어, 서열식별번호: 547, RGN APG08290.1의 뉴클레아제-불활성 변이체; 미국 특허 출원 번호 16/432,321을 참고하며, 그의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨).
본 개시내용의 일부 측면은 (i) 뉴클레아제-불활성 또는 닉카제 RGN 또는 도메인; 및 (ii) 데아미나제 효소 또는 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 효소 또는 도메인은 DNA-편집 효소 또는 도메인이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 효소는 데아미나제 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 효소 또는 도메인은 데아미나제 도메인이거나 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 시티딘 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 아포지단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 패밀리 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC1 패밀리 데아미나제이다. 다른 실시양태에서, 데아미나제는 APOBEC3 패밀리 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 활성화-유도된 시티딘 데아미나제 (AID)이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 ACF1/ASE 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 아데노신 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 ADAT 패밀리 데아미나제이다. 일부 핵산 데아미나제 효소 및 도메인은 본원에서 상세하게 기재된다 (표 17 참고). 추가의 적합한 데아미나제 효소 또는 도메인은 본 개시내용을 기반으로 하여 기술자에게 자명할 것이다. 이들 실시양태의 일부에서, 데아미나제 폴리펩티드는 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416, 420, 514 및 572-584 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그의 변이체를 포함한다.
본 개시내용은 다양한 구성의 융합 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 효소 또는 도메인은 RGN 도메인의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 효소 또는 도메인은 RGN 도메인의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 (GGGGS)n (서열식별번호: 585), (G)n (서열식별번호: 586), (EAAAK)n (서열식별번호: 587), 또는 (XP)n (서열식별번호: 588) 모티프, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하고, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 30의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30이거나, 또는 1개 초과의 링커 또는 1개 초과의 링커 모티프가 존재하는 경우, 이들의 임의의 조합이다. 추가의 적합한 링커 모티프 및 링커 구성은 관련 기술분야의 기술자에게 자명할 것이다. 일부 실시양태에서, 적합한 링커 모티프 및 구성에는 [Chen et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality (Adv Drug Deliv Rev. 2013; 65(10):1357-69]에 기재된 것들이 포함되며, 그의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 추가의 적합한 링커 서열은 본 개시내용을 기반으로 하여 관련 기술분야의 기술자에게 자명할 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 예시적인 융합 단백질의 일반적인 아키텍쳐는 하기 구조를 포함하며: [NH2]-[데아미나제 효소 또는 도메인]-[RGN 단백질 또는 도메인][COOH] 또는 [NH2]-[RGN 단백질 또는 도메인]-[데아미나제 효소 또는 도메인][COOH], 여기서 NH2는 융합 단백질의 N-말단이고, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다. 추가의 특징, 예를 들어 NLS와 융합 단백질의 나머지 사이에 및/또는 데아미나제 효소 또는 도메인과 RGN 단백질 또는 도메인 사이에 하나 이상의 링커 서열이 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 예시적인 특징은 국재화 서열, 예컨대 핵 국재화 서열, 세포질 국재화 서열, 수출 서열, 예컨대 핵 수출 서열, 또는 다른 국재화 서열, 뿐만 아니라 융합 단백질의 가용화, 정제 또는 검출에 유용한 서열 태그이다. 본원에 제공된 적합한 국재화 신호 서열 및 단백질 태그 서열에는 비오틴 카르복실라제 운반 단백질 (BCCP) 태그, myc-태그, 칼모듈린-태그, FLAG-태그, 헤마글루티닌 (HA)-태그, 폴리히스티딘 태그 (히스티딘 태그 또는 His-태그로도 지칭됨), 말토스 결합 단백질 (MBP)-태그, nus-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)-태그, 녹색 형광 단백질 (GFP)-태그, 티오레독신-태그, S-태그, 소프태그 (예를 들어, 소프태그 1, 소프태그 3), 스트렙태그, 비오틴 리가제 태그, FlAsH 태그, V5 태그, 및 SBP-태그가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 추가의 적합한 서열은 관련 기술분야의 기술자에게 자명할 것이다.
일부 실시양태에서, 데아미나제 효소, 또는 데아미나제 효소 또는 도메인을 갖는 예시적인 융합 단백질의 일반적인 아키텍쳐는 하기 구조를 포함하며: [NH2]-[NLS]-[RGN 단백질 또는 도메인]-[데아미나제]-[COOH], [NH2]-[NLS]-[데아미나제]-[RGN 단백질 또는 도메인]-[COOH], [NH2]-[RGN 단백질 또는 도메인]-[데아미나제]-[COOH], 또는 [NH2]-[데아미나제]-[RGN 단백질 또는 도메인]-[COOH], 여기서 NLS는 핵 국재화 신호이고, NH2는 융합 단백질의 N-말단이고, COOH는 융합 단백질의 C-말단이다. 일부 실시양태에서, 링커는 RGN 단백질 또는 도메인과 데아미나제 사이에 삽입된다. 일부 실시양태에서, NLS는 데아미나제 및/또는 RGN 단백질 또는 도메인의 C-말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, NLS는 데아미나제와 RGN 단백질 또는 도메인 사이에 위치한다. 추가의 특징, 예컨대 서열 태그 또한 존재할 수 있다. 본원에서 "RGN 단백질 또는 도메인"은 임의의 RNA-가이드된 뉴클레아제, 예컨대 CRISPR-Cas 단백질 및 그의 변이체 및 돌연변이체를 나타내며, 이는 본 발명의 융합 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있다. RGN 단백질은 뉴클레아제-불활성 RGN 또는 CRISPR-Cas, 예컨대 예를 들어 dCas9 (서열식별번호: 568) 또는 대안적으로 서열식별번호: 547, 또는 RGN 또는 Cas9 닉카제, 예를 들어 서열식별번호: 569 (또는 서열식별번호: 553)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드 및 데아미나제를 포함하고, 데아미나제는 임의의 서열식별번호: 374-545 또는 572-584, 또는 그의 활성 변이체와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 이들 실시양태의 일부에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416, 420, 514 및 572-584 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 데아미나제 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 융합 단백질의 예는 본원에서 실시예 부분에 기재된다.
데아미나제 효소 및 도메인의 한 예시적인 적합한 유형은 예를 들어 APOBEC 패밀리의 시토신 데아미나제이다. 시토신 데아미나제 효소의 아포지단백질 B mRNA 편집 복합체 (APOBEC) 패밀리는 제어되고 유익한 방식으로 돌연변이 유발을 개시하기 위해 작용하는 11개의 단백질을 포함한다 (Conticello et al., 2008. Genome Biology, 9(6): 229). 한 패밀리 구성원인 활성화-유도된 시티딘 데아미나제 (AID)는 전사 의존적인 가닥-편향된 방식으로 ssDNA에서 시토신을 우라실로 전환시킴으로써 항체의 성숙을 담당한다 (Reynaud et al., 2003. Nature Immunology, 4(7): 631-638). 아포지단백질 B 편집 복합체 3 (APOBEC3) 효소는 역전사된 바이러스 ssDNA에서 시토신의 탈아미노화를 통해 특정한 HIV-1 균주에 대한 인간 세포의 보호를 제공한다 (Bhagwat et al., 2004, 3(1): 85-9). 이들 단백질은 모두 촉매적 활성을 위해 Zn2+-배위 모티프 (HisX- Glu-X23-26-Pro-Cys-X2-4-Cys; 서열식별번호: 589) 및 결합된 물 분자를 필요로 한다. Glu 잔기는 탈아미노화 반응에서 친핵성 공격을 위해 물 분자를 수산화아연으로 활성화시키는 역할을 한다. 각각의 패밀리 구성원은 hAID의 경우 WRC (W는 A 또는 T이고, R은 A 또는 G임)에서부터 hAPOBEC3F의 경우 TTC에 이르는 그 자신의 특정한 "핫스팟"에서 우세하게 탈아미노화한다 (Navaratnam et al., 2006. Intl J Hematol 83(3): 195-200). APOBEC3G의 촉매적 도메인의 최근의 결정 구조는 6개의 α-나선에 의해 플랭킹된 5-가닥 β-시트 코어로 구성된 이차 구조를 밝혀 내었으며, 이는 전체 패밀리에 걸쳐 보존되는 것으로 믿어진다 (Holden et al., 2008. Nature 456(7218): 121-124). 활성 중심 루프는 ssDNA 결합 및 "핫스팟" 동일성 결정 둘 다를 담당하는 것으로 확인되었다 (Chelico et al., 2009. J Biol Chem 284(41): 27761-27765). 이들 효소의 과발현은 게놈 불안정성 및 암과 관련이 있으며, 그에 따라 서열-특이적인 표적화의 중요성을 강조한다 (Pham et al., 2005. Biochem 44(8): 2703-2715).
데아미나제 효소 및 도메인의 또 다른 예시적인 적합한 유형은 아데노신 데아미나제이다. ADAT 패밀리 아데노신 데아미나제는 RGN 또는 RGN의 단편 또는 도메인 또는 그의 변이체, 예를 들어 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인에 융합될 수 있으며, 그에 따라 Cas9-ADAT 융합 단백질을 생성한다. 본 개시내용은 RGN 또는 RGN의 단편 또는 도메인 또는 그의 변이체와 데아미나제 효소, 예를 들어 시토신 데아미나제, 예컨대 APOBEC 효소, 또는 아데노신 데아미나제 효소, 예컨대 ADAT 효소 사이의 체계적인 일련의 융합을 포함하며, 이로써 RGN-데아미나제 융합체는 게놈 DNA에서 특이적인 부위에 대한 데아미나제의 효소 활성을 지시한다. 인식 작용제로서 RGN 사용의 이점은 두 가지이다: (1) 융합 단백질의 서열 특이성은 sgRNA 서열을 간단히 변화시킴으로써 용이하게 변경될 수 있고, (2) RGN, 예컨대 Cas9는 dsDNA를 변성시킴으로써 그의 표적 서열에 결합하여, 단일-가닥인 DNA의 스트레치, 따라서 데아미나제의 생존가능한 기질을 생성한다. 성공적인 융합 단백질은 인간 및 마우스 데아미나제 도메인, 예를 들어 AID 도메인에 의해 생성되었다 (WO 2010132092, 본원에 참고로 포함됨). 본원에 인용된 데아미나제와 RGN 사이의 다양한 다른 융합 단백질 또한 고려된다.
RGN-DNA 복합체 (RGN-DNA 버블의 크기)에서 단일 가닥인 DNA의 부분은 설명되지 않았다. 그러나, sgRNA가 비-주형 가닥에 결합할 때에만 전사 간섭이 발생한다는 것이 전사를 간섭하도록 복합체에 대해 특이적으로 설계된 sgRNA를 갖는 dCas9 시스템에서 확인되었다. 이 결과는 DNA-Cas9 복합체에서 DNA의 특정한 부분이 Cas9에 의해 보호되지 않고, 융합 단백질에서 데아미나제에 의해 잠재적으로 표적화될 수 있음을 시사한다 (Qi et al., 2013. Cell 152(15): 1173-83). 따라서, 데아미나제 도메인을 갖는 Cas9의 N-말단 및 C-말단 융합 둘 다 또는 일반적으로 RGN은 본 개시내용의 측면에 따라 유용하다.
일부 실시양태에서, RGN의 데아미나제 도메인 및 RNA-가이드된 DNA-결합 도메인은 링커를 통해 서로 융합된다. 데아미나제 도메인 (예를 들어, AID)과 RGN 도메인 사이에 다양한 링커 길이 및 가요성이 이용될 수 있다 (예를 들어, 특정한 적용을 위해 데아미나제 활성에 대한 최적의 길이를 달성하기 위해 (GGGGS)n (서열식별번호 590) 및 (G)n 형태의 매우 가요성인 링커에서부터 (EAAAK)n (서열식별번호: 591) 및 (XP)n 형태의 더욱 강직한 링커에 이르는 범위).
본 개시내용의 측면에 따라 RNA-가이드된 DNA-결합 도메인에 융합될 수 있는 일부 예시적인 적합한 핵산 편집 효소 및 도메인, 예를 들어 데아미나제 및 데아미나제 도메인이 제공된다 (서열식별번호: 374-545 및 572-584). 일부 실시양태에서, 각각의 서열의 활성 도메인, 예를 들어 국재화 신호 (핵 국재화 신호, 핵 수출 신호없이, 세포질 국재화 신호)가 없는 도메인이 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 데아미나제 효소의 전장 아미노산, 예를 들어 서열식별번호: 374-545 또는 572-584 중 어느 하나를 포함한다. 그러나, 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 핵산 편집 효소의 전장 서열을 포함하지 않고, 그의 단편만을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 예를 들어 RNA-가이드된 DNA-결합 도메인 및 데아미나제 효소의 단편을 포함하고, 상기 단편은 데아미나제 도메인을 포함한다. 데아미나제 도메인의 예시적인 아미노산 서열은 표 17에 기재되고, 이러한 도메인의 추가의 적합한 서열은 관련 기술분야의 기술자에게 자명할 것이다.
본 발명의 측면에 따라 사용될 수 있는, 예를 들어 뉴클레아제-불활성 또는 닉카제 RGN 도메인에 융합될 수 있는 추가의 적합한 핵산 편집 효소 서열, 예를 들어 데아미나제 효소 및 도메인 서열은 본 개시내용을 기반으로 하여 관련 기술분야의 기술자에게 자명할 것이다. 일부 실시양태에서, 이러한 추가의 효소 서열에는 본원에 제공된 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 유사한 데아미나제 효소 또는 데아미나제 도메인 서열이 포함된다. 추가의 적합한 RGN 도메인, 변이체 및 서열 또한 관련 기술분야의 기술자에게 자명할 것이다. 이러한 추가의 적합한 RGN 도메인의 예에는 Dl0A, D10A/D839A/H840A, 및 D10A/D839A/H840A/N863A 돌연변이성 도메인이 포함되나 이로 제한되지 않는다 (예를 들어, [Mali et al., Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838]을 참고하며, 그의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨).
RNA-가이드된 DNA-결합 도메인 및 데아미나제 도메인을 포함하는 융합 단백질을 생성하기 위한 추가의 적합한 전략은 관련 기술분야의 일반적인 지식과 함께 본 개시내용을 기반으로 하여 관련 기술분야의 기술자에게 자명할 것이다. 링커를 사용하거나 또는 링커를 사용하지 않고 본 개시내용의 측면에 따른 융합 단백질을 생성하기 위한 적합한 전략은 또한 본 개시내용 및 관련 기술분야의 지식에 비추어 관련 기술분야의 기술자에게 자명할 것이다.
일부 실시양태에서, RNA-가이드된 DNA-결합 도메인은 닉카제 활성을 갖는 RGN 단백질 변이체이다. 일부 실시양태에서, RNA-가이드된 DNA-결합 도메인은 RGN 닉카제이다. 일부 실시양태에서, RGN은 본 발명의 RGN이다. 다른 실시양태에서, RGN은 본 발명의 RGN이 아니다. RGN 닉카제는 듀플렉스 핵산 분자 (예를 들어, 듀플렉스 DNA 분자, 이중-가닥 DNA 분자로도 지칭됨)의 한 가닥만을 절단할 수 있는 Cas9 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, RGN 닉카제는 듀플렉스 핵산 분자의 표적 가닥을 절단하며, 이는 RGN 닉카제가 RGN에 결합된 gRNA와 염기쌍을 형성한 (그에 대해 상보성인) 가닥을 절단함을 의미한다. 일부 실시양태에서, RGN 닉카제는 Dl0A 돌연변이 또는 등가의 돌연변이를 포함한다. 다른 실시양태에서, RGN 닉카제는 H840A 돌연변이 또는 등가의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, RGN 닉카제는 서열식별번호: 569에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RGN 닉카제는 D10A Cas9 닉카제이며, 이는 Cas9의 RuvC 도메인을 불활성화시키고, 듀플렉스 핵산 분자의 표적 비-염기 편집된 가닥을 절단시키며, 이는 D10A Cas9 닉카제가 Cas9에 결합된 gRNA (예를 들어, sgRNA)와 염기쌍을 형성한 염기인 가닥을 절단한다. 일부 실시양태에서, Cas9 닉카제는 H840A 돌연변이를 포함하고, 이는 Cas9 폴리펩티드의 HNH 도메인을 불활성화시킨다. H840A Cas9 닉카제는 비-표적 염기-편집된 가닥을 절단할 것이다. 일부 실시양태에서, RGN 닉카제는 서열식별번호: 568, 569, 547 또는 553과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 닉카제로 돌연변이된 추가의 적합한 RGN 단백질은 본 개시내용 및 관련 기술분야의 지식 (예를 들어 미국 특허 출원 번호 16/432,321에 개시된 RGN)을 기반으로 하여 관련 기술분야의 기술자에게 자명할 것이고, 본 개시내용의 범위 내에 있다.
본 개시내용의 일부 측면은 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, RNA-가이드된 DNA-결합 도메인 (예를 들어, 뉴클레아제 활성 RGN 도메인, 또는 뉴클레아제 불활성이거나 또는 닉카제로서 기능하는 RGN 변이체)을 포함하는 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 적어도 하나의 UGI 도메인에 직접적으로 또는 링커를 통해 추가로 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 적어도 2개의 UGI 도메인에 직접적으로 또는 링커를 통해 추가로 융합된다. 본 개시내용의 일부 측면은 적어도 1개의 UGI 도메인에 추가로 융합되고, UGI 도메인을 포함하지 않는 유사한 융합 단백질과 비교하여 증가된 C→T 핵염기 편집 효율을 갖는, 데아미나제-RGN 융합 단백질, 데아미나제-뉴클레아제 불활성 RGN 융합 단백질 및 데아미나제-닉카제 RGN 융합 단백질을 제공한다. 임의의 특정한 이론에 구애되기를 바라진 않지만, U:G 헤테로듀플렉스 DNA의 존재에 대한 세포성 DNA-복구 반응은 세포에서 핵염기 편집 효율의 감소에 대한 원인일 수 있다. 예를 들어, 우라실 DNA 글리코실라제 (UDG)는 세포에서 DNA로부터 U의 제거를 촉매하며, 이는 염기 절제 복구를 개시할 수 있으며, 가장 일반적인 결과로서 U:G 쌍에서 C:G 쌍으로 역전시킨다.
본 개시내용은 UGI 도메인에 추가로 융합된, 본 발명의 데아미나제 및 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 고려한다. 본 개시내용은 또한 UGI 도메인에 추가로 융합된, 데아미나제, RGN 닉카제 또는 뉴클레아제 불활성 RGN 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 고려한다. UGI 도메인의 사용이 C에서 U로의 변화를 촉매할 수 있는 핵산 편집 도메인의 편집 효율을 증가시킬 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, UGI 도메인을 포함하는 융합 단백질은 C 잔기를 탈아미노화시키는데 더욱 효율적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 하기 구조를 포함한다: [데아미나제]-[임의적인 링커 서열]- [뉴클레아제-불활성 RGN]-[임의적인 링커 서열]-[UGI]; [데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[UGI]-[임의적인 링커 서열]-[뉴클레아제-불활성 RGN]; [UGI]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[뉴클레아제-불활성 RGN]; [UGI]-[임의적인 링커 서열]-[뉴클레아제-불활성 RGN]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]; [뉴클레아제-불활성 RGN]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[UGI]; 또는 [뉴클레아제-불활성 RGN]-[임의적인 링커 서열]-[UGI]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]. "뉴클레아제-불활성 RGN"이 뉴클레아제-불활성으로 돌연변이된 임의의 RGN, 예컨대 임의의 CRISPR-Cas 단백질을 나타냄을 이해해야 한다. 또한, "UGI"가 1개 이상의 UGI 도메인을 나타냄을 이해해야 한다.
다른 실시양태에서, 융합 단백질은 하기 구조를 포함한다: [데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[RGN 닉카제]-[임의적인 링커 서열]-[UGI]; [데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[UGI]-[임의적인 링커 서열]-[RGN 닉카제]; [UGI]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[RGN 닉카제]; [UGI]-[임의적인 링커 서열]-[RGN 닉카제]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]; [RGN 닉카제]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]-[임의적인 링커 서열]-[UGI]; 또는 [RGN 닉카제]-[임의적인 링커 서열]-[UGI]-[임의적인 링커 서열]-[데아미나제]. "RGN 닉카제"가 닉카제로서 활성인 것으로 돌연변이된 임의의 RGN, 예컨대 임의의 CRISPR-Cas 단백질을 나타냄을 이해해야 한다. 또한, "UGI"가 1개 이상의 UGI 도메인을 나타냄을 이해해야 한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 링커 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 임의적인 링커 서열 중 하나 또는 둘 다가 존재한다.
일부 실시양태에서, 상기 일반적인 아키텍쳐에서 사용된 "-"는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, UGI를 포함하는 융합 단백질은 핵 표적화 서열, 예를 들어 핵 국재화 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 핵 국재화 서열 (NLS)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, NLS는 융합 단백질의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 융합 단백질의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 UGI 단백질의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 UGI 단백질의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 RGN 단백질의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 RGN 단백질의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 데아미나제의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 데아미나제의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 제2 RGN의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 제2 RGN의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 하나 이상의 링커를 통해 융합 단백질에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 링커없이 융합 단백질에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 본원에 제공되거나 또는 참고된 NLS 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, NLS는 서열식별번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, UGI 도메인은 야생형 UGI 또는 서열식별번호: 570에 제시된 UGI를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 UGI 단백질에는 UGI의 단편, 및 UGI 또는 UGI 단편에 대해 상동성인 단백질이 포함된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, UGI 도메인은 서열식별번호: 570에 제공된 아미노산 서열의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI 단편은 서열식별번호: 570에 제시된 아미노산 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5%를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI는 서열식별번호: 570에 제시된 아미노산 서열에 대해 상동성인 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 570에 제시된 아미노산 서열의 단편에 대해 상동성인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI 또는 UGI 단편, 또는 UGI 또는 UGI 단편의 상동체를 포함하는 단백질은 "UGI 변이체"로 지칭된다. UGI 변이체는 UGI 또는 그의 단편과 상동성을 공유한다. 예를 들어, UGI 변이체는 야생형 UGI 또는 서열식별번호: 570에 제시된 UGI와 적어도 70% 동일한, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한 또는 적어도 99.9% 동일한 것이다. 일부 실시양태에서, UGI 변이체는 UGI의 단편을 포함하며, 상기 단편은 야생형 UGI 또는 서열식별번호: 570에 제시된 UGI의 상응하는 단편과 적어도 70% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 적어도 99.5% 동일한 또는 적어도 99.9%이다.
적합한 UGI 단백질 및 뉴클레오티드 서열은 본원에 제공되고, 추가의 적합한 UGI 서열은 관련 기술분야의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 [Wang et al., 1989. J. Biol. Chem. 264: 1163-1171; Lundquist et al., 1997. J. Biol. Chem. 272:21408-21419; Ravishankar et al., 1998. Nucleic Acids Res. 26:4880-4887; 및 Putnam et al., 1999. J. Mol. Biol. 287:331-346(1999)]에 공개된 것들이 포함되고, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
추가의 단백질이 우라실 글리코실라제 억제제일 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 우라실-DNA 글리코실라제 염기-절제 복구 효소를 억제할 수 있는 (예를 들어, 입체적으로 차단할 수 있는) 다른 단백질은 본 개시내용의 범위 내에 있다. 추가로, 염기-절제 복구를 차단하거나 또는 억제하는 임의의 단백질 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, DNA와 결합하는 단백질이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, UGI에 대한 대용물이 사용된다. 일부 실시양태에서, 우라실 글리코실라제 억제제는 단일-가닥 DNA와 결합하는 단백질이다. 예를 들어, 우라실 글리코실라제 억제제는 에르위니아 타스마니엔시스(Erwinia tasmaniensis) 단일-가닥 결합 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 우라실 글리코실라제 억제제는 우라실과 결합하는 단백질이다. 일부 실시양태에서, 우라실 글리코실라제 억제제는 DNA에서 우라실과 결합하는 단백질이다. 일부 실시양태에서, 우라실 글리코실라제 억제제는 촉매적으로 불활성인 우라실 DNA-글리코실라제 단백질이다. 일부 실시양태에서, 우라실 글리코실라제 억제제는 DNA로부터 우라실을 절제하지 않는 촉매적으로 불활성인 우라실 DNA-글리코실라제 단백질이다. 다른 우라실 글리코실라제 억제제는 관련 기술분야의 기술자에게 자명하며 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 이해해야 한다. 적합한 UGI 단백질 서열 (서열식별번호: 570)이 본원에서 제공되고, 추가의 적합한 UGI 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 [Wang et al., 1989. J. Biol. Chem. 264: 1163-1171; Lundquist et al., 1997. J. Biol. Chem. 272:21408-21419; Ravishankar et al. 1998. Nucleic Acids Res. 26:4880-4887; 및 Putnam et al., 1999. J. Mol. Biol. 287:331-346]에 공개된 것들이 포함되고, 그의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 임의적인 링커는 (SGGS)n (서열식별번호: 592) 모티프를 포함하고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 19, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일부 실시양태에서, 임의적인 링커는 서열식별번호: 546에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 융합 단백질은 RGN의 세포 흡수를 용이하게 하는 적어도 하나의 세포-투과 도메인을 포함한다. 세포-투과 도메인은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 일반적으로 양으로 하전된 아미노산 잔기 (즉, 다중양이온성 세포-투과 도메인), 교대하는 극성 아미노산 잔기 및 비극성 아미노산 잔기 (즉, 양친매성 세포-투과 도메인), 또는 소수성 아미노산 잔기 (즉, 소수성 세포-투과 도메인)의 스트레치를 포함한다 (예를 들어, [Milletti F. (2012) Drug Discov Today 17:850-860] 참고). 세포-투과 도메인의 비제한적인 예는 인간 면역결핍 바이러스 1로부터의 트랜스-활성화 전사 활성화제 (TAT)이다.
핵 국재화 신호, 색소체 국재화 신호, 미토콘드리아 국재화 신호, 이중-표적화 국재화 신호, 및/또는 세포-투과 도메인은 융합 단백질의 아미노-말단 (N-말단), 카르복실-말단 (C-말단) 또는 내부 위치에 위치할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 융합 단백질, 및 단일 가이드 또는 이중 가이드 RNA로서 가이드 RNA (집합적으로 gRNA로 지칭됨)를 포함하는 리보핵단백질 복합체이다.
IV. RNA-가이드된 뉴클레아제, RNA-가이드된 DNA 결합 폴리펩티드, 데아미나제, CRISPR RNA, tracrRNA, 및 gRNA를 코딩하는 뉴클레오티드
본 개시내용은 본원에 개시된 RGN, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합체, 데아미나제, CRISPR RNA, tracrRNA 및/또는 sgRNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에는, 가이드 RNA 내에 포함될 때 연관된 RNA-가이드된 뉴클레아제와 관심 표적 서열의 서열-특이적인 결합을 지시할 수 있는 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CRISPR 반복 서열을 포함하거나 또는 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편이 포함된다. 가이드 RNA 내에 포함될 때 연관된 RNA-가이드된 뉴클레아제와 관심 표적 서열의 서열-특이적인 결합을 지시할 수 있는 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 tracrRNA를 포함하거나 또는 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편 또한 개시된다. RNA-가이드된 서열-특이적인 방식으로 표적 뉴클레오티드 서열에 결합하는 능력을 보유하는 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 RGN을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 그의 활성 단편 또는 변이체 또한 제공된다.
본 개시내용은 본원에 인용된 데아미나제 (서열식별번호: 374-545 및 572-584, 또는 그의 활성 변이체) 및 DNA 결합 폴리펩티드, 예를 들어 메가뉴클레아제, 아연 핑거 융합 단백질, 또는 TALEN를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 본 개시내용은 본원에 인용된 데아미나제 및 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 이러한 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드는 본 발명의 RGN, 관련 기술분야에 공지된 RGN, CRISPR-Cas 단백질, 또는 이들의 임의의 단백질 변이체일 수 있다. 단백질 변이체는 뉴클레아제-불활성이거나 또는 닉카제일 수 있다. 이러한 RGN 변이체의 예에는 뉴클레아제-불활성 RGN (서열식별번호: 568 또는 서열식별번호: 547) 또는 RGN 닉카제 돌연변이체 (서열식별번호: 569 또는 서열식별번호: 553)가 포함된다. RGN 뉴클레아제의 다른 예는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 유사한 상응하는 돌연변이는 뉴클레아제 불활성이거나 또는 닉카제인 돌연변이성 변이체를 생성할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드"의 사용은 본 개시내용을 DNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 폴리뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드 (RNA), 및 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드의 조합물을 포함할 수 있음을 인지할 것이다. 이러한 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드에는 천연 발생 분자 및 합성 유사체 둘 다가 포함된다. 이들에는 펩티드 핵산 (PNA), PNA-DNA 키메라, 록킹된 핵산 (LNA), 및 포스포티오레이트 연결된 서열이 포함된다. 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 또한 모든 형태의 서열, 예컨대 비제한적으로 단일 가닥 형태, 이중 가닥 형태, DNA-RNA 혼성체, 삼중 구조, 스템-루프 구조 등을 포괄한다.
RGN, 데아미나제 또는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 관심 유기체에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. "코돈-최적화된" 코딩 서열은 특정한 숙주 세포의 선호된 코돈 사용 빈도 또는 전사 조건을 모방하도록 설계된 그의 코돈 사용 빈도를 갖는 폴리뉴클레오티드 코딩 서열이다. 특정한 숙주 세포 또는 유기체에서의 발현은 번역된 아미노산 서열이 변하지 않도록 핵산 수준에서 하나 이상의 코돈 변경의 결과로서 증강된다. 핵산 분자는 전체적으로 또는 부분적으로 코돈 최적화될 수 있다. 광범위한 유기체에 대한 선호도 정보를 제공하는 코돈 표 및 다른 참고자료가 관련 기술분야에서 이용가능하다 (예를 들어, 식물-선호 코돈 용법의 논의에 대해서는 [Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11] 참고). 식물-선호 유전자를 합성하는 방법은 관련 기술분야에서 이용가능하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,380,831, 및 5,436,391, 및 [Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498]을 참고하며, 이들은 본원에 참고로 포함된다.
본원에 제공된 RGN, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합체, 데아미나제, crRNA, tracrRNA 및/또는 sgRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 시험관내 발현 또는 관심 세포, 소기관, 배아 또는 유기체에서의 발현을 위해 발현 카세트에 제공될 수 있다. 카세트는 폴리뉴클레오티드의 발현을 가능하게 하는 본원에 제공된 RGN, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합체, 데아미나제, crRNA, tracrRNA 및/또는 sgRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 5' 및 3' 조절 서열을 포함할 것이다. 카세트는 유기체에 동시 형질전환되는 적어도 하나의 추가의 유전자 또는 유전자 요소를 추가로 함유할 수 있다. 추가의 유전자 또는 요소가 포함되는 경우, 성분들은 작동가능하게 연결된다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 2가지 이상의 요소들 사이의 기능적 연결을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 프로모터와 관심 코딩 영역 (예를 들어, RGN, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합체, 데아미나제, crRNA, tracrRNA 및/또는 sgRNA를 코딩하는 영역) 사이의 연결은 관심 코딩 영역의 발현을 가능하게 하는 기능적 연결이다. 작동가능하게 연결된 요소는 연속적 또는 비-연속적일 수 있다. 2가지 단백질 코딩 영역의 결합을 지칭하기 위해 사용되는 경우, 작동가능하게 연결된이란 코딩 영역이 동일한 리딩 프레임 내에 있는 것으로 의도된다. 대안적으로, 추가의 유전자(들) 또는 요소(들)가 다중 발현 카세트 상에 제공될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 RGN을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 하나의 발현 카세트 상에 존재할 수 있는 반면에, crRNA, tracrRNA 또는 완전 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 별도의 발현 카세트 상에 존재할 수 있다. 이러한 발현 카세트에는 조절 영역의 전사 조절하에 있는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 다수개의 제한 부위 및/또는 재조합 부위가 제공된다. 발현 카세트는 선택가능한 마커 유전자를 추가로 함유할 수 있다.
발현 카세트는 5'-3' 전사 방향으로 관심 유기체에서 기능적인 전사 (일부 실시양태에서는 번역) 개시 영역 (즉, 프로모터), 본 발명의 RGN-, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합체-, 데아미나제-, crRNA-, tracrRNA- 및/또는 sgRNA-코딩 폴리뉴클레오티드, 및 전사 (일부 실시양태에서는 번역) 종결 영역 (즉, 종결 영역)을 포함할 것이다. 본 발명의 프로모터는 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 지시하거나 또는 유도할 수 있다. 조절 영역 (예를 들어, 프로모터, 전사 조절 영역, 및 번역 종결 영역)은 숙주 세포에 대해 또는 서로에 대해 내인성 또는 이종성일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 서열과 관련하여 "이종성"은 외래 종으로부터 기원하는 서열이거나, 또는 동일한 종으로부터 기원하는 경우에는 의도적인 인간 개입에 의해 조성 및/또는 게놈 유전자좌에서 그의 본래의 형태로부터 실질적으로 변형된 서열이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 키메라 유전자는 코딩 서열에 대해 이종성인 전사 개시 영역에 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함한다.
편리한 종결 영역은 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens)의 Ti-플라스미드, 예컨대 옥토핀 신타제 및 노팔린 신타제 종결 영역으로부터 입수가능하다. [Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; 및 Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639] 또한 참고한다.
추가의 조절 신호에는 전사 개시 시작 부위, 오퍼레이터, 활성화제, 인핸서, 다른 조절 요소, 리보솜 결합 부위, 개시 코돈, 종결 신호 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,039,523 및 4,853,331; EPO 0480762A2; [Sambrook et al. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), 이후 "Sambrook 11"; Davis et al., eds. (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Cold Spring Harbor, N.Y.], 및 여기에 인용된 참고문헌을 참고한다.
발현 카세트를 제조하기 위해, 적절한 배향으로, 적절한 경우 적절한 리딩 프레임으로 DNA 서열을 제공하도록 다양한 DNA 단편을 조작할 수 있다. 이를 위해, 어댑터 또는 링커를 사용하여 DNA 단편을 결합시킬 수 있거나, 또는 편리한 제한 부위, 불필요한 DNA의 제거, 제한 부위의 제거 등을 제공하기 위해 다른 조작이 수반될 수 있다. 이를 위해, 시험관내 돌연변이 유발, 프라이머 복구, 제한, 어닐링, 재치환, 예를 들어 전이 및 전환이 수반될 수 있다.
수많은 프로모터가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 프로모터는 원하는 결과를 기준으로 선택될 수 있다. 핵산은 구성적, 유도성, 성장 단계-특이적, 세포 유형-특이적, 조직-선호, 조직-특이적, 또는 관심 유기체에서의 발현을 위한 다른 프로모터와 조합될 수 있다. 예를 들어, WO 99/43838, 및 미국 특허 번호 8,575,425; 7,790,846; 8,147,856; 8,586832; 7,772,369; 7,534,939; 6,072,050; 5,659,026; 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; 및 6,177,611에 제시된 프로모터를 참고하며; 이들은 본원에 참고로 포함된다.
식물에서의 발현을 위해, 구성적 프로모터에는 CaMV 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); 쌀 액틴 (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); 유비퀴틴 (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 및 Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); 및 MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730) 또한 포함된다.
유도성 프로모터의 예는 저산소 또는 저온 스트레스에 의해 유도성인 Adh1 프로모터, 열 스트레스에 의해 유도성인 Hsp70 프로모터, 둘 모두 빛에 의해 유도성인 PPDK 프로모터 및 펩카르복실라제 프로모터이다. 화학적으로 유도성인 프로모터, 예컨대 완화제 유도된 In2-2 프로모터 (미국 특허 번호 5,364,780), 옥신 유도되고 융단층 특이적이지만 캘러스에서도 활성인 Axig1 프로모터 (PCT US01/22169), 스테로이드-반응성 프로모터 (예를 들어, 에스트로겐 유도된 ERE 프로모터, 및 [Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 및 McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257]에서의 글루코코르티코이드-유도성 프로모터 참고) 및 테트라시클린-유도성 및 테트라시클린-억제성 프로모터 (예를 들어, [Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237], 및 미국 특허 번호 5,814,618 및 5,789,156 참고) 또한 유용하며, 이들은 본원에 참고로 포함된다.
조직-특이적 또는 조직-선호 프로모터는 특정한 조직 내에서 발현 구축물의 표적 발현을 위해 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 조직-특이적 또는 조직-선호 프로모터는 식물 조직에서 활성이다. 식물에서 발달 조절하에 있는 프로모터의 예에는 특정 조직, 예컨대 잎, 뿌리, 과실, 종자 또는 꽃에서 전사를 우선적으로 개시하는 프로모터가 포함된다. "조직 특이적" 프로모터는 특정 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터이다. 유전자의 구성적 발현과는 달리, 조직-특이적인 발현은 유전자 조절의 여러 상호작용 수준의 결과이다. 따라서, 상동성인 또는 밀접하게 관련된 식물 종으로부터의 프로모터가 특정한 조직에서 트랜스진의 효율적이고 신뢰할 수 있는 발현을 달성하기 위해 바람직하게 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현은 조직-선호 프로모터를 포함한다. "조직 선호" 프로모터는 특정 조직에서 전사를 우선적으로 개시하지만 반드시 전체적으로 또는 단독으로 개시하는 것은 아닌 프로모터이다.
일부 실시양태에서, RGN, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합체, 데아미나제, crRNA 및/또는 tracrRNA를 코딩하는 핵산 분자는 세포 유형-특이적인 프로모터를 포함한다. "세포 유형 특이적인" 프로모터는 하나 이상의 장기의 특정 세포 유형에서 주로 발현을 유도하는 프로모터이다. 식물에서 기능성인 세포 유형 특이적인 프로모터가 주로 활성일 수 있는 식물 세포의 일부 예에는 예를 들어 BETL 세포, 뿌리, 잎에서의 맥관 세포, 자루 세포, 및 줄기 세포가 포함된다. 핵산 분자는 또한 세포 유형 선호 프로모터를 포함할 수 있다. "세포 유형 선호" 프로모터는 하나 이상의 장기의 특정 세포 유형에서 주로 대부분의 발현을 유도하지만 반드시 전체적으로 또는 단독으로 유도하는 것은 아닌 프로모터이다. 식물에서 기능성인 세포 유형 선호 프로모터가 우선적으로 활성일 수 있는 식물 세포의 일부 예에는 예를 들어 BETL 세포, 뿌리, 잎에서의 맥관 세포, 자루 세포, 및 줄기 세포가 포함된다.
RGN, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합체, 데아미나제, crRNA, tracrRNA 및/또는 sgRNA를 코딩하는 핵산 서열은 예를 들어 시험관내 mRNA 합성을 위해 파지 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 시험관내-전사된 RNA는 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위해 정제될 수 있다. 예를 들어, 프로모터 서열은 T7, T3 또는 SP6 프로모터 서열, 또는 T7, T3 또는 SP6 프로모터 서열의 변형일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 발현된 단백질 및/또는 RNA는 본원에 기재된 게놈 변형 방법에서 사용하기 위해 정제될 수 있다.
특정한 실시양태에서, RGN, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합체, 데아미나제, crRNA, tracrRNA 및/또는 sgRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 폴리아데닐화 신호 (예를 들어, SV40 폴리A 신호 및 식물에서 기능성인 다른 신호) 및/또는 적어도 하나의 전사 종결 서열에 연결될 수 있다. 추가로, RGN, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합체 또는 데아미나제를 코딩하는 서열은 또한 본원에 기재된 바와 같이 적어도 하나의 핵 국재화 신호, 적어도 하나의 세포-투과 도메인, 및/또는 단백질을 특정한 세포하 위치로 수송할 수 있는 적어도 하나의 신호 펩티드를 코딩하는 서열(들)에 연결될 수 있다.
RGN, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합체, 데아미나제, crRNA, tracrRNA 및/또는 sgRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터 또는 다중 벡터에 존재할 수 있다. "벡터"는 핵산을 숙주 세포로 수송, 전달 또는 도입하기 위한 폴리뉴클레오티드 조성물을 지칭한다. 적합한 벡터에는 플라스미드 벡터, 파지미드, 코스미드, 인공/미니-염색체, 트랜스포손, 및 바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터, 바쿨로바이러스 벡터)가 포함된다. 벡터는 추가의 발현 조절 서열 (예를 들어, 인핸서 서열, 코작 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열), 선택가능한 마커 서열 (예를 들어, 항생제 내성 유전자), 복제 기점 등을 포함할 수 있다. 추가의 정보는 ["Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 또는 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3rd edition, 2001]에서 확인할 수 있다.
벡터는 또한 형질전환된 세포의 선택을 위해 선택가능한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 형질전환된 세포 또는 조직의 선택을 위해 사용된다. 마커 유전자에는 항생제 내성을 코딩하는 유전자, 예컨대 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (NEO) 및 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT)를 코딩하는 유전자, 뿐만 아니라 제초성 화합물, 예컨대 글루포시네이트 암모늄, 브로목시닐, 이미다졸리논, 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트 (2,4-D)에 대한 내성을 부여하는 유전자가 포함된다.
일부 실시양태에서, RGN 폴리펩티드, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합체 또는 데아미나제를 코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트 또는 벡터는 crRNA 및/또는 tracrRNA를 코딩하는 서열, 또는 가이드 RNA를 생성하기 위해 조합된 crRNA 및 tracrRNA를 추가로 포함할 수 있다. crRNA 및/또는 tracrRNA를 코딩하는 서열(들)은 관심 유기체 또는 숙주 세포에서 crRNA 및/또는 tracrRNA의 발현을 위해 적어도 하나의 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, crRNA 및/또는 tracrRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 RNA 폴리머라제 III (Pol III)에 의해 인식되는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 Pol III 프로모터의 예에는 포유동물 U6, U3, H1, 및 7SL RNA 프로모터 및 쌀 U6 및 U3 프로모터가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
나타낸 바와 같이, RGN, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합체, 데아미나제, crRNA, tracrRNA 및/또는 sgRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 구축물을 이용하여 관심 유기체를 형질전환시킬 수 있다. 형질전환 방법은 뉴클레오티드 구축물을 관심 유기체에 도입시키는 것을 수반한다. "도입시키는"은 구축물이 숙주 세포의 내부로 접근하게 하는 방식으로 뉴클레오티드 구축물을 숙주 세포에 도입시키는 것으로 의도된다. 본 발명의 방법은 뉴클레오티드 구축물을 숙주 유기체에 도입시키기 위해 특정한 방법을 필요로 하지 않으며, 단지 뉴클레오티드 구축물이 숙주 유기체의 적어도 하나의 세포의 내부로 접근하기만 하면 된다. 숙주 세포는 진핵생물 또는 원핵생물 세포일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 진핵생물 숙주 세포는 식물 세포, 포유동물 세포, 또는 곤충 세포이다. 안정한 형질전환 방법, 일시적인 형질전환 방법, 및 바이러스-매개된 방법을 비롯하여 이로 제한되지 않는, 뉴클레오티드 구축물을 식물 및 다른 숙주 세포에 도입시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
상기 방법은 형질전환된 유기체, 예컨대 식물, 예컨대 전체 식물, 뿐만 아니라 식물 기관 (예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자, 식물 세포, 주아, 배아 및 그의 자손을 생성한다. 식물 세포는 분화될 수 있거나 또는 분화되지 않을 수 있다 (예를 들어 캘러스, 현탁액 배양 세포, 원형질체, 잎 세포, 뿌리 세포, 체관부 세포, 화분).
"트랜스제닉 유기체" 또는 "형질전환된 유기체" 또는 "안정하게 형질전환된" 유기체 또는 세포 또는 조직은 본 발명의 RGN, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합체, 데아미나제, crRNA 및/또는 tracrRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 도입되거나 또는 통합된 유기체를 지칭한다. 다른 외인성 또는 내인성 핵산 서열 또는 DNA 단편 또한 숙주 세포에 혼입될 수 있는 것으로 인지된다. 아그로박테리움(Agrobacterium)- 및 유전자총-매개된 형질전환은 식물 세포의 형질전환을 위해 주로 이용되는 2가지 접근법이다. 그러나, 숙주 세포의 형질전환은 감염, 형질감염, 미량주사, 전기천공, 미량투영, 유전자총 또는 입자 충격, 전기천공, 실리카/탄소 섬유, 초음파 매개, PEG 매개, 인산칼슘 공동 침전, 다가양이온 DMSO 기술, DEAE 덱스트란 절차, 및 바이러스 매개, 리포솜 매개 등에 의해 수행될 수 있다. RGN, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합체, 데아미나제, crRNA 및/또는 tracrRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 바이러스-매개된 도입에는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관된 바이러스 매개된 도입 및 발현, 뿐만 아니라 카울리모바이러스, 제미니바이러스, 및 RNA 식물 바이러스가 포함된다.
형질전환 프로토콜 뿐만 아니라, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 식물에 도입시키기 위한 프로토콜은 형질전환을 위해 표적화된 숙주 세포의 유형 (예를 들어, 외떡잎 또는 쌍떡잎 식물 세포)에 따라 달라질 수 있다. 형질전환 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 미국 특허 번호: 8,575,425; 7,692,068; 8,802,934; 7,541,517에 제시된 것들이 포함되며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다. 또한, [Rakoczy-Trojanowska, M. (2002) Cell Mol Biol Lett. 7:849-858; Jones et al. (2005) Plant Methods 1:5; Rivera et al. (2012) Physics of Life Reviews 9:308-345; Bartlett et al. (2008) Plant Methods 4:1-12; Bates, G.W. (1999) Methods in Molecular Biology 111:359-366; Binns and Thomashow (1988) Annual Reviews in Microbiology 42:575-606; Christou, P. (1992) The Plant Journal 2:275-281; Christou, P. (1995) Euphytica 85:13-27; Tzfira et al. (2004) TRENDS in Genetics 20:375-383; Yao et al. (2006) Journal of Experimental Botany 57:3737-3746; Zupan and Zambryski (1995) Plant Physiology 107:1041-1047; Jones et al. (2005) Plant Methods 1:5]을 참고한다
형질전환은 세포로 핵산의 안정한 또는 일시적인 포함을 일으킬 수 있다. "안정한 형질전환"은, 숙주 세포에 도입된 뉴클레오티드 구축물이 숙주 세포의 게놈과 통합하고, 그의 자손에 의해 유전될 수 있는 것을 의미하는 것으로 의도된다. "일시적인 형질전환"은, 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포에 도입되고, 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
엽록체의 형질전환 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, [Svab et al. (1990) Proc. Nail. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606]을 참고한다. 상기 방법은 선택가능한 마커를 함유하는 DNA의 입자 총 전달, 및 상동성 재조합을 통해 색소체 게놈으로 DNA의 표적화에 의존한다. 추가로, 색소체 형질전환은 핵-코딩된 및 색소체-지정된 RNA 폴리머라제의 조직-선호 발현에 의한 침묵 색소체-매개 트랜스진의 전사촉진에 의해 달성될 수 있다. 이러한 시스템은 [McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305]에서 보고되었다.
형질전환된 세포는 통상적인 방식에 따라 트랜스제닉 유기체, 예컨대 식물로 성장할 수 있다. 예를 들어, [McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84]를 참고한다. 이어서, 이들 식물을 성장시킨 다음, 동일한 형질전환된 균주 또는 상이한 균주와 수분시킬 수 있고, 생성된 혼성체는 확인된 원하는 표현형 특징의 구성적 발현을 가질 수 있다. 원하는 표현형 특징의 발현이 안정하게 유지되고 유전된 다음, 종자가 수확되는 것을 보장하도록 2 세대 이상 성장시켜, 원하는 표현형 특징의 발현이 달성될 수 있도록 보장할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명은 게놈에 안정하게 도입된 본 발명의 뉴클레오티드 구축물, 예를 들어 본 발명의 발현 카세트를 갖는 형질전환된 종자 ("트랜스제닉 종자"로도 지칭됨)를 제공한다.
대안적으로, 형질전환된 세포는 유기체에 도입될 수 있다. 이들 세포는 유기체로부터 기원할 수 있고, 세포는 생체외 접근법으로 형질전환된다.
본원에 제공된 서열은 임의의 식물 종, 예컨대 비제한적으로, 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 관심 식물의 예에는 옥수수 (메이즈), 수수, 밀, 해바라기, 토마토, 크루시퍼, 후추, 감자, 목화, 쌀, 대두, 사탕무, 사탕수수, 담배, 보리, 및 유채, 브라시카(Brassica) 종, 알팔파, 호밀, 조, 홍화, 땅콩, 고구마, 카사야, 커피, 코코넛, 파인애플, 감귤 나무, 코코아, 차, 바나나, 아보카도, 무화과, 구아바, 망고, 올리브, 파파야, 캐슈, 마카다미아, 아몬드, 귀리, 채소, 관상용 식물, 및 구과 식물이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
채소에는 토마토, 상추, 그린 빈, 리마 빈, 완두콩, 및 쿠르쿠미스(Curcumis) 속의 구성원, 예컨대 오이, 칸탈루프, 및 머스크 멜론이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 관상용 식물에는 진달래, 수국, 히비스커스, 장미, 튤립, 수선화, 페튜니아, 카네이션, 포인세티아, 및 국화가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 식물은 농작물 (예를 들어, 옥수수, 수수, 밀, 해바라기, 토마토, 크루시퍼, 후추, 감자, 목화, 쌀, 대두, 사탕무, 사탕수수, 담배, 보리, 유채 등)이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 식물에는 식물 세포, 식물 원형질체, 식물이 재생될 수 있는 식물 세포 조직 배양물, 식물 캘리(calli), 식물 덩어리, 및 식물 또는 식물의 일부분, 예컨대 배아, 화분, 배주, 종자, 잎, 꽃, 가지, 과실, 커넬, 이삭, 콥, 겉껍질, 자루, 뿌리, 근단, 꽃밥 등에서 온전한 식물 세포가 포함된다. 곡물은 종의 재배 또는 번식 이외의 목적으로 상업적인 재배자에 의해 생산된 성숙한 종자를 의미하는 것으로 의도된다. 재생된 식물의 자손, 변이체 및 돌연변이체 또한 본 발명의 범위 내에 포함되나, 단, 이들 부분은 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 개시된 서열을 보유하는 가공된 식물 생성물 또는 부산물, 예를 들어 대두박이 추가로 제공된다.
RGN, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합체, 데아미나제, crRNA 및/또는 tracrRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 임의의 원핵생물 종, 예컨대 비제한적으로, 고세균류 및 박테리아 (예를 들어, 바실러스(Bacillus) 종, 클레브시엘라(Klebsiella) 종, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 리조비움(Rhizobium) 종, 에스케리키아(Escherichia) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 살모넬라(Salmonella) 종, 시겔라(Shigella) 종, 비브리오(Vibrio) 종, 예르시니아(Yersinia) 종, 마이코플라즈마(Mycoplasma) 종, 아그로박테리움, 락토바실러스(Lactobacillus) 종)을 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다.
RGN, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합체, 데아미나제, crRNA 및/또는 tracrRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 임의의 진핵생물 종, 예컨대 비제한적으로 동물 (예를 들어, 포유동물, 곤충, 어류, 새, 및 파충류), 진균, 아메바, 조류 및 효모를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다.
통상적인 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법을 이용하여 포유동물 세포 또는 표적 조직에서 핵산을 도입시킬 수 있다. 이러한 방법을 이용하여 CRISPR 시스템의 성분을 코딩하는 핵산을 배양물 중의 또는 숙주 유기체 중의 세포에 투여할 수 있다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템에는 DNA 플라스미드, RNA (예를 들어, 본원에 기재된 벡터의 전사체), 네이키드 핵산, 및 리포솜과 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산이 포함된다. 바이러스 벡터 전달 시스템에는 세포로 전달 후에 에피솜 또는 통합 게놈을 갖는 DNA 및 RNA 바이러스가 포함된다. 유전자 요법 절차의 검토를 위해, [Anderson, Science 256: 808- 813 (1992); Nabel & Feigner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Bohm (eds) (1995); 및 Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)]를 참고한다.
핵산의 비-바이러스 전달 방법에는 리포펙션, 뉴클레오펙션, 미량주사, 유전자총, 비로솜, 리포솜, 이뮤노리포솜, 다가양이온 또는 지질: 핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 작용제-증강된 흡수가 포함된다. 리포펙션은 예를 들어 미국 특허 번호 5,049,386, 4,946,787; 및 4,897,355)에 기재되어 있고, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다 (예를 들어, 트랜스펙탐(Transfectam)™ 및 리포펙틴(Lipofectin)™). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질에는 프라이그너(Feigner), WO 91/17424; WO 91/16024의 것들이 포함된다. 전달은 세포로 (예를 들어 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직으로 (예를 들어 생체내 투여)일 수 있다. 지질:핵산 복합체, 예컨대 표적화된 리포솜, 예컨대 면역지질 복합체의 제조는 관련 기술분야의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, [Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291- 297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)]; 미국 특허 번호 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787 참고).
핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 바이러스를 신체의 특이적인 세포로 표적화하고 바이러스 페이로드를 핵으로 수송하는 고도로 진화된 과정을 활용한다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접적으로 투여될 수 있거나 (생체내) 또는 이들을 이용하여 시험관내에서 세포를 치료할 수 있고, 임의적으로 변형된 세포가 환자에게 투여될 수 있다 (생체외). 통상적인 바이러스 기반 시스템에는 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 및 단순 포진 바이러스 벡터가 포함될 수 있다. 숙주 게놈에서 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-연관된 바이러스 유전자 전달 방법에 의해 가능하며, 이는 종종 삽입된 트랜스진의 장기간 발현을 일으킨다. 추가로, 높은 형질도입 효율이 여러 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 관찰되었다.
레트로바이러스의 향성은 외래 외피 단백질을 도입하고, 표적 세포의 잠재적인 표적 집단을 확장시킴으로써 변경될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입하거나 또는 감염시킬 수 있고, 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 따라서, 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 따라 좌우될 것이다. 레트로바이러스 벡터는 6-10 kb 이하의 외래 서열에 대해 팩키징 능력을 갖는 시스-작용 긴 말단 반복부로 구성된다. 최소의 시스-작용 LTR은 벡터의 복제 및 팩키징에 충분하며, 이를 사용하여 치료 유전자를 표적 세포에 통합시켜 영구적인 트랜스진 발현을 제공한다. 광범위하게 사용되는 레트로바이러스 벡터에는 뮤린 백혈병 바이러스 (MuLV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GaLV), 유인원 면역결핍 바이러스 (SIV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 및 이들의 조합물을 기반으로 하는 것들이 포함된다 (예를 들어, [Buchscher et al., J. Viral. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Viral. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Viral. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Viral. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., 1. Viral. 65:2220-2224 (1991)]; PCT/US94/05700 참고).
일시적인 발현이 바람직한 경우에, 아데노바이러스 기반 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 여러 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율을 가질 수 있고, 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터를 사용하여, 높은 역가 및 수준의 발현이 수득되었다. 이 벡터는 비교적 간단한 시스템으로 다량 생산될 수 있다. 또한, 아데노-연관된 바이러스 ("AAV") 벡터를 사용하여, 예를 들어 핵산 및 펩티드의 시험관내 생성에서 및 생체내 및 생체외 유전자 요법 절차를 위해 세포를 표적 핵산으로 형질도입시킬 수 있다 (예를 들어, [West et al., Virology 160:38-47 (1987)]; 미국 특허 번호 4,797,368; WO 93/24641; [Katin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)] 참고). 재조합 AAV 벡터의 구축은 수많은 공보, 예컨대 미국 특허 번호 5,173,414; [Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski et al., J. Viral. 63:03822-3828 (1989)]에 기재되어 있다. 전형적으로 팩키징 세포를 사용하여 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성한다. 이러한 세포에는 아데노바이러스를 팩키징하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 팩키징하는 ψJ2 세포 또는 PA317 세포가 포함된다.
유전자 요법에서 사용되는 바이러스 벡터는 일반적으로 핵산 벡터를 바이러스 입자로 팩키징하는 세포주를 생성함으로써 생성된다. 벡터는 전형적으로 팩키징 및 숙주로의 후속적인 통합을 위해 필요한 최소 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 폴리뉴클레오티드(들)에 대한 발현 카세트에 의해 대체된다. 잃어버린 바이러스 기능은 전형적으로 팩키징 세포주에 의해 트랜스로 제공된다. 예를 들어, 유전자 요법에서 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 팩키징 및 숙주 게놈으로의 통합을 위해 필요한 AAV 게놈으로부터의 ITR 서열만을 갖는다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉, rep 및 cap을 코딩하는 헬퍼 플라스미드를 함유하지만 ITR 서열은 결여된 세포주에서 팩키징된다.
세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스에 의해 감염될 수 있다. 헬퍼 바이러스는 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 벡터의 복제 및 AAV 유전자의 발현을 촉진시킨다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인해 유의한 양으로 팩키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은 예를 들어 AAV에 비해 아데노바이러스가 덜 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다. 세포로 핵산의 추가의 전달 방법은 관련 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 US20030087817을 참고한다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 하나 이상의 벡터에 의해 일시적으로 또는 비-일시적으로 형질감염된다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체에서 자연적으로 발생하는 것처럼 형질감염된다. 일부 실시양태에서, 형질감염된 세포를 대상체로부터 취한다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체로부터 취한 세포, 예컨대 세포주로부터 유래된다. 조직 배양을 위한 매우 다양한 세포주가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 세포주의 예에는 C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLaS3, Huhl, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panel, PC-3, TFl, CTLL-2, CIR, Rat6, CVI, RPTE, AlO, T24, 182, A375, ARH-77, Calul, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388Dl, SEM-K2, WEHI- 231, HB56, TIB55, lurkat, 145.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4. COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, BS-C-1 원숭이 신장 상피, BALB/3T3 마우스 배아 섬유모세포, 3T3 Swiss, 3T3-Ll, 132-d5 인간 태아 섬유모세포; 10.1 마우스 섬유모세포, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, BCP-I 세포, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10Tl/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-Kl, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr-/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L235010, CORL23/ R23, COS-7, COV-434, CML Tl, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepalclc7, HL-60, HMEC, HT-29, lurkat, lY 세포, K562 세포, Ku812, KCL22, KGl, KYOl, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-l0A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCKII, MDCKII, MOR/ 0.2R, MONO-MAC 6, MTD-lA, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, OPCN/OPCT 세포주, Peer, PNT-lA/ PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, Saos-2 세포, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, THPl 세포주, U373, U87, U937, VCaP, Vero 세포, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR, 및 그의 트랜스제닉 변이체가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 세포주는 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 다양한 공급처로부터 입수가능하다 (예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, ATCC) (버지니아주 마나사스) 참고).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포를 사용하여, 하나 이상의 벡터-유래된 서열을 포함하는 새로운 세포주를 확립한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CRISPR 시스템 또는 데아미나제 또는 그의 융합체의 성분으로 일시적으로 형질감염되고 (예컨대 하나 이상의 벡터의 일시적인 형질감염, 또는 RNA로의 형질감염에 의해), CRISPR 복합체 또는 데아미나제의 활성을 통해 변형된 세포를 사용하여, 변형을 함유하지만 임의의 다른 외인성 서열이 결여된 세포를 포함하는 새로운 세포주를 확립한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 벡터에 의해 일시적으로 또는 비-일시적으로 형질감염된 세포, 또는 이러한 세포로부터 유래된 세포주는 하나 이상의 시험 화합물을 평가하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 벡터를 사용하여, 비-인간 트랜스제닉 동물 또는 트랜스제닉 식물을 생성한다. 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 동물은 포유동물, 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼이다. 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 인간 세포를 생성한다.
V. 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 변이체 및 단편
본 개시내용은 그의 아미노산 서열이 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43, 50, 374-545, 572-590 및 그의 활성 변이체에 제시된 천연 발생 (즉, 야생형) RNA-가이드된 뉴클레아제 및 데아미나제의 활성 변이체 및 단편, 뿐만 아니라 천연 발생 CRISPR 반복부, 예컨대 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63에 제시된 서열의 활성 변이체 및 단편, 및 천연 발생 tracrRNA, 예컨대 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62에 제시된 서열의 활성 변이체 및 단편, 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 데아미나제, 예컨대 서열식별번호: 374-545 및 572-584에 제시된 서열의 활성 변이체 및 단편이 제공된다.
변이체 또는 단편의 활성이 관심 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 비해 변경될 수 있지만, 변이체 및 단편은 관심 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 기능을 보유해야 한다. 예를 들어, 변이체 또는 단편은 관심 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 비교하여 증가된 활성, 감소된 활성, 상이한 스펙트럼의 활성 또는 활성에서의 임의의 다른 변경을 가질 수 있다.
본원에 개시된 것과 같은 천연 발생 RGN 폴리펩티드의 단편 및 변이체는 서열-특이적인, RNA-가이드된 DNA-결합 활성을 보유할 것이다. 특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 것과 같은 천연 발생 RGN 폴리펩티드의 단편 및 변이체는 뉴클레아제 활성 (단일 가닥 또는 이중 가닥)을 보유할 것이다. 다른 실시양태에서, 천연 발생 데아미나제, 예컨대 본원에 개시된 것들의 단편 및 변이체는 데아미나제 활성을 보유할 것이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 변이체는 변경된 활성, 예를 들어 DNA 주형에 대한 활성, 또는 본래의 데아미나제와는 상이한 뉴클레오티드에 대한 활성, 예를 들어 아데노신에 대한 활성을 갖는다.
본원에 개시된 것과 같은 천연 발생 CRISPR 반복부의 단편 및 변이체는 (tracrRNA를 포함하는) 가이드 RNA의 일부일 때 (가이드 RNA와 복합체화된) RNA-가이드된 뉴클레아제에 결합하여 이를 서열-특이적인 방식으로 표적 뉴클레오티드 서열로 가이드하는 능력을 보유할 것이다.
본원에 개시된 것과 같은 천연 발생 tracrRNA의 단편 및 변이체는 (CRISPR RNA를 포함하는) 가이드 RNA의 일부일 때 (가이드 RNA와 복합체화된) RNA-가이드된 뉴클레아제를 서열-특이적인 방식으로 표적 뉴클레오티드 서열로 가이드하는 능력을 보유할 것이다.
용어 "단편"은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부분을 지칭한다. "단편" 또는 "생물학적으로 활성인 부분"에는 생물학적 활성을 보유하도록 (즉, 가이드RNA 내에 포함될 때 서열-특이적인 방식으로 RGN과 결합하여 이를 표적 뉴클레오티드 서열로 지시하도록) 충분한 개수의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. "단편" 또는 "생물학적으로 활성인 부분"에는 생물학적 활성을 보유하도록 (즉, 가이드 RNA와 복합체화될 때 서열-특이적인 방식으로 표적 뉴클레오티드 서열에 결합하도록) 충분한 개수의 연속 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드가 포함된다. RGN 단백질의 단편에는 대안적인 하류 시작 부위의 사용으로 인해 전장 서열보다 더 짧은 것들이 포함된다. RGN 단백질의 생물학적으로 활성인 부분은 예를 들어 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50의 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050개 또는 그 초과의 연속 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 생물학적으로 활성인 부분은 재조합 기술에 의해 제조되고 서열-특이적인 RNA-가이드된 DNA-결합 활성에 대해 평가될 수 있다. CRISPR 반복 서열의 생물학적으로 활성인 단편은 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63의 적어도 8개 연속 핵산을 포함할 수 있다. CRISPR 반복 서열의 생물학적으로 활성인 부분은 예를 들어 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63의 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. tracrRNA의 생물학적으로 활성인 부분은 예를 들어 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62의 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80개 또는 그 초과의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 데아미나제의 생물학적으로 활성인 부분은 예를 들어 서열식별번호: 374-545 및 572-584 중 어느 하나의 10, 25, 50, 100, 150, 200 또는 그 초과의 연속 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
일반적으로, "변이체"는 실질적으로 유사한 서열을 의미하는 것으로 의도된다. 폴리뉴클레오티드의 경우, 변이체는 본래의 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 내부 부위에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실 및/또는 부가, 및/또는 본래의 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상 부위에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "본래의" 또는 "야생형" 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 각각 천연 발생 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 경우, 보존적 변이체에는 유전자 코드의 축퇴성 때문에 관심 유전자의 본래의 아미노산 서열을 코딩하는 이들 서열이 포함된다. 이들과 같은 천연 발생 대립유전자 변이체는 널리 공지된 분자 생물학 기술, 예를 들어 하기에서 설명되는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 혼성화 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 변이체 폴리뉴클레오티드에는 또한 합성에 의해 유래된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 부위-지정된 돌연변이 유발을 이용하여 생성되었지만 관심 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 여전히 코딩하는 것들이 포함된다. 일반적으로, 본원에 개시된 특정한 폴리뉴클레오티드의 변이체는 본원에 기재된 서열 정렬 프로그램 및 파라미터에 의해 결정시 특정한 해당 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 가질 것이다.
본원에 개시된 특정한 폴리뉴클레오티드 (즉, 기준 폴리뉴클레오티드)의 변이체는 또한 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드 및 기준 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드 사이의 퍼센트 서열 동일성을 비교함으로써 평가될 수 있다. 임의의 두 폴리펩티드 사이의 퍼센트 서열 동일성은 본원에 기재된 서열 정렬 프로그램 및 파라미터를 사용하여 계산될 수 있다. 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 임의의 주어진 쌍을 그들이 코딩하는 두 폴리펩티드에 의해 공유된 퍼센트 서열 동일성을 비교함으로써 평가하는 경우, 코딩된 두 폴리펩티드 사이의 퍼센트 서열 동일성은 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성이다.
특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 임의의 서열식별번호: 374-545 또는 572-584의 아미노산 서열과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 데아미나제 폴리펩티드를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 데아미나제는 임의의 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416, 420, 514 및 572-584의 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성인 아미노산 서열을 갖는다. 이들 실시양태의 일부에서, 변이체 데아미나제 폴리펩티드는 서열식별번호: 572-584 중 어느 하나와 특정한 수준의 서열 동일성을 가지며, 특이적인 아미노산 잔기는 모 서열로부터 변하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 572는 서열식별번호: 572의 위치 102에 상응하는 위치에서 리신, 위치 104에 상응하는 위치에서 티로신, 및 위치 106에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 574는 서열식별번호: 574의 위치 101에 상응하는 위치에서 글루탐산, 위치 103에 상응하는 위치에서 세린, 및 위치 105에 상응하는 위치에서 리신을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 575는 서열식별번호: 575의 위치 101에 상응하는 위치에서 리신, 위치 103에 상응하는 위치에서 류신, 및 위치 105에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 576은 서열식별번호: 576의 위치 105에 상응하는 위치에서 알라닌 및 위치 107에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 577은 서열식별번호: 577의 위치 102에 상응하는 위치에서 글리신, 위치 104에 상응하는 위치에서 세린, 및 위치 106에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 578은 서열식별번호: 578의 위치 105에 상응하는 위치에서 세린 및 위치 107에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 579는 서열식별번호: 579의 위치 102에 상응하는 위치에서 세린, 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 및 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 580은 서열식별번호: 580의 위치 111에 상응하는 위치에서 글리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 581은 서열식별번호: 581의 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신, 및 위치 108에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 582는 서열식별번호: 582의 위치 102에 상응하는 위치에서 아르기닌, 위치 104에 상응하는 위치에서 트립토판, 및 위치 106에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 583은 서열식별번호: 583의 위치 104에 상응하는 위치에서 아르기닌 및 위치 106에 상응하는 위치에서 세린을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 584는 서열식별번호: 584의 위치 110에 상응하는 위치에서 페닐알라닌, 위치 112에 상응하는 위치에서 세린, 및 위치 114에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다.
본 발명의 데아미나제 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 변이체는 적게는 약 1-15개 아미노산 잔기, 적게는 약 1-10개, 예컨대 약 6-10개, 적게는 5개, 적게는 4개, 적게는 3개, 적게는 2개 또는 적게는 1개 아미노산 잔기만큼 상이할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드는 N-말단 또는 C-말단 절단을 포함할 수 있으며, 이는 폴리펩티드의 N 또는 C 말단으로부터 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050개 아미노산 또는 그 초과의 결실을 포함할 수 있다.
다른 특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50의 아미노산 서열과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명의 RGN 또는 데아미나제 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 변이체는 적게는 약 1-15개 아미노산 잔기, 적게는 약 1-10개, 예컨대 약 6-10개, 적게는 5개, 적게는 4개, 적게는 3개, 적게는 2개 또는 적게는 1개 아미노산 잔기만큼 상이할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드는 N-말단 또는 C-말단 절단을 포함할 수 있으며, 이는 폴리펩티드의 N 또는 C 말단으로부터 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050개 아미노산 또는 그 초과의 결실을 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CRISPR 반복부를 포함하거나 또는 코딩한다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 tracrRNA를 포함하거나 또는 코딩할 수 있다.
본 발명의 CRISPR 반복부 또는 tracrRNA의 생물학적으로 활성인 변이체는 적게는 약 1-25개 뉴클레오티드, 적게는 약 1-20개, 적게는 약 1-10개, 적게는 약 6-10개, 적게는 5개, 적게는 4개, 적게는 3개, 적게는 2개 또는 적게는 1개 뉴클레오티드만큼 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 또는 3' 말단 절단을 포함할 수 있고, 이는 폴리뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단으로부터 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80개 뉴클레오티드 또는 그 초과의 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR 반복부 또는 tracrRNA는 뉴클레오티드의 결실 및/또는 삽입 둘 다에 의해 및 또한 돌연변이 또는 치환에 의해 변경될 수 있다.
변이체 단백질 및 폴리뉴클레오티드를 생성하는 본원에 제공된 RGN 폴리펩티드, DNA-결합 폴리펩티드-데아미나제 융합 폴리펩티드, 데아미나제 폴리펩티드, CRISPR 반복부 및 tracrRNA에 대해 변형이 이루어질 수 있음을 인지한다. 인위적으로 설계된 변화는 부위-지정된 돌연변이 유발 기술의 적용을 통해 도입될 수 있다. 대안적으로, 본원에 개시된 서열과 구조적으로 및/또는 기능적으로 관련이 있는 아직 공지되지 않거나 또는 아직 확인되지 않은 본래의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드 또한 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 확인될 수 있다. 보존적 아미노산 치환이 RGN 또는 데아미나제 단백질의 기능을 변경시키지 않는 비보존된 영역에서 이루어질 수 있다. 대안적으로, RGN 또는 데아미나제의 활성을 개선시키거나 또는 변경시키는 변형이 이루어질 수 있다.
변이체 폴리뉴클레오티드 및 단백질은 또한 돌연변이 유발 및 재조합 유발 절차, 예컨대 DNA 셔플링으로부터 유래된 서열 및 단백질을 포함한다. 이러한 절차에 의해, 본원에 개시된 하나 이상의 상이한 RGN 또는 데아미나제 단백질 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43, 50, 374-545 및 572-584)은 원하는 성질을 갖는 새로운 RGN 또는 데아미나제 단백질을 생성하도록 조작된다. 이러한 방식으로, 실질적인 서열 동일성을 갖는 서열 영역을 포함하는 관련된 서열 폴리뉴클레오티드의 집단으로부터 재조합 폴리뉴클레오티드의 라이브러리가 생성되고, 시험관내 또는 생체내에서 상동성 재조합될 수 있다. 예를 들어, 이 접근법을 이용하여, 관심 도메인을 코딩하는 서열 모티프가 본원에 제공된 RGN 서열 및 다른 공지된 RGN 유전자 사이에서 셔플링되어, 개선된 관심 성질, 예컨대 효소의 경우 증가된 Km을 갖는 단백질을 코딩하는 새로운 유전자를 수득할 수 있다. 본원에 제공된 데아미나제는 또한 유사한 전략에서 셔플링될 수 있다. 이러한 DNA 셔플링을 위한 전략은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, [Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291]; 및 미국 특허 번호 5,605,793 및 5,837,458을 참고한다. "셔플링된" 핵산은 셔플링 절차, 예컨대 본원에 제시된 임의의 셔플링 절차에 의해 생성되는 핵산이다. 셔플링된 핵산은 예를 들어 인공적인, 임의적으로 재귀적인 방식으로 2가지 이상의 핵산 (또는 문자열)을 (물리적으로 또는 가상으로) 재조합함으로써 생성된다. 일반적으로, 하나 이상의 스크리닝 단계를 셔플링 과정에서 이용하여 관심 핵산을 확인하고; 이 스크리닝 단계는 임의의 재조합 단계 이전에 또는 이후에 수행될 수 있다. 일부 (그러나 전부는 아님) 셔플링 실시양태에서, 스크리닝될 풀의 다양성을 증가시키기 위해 선택 이전에 다중 라운드의 재조합을 수행하는 것이 바람직하다. 재조합 및 선택의 전체 과정을 임의적으로 재귀적으로 반복한다. 문맥에 따라, 셔플링은 재조합 및 선택의 전체 과정을 지칭할 수 있거나, 또는 대안적으로 전체 과정 중 재조합 부분을 간단히 지칭할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 범위에 걸쳐 최대 대응을 위해 정렬될 때 동일한 두 서열의 잔기를 지칭한다. 서열 동일성의 백분율이 단백질과 관련하여 사용될 때, 동일하지 않은 잔기 위치는 종종 보존적 아미노산 치환에 의해 상이한 것으로 인지되며, 여기서 아미노산 잔기는 유사한 화학적 성질 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 따라서 분자의 기능적 성질이 변하지 않는다. 서열이 보존적 치환에서 상이할 때, 퍼센트 서열 동일성은 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는다고 한다. 이러한 조정을 위한 수단은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 전형적으로 이는 전체가 아니라 부분 미스매치로서 보존적 치환을 평점하여, 서열 동일성 백분율을 증가시킨다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산에 1의 점수가 주어지고, 비-보존적 치환에 0의 점수가 주어지는 경우, 보존적 치환에는 0 내지 1의 점수가 주어진다. 보존적 치환의 평점은 예를 들어 프로그램 PC/GENE (인텔리제네틱스(Intelligenetics), 캘리포니아주 마운틴뷰)에서 구현되는 바와 같이 계산된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "서열 동일성 백분율"은 비교 범위에 걸쳐 최적으로 정렬된 두 서열을 비교함으로써 결정된 값을 의미하며, 비교 범위에서 폴리뉴클레오티드 서열의 일부분은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 기준 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 매칭된 위치의 개수를 수득하기 위해 두 서열에서 발생하는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기의 위치의 개수를 결정하고, 매칭된 위치의 개수를 비교 범위의 총 위치의 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 수득함으로써 계산된다.
달리 명시되지 않는다면, 본원에 제공된 서열 동일성/유사성 값은 하기 파라미터를 사용하여 GAP 버전 10을 사용하여 수득한 값을 지칭한다: 50의 GAP 가중치 및 3의 길이 가중치, 및 nwsgapdna.cmp 평점 행렬을 사용하는 뉴클레오티드 서열에 대한 % 동일성 및 % 유사성; 8의 GAP 가중치 및 2의 길이 가중치, 및 BLOSUM62 평점 행렬을 사용하는 아미노산 서열에 대한 % 동일성 및 % 유사성; 또는 그의 임의의 등가의 프로그램. "등가의 프로그램"은, GAP 버전 10에 의해 생성된 상응하는 정렬과 비교할 때, 해당하는 임의의 두 서열에 대해, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 매치 및 동일한 퍼센트 서열 동일성을 갖는 정렬을 생성하는 임의의 서열 비교 프로그램을 의미한다.
해당 서열 쌍에 대해 가능한 가장 높은 점수에 도달하도록 정의된 아미노산 치환 행렬 (예를 들어, BLOSUM62), 갭 존재 패널티 및 갭 확장 패널티를 이용하는 유사성 평점을 위해 두 서열이 정렬될 때, 이들은 "최적으로 정렬된" 것이다. 아미노산 치환 행렬, 및 두 서열 사이의 유사성을 정량화하는데 있어서 그들의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 [Dayhoff et al. (1978) "A model of evolutionary change in proteins." In "Atlas of Protein Sequence and Structure," Vol. 5, Suppl. 3 (ed. M. O. Dayhoff), pp. 345-352. Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C. and Henikoff et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919]에 기재되어 있다. BLOSUM62 행렬은 종종 서열 정렬 프로토콜에서 디폴트 평점 치환 행렬로서 사용된다. 갭 존재 패널티는 정렬된 서열 중 하나에서 단일 아미노산 갭의 도입에 대해 부과되고, 갭 확장 패널티는 이미 개방된 갭에 삽입된 각각의 추가의 빈 아미노산 위치에 대해 부과된다. 정렬은 정렬이 시작되고 끝나는 각각의 서열의 아미노산 위치에 의해, 임의적으로 가능한 가장 높은 점수에 도달하도록 하나의 서열 또는 두 서열 모두에서 하나의 갭 또는 다중 갭의 삽입에 의해 정의된다. 최적의 정렬 및 평점은 수동으로 달성될 수 있지만, 상기 과정은 컴퓨터-실행된 정렬 알고리즘, 예를 들어 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재되고 생명공학 정보 웹사이트 국제 센터(National Center for Biotechnology Information Website (www.ncbi.nlm.nih.gov))에서 공개적으로 입수가능한 갭이 있는 BLAST 2.0의 사용에 의해 용이해진다. 다중 정렬을 비롯하여 최적의 정렬은 예를 들어 www.ncbi.nlm.nih.gov로부터 입수가능하고 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 PSI-BLAST를 이용하여 제조될 수 있다.
기준 서열에 대해 최적으로 정렬된 아미노산 서열과 관련하여, 아미노산 잔기는 정렬에서 잔기가 쌍을 형성한 기준 서열의 위치에 "상응한다". "위치"는 N-말단에 대한 그의 위치를 기반으로 하여 기준 서열에서 각각의 아미노산을 순차적으로 식별하는 번호로 표시된다. 최적의 정렬을 결정할 때 고려되어야 하는 결실, 삽입, 말단 절단, 융합 등으로 인해, 일반적으로 N-말단으로부터 간단히 카운팅함으로써 결정되는 시험 서열에서의 아미노산 잔기 개수는 기준 서열에서 그의 상응하는 위치의 번호와 반드시 동일하지는 않을 것이다. 예를 들어, 정렬된 시험 서열에서 결실이 있는 경우, 결실 부위에서는 기준 서열에서의 위치에 상응하는 아미노산이 없을 것이다. 정렬된 기준 서열에서 삽입이 있는 경우, 해당 삽입은 기준 서열에서 임의의 아미노산 위치에 상응하지 않을 것이다. 말단 절단 또는 융합의 경우, 상응하는 서열에서 임의의 아미노산에 상응하지 않는 기준 또는 정렬된 서열에서의 아미노산 스트레치가 있을 수 있다.
VI. 항체
서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43, 50, 374-545 및 572-584에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것들 또는 그의 활성 변이체 또는 단편을 비롯하여 RGN 폴리펩티드, 본 발명의 RGN 폴리펩티드를 포함하는 리보핵단백질, 데아미나제, 또는 DNA-결합 데아미나제 융합 단백질에 대한 항체 또한 포함된다. 항체의 생성 방법 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.]; 및 미국 특허 번호 4,196,265 참고). 이들 항체는 RGN 폴리펩티드 또는 리보핵단백질의 검출 및 단리를 위한 키트에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 리보핵단백질, 예를 들어 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43, 50, 374-545 및 572-584 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 키트를 제공한다.
VII. 관심 표적 서열의 결합을 위한 시스템 및 리보핵단백질 복합체, 및 이를 제조하는 방법
본 개시내용은 관심 표적 서열의 결합을 위한 시스템을 제공하고, 상기 시스템은 적어도 하나의 가이드 RNA 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 적어도 하나의 RNA-가이드된 뉴클레아제 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 가이드 RNA는 관심 표적 서열과 혼성화하고, 또한 RGN 폴리펩티드와 복합체를 형성하여, RGN 폴리펩티드가 표적 서열과 결합하도록 지시한다. 이들 일부 실시양태에서, RGN은 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50의 아미노산 서열, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 가이드 RNA는 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CRISPR 반복 서열, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 가이드 RNA는 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 tracrRNA, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편을 포함한다. 상기 시스템의 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA 또는 이중-가이드 RNA일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 시스템은 가이드RNA에 대해 이종성인 RNA-가이드된 뉴클레아제를 포함하고, RGN 및 가이드RNA는 원래 자연적으로 복합체화되지 않는다.
본 개시내용은 또한 핵산 서열에 대해 표적화하고 표적 핵산 서열을 변형시키는 시스템을 제공한다. RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드, 예컨대 RGN, 및 gRNA는 리보핵폴리펩티드 복합체를 관심 핵산 서열로 표적화시키는 것을 담당하고; 데아미나제 폴리펩티드는 표적화된 핵산 서열을 변형시키는 것을 담당한다. 가이드 RNA는 관심 표적 서열과 혼성화하고, 또한 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드와 복합체를 형성하여, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드가 표적 서열에 결합하도록 지시한다. RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드는 융합 단백질의 한 도메인이고; 다른 도메인은 본원에 기재된 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드는 RGN, 예컨대 Cas9이다. 추가의 실시양태에서, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드는 서열식별번호: 568, 569, 547, 553의 아미노산 서열, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편을 포함한다. RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드의 다른 예에는 RGN, 예컨대 미국 특허 출원 번호 16/432,321 (그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 것들이 포함된다. 일부 실시양태에서, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드는 유형 II CRISPR-Cas 폴리펩티드, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편이다. 일부 실시양태에서, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드는 유형 V CRISPR-Cas 폴리펩티드, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편이다. 다른 실시양태에서, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드는 유형 VI CRISPR-Cas 폴리펩티드이다. 다른 실시양태에서, 융합 단백질의 DNA-결합 도메인은 RNA 가이드, 예컨대 Zn 아연 뉴클레아제, TALEN, 또는 메가뉴클레아제 폴리펩티드를 필요로 하지 않으며, 각각의 뉴클레아제 활성은 불활성화되었다.
본원에 제공된 관심 표적 서열의 결합을 위한 시스템은 적어도 하나의 단백질에 결합된 RNA의 적어도 하나의 분자인 리보핵단백질 복합체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 리보핵단백질 복합체는 RNA 성분으로서 적어도 하나의 가이드 RNA 및 단백질 성분으로서 RNA-가이드된 뉴클레아제를 포함한다. 이러한 리보핵단백질 복합체는 RGN 폴리펩티드를 천연적으로 발현하고 관심 표적 서열에 대해 특이적인 특정한 가이드 RNA를 발현하도록 조작된 세포 또는 유기체로부터 정제될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 리보핵단백질 복합체는 RNA 성분으로서 적어도 하나의 가이드 RNA, 및 단백질 성분으로서 본 발명의 데아미나제 및 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 융합 단백질의 경우 또는 본 발명의 RGN의 경우, 리보핵단백질 복합체는 융합 단백질 (또는 본 발명의 RGN 단독) 및 가이드 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환되고 융합 단백질 (또는 본 발명의 RGN 단독) 및 가이드 RNA의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 배양된 세포 또는 유기체로부터 정제될 수 있다. 따라서, 본 발명의 RGN, 본 발명의 데아미나제, 본 발명의 RGN을 포함하는 리보핵단백질 복합체, 본 발명의 융합 단백질, 또는 융합 단백질 리보핵단백질 복합체를 제조하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 폴리펩티드 (일부 실시양태에서, 가이드 RNA)가 발현되는 조건하에서 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 일부 실시양태에서 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 배양하는 것을 포함한다. 이어서, 본 발명의 RGN, 본 발명의 RGN을 포함하는 리보핵단백질 복합체, 본 발명의 융합 단백질, 또는 융합 단백질 리보핵단백질 복합체를 배양된 세포의 용해물로부터 정제할 수 있다.
생물학적 샘플의 용해물로부터 본 발명의 RGN, 본 발명의 데아미나제, 본 발명의 RGN을 포함하는 리보핵단백질 복합체, 본 발명의 융합 단백질, 또는 융합 단백질 리보핵단백질 복합체를 정제하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 크기 배제 및/또는 친화도 크로마토그래피, 2D-PAGE, HPLC, 역상 크로마토그래피, 면역침전). 특정한 방법에서, 본 발명의 폴리펩티드는 재조합적으로 생성되고, 그의 정제에 도움이 되도록 정제 태그, 예컨대 비제한적으로 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토스 결합 단백질, 티오레독신 (TRX), 폴리(NANP), 직렬식 친화도 정제 (TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis (서열식별번호: 593), 10xHis (서열식별번호: 594), 비오틴 카르복실 담체 단백질 (BCCP), 및 칼모둘린을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 태그 부착된 폴리펩티드 또는 리보핵단백질 복합체는 고정된 금속 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제된다. 관련 기술분야에 공지된 다른 유사한 방법, 예컨대 다른 형태의 크로마토그래피 또는 예를 들어 면역침전을 단독으로 또는 조합하여 이용할 있음을 이해할 것이다.
"단리된" 또는 "정제된" 폴리펩티드, 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분은 그의 천연 발생 환경에서 발견되는 폴리펩티드에 일반적으로 동반되거나 또는 그와 상호작용하는 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는다. 따라서, 단리된 또는 정제된 폴리펩티드는 다른 세포 물질, 또는 재조합 기술에 의해 생성되는 경우 배양 배지를 실질적으로 함유하지 않거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는다. 세포 물질을 실질적으로 함유하지 않는 단백질에는 약 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% (건조 중량 기준) 미만의 오염 단백질을 갖는 단백질 제제가 포함된다. 본 발명의 단백질 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분이 재조합적으로 생성될 때, 최적으로 배양 배지는 약 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% (건조 중량 기준) 미만의 화학적 전구체 또는 관심 단백질이 아닌 화학물질을 나타낸다.
관심 표적 서열의 결합 및/또는 절단을 위해 본원에 제공된 특정한 방법은 시험관내 조립된 RGN 리보핵단백질 복합체의 사용을 수반한다. RGN 리보핵단백질 복합체의 시험관내 조립체는, RGN 폴리펩티드와 가이드 RNA의 결합을 가능하게 하는 조건하에서 RGN 폴리펩티드를 가이드 RNA와 접촉시키는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "접촉하다", "접촉하는", "접촉된"은 원하는 반응을 수행하는데 적합한 조건하에서 원하는 반응의 성분들을 함께 배치시키는 것을 지칭한다. RGN 폴리펩티드는 시험관내 번역을 통해 생성되거나 또는 화학적으로 합성된 생물학적 샘플, 세포 용해물 또는 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 가이드 RNA는 시험관내에서 전사되거나 또는 화학적으로 합성된 생물학적 샘플, 세포 용해물 또는 배양 배지로부터 정제될 수 있다. RGN 폴리펩티드 및 가이드 RNA는 RGN 리보핵단백질 복합체의 시험관내 조립을 가능하게 하도록 용액 (예를 들어, 완충된 식염수 용액)과 접촉할 수 있다.
VIII. 표적 서열의 결합, 절단 또는 변형 방법
본 개시내용은 관심 표적 뉴클레오티드 서열을 결합, 절단 및/또는 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 가이드 RNA 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 RGN 폴리펩티드 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시스템을 표적 서열, 또는 표적 서열을 포함하는 세포, 소기관 또는 배아에 전달하는 것을 포함한다. 이들 일부 실시양태에서, RGN은 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50의 아미노산 서열, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 가이드 RNA는 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CRISPR 반복 서열, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 가이드 RNA는 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 tracrRNA, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편을 포함한다. 시스템의 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA 또는 이중-가이드 RNA일 수 있다. 시스템의 RGN은 뉴클레아제 데드 RGN일 수 있거나, 닉카제 활성을 가질 수 있거나, 또는 융합 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 염기-편집 폴리펩티드, 예를 들어 시티딘 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제를 포함한다. 특정한 실시양태에서, RGN 및/또는 가이드 RNA는, RGN 및/또는 가이드 RNA (또는 RGN 및 가이드 RNA 중 적어도 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들))가 도입되는 세포, 소기관 또는 배아에 대해 이종성이다.
다른 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 가이드 RNA 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 데아미나제 및 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하는 시스템을 표적 서열, 또는 표적 서열을 포함하는 세포, 소기관 또는 배아에 전달하는 것을 포함한다. 이들 실시양태의 일부에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 374-545 또는 572-584의 아미노산 서열 중 어느 하나, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 표적 폴리뉴클레오티드를 본원에 개시된 데아미나제와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 표적 폴리뉴클레오티드를 데아미나제 도메인 및 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함한다. 이들 실시양태의 일부에서, 상기 방법은 DNA 분자를 (a) 데아미나제 도메인 및 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드, 예를 들어 뉴클레아제-불활성 RGN 도메인을 포함하는 융합 단백질; 및 (b) (a)의 융합 단백질을 DNA 가닥의 표적 뉴클레오티드 서열에 대해 표적화하는 gRNA와 접촉시키는 것을 포함하고; 뉴클레오티드 염기의 탈아미노화에 효과적인 양으로 및 그에 적합한 조건하에 DNA 분자를 융합 단백질 및 gRNA와 접촉시킨다. 데아미나제가 방법에서 사용되는 이들 실시양태의 일부에서, 데아미나제는 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416, 420, 514 및 572-584 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하며, 변이체는 임의의 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416, 420, 514 및 572-584의 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성인 아미노산 서열을 갖는다. 이들 실시양태의 일부에서, 변이체 데아미나제 폴리펩티드는 서열식별번호: 572-584 중 어느 하나와 특정 수준의 서열 동일성을 가지며, 구체적인 아미노산 잔기는 모 서열로부터 변하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 572는 서열식별번호: 572의 위치 102에 상응하는 위치에서 리신, 위치 104에 상응하는 위치에서 티로신, 및 위치 106에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 574는 서열식별번호: 574의 위치 101에 상응하는 위치에서 글루탐산, 위치 103에 상응하는 위치에서 세린, 및 위치 105에 상응하는 위치에서 리신을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 575는 서열식별번호: 575의 위치 101에 상응하는 위치에서 리신, 위치 103에 상응하는 위치에서 류신, 및 위치 105에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 576은 서열식별번호: 576의 위치 105에 상응하는 위치에서 알라닌 및 위치 107에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 577은 서열식별번호: 577의 위치 102에 상응하는 위치에서 글리신, 위치 104에 상응하는 위치에서 세린, 및 위치 106에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 578은 서열식별번호: 578의 위치 105에 상응하는 위치에서 세린 및 위치 107에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 579는 서열식별번호: 579의 위치 102에 상응하는 위치에서 세린, 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 및 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 580은 서열식별번호: 580의 위치 111에 상응하는 위치에서 글리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 581은 서열식별번호: 581의 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신, 및 위치 108에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 582는 서열식별번호: 582의 위치 102에 상응하는 위치에서 아르기닌, 위치 104에 상응하는 위치에서 트립토판, 및 위치 106에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 583은 서열식별번호: 583의 위치 104에 상응하는 위치에서 아르기닌 및 위치 106에 상응하는 위치에서 세린을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 변이체 서열식별번호: 584는 서열식별번호: 584의 위치 110에 상응하는 위치에서 페닐알라닌, 위치 112에 상응하는 위치에서 세린, 및 위치 114에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 DNA 분자를 (a) 데아미나제 도메인 및 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드, 예를 들어 뉴클레아제-불활성 RGN 도메인을 포함하는 융합 단백질; 및 (b) (a)의 융합 단백질을 DNA 가닥의 표적 뉴클레오티드 서열에 대해 표적화하는 gRNA와 접촉시키는 것을 포함하며; 뉴클레오티드 염기의 탈아미노화에 효과적인 양으로 및 그에 적합한 조건하에 DNA 분자를 융합 단백질 및 gRNA와 접촉시킨다. 일부 실시양태에서, 표적 DNA 서열은 질환 또는 장애와 연관된 서열을 포함하고, 뉴클레오티드 염기의 탈아미노화는 질환 또는 장애와 연관이 없는 서열을 생성한다. 일부 실시양태에서, 표적 DNA 서열은 농작물의 대립유전자에 존재하고, 관심 형질을 갖는 특정한 대립유전자는 더 낮은 농경학적 가치를 갖는 식물을 생성한다. 뉴클레오티드 염기의 탈아미노화는 식물의 형질을 개선하고 농경학적 가치를 증가시키는 대립유전자를 생성한다.
일부 실시양태에서, DNA 서열은 질환 또는 장애와 연관된 T→C 또는 A→G 점 돌연변이를 포함하고, 돌연변이성 C 또는 G 염기의 탈아미노화는 질환 또는 장애와 연관이 없는 서열을 생성한다. 일부 실시양태에서, 탈아미노화는 질환 또는 장애와 연관된 서열에서 점 돌연변이를 수정한다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 장애와 연관된 서열은 단백질을 코딩하고, 탈아미노화는 질환 또는 장애와 연관된 서열에 정지 코돈을 도입시켜, 코딩된 단백질을 말단 절단시킨다. 일부 실시양태에서, 접촉은 질환 또는 장애를 가진 것으로 의심되거나, 그를 갖거나 또는 그로 진단된 대상체에서 생체내에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 게놈에서 점 돌연변이 또는 단일-염기 돌연변이와 연관된 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 유전 질환, 암, 대사 질환, 또는 리소좀 저장 질환이다.
상기 방법이 가이드 RNA 및/또는 RGN 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명의 데아미나제 및 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 전달하는 것을 포함하는 것인 이들 실시양태에서, 세포 또는 배아는 가이드 RNA 및/또는 RGN 폴리펩티드가 발현되는 조건하에 배양될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 상기 방법은 표적 서열을 RGN 리보핵단백질 복합체와 접촉시키는 것을 포함한다. RGN 리보핵단백질 복합체는 뉴클레아제 데드이거나 또는 닉카제 활성을 갖는 RGN을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 리보핵단백질 복합체의 RGN은 염기-편집 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 개시된 데아미나제를 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 다른 실시양태에서, 리보핵단백질 복합체는 본 발명의 데아미나제 및 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 방법은 표적 서열을 포함하는 세포, 소기관 또는 배아에 RGN 리보핵단백질 복합체를 전달하는 것을 포함한다. RGN 리보핵단백질 복합체는 본원에 기재된 바와 같이 생물학적 샘플로부터 정제되고, 재조합적으로 생성되고, 후속적으로 정제되거나, 또는 시험관내에서 조립된 것일 수 있다. 표적 서열 또는 세포 소기관 또는 배아와 접촉하는 RGN 리보핵단백질 복합체가 시험관내에서 조립된 것인 이들 실시양태에서, 상기 방법은 표적 서열, 세포, 소기관 또는 배아와 접촉하기 전에 복합체의 시험관내 조립체를 추가로 포함할 수 있다.
정제된 또는 시험관내 조립된 RGN 리보핵단백질 복합체를 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 비제한적으로 전기천공을 이용하여 세포, 소기관 또는 배아에 도입시킬 수 있다. 대안적으로, RGN 폴리펩티드, 본 발명의 데아미나제 및 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, 및/또는 가이드 RNA를 코딩하거나 또는 포함하는 폴리뉴클레오티드를 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법 (예를 들어, 전기천공)을 이용하여 세포, 소기관 또는 배아에 도입시킬 수 있다.
표적 서열, 또는 표적 서열을 포함하는 세포, 소기관 또는 배아에 전달하거나 또는 그와 접촉시, 가이드 RNA는 RGN 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드가 서열-특이적인 방식으로 표적 서열과 결합하도록 지시한다. RGN이 뉴클레아제 활성을 갖는 것인 이들 실시양태에서, RGN 폴리펩티드는 결합시 관심 표적 서열을 절단한다. 표적 서열은 제공된 공여자 폴리뉴클레오티드에 의해 내인성 복구 메카니즘, 예컨대 비상동성 말단 결합, 또는 상동성-지정된 복구를 통해 후속적으로 변형될 수 있다.
RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드와 표적 서열의 결합을 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 염색질 면역침전 검정, 겔 이동성 변화 검정, DNA 풀다운 검정, 리포터 검정, 마이크로플레이트 포획 및 검출 검정이 포함된다. 마찬가지로, 표적 서열의 절단 또는 변형을 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 시험관내 또는 생체내 절단 검정이 포함되며, 절단은 분해 생성물의 검출을 용이하게 하기 위해 표적 서열에 적절한 표지 (예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 기질)를 부착시키거나 또는 부착시키지 않고 PCR, 시퀀싱, 또는 겔 전기영동에 의해 확인된다. 대안적으로, 닉킹 촉발된 지수적 증폭 반응 (NTEXPAR) 검정을 이용할 수 있다 (예를 들어, [Zhang et al. (2016) Chem. Sci. 7:4951-4957] 참고). 생체내 절단은 서베이어(Surveyor) 검정을 이용하여 평가될 수 있다 (Guschin et al. (2010) Methods Mol Biol 649:247-256).
일부 실시양태에서, 상기 방법은 1개 초과의 가이드 RNA와 복합체화된 단일 유형의 RGN의 사용을 수반한다. 1개 초과의 가이드 RNA는 단일 유전자의 상이한 영역을 표적화할 수 있거나 또는 다중 유전자를 표적화할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 융합 단백질의 일부로서 1개 초과의 가이드 RNA와 복합체화된 단일 유형의 RNA-결합 DNA-가이드된 도메인의 사용을 수반한다. 이러한 다중 표적화는 융합 단백질의 데아미나제 도메인이 핵산을 변형시킬 수 있게 하여, 관심 게놈에서 다중 돌연변이를 도입시킨다.
공여자 폴리뉴클레오티드가 제공되지 않는 것인 이들 실시양태에서, RGN 폴리펩티드에 의해 도입된 이중 가닥 파손은 비상동성 말단-연결 (NHEJ) 복구 과정에 의해 복구될 수 있다. NHEJ의 오류가 발생하기 쉬운 성질 때문에, 이중 가닥 파손의 복구는 표적 서열에 대해 변형을 일으킬 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 분자와 관련하여 "변형"은 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열에서의 변화를 지칭하고, 이는 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 치환, 또는 이들의 조합일 수 있다. 표적 서열의 변형은 변경된 단백질 생성물의 발현 또는 코딩 서열의 불활성화를 일으킬 수 있다.
공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하는 이들 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드의 공여자 서열은 도입된 이중 가닥 파손의 복구 과정 동안에 표적 뉴클레오티드 서열에 통합되거나 또는 그와 교환되어, 외인성 공여자 서열의 도입을 일으킬 수 있다. 따라서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 관심 표적 서열에 도입되는 것을 원하는 공여자 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공여자 서열은 새로 통합된 공여자 서열이 RGN에 의해 인식 및 절단되지 않도록 원래의 표적 뉴클레오티드 서열을 변경시킨다. 공여자 서열의 통합은 표적 뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 플랭킹 서열을 갖는 공여자 폴리뉴클레오티드 내에 포함시킴으로써 증강될 수 있으며, 이는 상동성-지정된 복구 과정을 가능하게 한다. RGN 폴리펩티드가 이중 가닥 엇갈린 파손을 도입하는 것인 이들 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 상용성 오버행에 의해 플랭킹된 공여자 서열을 포함할 수 있으며, 이는 이중 가닥 파손의 복구 동안에 비상동성 복구 과정에 의해 오버행을 포함하는 절단된 표적 뉴클레오티드 서열로의 공여자 서열의 직접적인 라이게이션을 가능하게 한다.
상기 방법이 닉카제인 (즉, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 단일 가닥만을 절단하는) 본 발명의 RGN의 사용을 수반하는 것인 이들 실시양태에서, 상기 방법은 동일한 또는 중복되는 표적 서열을 표적화하고 폴리뉴클레오티드의 상이한 가닥을 절단하는 2개의 RGN 닉카제를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 양성 (+) 가닥만을 절단하는 RGN 닉카제는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 음성 (-) 가닥만을 절단하는 제2 RGN 닉카제와 함께 도입될 수 있다. 유사하게, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본 발명의 데아미나제 및 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드, 예를 들어 및 RGN을 포함하는 융합 폴리펩티드의 사용을 수반하며, RGN은 닉카제 (예를 들어 서열식별번호: 569)이다.
다양한 실시양태에서, 표적 뉴클레오티드 서열과 결합시키고, 표적 서열을 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포, 소기관 또는 배아에 적어도 하나의 가이드 RNA 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 RGN 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입시키고, 가이드 RNA 및/또는 RGN 폴리펩티드 (코딩 서열이 도입된 경우)를 발현시키는 것을 포함하고, RGN 폴리펩티드는 뉴클레아제-데드 RGN이고 검출가능한 표지를 추가로 포함하며, 상기 방법은 검출가능한 표지를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 검출가능한 표지는 융합 단백질 (예를 들어, 형광 단백질)로서 RGN에 융합될 수 있거나, 또는 시각적으로 또는 다른 수단에 의해 검출될 수 있는 RGN 폴리펩티드에 접합되거나 또는 그 안에 혼입된 소분자일 수 있다.
표적 서열의 조절하에 표적 서열 또는 관심 유전자의 발현을 조절하는 방법 또한 본원에 제공된다. 상기 방법은 세포, 소기관 또는 배아에 적어도 하나의 가이드 RNA 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 RGN 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입시키고, 가이드 RNA 및/또는 RGN 폴리펩티드 (코딩 서열이 도입된 경우)를 발현시키는 것을 포함하고, RGN 폴리펩티드는 뉴클레아제-데드 RGN이다. 이들 일부 실시양태에서, 뉴클레아제-데드 RGN은 본원에 기재된 발현 조절인자 도메인 (즉, 후성적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인 또는 전사 리프레서 도메인)을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제-데드 RGN은 본원에 기재된 데아미나제를 포함하는 융합 단백질이다.
본 개시내용은 또한 관심 표적 뉴클레오티드 서열의 결합 및/또는 변형을 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 적어도 하나의 가이드 RNA 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 RGN 및 염기-편집 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 데아미나제를 포함하는 적어도 하나의 융합 폴리펩티드, 또는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시스템을 표적 서열, 또는 표적 서열을 포함하는 세포, 소기관 또는 배아에 전달하는 것을 포함한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 임의의 방법을 이용하여 단일 표적 서열 또는 다중 표적 서열을 표적화할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 상기 방법은 단일 유전자 내의 다중의 별개의 서열 및/또는 다중 유전자를 표적화할 수 있는 다중의 별개의 가이드 RNA와 조합하여 단일 RGN 폴리펩티드를 사용하는 것을 포함한다. 다중의 별개의 가이드 RNA를 다중의 별개의 RGN 폴리펩티드와 조합하여 도입하는 방법 또한 본원에 포함된다. 이들 가이드 RNA 및 가이드 RNA/RGN 폴리펩티드 시스템은 단일 유전자 내의 다중의 별개의 서열 및/또는 다중 유전자를 표적화할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 방법 및 조성물에 개시된 임의의 하나 이상의 요소를 함유하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 벡터 시스템, 및 키트의 사용에 대한 지침서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터 시스템은 (a) tracr 메이트 서열, 및 tracr 메이트 서열의 상류에 가이드 서열을 삽입하기 위한 하나 이상의 삽입 부위에 작동가능하게 연결된 제1 조절 요소, 여기서 가이드 서열은 발현될 때 CRISPR 복합체와 진핵생물 세포의 표적 서열의 서열-특이적인 결합을 지시하고, 여기서 CRISPR 복합체는 (1) 표적 서열과 혼성화된 가이드 서열, 및 (2) tracr 서열과 혼성화된 트레이스 메이트 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함함; 및/또는 (b) 핵 국재화 서열을 포함하는 상기 CRISPR 효소를 코딩하는 효소 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제2 조절 요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드, 예컨대 RGN 폴리펩티드, 예를 들어 뉴클레아제-불활성 Cas9 도메인, 및 본 발명의 데아미나제, 및 임의적으로 Cas9 도메인과 데아미나제 사이에 위치하는 링커를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 또한, 일부 실시양태에서, 키트는 적합한 시약, 완충제 및/또는 예를 들어 시험관내 또는 생체내 DNA 또는 RNA 편집을 위해 융합 단백질의 사용에 대한 지침서를 포함한다. 요소들은 개별적으로 또는 조합으로 제공될 수 있고, 임의의 적합한 용기, 예컨대 바이알, 보틀 또는 튜브에 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 핵산 서열의 표적화된 편집에 적합한 gRNA의 설계 및 사용에 관한 지침서를 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 1가지 이상의 언어로 된 지침서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 요소 중 하나 이상을 이용하는 과정에서 사용하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 시약은 임의의 적합한 용기에 제공될 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나 이상의 반응 또는 보관 완충제를 제공할 수 있다. 시약은 특정한 검정에서 이용가능한 형태로, 또는 사용하기 전에 하나 이상의 다른 성분의 첨가를 필요로 하는 형태로 (예를 들어 농축물 또는 동결건조된 형태로) 제공될 수 있다. 완충제는 임의의 완충제, 예컨대 비제한적으로 탄산나트륨 완충제, 중탄산나트륨 완충제, 붕산염 완충제, Tris 완충제, MOPS 완충제, HEPES 완충제, 및 이들의 조합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 완충제는 알칼리성이다. 일부 실시양태에서, 완충제는 약 7 내지 약 10의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 키트는 가이드 서열 및 조절 요소와 작동가능하게 연결하기 위해 벡터에 삽입하기 위한 가이드 서열에 상응하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 상동성 재조합 주형 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 본 발명은 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 CRISPR 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는데 효과적인 수단을 제공한다. 본 발명의 CRISPR 복합체는 다양한 세포 유형에서 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 (예를 들어, 결실, 삽입, 전좌, 불활성화, 활성화) 것을 비롯하여 다양한 유용성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 CRISPR 복합체는 예를 들어 유전자 요법, 약물 스크리닝, 질환 진단, 및 예후에서 광범위한 적용을 갖는다. 예시적인 CRISPR 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열과 혼성화된 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함한다.
VIII. 표적 폴리뉴클레오티드
한 측면에서, 본 발명은 진핵생물 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법을 제공하며, 이는 생체내, 생체외 또는 시험관내일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 인간 또는 비-인간 동물 또는 식물 (예컨대 미세조류)로부터 세포 또는 세포 집단을 샘플링하고, 세포 또는 세포들을 변형시키는 것을 포함한다. 배양은 임의의 생체외 단계에서 일어날 수 있다. 세포 또는 세포들은 심지어 비-인간 동물 또는 식물 (예컨대 미세조류)에 재도입될 수 있다.
자연적인 가변성을 이용하여, 식물 재배자는 바람직한 특성, 예컨대 수율, 품질, 균일성, 강도 및 해충에 대한 내성에 대해 가장 유용한 유전자들을 조합한다. 이들 바람직한 특성에는 성장, 광주기 선호도, 온도 요건, 꽃 또는 번식 발달의 개시일, 지방산 함량, 곤충 내성, 질환 내성, 선충 내성, 진균 내성, 제초제 내성, 다양한 환경 인자, 예컨대 가뭄, 열, 습기, 추위, 바람, 및 고염도를 비롯한 불리한 토양 조건에 대한 내성이 포함된다. 이들 유용한 유전자의 공급원에는 본래 또는 외래 품종, 가보(heirloom) 품종, 야생 식물 동족, 및 유도된 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 유발제로 처리된 식물 물질이 포함된다. 본 발명을 이용하여, 식물 재배자는 돌연변이를 유도하는 새로운 도구를 제공한다. 따라서, 관련 기술분야의 기술자는 유용한 유전자의 공급원에 대한 게놈을 분석할 수 있고, 원하는 특징 또는 특성을 갖는 품종에서 본 발명을 이용하여 이전의 돌연변이 유발제에 비해 더욱 정밀하게 유용한 유전자의 증가를 유도할 수 있고, 따라서 식물 재배 프로그램을 가속화 및 개선시킬 수 있다.
RGN 시스템의 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵생물 세포에 대해 내인성 또는 외인성인 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵생물 세포의 핵에 존재하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 유전자 생성물 (예를 들어, 단백질)을 코딩하는 서열 또는 비-코딩 서열 (예를 들어, 조절 폴리뉴클레오티드 또는 정크 DNA)일 수 있다. 이론에 구애되기를 바라지 않지만, 표적 서열이 PAM (프로토스페이서 인접한 모티프); 즉, CRISPR 복합체에 의해 인식되는 짧은 서열과 회합되어야 하는 것으로 믿어진다. PAM에 대한 정확한 서열 및 길이 요건은 사용된 CRISPR 효소에 따라 다르지만, PAM은 전형적으로 프로토스페이서 (즉, 표적 서열)에 인접한 2-5개 염기쌍 서열이다.
CRISPR 복합체의 표적 폴리뉴클레오티드는 수많은 질환-연관된 유전자 및 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 신호전달 생화학적 경로-연관된 유전자 및 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드의 예에는 신호전달 생화학적 경로와 연관된 서열, 예를 들어 신호전달 생화학적 경로-연관된 유전자 또는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 표적 폴리뉴클레오티드의 예에는 질환 연관된 유전자 또는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. "질환-연관된" 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는, 비-질환 대조군의 조직 또는 세포와 비교하여 질환-발병 조직으로부터 유래된 세포에서 전사 또는 번역 생성물을 비정상적인 수준으로 또는 비정상적인 형태로 생성하는 임의의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이는 비정상적으로 높은 수준으로 발현되는 유전자일 수 있고; 이는 비정상적으로 낮은 수준으로 발현되는 유전자일 수 있고, 변경된 발현은 질환의 발병 및/또는 진행과 상관관계가 있다. 질환-연관된 유전자는 또한 질환의 병인 (예를 들어, 원인 돌연변이)의 원인이 되는 유전자(들)에 직접적인 책임이 있거나 또는 그들과 연결 불균형 상태에 있는 돌연변이(들)를 보유하는 유전자 또는 유전자 변이를 지칭한다. 전사된 또는 번역된 생성물은 공지되어 있거나 또는 공지되어 있지 않을 수 있고, 추가로 정상 또는 비정상 수준일 수 있다. 질환-연관된 유전자 및 폴리뉴클레오티드의 예는 월드 와이드 웹(World Wide Web)으로 이용가능한 맥쿠식-나탄 인스티튜트 오브 제네틱 메디신, 존스 홉킨스 유니버시티(McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University, 메릴랜드주 볼티모어) 및 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션, 내셔널 라이브러리 오브 메디신(National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, 메릴랜드주 베데스다)으로부터 입수할 수 있다.
CRISPR 시스템이 관심 게놈 서열로의 표적화에서 비교적 용이하다는 점에서 특히 유용하지만, RGN이 원인 돌연변이를 해결할 수 있는 것에 대한 문제가 여전히 남아 있다. 한 접근법은 RGN (바람직하게는 RGN의 불활성 또는 닉카제 변이체)과 염기-편집 효소 또는 염기 편집 효소의 활성 도메인, 예컨대 시티딘 데아미나제 또는 아데노신 데아미나제 염기 편집기 사이의 융합 단백질을 생성하는 것이다 (미국 특허 번호 9,840, 699, 본원에 참고로 포함됨). 일부 실시양태에서, 상기 방법은 DNA 분자를 (a) 본 발명의 RGN 및 염기-편집 폴리펩티드, 예컨대 데아미나제를 포함하는 융합 단백질; 및 (b) (a)의 융합 단백질을 DNA 가닥의 표적 뉴클레오티드 서열로 표적화하는 gRNA와 접촉시키는 것을 포함하며; 뉴클레오티드 염기를 탈아미노화시키는데 효과적인 양으로 및 그에 적합한 조건하에 DNA 분자를 융합 단백질 및 gRNA와 접촉시킨다. 일부 실시양태에서, 표적 DNA 서열은 질환 또는 장애와 연관된 서열을 포함하고, 뉴클레오티드 염기의 탈아미노화는 질환 또는 장애와 연관이 없는 서열을 생성한다. 일부 실시양태에서, 표적 DNA 서열은 농작물의 대립유전자에 존재하고, 관심 특성을 갖는 특정한 대립유전자는 더 적은 농경학적 가치를 갖는 식물을 생성한다. 뉴클레오티드 염기의 탈아미노화는 식물의 특성을 개선시키고 농경학적 가치를 증가시키는 대립유전자를 생성한다.
일부 실시양태에서, DNA 서열은 질환 또는 장애와 연관된 T→C 또는 A→G 점 돌연변이를 포함하며, 돌연변이성 C 또는 G 염기의 탈아미노화는 질환 또는 장애와 연관이 없는 서열을 생성한다. 일부 실시양태에서, 탈아미노화는 질환 또는 장애와 연관된 서열에서 점 돌연변이를 수정한다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 장애와 연관된 서열은 단백질을 코딩하고, 탈아미노화는 질환 또는 장애와 연관된 서열에 정지 코돈을 도입시켜, 코딩된 단백질의 말단 절단을 일으킨다. 일부 실시양태에서, 접촉은 질환 또는 장애를 갖기 쉬운, 갖고 있는 또는 가진 것으로 진단된 대상체의 생체 내에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 게놈에서 점 돌연변이 또는 단일-염기 돌연변이와 연관된 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 유전 질환, 암, 대사 질환, 또는 리소좀 저장 질환이다.
유전 질환의 원인이 되는 유전자좌, 특히 본 발명의 RGN 또는 RGN-염기 편집기 융합 단백질에 의해 용이하게 표적화될 수 있는 유전자좌의 추가의 예는 실시예 7 및 상응하는 표 8에서 확인할 수 있다.
헐러(Hurler) 증후군
본 발명의 RGN-염기 편집기 융합 단백질에 의존하는 접근법을 이용하여 수정될 수 있는 유전적으로 유전된 질환의 예는 헐러 증후군이다. MPS-1로도 공지된 헐러 증후군은 α-L-이두로니다제 (IDUA)의 결핍으로 인한 것이며, 리소좀에서 데르마탄 술페이트 및 헤파란 술페이트가 분자 수준으로 축적되는 것을 특징으로 하는 리소좀 저장 질환을 일으킨다. 이 질환은 일반적으로 α-L-이두로니다제를 코딩하는 IDUA 유전자에서 돌연변이에 의해 유발된 유전적으로 유전된 장애이다. 일반적인 IDUA 돌연변이는 W402X 및 Q70X이며, 이들 둘 다 번역의 조기 종결을 일으키는 넌센스 돌연변이이다. 예를 들어 염기-편집 접근법에 의한 단일 뉴클레오티드의 복귀가 야생형 코딩 서열을 복구하고, 유전자좌의 내인성 조절 메카니즘에 의해 조절되는 단백질 발현을 일으키기 때문에, 이러한 돌연변이는 정밀한 게놈 편집 (PGE) 접근법에 의해 잘 해결된다. 추가로, 이형접합체가 무증상인 것으로 공지되어 있기 때문에, 돌연변이된 대립유전자 중 하나만을 수정하면 되므로, 이들 돌연변이 중 하나를 표적화하는 PGE 요법은 이 질환을 가진 많은 환자에게 유용할 것이다 ([Bunge et al. (1994) Hum. Mol. Genet. 3(6): 861-866], 본원에 참고로 포함됨).
헐러 증후군에 대한 현재의 치료에는 효소 대체 요법 및 골수 이식이 포함된다 ([Vellodi et al. (1997) Arch. Dis. Child. 76(2): 92-99; Peters et al. (1998) Blood 91(7): 2601-2608] 본원에 참고로 포함됨). 효소 대체 요법이 헐러 증후군 환자의 생존 및 삶의 질에 극적인 영향을 미쳤지만, 이 접근법은 고가이며 시간 소모적인 매주 주입을 필요로 한다. 추가의 접근법에는 발현 벡터 상의 IDUA 유전자의 전달 또는 혈청 알부민과 같이 고도로 발현된 유전자좌로의 유전자의 삽입이 포함된다 (미국 특허 번호 9,956,247, 본원에 참고로 포함됨). 그러나, 이들 접근법은 원래의 IDUA 유전자좌를 수정된 코딩 서열로 복구하지 않는다. 게놈-편집 전략은 수많은 이점을 가지며, 가장 주목할만하게는, 유전자 발현의 조절이 건강한 개체에서 존재하는 자연적인 메카니즘에 의해 조절된다는 것이다. 추가로, 염기 편집의 이용은 종양 억제 메카니즘의 방해에 의해 큰 염색체 재배열, 세포 사멸, 또는 종양 발생을 초래할 수 있는 이중 가닥 DNA 파손을 일으킬 필요가 없다. 이 질환의 원인 돌연변이를 수정하는 방법에 대한 가능한 설명은 실시예 8에 제공된다. 기재된 방법은 인간 게놈에서 특정 질환-유발 돌연변이를 표적화하고 수정하기 위해 본 발명의 RGN-염기 편집기 융합 단백질을 사용하는 것에 대한 일반적인 전략의 예이다. 표 8에 기재된 것과 같은 표적 질환에 대한 유사한 접근법 또한 추구될 수 있음을 이해할 것이다. 추가로, 다른 종, 특히 일반적인 가정 애완 동물 또는 가축에서 질환-유발 돌연변이를 표적화하는 유사한 접근법 또한 본 발명의 RGN을 사용하여 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 일반적인 가정 애완 동물 및 가축에는 개, 고양이, 말, 돼지, 소, 양, 닭, 당나귀, 뱀, 페럿, 어류, 예컨대 연어 및 새우가 포함된다.
프리드라이히(Friedreich) 운동실조
본 발명의 RGN은 또한 원인 돌연변이가 더욱 복잡한 인간 치료 접근법에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 프리드라이히 운동실조 및 헌팅턴(Huntington) 질환과 같은 일부 질환은 유전자의 특정한 영역에서 3개 뉴클레오티드 모티프의 반복부에서의 유의한 증가의 결과이며, 이는 발현된 단백질이 기능하고 발현되는 능력에 영향을 미친다. 프리드라이히 운동실조 (FRDA)는 척수에서 신경 조직의 진행성 퇴행을 일으키는 상염색체성 열성 질환이다. 미토콘드리아에서 프라탁신 (FXN) 단백질의 감소된 수준은 세포 수준에서 산화성 손상 및 철 결핍을 초래한다. 감소된 FXN 발현은 체세포 및 생식선 FXN 유전자에서 인트론 1 내의 GAA 삼중항 확장과 관련이 있었다. FRDA 환자에서, GAA 반복부는 종종 70개 초과, 때때로 심지어 1000개 초과 (가장 흔하게는 600-900개)의 삼중항으로 구성되는 반면에, 발병하지 않은 개체는 약 40개 이하의 반복부를 갖는다 ([Pandolfo et al. (2012) Handbook of Clinical Neurology 103: 275-294; Campuzano et al. (1996) Science 271: 1423-1427; Pandolfo (2002) Adv. Exp. Med. Biol. 516: 99-118]; 모두 본원에 참고로 포함됨).
프리드라이히 운동실조 (FRDA)를 초래하는 트리뉴클레오티드 반복 서열의 확장은 FRDA 불안정 영역으로 지칭되는 FXN 유전자 내의 정의된 유전자좌에서 발생한다. RNA 가이드된 뉴클레아제 (RGN)는 FRDA 환자 세포에서 불안정 영역을 절제하기 위해 사용될 수 있다. 이 접근법은 하기를 필요로 한다: 1) 인간 게놈에서 대립유전자를 표적화하도록 프로그래밍될 수 있는 RGN 및 가이드 RNA 서열; 및 2) RGN 및 가이드 서열에 대한 전달 접근법. 게놈 편집을 위해 사용되는 여러 뉴클레아제, 예컨대 흔히 사용되는 에스. 피로게네스(S. pyogenes)로부터의 Cas9 뉴클레아제 (SpCas9)는 본질적으로 기능적 발현 카세트를 위해 필요한 다른 유전자 요소 외에도 SpCas9 유전자 및 가이드 RNA의 길이를 고려할 때 너무 커서 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터에 팩키징되지 않는다. 이는 SpCas9를 사용하는 접근법을 더 어렵게 만든다.
본 발명의 조밀한 RNA 가이드된 뉴클레아제는 FRDA 불안정 영역의 절제에 매우 적합하다. 각각의 RGN은 FRDA 불안정 영역 근처에 있는 PAM 요건을 갖는다. 추가로, 이들 RGN 각각은 가이드 RNA와 함께 AAV 벡터에 팩키징될 수 있다. 2개의 가이드 RNA의 팩킹은 제2 벡터를 필요로 할 수 있지만, 이 접근법은 두 벡터 사이의 단백질 서열을 분할할 수 있는 더 큰 뉴클레아제, 예컨대 SpCas9에서 필요로 되는 것보다 여전히 유리하게 비교된다. 이 질환의 원인 돌연변이를 수정하는 방법에 대한 가능한 설명은 실시예 9에 제공된다. 기재된 방법은 게놈 불안정 영역을 제거하는 본 발명의 RGN을 이용하는 전략을 포함한다. 이러한 전략은 유사한 유전적 근거를 갖는 다른 질환 및 장애, 예컨대 헌팅턴 질환에 적용가능하다. 본 발명의 RGN을 이용하는 유사한 전략은 농경학적으로 또는 경제적으로 중요한 비-인간 동물, 예컨대 개, 고양이, 말, 돼지, 소, 양, 닭, 당나귀, 뱀, 페럿, 어류, 예컨대 연어 및 새우에서 유사한 질환 및 장애에 또한 적용가능하다.
혈색소병증
본 발명의 RGN은 또한 유익한 효과를 일으킬 수 있는 파괴적 돌연변이를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 헤모글로빈을 코딩하는 유전자, 특히 베타 글로빈 쇄 (HBB 유전자)에서의 유전적 결함은 겸상 적혈구 빈혈 및 지중해 빈혈을 비롯하여 혈색소병증으로 공지된 수많은 질환의 원인이 될 수 있다.
성인 인간에서, 헤모글로빈은 2개의 알파 (α)-유사 글로빈 쇄 및 2개의 베타 (β)-유사 글로빈 쇄 및 4개의 헴 기를 포함하는 이종사합체이다. 성인에서, α2β2 사합체는 헤모글로빈 A (HbA) 또는 성인 헤모글로빈으로 지칭된다. 전형적으로, 알파 및 베타 글로빈 쇄는 대략 1:1 비로 합성되고, 이 비는 헤모글로빈 및 적혈구 (RBC) 안정화의 측면에서 중요한 것으로 보인다. 발달 중인 태아에서는, 산소가 모체의 혈류를 통해 아기의 시스템으로 전달될 수 있도록 헤모글로빈 A에 비해 산소에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 상이한 형태의 헤모글로빈인 태아 헤모글로빈 (HbF)이 생성된다. 태아 헤모글로빈 또한 2개의 α 글로빈 쇄를 함유하지만, 성인 β-글로빈 쇄 대신에 이는 2개의 태아 감마 (γ)-글로빈 쇄를 갖는다 (즉, 태아 헤모글로빈은 α2γ2임). 감마-글로빈에서 베타-글로빈 생성으로의 전환의 조절은 매우 복잡하며, 베타 글로빈 전사의 상향조절과 동시에 감마 글로빈 전사의 하향조절을 주로 수반한다. 대략 임신 30 주에, 태아에서 베타 글로빈의 생성이 증가하면서 감마 글로빈의 합성이 감소하기 시작한다. 일부 HbF는 성인기까지 지속되지만 (총 헤모글로빈의 대략 1-3%), 대략 10 개월째에 신생아의 헤모글로빈은 거의 모두 α2β2이다. 혈색소병증을 가진 대부분의 환자에서는, 감마 글로빈을 코딩하는 유전자가 여전히 존재하지만, 상기 기재된 바와 같이 분만시 발생하는 정상 유전자 억제로 인해 발현은 비교적 낮다.
겸상 적혈구 질환은 β 글로빈 유전자 (HBB)에서 V6E 돌연변이 (DNA 수준에서 GAG에서 GTG로)에 의해 유발되며, 생성된 헤모글로빈은 "헤모글로빈S" 또는 "HbS"로 지칭된다. 보다 낮은 산소 조건하에서는, HbS 분자가 응집하고 섬유성 침전물을 형성한다. 이들 응집물은 RBC의 이상 또는 '겸상화'를 유발하여, 세포의 유연성을 상실한다. 겸상 RBC는 더이상 모세혈관계로 넣어질 수 없으며, 겸상 적혈구 환자에서 혈관 폐색 위기를 일으킬 수 있다. 또한, 겸상 RBC는 정상 RBC에 비해 더 약하고, 용혈의 경향을 가지며, 결국 환자에서 빈혈을 초래한다.
겸상 적혈구 환자의 치료 및 관리는 항생체 치료, 통증 관리, 및 급성 에피소드 동안 수혈을 수반하는 평생의 일이다. 한 접근법은 히드록시우레아의 사용이며, 이는 감마 글로빈의 생성을 증가시킴으로써 부분적으로 그의 효과를 발휘한다. 만성 히드록시우레아 요법의 장기간 부작용은 아직 알려져 있지 않지만, 상기 치료는 원치않는 부작용을 일으키고, 환자마다 다양한 효능을 가질 수 있다. 겸상 적혈구 치료의 효능에서의 증가에도 불구하고, 환자의 기대 수명은 여전히 50대 중후반에 불과하며, 상기 질환과 연관된 이환율은 환자의 삶의 질에 큰 영향을 미친다.
지중해 빈혈 (알파 지중해 빈혈 및 베타 지중해 빈혈) 또한 헤모글로빈과 관련된 질환이며, 전형적으로 감소된 글로빈 쇄 발현을 수반한다. 이는 유전자의 조절 영역의 돌연변이를 통해, 또는 감소된 발현 또는 감소된 수준 또는 기능적 글로빈 단백질을 유발하는 글로빈 코딩 서열에서의 돌연변이로부터 발생할 수 있다. 지중해 빈혈의 치료에는 일반적으로 수혈 및 철 킬레이트 요법이 수반된다. 적절한 공여자가 확인될 수 있는 경우에는 골수 이식 또한 중증 지중해 빈혈을 가진 사람의 치료를 위해 이용되고 있지만, 이 절차는 상당한 위험을 가질 수 있다.
SCD 및 베타 지중해 빈혈 둘 다의 치료에 대해 제안된 한 접근법은, HbF가 비정상적인 성인 헤모글로빈을 기능적으로 대체하도록 감마 글로빈의 발현을 증가시키는 것이다. 상기 언급된 바와 같이, 히드록시우레아에 의한 SCD 환자의 치료는 감마 글로빈 발현을 증가시키는 그의 효과로 인해 부분적으로 성공적인 것으로 여겨진다 ([DeSimone (1982) Proc Nat'l Acad Sci USA 79(14):4428-31; Ley, et al., (1982) N. Engl. J. Medicine, 307: 1469-1475; Ley, et al., (1983) Blood 62: 370-380; Constantoulakis et al., (1988) Blood 72(6):1961-1967], 모두 본원에 참고로 포함됨). HbF의 발현 증가는 그의 생성물이 감마 글로빈 발현을 조절하는 역할을 하는 유전자의 확인을 수반한다. 이러한 한 유전자는 BCL11A이다. BCL11A는 성인 적혈구 전구체 세포에서 발현되는 아연 핑거 단백질을 코딩하고, 그의 발현의 하향조절은 감마 글로빈 발현을 증가시킨다 ([Sankaran et al. (2008) Science 322: 1839], 본원에 참고로 포함됨). BCL11A 유전자에 대해 표적화된 억제성 RNA의 사용이 제안되었지만 (예를 들어, 미국 특허 공보 2011/0182867, 본원에 참고로 포함됨), 이 기술은 몇가지 잠재적인 단점을 가지며, 예를 들어 완전한 녹다운이 달성되지 않을 수 있고, 이러한 RNA의 전달이 문제가 될 수 있으며, RNA가 지속적으로 존재해야 하므로, 평생 여러 치료를 필요로 한다.
본 발명의 RGN을 이용하여 BCL11A 인핸서 영역을 표적화하여, BCL11A의 발현을 방해할 수 있고, 이로써 감마 글로빈 발현이 증가된다. 이러한 표적화된 방해는 비상동성 말단 결합 (NHEJ)에 의해 달성될 수 있으며, 이에 의해 본 발명의 RGN이 BCL11A 인핸서 영역 내의 특정한 서열에 대해 표적화되고, 이중 가닥 파손이 형성되고, 전형적으로 유해한 돌연변이를 동시에 도입시키면서 세포 기구가 파손을 복구한다. 다른 질환 표적에 대해 기재된 것과 유사하게, 본 발명의 RGN은 생체내 전달을 위해 RGN 및 그의 가이드 RNA에 대한 발현 카세트를 단일 AAV 벡터에 팩키징할 수 있게 하는 그의 비교적 작은 크기 때문에 다른 공지된 RGN에 비해 이점을 갖는다. 이 방법에 대해 가능한 설명은 실시예 10에 제공된다. 본 발명의 RGN을 이용하는 유사한 전략은 또한 인간 및 농경학적으로 또는 경제적으로 중요한 비-인간 동물 모두에서 유사한 질환 및 장애에 적용될 수 있다.
IX. 폴리뉴클레오티드 유전자 변형을 포함하는 세포
본원에 기재된 RGN, crRNA, tracrRNA 및/또는 데아미나제에 의해 매개되는 과정을 이용하여 변형된 관심 표적 서열을 포함하는 세포 및 유기체가 본원에 제공된다. 이들 일부 실시양태에서, RGN은 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50,의 아미노산 서열, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 가이드 RNA는 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CRISPR 반복 서열, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 가이드 RNA는 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 tracrRNA, 또는 그의 활성 변이체 또는 단편을 포함한다. 상기 시스템의 가이드 RNA는 단일 가이드 RNA 또는 이중-가이드 RNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 데아미나제는 서열식별번호: 374-545 및 572-584 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 그의 활성 변이체 또는 단편을 포함한다.
변형된 세포는 진핵생물 (예를 들어, 포유동물, 식물, 곤충 세포) 또는 원핵생물일 수 있다. 본원에 기재된 RGN, crRNA 및/또는 tracrRNA를 이용하는 과정에 의해 변형된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 소기관 및 배아 또한 제공된다. 유전자 변형된 세포, 유기체, 소기관 및 배아는 변형된 뉴클레오티드 서열에 대해 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다.
세포, 유기체, 소기관 또는 배아의 염색체 변형은 변경된 발현 (상향조절 또는 하향조절), 불활성화, 또는 변경된 단백질 생성물 또는 통합된 서열의 발현을 일으킬 수 있다. 염색체 변형이 유전자의 불활성화 또는 비기능성 단백질 생성물의 발현을 일으키는 것인 이들 예에서, 유전자 변형된 세포, 유기체, 소기관 또는 배아는 "녹아웃"으로 지칭된다. 녹아웃된 표현형은 결실 돌연변이 (즉, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실), 삽입 돌연변이 (즉, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입), 또는 넌센스 돌연변이 (즉, 정지 코돈이 도입되도록 하는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환)의 결과일 수 있다.
대안적으로, 세포, 유기체, 소기관 또는 배아의 염색체 변형은 "녹인"을 생성할 수 있으며, 이는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 염색체 통합으로부터 발생한다. 이들 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 야생형 단백질을 코딩하는 염색체 서열이 불활성화되지만 외인성으로 도입된 단백질이 발현되도록 염색체에 통합된다.
다른 실시양태에서, 염색체 변형은 변이체 단백질 생성물을 생성한다. 발현된 변이체 단백질 생성물은 적어도 하나의 아미노산 치환 및/또는 적어도 하나의 아미노산의 부가 또는 결실을 가질 수 있다. 변경된 염색체 서열에 의해 코딩되는 변이체 단백질 생성물은 야생형 단백질, 예컨대 비제한적으로 변경된 효소 활성 또는 기질 특이성과 비교하여 변형된 특징 또는 활성을 나타낼 수 있다.
여전히 다른 실시양태에서, 염색체 변형은 단백질의 변경된 발현 패턴을 일으킬 수 있다. 비제한적인 예로서, 단백질 생성물의 발현을 조절하는 조절 영역에서의 염색체 변경은 단백질 생성물의 과발현 또는 하향조절, 또는 변경된 조직 또는 일시적인 발현 패턴을 일으킬 수 있다.
단수 형태는 1개 또는 1개 초과의 (즉, 적어도 하나의) 문법적 대상을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, "폴리펩티드"는 하나 이상의 폴리펩티드들을 의미한다.
본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허 출원은 이 개시내용이 속하는 기술분야의 기술자의 수준을 나타낸다. 모든 공보 및 특허 출원은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
상기 발명이 이해의 명료함의 목적으로 설명 및 예시를 위해 일부 상세하게 기재되었지만, 특정 변화 및 변형이 첨부된 실시양태의 범위 내에서 실시될 수 있음이 명백할 것이다.
비제한적인 실시양태에는 하기가 포함된다:
1. RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자이며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RGN 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
상기 RGN 폴리펩티드는 표적 DNA 서열과 혼성화할 수 있는 가이드 RNA (gRNA)에 결합할 때 RNA-가이드된 서열 특이적인 방식으로 상기 표적 DNA 서열과 결합하고,
RGN 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 분자.
2. 실시양태 1에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드가 결합시 상기 표적 DNA 서열을 절단할 수 있는 것인 핵산 분자.
3. 실시양태 2에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드에 의한 절단이 이중 가닥 파손을 생성하는 것인 핵산 분자.
4. 실시양태 2에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드에 의한 절단이 단일 가닥 파손을 생성하는 것인 핵산 분자.
5. 실시양태 1에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드가 뉴클레아제 데드이거나 또는 닉카제로서 기능하는 것인 핵산 분자.
6. 실시양태 5에 있어서, RGN 폴리펩티드가 염기-편집 폴리펩티드에 작동가능하게 융합된 것인 핵산 분자.
7. 실시양태 6에 있어서, 상기 염기-편집 폴리펩티드가 데아미나제인 핵산 분자.
8. 실시양태 7에 있어서, 상기 데아미나제가 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416, 420, 514 및 572-584 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 핵산 분자.
9. 실시양태 1-8 중 어느 하나에 있어서, RGN 폴리펩티드가 하나 이상의 핵 국재화 신호를 포함하는 것인 핵산 분자.
10. 실시양태 1-9 중 어느 하나에 있어서, RGN 폴리펩티드가 진핵생물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 것인 핵산 분자.
11. 실시양태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 DNA 서열이 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM)에 인접하게 위치하는 것인 핵산 분자.
12. 실시양태 1-11 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
13. 실시양태 12에 있어서, 상기 표적 DNA 서열과 혼성화할 수 있는 상기 gRNA를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 벡터.
14. 실시양태 13에 있어서, 상기 gRNA가 단일 가이드 RNA인 벡터.
15. 실시양태 13에 있어서, 상기 gRNA가 이중-가이드 RNA인 벡터.
16. 실시양태 13-15 중 어느 하나에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 CRISPR 반복 서열을 포함하는 CRISPR RNA를 포함하는 것인 벡터.
17. 실시양태 13-16 중 어느 하나에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 tracrRNA을 포함하는 것인 벡터.
18. 실시양태 1-11 중 어느 하나의 핵산 분자 또는 실시양태 12-17 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 세포.
19. RGN 폴리펩티드가 발현되는 조건하에 실시양태 18의 세포를 배양하는 것을 포함하는, RGN 폴리펩티드를 제조하는 방법.
20. 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종성 핵산 분자를 세포에 도입시키고;
상기 RGN 폴리펩티드는 표적 DNA 서열과 혼성화할 수 있는 가이드 RNA (gRNA)에 결합할 때 RNA-가이드된 서열 특이적인 방식으로 상기 표적 DNA 서열과 결합하며;
RGN 폴리펩티드가 발현되는 조건하에 상기 세포를 배양하는 것을 포함하는, RGN 폴리펩티드를 제조하는 방법.
21. 실시양태 19 또는 20에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드를 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
22. 실시양태 19 또는 20에 있어서, 상기 세포가 상기 RGN 폴리펩티드에 결합하여 RGN 리보핵단백질 복합체를 형성하는 하나 이상의 가이드 RNA를 추가로 발현하는 것인 방법.
23. 실시양태 22에 있어서, 상기 RGN 리보핵단백질 복합체를 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
24. CRISPR RNA (crRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자이며, 상기 crRNA는 스페이서 서열 및 CRISPR 반복 서열을 포함하고, 상기 CRISPR 반복 서열은 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
a) 상기 crRNA; 및
b) 상기 crRNA의 상기 CRISPR 반복 서열에 혼성화된 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)
를 포함하는 가이드 RNA는
상기 가이드 RNA가 RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 폴리펩티드와 결합할 때 상기 crRNA의 스페이서 서열을 통해 서열 특이적인 방식으로 표적 DNA 서열과 혼성화할 수 있고,
crRNA를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 분자.
25. 실시양태 24의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
26. 실시양태 25에 있어서, 상기 벡터가 상기 tracrRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 벡터.
27. 실시양태 26에 있어서, 상기 tracrRNA가 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 벡터.
28. 실시양태 26 또는 27에 있어서, 상기 crRNA를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 tracrRNA를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드가 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 단일 가이드 RNA로서 코딩되는 것인 벡터.
29. 실시양태 26 또는 27에 있어서, 상기 crRNA를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 tracrRNA를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드가 별도의 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 벡터.
30. 실시양태 25-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터가 상기 RGN 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 상기 RGN 폴리펩티드가 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
31. 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자이며;
a) 상기 tracrRNA; 및
b) 스페이서 서열 및 CRISPR 반복 서열을 포함하는 crRNA
- 상기 tracrRNA는 상기 crRNA의 상기 CRISPR 반복 서열과 혼성화함
를 포함하는 가이드 RNA는
상기 가이드 RNA가 RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 폴리펩티드에 결합할 때 상기 crRNA의 스페이서 서열을 통해 서열 특이적인 방식으로 표적 DNA 서열과 혼성화할 수 있고,
tracrRNA를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 분자.
32. 실시양태 31의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
33. 실시양태 32에 있어서, 상기 벡터가 상기 crRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 벡터.
34. 실시양태 33에 있어서, 상기 crRNA의 CRISPR 반복 서열이 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 벡터.
35. 실시양태 33 또는 34에 있어서, 상기 crRNA를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 tracrRNA를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드가 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 단일 가이드 RNA로서 코딩되는 것인 벡터.
36. 실시양태 33 또는 34에 있어서, 상기 crRNA를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 tracrRNA를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드가 별도의 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 벡터.
37. 실시양태 32-36 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터가 상기 RGN 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 상기 RGN 폴리펩티드가 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
38. 표적 DNA 서열에 결합하기 위한 시스템이며, 상기 시스템은 하기를 포함하고:
a) 상기 표적 DNA 서열과 혼성화할 수 있는 하나 이상의 가이드 RNA, 또는 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열; 및
b) 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 폴리펩티드, 또는 RGN 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하고 RGN 폴리펩티드를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열 각각이 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 이종성인 프로모터에 작동가능하게 연결되고;
하나 이상의 가이드 RNA는 표적 DNA 서열과 혼성화하고,
하나 이상의 가이드 RNA는 RGN 폴리펩티드와 복합체를 형성하여, 상기 RGN 폴리펩티드가 상기 표적 DNA 서열에 결합하도록 지시하는 것인 시스템.
39. 실시양태 38에 있어서, 상기 gRNA가 단일 가이드 RNA (sgRNA)인 시스템.
40. 실시양태 38에 있어서, 상기 gRNA가 이중-가이드 RNA인 시스템.
41. 실시양태 38-40 중 어느 하나에 있어서, 상기 gRNA가 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CRISPR 반복 서열을 포함하는 것인 시스템.
42. 실시양태 38-41 중 어느 하나에 있어서, 상기 gRNA가 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 tracrRNA를 포함하는 것인 시스템.
43. 실시양태 38-42 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 DNA 서열이 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM)에 인접하게 위치하는 시스템.
44. 실시양태 38-43 중 어느 하나에 있어서, 표적 DNA 서열이 세포 내에 있는 것인 시스템.
45. 실시양태 44에 있어서, 세포가 진핵생물 세포인 시스템.
46. 실시양태 45에 있어서, 진핵생물 세포가 식물 세포인 시스템.
47. 실시양태 45에 있어서, 진핵생물 세포가 포유동물 세포인 시스템.
48. 실시양태 45에 있어서, 진핵생물 세포가 곤충 세포인 시스템.
49. 실시양태 44에 있어서, 세포가 원핵생물 세포인 시스템.
50. 실시양태 38-49 중 어느 하나에 있어서, 전사될 때 하나 이상의 가이드 RNA가 표적 DNA 서열과 혼성화하고, 가이드 RNA가 표적 DNA 서열의 절단을 초래하는 RGN 폴리펩티드와 복합체를 형성하는 것인 시스템.
51. 실시양태 50에 있어서, 절단이 이중 가닥 파손을 생성하는 것인 시스템.
52. 실시양태 50에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드에 의한 절단이 단일 가닥 파손을 생성하는 것인 시스템.
53. 실시양태 38-49 중 어느 하나에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드가 뉴클레아제 데드이거나 또는 닉카제로서 기능하는 것인 시스템.
54. 실시양태 53에 있어서, RGN 폴리펩티드가 염기-편집 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 것인 시스템.
55. 실시양태 54에 있어서, 상기 염기-편집 폴리펩티드가 데아미나제인 시스템.
56. 실시양태 55에 있어서, 상기 데아미나제가 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416, 420, 514 및 572-584 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 시스템.
57. 실시양태 38-56 중 어느 하나에 있어서, RGN 폴리펩티드가 하나 이상 핵 국재화 신호를 포함하는 것인 시스템.
58. 실시양태 38-57 중 어느 하나에 있어서, RGN 폴리펩티드가 진핵생물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 것인 시스템.
59. 실시양태 38-58 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 RGN 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 하나의 벡터 상에 위치하는 것인 시스템.
60. 실시양태 38-59 중 어느 하나에 있어서, 상기 시스템이 하나 이상의 공여자 폴리뉴클레오티드, 또는 하나 이상의 공여자 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인 시스템.
61. 실시양태 38-60 중 어느 하나에 따른 시스템을 표적 DNA 서열, 또는 표적 DNA 서열을 포함하는 세포에 전달하는 것을 포함하는, 표적 DNA 서열에 결합시키는 방법.
62. 실시양태 61에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드 또는 상기 가이드 RNA가 검출가능한 표지를 추가로 포함하여, 상기 표적 DNA 서열의 검출을 가능하게 하는 것인 방법.
63. 실시양태 61에 있어서, 상기 가이드 RNA 또는 상기 RGN 폴리펩티드가 발현 조절인자를 추가로 포함하여, 상기 표적 DNA 서열, 또는 상기 표적 DNA 서열에 의한 전사 조절하에 있는 유전자의 발현을 조절하는 것인 방법.
64. 실시양태 38-60 중 어느 하나에 따른 시스템을 표적 DNA 서열, 또는 표적 DNA 서열을 포함하는 세포에 전달하는 것을 포함하는, 표적 DNA 서열을 절단하거나 또는 변형시키는 방법.
65. 실시양태 64에 있어서, 상기 변형된 표적 DNA 서열이 표적 DNA 서열로의 이종성 DNA의 삽입을 포함하는 것인 방법.
66. 실시양태 64에 있어서, 상기 변형된 표적 DNA 서열이 표적 DNA 서열로부터 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
67. 실시양태 64에 있어서, 상기 변형된 표적 DNA 서열이 표적 DNA 서열에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
68. a) RGN 리보뉴클레오티드 복합체의 형성에 적합한 조건하에
i) 표적 DNA 서열과 혼성화할 수 있는 하나 이상의 가이드 RNA; 및
ii) 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RGN 폴리펩티드
를 조합함으로써 시험관내에서 RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 리보뉴클레오티드 복합체를 조립하고;
b) 상기 표적 DNA 서열, 또는 상기 표적 DNA 서열을 포함하는 세포를 시험관내-조립된 RGN 리보뉴클레오티드 복합체와 접촉시키는 것을 포함하는, 표적 DNA 서열에 결합시키는 방법이며;
하나 이상의 가이드 RNA는 표적 DNA 서열과 혼성화하여, 상기 RGN 폴리펩티드가 상기 표적 DNA 서열에 결합하도록 지시하는 것인 방법.
69. 실시양태 68에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드 또는 상기 가이드 RNA가 검출가능한 표지를 추가로 포함하여, 상기 표적 DNA 서열의 검출을 가능하게 하는 것인 방법.
70. 실시양태 68에 있어서, 상기 가이드 RNA 또는 상기 RGN 폴리펩티드가 발현 조절인자를 추가로 포함하여, 상기 표적 DNA 서열의 발현의 조절을 가능하게 하는 것인 방법.
71. DNA 분자를 하기와 접촉시키는 것을 포함하는, 표적 DNA 서열을 절단하고/거나 변형시키는 방법이며:
a) RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 폴리펩티드, 여기서 상기 RGN은 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함; 및
b) (a)의 RGN을 표적 DNA 서열에 대해 표적화할 수 있는 하나 이상의 가이드 RNA;
하나 이상의 가이드 RNA는 표적 DNA 서열과 혼성화하여, 상기 RGN 폴리펩티드가 상기 표적 DNA 서열과 결합하도록 지시하고, 상기 표적 DNA 서열의 절단 및/또는 변형이 발생하는 것인 방법.
72. 실시양태 71에 있어서, 상기 변형된 표적 DNA 서열이 표적 DNA 서열로의 이종성 DNA의 삽입을 포함하는 것인 방법.
73. 실시양태 71에 있어서, 상기 변형된 표적 DNA 서열이 표적 DNA 서열로부터 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
74. 실시양태 71에 있어서, 상기 변형된 표적 DNA 서열이 표적 DNA 서열에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
75. 실시양태 71-74 중 어느 하나에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드가 닉카제인 방법.
76. 실시양태 73 또는 74에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드가 뉴클레아제 데드이고, 염기-편집 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
77. 실시양태 68-76 중 어느 하나에 있어서, 상기 gRNA가 단일 가이드 RNA (sgRNA)인 방법.
78. 실시양태 68-76 중 어느 하나에 있어서, 상기 gRNA가 이중-가이드 RNA인 방법.
79. 실시양태 68-78 중 어느 하나에 있어서, 상기 gRNA가 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CRISPR 반복 서열을 포함하는 것인 방법.
80. 실시양태 68-79 중 어느 하나에 있어서, 상기 gRNA가 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 tracrRNA를 포함하는 것인 방법.
81. 실시양태 68-80 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 DNA 서열이 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM)에 인접하게 위치하는 것인 방법.
82. 실시양태 61-81 중 어느 하나에 있어서, 표적 DNA 서열이 세포 내에 위치하는 것인 방법.
83. 실시양태 82에 있어서, 세포가 진핵생물 세포인 방법.
84. 실시양태 83에 있어서, 진핵생물 세포가 식물 세포인 방법.
85. 실시양태 83에 있어서, 진핵생물 세포가 포유동물 세포인 방법.
86. 실시양태 83에 있어서, 진핵생물 세포가 곤충 세포인 방법.
87. 실시양태 82에 있어서, 세포가 원핵생물 세포인 방법.
88. 실시양태 82-87 중 어느 하나에 있어서, RGN 폴리펩티드가 발현되는 조건하에 세포를 배양하여, 표적 DNA 서열을 절단하여 변형된 DNA 서열을 생성하고; 상기 변형된 DNA 서열을 포함하는 세포를 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
89. 실시양태 88의 방법에 따른 변형된 표적 DNA 서열을 포함하는 세포.
90. 실시양태 89에 있어서, 세포가 진핵생물 세포인 세포.
91. 실시양태 90에 있어서, 진핵생물 세포가 식물 세포인 세포.
92. 실시양태 91의 세포를 포함하는 식물.
93. 실시양태 91의 세포를 포함하는 종자.
94. 실시양태 90에 있어서, 진핵생물 세포가 포유동물 세포인 세포.
95. 실시양태 90에 있어서, 진핵생물 세포가 곤충 세포인 세포.
96. 실시양태 89에 있어서, 세포가 원핵생물 세포인 세포.
97. 세포에 하기를 도입시키는 것을 포함하고:
a) RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 폴리펩티드, 또는 상기 RGN 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - 여기서 RGN 폴리펩티드는 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, RGN 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 세포에서 RGN 폴리펩티드의 발현이 가능하도록 프로모터에 작동가능하게 연결됨; 및
b) 가이드 RNA (gRNA), 또는 상기 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - 여기서 gRNA는 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CRISPR 반복 서열을 포함하고, gRNA를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 세포에서 gRNA의 발현이 가능하도록 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
이로써 RGN 및 gRNA은 원인 돌연변이의 게놈 위치에 대해 표적화되고, 원인 돌연변이를 제거하도록 게놈 서열을 변형시키는 것인, 유전적으로 유전된 질환에 대한 원인 돌연변이에서의 수정에 의해 유전자 변형된 세포를 생성하는 방법.
98. 실시양태 97에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드가 뉴클레아제 데드이거나 또는 닉카제로서 기능하는 것인 방법.
99. 실시양태 98에 있어서, RGN 폴리펩티드가 염기-편집 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
100. 실시양태 99에 있어서, 상기 염기-편집 폴리펩티드가 데아미나제인 방법.
101. 실시양태 100에 있어서, 데아미나제가 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416, 420, 514 및 572-584 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
102. 실시양태 97-101 중 어느 하나에 있어서, 세포가 동물 세포인 방법.
103. 실시양태 102에 있어서, 동물 세포가 포유동물 세포인 방법.
104. 실시양태 103에 있어서, 세포가 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 말, 소, 돼지, 또는 인간으로부터 유래되는 것인 방법.
105. 실시양태 102에 있어서, 유전적으로 유전된 질환이 표 8에 나열된 질환인 방법.
106. 실시양태 102에 있어서, 유전적으로 유전된 질환이 헐러 증후군인 방법.
107. 실시양태 106에 있어서, gRNA가 서열식별번호: 337을 표적화하는 스페이서 서열을 포함하는 것인 방법.
108. 세포에 하기를 도입하는 것을 포함하며:
a) RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 폴리펩티드, 또는 상기 RGN 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - 여기서 RGN 폴리펩티드는 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, RGN 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 세포에서 RGN 폴리펩티드의 발현이 가능하도록 프로모터에 작동가능하게 연결됨; 및
b) 제1 가이드 RNA (gRNA), 또는 상기 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - 여기서 gRNA는 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CRISPR 반복 서열을 포함하고, gRNA를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 세포에서 gRNA의 발현이 가능하도록 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 추가로 gRNA는 불안정 게놈 영역의 5' 플랭크를 표적화하는 스페이서 서열을 포함함; 및
c) 제2 가이드 RNA (gRNA), 또는 상기 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - 여기서 gRNA는 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CRISPR 반복 서열을 포함하고, gRNA를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 세포에서 gRNA의 발현이 가능하도록 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 추가로 상기 제2 gRNA는 불안정 게놈 영역의 3' 플랭크를 표적화하는 스페이서 서열을 포함함;
이로써 RGN 및 2개의 gRNA는 불안정 게놈 영역을 표적화하고, 불안정 게놈 영역의 적어도 일부분이 제거되는 것인, 질환을 유발하는 불안정 게놈 영역에서 결실을 갖는 유전자 변형된 세포를 생성하는 방법.
109. 실시양태 108에 있어서, 세포가 동물 세포인 방법.
110. 실시양태 108에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
111. 실시양태 110에 있어서, 세포가 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 말, 소, 돼지, 또는 인간으로부터 유래되는 것인 방법.
112. 실시양태 109에 있어서, 유전적으로 유전된 질환이 프리드리히(Friedrich) 운동실조 또는 헌팅턴 질환인 방법.
113. 실시양태 112에 있어서, 제1 gRNA가 서열식별번호: 340, 341, 342 또는 343을 표적화하는 스페이서 서열을 포함하는 것인 방법.
114. 실시양태 113에 있어서, 제2 gRNA가 서열식별번호: 340, 341, 342 또는 343을 표적화하는 스페이서 서열을 포함하는 것인 방법.
115. 단리된 인간 조혈 전구 세포에 하기를 도입하는 것을 포함하며:
a) RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 폴리펩티드, 또는 상기 RGN 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - 여기서 RGN 폴리펩티드는 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, RGN 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 세포에서 RGN 폴리펩티드의 발현이 가능하도록 프로모터에 작동가능하게 연결됨; 및
b) 가이드 RNA (gRNA), 또는 상기 gRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 - 여기서 gRNA는 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CRISPR 반복 서열을 포함하고, gRNA를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 세포에서 gRNA의 발현이 가능하도록 프로모터에 작동가능하게 연결됨,
이로써 RGN 및 gRNA는 세포에서 발현되고, BCL11A 인핸서 영역에서 절단하여, 인간 조혈 전구 세포의 유전자 변형을 일으키고, BCL11A의 mRNA 및/또는 단백질 발현을 감소시키는 것인, 감소된 BCL11A mRNA 및 단백질 발현을 갖는 유전자 변형된 포유동물의 조혈 전구 세포를 생성하는 방법.
116. 실시양태 115에 있어서, gRNA가 서열식별번호: 350, 351 또는 352를 표적화하는 스페이서 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
117. 표적 DNA 서열과 결합하기 위한 시스템이며, 상기 시스템은 하기를 포함하고:
a) 상기 표적 DNA 서열과 혼성화할 수 있는 하나 이상의 가이드 RNA, 또는 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열; 및
b) 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 폴리펩티드;
하나 이상의 가이드 RNA는 표적 DNA 서열과 혼성화하고,
하나 이상의 가이드 RNA는 RGN 폴리펩티드와 복합체를 형성하여, 상기 RGN 폴리펩티드가 상기 표적 DNA 서열에 결합하도록 지시하는 것인 시스템.
118. 실시양태 117에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드가 뉴클레아제 데드이거나 또는 닉카제로서 기능하는 것인 시스템.
119. 실시양태 117 또는 118에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드가 염기-편집 폴리펩티드에 작동가능하게 융합된 것인 시스템.
120. 실시양태 119에 있어서, 염기-편집 폴리펩티드가 데아미나제인 시스템.
121. 실시양태 120에 있어서, 데아미나제 폴리펩티드가 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416, 420, 514 및 572-584 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 시스템.
122. 데아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자이며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416 또는 420과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 데아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
상기 데아미나제 폴리펩티드는 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 뉴클레오티드를 탈아미노화시키고;
상기 데아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 분자.
123. 실시양태 122에 있어서, 데아미나제 폴리펩티드가 진핵생물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는 것인 핵산 분자.
124. 실시양태 122 또는 123에 있어서, 데아미나제 폴리펩티드가 상기 데아미나제 폴리펩티드를 상기 표적 폴리뉴클레오티드에 국재화시키는 DNA-결합 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 분자.
125. 실시양태 124에 있어서, DNA-결합 폴리펩티드가 메가뉴클레아제, 아연 핑거 융합 단백질, 또는 TALEN인 핵산 분자.
126. 실시양태 124에 있어서, DNA-결합 폴리펩티드가 RNA 가이드와 복합체로 작용하고, 따라서 RNA-가이드되는 것인 핵산 분자.
127. 실시양태 126에 있어서, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드가 RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드이거나 또는 그로부터 유래된 것인 핵산 분자.
128. 실시양태 127에 있어서, RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드가 유형 II CRISPR-Cas 폴리펩티드인 핵산 분자.
129. 실시양태 127에 있어서, RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드가 유형 V CRISPR-Cas 폴리펩티드인 핵산 분자.
130. 실시양태 126-129 중 어느 하나에 있어서, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드가 닉카제인 핵산 분자.
131. 실시양태 127에 있어서, RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드가 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것인 핵산 분자.
132. 실시양태 124-131 중 어느 하나에 있어서, 데아미나제 폴리펩티드가 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 분자.
133. 실시양태 132에 있어서, UGI 폴리펩티드가 서열식별번호: 570의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 것인 핵산 분자.
134. 실시양태 122-133 중 어느 하나에 있어서, 데아미나제 폴리펩티드가 핵 국재화 신호 (NLS)를 추가로 포함하는 것인 핵산 분자.
135. 실시양태 122-134 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
136. 실시양태 126-134 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터이며, 상기 벡터는 상기 표적 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있고 상기 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드와 복합체로 작용할 수 있는 가이드 RNA (gRNA)를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인 벡터.
137. 실시양태 136에 있어서, 상기 gRNA가 단일 가이드 RNA인 벡터.
138. 실시양태 136에 있어서, 상기 gRNA가 이중-가이드 RNA인 벡터.
139. 실시양태 122-134 중 어느 하나의 핵산 분자 또는 실시양태 135-138 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 세포.
140. 실시양태 139의 세포를 데아미나제 폴리펩티드가 발현되는 조건하에 배양하는 것을 포함하는, 데아미나제 폴리펩티드의 제조 방법.
141. 아데노신 데아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자이며, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 아데노신 데아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
a) 서열식별번호: 514와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
b) 서열식별번호: 572와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 572의 위치 102에 상응하는 위치에서 리신, 서열식별번호: 572의 위치 104에 상응하는 위치에서 티로신, 및 서열식별번호: 572의 위치 106에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
c) 서열식별번호: 573과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
d) 서열식별번호: 574와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 574의 위치 101에 상응하는 위치에서 글루탐산, 서열식별번호: 574의 위치 103에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 574의 위치 105에 상응하는 위치에서 리신을 포함하는 아미노산 서열;
e) 서열식별번호: 575와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 575의 위치 101에 상응하는 위치에서 리신, 서열식별번호: 575의 위치 103에 상응하는 위치에서 류신, 및 서열식별번호: 575의 위치 105에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
f) 서열식별번호: 576과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 576의 위치 105에 상응하는 위치에서 알라닌 및 서열식별번호: 576의 위치 107에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함하는 아미노산 서열;
g) 서열식별번호: 577과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 577의 위치 102에 상응하는 위치에서 글리신, 서열식별번호: 577의 위치 104에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 577의 위치 106에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함하는 아미노산 서열;
h) 서열식별번호: 578과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 578의 위치 105에 상응하는 위치에서 세린 및 서열식별번호: 578의 위치 107에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
i) 서열식별번호: 579와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 579의 위치 102에 상응하는 위치에서 세린, 서열식별번호: 579의 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 및 서열식별번호: 579의 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신을 포함하는 아미노산 서열;
j) 서열식별번호: 580과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 580의 위치 111에 상응하는 위치에서 글리신을 포함하는 아미노산 서열;
k) 서열식별번호: 581과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 581의 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 서열식별번호: 581의 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신, 및 서열식별번호: 581의 위치 108에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
l) 서열식별번호: 582와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 582의 위치 102에 상응하는 위치에서 아르기닌, 서열식별번호: 582의 위치 104에 상응하는 위치에서 트립토판, 및 서열식별번호: 582의 위치 106에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
m) 서열식별번호: 583과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 583의 위치 104에 상응하는 위치에서 아르기닌 및 서열식별번호: 583의 위치 106에 상응하는 위치에서 세린을 포함하는 아미노산 서열; 및
n) 서열식별번호: 584와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 584의 위치 110에 상응하는 위치에서 페닐알라닌, 서열식별번호: 584의 위치 112에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 584의 위치 114에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
상기 아데노신 데아미나제 폴리펩티드는 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 아데노신을 탈아미노화시키고;
아데노신 데아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 분자.
142. 실시양태 141에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 폴리펩티드가 진핵생물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는 것인 핵산 분자.
143. 실시양태 141 또는 142에 있어서, 아데노신 데아미나제 폴리펩티드가 상기 아데노신 데아미나제 폴리펩티드를 상기 표적 폴리뉴클레오티드에 국재화시키는 DNA-결합 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 분자.
144. 실시양태 143에 있어서, DNA-결합 폴리펩티드가 메가뉴클레아제, 아연 핑거 융합 단백질, 또는 TALEN인 핵산 분자.
145. 실시양태 143에 있어서, DNA-결합 폴리펩티드가 RNA 가이드와 복합체로 작용하고, 따라서 RNA-가이드된 것인 핵산 분자.
146. 실시양태 145에 있어서, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드가 RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드이거나 또는 그로부터 유래된 것인 핵산 분자.
147. 실시양태 146에 있어서, RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드가 유형 II CRISPR-Cas 폴리펩티드인 핵산 분자.
148. 실시양태 146에 있어서, RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드가 유형 V CRISPR-Cas 폴리펩티드인 핵산 분자.
149. 실시양태 145-148 중 어느 하나에 있어서, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드가 닉카제인 핵산 분자.
150. 실시양태 146에 있어서, RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드가 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것인 핵산 분자.
151. 실시양태 141-150 중 어느 하나에 있어서, 아데노신 데아미나제 폴리펩티드가 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 분자.
152. 실시양태 151에 있어서, UGI 폴리펩티드가 서열식별번호: 570의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 것인 핵산 분자.
153. 실시양태 141-152 중 어느 하나에 있어서, 아데노신 데아미나제 폴리펩티드가 핵 국재화 신호 (NLS)를 추가로 포함하는 것인 핵산 분자.
154. 실시양태 141-153 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
155. 실시양태 145-153 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터이며, 상기 벡터는 상기 표적 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있고 상기 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드와 복합체로 작용할 수 있는 가이드 RNA (gRNA)를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인 벡터.
156. 실시양태 155에 있어서, 상기 gRNA가 단일 가이드 RNA인 벡터.
157. 실시양태 155에 있어서, 상기 gRNA가 이중-가이드 RNA인 벡터.
158. 실시양태 141-153 중 어느 하나의 핵산 분자 또는 실시양태 154-157 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 세포.
159. 실시양태 158의 세포를 아데노신 데아미나제 폴리펩티드가 발현되는 조건하에 배양하는 것을 포함하는, 아데노신 데아미나제 폴리펩티드의 제조 방법.
160. 하기를 포함하는 융합 단백질이며:
a) 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하는 DNA-결합 폴리펩티드; 및
b) 데아미나제 폴리펩티드,
상기 데아미나제 폴리펩티드는 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416 또는 420과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 데아미나제 폴리펩티드는 상기 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 뉴클레오티드를 탈아미노화시키는 것인 융합 단백질.
161. 실시양태 160에 있어서, DNA-결합 폴리펩티드가 메가뉴클레아제, 아연 핑거 융합 단백질, 또는 TALEN인 융합 단백질.
162. 실시양태 160에 있어서, DNA-결합 폴리펩티드가 RNA 가이드와 복합체로 작용하고, 따라서 RNA-가이드된 것인 융합 단백질.
163. 실시양태 162에 있어서, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드가 RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드이거나 또는 그로부터 유래된 것인 융합 단백질.
164. 실시양태 163에 있어서, RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드가 유형 II CRISPR-Cas 폴리펩티드인 융합 단백질.
165. 실시양태 163에 있어서, RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드가 유형 V CRISPR-Cas 폴리펩티드인 융합 단백질.
166. 실시양태 162-165 중 어느 하나에 있어서, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드가 닉카제인 융합 단백질.
167. 실시양태 163에 있어서, RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드가 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것인 융합 단백질.
168. 실시양태 160-167 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질이 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 폴리펩티드를 추가로 포함하는 것인 융합 단백질.
169. 실시양태 168에 있어서, UGI 폴리펩티드가 서열식별번호: 570의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 것인 융합 단백질.
170. 실시양태 160-169 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질이 핵 국재화 신호 (NLS)를 추가로 포함하는 것인 융합 단백질.
171. 하기를 포함하는 융합 단백질이며:
a) 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하는 DNA-결합 폴리펩티드; 및
b) 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 아데노신 데아미나제 폴리펩티드:
i) 서열식별번호: 514와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
ii) 서열식별번호: 572와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 572의 위치 102에 상응하는 위치에서 리신, 서열식별번호: 572의 위치 104에 상응하는 위치에서 티로신, 및 서열식별번호: 572의 위치 106에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
iii) 서열식별번호: 573과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
iv) 서열식별번호: 574와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 574의 위치 101에 상응하는 위치에서 글루탐산, 서열식별번호: 574의 위치 103에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 574의 위치 105에 상응하는 위치에서 리신을 포함하는 아미노산 서열;
v) 서열식별번호: 575와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 575의 위치 101에 상응하는 위치에서 리신, 서열식별번호: 575의 위치 103에 상응하는 위치에서 류신, 및 서열식별번호: 575의 위치 105에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
vi) 서열식별번호: 576과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 576의 위치 105에 상응하는 위치에서 알라닌 및 서열식별번호: 576의 위치 107에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함하는 아미노산 서열;
vii) 서열식별번호: 577과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 577의 위치 102에 상응하는 위치에서 글리신, 서열식별번호: 577의 위치 104에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 577의 위치 106에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함하는 아미노산 서열;
viii) 서열식별번호: 578과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 578의 위치 105에 상응하는 위치에서 세린 및 서열식별번호: 578의 위치 107에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
ix) 서열식별번호: 579와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 579의 위치 102에 상응하는 위치에서 세린, 서열식별번호: 579의 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 및 서열식별번호: 579의 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신을 포함하는 아미노산 서열;
x) 서열식별번호: 580과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 580의 위치 111에 상응하는 위치에서 글리신을 포함하는 아미노산 서열;
xi) 서열식별번호: 581과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 581의 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 서열식별번호: 581의 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신, 및 서열식별번호: 581의 위치 108에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
xii) 서열식별번호: 582와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 582의 위치 102에 상응하는 위치에서 아르기닌, 서열식별번호: 582의 위치 104에 상응하는 위치에서 트립토판, 및 서열식별번호: 582의 위치 106에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
xiii) 서열식별번호: 583과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 583의 위치 104에 상응하는 위치에서 아르기닌 및 서열식별번호: 583의 위치 106에 상응하는 위치에서 세린을 포함하는 아미노산 서열; 및
xiv) 서열식별번호: 584와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 584의 위치 110에 상응하는 위치에서 페닐알라닌, 서열식별번호: 584의 위치 112에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 584의 위치 114에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
상기 아데노신 데아미나제 폴리펩티드는 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 아데노신을 탈아미노화시키는 것인 융합 단백질.
172. 실시양태 171에 있어서, DNA-결합 폴리펩티드가 메가뉴클레아제, 아연 핑거 융합 단백질, 또는 TALEN인 융합 단백질.
173. 실시양태 171에 있어서, DNA-결합 폴리펩티드가 RNA 가이드와 복합체로 작용하고, 따라서 RNA-가이드된 것인 융합 단백질.
174. 실시양태 173에 있어서, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드가 RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드이거나 또는 그로부터 유래된 것인 융합 단백질.
175. 실시양태 174에 있어서, RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드가 유형 II CRISPR-Cas 폴리펩티드인 융합 단백질.
176. 실시양태 174에 있어서, RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드가 유형 V CRISPR-Cas 폴리펩티드인 융합 단백질.
177. 실시양태 173-176 중 어느 하나에 있어서, RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드가 닉카제인 융합 단백질.
178. 실시양태 174에 있어서, RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드가 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것인 융합 단백질.
179. 실시양태 171-178 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질이 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 폴리펩티드를 추가로 포함하는 것인 융합 단백질.
180. 실시양태 179에 있어서, UGI 폴리펩티드가 서열식별번호: 570의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 것인 융합 단백질.
181. 실시양태 171-180 중 어느 하나에 있어서, 융합 단백질이 핵 국재화 신호 (NLS)를 추가로 포함하는 것인 융합 단백질.
182. 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키기 위한 시스템이며, 상기 시스템은 하기를 포함하고:
a) 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 하나 이상의 가이드 RNA, 또는 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열; 및
b) 실시양태 162-170 및 173-181 중 어느 하나의 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하고 융합 단백질을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열 각각은 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 이종성인 프로모터에 대해 작동가능하게 연결되고;
하나 이상의 가이드 RNA는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화하고,
하나 이상의 가이드 RNA는 융합 단백질의 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드와의 복합체를 형성하여, 상기 융합 단백질이 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 결합하여 그를 변형시키도록 지시하는 것인 시스템.
183. 실시양태 182에 있어서, 상기 gRNA가 단일 가이드 RNA (sgRNA)인 시스템.
184. 실시양태 182에 있어서, 상기 gRNA가 이중-가이드 RNA인 시스템.
185. 실시양태 182-184 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM)에 인접하여 위치하는 것인 시스템.
186. 실시양태 182-185 중 어느 하나에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 세포 내에 있는 것인 시스템.
187. 실시양태 186에 있어서, 세포가 진핵생물 세포인 시스템.
188. 실시양태 187에 있어서, 진핵생물 세포가 식물 세포인 시스템.
189. 실시양태 187에 있어서, 진핵생물 세포가 포유동물 세포인 시스템.
190. 실시양태 187에 있어서, 진핵생물 세포가 곤충 세포인 시스템.
191. 실시양태 186에 있어서, 세포가 원핵생물 세포인 시스템.
192. 표적 폴리뉴클레오티드를 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416 또는 420과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 데아미나제와 접촉시키는 것을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드를 탈아미노화시키는 방법이며, 상기 데아미나제 폴리펩티드는 상기 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 뉴클레오티드를 탈아미노화시키는 것인 방법.
193. 표적 폴리뉴클레오티드를 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 아데노신 데아미나제 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 아데노신을 탈아미노화시키는 방법이며:
a) 서열식별번호: 514와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
b) 서열식별번호: 572와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 572의 위치 102에 상응하는 위치에서 리신, 서열식별번호: 572의 위치 104에 상응하는 위치에서 티로신, 및 서열식별번호: 572의 위치 106에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
c) 서열식별번호: 573과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
d) 서열식별번호: 574와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 574의 위치 101에 상응하는 위치에서 글루탐산, 서열식별번호: 574의 위치 103에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 574의 위치 105에 상응하는 위치에서 리신을 포함하는 아미노산 서열;
e) 서열식별번호: 575와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 575의 위치 101에 상응하는 위치에서 리신, 서열식별번호: 575의 위치 103에 상응하는 위치에서 류신, 및 서열식별번호: 575의 위치 105에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
f) 서열식별번호: 576과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 576의 위치 105에 상응하는 위치에서 알라닌 및 서열식별번호: 576의 위치 107에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함하는 아미노산 서열;
g) 서열식별번호: 577과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 577의 위치 102에 상응하는 위치에서 글리신, 서열식별번호: 577의 위치 104에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 577의 위치 106에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함하는 아미노산 서열;
h) 서열식별번호: 578과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 578의 위치 105에 상응하는 위치에서 세린 및 서열식별번호: 578의 위치 107에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
i) 서열식별번호: 579와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 579의 위치 102에 상응하는 위치에서 세린, 서열식별번호: 579의 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 및 서열식별번호: 579의 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신을 포함하는 아미노산 서열;
j) 서열식별번호: 580과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 580의 위치 111에 상응하는 위치에서 글리신을 포함하는 아미노산 서열;
k) 서열식별번호: 581과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 581의 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 서열식별번호: 581의 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신, 및 서열식별번호: 581의 위치 108에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
l) 서열식별번호: 582와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 582의 위치 102에 상응하는 위치에서 아르기닌, 서열식별번호: 582의 위치 104에 상응하는 위치에서 트립토판, 및 서열식별번호: 582의 위치 106에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
m) 서열식별번호: 583과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 583의 위치 104에 상응하는 위치에서 아르기닌 및 서열식별번호: 583의 위치 106에 상응하는 위치에서 세린을 포함하는 아미노산 서열; 및
n) 서열식별번호: 584와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 584의 위치 110에 상응하는 위치에서 페닐알라닌, 서열식별번호: 584의 위치 112에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 584의 위치 114에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
상기 아데노신 데아미나제 폴리펩티드는 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 아데노신을 탈아미노화시키는 것인 방법.
194. 표적 폴리뉴클레오티드를 실시양태 160, 161, 171 및 172 중 어느 하나의 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법이며, 상기 DNA-결합 폴리펩티드는 상기 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하고, 상기 데아미나제는 상기 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 뉴클레오티드를 탈아미노화시키는 것인 방법.
195. 표적 폴리뉴클레오티드를 실시양태 162-170 및 173-181 중 어느 하나의 융합 단백질과 접촉시키고, 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA), 또는 하나 이상의 gRNA를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 도입시키는 것을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법이며;
하나 이상의 gRNA는 상기 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 융합 단백질의 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드와의 복합체를 형성하여, 상기 융합 단백질이 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하도록 지시하고, 융합 단백질의 상기 데아미나제 폴리펩티드는 상기 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 뉴클레오티드를 탈아미노화시켜, 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것인 방법.
196. 실시양태 195에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 세포 내에 있는 것인 방법.
197. 실시양태 196에 있어서, 세포가 진핵생물 세포인 방법.
198. 실시양태 197에 있어서, 진핵생물 세포가 포유동물 세포인 방법.
199. 실시양태 197에 있어서, 진핵생물 세포가 식물 세포인 방법.
200. 실시양태 195 내지 199 중 어느 하나에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 변형이 C에서 T로의 점 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
201. 실시양태 200에 있어서, C 염기의 탈아미노화가 질환 또는 장애와 연관된 서열을 수정하는 것인 방법.
202. 실시양태 200에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 변형이 농작물의 게놈에서 C에서 T로의 변화를 포함하고, C 염기의 탈아미노화가 농작물의 농경학적 품질을 개선시키는 서열을 생성하는 것인 방법.
203. 실시양태 195 내지 199 중 어느 하나에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 변형이 A에서 G로의 점 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
204. 실시양태 203에 있어서, A 염기의 탈아미노화가 질환 또는 장애와 연관된 서열을 수정하는 것인 방법.
205. 실시양태 203에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 변형이 농작물의 게놈에서 A에서 G로의 변화를 포함하고, A 염기의 탈아미노화가 농작물의 농격학적 품질을 개선시키는 서열을 생성하는 것인 방법.
하기 실시예는 설명을 위해 제공되며, 제한하는 것이 아니다.
실험
실시예 1. RNA-가이드된 뉴클레아제의 확인
6개의 별개의 CRISPR-연관된 RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN)를 확인하였고, 하기 표 1에 기재하였다. APG00969, APG03128 및 APG00771은 유형 II-C RGN이다. APG09748, APG02789 및 APG09106은 유형 V-B RGN이다. 표 1은 각각의 RGN의 명칭, 그의 아미노산 서열, 그가 유래된 공급원, 및 가공된 crRNA 반복 서열 및 tracrRNA 서열을 제공한다. 표 1은 sgRNA의 핵산 표적 서열을 결정하는 포괄적인 단일 가이드 RNA (sgRNA) 서열을 추가로 제공한다. 스페이서 서열의 위치는 폴리-N 서열에 의해 표시된다. 이 폴리-N 서열은 sgRNA에서 스페이서 서열의 위치를 나타내고, 기능적인 스페이서 서열에 필요한 길이를 나타내지는 않는다. 유형 II-C RGN 시스템 각각은 tracrRNA의 헤어핀 스템의 염기에서 보존된 서열을 갖고: APG00969는 UNANNC (서열식별번호: 13)를 갖고; APG03128은 ANGNNU (서열식별번호: 23)를 갖고; APG00771은 UNANNA (서열식별번호: 42)를 갖는다.
표 1: 서열식별번호 및 CRISPR 연관된 시스템의 개요
Figure pct00001
실시예 2: 가이드 RNA 확인 및 sgRNA 구축
연구 중인 RNA-가이드된 뉴클레아제 시스템을 본래 발현하는 박테리아의 배양물을 중간-로그 단계 (~0.600의 OD600)로 성장시키고, 펠렛화하고, 급속 냉동하였다. mirVANA miRNA 단리 키트 (라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 캘리포니아주 칼스바드)를 사용하여 RNA를 펠렛으로부터 단리하고, 단리된 RNA로부터 NEBNext 소형 RNA 라이브러리 제조 키트 (NEB, 메사추세츠주 베벌리)를 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 제조하였다. 라이브러리 제조물을 6% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 crRNA 및 tracrRNA를 검출하기 위해 각각 18-65nt 및 90-200nt RNA 종에 상응하는 2가지 크기 분획으로 분획화하였다. 딥 시퀀싱 (더 작은 분획의 경우 40 bp 쌍-말단 및 더 큰 분획의 경우 80bp 쌍-말단)은 Next Seq 500 (하이 아웃풋 키트(High Output kit)) 상에서 서비스 제공자 (모진(MoGene), 미주리주 세인트 루이스)에 의해 수행되었다. 판독을 컷어댑트(Cutadapt)를 사용하여 품질을 다듬고, 보우타이(Bowtie)2를 이용하여 기준 게놈에 맵핑하였다. 커스텀 RNAseq 파이프라인을 파이썬에 기록하여 crRNA 및 tracrRNA 전사체를 검출하였다. 가공된 crRNA 경계를 본래의 반복 스페이서 어레이의 서열 커버리지에 의해 결정하였다. tracrRNA의 안티-반복 부분은 허용적 BLASTn 파라미터를 사용하여 확인하였다. RNA 시퀀싱 깊이는 안티-반복부를 함유하는 전사체를 확인함으로써 가공된 tracrRNA의 경계를 확인시켰다. RNA의 수동 큐레이션을 RNA 폴딩 소프트웨어인 NUPACK에 의해 이차 구조 예측을 이용하여 수행하였다. 대안적으로, APG02789를 위한 tracrRNA는 소형 RNA 시퀀싱을 통해서가 아니라 안티-반복 서열에 의해 생물정보학적으로 결정되었다. 일반적으로, sgRNA 카세트를 DNA 합성에 의해 제조하였고, 일반적으로 APG00771, APG03128 및 APG00969를 위해 다음과 같이 설계되었다 (5'→3') 20-30 bp 스페이서 서열 -- crRNA의 가공된 반복 부분 -- 4 bp 비상보성 링커 (AAAG; 서열식별번호: 8) -- 가공된 tracrRNA. APG09748, APG09106 및 APG02789의 경우, sgRNA 카세트는 다음과 같이 설계되었다 (5'→3'): 가공된 tracrRNA -- 4 bp 비상보성 링커 (AAAG; 서열식별번호: 8) -- crRNA의 가공된 반복 부분) -- 20-30 bp 표적 스페이서 서열. 관련 기술분야에 공지된 다른 4 bp 또는 6 bp 비상보성 링커 또한 sgRNA 설계를 위해 사용될 수 있다. 시험관내 검정의 경우, 진아트(GeneArt)™ 정밀 gRNA 합성 키트 (써모피셔(ThermoFisher))를 사용하여 sgRNA 카세트의 시험관내 전사에 의해 sgRNA를 합성하였다. 각각의 RGN 폴리펩티드에 대한 가공된 crRNA 및 tracrRNA 서열을 확인하였고, 표 1에 제시되어 있다. PAM 라이브러리 1 및 2에 대해 구축된 sgRNA에 대해서는 하기를 참고한다.
실시예 3: 각각의 RGN에 대한 PAM 요건의 결정
각각의 RGN에 대한 PAM 요건을 [Kleinstiver et al. (2015) Nature 523:481-485 및 Zetsche et al. (2015) Cell 163:759-771]로부터 본질적으로 채택된 PAM 고갈 검정을 사용하여 결정하였다. 간략히, 2개의 플라스미드 라이브러리 (L1 및 L2)를 pUC18 백본 (ampR)에서 생성하였고, 이들 각각은 8개의 무작위 뉴클레오티드 (즉, PAM 영역)에 의해 플랭킹된 별개의 30bp 프로토스페이서 (표적) 서열을 함유하였다. RGN APG00969, APG03128 및 APG00771에 대한 라이브러리 1 및 라이브러리 2의 표적 서열 및 플랭킹 PAM 영역은 각각 서열식별번호: 14 및 15이다. RGN AP09748, APG02789 및 APG09106에 대한 라이브러리 1 및 라이브러리 2의 표적 서열 및 플랭킹 PAM 영역은 각각 서열식별번호: 32 및 33이다.
L1 또는 L2에서 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 함유하는 동족 sgRNA와 함께, 본 발명의 RGN을 함유하는 pRSF-1b 발현 벡터 (이. 콜라이에 대해 코돈 최적화됨)를 보유하는 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3) 세포에 라이브러리를 별도로 전기천공하였다. 충분한 라이브러리 플라스미드를 형질전환 반응에서 사용하여, >10^6 CFU를 수득하였다. pRSF-1b 백본에서 RGN 및 sgRNA 둘 다 T7 프로모터의 조절하에 있었다. 형질전환 반응을 1 시간 동안 회복시킨 후, 이를 카르베니실린 및 카나마이신을 함유하는 LB 배지로 희석하고, 밤새 성장시켰다. 다음 날, 혼합물을 자체-유도 오버나이트 익스프레스(Overnight Express)™ 즉석 TB 배지 (밀리포어 시그마(Millipore Sigma))로 희석하여 RGN 및 sgRNA를 발현시키고, 추가 4 시간 또는 20 시간 동안 성장시켰고, 그 후에 세포를 스핀 다운하고, 플라스미드 DNA를 미니-프렙 키트(Mini-prep kit) (퀴아젠(Qiagen), 메릴랜드주 저먼타운)에 의해 단리하였다. 적절한 sgRNA의 존재하에, RGN에 의해 인식가능한 PAM을 함유하는 플라스미드가 절단되어, 집단으로부터 제거될 것이다. RGN에 의해 인식되지 않거나 또는 적절한 sgRNA를 함유하지 않는 박테리아로 형질전환된 PAM을 함유하는 플라스미드는 생존하고 복제할 것이다. 절단되지 않은 플라스미드의 PAM 및 프로토스페이서 영역을 PCR-증폭시키고, 공개된 프로토콜 (16s-메가게놈 라이브러리 제조 가이드 15044223B, 일루미나(Illumina), 캘리포니아주 샌디에고)에 따라 시퀀싱을 위해 준비하였다. 딥 시퀀싱 (80bp 단일 말단 판독)은 서비스 제공자 (모진, 미주리주 세인트 루이스)에 의해 MiSeq (일루미나) 상에서 수행되었다. 전형적으로, 앰플리콘당 1-4M 판독이 수득되었다. PAM 영역을 추출하고, 카운팅하고, 각각의 샘플의 총 판독에 대해 정규화하였다. 플라스미드 절단을 유도하는 PAM은 대조군과 비교할 때 (즉, 라이브러리가 RGN을 함유하지만 적절한 sgRNA가 결여된 이. 콜라이로 형질전환되었을 때) 적게 표시되는 것으로 확인되었다. 신규한 RGN에 대한 PAM 요건을 표시하기 위해, 해당 영역의 모든 서열에 대한 고갈률 (샘플에서 빈도/대조군에서 빈도)을 -log 염기 2 형질전환에 의해 농축 값으로 전환시켰다. 충분한 PAM은 농축 값 >2.3 (고갈률 < ~0.2에 상응함)을 가진 것들로 정의되었다. 두 라이브러리 모두에서 이 역치보다 높은 PAM을 수집하였고, 웹 로고를 생성하기 위해 사용하였으며, 이는 예를 들어 "웹로고(weblogo)"로 공지된 인터넷 상의 웹-기반 서비스를 이용하여 생성될 수 있다. 상위 농축 PAM에서 일정한 패턴이 있을 때 PAM 서열을 확인하고 보고하였다. 각각의 RGN에 대한 PAM (농축 지수 (EF) >2.3을 가짐)이 표 2에 제공된다. 일부 RGN의 경우, 비제한적인 예시적인 PAM (EF>3.3을 가짐) 또한 확인되었다. PAM 배향은 APG00969, APG03128, APG00771의 경우 5'-표적-PAM-3'이고, APG09748, APG09106 및 APG02789의 경우 5'-PAM-표적-3'이다.
표 2: PAM 결정
Figure pct00002
실시예 4: 뉴클레아제 활성을 증가시키기 위한 가이드 RNA의 조작
매우 높은 서열 동일성을 갖고 동일한 PAM을 갖는 RGN APG09748 및 APG09106의 경우, RNA 폴딩 예측을 이용하여, 뉴클레아제 활성을 최적화시키도록 변형될 수 있는 가이드 RNA의 영역을 결정하였다. 반복:안티-반복 영역에서 crRNA:tracrRNA 염기쌍 형성의 안정성은 반복:안티-반복 영역을 단축시키고, G-C 염기쌍을 부가하고, G-U 동요(wobble) 쌍을 제거함으로써 증가되었다. "최적화된" 가이드 변이체를 시험관내 절단 검정에서 RGN APG09748을 이용하여 시험하고 야생형 gRNA와 비교하였다.
RNP 형성을 위한 RGN을 생성하기 위해, C-말단 His6 (서열식별번호: 593) 또는 His10 (서열식별번호: 594) 태그에 융합된 RGN을 함유하는 발현 플라스미드를 구축하고, 이. 콜라이의 BL21 (DE3) 균주로 형질전환시켰다. 발현은 50 μg/mL 카나마이신으로 보충된 매직 미디어(Magic Media) (써모 피셔)를 사용하여 수행하였다. 용해 및 정화 이후, 단백질을 고정된 금속 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하고, 큐빗(Qubit) 단백질 정량화 키트 (써모 피셔)를 사용하여 또는 계산된 소광 계수를 이용하는 UV-vis에 의해 정량화하였다.
리보핵단백질 (RNP)은 정제된 RGN을 sgRNA와 함께 ~2:1 비로 실온에서 20 분 동안 인큐베이션함으로써 제조하였다. 시험관내 절단 반응을 위해, RNP를 바람직한 PAM 서열에 의해 플랭킹된 표적화된 프로토스페이서를 함유하는 플라스미드 또는 선형 dsDNA와 함께 실온에서 >30 분 동안 인큐베이션하였다. TRAC 유전자좌 내의 2가지 표적 핵산 서열, TRAC11 (서열식별번호: 60) 및 TRAC14 (서열식별번호: 61)를 시험하였다. gRNA를 정확한 표적 핵산 서열을 갖는 (예를 들어, gRNA는 TRAC11 스페이서 서열을 갖고, 검정된 표적은 TRAC11임) 및 정확한 표적 핵산 서열을 갖지 않는 (예를 들어, gRNA는 TRAC11 스페이서 서열을 갖고, 검정된 표적이 TRAC14임) 표적화된 활성 둘 다에 대해 검정하였다. 플라스미드 절단에 의해 결정된 활성을 아가로스 겔 전기영동에 의해 평가하였다. 결과는 표 3에 나타내었다. 가이드 변이체는 서열식별번호: 56-59로서 나열되고, 스페이서 서열과 함께 제공된다. 이들 가이드 서열은 AAAA의 비상보성 뉴클레오티드 링커 (서열식별번호: 31)를 사용한다. 반복:안티-반복 결합이 증가된 최적화된 gRNA (서열식별번호: 64; 폴리-N은 스페이서 서열의 위치를 나타냄)는 최적화된 tracrRNA (서열식별번호: 62) 및 최적화된 crRNA (서열식별번호: 63) 성분을 갖는다. 최적화된 가이드 변이체는 이전에 야생형 가이드 RNA를 사용하여 절단이 검출되지 않은 2가지 유전자좌를 절단할 수 있다. 반복:안티-반복 영역에서 혼성화의 최적화를 통해, TRAC 유전자좌에서 다중 표적에 대해 APG09748의 시험관내 절단이 0% 절단에서 100% 절단으로 증가하였다.
표 3: 조작된 가이드 변이체에 의한 APG09748의 편집 효율
Figure pct00003
추가의 최적화된 gRNA 변이체를 설계하고 검정하였다. 추가로, 스페이서 길이가 절단 효율에 어떻게 영향을 미치는지 결정하기 위해 상이한 길이의 스페이서 서열 또한 시험하였다. 스페이서 서열 외부의 sgRNA는 이 검정에서 "백본"으로 지칭된다. 표 4에서, 이들은 "WT" (서열식별번호: 53, 야생형 서열), 및 3가지 최적화된 sgRNA: V1 (서열식별번호: 65), V2 (서열식별번호: 66) 및 V3 (서열식별번호: 64)으로 표시된다. 이들 서열 모두 스페이서 서열의 위치를 나타내기 위해 폴리-N을 갖는다. 가이드는 시험관내 전사 (IVT)에 의해 sgRNA로 발현되었다. 야생형 sgRNA 백본과 비교하여, V1은 87.8% 동일하고, V2는 92.4% 동일하고, V3은 85.5% 동일하다. 이중-가이드 RNA를 나타내지만 그 외에는 상기 인용된 야생형 및 최적화된 sgRNA와 유사한 합성 tracrRNA:crRNA 듀플렉스 ("합성") 또한 생성하여 시험하였다.
이 검정 세트의 경우, RGN APG09106이 사용되었고; 그 외에는 시험관내 절단 반응을 위한 방법이 상기 기재된 것과 유사하였다. 표적화된 핵산 서열은 표적 1 (서열식별번호: 67) 및 표적 2 (서열식별번호: 68)이었다. 결과는 표 4에 나타내었다.
표 4: 조작된 가이드 변이체에 의한 APG09106의 편집 효율
Figure pct00004
실시예 5: 포유동물 세포에서 유전자 편집 활성의 입증
실시예 5.1: 포유동물 세포에서 APG02789의 활성
인간 발현을 위해 코돈 최적화된 RGN 뉴클레오티드 서열을 N-말단 핵 국재화 태그를 사용하여 합성하고, pcDNA3.1 CMV 발현 플라스미드에 클로닝하였다. RGN 폴리펩티드의 최종 구축물은 다음과 같다: N-말단 -SV40 NLS (서열식별번호: 10)- 3X FLAG 태그 (서열식별번호: 11)- RGN 서열 (서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50)- 뉴클레오플라스민 NLS (서열식별번호: 12)- C-말단. sgRNA 서열의 발현을 유도하는 U6 프로모터를 포함하는 PCR 앰플리콘은 허큘라제(Herculase) II (애질런트 테크놀로지즈(Agilent Technologies))를 사용하여 생성하였다. 400 ng의 RGN 발현 플라스미드 및 100 ng의 sgRNA PCR 생성물을 리포펙타민 2000 시약 (라이프 테크놀로지즈)을 사용하여 75-90% 전면생장에서 HEK293FT 세포의 24-웰 플레이트로 형질감염시켰다. 세포를 형질감염 후에 게놈 DNA 추출 전에 37℃에서 72 시간 동안 인큐베이션하였다. 게놈 DNA를 제조자의 프로토콜에 따라 퀵익스트랙트(QuickExtract) DNA 추출 용액 (에피센터(Epicentre))을 사용하여 추출하였다. RGN 표적 부위를 플랭킹하는 게놈 영역을 PCR 증폭시키고, 생성물을 제조자의 프로토콜에 따라 퀴아퀵 스핀 컬럼(QiaQuick Spin Column) (퀴아젠)을 사용하여 정제하였다. 200-500 ng의 총 정제된 PCR 생성물을 10 μl의 최종 부피로 1 μl의 10x Taq DNA 폴리머라제 PCR 완충제 (엔자이마틱스(Enzymatics)) 및 초순수와 혼합하고, 재어닐링 과정에 적용하여 헤테로듀플렉스를 형성하였다: 10 분 동안 95℃, -2℃/s 속도로 95℃에서 85℃로, -0.25℃/s 속도로 85℃에서 25℃로, 및 1 분 동안 25℃ 유지. 재어닐링 이후, 생성물을 제조자의 권고된 프로토콜에 따라 서베이어 뉴클레아제 및 서베이어 인핸서 S (인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈(Integrated DNA Technologies))로 처리하고, 4-20% 노벡스(Novex) TBE 폴리아크릴아미드 겔 (라이프 테크놀로지즈) 상에서 분석하였다. 겔을 SYBR 골드 DNA 염색 (라이프 테크놀로지즈)으로 10 분 동안 염색하고, 겔 독(Gel Doc) 겔 영상화 시스템 (바이오-라드(Bio-rad))으로 영상화하였다. 정량화는 상대적인 밴드 강도를 기반으로 하였다. Indel 백분율은 하기 식에 의해 결정하고: 100x(1-(1-(b+c)/(a+b+c))½), 여기서 a는 소화되지 않은 PCR 생성물의 통합 강도이고, b 및 c는 각각의 절단 생성물의 통합 강도이다.
RGN APG02789의 경우, 상기 기재된 바와 같이 방법을 수행하였다. 인간 게놈에서 수많은 상이한 유전자가 RNA-가이드된 절단을 위해 표적화되었다. 이들 유전자좌는 sgRNA의 서열식별번호에 대한 참고와 함께 하기 표 5에 포함된다. RGN 활성의 지표인 indel 백분율 또한 나타낸다.
표 5: 포유동물 세포에서 APG02789의 활성
Figure pct00005
실시예 5.2: 포유동물 세포에서 APG09106의 활성
RGN 발현 카세트를 생성하여, 포유동물 발현을 위해 벡터에 도입하였다. RGN APG00969, APG03128, APG09748, APG09106 및 APG02789 각각을 인간 발현을 위해 코돈-최적화시켰고 (각각 서열식별번호: 357-361), 발현된 단백질을 N-말단에서 SV40 핵 국재화 서열 (NLS; 서열식별번호: 10)에 및 3xFLAG 태그 (서열식별번호: 11)에 작동가능하게 융합시켰고, C-말단에서 뉴클레오플라스민 NLS 서열 (서열식별번호: 12)에 작동가능하게 융합시켰다. 직렬식으로 작동가능하게 융합된 NLS 서열의 2개의 카피를 사용하였다. 각각의 발현 카세트는 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (서열식별번호: 334)의 조절하에 있었다. CMV 전사 인핸서 (서열식별번호: 335) 또한 CMV 프로모터를 포함하는 구축물에 포함될 수 있음이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 인간 RNA 폴리머라제 III U6 프로모터 (서열식별번호: 336)의 조절하에 단일 gRNA 각각을 코딩하는 가이드 RNA 발현 구축물을 생성하여, 발현 벡터에 도입하였다. 가이드는 AurkB 유전자의 영역을 표적화하였다. 한 RNA-가이드된 뉴클레아제의 경우, 단백질의 뉴클레아제 활성을 증가시키기 위해 특정 잔기를 돌연변이시켰고, 구체적으로 APG09106의 T849 잔기를 아르기닌 (서열식별번호: 362)으로 돌연변이시켰다. 이 점 돌연변이는 포유동물 세포에서 편집률을 증가시켰다.
상기 기재된 구축물을 포유동물 세포에 도입하였다. 형질감염 하루 전날에, 1x105 HEK293T 세포 (시그마)을 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM) 플러스 10% (vol/vol) 태아 소 혈청 (깁코(Gibco)) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (깁코) 중에서 24-웰 디쉬에 플레이팅하였다. 세포가 50-60% 전면생장한 다음 날, 500 ng의 RGN 발현 플라스미드 플러스 500 ng의 단일 gRNA 발현 플라스미드를 제조자의 지침에 따라 웰당 1.5 μL의 리포펙타민 3000 (써모 사이언티픽)을 사용하여 공동 형질감염시켰다. 48 시간 성장시킨 후, 총 게놈 DNA를 제조자의 지침에 따라 게놈 DNA 단리 키트 (마쉐리-나겔(Machery-Nagel))를 사용하여 수확하였다.
이어서, 총 게놈 DNA를 분석하여, AurkB 표적에서 편집률을 결정하였다. 올리고뉴클레오티드를 생성하여, PCR 증폭, 및 증폭된 게놈 표적 부위 (서열식별번호: 363 및 364)의 후속적인 분석을 위해 사용하였다. 모든 PCR 반응은 0.5 μM의 각각의 프라이머를 포함하는 20 μL 반응 중에서 10 μL의 2X 마스터 믹스 퓨전 하이-피델리티(Master Mix Phusion High-Fidelity) DNA 폴리머라제 (써모 사이언티픽)를 사용하여 수행하였다. 먼저, 각각의 표적 유전자를 포함하는 큰 게놈 영역을 PCR#1 프라이머 (서열식별번호: 363 및 364)를 사용하고 하기 프로그램을 이용하여 증폭시켰다: 98℃, 1 분; [98℃, 10 초; 62℃, 15 초; 72℃, 5 분]의 30 주기; 72℃, 5 분; 12℃, 계속.
이어서, 1 마이크로리터의 이 PCR 반응을 각각의 가이드에 대해 특이적인 프라이머 (PCR#2 프라이머; 서열식별번호: 365-370)를 사용하고 하기 프로그램을 이용하여 추가로 증폭시켰다: 98℃, 1 분; [98℃, 10 초; 67℃, 15 초; 72℃, 30 초]의 35 주기; 72℃, 5 분; 12℃, 계속. PCR#2에 대한 프라이머에는 일루미나 시퀀싱을 위한 넥스테라(Nextera) 판독 1 및 판독 2 트랜스포사제 어댑터 오버행 서열이 포함된다.
제2 PCR 증폭 이후, DNA를 제조자의 지침에 따라 PCR 클린업 키트 (자이모(Zymo))를 사용하여 세척하고, 물에 용리시켰다. 200-500ng의 정제된 PCR#2 생성물을 20 μL 반응 중에서 2 μL의 10X NEB 완충제 2 및 물과 합하고, 하기 프로그램을 이용하여 어닐링하여 헤테로듀플렉스 DNA를 생성하였다: 95℃, 5 분; 95-85℃, 2℃/초의 속도로 냉각; 85-25℃, 0.1℃/초의 속도로 냉각; 12℃, 계속. 어닐링 후에, 5 μL의 DNA를 비 효소 대조군으로서 제거하였고, 1 μL의 T7 엔도뉴클레아제 I (NEB)을 첨가하고, 반응을 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 이후, 5x 플래쉬겔(FlashGel) 로딩 염료 (론자(Lonza))를 첨가하고, 겔 전기영동을 이용하여 2.2% 아가로스 플래쉬겔 (론자)에 의해 5 μL의 각각의 반응 및 대조군을 분석하였다. 겔의 가시화 이후에, 비상동성 말단 결합 (NHEJ)의 백분율은 하기 방정식을 이용하여 결정하였고: %NHEJ 사건 = 100 x [1-(1-절단된 분획)(½)], 여기서 (절단된 분획)은 다음과 같이 정의된다: (소화된 생성물의 밀도)/(소화된 생성물의 밀도 + 소화되지 않은 모 밴드).
일부 샘플의 경우, 서베이어®를 이용하여 포유동물 세포에서의 발현 이후의 결과를 분석하였다. 형질감염 이후 세포를 37℃에서 72 시간 동안 인큐베이션한 다음, 게놈 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA는 제조자의 프로토콜에 따라 퀵익스트랙트 DNA 추출 용액 (에피센터)을 사용하여 추출하였다. RGN 표적 부위를 플랭킹하는 게놈 영역을 PCR 증폭시키고, 생성물을 제조자의 프로토콜에 따라 퀴아퀵 스핀 컬럼 (퀴아젠)을 사용하여 정제하였다. 200-500 ng의 총 정제된 PCR 생성물을 10 μl의 최종 부피로 1 μl의 10x Taq DNA 폴리머라제 PCR 완충제 (엔자이마틱스) 및 초순수와 혼합하고, 재어닐링 과정에 적용하여 헤테로듀플렉스를 형성하였다: 10 분 동안 95℃, -2℃/s 속도로 95℃에서 85℃로, -0.25℃/s 속도로 85℃에서 25℃로, 및 1 분 동안 25℃ 유지.
재어닐링 이후, 생성물을 제조자의 권고된 프로토콜에 따라 서베이어® 뉴클레아제 및 서베이어® 인핸서 S (인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈)로 처리하고, 4-20% 노벡스(Novex) TBE 폴리아크릴아미드 겔 (라이프 테크놀로지즈) 상에서 분석하였다. 겔을 SYBR 골드 DNA 염색 (라이프 테크놀로지즈)으로 10 분 동안 염색하고, 겔 독(Gel Doc) 겔 영상화 시스템 (바이오-라드)으로 영상화하였다. 정량화는 상대적인 밴드 강도를 기반으로 하였다. Indel 백분율은 하기 식에 의해 결정하고: 100x(1-(1-(b+c)/(a+b+c))½), 여기서 a는 소화되지 않은 PCR 생성물의 통합 강도이고, b 및 c는 각각의 절단 생성물의 통합 강도이다.
추가로, 일루미나 오버행 서열을 함유하는 PCR#2로부터의 생성물은 일루미나 16S 메가게놈 시퀀싱 라이브러리 프로토콜에 따라 라이브러리 제조를 거쳤다. 딥 시퀀싱은 서비스 제공자 (모진)에 의해 일루미나 Mi-Seq 플랫폼 상에서 수행되었다. 전형적으로 앰플리콘당 200,000개의 250 bp 쌍-말단 판독 (2 x 100,000 판독)이 생성된다. 판독을 CRISPResso (Pinello, et al. 2016 Nature Biotech, 34:695-697)를 이용하여 분석하여, 편집률을 계산하였다. 출력 정렬을 수동-큐레이션하여, 삽입 및 결실 부위를 확인할 뿐만 아니라, 재조합 부위에서 미세상동성 부위를 확인하였다. 편집률은 표 6에 나타내었다. 모든 실험은 인간 세포에서 수행하였다. "표적 서열"은 유전자 표적 내의 표적화된 서열이다. 각각의 표적 서열의 경우, 가이드 RNA는 사용된 RGN에 따라 상보성 RNA 스페이서 서열 및 적절한 sgRNA를 포함하였다. 가이드 RNA에 의한 선택된 실험 분석은 표 7.1 및 7.2에 나타내었다.
표 6: AurkB 유전자 표적에 대한 전체 편집률
Figure pct00006
각각의 가이드에 대한 특이적인 삽입 및 결실을 표 7.1 및 7.2에 나타내었다. 이들 표에서, 표적 서열은 굵은 대문자로 표시되었다. 8합체 PAM 영역은 이중 밑줄로 표시되었고, 인식된 주요 뉴클레오티드는 굵게 표시되었다. 삽입은 소문자로 표시되었다. 결실은 점선 (---)으로 나타내었다. INDEL 위치는 표적 서열의 PAM 근위 엣지로부터 계산되고, 엣지는 위치 0이다. 위치가 엣지의 표적 쪽에 있는 경우, 위치는 양수 (+)이고; 위치가 엣지의 PAM 쪽에 있는 경우, 위치는 음수 (-)이다.
표 7.1: RGN APG09106을 사용한 가이드 831에 대한 특이적인 삽입 및 결실
Figure pct00007
표 7.2: APG09106 T849R을 사용한 가이드 831에 대한 특이적인 삽입 및 결실
Figure pct00008
실시예 6: 식물 세포에서 유전자 편집 활성의 입증
본 발명의 RGN의 RNA-가이드된 뉴클레아제 활성을 [Li, et al., 2013 (Nat. Biotech. 31:688-691)]로부터 채택된 프로토콜을 이용하여 식물 세포에서 입증하였다. 간략히, N-말단 SV40 핵 국재화 신호를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 RGN (서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50)의 식물 코돈 최적화된 버전을 일시적인 형질전환 벡터에서 강한 구성적 35S 프로모터 뒤에 클로닝한다. 적절한 PAM 서열을 플랭킹하는 식물 PDS 유전자에서 하나 이상의 부위를 표적화하는 sgRNA는 제2 일시적인 발현 벡터에서 식물 U6 프로모터 뒤에 클로닝한다. PEG-매개된 형질전환을 이용하여 발현 벡터를 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 엽육 원형질체에 도입시킨다. 형질전환된 원형질체를 어두운 곳에서 최대 36 시간 동안 인큐베이션한다. DNeasy 식물 미니 키트 (퀴아젠)를 사용하여 게놈 DNA를 원형질체로부터 단리한다. RGN 표적 부위를 플랭킹하는 게놈 영역을 PCR 증폭시키고, 생성물을 제조자의 프로토콜에 따라 퀴아퀵 스핀 컬럼 (퀴아젠)을 사용하여 정제한다. 200-500 ng의 총 정제된 PCR 생성물을 10 μl의 최종 부피로 1 μl 10x Taq DNA 폴리머라제 PCR 완충제 (엔자이마틱스) 및 초순수와 혼합하고, 재어닐링 과정에 적용하여 헤테로듀플렉스를 형성한다: 10 분 동안 95℃, -2℃/s 속도로 95℃에서 85℃로, -0.25℃/s 속도로 85℃에서 25℃로, 및 1 분 동안 25℃ 유지.
재어닐링 이후, 생성물을 제조자의 권고된 프로토콜에 따라 서베이어 뉴클레아제 및 서베이어 인핸서 S (인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈)로 처리하고, 4-20% 노벡스 TBE 폴리아크릴아미드 겔 (라이프 테크놀로지즈) 상에서 분석한다. 겔을 SYBR 골드 DNA 염색 (라이프 테크놀로지즈)에 의해 10 분 동안 염색하고, 겔 독 겔 영상화 시스템 (바이오-라드)에 의해 영상화한다. 정량화는 상대적인 밴드 강도를 기반으로 한다. Indel 백분율은 하기 식에 의해 결정하고: 100x(1-(1-(b+c)/(a+b+c))½), 여기서 a는 소화되지 않은 PCR 생성물의 통합 강도이고, b 및 c는 각각의 절단 생성물의 통합 강도이다.
실시예 7: 질환 표적의 확인
임상 변이체의 데이터베이스를 NCBI ClinVar 웹사이트에서 월드 와이드 웹을 통해 입수가능한 NCBI ClinVar 데이터베이스로부터 수득하였다. 병원성 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 이 목록으로부터 확인하였다. 게놈 유전자좌 정보를 이용하여, 각각의 SNP와 중복되고 그를 둘러싸는 영역에서 CRISPR 표적을 확인하였다. 본 발명의 RGN의 조합물에서 염기 편집을 이용하여 원인 돌연변이 ("Casl Mut.")를 표적화하도록 수정될 수 있는 SNP의 선택은 표 8에 나열되어 있다. 표 8에서, 각각의 질환의 하나의 가명만이 나열된다. "RS#"는 NCBI 웹사이트에서 SNP 데이터베이스를 통해 확인된 RS 수탁 번호에 상응한다. 대립유전자ID는 원인 대립유전자 수탁 번호에 상응하고, 염색체 수탁 번호는 또한 NCBI 웹사이트를 통해 확인된 수탁 참고 번호를 제공한다. 표 8은 또한 각각의 질환에 대해 나열된 RGN에 적합한 게놈 표적 서열 정보를 제공한다. 표적 서열 정보는 또한 본 발명의 상응하는 RGN에 대해 필요한 sgRNA의 생성을 위해 프로토스페이서 서열을 제공한다.
표 8: 본 발명의 RGN에 대한 질환 표적
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실시예 8: 헐러 증후군의 원인이 되는 표적화 돌연변이
다음은 헐러 증후군을 가진 대부분의 환자에서 상기 질환의 원인이 되는 돌연변이를 수정하는 RNA 지정된 염기 편집 시스템을 이용하여 MPS-1로도 지칭되는 헐러 증후군에 대한 잠재적인 치료법을 기재한다. 이 접근법은 RNA 유도되고 광범위한 조직 유형으로 전달을 위해 단일 AAV 벡터에 팩키징될 수 있는 염기 편집 융합 단백질을 이용한다. 사용된 정확한 조절 요소 및 염기 편집기 도메인에 따라, 질환 유전자좌를 표적화하기 위해 염기 편집 융합 단백질 및 단일 가이드 RNA 둘 다를 코딩하는 단일 벡터를 조작하는 것 또한 가능할 수 있다.
실시예 8.1: 이상적인 PAM에 의한 RGN의 확인
유전 질환 MPS-1은 리소좀에서 데르마탄 술페이트 및 헤파란 술페이트가 분자 수준으로 축적되는 것을 특징으로 하는 리소좀 저장 질환이다. 이 질환은 일반적으로 α-L-이두로니다제를 코딩하는 IDUA 유전자 (NCBI 기준 서열 NG_008103.1)에서의 돌연변이에 의해 유발된 선천성 유전 장애이다. 상기 질환은 α-L-이두로니다제 결핍의 결과이다. 북유럽 배경을 갖는 개인의 연구에서 확인된 가장 흔한 IDUA 돌연변이는 W402X 및 Q70X이고, 두 넌센스 돌연변이 모두 조기 번역 종결을 일으킨다 (Bunge et al. (1994), Hum. Mol. Genet, 3(6): 861-866, 본원에 참고로 포함됨). 단일 뉴클레오티드의 복귀가 야생형 코딩 서열을 복구하고, 유전자좌의 내인성 조절 메카니즘에 의해 조절되는 단백질 발현을 일으킨다.
인간 Idua 유전자의 W402X 돌연변이는 MPS-1H 사례의 높은 비율을 차지한다. 염기 편집기는 가이드 RNA의 프로토스페이서 성분의 결합 부위에 비해 좁은 서열 범위를 표적화할 수 있고, 따라서 표적 유전자좌로부터 특정한 거리에서 PAM 서열의 존재가 전략의 성공에 필수적이다. 염기 편집 단백질의 상호작용 동안에 표적 돌연변이가 노출된 비-표적 가닥 (NTS) 상에 있어야 하고, RGN 도메인의 풋프린트가 PAM 근처의 영역으로의 접근을 차단할 것이라는 제약을 고려할 때, 접근가능한 유전자좌는 PAM으로부터 10-30 bp인 것으로 생각된다. 이 범위에서 근처의 다른 아데노신 염기의 편집 및 돌연변이 유발을 피하기 위해, 상이한 링커가 스크리닝된다. 이상적인 범위는 PAM으로부터 12-16 bp이다.
RGN APG00969는 상용성인 PAM 서열을 갖는다. APG00969는 5'- nnARV-3'의 PAM 서열 (서열식별번호: 7)을 갖고, 소형의 크기를 가지며, 이는 잠재적으로 단일 AAV 벡터를 통한 전달을 가능하게 한다. 이 전달 접근법은 다른 것들에 비해 광범위한 조직 (간, 근육, CNS)으로의 접근, 및 잘 확립된 안전성 프로파일 및 제작 기술과 같은 다양한 이점을 제공한다.
에스. 피로게네스로부터의 Cas9 (SpyCas9)는 W402X 유전자좌 근처에 존재하는 NGG의 PAM 서열 (서열식별번호: 323)을 필요로 하지만, SpyCas9의 크기는 단일 AAV 벡터로 팩키징되는 것을 방지하며, 따라서 상기 언급된 이 접근법의 이점을 포기한다. 이중 전달 전략이 이용될 수 있지만 (예를 들어, Ryu et al., (2018), Nat. Biotechnol., 36(6): 536-539, 본원에 참고로 포함됨), 이는 상당한 제작 복잡성 및 비용을 부가할 것이다. 추가로, 주어진 세포에서 성공적으로 편집되려면 세포에서 융합 단백질의 벡터 및 조립체 둘 다로의 감염을 필요로 하기 때문에, 이중 바이러스 벡터 전달은 유전자 수정의 효율을 상당히 감소시킨다.
흔히 사용되는 에스. 아우레우스로부터의 Cas9 병렬상동체 (SauCas9)는 SpyCas9에 비해 상당히 작은 크기를 갖지만, 더 복잡한 PAM 요건 - NGRRT (서열식별번호: 324)을 갖는다. 그러나, 이 서열은 원인 유전자좌의 염기 편집에 유용할 것으로 예상되는 범위 내에 있지 않다.
실시예 8.2: RGN 융합 구축물 및 sgRNA 서열
하기 도메인을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 생성된다: 1) DNA 절단 활성 ("데드" 또는 "닉카제")을 불활성화시키는 돌연변이를 갖는 RGN 도메인; 2) 염기 편집에 유용한 아데노신 데아미나제. 하기 표 (표 9)에 기재된 구축물은 염기 편집 활성 도메인을 갖는 융합 단백질, 이 실시예에서는 데드 RGN APG00969 (서열식별번호: 327)의 N-말단에 작동가능하게 융합된 APG02312 (서열식별번호: 325)의 돌연변이된 변이체를 포함한다. 염기 편집 활성 도메인은 본 발명의 임의의 아데노신 데아미나제, 예를 들어 서열식별번호: 514 또는 572-584일 수 있다. 융합 단백질 또한 RGN의 C-말단에서 염기-편집 효소로 제조될 수 있음이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 추가로, 융합 단백질의 RGN 및 염기 편집기는 전형적으로 링커 아미노 서열에 의해 분리된다. 표준 링커의 길이가 15-30개 아미노산 범위임이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 추가로, RGN과 염기-편집 효소 사이의 특정한 융합 단백질 또한 염기 편집 효율을 증가시킬 수 있는 적어도 하나의 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인 (서열식별번호: 570)을 포함할 수 있음이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (미국 특허 번호 10,167, 457, 본원에 참고로 포함됨). 따라서, 융합 단백질은 RGN APG00969 또는 그의 변이체, 아데노신 데아미나제, 및 임의적으로 적어도 하나의 UGI를 포함할 수 있다.
표 9: RNA-표적화된 염기 편집을 위한 구축물
Figure pct00025
RGN의 접근가능한 편집 부위는 PAM 서열에 의해 결정된다. RGN을 염기 편집 도메인과 조합할 때, NTS가 단일 가닥이지만 RGN이 유전자좌와 연관되기 때문에, 편집을 위한 표적 잔기는 비-표적 가닥 (NTS) 상에 있어야 한다. 수많은 뉴클레아제 및 상응하는 가이드 RNA의 평가는 이 특정한 유전자좌에 대해 가장 적절한 유전자 편집 도구의 선택을 가능하게 한다. 인간 Idua 유전자에서 상기 기재된 구축물에 의해 표적화될 수 있는 몇몇 잠재적인 PAM 서열은 W402X 돌연변이의 원인이 되는 돌연변이성 뉴클레오티드의 근처에 있다. 1) 질환 유전자좌에서 비-코딩 DNA 가닥에 대해 상보성인 "스페이서"; 및 2) 가이드 RNA와 RGN의 회합을 위해 필요한 RNA 서열을 함유하는 가이드 RNA 전사체를 코딩하는 서열 또한 생성된다. 이러한 sgRNA는 예를 들어 서열식별번호: 356에 의해 코딩될 수 있다. 관련 기술분야의 기술자에 의해 고안될 수 있는 이러한 sgRNA 또는 유사한 sgRNA는 상기 염기 편집기 또는 상이한 RGN-데아미나제 융합체를 갖는 염기 편집기를 관심 유전자좌로 지시하는데 있어서 그들의 효율에 대해 평가될 수 있다.
실시예 8.3: 헐러 질환 환자로부터의 세포에서 활성에 대한 검정
유전자형 전략을 검증하고 상기 기재된 구축물을 평가하기 위해, 헐러 질환 환자로부터의 섬유모세포를 사용한다. 인간 세포에서 이들의 발현을 위해 융합 단백질 코딩 서열 및 sgRNA 코딩 서열의 상류에 적절한 프로모터를 함유하는 벡터가 설계되며, 이는 실시예 5에 기재된 이들 벡터와 유사하다. 인간 세포에서 높은 발현 수준을 갖는 것으로 공지되어 있거나 또는 섬유모세포 세포에서 특이적으로 잘 발현될 수 있는 프로모터 및 다른 DNA 요소 (예를 들어 인핸서, 또는 종결인자) 또한 사용될 수 있는 것으로 인지된다. 벡터를 표준 기술, 예를 들어 실시예 5에 기재된 것과 유사한 형질감염을 이용하여 섬유모세포에 형질감염시킨다. 대안적으로, 전기천공을 이용할 수 있다. 세포를 1 - 3 일 동안 배양한다. 게놈 DNA (gDNA)를 표준 기술을 이용하여 단리한다. 편집 효율은 하기에 추가로 기재된 바와 같이 정제된 gDNA에 대해 qPCR 유전자형 분석 검정 및/또는 차세대 시퀀싱을 수행함으로써 결정된다.
탁맨(Taqman)™ qPCR 분석은 야생형 및 돌연변이성 대립유전자에 대해 특이적인 프로브를 사용한다. 이들 프로브는 qPCR 장비를 사용하여 그들의 스펙트럼 여기 및/또는 방출 성질에 의해 분석되는 형광단을 보유한다. PCR 프라이머 및 프로브를 함유하는 유전자형 분석 키트는 상업적으로 입수될 수 있거나 (즉, SNP ID rs121965019의 경우 써모 피셔 탁맨™ SNP 유전자형 분석 검정ID C__27862753_10) 또는 설계될 수 있다. 설계된 프라이머 및 프로브 세트의 예는 표 10에 제시된다.
표 10: RT-PCR 프라이머 및 프로브
Figure pct00026
편집 실험 이후에, gDNA는 표준 방법 및 상기 기재된 프라이머 및 프로브를 사용하여 qPCR 분석에 적용된다. 예상된 결과가 표 11에 제시된다. 이 시험관내 시스템을 이용하여 구축물을 편리하게 평가할 수 있고, 추가의 연구를 위해 높은 편집 효율을 갖는 것을 선택할 수 있다. 상기 시스템은 W402X 돌연변이가 있는 및 없는 세포와, 바람직하게는 이 돌연변이에 대해 이형접합성인 일부 세포와 비교하여 평가될 것이다. Ct 값은 Sybr 그린과 같은 염료를 사용하여 기준 유전자 또는 유전자좌의 총 증폭과 비교될 것이다.
표 11: 예상된 qPCR 결과
Figure pct00027
조직은 또한 차세대 시퀀싱에 의해 분석될 수 있다. 하기 (표 12) 제시된 것들과 같은 프라이머 결합 부위, 또는 관련 기술분야의 기술자에 의해 확인될 수 있는 다른 적합한 프라이머 결합 부위를 사용할 수 있다. PCR 증폭 이후에, 일루미나 넥스테라 XT 오버행 서열을 함유하는 생성물은 일루미나 16S 메타게놈 시퀀싱 라이브러리 프로토콜에 따라 라이브러리 제조를 거쳤다. 딥 시퀀싱은 일루미나 Mi-Seq 플랫폼 상에서 수행한다. 전형적으로, 앰플리콘당 200,000개의 250 bp 쌍-말단 판독 (2 x 100,000 판독)이 생성된다. 판독을 CRISPResso (Pinello et al., 2016)를 이용하여 분석하여 편집률을 계산한다. 출력 정렬을 수동-큐레이션하여, 삽입 및 결실 부위를 확인할 뿐만 아니라, 재조합 부위에서 미세상동성 부위를 확인한다.
표 12: NGS 프라이머 결합 부위
Figure pct00028
항-IDUA 항체를 사용하는 형질감염된 세포 및 대조군 세포의 세포 용해물의 웨스턴 블롯팅을 수행하여 전장 단백질의 발현을 검증하고, 기질 4-메틸움벨리페릴 a-L-이두로니드를 사용하는 세포 용해물에 대한 효소 활성 검정은 효소가 촉매 활성임을 검증한다 ([Hopwood et al., Clin.Chim. Acta (1979), 92(2): 257-265], 본원에 참고로 포함됨). 이들 실험은 원래의 IduaW402X/W402X 세포주 (형질감염 없음), 염기 편집 구축물 및 무작위 가이드 서열에 의해 형질감염된 IduaW402X/W402X 세포주, 및 야생형 IDUA를 발현하는 세포주와 비교하여 수행된다.
실시예 8.4: 뮤린 모델에서 질환 치료 검증
이 치료 접근법의 효능을 검증하기 위해, 유사한 아미노산에서 넌센스 돌연변이를 갖는 마우스 모델을 이용한다. 마우스 균주는 헐러 증후군 환자에서의 상동성 돌연변이에 상응하는 그의 Idua 유전자 (Gene ID: 15932)에 W392X 돌연변이를 보유한다 ([Bunge et al., (1994), Hum. Mol. Genet. 3(6): 861-866], 본원에 참고로 포함됨). 이 유전자좌는 이전 실시예에 기재된 염기 편집기에 의한 수정을 위해 필요한 PAM 서열이 결여된 인간 서열과 비교하여 별개의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 따라서 뉴클레오티드 수정을 수행하기 위해 별개의 융합 단백질의 설계를 필요로 한다. 이 동물에서 상기 질환의 개선은 유전자 전달 벡터에 의해 접근가능한 조직에서 돌연변이를 수정하는 치료 접근법을 검증할 수 있다.
이 돌연변이에 대해 동형접합성인 마우스는 헐러 증후군 환자와 유사한 수많은 표현형 특징을 나타낸다. RNA 가이드 서열과 함께 상기 (표 9) 기재된 염기 편집-RGN 융합 단백질을 마우스에서 단백질 발현 및 RNA 전사를 가능하게 하는 발현 벡터에 혼입시킨다. 연구 설계는 하기 표 13에 제시된다. 연구에는 염기-편집 융합 단백질 및 RNA 가이드 서열을 포함하는 고용량의 발현 벡터, 저용량의 동일한 발현 벡터로 처리된 그룹, 염기 편집 융합 단백질 또는 가이드 RNA를 포함하지 않는 발현 벡터로 처리된 모델 마우스인 대조군, 및 동일한 빈 벡터로 처리된 야생형 마우스인 제2 대조군이 포함된다.
표 13: 뮤린 모델에서 게놈 편집 실험
Figure pct00029
평가를 위한 종점에는 체중, 소변 GAG 배설, 혈청 IDUA 효소 활성, 관심 조직에서 IDUA 활성, 조직 병리학, SNP의 수정을 검증하기 위한 관심 조직의 유전자형 분석, 및 거동적 및 신경학적 평가가 포함된다. 일부 종점은 종료되기 때문에, 예를 들어 연구 종료 이전에 조직 병리학 및 조직 IDUA 활성을 평가하기 위해 추가의 그룹을 추가할 수 있다. 추가의 종점의 예는 헐러 증후군 동물 모델을 확립하는 공개된 논문에서 확인할 수 있다 ([Shull et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91(26): 12937-12941; Wang et al. (2010), Mol. Genet. Metab., 99(1): 62-71; Hartung et al. (2004), Mol. Ther., 9(6): 866-875; Liu et al. (2005), Mol. Ther., 11(1): 35-47; Clarke et al. (1997), Hum. Mol. Genet. 6(4): 503-511]; 모두 본원에 참고로 포함됨).
한 가지 가능한 전달 벡터는 아데노 연관된 바이러스 (AAV)를 이용한다. 벡터는 CMV 인핸서 (서열식별번호: 335) 및 프로모터 (서열식별번호: 334) 또는 다른 적합한 인핸서 및 프로모터 조합물, 임의적으로 코작 서열 뒤에 있으며, 3' 말단에서 종결인자 서열 및 폴리아데닐화 서열, 예컨대 [Levitt, N.; Briggs, D.; Gil, A.; Proudfoot, N. J. Definition of an Efficient Synthetic Poly(A) Site. Genes Dev. 1989, 3 (7), 1019-1025]에 기재된 최소 서열에 작동가능하게 융합된 염기 편집기-dRGN 융합 단백질 코딩 서열 (예를 들어, 상기 기재된 Nuc-ADAT-링커-dAPG19748-링커-SV40)을 포함하도록 생성된다. 벡터는 그의 5' 말단에서 인간 U6 프로모터 (서열식별번호: 336), 또는 소형 비-코딩 RNA의 생성에 적합한 또 다른 프로모터에 작동가능하게 연결된 단일 가이드 RNA를 코딩하는 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있고, AAV 캡시드로의 팩키징에 필요하며 관련 기술분야에 널리 공지된 역전된 말단 반복 (ITR) 서열을 추가로 포함할 수 있다. 생성 및 바이러스 팩키징은 표준 방법, 예컨대 미국 특허 번호 9,587,250 (본원에 참고로 포함됨)에 기재된 방법에 의해 수행된다.
다른 가능한 바이러스 벡터에는 아데노바이러스 및 렌티바이러스 벡터가 포함되며, 이들은 흔히 사용되고, 상이한 팩키징 능력 및 요건과 함께 유사한 요소를 함유한다. 비-바이러스 전달 방법, 예컨대 지질 나노입자에 의해 캡슐화된 mRNA 및 sgRNA ([Cullis, P. R. and Allen, T. M. (2013), Adv. Drug Deliv. Rev. 65(1): 36-48; Finn et al. (2018), Cell Rep. 22(9): 2227-2235], 둘 다 참고로 포함됨), 플라스미드 DNA의 유체역학적 주사 ([Suda T and Liu D, 2007, Mol. Ther. 15(12): 2063-2069], 본원에 참고로 포함됨), 또는 금 나노입자와 회합된 sgRNA의 리보핵단백질 복합체 (Lee, K.; Conboy, M.; Park, H. M.; Jiang, F.; Kim, H. J.; Dewitt, M. A.; Mackley, V. A.; Chang, K.; Rao, A.; Skinner, C.; et al., Nat. Biomed. Eng. 2017, 1 (11), 889-90) 또한 이용될 수 있다.
실시예 8.5: 인간화 유전자좌를 갖는 뮤린 모델에서 질환 수정
인간 요법에서 사용되는 것과 동일한 염기 편집기 구축물의 효능을 평가하기 위해, W392 근처의 뉴클레오티드가 W402 주위에서 인간 서열과 매칭되도록 변경된 마우스 모델이 필요하다. 이는 다양한 기술, 예컨대 마우스 배아의 유전자좌를 절단하고 대체하도록 RGN 및 HDR 주형의 사용에 의해 달성될 수 있다.
높은 아미노산 보존 정도로 인해, 마우스 유전자좌에서 대부분의 뉴클레오티드는 표 14에 제시된 바와 같이 침묵 돌연변이를 가진 인간 서열의 것들로 변경될 수 있다. 생성된 조작된 마우스 게놈에서 변경된 코딩 서열을 생성하는 염기 변화만이 도입된 정지 코돈 이후에 발생한다.
표 14: 인간화 마우스 유전자좌를 생성하는 뉴클레오티드 돌연변이
Figure pct00030
이 마우스 균주의 조작시, 실시예 8.4에 기재된 바와 같이 유사한 실험이 수행될 것이다.
실시예 9: 프리드라이히 운동실조의 원인이 되는 표적화 돌연변이
프리드라이히 운동실조 (FRDA)를 초래하는 트리뉴클레오티드 반복 서열의 확장은 FRDA 불안정 영역으로 지칭되는 FXN 유전자 내의 정의된 유전자좌에서 발생한다. RNA 가이드된 뉴클레아제 (RGN)는 FRDA 환자 세포에서 불안정 영역을 절제하기 위해 사용될 수 있다. 이 접근법은 다음을 필요로 한다: 1) 인간 게놈에서 대립유전자를 표적화도록 프로그래밍될 수 있는 RGN 및 가이드 RNA 서열; 및 2) RGN 및 가이드 서열에 대한 전달 접근법. 게놈 편집을 위해 사용되는 여러 뉴클레아제, 예컨대 흔히 사용되는 에스. 피로게네스로부터의 Cas9 뉴클레아제 (SpCas9)는 본질적으로 기능적 발현 카세트를 위해 필요한 다른 유전자 요소 외에도 SpCas9 유전자 및 가이드 RNA의 길이를 고려할 때 너무 커서 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터에 팩키징되지 않는다. 이는 SpCas9를 사용하는 실행가능한 접근법을 가능하지 않게 만든다.
본 발명의 조밀한 RNA 가이드된 뉴클레아제, 특히 APG09748 및 APG09106은 FRDA 불안정 영역의 절제에 매우 적합하다. 각각의 RGN은 FRDA 불안정 영역 근처에 있는 PAM 요건을 갖는다. 추가로, 이들 RGN 각각은 가이드 RNA와 함께 AAV 벡터에 팩키징될 수 있다. 2개의 가이드 RNA의 팩킹은 제2 벡터를 필요로 할 수도 있지만, 이 접근법은 두 벡터 사이의 단백질 서열을 분할할 수 있는 더 큰 뉴클레아제, 예컨대 SpCas9에서 필요로 되는 것보다 여전히 유리하게 비교된다.
표 15는 FRDA 불안정 영역의 5' 및 3' 플랭킹으로 APG09748 또는 APG09106을 표적화하는데 적합한 게놈 표적 서열의 위치, 뿐만 아니라 게놈 표적에 대한 sgRNA의 서열을 나타낸다. 유전자좌에서, RGN은 FA 불안정 영역을 절제할 것이다. 상기 영역의 절제는 유전자좌의 일루미나 시퀀싱에 의해 검증될 수 있다.
표 15: RGN 시스템에 대한 게놈 표적 서열
Figure pct00031
실시예 10: 겸상 적혈구 질환의 원인이 되는 표적화 돌연변이
BCL11A 인핸서 영역 (서열식별번호: 348) 내의 표적화 서열은 겸상 적혈구 질환의 증상을 치유하거나 또는 완화시키기 위해 태아 헤모글로불린 (HbF)을 증가시키는 메카니즘을 제공할 수 있다. 예를 들어, 게놈 차원의 연관성 연구에 의해 증가된 HbF 수준과 연관된 BCL11A에서의 유전자 변이의 집합을 확인하였다. 이들 변이는 단계-특이적인 계통-제한된 인핸서 영역으로서 기능하는 BCL11A의 비-코딩 영역에서 발견되는 SNP의 집합이다. 추가의 연구를 통해, 이 BCL11A 인핸서가 BCL11A 발현을 위해 적혈구 세포에서 필요하다는 것이 밝혀졌다 ([Bauer et al., (2013) Science 343:253-257], 본원에 참고로 포함됨). 인핸서 영역은 BCL11A 유전자의 인트론 2 내에서 발견되었고, 인트론 2에서 DNaseI 과민성 (종종 조절 능력과 연관된 염색질 상태를 나타냄)인 3개의 영역이 확인되었다. 이들 3개의 영역은 BCL11A의 전사 시작 부위로부터의 거리 (킬로염기)에 따라 "+62", "+58" 및 "+55"로 확인되었다. 이들 인핸서 영역은 대략 350 (+55); 550 (+58); 및 350 (+62) 뉴클레오티드 길이이다 (Bauer et al., 2013).
실시예 10.1: 바람직한 RGN 시스템의 확인
여기서 BCL11A가 성인 헤모글로빈에서 베타-글로빈을 제조하는 것을 담당하는 유전자인 HBB 유전자좌 내의 그의 결합 부위로 결합하는 것을 방해하는 RGN 시스템을 사용하는 베타-혈색소병증의 잠재적인 치료가 기재된다. 이 접근법은 포유동물 세포에서 더욱 효율적인 NHEJ를 사용한다. 또한, 이 접근법은 생체내 전달을 위해 단일 AAV 벡터로 팩키징될 수 있는 충분히 작은 크기를 갖는 뉴클레아제를 사용한다.
인간 BCL11A 인핸서 영역 (서열식별번호: 348)에서 GATA1 인핸서 모티프는 성인 인간 적혈구에서 HbF의 동시 재발현과 함께 BCL11A 발현을 감소시키기 위해 RNA 가이드된 뉴클레아제 (RGN)를 사용하여 방해하기 위한 이상적인 표적이다 (Wu et al. (2019) Nat Med 387:2554). APG09748 또는 APG09106과 상용성인 몇몇 PAM 서열은 이 GATA1 부위를 둘러싸는 유전자좌에서 용이하게 명백하다. 이들 뉴클레아제는 5'-DTTN-3'의 PAM 서열 (서열식별번호: 30)을 갖고, 소형의 크기를 가지며, 이는 잠재적으로 단일 AAV 또는 아데노바이러스 벡터에서 적절한 가이드 RNA와 함께 그들의 전달을 가능하게 한다. 이 전달 접근법은 다른 것들에 비해 조혈 줄기 세포로의 접근, 및 잘 확립된 안전성 프로파일 및 제작 기술과 같은 다양한 이점을 제공한다.
흔히 사용되는 에스. 피로게네스로부터의 Cas9 뉴클레아제 (SpyCas9)는 5'-NGG-3'의 PAM 서열 (서열식별번호: 323)을 필요로 하며, 이 중에서 몇몇은 GATA1 모티프 근처에 존재한다. 그러나, SpyCas9의 크기는 단일 AAV 또는 아데노바이러스 벡터로 팩키징되는 것을 방지하며, 따라서 상기 언급된 이 접근법의 이점을 포기한다. 이중 전달 전략을 이용할 수 있지만, 이는 상당한 제작 복잡성 및 비용을 부가할 것이다. 추가로, 주어진 세포에서 성공적으로 편집되려면 두 벡터 모두로의 감염을 필요로 하기 때문에, 이중 바이러스 벡터 전달은 유전자 수정의 효율을 상당히 감소시킨다.
인간 코돈 최적화된 APG09748 (서열식별번호: 349) 또는 APG09106 (서열식별번호: 360)을 코딩하는 발현 카세트는 실시예 5에 기재된 것과 유사하게 생성된다. RGN APG09748 또는 APG09106에 대한 가이드 RNA를 발현하는 발현 카세트 또한 생성된다. 이들 가이드 RNA는 다음을 포함한다: 1) BCL11A 인핸서 유전자좌 (표적 서열) 내의 비-코딩 또는 코딩 DNA 가닥에 대해 상보성인 프로토스페이서 서열 및 2) 가이드 RNA와 RGN의 회합을 위해 필요한 RNA 서열. APG09748 또는 APG09106에 의해 표적화하기 위한 몇몇 잠재적인 PAM 서열은 BCL11A GATA1 인핸서 모티프를 둘러싸고 있기 때문에, BCL11A GATA1 인핸서 서열의 강건한 절단 및 NHEJ 매개된 방해를 제공하는 최상의 프로토스페이서 서열을 결정하기 위해 몇몇 잠재적인 가이드 RNA 구축물이 생성된다. 표 16에서 표적 게놈 서열은 표 16에 제공된 sgRNA를 이용하여 RGN을 이 유전자좌로 지시하기 위해 평가된다.
표 16: APG09748을 사용하여 BCL11A GATA1 인핸서 유전자좌에 대한 표적 서열
Figure pct00032
APG09748 또는 APG09106이 BCL11A 인핸서 영역을 방해하는 삽입 또는 결실을 생성하는 효율을 평가하기 위해, 인간 세포주, 예컨대 인간 배아 신장 세포 (HEK 세포)를 사용한다. RGN 발현 카세트를 포함하는 DNA 벡터 (예를 들어, 실시예 5에 기재됨)를 생성한다. 표 16의 가이드 RNA 서열에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 별도의 벡터를 또한 생성한다. 이러한 발현 카세트는 실시예 5에 기재된 바와 같이 인간 RNA 폴리머라제 III U6 프로모터 (서열식별번호: 336)를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, RGN 및 가이드 RNA 둘 다의 발현 카세트를 포함하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 벡터를 실시예 5에 기재된 것과 같은 표준 기술을 이용하여 HEK 세포에 도입시키고, 세포를 1-3 일 동안 배양한다. 이 배양 기간 이후에, 게놈 DNA를 단리하고, 삽입 또는 결실의 빈도를 실시예 5에 기재된 바와 같이 T7 엔도뉴클레아제 I 소화 및/또는 직접적인 DNA 시퀀싱을 이용하여 결정한다.
표적 BCL11A 영역을 포함하는 DNA 영역을 일루미나 넥스테라 XT 오버행 서열을 함유하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨다. 이들 PCR 앰플리콘은 T7 엔도뉴클레아제 I 소화를 이용하여 NHEJ 형성에 대해 시험하거나, 또는 일루미나 16S 메타게놈 시퀀싱 라이브러리 프로토콜 또는 유사한 차세대 시퀀싱 (NGS) 라이브러리 제조에 따라 라이브러리 제조를 거친다. 딥 시퀀싱 이후에, 생성된 판독을 CRISPResso에 의해 분석하여, 편집률을 계산한다. 출력 정렬을 수동-큐레이션하여, 삽입 및 결실 부위를 확인한다. 이 분석을 통해 바람직한 RGN 및 상응하는 바람직한 가이드 RNA (sgRNA)가 확인된다. 상기 분석은 APG09748 또는 APG09106 둘 다 동등하게 바람직하게 할 수 있다. 추가로, 상기 분석은 1개 초과의 바람직한 가이드 RNA가 있거나, 또는 표 16의 모든 표적 게놈 서열이 동등하게 바람직함을 결정할 수 있다.
실시예 10.2: 태아 헤모글로빈의 발현에 대한 검정
이 실시예에서, BCL11A 인핸서 영역을 방해하는 APG09748 또는 APG09106 생성된 삽입 또는 결실을 태아 헤모글로빈의 발현에 대해 검정한다. 건강한 인간 공여자 CD34+ 조혈 줄기 세포 (HSC)를 사용한다. 이들 HSC를 배양하고, 바람직한 RGN 및 바람직한 sgRNA의 코딩 영역을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 벡터(들)을 실시예 8.3에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 도입시킨다. 전기천공 이후에, 확립된 프로토콜을 이용하여 시험관내에서 이들 세포를 적혈구로 분화시킨다 (예를 들어, [Giarratana et al. (2004) Nat Biotechnology 23:69-74], 본원에 참고로 포함됨). 이어서, HbF의 발현을 항-인간 HbF 항체에 의해 웨스턴 블롯팅을 이용하여 측정하거나, 또는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 정량화한다. BCL11A 인핸서 유전자좌의 성공적인 방해가 가이드 없이 RGN에 의해서만 전기천공된 HSC와 비교할 때 HbF 생성의 증가를 유도할 것으로 예상된다.
실시예 10.3: 감소된 겸상 적혈구 형성에 대한 검정
이 실시예에서, BCL11A 인핸서 영역을 방해하는 APG09748 또는 APG09106 생성된 삽입 또는 결실을 감소된 겸상 적혈구 형성에 대해 검정한다. 겸상 적혈구 질환에 걸린 환자로부터의 공여자 CD34+ 조혈 줄기 세포 (HSC)를 사용한다. 이들 HSC를 배양하고, 바람직한 RGN 및 바람직한 sgRNA의 코딩 영역을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 벡터(들)를 실시예 8.3에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 도입시킨다. 전기천공 이후에, 확립된 프로토콜을 이용하여 시험관내에서 이들 세포를 적혈구로 분화시킨다 (예를 들어, [Giarratana et al. (2004) Nat Biotechnology 23:69-74], 본원에 참고로 포함됨). 이어서, HbF의 발현을 항-인간 HbF 항체에 의해 웨스턴 블롯팅을 이용하여 측정하거나, 또는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 정량화한다. BCL11A 인핸서 유전자좌의 성공적인 방해가 가이드 없이 RGN에 의해서만 전기천공된 HSC와 비교할 때 HbF 생성의 증가를 유도할 것으로 예상된다.
겸상 적혈구 형성을 메타비술파이트의 첨가에 의해 이들 분화된 적혈구에서 유도한다. 현미경을 이용하여 겸상 대 정상 적혈구의 개수를 카운팅한다. 처리되지 않거나 또는 RGN 단독으로 처리된 세포에 비해 APG09748 또는 APG09106 플러스 sgRNA로 처리된 세포에서 겸상 적혈구의 개수가 더 적을 것으로 예상된다.
실시예 10.4: 뮤린 모델에서 질환 치료 검증
BCL11A 유전자좌의 APG09748 또는 APG09106 방해를 이용하는 효능을 평가하기 위해, 겸상 적혈구 빈혈의 적합한 인간화 마우스 모델을 이용한다. 바람직한 RGN 및 바람직한 sgRNA를 코딩하는 발현 카세트를 AAV 벡터 또는 아데노바이러스 벡터에 팩키징한다. 특히, 아데노바이러스 유형 Ad5/35가 HSC를 표적화하는데 효과적이다. 겸상 적혈구 대립유전자를 갖는 인간화 HBB 유전자좌를 함유하는 적합한 마우스 모델, 예컨대 B6;FVB-Tg(LCR-HBA2,LCR-HBB*E26K)53Hhb/J 또는 B6.Cg-Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg(HBA-HBBs)41Paz/HhbJ를 선택한다. 이들 마우스를 과립구 콜로니-자극 인자 단독으로 또는 플레릭사포어와 조합하여 처리하여, HSC를 순환으로 동원시킨다. 이어서, RGN 및 가이드 플라스미드를 갖는 AAV 또는 아데노바이러스를 정맥내로 주사하고, 마우스를 1 주일 동안 회복시킨다. 이들 마우스로부터 수득한 혈액을 메타비술파이트를 사용하여 시험관내 겸상화 검정에서 시험하고, 마우스를 사망률 및 조혈 기능을 모니터링하기 위해 종적으로 추적한다. 두 발현 카세트 모두 결여된 바이러스 또는 RGN 발현 카세트만을 갖는 바이러스로 처리된 마우스와 비교할 때 RGN 및 가이드 RNA를 갖는 AAV 또는 아데노바이러스로의 처리가 겸상화, 사망률을 감소시키고, 조혈 기능을 개선시킬 것으로 예상된다.
실시예 11: 데아미나제의 확인
미생물 배양물을 표준 실험실 배지에서 액체 배양물에서 성장시켰다. 배양물을 DNA 제조 전에 포화까지 (16 내지 24 시간) 성장시켰다. DNA를 세제 용해에 의해 박테리아 세포로부터 추출한 후, 실리카 매트릭스에 결합시키고, 에탄올 완충제로 세척하였다. 정제된 DNA를 약알칼리성 수성 완충제에 의해 실리카 매트릭스로부터 용리시켰다.
시퀀싱을 위한 DNA를 분광광도법에 의해 순도 및 농도에 대해 시험하였다. 시퀀싱 라이브러리를 넥스테라 XT 라이브러리 제조 키트를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 제조하였다. 서열 데이터는 일루미나 HiSeq 2000 시스템 사용자 가이드 프로토콜에 따라 HiSeq 2000 상에서 생성하였다.
시퀀싱 판독은 씨엘씨 바이오 어셈블리 셀(CLC Bio Assembly Cell) 소프트웨어 패키지를 사용하여 드래프트 게놈으로 조립하였다. 조립 후에, 몇몇 방법에 의해 유전자 호출이 이루어졌고, 생성된 유전자 서열을 조사하여 데아미나제 유전자의 신규한 상동성을 확인하였다. 신규한 유전자는 BLAST 및 도메인 조성에 의해 확인하였다. 촉매적 도메인 D/H/C-[X]-E-[X15-45]-P-C-[X2]-C (서열식별번호: 613)는 모든 효소에서 예측되었다. 추가로, 시퀀싱된 진핵생물 유기체의 게놈으로부터의 가상의 데아미나제인 NCBI 데이터베이스에서 확인된 서열 또한 실험하였다. 확인된 268개의 APOBEC 도메인 단백질은 65% 상동성으로 클러스터화되었고, 47개의 후보가 데아미나제 활성 검정을 위해 선택되었다. 확인된 392개의 ADAT 도메인 단백질은 65% 상동성으로 클러스터화되었고, 추가로 서열 길이를 기반으로 하여 선택되었다. 모두 220개 미만의 아미노산 길이인 125개의 ADAT 도메인 단백질이 데아미나제 활성 검정을 위해 선택되었다.
표 17은 47개의 선택된 APOBEC 도메인 단백질 및 125개의 ADAT 도메인 단백질을 나타낸다. 각각의 폴리펩티드에 대한 독특한 식별 코드를 제공하는 서열식별번호 및 APG ID가 표시된다. 입수가능한 경우, NCBI 및 유니프롯(Uniprot) 수탁 번호가 제공된다. "도메인 설명"은 데아미나제가 ADAT 또는 APOBEC 도메인을 갖는지 여부를 나타낸다. 확인된 폴리펩티드 서열 내에서 ADAT 또는 APOBEC 도메인의 시작 및 끝 또한 나타낸다.
표 17: 확인된 데아미나제
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
실시예 12: 데아미나제 활성에 대한 검정
실시예 12.1: 추정 데아미나제의 선택
표 17에 나타낸 선택된 단백질의 코딩 서열은 박테리아에서의 발현을 위해 코돈-최적화되고, 합성되고, 5' 말단에서 T7 프로모터에 작동가능하게 연결된 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 박테리아 발현 벡터에 도입된다.
실시예 12.2: 데아미나제 활성 검정
데아미나제 활성 검정은 [Garibyan et al. (DNA Repair 2: 593-608, 2003)]을 기반으로 한다. 에스케리키아 콜라이의 rpoB 유전자에서의 돌연변이는 RNA 폴리머라제의 β 서브유닛을 변경시킴으로써 항생제 리팜피신 (Rifr)에 대한 내성을 일으킨다.
실시예 12.1에 기재된 바와 같이, 추정 데아미나제를 코딩하는 박테리아 발현 벡터를 T7 발현 이. 콜라이 세포 (NEBioLabs)에 도입시켰다. 세포는 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 (UGI; 서열식별번호: 570) 및 카르베니실린 선택가능한 마커를 코딩하는 별도의 발현 플라스미드 또한 함유할 수 있다. 세포를 포화까지 성장시킨 다음, 자가-유도 배지 (매직미디어™, 써모 피셔 사이언티픽)의 접종물을 위한 공급원으로서 사용한 다음, 추가 5 시간 동안 성장시켰다. 세포를 UGI 발현 플라스미드를 또한 함유하는지 여부에 따라 카나마이신을 갖는 LB 또는 카나마이신 및 카르베니실린을 갖는 LB 상에 희석-플레이팅시킨다. 이들 희석-플레이트를 사용하여 총 세포 카운트를 구하였다. rpoB 유전자로의 돌연변이를 성공적으로 도입시킬 수 있는 추정 데아미나제 발현 벡터를 확인하기 위해 동일한 세포를 리팜피신을 갖는 LB 또는 리팜피신 및 카르베니실린을 갖는 LB 상에 또한 플레이팅하였다.
리팜피신을 함유하는 LB 플레이트 상에서 성장시킨 박테리아 콜로니로부터 데아미나제 발현 벡터를 단리하고, 검정을 적어도 2회 반복하였다. 확인한 후에, 박테리아 세포를 시퀀싱하였다. 예상치 못하게도, 평가를 위해 선택된 단백질을 함유하는 47개의 APOBEC 도메인 중에서, 단지 9개만이 데아미나제 활성을 나타내었다. 평가를 위해 선택된 단백질을 함유하는 125개의 ADAT 도메인 중에서, 어느 것도 데아미나제 활성을 나타내지 않았다. 이는 데아미나제 활성이 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기반으로 하여 예측될 수 없지만, 대신에 실험적으로 결정되어야 함을 시사한다. 이 검정에서 확인된 9개의 활성 데아미나제에 대한 결과는 표 18에 나타내었다. 리팜피신-내성 콜로니로부터의 rpoB 유전자를 시퀀싱하여 유도된 돌연변이를 확인하였다. 돌연변이율은 각각의 활성 데아미나제를 포함하는 내성 콜로니의 개수를 콜로니의 총 개수와 비교함으로써 계산되었다.
표 18: 활성 데아미나제의 돌연변이율의 NGS 분석
Figure pct00041
실시예 13: 박테리아 세포에서 염기 편집 활성
APG00868 (서열식별번호: 374) 또한 후속적인 활성 스크린에서 활성 데아미나제로 확인되었다. 10개의 확인된 활성 데아미나제의 코딩 서열을 그의 N-말단에서 NLS (서열식별번호: 10)를 포함하고, 그의 C-말단에서 표 18의 활성 데아미나제에 작동가능하게 연결되고, 그의 C-말단에서 링커 서열 (서열식별번호: 546)에 작동가능하게 연결되고, 그의 C-말단에서 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질, 즉, 뉴클레아제-불활성 RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) dAPG08290.1 변이체 (서열식별번호: 547)에 작동가능하게 연결되고, 그의 C-말단에서 제2 NLS에 작동가능하게 연결되고, 그의 C-말단에서 TEV 부위 (서열식별번호: 548)에 작동가능하게 연결되고, 그의 C-말단에서 10x His (서열식별번호 594) 태그에 작동가능하게 연결된 융합 단백질을 생성하는 발현 카세트에 도입시켰다. 실시예 12에서 확인된 선택된 데아미나제 및 APG00868을 박테리아 세포에서 표적화된 염기 편집 활성을 위해 검정하였다.
이 활성 검정은 실시예 12와 매우 유사하였다. 그러나, 이들 실험의 경우에는 데아미나제를 불활성 RGN에 연결시켜서, rpoB 유전자의 특정한 영역을 표적화하여 표적화된 C에서 T로의 돌연변이를 도입시킬 수 있었다. 추가로, RGN-데아미나제 융합체의 표적화를 위한 가이드 RNA를 발현할 수 있는 발현 카세트를 포함하는 벡터를 생성하였다. 이들 실험에서 4가지 상이한 가이드 RNA를 사용하였다. 표 19에서 "비표적화된" (서열식별번호: 549)으로 지칭되는 제1 가이드는 RGN-데아미나제 융합체를 rpoB 유전자가 아닌 게놈 박테리아 DNA의 영역으로 가이드하였다. 표적 1 (서열식별번호: 550)은 rpoB 단백질에서 R529C 돌연변이를 도입시키는 rpoB 유전자의 영역이었다. 표적 2 (서열식별번호: 551)는 rpoB 단백질에서 A532V 돌연변이를 도입시키는 rpoB 유전자의 영역이었고, 표적 3 (서열식별번호: 552)은 rpoB 단백질에서 Q513R 돌연변이를 도입시키는 rpoB 유전자의 영역이었다. 표적 1 및 2의 원하는 돌연변이는 GC 쌍에서 AT 쌍으로의 염기 편집의 결과이다. 표적 3의 원하는 돌연변이는 AT 쌍에서 GC 쌍으로의 염기 편집의 결과이다. 다른 가능한 돌연변이 또한 이들 표적에서 확인될 수 있다.
rpoB 유전자 상의 관심 위치로 표적화시키는 가이드 RNA를 발현할 수 있는 발현 카세트를 포함하는 벡터와 함께 융합 단백질 발현 벡터를 T7 발현 이. 콜라이 세포 (NEBioLabs)에 도입시켰다. 세포를 포화까지 성장시킨 다음, 자가-유도 배지 (매직미디어™, 써모 피셔 사이언티픽)의 접종물을 위한 공급원으로서 사용한 다음, 추가 5 시간 동안 성장시켰다. 세포를 카나마이신을 갖는 LB 상에 희석-플레이팅시키고, 이들 희석-플레이트를 사용하여 총 세포 카운트를 구하였다. rpoB 유전자에서 돌연변이를 보유하는 콜로니를 확인하기 위해 동일한 세포를 리팜피신을 갖는 LB 상에 또한 플레이팅하였다. "비표적화된" 및 표적화된 데아미나제-RGN 융합 단백질 ("표적화된")에 대한 돌연변이율을 계산하였고, 표 19에 나타내었다. rpoB 유전자에 대해 표적화되지 않은 데아미나제-RGN 융합체와 비교하여 표적화된 데아미나제-RGN 융합체의 돌연변이율에서 퍼센트 증가 ("% 증가") 또한 표 19에 나타내었다. 데아미나제로서 기능하는 것으로 공지된 양성 대조군 포유동물 APOBEC 또한 포함되었다.
표 19: 표적화된 및 비표적화된 데아미나제의 돌연변이율
Figure pct00042
실시예 14: 포유동물 세포에서 염기 편집 활성
확인된 활성 데아미나제의 코딩 서열을 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화시키고, 그의 N-말단에서 NLS (서열식별번호: 10)를 포함하고, 그의 C-말단에서 3xFLAG 태그 (서열식별번호: 11)에 작동가능하게 연결되고, 그의 C-말단에서 본 발명의 데아미나제에 작동가능하게 연결되고, 그의 C-말단에서 아미노산 링커 (서열식별번호: 546)에 작동가능하게 연결되고, 그의 C-말단에서 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드, 즉, 닉카제로서 기능하도록 돌연변이된 RGN (nAPG07433.1; 서열식별번호: 553)에 작동가능하게 연결되고, 그의 C-말단에서 제2 NLS에 작동가능하게 연결된 융합 단백질을 생성하는 발현 카세트에 도입시켰다. 추가로, APG07386의 N-말단 및 C-말단 단편 (각각 서열식별번호: 554로서 APG07386-NTD 및 서열식별번호: 555로서 APG07386-CTD)을 발현 카세트에 개별적으로 도입시켜 각각의 단편의 데아미나제-RGN 융합체를 생성하였다. 이들 발현 카세트 각각을 포유동물 세포에서 융합 단백질의 발현을 유도할 수 있는 벡터에 도입시켰다. 데아미나제-RGN 융합 단백질을 결정된 게놈 위치로 표적화하기 위해 가이드 RNA를 발현할 수 있는 벡터 또한 생성하였다. 이들 가이드 RNA는 데아미나제-RGN 융합 단백질을 염기 편집을 위한 표적화된 게놈 서열로 가이드할 수 있다. 서열식별번호: 556-561은 시험한 가이드 RNA를 코딩한다.
실시예 14.1: 데아미나제 중에서 효율성 및 서열 특이성
상기 기재된 데아미나제-RGN 융합 단백질 및 가이드 RNA를 발현할 수 있는 벡터를 리포펙션 또는 전기천공을 이용하여 HEK293T 세포에 형질감염시켰다. 리포펙션의 경우, 성장 배지 (DMEM + 10% 태아 소 혈청 + 1% 페니실린/스트렙토마이신)에서 형질감염 전날에 세포를 24-웰 플레이트에서 1x105 세포/웰로 시딩하였다. 제조자의 지침에 따라 500ng의 데아미나제-RGN 융합 발현 벡터 및 1 μg의 가이드 RNA 발현 벡터를 리포펙타민® 3000 시약 (써모 피셔 사이언티픽)을 이용하여 형질감염시켰다. 전기천공의 경우, 제조자의 지침에 따라 세포를 네온(Neon)® 형질감염 시스템 (써모 피셔 사이언티픽)을 이용하여 전기천공시켰다.
리포펙션 또는 전기천공 24-48 시간 후에, 게놈 DNA를 형질감염된 또는 전기천공된 세포로부터 수확하고, DNA를 시퀀싱하고, 표적화된 염기-편집 돌연변이의 존재에 대해 분석하였다.
하기 표 20은 APG07386의 C-말단 및 N-말단 단편을 비롯하여 각각의 데아미나제에 대한 시티딘 염기의 편집률을 나타낸다. 숫자 라인은 RGN의 PAM과 관련하여 표적화된 게놈 서열에서 시티딘 염기의 위치를 나타낸다. 각각의 위치에서 C 뉴클레오티드의 편집률은 다중 표적의 평균으로서 나타내었다. 표적의 개수 (n)는 각각의 위치에 대해 컬럼 아래에 나열된다. 표준 편차는 괄호 안에 나타내었다. 이 검정에서, APG09980, APG07386-CTD, APG05840, APG05241, APG07280, APG09688 및 APG00868은 적어도 하나의 시티딘의 적어도 일부 수준의 시티딘 염기 편집 활성을 나타낸다.
표 20: 포유동물 세포에서 C 뉴클레오티드의 편집률
Figure pct00043
Figure pct00044
실시예 14.2: 표적화된 염기 편집에 대한 형광 검정
첫번째 위치 C를 T로 변경시키기 위해 H66 코돈이 시토신 데아미나제를 사용하여 히스티딘 (CAT)으로부터 야생형 티로신 (TAT) 잔기로 되돌릴 수 있도록, 청색 형광 단백질 (BFP, 서열식별번호: 562)로의 형광 이동을 유발하는 Y66H 돌연변이를 함유하는 증강된 녹색 형광 단백질 (EGFP)을 보유하는 벡터를 구축하였다. 성공적인 C에서 T로의 전환은 정량화될 수 있는 EGFP의 발현을 생성한다. 데아미나제-RGN 융합 단백질을 Y66H 돌연변이 (서열식별번호: 563) 주변 영역으로 표적화하는 가이드 RNA를 발현할 수 있는 제2 벡터 또한 생성하였다.
데아미나제-RGN 융합 단백질 및 가이드 RNA를 발현할 수 있는 벡터와 함께 이러한 BFP에서 EGFP로의 리포터 벡터를 리포펙션 또는 전기천공을 이용하여 HEK293T 세포에 형질감염시켰다. 리포펙션의 경우, 성장 배지 (DMEM + 10% 태아 소 혈청 + 1% 페니실린/스트렙토마이신)에서 형질감염 전날에 세포를 24-웰 플레이트에서 1x105 세포/웰로 시딩하였다. 제조자의 지침에 따라 500 ng의 각각의 BFP 리포터 벡터, 데아미나제-RGN 발현 벡터, 및 가이드 RNA 발현 벡터를 리포펙타민® 3000 시약 (써모 피셔 사이언티픽)을 이용하여 형질감염시켰다. 전기천공의 경우, 제조자의 지침에 따라 세포를 네온® 형질감염 시스템 (써모 피셔 사이언티픽)을 이용하여 전기천공시켰다.
리포펙션 또는 전기천공 24-48 시간 후에, GFP+ 세포의 존재에 대해 세포를 현미경으로 조사함으로써 GFP의 발현을 결정하였다. 육안 검사 후에, GFP+ 세포 대 GFP- 세포의 비율을 결정할 수 있다. 표 21에 보고된 데아미나제-RGN 융합 단백질을 발현하는 포유동물 세포에 대해 형광을 관찰하였다. 관련 기술분야의 기술자는 RIPA 완충제를 사용하여 세포를 또한 용해시킬 수 있고, 생성된 용해물을 형광 플레이트 판독기 상에서 분석하여, BFP 및 GFP에 대한 형광 강도를 결정할 수 있음을 이해할 것이다. 추가로, 세포 분류에 의해 세포를 분석하여 BFP+, GFP+ 및 GFP- 세포의 정확한 비율을 결정할 수 있다.
표 21: 포유동물 시토신 데아미나제 형광 리포터 결과
Figure pct00045
N.D = 검출되지 않음; + = 약간의 GFP+ 세포가 검출됨, ++ = 많은 GFP+ 세포가 검출됨
실시예 15: 아데노신 및 시토신 염기 편집기의 생성을 위한 데아미나제의 다양화
DNA 서열에서 A 또는 T 잔기를 G 또는 C로 변화시킬 수 있는 아데노신 염기 편집기 (ABE)가 천연 발생하는 것으로 공지되어 있지 않다. 하기 다양화 전략을 이용하여, DNA 주형에 대해 작용하는 ABE를 확인하기 위한 목적으로 데아미나제 변이체를 생성하였다.
첫번째 전략은 [Gaudelli et al (Nature, 2017, doi:10.1038/nature24644] (본원에 참고로 포함됨)과 유사한 오류가 발생하기 쉬운 PCR 효소에 의한 무작위 돌연변이 유발이었다. 프라이머를 설계하고, 표 17의 125개의 ADAT 효소에 대한 뉴클레오티드 서열을 생성하였다. 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 제조자의 지침에 따라 젠모르프(GenMorph) II 무작위 돌연변이 유발 키트 (애질런트 테크놀로지즈)를 사용하여 수행하였다. 돌연변이된 ADAT PCR 생성물을 제조자의 지침에 따라 ZR-96 DNA 클린-업 키트(Clean-up Kit)™ (자이모 리써치(Zymo Research))를 사용하여 정제하였다. 이 접근법으로부터, 약 1천만 개의 ADAT 변이체를 생성하였다.
추구된 두번째 전략은 [Stemmer, W. P. C. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994)]과 유사한 유전자 셔플링이었다. 표 17의 125개의 ADAT 효소에 대한 코딩 서열을 본질적으로 제조자의 지침에 따라 퓨전® 하이-피델리티 DNA 폴리머라제 (NEBiolabs)를 사용하여 PCR 증폭시키고, 제조자의 지침에 따라 디엔에이 클린 앤 컨선트레이터(DNA Clean & Concentrator)™-5 (자이모 리써치)를 사용하여 정제하였다. 상이한 ADAT 코딩 서열을 갖는 정제된 DNA를 풀링하고, 컷스마트(Cutsmart)® 완충제 중에서 37℃에서 60 분 동안 효소 RsaI, AfeI, BsaAI 및 BsaHI에 의한 제한 소화에 적용하였다. 소화 후에, 반응을 겔 전기영동에 의해 분리하고, 소화된 단편을 자이모클린(Zymoclean)™ 겔 DNA 복구 키트를 사용하여 정제하였다. 이어서, 정제된 단편을 PCR 증폭을 이용하여 조립하고, 조립되고 증폭된 생성물을 정제하였다. 이 접근법으로부터, 약 2백만 개의 ADAT 변이체를 생성하였다.
마지막 전략은 핵산과 잠재적으로 상호작용하는 구조적 잔기와 상동성인 잔기를 표적화하는 것이었다. ADAT-유사 효소의 경우, RNA (RCSB 프로테인 데이터 뱅크(Protein Data Bank) 식별번호: 2B3J; [Losey et al., 2006, Nat. Struct. Mol. Biol. 13: 153-159])와 복합체화된 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) tRNA 아데노신 데아미나제, TadA의 결정 구조의 주의깊은 검사를 통해, 이. 콜라이 TadA (유니프롯 P68398 및 진뱅크 수탁번호 NP_417054) P48, L84, A106, D108 및 K110과 상동성인 잔기에서 잠재적인 상호작용이 나타났다. 이어서, 이들 상동성 잔기의 포화 돌연변이 유발을 표 17로부터의 125개의 ADAT-도메인 데아미나제에 대해 수행하였다. 이 접근법으로부터, 약 1백만 개의 ADAT 변이체를 생성하였다.
관련 기술분야의 기술자는 이들 접근법이 배타적이지 않고, 조합될 수 있으며, 각각의 연속 라운드의 개선의 결과에 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 포화 돌연변이 유발 또는 반복적인 포화 돌연변이 유발 (Reetz and Carballeira, 2007, Nature Protocols, 2 (4): 891-903)은 반복적인 것으로 공지되어 있으며, 이는 최적의 후보가 확인될 때가지 한 라운드로부터 최상의 성능 후보가 추가 라운드의 돌연변이 및 스크리닝을 위해 선택된다는 것을 의미한다.
실시예 16: 아데노신 염기 편집기 및 시토신 염기 편집기의 생성을 위한 활성의 다양화된 데아미나제의 결정
실시예 16.1: 다양화된 데아미나제에 대한 박테리아 활성 검정
실시예 15의 다양화된 라운드로부터의 ADAT 돌연변이성 변이체 생성물을 그의 N-말단에서 NLS (서열식별번호: 10)를 포함하고, 그의 C-말단에서 돌연변이된 데아미나제에 작동가능하게 연결되고, 그의 C-말단에서 링커 서열 (서열식별번호: 546)에 작동가능하게 연결되고, 그의 C-말단에서 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질, 즉, 뉴클레아제-불활성 RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) dAPG08290.1 변이체 (서열식별번호: 547)에 작동가능하게 연결되고, 그의 C-말단에서 제2 NLS에 작동가능하게 연결되고, 그의 C-말단에서 TEV 부위 (서열식별번호: 548)에 작동가능하게 연결되고, 그의 C-말단에서 10x His 태그 (서열식별번호: 594)에 작동가능하게 연결된 융합 단백질을 생성하는 발현 카세트에 도입시켰다.
이 활성 검정은 실시예 13과 매우 유사하였다. 그러나, 이들 실험의 경우에는, 시토신 염기 편집 선택의 경우 H193R (서열식별번호: 566) 또는 아데노신 염기 편집 선택의 경우 H193Y (서열식별번호: 567)로 돌연변이된 H193을 갖는 불활성화된 클로람페니콜 유전자를 갖는 구축물을 제조하였다. 각각의 플라스미드는 RGN-데아미나제 융합체를 플라스미드의 적절한 영역으로 표적화하기 위해 가이드 RNA를 또한 함유하였다. 성공적인 CG에서 TA로의 전환시 (서열식별번호: 566의 경우) 또는 AT에서 GC로의 전환시 (서열식별번호: 567의 경우), 박테리아 세포는 클로람페니콜을 함유하는 배지에서 생존할 수 있을 것이다.
불활성화된 클로람페니콜 유전자를 포함하고 sgRNA를 표적화하는 벡터와 함께 융합 단백질 발현 벡터를 T7 발현 이. 콜라이 세포 (NEBioLabs)에 도입시켰다. 세포를 포화까지 성장시킨 다음, 자가-유도 배지 (매직미디어™, 써모 피셔 사이언티픽)의 접종물을 위한 공급원으로서 사용한 다음, 추가 5 시간 동안 성장시켰다. 세포를 카나마이신 및 카르베니실린을 갖는 LB 상에 희석-플레이팅시키고, 이들 희석-플레이트를 사용하여 총 세포 카운트를 구하였다. 활성인 돌연변이된 데아미나제를 보유하는 콜로니를 확인하기 위해 동일한 세포를 카나마이신, 카르베니실린 및 클로람페니콜을 갖는 LB 상에 또한 플레이팅하였다. 대표적인 클론을 선택하고 시퀀싱한 다음, 개별적으로 시험하였다. 추가로, "비표적화된" 돌연변이율을 측정하기 위해 동일한 세포를 카나마이신 및 리팜피신을 갖는 LB 상에 또한 플레이팅하였다. H193R 플라스미드 ("CBE")로 표적화된 데아미나제-RGN 융합 단백질에 대한 돌연변이율 ("Mutn Rate")을 계산하고, H193Y 플라스미드 ("ABE")로 표적화된 데아미나제-RGN 융합 단백질에 대한 돌연변이율을 표 22에 나타내었다. 데드 RGN (dAPG08290.1; 서열식별번호: 547)만을 함유하는 세포에서 관찰된 백그라운드와 비교하여 상대적인 아데닌 염기 편집률 ("ABE Rel Rate"), 시토신 염기 편집률 ("CBE Rel Rate"), 및 오프 타겟률 ("Off-T Rel Rate) 또한 나타내었다. 시토신 데아미나제로서 기능하는 것으로 공지된 양성 대조군 포유동물 데아미나제 또한 포함되었다.
표 22: 선택된 돌연변이된 데아미나제의 돌연변이율
Figure pct00046
실시예 16.2: 표적화된 염기 편집에 대한 형광 검정
세번째 위치 A를 G로 변경시키기 위해 아데노신 데아미나제를 사용하여 W58 코돈을 정지 (TGA)에서 야생형 트립토판 (TGG) 잔기로 되돌릴 수 있도록, 조기 정지 코돈 (서열식별번호: 564)을 생성하는 W58* 돌연변이를 함유하는 증강된 녹색 형광 단백질 (EGFP)을 보유하는 벡터를 구축하였다. 성공적인 A에서 G로의 전환은 정량화될 수 있는 EGFP의 발현을 생성한다. 데아미나제-RGN 융합 단백질을 W58* 돌연변이 (서열식별번호: 565) 주위 영역으로 표적화하는 가이드 RNA를 발현할 수 있는 두번째 벡터 또한 생성하였다.
데아미나제-RGN 융합 단백질 및 가이드 RNA를 발현할 수 있는 벡터와 함께 이러한 EGFP에서 EGFP로의 리포터 벡터를 리포펙션 또는 전기천공을 이용하여 HEK293T 세포에 형질감염시켰다. 리포펙션의 경우, 성장 배지 (DMEM + 10% 태아 소 혈청 + 1% 페니실린/스트렙토마이신)에서 형질감염 전날에 세포를 24-웰 플레이트에서 1x105 세포/웰로 시딩하였다. 제조자의 지침에 따라 500 ng의 각각의 데드 EGFP 리포터 벡터, 데아미나제-RGN 발현 벡터, 및 가이드 RNA 발현 벡터를 리포펙타민® 3000 시약 (써모 피셔 사이언티픽)을 이용하여 형질감염시켰다. 전기천공의 경우, 제조자의 지침에 따라 세포를 네온® 형질감염 시스템 (써모 피셔 사이언티픽)을 이용하여 전기천공시켰다.
리포펙션 또는 전기천공 24-48 시간 후에, GFP+ 세포의 존재에 대해 세포를 현미경으로 조사함으로써 GFP의 발현을 결정하였다. 육안 검사 후에, GFP+ 세포 대 GFP- 세포의 비율을 결정할 수 있다. 표 23에 보고된 데아미나제-RGN 융합 단백질을 발현하는 포유동물 세포에 대해 형광을 관찰하였다. 관련 기술분야의 기술자는 RIPA 완충제를 사용하여 세포를 또한 용해시킬 수 있고, 생성된 용해물을 형광 플레이트 판독기 상에서 분석하여, GFP에 대한 형광 강도를 결정할 수 있음을 이해할 것이다. 추가로, 세포 분류에 의해 세포를 분석하여 GFP+ 및 GFP- 세포의 정확한 비율을 결정할 수 있다.
표 23: 포유동물 아데노신 데아미나제 형광 리포터 결과
Figure pct00047
+ = 약간의 GFP+ 세포가 검출됨, ++ = 많은 GFP+ 세포가 검출됨, +++ = 가장 많은 수의 GFP+ 세포가 관찰됨
SEQUENCE LISTING <110> LIFEEDIT, INC. <120> POLYPEPTIDES USEFUL FOR GENE EDITING AND METHODS OF USE <130> L103438 1150WO (0038.7) <140> <141> <150> 62/932,169 <151> 2019-11-07 <150> 62/790,261 <151> 2019-01-09 <150> 62/790,266 <151> 2019-01-09 <150> 62/790,262 <151> 2019-01-09 <150> 62/790,256 <151> 2019-01-09 <150> 61/790,258 <151> 2019-01-09 <150> 62/785,391 <151> 2018-12-27 <160> 617 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1060 <212> PRT <213> Bacillus sp. <220> <221> source <223> /note="APG00969" <400> 1 Met Lys Gln Thr Ser Tyr Ser Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Ala Ser 1 5 10 15 Val Gly Tyr Gly Leu Ile Asp Asn Asp Glu Asn Ile Val Asp Ala Gly 20 25 30 Val Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Ser Lys Asn Asn Asp Gly Arg Arg 35 40 45 Lys Ser Arg Gly Ser Lys Arg Leu Ile Arg Arg Lys Arg His Arg Ile 50 55 60 Ala Arg Val Lys His Leu Leu Lys Glu Ser Gly Ile Asp Val Ser Tyr 65 70 75 80 Glu Asn Thr Val Leu Thr Asn Pro Tyr Glu Ile Arg Cys Lys Gly Leu 85 90 95 Thr Leu Pro Leu Thr Asn His Glu Leu Ser Ile 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Phe Arg Thr Lys 305 310 315 320 Ala Asn Gly Thr Pro Asp Phe Leu Ser Ile Lys Ile Tyr His Asp Leu 325 330 335 Lys Gly Ile Ile Asp Asp Lys Gln Leu Leu Asp Asp Ile Ala Phe Leu 340 345 350 Asp Asn Val Ala Gln Ile Leu Thr Val Trp Gln Asp Ser Gln Ser Ile 355 360 365 Gln Glu Lys Leu Lys Thr Leu Asn Lys Asn Leu Asp Asp Lys Thr Ile 370 375 380 Lys Glu Ile Ser Glu Leu Lys Lys Tyr Thr Gln Thr His Ser Leu Ser 385 390 395 400 Leu Lys Leu Ile Asn Val Leu Leu Pro Glu Leu Trp Glu Thr Thr Lys 405 410 415 Asn Gln Met Thr Ile Leu Ser Glu Leu Lys Leu Lys Pro Arg Lys Ile 420 425 430 Asp Leu His Asn Cys Asn Glu Ile Pro Val Asn Met Ile Asn Asp Leu 435 440 445 Ile Val Ser Pro Val Val Arg Arg Ser Leu Thr Gln Ser Ile Glu Met 450 455 460 Ile Asn Gln Ile Ile Lys Asp Tyr Gly His Pro Arg Glu Ile Val Ile 465 470 475 480 Glu Leu Ala Arg Glu Lys Asn Ser Glu Glu Lys Lys Asn Phe Ile Lys 485 490 495 Ser Leu Asn Glu Lys Asn Lys Gln Ile Asn Asp Glu Val Ile Glu Lys 500 505 510 Leu Asn Ala Ser Asn His Arg Asp Asn Lys Gly Met 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 48 auaauaaagg ugaccuauag ggucaaugaa ucugugcgug ugccauaagu aauuaaaaau 60 uacccaccac aggauuaucu uauuucugcu aaguguuuag aaaggccuga auacuuagca 120 gaaauaauga ugauuggcac acuacaacag ccacaacguc uauaucaugg 170 <210> 49 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 49 attn 4 <210> 50 <211> 1108 <212> PRT <213> Brevibacillus sp. <220> <221> source <223> /note="APG09106" <400> 50 Met Ala Ile Arg Ser Ile Lys Leu Lys Leu Lys Thr Arg Thr Gly Pro 1 5 10 15 Glu Ala Gln Asn Leu Arg Lys Gly Ile Trp Arg Thr His Arg Leu Leu 20 25 30 Asn Glu Gly Val Ala Tyr Tyr Met Lys Met Leu Leu Leu Phe Arg Gln 35 40 45 Glu Ser Thr Gly Gly Gln Thr Lys Lys Glu Leu Gln Glu Glu Leu Val 50 55 60 Arg His Ile Arg Glu Gln Gln Gln Lys Asn Arg Ala Asp Lys Asn Thr 65 70 75 80 Gln Ala Leu Pro Leu Asp Lys 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 84 gaccuauagg gucaaugaau cugugcgugu gccauaagua auuaaaaauu acccaccaca 60 ggagcaccug aaaacaggug cuuggcaccc ugucguugcc ccucccagau cau 113 <210> 85 <211> 113 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 85 gaccuauagg gucaaugaau cugugcgugu gccauaagua auuaaaaauu acccaccaca 60 ggagcaccug aaaacaggug cuuggcacgg aggcugagac aggagaguug cuu 113 <210> 86 <211> 113 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 86 gaccuauagg gucaaugaau cugugcgugu gccauaagua auuaaaaauu acccaccaca 60 ggagcaccug aaaacaggug cuuggcacau agccccccuu gagcacacag agg 113 <210> 87 <211> 113 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 87 gaccuauagg gucaaugaau cugugcgugu gccauaagua 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 545 Met Val Glu Ala Gly Val Thr Ala Ala Ser Ala Ala Thr Ala Ala Thr 1 5 10 15 Ala Ala Ser Ala Thr Ser Ala Ala Ala Phe Leu Pro Trp Thr Glu Glu 20 25 30 Asp Ala Arg Tyr Ile Arg Leu Ala Leu Glu Glu Ala Gln Ala Ala Tyr 35 40 45 Asp Ile Gly Glu Val Pro Val Gly Ala Leu Val Val Ser Ala Lys Gly 50 55 60 Glu Ile Leu Gly Arg Gly Tyr Asn Arg Thr Ile Ile Asp His Asp Pro 65 70 75 80 Thr Ala His Ala Glu Ile Val Ala Leu Arg Asn Ala Ala Arg Gln Leu 85 90 95 Glu Asn Tyr Arg Leu Pro Gly Ile Thr Val Tyr Val Thr Leu Glu Pro 100 105 110 Cys Val Met Cys Ile Gly Ala Met Leu His Ala Arg Leu Ala Arg Val 115 120 125 Val Phe Gly Ala Tyr Asp Pro Lys Thr Gly Ala Cys Gly Ser Val Leu 130 135 140 Asp Val Gly Ala Val Pro Lys Leu Asn His His Thr Ser Val Thr Gly 145 150 155 160 Gly Val Leu Ala Glu Pro Cys Gly Asp Leu Leu Arg Arg Phe Phe Arg 165 170 175 Glu Arg Arg Ala Lys Glu Ser Ile Ala 180 185 <210> 546 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 550 acgcacaaac gtcgtatctc cgcacgtcat agttccatga aagccaaaag tggctttgat 60 gtttctatga taagggtttc ggcccgtggc gtcggggatc gcctgcccat tccgatgggc 120 ttctccccat ttatt 135 <210> 551 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 551 tatctccgca ctcggcccag gcggtgtcat agttccatga aagccaaaag tggctttgat 60 gtttctatga taagggtttc ggcccgtggc gtcggggatc gcctgcccat tccgatgggc 120 ttctccccat ttatt 135 <210> 552 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 552 cagctgtctc agtttatgga ccagagtcat agttccatga aagccaaaag tggctttgat 60 gtttctatga taagggtttc ggcccgtggc gtcggggatc gcctgcccat tccgatgggc 120 ttctccccat ttatt 135 <210> 553 <211> 1071 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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(32)..(35) <223> /note="This region may encompass 2-4 residues" <400> 589 His Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Cys Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Cys 35 <210> 590 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 590 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 591 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 591 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 592 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> SITE <222> (1)..(80) <223> /note="This sequence may encompass 1-20 'Ser Gly Gly Ser' repeating units" <400> 592 Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 1 5 10 15 Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 50 55 60 Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 65 70 75 80 <210> 593 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag" <400> 593 His His His His His His 1 5 <210> 594 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 10xHis tag" <400> 594 His His His His His His His His His His 1 5 10 <210> 595 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 595 gtctgattgc ctgtcgttgc ccctcccaag gagttggcag a 41 <210> 596 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 596 gtctgattgc 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annotations for variant positions" <400> 613 Asp Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Pro Cys Xaa Xaa Cys 50 <210> 614 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 614 Glu Glu Gln Leu 1 <210> 615 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 615 Ala Glu Val Ser Gln Ala 1 5 <210> 616 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 616 Gly Glu Gln Leu 1 <210> 617 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 617 Ala Glu Val Ser Lys Ala 1 5

Claims (45)

  1. RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자이며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RGN 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
    상기 RGN 폴리펩티드는 표적 DNA 서열과 혼성화할 수 있는 가이드 RNA (gRNA)에 결합할 때 RNA-가이드된 서열 특이적인 방식으로 상기 표적 DNA 서열에 결합하고,
    RGN 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드가 뉴클레아제 데드이거나 또는 닉카제로서 기능하는 것인 핵산 분자.
  3. 제2항에 있어서, RGN 폴리펩티드가 염기-편집 폴리펩티드에 작동가능하게 융합된 것인 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 벡터가 상기 가이드 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 가이드 RNA가 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 CRISPR 반복 서열을 포함하는 CRISPR RNA를 포함하는 것인 벡터.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 가이드 RNA가 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 tracrRNA를 포함하는 것인 벡터.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
  8. CRISPR RNA (crRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자이며, 상기 crRNA는 스페이서 서열 및 CRISPR 반복 서열을 포함하고, 상기 CRISPR 반복 서열은 서열식별번호: 2, 17, 25, 36, 44, 51 또는 63과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
    a) 상기 crRNA; 및
    b) 상기 crRNA의 상기 CRISPR 반복 서열에 혼성화된 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)
    를 포함하는 가이드 RNA는
    상기 가이드 RNA가 RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 폴리펩티드에 결합할 때, 상기 crRNA의 스페이서 서열을 통해 서열 특이적인 방식으로 표적 DNA 서열에 혼성화할 수 있고,
    crRNA를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 분자.
  9. 제8항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 벡터가 상기 tracrRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 벡터.
  11. 서열식별번호: 3, 18, 26, 37, 45, 52 또는 62와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자이며;
    a) 상기 tracrRNA; 및
    b) 스페이서 서열 및 CRISPR 반복 서열을 포함하는 crRNA
    - 상기 tracrRNA는 상기 crRNA의 상기 CRISPR 반복 서열과 혼성화함
    를 포함하는 가이드 RNA는
    상기 가이드 RNA가 RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 폴리펩티드에 결합할 때, 상기 crRNA의 스페이서 서열을 통해 서열 특이적인 방식으로 표적 DNA 서열에 혼성화할 수 있고,
    tracrRNA를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 분자.
  12. 제11항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 벡터가 상기 crRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 벡터.
  14. 표적 DNA 서열에 결합하기 위한 시스템이며, 상기 시스템은
    a) 상기 표적 DNA 서열과 혼성화할 수 있는 하나 이상의 가이드 RNA, 또는 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열; 및
    b) 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 폴리펩티드, 또는 RGN 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
    을 포함하고;
    하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하고 RGN 폴리펩티드를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열 각각은 상기 각각의 뉴클레오티드 서열에 대해 이종성인 프로모터에 작동가능하게 연결되고;
    하나 이상의 가이드 RNA는 표적 DNA 서열과 혼성화하고,
    하나 이상의 가이드 RNA는 RGN 폴리펩티드와 복합체를 형성하여, 상기 RGN 폴리펩티드가 상기 표적 DNA 서열에 결합하도록 지시하는 것인 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 표적 DNA 서열이 진핵생물 세포 내에 있는 것인 시스템.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드가 뉴클레아제 데드이거나 또는 닉카제로서 기능하고, RGN 폴리펩티드가 염기-편집 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 것인 시스템.
  17. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 시스템이 하나 이상의 공여자 폴리뉴클레오티드, 또는 하나 이상의 공여자 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 하나 이상의 공여자 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열 각각이 상기 각각의 뉴클레오티드 서열에 대해 이종성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 시스템.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 시스템을 표적 DNA 서열 또는 표적 DNA 서열을 포함하는 세포에 전달하는 것을 포함하는, 표적 DNA 서열에 결합시키는 방법.
  19. 표적 DNA 서열을
    a) RNA-가이드된 뉴클레아제 (RGN) 폴리펩티드 - 여기서 상기 RGN은 서열식별번호: 1, 16, 24, 35, 43 또는 50과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함;
    b) (a)의 RGN을 표적 DNA 서열에 표적화시킬 수 있는 하나 이상의 가이드 RNA
    와 접촉시키는 것을 포함하며;
    하나 이상의 가이드 RNA는 표적 DNA 서열과 혼성화하여, 상기 RGN 폴리펩티드가 상기 표적 DNA 서열에 결합하도록 지시하고, 상기 표적 DNA 서열의 절단 및/또는 변형이 일어나는 것인, 표적 DNA 서열을 절단하고/거나 변형시키는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 변형된 표적 DNA 서열이 표적 DNA 서열로부터 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실 또는 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 RGN 폴리펩티드가 뉴클레아제 데드이거나 또는 닉카제로서 기능하고, RGN 폴리펩티드가 염기-편집 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 변형된 표적 DNA 서열이 표적 DNA 서열로의 이종성 DNA의 삽입을 포함하는 것인 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 DNA 서열이 세포 내에 있는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 세포가 진핵생물 세포인 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, RGN 폴리펩티드가 발현되고 표적 DNA 서열을 절단하여 변형된 DNA 서열을 생성하는 조건하에 세포를 배양하고; 상기 변형된 DNA 서열을 포함하는 세포를 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  26. 제25항의 방법에 따른 변형된 표적 DNA 서열을 포함하는 세포.
  27. 데아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자이며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416 또는 420과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 데아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
    상기 데아미나제 폴리펩티드는 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 뉴클레오티드를 탈아미노화시키고;
    데아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 분자.
  28. 제27항에 있어서, 상기 데아미나제 폴리펩티드가 상기 데아미나제 폴리펩티드를 상기 표적 폴리뉴클레오티드에 국재화시키는 RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드에 작동가능하게 융합된 것인 핵산 분자.
  29. 제28항에 있어서, 상기 RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드가 닉카제인 핵산 분자.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  31. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제30항의 벡터를 포함하는 세포.
  32. 아데노신 데아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자이며, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 아데노신 데아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
    a) 서열식별번호: 514와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    b) 서열식별번호: 572와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 572의 위치 102에 상응하는 위치에서 리신, 서열식별번호: 572의 위치 104에 상응하는 위치에서 티로신, 및 서열식별번호: 572의 위치 106에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
    c) 서열식별번호: 573과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    d) 서열식별번호: 574와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 574의 위치 101에 상응하는 위치에서 글루탐산, 서열식별번호: 574의 위치 103에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 574의 위치 105에 상응하는 위치에서 리신을 포함하는 아미노산 서열;
    e) 서열식별번호: 575와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 575의 위치 101에 상응하는 위치에서 리신, 서열식별번호: 575의 위치 103에 상응하는 위치에서 류신, 및 서열식별번호: 575의 위치 105에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
    f) 서열식별번호: 576과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 576의 위치 105에 상응하는 위치에서 알라닌 및 서열식별번호: 576의 위치 107에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함하는 아미노산 서열;
    g) 서열식별번호: 577과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 577의 위치 102에 상응하는 위치에서 글리신, 서열식별번호: 577의 위치 104에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 577의 위치 106에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함하는 아미노산 서열;
    h) 서열식별번호: 578과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 578의 위치 105에 상응하는 위치에서 세린 및 서열식별번호: 578의 위치 107에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
    i) 서열식별번호: 579와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 579의 위치 102에 상응하는 위치에서 세린, 서열식별번호: 579의 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 및 서열식별번호: 579의 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신을 포함하는 아미노산 서열;
    j) 서열식별번호: 580과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 580의 위치 111에 상응하는 위치에서 글리신을 포함하는 아미노산 서열;
    k) 서열식별번호: 581과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 581의 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 서열식별번호: 581의 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신, 및 서열식별번호: 581의 위치 108에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
    l) 서열식별번호: 582와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 582의 위치 102에 상응하는 위치에서 아르기닌, 서열식별번호: 582의 위치 104에 상응하는 위치에서 트립토판, 및 서열식별번호: 582의 위치 106에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
    m) 서열식별번호: 583과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 583의 위치 104에 상응하는 위치에서 아르기닌 및 서열식별번호: 583의 위치 106에 상응하는 위치에서 세린을 포함하는 아미노산 서열; 및
    n) 서열식별번호: 584와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 584의 위치 110에 상응하는 위치에서 페닐알라닌, 서열식별번호: 584의 위치 112에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 584의 위치 114에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
    상기 아데노신 데아미나제 폴리펩티드는 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 아데노신을 탈아미노화시키고;
    아데노신 데아미나제 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 분자.
  33. 제32항에 있어서, 상기 아데노신 데아미나제 폴리펩티드가 상기 아데노신 데아미나제 폴리펩티드를 상기 표적 폴리뉴클레오티드에 국재화시키는 RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드에 작동가능하게 융합된 것인 핵산 분자.
  34. 제33항에 있어서, 상기 RNA-가이드된 뉴클레아제 폴리펩티드가 닉카제인 핵산 분자.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  36. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제35항의 벡터를 포함하는 세포.
  37. 하기를 포함하는 융합 단백질이며:
    a) 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하는 DNA-결합 폴리펩티드; 및
    b) 데아미나제 폴리펩티드,
    상기 데아미나제 폴리펩티드는 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416 또는 420과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 데아미나제 폴리펩티드는 상기 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 뉴클레오티드를 탈아미노화시키는 것인 융합 단백질.
  38. 제37항에 있어서, DNA-결합 폴리펩티드가 닉카제 활성을 갖는 RNA-가이드된 뉴클레아제인 융합 단백질.
  39. 하기를 포함하는 융합 단백질이며:
    a) 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하는 DNA-결합 폴리펩티드; 및
    b) 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 아데노신 데아미나제 폴리펩티드:
    i) 서열식별번호: 514와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    ii) 서열식별번호: 572와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 572의 위치 102에 상응하는 위치에서 리신, 서열식별번호: 572의 위치 104에 상응하는 위치에서 티로신, 및 서열식별번호: 572의 위치 106에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
    iii) 서열식별번호: 573과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    iv) 서열식별번호: 574와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 574의 위치 101에 상응하는 위치에서 글루탐산, 서열식별번호: 574의 위치 103에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 574의 위치 105에 상응하는 위치에서 리신을 포함하는 아미노산 서열;
    v) 서열식별번호: 575와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 575의 위치 101에 상응하는 위치에서 리신, 서열식별번호: 575의 위치 103에 상응하는 위치에서 류신, 및 서열식별번호: 575의 위치 105에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
    vi) 서열식별번호: 576과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 576의 위치 105에 상응하는 위치에서 알라닌 및 서열식별번호: 576의 위치 107에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함하는 아미노산 서열;
    vii) 서열식별번호: 577과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 577의 위치 102에 상응하는 위치에서 글리신, 서열식별번호: 577의 위치 104에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 577의 위치 106에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함하는 아미노산 서열;
    viii) 서열식별번호: 578과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 578의 위치 105에 상응하는 위치에서 세린 및 서열식별번호: 578의 위치 107에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
    ix) 서열식별번호: 579와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 579의 위치 102에 상응하는 위치에서 세린, 서열식별번호: 579의 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 및 서열식별번호: 579의 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신을 포함하는 아미노산 서열;
    x) 서열식별번호: 580과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 580의 위치 111에 상응하는 위치에서 글리신을 포함하는 아미노산 서열;
    xi) 서열식별번호: 581과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 581의 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 서열식별번호: 581의 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신, 및 서열식별번호: 581의 위치 108에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
    xii) 서열식별번호: 582와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 582의 위치 102에 상응하는 위치에서 아르기닌, 서열식별번호: 582의 위치 104에 상응하는 위치에서 트립토판, 및 서열식별번호: 582의 위치 106에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
    xiii) 서열식별번호: 583과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 583의 위치 104에 상응하는 위치에서 아르기닌 및 서열식별번호: 583의 위치 106에 상응하는 위치에서 세린을 포함하는 아미노산 서열; 및
    xiv) 서열식별번호: 584와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 584의 위치 110에 상응하는 위치에서 페닐알라닌, 서열식별번호: 584의 위치 112에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 584의 위치 114에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
    상기 아데노신 데아미나제 폴리펩티드는 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 아데노신을 탈아미노화시키는 것인 융합 단백질.
  40. 제39항에 있어서, DNA-결합 폴리펩티드가 닉카제 활성을 갖는 RNA-가이드된 뉴클레아제인 융합 단백질.
  41. 하기를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키기 위한 시스템이며:
    a) 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 하나 이상의 가이드 RNA, 또는 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열; 및
    b) 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
    하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하고 융합 단백질을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열 각각은 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 이종성인 프로모터에 대해 작동가능하게 연결되고;
    하나 이상의 가이드 RNA는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화하고,
    하나 이상의 가이드 RNA는 융합 단백질의 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드와의 복합체를 형성하여, 상기 융합 단백질이 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하여 그를 변형시키도록 지시하는 것인 시스템.
  42. 표적 폴리뉴클레오티드를 서열식별번호: 374, 383, 397, 399, 407, 408, 411, 414, 416 또는 420과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 데아미나제와 접촉시키는 것을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드를 탈아미노화시키는 방법이며, 상기 데아미나제 폴리펩티드는 상기 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 뉴클레오티드를 탈아미노화시키는 것인 방법.
  43. 표적 폴리뉴클레오티드를 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 아데노신 데아미나제 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 아데노신을 탈아미노화시키는 방법이며:
    a) 서열식별번호: 514와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    b) 서열식별번호: 572와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 572의 위치 102에 상응하는 위치에서 리신, 서열식별번호: 572의 위치 104에 상응하는 위치에서 티로신, 및 서열식별번호: 572의 위치 106에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
    c) 서열식별번호: 573과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    d) 서열식별번호: 574와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 574의 위치 101에 상응하는 위치에서 글루탐산, 서열식별번호: 574의 위치 103에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 574의 위치 105에 상응하는 위치에서 리신을 포함하는 아미노산 서열;
    e) 서열식별번호: 575와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 575의 위치 101에 상응하는 위치에서 리신, 서열식별번호: 575의 위치 103에 상응하는 위치에서 류신, 및 서열식별번호: 575의 위치 105에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
    f) 서열식별번호: 576과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 576의 위치 105에 상응하는 위치에서 알라닌 및 서열식별번호: 576의 위치 107에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함하는 아미노산 서열;
    g) 서열식별번호: 577과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 577의 위치 102에 상응하는 위치에서 글리신, 서열식별번호: 577의 위치 104에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 577의 위치 106에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함하는 아미노산 서열;
    h) 서열식별번호: 578과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 578의 위치 105에 상응하는 위치에서 세린 및 서열식별번호: 578의 위치 107에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
    i) 서열식별번호: 579와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 579의 위치 102에 상응하는 위치에서 세린, 서열식별번호: 579의 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 및 서열식별번호: 579의 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신을 포함하는 아미노산 서열;
    j) 서열식별번호: 580과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 580의 위치 111에 상응하는 위치에서 글리신을 포함하는 아미노산 서열;
    k) 서열식별번호: 581과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 581의 위치 104에 상응하는 위치에서 글루타민, 서열식별번호: 581의 위치 106에 상응하는 위치에서 글리신, 및 서열식별번호: 581의 위치 108에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
    l) 서열식별번호: 582와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 582의 위치 102에 상응하는 위치에서 아르기닌, 서열식별번호: 582의 위치 104에 상응하는 위치에서 트립토판, 및 서열식별번호: 582의 위치 106에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함하는 아미노산 서열;
    m) 서열식별번호: 583과 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 583의 위치 104에 상응하는 위치에서 아르기닌 및 서열식별번호: 583의 위치 106에 상응하는 위치에서 세린을 포함하는 아미노산 서열; 및
    n) 서열식별번호: 584와 적어도 90% 서열 동일성을 갖고, 서열식별번호: 584의 위치 110에 상응하는 위치에서 페닐알라닌, 서열식별번호: 584의 위치 112에 상응하는 위치에서 세린, 및 서열식별번호: 584의 위치 114에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 아미노산 서열;
    상기 아데노신 데아미나제 폴리펩티드는 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 아데노신을 탈아미노화시키는 것인 방법.
  44. 표적 폴리뉴클레오티드를 제37항 또는 제39항의 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법이며, 상기 DNA-결합 폴리펩티드는 상기 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하고, 상기 데아미나제는 상기 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 뉴클레오티드를 탈아미노화시키는 것인 방법.
  45. 표적 폴리뉴클레오티드를 제38항 또는 제40항의 융합 단백질과 접촉시키고, 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA), 또는 하나 이상의 gRNA를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 도입시키는 것을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법이며;
    하나 이상의 gRNA는 상기 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고, 융합 단백질의 RNA-가이드된 DNA-결합 폴리펩티드와의 복합체를 형성하여, 상기 융합 단백질이 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하도록 지시하고, 융합 단백질의 상기 데아미나제 폴리펩티드는 상기 표적 폴리뉴클레오티드에서 적어도 하나의 뉴클레오티드를 탈아미노화시켜, 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것인 방법.
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