KR20150107739A - 유전자 산물의 발현의 변경을 위한 ｃｒｉｓｐｒ―ｃａｓ 시스템 및 방법 - Google Patents

유전자 산물의 발현의 변경을 위한 ｃｒｉｓｐｒ―ｃａｓ 시스템 및 방법 Download PDF

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KR20150107739A
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펑 장
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더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드
매사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

본 발명은 표적 유전자 서열 및 관련 유전자 산물의 발현을 변경시키기 위한 시스템, 방법 및 조성물을 제공한다. 일부가 CRISPR 복합체의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 벡터 및 벡터 시스템, 및 이러한 벡터의 설계 및 사용 방법이 제공된다. 또한, 진핵 세포에서 CRISPR 복합체 형성의 유도 방법 및 CRISPR-Cas 시스템의 이용 방법이 제공된다.

Description

유전자 산물의 발현의 변경을 위한 ＣＲＩＳＰＲ―ＣＡＳ 시스템 및 방법 {CRISPR-CAS SYSTEMS AND METHODS FOR ALTERING EXPRESSION OF GENE PRODUCTS}
관련 출원 및 참조에 의한 포함
본 출원은 각각 2013년 7월 2일 및 2013년 10월 15일에 출원되고, 명칭이 "CRISPR-CAS SYSTEMS AND METHODS FOR ALTERING EXPRESSION OF GENE PRODUCTS"이며, 각각 브로드(Broad) 참조번호 BI-2011/008A를 갖는 미국 가출원 제61/842,322호 및 미국 특허 출원 제14/054,414호에 대한 우선권을 주장한다. 또한, 각각 2012년 12월 12일, 2013년 1월 2일, 2013년 3월 15일 및 2013년 6월 17일에 출원되고, 모두 명칭이 "SYSTEMS METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION"이며, 각각 브로드 참조번호 BI-2011/008/WSGR 사건 번호 44063-701.101, BI-2011/008/WSGR 사건 번호 44063-701.102, 브로드 참조번호 BI-2011/008/VP 사건 번호 44790.02.2003 및 BI-2011/008/VP 사건 번호 44790.03.2003을 갖는 미국 가출원 제61/736,527호, 제61/748,427호, 제61/791,409호 및 제61/835,931호에 대한 우선권을 주장한다.
각각 2013년 1월 30일; 2013년 2월 25일; 2013년 3월 15일; 2013년 3월 28일; 2013년 4월 20일; 2013년 5월 6일; 및 2013년 5월 28일에 출원되고, 각각 명칭이 "ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION"인 미국 가출원 제61/758,468호; 제61/769,046호; 제61/802,174호; 제61/806,375호; 제61/814,263호; 제61/819,803호 및 제61/828,130호를 참조한다. 또한, 각각이 2013년 6월 17일에 출원된 미국 가출원 제61/835,936호, 제61/836,127호, 제61/836,101호, 제61/836,080호 및 제61/835,973호를 참조한다.
전술한 출원, 및 상기 출원에 또는 상기 출원의 절차 중에 인용된 모든 문헌("출원 인용 문헌") 및 상기 출원 인용 문헌에 인용되거나 참고된 모든 문헌, 및 본원에서 인용되거나 참고된 모든 문헌("본원 인용 문헌") 및 본원 인용 문헌에 인용되거나 참고된 모든 문헌은, 본원에 언급되거나 본원에 참고로 포함된 임의의 문헌에 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조사의 지침서, 설명서, 제품 명세서 및 제품 시이트(sheet)와 함께, 본원에 참고로 포함되어 있으며, 그리고 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 모든 참조된 문헌은 마치 각각의 개별 문헌을 참고로 포함하는 것으로 특정적으로 그리고 개별적으로 나타내는 것과 동일한 정도로 참고로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; CRISPR) 및 그의 성분과 관련된 벡터 시스템을 사용할 수 있는 게놈 변동(genomic perturbation) 또는 유전자-교정(gene-editing)과 같이 서열 표적화를 수반하는 유전자 발현의 제어를 위해 사용되는 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것이다.
연방 정부가 후원하는 연구에 대한 성명
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 지급된 NIH 파이오니어 어워드(Pioneer Award) DP1MH100706 하의 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 소정의 권리를 갖는다.
게놈 시퀀싱(sequencing) 기술 및 분석 방법의 최근의 진전에 의해, 다양한 생물학적 기능 및 질병(disease)과 관련된 유전적 요인을 분류하고 발견하는 능력이 상당히 가속화되었다. 개별 유전 요소의 선택적 변동을 가능하게 함으로써 원인이 되는 유전 변이의 체계적인 역의 조작을 가능하게 할 뿐 아니라, 합성 생물학, 생명공학 및 의학 응용을 진전시키기 위하여, 정밀한 게놈 표적화 기술이 필요하다. 게놈-교정 기술, 예를 들어, 디자이너 징크 핑거, 전사 활성화제-유사 이펙터(effector)(TALE) 또는 귀소 메가뉴클레아제(homing meganuclease)가 표적화된 게놈 변동을 생성하는데 이용가능하지만, 가격이 알맞고, 설립하기 용이하며, 확대가능하고, 진핵 게놈 내의 다수의 위치를 표적화하는데 부합되는 새로운 게놈 조작 기술이 필요하다.
발명의 요약
다수의 응용에서 대안의 강력한 서열 표적화 시스템 및 기술이 긴급하게 필요하다. 본 발명은 이러한 요구를 다루며, 관련 이점을 제공한다. CRISPR/Cas 또는 CRISPR-Cas 시스템(두 용어 모두는 본 출원에서 상호교환가능하게 사용된다)은 특정 서열을 표적화하기 위해 맞춤형 단백질의 생성을 필요로 하지 않고, 오히려, 단일의 Cas 효소가 짧은 RNA 분자에 의해 프로그램화되어, 특정 DNA 표적을 인식할 수 있으며, 다시 말하면, Cas 효소는 상기 짧은 RNA 분자를 사용하여 특정 DNA 표적에 동원될 수 있다. 게놈 시퀀싱(sequencing) 기술 및 분석 방법의 레퍼토리에 CRISPR-Cas 시스템을 부가하면, 방법을 상당히 단순화시킬 수 있으며, 다양한 생물학적 기능 및 질병과 관련된 유전적 요인을 분류하고 발견하는 능력을 가속화시킬 수 있다. 유해 영향 없이 게놈 교정을 위해 효율적으로 CRISPR-Cas 시스템을 사용하기 위하여, 조작의 양태, 및 청구된 발명의 양태인 이들 게놈 조작 도구의 최적화를 이해하는 것이 중요하다.
일 양태에서, 본 발명은 Cas 단백질 및 DNA 분자를 표적화하는 하나 이상의 가이드 RNA를 포함할 수 있는 조작된 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자를 함유하고 이를 발현하는 세포로 도입하여, 하나 이상의 가이드 RNA가 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌를 표적화하고, Cas 단백질이 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌를 절단하여, 하나 이상의 유전자 산물의 발현이 변경되거나 변형되는 단계를 포함할 수 있는 하나 이상의 유전자 산물의 발현의 변경 또는 변형 방법을 제공하며; Cas 단백질 및 가이드 RNA는 천연적으로 함께 발생하지 않는다. 본 발명은 2개 이상의 유전자 산물의 발현이 변경되거나 변형될 수 있음을 이해한다. 본 발명은 추가로 가이드 RNA가 tracr 서열에 융합된 가이드 서열을 포함하는 것을 이해한다. 바람직한 구현예에서, 세포는 진핵 세포이고, 더욱 바람직한 구현예에서, 세포는 포유동물 세포이며, 더더욱 바람직한 구현예에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 또한, 본 발명은 Cas 단백질이 하나 이상의 핵 국소화 신호(들)(NLS(들))를 포함할 수 있음을 이해한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 II형 CRISPR 시스템 효소이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) 또는 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) Cas9이며, 이들 유기체로부터 유래된 돌연변이된 Cas9를 포함할 수 있다. 단백질은 Cas9 상동체 또는 오솔로그(ortholog)일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 표적 서열의 위치에서 1개 또는 2개 가닥의 절단을 유도한다. 본 발명의 추가의 양태에서, 유전자 산물의 발현은 감소되고, 유전자 산물은 단백질이다. 본 발명은 세포로의 도입이 바이러스 입자, 리포솜, 전기천공법, 미세주입 또는 컨쥬게이션을 포함할 수 있는 전달 시스템에 의한 것임을 이해한다.
다른 양태에서, 본 발명은 a) 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌 내의 표적 서열과 혼성화하는 하나 이상의 CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA에 작동가능하게 연결된 제1 조절 요소, b) Cas 단백질에 작동가능하게 연결된 제2 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있는 조작된 비-천연 발생 벡터 시스템을 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자를 함유하고 이를 발현하는 세포로 도입하는 단계를 포함하는 하나 이상의 유전자 산물의 발현의 변경 또는 변형 방법을 제공하며, 여기서, 성분 (a) 및 (b)는 상기 시스템의 동일한 또는 상이한 벡터에 배치되어, 가이드 RNA가 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌를 표적화하고, Cas 단백질이 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌를 절단하여, 하나 이상의 유전자 산물의 발현이 변경되거나 변형되고; Cas 단백질 및 가이드 RNA는 천연적으로 함께 발생하지 않는다. 본 발명은 2개 이상의 유전자 산물의 발현이 변경되거나 변형될 수 있음을 이해한다. 본 발명은 추가로, 가이드 RNA가 tracr 서열에 융합된 가이드 서열을 포함함을 이해한다. 바람직한 구현예에서, 세포는 진핵 세포이며, 더욱 바람직한 구현예에서, 세포는 포유동물 세포이고, 더더욱 바람직한 구현예에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 또한, 본 발명은 시스템의 벡터가 하나 이상의 NLS(들)를 더 포함할 수 있음을 이해한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 II형 CRISPR 시스템 효소이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코커스 써모필러스 Cas9이며, 이들 유기체로부터 유래된 돌연변이된 Cas9를 포함할 수 있다. 단백질은 Cas9 상동체 또는 오솔로그일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 표적 서열의 위치에서 1개 또는 2개 가닥의 절단을 유도한다. 본 발명의 추가의 양태에서, 유전자 산물의 발현은 감소되고, 유전자 산물은 단백질이다. 본 발명은 세포로의 도입이 바이러스 입자, 리포솜, 전기천공법, 미세주입 또는 컨쥬게이션을 포함할 수 있는 전달 시스템에 의한 것임을 이해한다.
또한, 본 발명은 a) 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌 내의 표적 서열과 혼성화하는 하나 이상의 CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA에 작동가능하게 연결된 제1 조절 요소, b) Cas 단백질에 작동가능하게 연결된 제2 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있는 조작된 비-천연 발생 벡터 시스템을 제공하며, 여기서, 성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일한 또는 상이한 벡터에 배치되어, 가이드 RNA가 세포 내의 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌를 표적화하고, Cas 단백질이 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌를 절단하여, 하나 이상의 유전자 산물의 발현이 변경되거나 변형되고; Cas 단백질 및 가이드 RNA가 천연적으로 함께 발생하지 않는다. 본 발명은 2개 이상의 유전자 산물의 발현이 변경되거나 변형될 수 있음을 이해한다. 본 발명은 추가로, 가이드 RNA가 tracr 서열에 융합된 가이드 서열을 포함함을 이해한다. 바람직한 구현예에서, 세포는 진핵 세포이며, 더욱 바람직한 구현예에서, 세포는 포유동물 세포이고, 더더욱 바람직한 구현예에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 또한, 본 발명은 시스템의 벡터가 하나 이상의 NLS(들)를 더 포함할 수 있음을 이해한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 II형 CRISPR 시스템 효소이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코커스 써모필러스 Cas9이며, 이들 유기체로부터 유래된 돌연변이된 Cas9를 포함할 수 있다. 단백질은 Cas9 상동체 또는 오솔로그일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 표적 서열의 위치에서 1개 또는 2개 가닥의 절단을 유도한다. 본 발명의 추가의 양태에서, 유전자 산물의 발현은 감소되고, 유전자 산물은 단백질이다. 본 발명은 세포로의 도입이 바이러스 입자, 리포솜, 전기천공법, 미세주입 또는 컨쥬게이션을 포함할 수 있는 전달 시스템에 의한 것임을 이해한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Cas 단백질 및 세포 내의 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌를 표적화하는 하나 이상의 가이드 RNA를 포함할 수 있는 프로그램화가능한 조작된 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 제공하며, Cas 단백질은 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌를 절단하여, 하나 이상의 유전자 산물의 발현이 변경되거나 변형되고; Cas 단백질 및 가이드 RNA가 천연적으로 함께 발생하지 않는다. 본 발명은 2개 이상의 유전자 산물의 발현이 변경되거나 변형될 수 있음을 이해한다. 본 발명은 추가로, 가이드 RNA가 tracr 서열에 융합된 가이드 서열을 포함함을 이해한다. 바람직한 구현예에서, 세포는 진핵 세포이며, 더욱 바람직한 구현예에서, 세포는 포유동물 세포이고, 더더욱 바람직한 구현예에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 또한, 본 발명은 CRISPR-Cas 시스템이 하나 이상의 NLS(들)를 더 포함할 수 있음을 이해한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 II형 CRISPR 시스템 효소이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코커스 써모필러스 Cas9이며, 이들 유기체로부터 유래된 돌연변이된 Cas9를 포함할 수 있다. 단백질은 Cas9 상동체 또는 오솔로그일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 표적 서열의 위치에서 1개 또는 2개 가닥의 절단을 유도한다. 본 발명의 추가의 양태에서, 유전자 산물의 발현은 감소되고, 유전자 산물은 단백질이다. 본 발명은 세포로의 도입이 바이러스 입자, 리포솜, 전기천공법, 미세주입 또는 컨쥬게이션을 포함할 수 있는 전달 시스템에 의한 것임을 이해한다.
일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, 시스템은 (a) tracr 메이트(mate) 서열, 및 tracr 메이트 서열의 상류에 하나 이상의 가이드 서열을 삽입하기 위한 하나 이상의 삽입 부위에 작동가능하게 연결된 제1 조절 요소로서, 상기 가이드 서열은 발현되는 경우, 진핵 세포 내의 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하고, 상기 CRISPR 복합체는 (1) 상기 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열, 및 (2) 상기 tracr 서열에 혼성화되는 tracr 메이트 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하는 제1 조절 요소; 및 (b) 핵 국소화 서열을 포함하는 상기 CRISPR 효소를 인코딩하는 효소-코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제2 조절 요소를 포함하며; 성분 (a) 및 (b)는 상기 시스템의 동일한 또는 상이한 벡터에 위치한다. 일부 구현예에서, 성분 (a)는 제1 조절 요소의 제어 하에 tracr 메이트 서열의 하류의 tracr 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 성분 (a)는 제1 조절 요소에 작동가능하게 연결된 2개 이상의 가이드 서열을 더 포함하며, 2개 이상의 가이드 서열의 각각은 발현되는 경우, 진핵 세포 내의 상이한 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 지시한다. 일부 구현예에서, 상기 시스템은 제3 조절 요소, 예를 들어, 중합효소 III 프로모터의 제어 하에 tracr 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, tracr 서열은 최적으로 정렬되는 경우, tracr 메이트 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 나타낸다. 최적의 정렬의 결정은 당업자의 이해 범위 내에 있다. 예를 들어, 공개적이며 상업적으로 이용가능한 정렬 알고리즘 및 프로그램, 예를 들어, 비제한적으로 ClustalW, matlab의 Smith-Waterman, Bowtie, Geneious, Biopython 및 SeqMan이 존재한다. 일부 구현예에서, CRISPR 복합체는 진핵 세포의 핵에서 검출가능한 양으로 상기 CRISPR 복합체의 축적을 유도하기에 충분한 세기의 하나 이상의 핵 국소화 서열을 포함한다. 이론에 구속되지 않으면서, 핵 국소화 서열은 진핵생물에서 CRISPR 복합체 활성에 필요하지 않지만, 이러한 서열을 포함하여, 시스템의 활성을 증진시켜, 특히 핵 내의 핵산 분자를 표적화하는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 II형 CRISPR 시스템 효소이다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 Cas9 효소이다. 일부 구현예에서, Cas9 효소는 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코커스 써모필러스 Cas9이며, 이들 유기체로부터 유래된 돌연변이된 Cas9를 포함할 수 있다. 효소는 Cas9 상동체 또는 오솔로그일 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 위치에서 1개 또는 2개 가닥의 절단을 유도한다. 일부 구현예에서, 제1 조절 요소는 중합효소 III 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 조절 요소는 중합효소 II 프로모터이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25개 뉴클레오티드 또는 10 내지 30개 또는 15 내지 25개 또는 15 내지 20개 뉴클레오티드 길이이다. 일반적으로, 그리고 본원에서, 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 단일-가닥, 이중-가닥 또는 부분 이중-가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단을 포함하거나, 자유 말단을 포함하지 않는(예를 들어, 환형) 핵산 분자; DNA, RNA 또는 둘 모두를 포함하는 핵산 분자; 및 당업계에 공지되어 있는 다른 종류의 폴리뉴클레오티드를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 하나의 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 세그먼트가 예를 들어, 표준 분자 클로닝 기술에 의해 삽입될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서, 바이러스-유래 DNA 또는 RNA 서열은 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 복제 결함 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)로의 패키징을 위한 벡터에 존재한다. 또한, 바이러스 벡터는 숙주 세포로의 트랜스펙션(transfection)을 위해 바이러스가 지니는 폴리뉴클레오티드도 포함한다. 특정 벡터(예를 들어, 박테리아 복제 원점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터)는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다. 기타 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입시에 숙주 세포의 게놈으로 통합되며, 이에 의해, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 게다가, 특정 벡터는 그들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 재조합 DNA 기술에 유용한 통상적인 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다.
재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 핵산의 발현에 적절한 형태의 본 발명의 핵산을 포함할 수 있으며, 이는 재조합 발현 벡터가, 발현을 위해 사용될 숙주 세포에 기초하여 선택될 수 있는, 발현될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동가능하게 연결된"은 대상 뉴클레오티드 서열이 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템 내에서, 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입되는 경우 숙주 세포 내에서) 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 방식으로 조절 요소(들)에 연결된 것을 의미하는 의도이다.
용어 "조절 요소"는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site; IRES) 및 기타 발현 제어 요소(예를 들어, 전사 종결 신호, 예를 들어, 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)를 포함하는 의도이다. 이러한 조절 요소는 예를 들어, 문헌[Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기술되어 있다. 조절 요소는 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 유도하는 조절 요소 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도하는 조절 요소(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)를 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 요망되는 대상 조직, 예를 들어, 근육, 뉴런, 뼈, 피부, 혈액, 특정 기관(예를 들어, 간, 췌장) 또는 특정 세포 유형(예를 들어, 림프구)에서 주로 발현을 유도할 수 있다. 또한, 조절 요소는 시간-의존적 방식으로, 예를 들어, 세포-주기 의존적 또는 발생 단계-의존적 방식으로 발현을 유도할 수 있으며, 이는 조직 또는 세포-유형에 특이적이거나 그렇지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 pol III 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 pol III 프로모터), 하나 이상의 pol II 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 pol II 프로모터), 하나 이상의 pol I 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 pol I 프로모터) 또는 그들의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예에는 U6 및 H1 프로모터가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. pol II 프로모터의 예에는 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서가 존재), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서가 존재)[예를 들어, 문헌(Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)) 참조], SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 또한, 용어 "조절 요소"에는 인핸서 요소, 예를 들어, WPRE; CMV 인핸서; HTLV-I의 LTR 내의 R-U5' 세그먼트(문헌[Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988]); SV40 인핸서; 및 토끼 β-글로빈의 엑손 2와 3 사이의 인트론 서열(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981])이 포함된다. 발현 벡터의 설계가 형질전환될 숙주 세포의 선택, 요망되는 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다. 벡터를 숙주 세포로 도입하여, 전사물, 본원에 기술된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩된 융합 단백질 또는 펩티드를 포함하는 단백질 또는 펩티드(예를 들어, 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부(CRISPR) 전사물, 단백질, 효소, 그의 돌연변이체 형태, 그의 융합 단백질 등)를 생성할 수 있다.
유리한 벡터는 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하며, 또한, 이러한 벡터의 유형은 특정 세포 유형을 표적화하기 위해 선택될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 (a) tracr 메이트 서열, 및 tracr 메이트 서열의 상류에 하나 이상의 가이드 서열을 삽입하기 위한 하나 이상의 삽입 부위에 작동가능하게 연결된 제1 조절 요소로서, 상기 가이드 서열은 발현되는 경우, 진핵 세포 내의 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하고, 상기 CRISPR 복합체는 (1) 상기 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열, 및 (2) 상기 tracr 서열에 혼성화되는 tracr 메이트 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하는 제1 조절 요소; 및/또는 (b) 핵 국소화 서열을 포함하는 상기 CRISPR 효소를 인코딩하는 효소-코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제2 조절 요소를 포함하는 진핵 숙주 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 성분 (a) 및 (b)를 포함한다. 일부 구현예에서, 성분 (a), 성분 (b) 또는 성분 (a) 및 (b)는 숙주 진핵 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된다. 일부 구현예에서, 성분 (a)는 제1 조절 요소의 제어 하에 tracr 메이트 서열의 하류의 tracr 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 성분 (a)는 제1 조절 요소에 작동가능하게 연결된 2개 이상의 가이드 서열을 더 포함하며, 2개 이상의 가이드 서열의 각각은 발현되는 경우, 진핵 세포 내의 상이한 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 유도한다. 일부 구현예에서, 진핵 숙주 세포는 상기 tracr 서열에 작동가능하게 연결된 제3 조절 요소, 예를 들어, 중합효소 III 프로모터를 더 포함한다. 일부 구현예에서, tracr 서열은 최적으로 정렬되는 경우 tracr 메이트 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 나타낸다. 효소는 Cas9 상동체 또는 오솔로그일 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 위치에서 1개 또는 2개의 가닥의 절단을 유도한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 DNA 가닥 절단 활성이 결여된다. 일부 구현예에서, 제1 조절 요소는 중합효소 III 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 조절 요소는 중합효소 II 프로모터이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25개 뉴클레오티드 또는 10 내지 30개 또는 15 내지 25개 또는 15 내지 20개 뉴클레오티드 길이이다. 일 양태에서, 본 발명은 기술된 구현예 중 임의의 것에 따른 진핵 숙주 세포를 포함하는 비-인간 진핵 유기체; 바람직하게는 다세포 진핵 유기체를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 기술된 구현예 중 임의의 것에 따른 진핵 숙주 세포를 포함하는 진핵 유기체; 바람직하게는 다세포 진핵 유기체를 제공한다. 이들 양태의 일부 구현예에서 유기체는 동물; 예를 들어, 포유동물일 수 있다. 또한, 유기체는 절지동물, 예를 들어, 곤충일 수 있다. 또한, 유기체는 식물일 수도 있다. 추가로, 유기체는 진균일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 성분 중 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 벡터 시스템 및 키트 사용 지침서를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 시스템은 (a) tracr 메이트 서열, 및 tracr 메이트 서열의 상류에 하나 이상의 가이드 서열을 삽입하기 위한 하나 이상의 삽입 부위에 작동가능하게 연결된 제1 조절 요소로서, 상기 가이드 서열은 발현되는 경우, 진핵 세포 내의 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하고, 상기 CRISPR 복합체는 (1) 상기 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열, 및 (2) 상기 tracr 서열에 혼성화되는 tracr 메이트 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하는 제1 조절 요소; 및/또는 (b) 핵 국소화 서열을 포함하는 상기 CRISPR 효소를 인코딩하는 효소-코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제2 조절 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 시스템의 동일한 또는 상이한 벡터에 위치한 성분 (a) 및 (b)를 포함한다. 일부 구현예에서, 성분 (a)는 제1 조절 요소의 제어 하에 tracr 메이트 서열의 하류의 tracr 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 성분 (a)는 제1 조절 요소에 작동가능하게 연결된 2개 이상의 가이드 서열을 더 포함하며, 2개 이상의 가이드 서열의 각각은 발현되는 경우, 진핵 세포 내의 상이한 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 유도한다. 일부 구현예에서, 시스템은 상기 tracr 서열에 작동가능하게 연결된 제3 조절 요소, 예를 들어, 중합효소 III 프로모터를 더 포함한다. 일부 구현예에서, tracr 서열은 최적으로 정렬되는 경우 tracr 메이트 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 나타낸다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 진핵 세포의 핵에서 검출가능한 양의 상기 CRISPR 효소의 축적을 유도하기에 충분한 세기의 하나 이상의 핵 국소화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 II형 CRISPR 시스템 효소이다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 Cas9 효소이다. 일부 구현예에서, Cas9 효소는 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코커스 써모필러스 Cas9이며, 이들 유기체로부터 유래된 돌연변이된 Cas9를 포함할 수 있다. 효소는 Cas9 상동체 또는 오솔로그일 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 위치에서 1개 또는 2개의 가닥의 절단을 유도한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 DNA 가닥 절단 활성이 결여된다. 일부 구현예에서, 제1 조절 요소는 중합효소 III 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 조절 요소는 중합효소 II 프로모터이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25개 뉴클레오티드 또는 10 내지 30개 또는 15 내지 25개 또는 15 내지 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일 양태에서, 본 발명은 진핵 세포에서의 표적 폴리뉴클레오티드의 변경 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CRISPR 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하게 하여, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 초래하여, 표적 폴리뉴클레오티드를 변경시키는 단계를 포함하며, 여기서, CRISPR 복합체는 상기 표적 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하며, 상기 가이드 서열은 tracr 메이트 서열에 연결되며, tracr 메이트 서열은 차례로 tracr 서열에 혼성화된다. 일부 구현예에서, 상기 절단은 상기 CRISPR 효소에 의한, 표적 서열의 위치에서의 1개 또는 2개의 가닥의 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 절단은 감소된 표적 유전자의 전사를 야기한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 외인성 주형 폴리뉴클레오티드와의 상동성 재조합에 의해 상기 절단된 표적 폴리뉴클레오티드를 수복하는 단계를 더 포함하며, 상기 수복은 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 돌연변이를 야기한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 표적 서열을 포함하는 유전자로부터 발현되는 단백질의 하나 이상의 아미노산 변화를 야기한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 벡터를 상기 진핵 세포로 전달하는 단계를 더 포함하며, 하나 이상의 벡터는 CRISPR 효소, tracr 메이트 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열 중 하나 이상의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 대상체 내의 진핵 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, 상기 변경은 세포 배양물 중의 상기 진핵 세포에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 변경 전에 상기 진핵 세포를 대상체로부터 분리하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 진핵 세포 및/또는 그로부터 유래된 세포를 상기 대상체로 복귀시키는 단계를 더 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 진핵 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 발현의 변경 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CRISPR 복합체가 폴리뉴클레오티드에 결합하게 하여, 상기 결합이 상기 폴리뉴클레오티드의 증가되거나 감소된 발현을 야기하도록 하는 단계를 포함하며; 여기서, CRISPR 복합체는 상기 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하고, 상기 가이드 서열은 tracr 메이트 서열에 연결되고, tracr 메이트 서열은 차례로 tracr 서열로 혼성화된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 벡터를 상기 진핵 세포로 전달하는 단계를 더 포함하며, 여기서, 하나 이상의 벡터는 CRISPR 효소, tracr 메이트 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열 중 하나 이상의 발현을 유도한다.
일 양태에서, 본 발명은 돌연변이된 질병 유전자를 포함하는 모델 진핵 세포의 생성 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 질병 유전자는 질병을 갖거나 질병이 발생할 위험의 증가와 관련된 임의의 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 벡터를 진핵 세포로 도입하는 단계로서, 하나 이상의 벡터는 CRISPR 효소, tracr 메이트 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열 중 하나 이상의 발현을 유도하는 단계; 및 (b) CRISPR 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하게 하여, 상기 질병 유전자 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 야기하여, 돌연변이된 질병 유전자를 포함하는 모델 진핵 세포를 생성하는 단계로서, CRISPR 복합체가 (1) 표적 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열, 및 (2) tracr 서열에 혼성화되는 tracr 메이트 서열과 복합체화되는 CRISPR 효소를 포함하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 절단은 상기 CRISPR 효소에 의한, 표적 서열의 위치에서의 1개 또는 2개의 가닥의 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 절단은 표적 유전자의 감소된 전사를 야기한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 외인성 주형 폴리뉴클레오티드와의 상동성 재조합에 의해 상기 절단된 표적 폴리뉴클레오티드를 수복하는 단계를 더 포함하며, 상기 수복은 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 돌연변이를 야기한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 표적 서열을 포함하는 유전자로부터의 단백질 발현의 하나 이상의 아미노산 변화를 야기한다.
일 양태에서, 본 발명은 질병 유전자와 관련된 세포 신호전달 사건을 조절하는 생물학적 활성 작용제의 개발 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 질병 유전자는 질병을 갖거나 질병이 발생할 위험의 증가와 관련된 임의의 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (a) 시험 화합물을 기술된 구현예 중 임의의 것의 모델 세포와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 질병 유전자의 상기 돌연변이와 관련된 세포 신호전달 사건의 감소 또는 증가를 나타내는 판독치의 변화를 검출하여, 상기 질병 유전자와 관련된 상기 세포 신호전달 사건을 조절하는 상기 생물학적 활성 작용제를 개발하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 tracr 메이트 서열의 상류에 가이드 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 가이드 서열은 발현되는 경우, 진핵 세포에 존재하는 상응하는 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 진핵 세포에 존재하는 바이러스 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 원암유전자(proto-oncogene) 또는 암유전자이다.
일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 돌연변이를 하나 이상의 세포(들) 내의 유전자에 도입함에 의한 하나 이상의 세포(들)의 선택 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 벡터를 세포(들)로 도입하는 단계로서, 하나 이상의 벡터가 CRISPR 효소, tracr 메이트 서열에 연결된 가이드 서열, tracr 서열 및 교정 주형 중 하나 이상의 발현을 유도하고; 교정 주형이 CRISPR 효소 절단을 없애는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 단계; 선택될 세포(들)에서 교정 주형과 표적 폴리뉴클레오티드의 상동성 재조합을 가능하게 하는 단계; CRISPR 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합되게 하여, 상기 유전자 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 초래하는 단계로서, CRISPR 복합체는 (1) 표적 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열 및 (2) tracr 서열에 혼성화되는 tracr 메이트 서열과 복합체화되는 CRISPR 효소를 포함하고, 표적 폴리뉴클레오티드로의 CRISPR 복합체의 결합이 세포사를 유도하여, 하나 이상의 돌연변이가 도입된 하나 이상의 세포(들)가 선택되게 하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 II형 CRISPR 시스템 효소이다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 Cas9 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코커스 써모필러스 Cas9이며, 이들 유기체로부터 유래된 돌연변이된 Cas9를 포함할 수 있다. 효소는 Cas9 상동체 또는 오솔로그일 수 있다. 일부 구현예에서, 효소는 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, 효소는 표적 서열의 위치에서 1개 또는 2개 가닥의 절단을 유도한다. 바람직한 구현예에서, CRISPR 효소는 Cas9이다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 선택되는 세포는 진핵 세포일 수 있다. 본 발명의 양태는 선택 마커 또는 반대-선택 시스템을 포함할 수 있는 2-단계 과정을 필요로 하지 않고 특정 세포의 선택을 가능하게 한다.
본 발명의 양태는 내인성 게놈 내의 부위-특이적 유전자 녹아웃을 이해한다: 본 발명은 아연 핑거 및 TAL 이펙터에 기초한 부위-특이적 뉴클레아제 기술을 사용하는 것보다 유리한데, 그 이유는 그것이 정교한 설계를 필요로 하지 않고, 동일한 게놈 내의 다중의 유전자를 동시에 녹아웃시키는데 사용될 수 있기 때문이다. 추가의 양태에서, 본 발명은 부위-특이적 게놈 교정을 이해한다. 본 발명은 천연 또는 인공 부위-특이적 뉴클레아제 또는 재조합효소(recombinase)를 사용하는 것보다 유리한데, 그 이유는 그것이 부위-특이적 이중 가닥 파단을 도입하여, 표적화된 게놈 유전자좌에서 상동성 재조합을 가능하게 할 수 있기 때문이다. 다른 양태에서, 본 발명은 DNA 서열-특이적 간섭을 이해한다. 본 발명은 이들 유기체의 게놈 내의 특정 부위에 파단을 직접 도입함으로써 유해한 DNA-기반의 유기체, 예를 들어, 미생물, 바이러스 또는 심지어 암 세포의 게놈을 불활성화시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 CRISPR-Cas 시스템이 다중 서열-특이적 CRISPR 스페이서 요소 또는 가이드 서열의 사용을 통하여 게놈 내의 다중의 부위에 용이하게 표적화될 수 있기 때문에 본 발명은 다중화 게놈 조작을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
따라서, 본 발명의 목적은 발명 내에 해당 출원인이 권리를 보유하고 있는 임의의 선행기술에서 공지된 제품, 그 제품의 제조 절차 또는 그 제품의 사용 방법을 포함하지 않으며, 이로써 임의의 선행기술에서 공지된 제품, 절차 및 방법에 대해서는 권리포기를 개시한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 범위 내에 USPTO(35 U.S.C. § 112, 제1 단락) 또는 EPO(EPC의 제83조)의 기재된 사항 및 구현 요건을 충족하지 않는 임의의 제품, 절차 또는 그 제품의 제조 또는 그 제품의 사용 방법을 포함하지 않는 것을 의도로 하며, 이로써 해당 출원인이 권리를 유지하고 있는 임의의 선행기술에서 기재된 제품, 그 제품의 제조 방법 또는 그 제품의 사용 방법에 대한 권리 포기를 개시하는 것을 추가로 언급한다.
본 개시내용 및 특히 청구범위 및/또는 단락에서, "함유한다", "함유된", "함유하는" 등과 같은 용어가 미국 특허법에 귀속되는 의미를 가질 수 있고; 예를 들어, "포함한다", "포함된", "포함하는" 등을 의미할 수 있으며; "본질적으로 이루어지는" 및 "본질적으로 이루어진다"와 같은 용어가 미국 특허법에 귀속되는 의미를 갖고, 예를 들어, 명백하게 열거되지 않는 구성요소를 허용하지만, 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 또는 새로운 특징에 영향을 미치는 구성요소를 배제함이 주목된다. 상기 및 기타 구현예는 하기 상세한 설명으로부터 개시되거나, 그로부터 명백하고 그에 의해 포함된다.
본 발명의 신규의 특징은 특히 첨부된 청구범위에 개시되어 있다. 본 발명의 원리가 이용된 예시적인 구현예에 기재되어 있는 하기의 상세한 설명을 참조함으로써 본 발명의 특징 및 장점을 더욱 잘 이해할 것이며, 첨부된 도면은 다음과 같다:
도 1은 CRISPR 시스템의 개략적 모델을 보여준다. 스트렙토코커스 피오게네스 유래의 Cas9 뉴클레아제(황색)는 20-nt 가이드 서열(청색) 및 스캐폴드(적색)로 이루어진 합성 가이드 RNA(sgRNA)에 의해 게놈 DNA에 표적화된다. 가이드 서열은 필수 5'-NGG 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif, PAM; 진홍색)의 인접 상류의 DNA 표적(청색)과 염기쌍을 형성하며, Cas9는 PAM의 약 3 bp 상류(적색 삼각형)에서 이중 가닥 파단(DSB)을 매개한다.
도 2a 내지 도 2f는 예시적인 CRISPR 시스템, 가능한 작용 메카니즘, 진핵 세포에서의 발현을 위한 예시적인 적합화, 및 핵 국소화 및 CRISPR 활성을 평가하는 시험의 결과를 보여준다. 도 2c는 출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 23-24를 개시한다. 도 2e는 출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 25-27을 개시한다. 도 2f는 출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 28-32를 개시한다.
도 3a 내지 도 3d는 예시적인 표적에 대한 SpCas9 특이성의 평가의 결과를 보여준다. 도 3a는 출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 33, 26 및 34-44를 개시한다. 도 3c는 SEQ ID NO: 33을 개시한다.
도 4a 내지 도 4g는 예시적인 벡터 시스템 및 진핵 세포에서 상동성 재조합의 유도에서의 그의 사용에 대한 결과를 보여준다. 도 4e는 SEQ ID NO: 45를 개시한다. 도 4f는 출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 46-47을 개시한다. 도 4g는 출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 48-52를 개시한다.
도 5은 프로토스페이서 서열(출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 16, 15, 14, 53-58, 18, 17 및 59-63)의 표를 제공하며, 인간 및 마우스 게놈 내의 유전자좌(loci)에 대한 상응하는 PAM이 있는 예시적인 스트렙토코커스 피오게네스 및 스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR 시스템에 기초하여 설계된 프로토스페이서 표적에 대한 변형 효율 결과를 요약한 것이다. 세포를 Cas9 및 pre-crRNA/tracrRNA 또는 키메라 RNA 중 어느 하나로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션 후 72시간에 분석하였다. 삽입-결실(indel) 백분율은 표기된 세포주로부터의 서베이어(Surveyor) 검정 결과에 기초하여 계산된다(모든 프로토스페이서 표적에 대하여 N=3, 오차는 S.E.M.이고, N.D.는 서베이어 검정을 사용하여 검출가능하지 않음을 나타내며, N.T.는 이러한 연구에서 시험하지 않음을 나타낸다).
도 6a 내지 도 6c는 Cas9-매개의 유전자 표적화를 위한 상이한 tracrRNA 전사물의 비교를 보여준다. 도 6a는 출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 64-65를 개시한다.
도 7은 이중 가닥 파단-유도 마이크로-삽입 및 -결실의 검출을 위한 서베이어 뉴클레아제 검정의 개략도를 보여준다.
도 8A 및 도 8B는 진핵 세포에서 CRISPR 시스템 요소의 발현을 위한 예시적인 비시스트로닉(bicistronic) 발현 벡터를 보여준다. 도 8A는 출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 66-68을 개시한다. 도 8B는 출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 69-71을 개시한다.
도 9A 내지 도 9C는 인간 게놈에서 인접 스트렙토코커스 피오게네스 SF370 유전자좌 1 PAM(NGG)(도 9A) 간의 거리 및 스트렙토코커스 써모필러스 LMD9 유전자좌 2 PAM(NNAGAAW)(도 9B) 간의 거리; 및 염색체(Chr)에 의한 각 PAM에 대한 거리(도 9C)의 히스토그램을 보여준다.
도 10a 내지 도 10d는 예시적인 CRISPR 시스템, 진핵 세포에서의 발현을 위한 예시적인 적합화 및 CRISPR 활성을 평가하는 시험의 결과를 보여준다. 도 10b는 출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 72-73을 개시한다. 도 10c는 SEQ ID NO: 74를 개시한다.
도 11A 내지 도 11C는 포유동물 세포에서 게놈 유전자좌의 표적화를 위한 CRISPR 시스템의 예시적인 조작을 보여준다. 도 11A는 SEQ ID NO: 75를 개시한다. 도 11B는 출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 76-78을 개시한다.
도 12A 및 도 12B는 포유동물 세포에서 crRNA 가공의 노던 블롯(Northern blot) 분석의 결과를 보여준다. 도 12A는 SEQ ID NO: 79를 개시한다.
도 13A 및 도 13B는 인간 PVALB 및 마우스 Th 유전자좌에서 프로토스페이서의 예시적인 선택을 보여준다. 도 13A는 SEQ ID NO: 80을 개시한다. 도 13B는 SEQ ID NO: 81을 개시한다.
도 14는 인간 EMX1 유전자좌에서 스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR 시스템의 예시적인 프로토스페이서 및 상응하는 PAM 서열 표적을 보여준다. 도 14는 SEQ ID NO: 74를 개시한다.
도 15는 서베이어, RFLP, 게놈 시퀀싱 및 노던 블롯 검정을 위해 사용되는 프라이머 및 프로브에 대한 서열(출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 82-93)의 표를 제공한다.
도 16a 내지 도 16c는 키메라 RNA를 사용한 CRISPR 시스템의 예시적인 조작 및 진핵 세포에서 시스템 활성에 대한 서베이어 검정의 결과를 보여준다. 도 16A는 SEQ ID NO: 94를 개시한다.
도 17a 및 도 17b는 진핵 세포에서 CRISPR 시스템 활성에 대한 서베이어 검정의 결과의 그래프 표현을 보여준다.
도 18은 UCSC 게놈 브라우저(browser)를 사용한 인간 게놈 내의 일부 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 표적 부위의 예시적인 가시화를 보여준다. 도 18은 출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 95-173을 개시한다.
도 19a 내지 도 19d는 3개 그룹의 큰 Cas9(약 1400개 아미노산) 및 2개 그룹의 작은 Cas9(약 1100개 아미노산)를 포함하는 5개 과의 Cas9를 보여주는 계통 분석의 원형 표기를 보여준다.
도 20a 내지 도 20f는 3개 그룹의 큰 Cas9(약 1400개 아미노산) 및 2개 그룹의 작은 Cas9(약 1100개 아미노산)를 포함하는 5개 과의 Cas9를 보여주는 계통 분석의 선형 표기를 보여준다.
도 21a 내지 도 21d는 상동성 재조합을 통한 게놈 교정을 보여준다. (a) RuvC I 촉매 도메인 내에 D10A 돌연변이가 있는 SpCas9 닉카아제(nickase)의 개략도. (b) 수복 주형으로서 센스 또는 안티센스 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 사용하는 인간 EMX1 유전자좌에서의 상동성 재조합(HR)을 나타내는 개략도. 위의 적색 화살표는 sgRNA 절단 부위를 나타내며; 유전자형분석을 위한 PCR 프라이머(표 J 및 K)는 우측 패널에 화살표로 표시되어 있다. 도 21c는 출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 174-176, 174, 177 및 176을 개시한다. (c) HR에 의해 변형된 영역의 서열. d, 야생형(wt) 및 EMX1 표적 1 유전자좌에서의 닉카아제(D10A) SpCas9-매개의 삽입-결실에 대한 서베이어 검정(n=3). 화살표는 예상되는 단편 크기의 위치를 나타낸다.
도 22a 및 도 22b는 SpCas9에 대한 단일 벡터 설계를 보여준다. 도 22a는 출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 178-180을 개시한다. 도 22B는 SEQ ID NO: 181을 개시한다.
본원에서 도면은 오직 예시의 목적을 위한 것이며, 반드시 척도에 따라 도시된 것은 아니다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환가능하게 사용된다. 그것들은 임의의 길이의 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중 어느 하나, 또는 그의 유사체의 중합체 형태를 말한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 기지의 또는 미지의 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연관 분석으로부터 정의된 유전자좌들(유전자좌), 엑손, 인트론, 전령 RNA(mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어, 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형이 존재한다면, 중합체의 조립 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 성분에 의해 단속될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합화 후에, 예를 들어, 표지화 성분과의 컨쥬게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다.
본 발명의 양태에서, 용어 "키메라 RNA", "키메라 가이드 RNA", "가이드 RNA", "단일의 가이드 RNA" 및 "합성 가이드 RNA"는 상호교환가능하게 사용되며, 가이드 서열, tracr 서열 및 tracr 메이트 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "가이드 서열"은 표적 부위를 지정하는 가이드 RNA 내의 약 20bp 서열을 지칭하며, 용어 "가이드" 또는 "스페이서"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 또한, 용어 "tracr 메이트 서열"은 용어 "직접 반복부(들)"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 예시적인 CRISPR-Cas 시스템은 도 1에 예시되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형"은 당업자에 의해 이해되는 해당 분야의 용어이며, 그것이 돌연변이체 또는 변이체로부터 구별되는 정도로 천연에서 발생하는 것과 같은 전형적인 형태의 유기체, 균주, 유전자 또는 특징을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 천연에서 발생하는 것에서 벗어난 패턴을 갖는 특성의 표현을 의미하는 것으로 이해해야 한다.
용어 "비-천연 발생" 또는 "조작된"은 상호교환가능하게 사용되며, 인간의 손의 개입을 나타낸다. 상기 용어는 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 대하여 언급되는 경우, 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 천연에서 천연적으로 관련되어 있고, 천연에서 관찰되는 적어도 하나의 다른 성분이 적어도 실질적으로 없음을 의미한다.
"상보성"은 통상의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 기타 비-통상적 유형에 의해 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 지칭한다. 상보성 백분율은 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기 쌍형성)을 형성할 수 있는 핵산 분자 내의 잔기의 백분율을 나타낸다(예를 들어, 10개 중 5, 6, 7, 8, 9, 10개는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 상보성임). "완전한 상보성"은 핵산 서열의 모든 연속 잔기가 동일한 수의 제2 핵산 서열 내의 연속 잔기와 수소 결합할 것임을 의미한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "실질적인 상보성"은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 상보성 정도를 지칭하거나, 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 2개의 핵산을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 혼성화를 위한 "엄격한 조건"은 표적 서열에 대하여 상보성을 갖는 핵산 서열이 대개 표적 서열과 혼성화하며, 비-표적 서열에는 실질적으로 혼성화하지 않는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 일반적으로 서열-의존적이며, 다수의 요인에 따라 달라진다. 일반적으로, 서열이 길수록, 서열이 그의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 온도가 더 높아진다. 엄격한 조건의 비제한적인 예는 문헌[Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y.]에 상세히 기재되어 있다.
"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여, 복합체를 형성하고, 이 복합체는 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨 크릭 염기 쌍형성, 후그스타인(Hoogstein) 결합 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 발생할 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일의 자가 혼성화 가닥 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 PCR의 개시 또는 효소에 의한 폴리뉴클레오티드의 절단과 같은 보다 광범위한 과정에서 하나의 단계를 이룰 수 있다. 주어진 서열과 혼성화할 수 있는 서열은 주어진 서열의 "상보물"로 지칭된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 (예를 들어, mRNA 또는 기타 RNA 전사물로) 전사되는 과정 및/또는 이후에 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사물 및 인코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 산물"로 지칭될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된다면, 발현은 진핵 세포에서의 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 그것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그것은 비-아미노산에 의해 단속될 수 있다. 또한, 상기 용어는 변형된 아미노산 중합체, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화(lipidation), 아세틸화, 인산화 또는 임의의 기타 조작, 예를 들어, 표지화 성분과의 컨쥬게이션을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 및 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱을 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 포함한다.
용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 포유동물은 쥣과, 원숭이, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 애완동물을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 생체내에서 수득되거나 시험관내에서 배양된 생물학적 엔티티(entity)의 조직, 세포 및 그들의 자손도 또한 포함된다.
용어 "치료제", "치료가능한 작용제" 또는 "치료 작용제"는 상호교환가능하게 사용되며, 대상체로의 투여 시에 몇몇 유리한 효과를 부여하는 분자 또는 화합물을 지칭한다. 유리한 효과는 진단적 결정을 가능하게 하는 것; 질병, 증상, 장애 또는 병태의 개선; 질병, 증상, 장애 또는 질환의 발병의 감소 또는 예방; 및 일반적으로 질병, 증상, 장애 또는 병태의 대응을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는" 또는 "완화하는" 또는 "개선하는"은 상호교환가능하게 사용된다. 이들 용어는 치료 이익 및/또는 예방 이익을 포함하나 이들에 한정되지 않는 유리한 또는 요망되는 결과를 수득하는 방법을 지칭한다. 치료 이익은 치료 하의 하나 이상의 질병, 질환 또는 증상의 임의의 치료적으로 유의미한 개선 또는 그에 대한 효과를 의미한다. 예방 이익에 있어서, 조성물은 특정 질병, 질환 또는 증상이 발생할 위험이 있는 대상체에게 또는 질병, 질환 또는 증상이 아직 나타나지 않을지라도, 질병의 하나 이상의 생리학적 증상을 보고하는 대상체에게 투여될 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 유리한 또는 요망되는 결과를 야기하기에 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 치료되는 대상체 및 병태, 대상체의 체중 및 연령, 병태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 상기 용어는 본원에 기술된 영상화 방법 중 임의의 것에 의한 검출을 위한 이미지를 제공할 용량에 적용된다. 특정 용량은 선택된 특정 작용제, 뒤따르는 투여 요법, 그것이 다른 화합물과 병용하여 투여되는지 여부, 투여 시기, 영상화되는 조직 및 그것을 운반하는 신체 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 유전체학 및 재조합 DNA의 통상의 기술을 사용한다. 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989)]; 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987))]; 시리즈 문헌[METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987))]을 참조한다.
본 발명의 몇몇 양태는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템 또는 그와 같은 벡터에 관한 것이다. 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서 CRISPR 전사물(예를 들어, 핵산 전사물, 단백질 또는 효소)의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 전사물은 박테리아 세포, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 곤충 세포(배큘로바이러스 발현 벡터 사용), 효모 세포 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 적절한 숙주 세포는 문헌[Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 추가로 논의되어 있다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 예를 들어, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 사용하여 시험관내에서 전사되고 번역될 수 있다.
벡터는 원핵생물에 도입되고, 그에서 증식될 수 있다. 일부 구현예에서, 원핵생물은 진핵 세포로 도입되거나 또는 진핵 세포로 도입되는 벡터의 생성에서 중간체 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 패키징 시스템의 일부로서 플라스미드 증폭)로서 벡터의 카피를 증폭시키기 위해서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 원핵생물은 벡터의 카피를 증폭시키고, 하나 이상의 핵산을 발현하기 위해, 예를 들어, 숙주 세포 또는 숙주 유기체로의 전달을 위한 하나 이상의 단백질의 공급원을 제공하기 위해 사용된다. 원핵생물에서의 단백질의 발현은 자주 융합 또는 비-융합 단백질 중 어느 하나의 발현을 유도하는 구성성 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 에스케리키아 콜라이에서 수행된다. 융합 벡터는 거기에 인코딩된 단백질로, 예를 들어, 재조합 단백질의 아미노 말단으로 수많은 아미노산을 부가한다. 이러한 융합 벡터는 다음과 같은 하나 이상의 목적을 제공할 수 있다: (i) 재조합 단백질의 발현의 증가; (ii) 재조합 단백질의 용해도의 증가; 및 (iii) 친화성 정제에서 리간드로 작용함으로써 재조합 단백질의 정제의 보조. 종종, 융합 발현 벡터에서, 단백질분해 절단 부위는 융합 모이어티와 재조합 단백질의 연접부에 도입되어, 융합 단백질의 정제 이후에 융합 모이어티로부터 재조합 단백질의 분리를 가능하게 한다. 이러한 효소 및 그들의 동족 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나아제를 포함한다. 예시적인 융합 발현 벡터는 pGEX(파마시아 바이오테크 인코포레이티드(Pharmacia Biotech Inc); 문헌[Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40]), pMAL(미국 매사추세츠주 비벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 및 pRIT5(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 파마시아(Pharmacia))를 포함하며, 이는 각각 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 E 결합 단백질 또는 단백질 A를 표적 재조합 단백질에 융합시킨다.
적절한 유도성 비-융합 에스케리키아 콜라이 발현 벡터의 예는 pTrc(문헌[Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315]) 및 pET 11d(문헌[Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89])를 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 사카로마이세스 세레비지애에서의 발현을 위한 벡터의 예에는 pYepSec1(문헌[Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234]), pMFa(문헌[Kuijan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943]), pJRY88(문헌[Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123]), pYES2(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 인비트로겐 코포레이션) 및 picZ(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 인비트로겐 코포레이션)가 포함된다.
일부 구현예에서, 벡터는 배큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 단백질 발현을 유도한다. 배양된 곤충 세포(예를 들어, SF9 세포)에서 단백질의 발현에 이용가능한 배큘로바이러스 벡터는 pAc 시리즈(문헌[Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165]) 및 pVL 시리즈(문헌[Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39])를 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에서 하나 이상의 서열의 발현을 유도할 수 있다. 포유동물 발현 벡터의 예는 pCDM8(문헌[Seed, 1987. Nature 329: 840]) 및 pMT2PC(문헌[Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195])를 포함한다. 포유동물 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 조절 기능은 전형적으로 하나 이상의 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스, 유인원 바이러스 40 및 본원에 개시되고 당업계에 공지되어 있는 기타의 것으로부터 유래된다. 원핵 및 진핵 세포 둘 모두를 위한 다른 적절한 발현 시스템에 대하여, 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]의 16 및 17장을 참조한다.
일부 구현예에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 특정 세포 유형에서 우선적으로 핵산의 발현을 유도할 수 있다(예를 들어, 핵산을 발현하기 위하여 조직-특이적 조절 요소가 사용됨). 조직-특이적 조절 요소가 해당 분야에 공지되어 있다. 적절한 조직-특이적 프로모터의 비제한적인 예에는 알부민 프로모터(간-특이적; 문헌[Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277]), 림프-특이적 프로모터(문헌[Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275]), 특히, T 세포 수용체(문헌[Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733]) 및 면역글로불린의 프로모터(문헌[Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740]; 문헌[Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748]), 뉴런-특이적 프로모터(예를 들어, 신경섬유 프로모터; 문헌[Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477]), 췌장-특이적 프로모터(문헌[Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916]) 및 유선-특이적 프로모터(예를 들어, 유장(milk whey) 프로모터; 미국 특허 제4,873,316호 및 유럽 출원 공개 제264,166호)가 포함된다. 발생-조절 프로모터, 예를 들어, 쥣과 hox 프로모터(문헌[Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379]) 및 α-태아단백질 프로모터(문헌[Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546])도 또한 포함된다.
일부 구현예에서, 조절 요소는 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소에 작동가능하게 연결되어 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 유도한다. 일반적으로, SPIDR(스페이서 산재 직접 반복부)로도 공지되어 있는 CRISPR(클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부)은 통상 특정 박테리아 종에 특이적인 DNA 유전자좌의 과를 구성한다. CRISPR 유전자좌는 에스케리키아 콜라이에서 인식되는 별개의 부류의 산재된 짧은 서열 반복부(SSR) 및 관련 유전자를 포함한다(문헌[Ishino et al., J. Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]]; 및 문헌[Nakata et al., J. Bacteriol., 171:3553-3556 [1989]]). 유사한 산재된 SSR이 할로페락스 메디테라네이(Haloferax mediterranei), 스트렙토코커스 피오게네스, 아나바에나(Anabaena) 및 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)에서 확인되었다(문헌[Groenen et al., Mol. Microbiol., 10:1057-1065 [1993]]; 문헌[Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254-263 [1999]]; 문헌[Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]]; 및 문헌[Mojica et al., Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995]] 참조). CRISPR 유전자좌는 전형적으로 SRSR(규칙적으로 산재된 짧은 반복부(short regularly spaced repeats))로 명명된 반복부의 구조가 다른 SSR과 상이하다(문헌[Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:23-33 [2002]]; 및 문헌[Mojica et al., Mol. Microbiol., 36:244-246 [2000]]). 일반적으로, 반복부는 실질적으로 고정된 길이를 갖는 독특한 개재 서열에 의해 규칙적으로 산재된 클러스터에 존재하는 짧은 요소이다(상기 문헌[Mojica et al., [2000]]). 반복 서열이 균주들 간에 고도로 보존되어 있지만, 산재된 반복부의 수와 스페이서 영역의 서열은 전형적으로 균주마다 상이하다(문헌[van Embden et al., J. Bacteriol., 182:2393-2401 [2000]]). CRISPR 유전자좌는 아에로피룸(Aeropyrum), 피로바쿨룸(Pyrobaculum), 술폴로부스(Sulfolobus), 아캐오글로부스(Archaeoglobus), 할로카르쿨라(Halocarcula), 메타노박테리움(Methanobacterium), 메타노코커스(Methanococcus), 메타노사르시나(Methanosarcina), 메타노피러스(Methanopyrus), 피로코커스(Pyrococcus), 피크로필러스(Picrophilus), 써모플라스마(Thermoplasma), 코리네박테리움(Corynebacterium), 마이코박테리움(Mycobacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 아퀴펙스(Aquifex), 포르피로모나스(Porphyromonas), 클로로비움(Chlorobium), 써머스(Thermus), 바실러스(Bacillus), 리스테리아(Listeria), 스타필로코커스(Staphylococcus), 클로스트리디움(Clostridium), 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter), 마이코플라스마(Mycoplasma), 푸소박테리움(Fusobacterium), 아자쿠스(Azarcus), 크로모박테리움(Chromobacterium), 네이세리아(Neisseria), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 데설포비브리오(Desulfovibrio), 게오박터(Geobacter), 믹소코커스(Myxococcus), 캄필로박터(Campylobacter), 볼리넬라(Wolinella), 아시네토박터(Acinetobacter), 에르위니아(Erwinia), 에스케리키아, 레지오넬라(Legionella), 메틸로코커스(Methylococcus), 파스퇴렐라(Pasteurella), 포토박테리움(Photobacterium), 살모넬라(Salmonella), 잔토모나스(Xanthomonas), 예르시니아(Yersinia), 트레포네마(Treponema) 및 써모토가(Thermotoga)를 포함하나 이들에 한정되지 않는 40개 초과의 원핵생물에서 확인되었다(예를 들어, 문헌[Jansen et al., Mol. Microbiol., 43:1565-1575 [2002]]; 및 문헌[Mojica et al., [2005]] 참조).
일반적으로, "CRISPR 시스템"은 집합적으로 Cas 유전자를 인코딩하는 서열, tracr(트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복부" 및 tracrRNA-가공 부분 직접 반복부 포함), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로도 지칭) 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 기타 서열 및 전사물을 포함하는 CRISPR-관련("Cas") 유전자의 발현에 수반되거나, 그의 활성을 유도하는 전사물 및 다른 요소를 지칭한다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 I형, II형 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유래된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 증진시키는 요소(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 프로토스페이서로도 지칭)를 특징으로 한다. CRISPR 복합체의 형성의 맥락에서, "표적 서열"은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 간의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 증진시킨다. 본질적으로 완전한 상보성이 필요하지 않지만, 혼성화를 야기하고, CRISPR 복합체의 형성을 증진시키는 충분한 상보성이 존재한다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 진핵 세포의 세포기관, 예를 들어, 미토콘드리아 또는 엽록체 내에 존재할 수 있다. 표적 서열을 포함하는 표적화된 유전자좌로의 재조합을 위해 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "교정 주형" 또는 "교정 폴리뉴클레오티드" 또는 "교정 서열"로 지칭된다. 본 발명의 양태에서, 외인성 주형 폴리뉴클레오티드는 교정 주형으로 지칭될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 재조합은 상동성 재조합이다.
전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서, CRISPR 복합체(표적 서열에 혼성화되고, 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화되는 가이드 서열을 포함)의 형성은 표적 서열 내의 또는 그 근처의(예를 들어, 그로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 이상의 염기쌍 내의) 하나의 또는 둘 모두의 가닥의 절단을 야기한다. 이론에 구속되지 않으면서, 야생형 tracr 서열의 전부 또는 그의 일부(예를 들어, 야생형 tracr 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 이상의 뉴클레오티드)를 포함하거나 그로 이루어질 수 있는 tracr 서열은 또한, 가이드 서열에 작동가능하게 연결된 tracr 메이트 서열의 전부 또는 일부로의 tracr 서열의 적어도 일부분에 따른 혼성화에 의해서와 같이 CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, tracr 서열은 혼성화하고, CRISPR 복합체의 형성에 참여하기에 충분한, tracr 메이트 서열에 대한 상보성을 갖는다. 표적 서열과 마찬가지로, 완전한 상보성이 필요하지 않지만, 작용성이기에 충분한 상보성이 존재하는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, tracr 서열은 최적으로 정렬되는 경우 tracr 메이트 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 갖는다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 유도하는 하나 이상의 벡터는 CRISPR 시스템의 요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 유도하도록 숙주 세포 내로 도입된다. 예를 들어, Cas 효소, tracr-메이트 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 개별 벡터 상의 개별 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 발현되는 요소 중 둘 이상은 단일의 벡터에서 조합될 수 있으며, 하나 이상의 추가의 벡터는 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 성분을 제공한다. 단일의 벡터에서 조합되는 CRISPR 시스템 요소는 임의의 적절한 배향으로 배열될 수 있으며, 예를 들어, 하나의 요소는 제2 요소에 대하여 5'에(그의 "상류"에) 위치하거나 그에 대하여 3'에(그의 "하류"에) 위치한다. 하나의 요소의 코딩 서열은 제2 요소의 코딩 서열의 동일한 가닥 또는 반대 가닥에 위치할 수 있으며, 동일하거나 반대 방향으로 배향될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일의 프로모터는 CRISPR 효소를 인코딩하는 전사물 및 하나 이상의 인트론 서열 내에(예를 들어, 각각이 상이한 인트론 내에, 2개 이상이 적어도 하나의 인트론 내에 또는 전부가 단일의 인트론 내에) 매립된 가이드 서열, tracr 메이트 서열(선택적으로 가이드 서열에 작동가능하게 연결), 및 tracr 서열 중 하나 이상의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소, 가이드 서열, tracr 메이트 서열 및 tracr 서열이 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 그로부터 발현된다. SpCas9에 대한 단일 벡터 작제물은 도 22에 예시되어 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 삽입 부위, 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열("클로닝 부위"로도 지칭)을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 삽입 부위(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 삽입 부위)는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 상류 및/또는 하류에 위치한다. 일부 구현예에서, 벡터는 tracr 메이트 서열의 상류에 있고, 선택적으로 tracr 메이트 서열에 작동가능하게 연결된 조절 요소의 하류에 있는 삽입 부위를 포함하여, 삽입 부위로의 가이드 서열의 삽입 후에, 그리고 발현 시에, 가이드 서열이 진핵 세포 내의 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하게 한다. 일부 구현예에서, 벡터는 2개 이상의 삽입 부위를 포함하며, 각각의 삽입 부위는 2개의 tracr 메이트 서열 사이에 위치하여, 각 부위에서 가이드 서열의 삽입을 가능하게 한다. 이러한 배열에서, 2개 이상의 가이드 서열은 단일의 가이드 서열의 2개 이상의 카피, 2개 이상의 상이한 가이드 서열 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다중의 상이한 가이드 서열이 사용되는 경우, 단일의 발현 작제물을 사용하여 세포 내의 다중의 상이한 상응하는 표적 서열에 CRISPR 활성을 표적화할 수 있다. 예를 들어, 단일의 벡터는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개 이상의 가이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 이러한 가이드-서열-함유 벡터가 제공될 수 있으며, 선택적으로 세포로 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 CRISPR 효소, 예를 들어, Cas 단백질을 인코딩하는 효소-코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 요소를 포함한다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 및 Csx12로도 알려짐), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 그의 상동체 또는 그의 변형된 버전을 포함한다. 이들 효소가 알려져 있으며; 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 서열은 수탁 번호 Q99ZW2 하에 스위스프로트(SwissProt) 데이터베이스에서 관찰될 수 있다. 일부 구현예에서, 비변형 CRISPR 효소, 예를 들어, Cas9는 DNA 절단 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 Cas9이며, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코커스 뉴모니애로부터의 Cas9일 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 상보물 내에서와 같은 표적 서열의 위치에서 1개 또는 2개의 가닥의 절단을 유도한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 처음 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500개 이상의 염기쌍에서 1개 또는 2개의 가닥의 절단을 유도한다. 일부 구현예에서, 벡터는 상응하는 야생형 효소에 대하여 돌연변이되어, 돌연변이된 CRISPR 효소에 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 1개 또는 2개 모두의 가닥의 절단 능력이 결여되게 한 CRISPR 효소를 인코딩한다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인 내에서의 아스파르트산에서 알라닌으로의 치환(D10A)은 Cas9를 둘 모두의 가닥을 절단하는 뉴클레아제에서 닉카아제(단일 가닥 절단)로 전환시킨다. Cas9가 닉카아제가 되게 하는 돌연변이의 다른 예는 제한 없이, H840A, N854A 및 N863A를 포함한다. 본 발명의 양태에서, 닉카아제는 상동성 재조합을 통한 게놈 교정을 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어, 도 21은 상동성 재조합을 통한 게놈 교정을 보여준다. 도 21(a)는 RuvC I 촉매 도메인 내에 D10A 돌연변이가 있는 SpCas9 닉카아제의 개략도를 보여준다. (b)는 수복 주형으로서 센스 또는 안티센스 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 사용하는 인간 EMX1 유전자좌에서의 상동성 재조합(HR)을 나타낸 개략도이다. (c)는 HR에 의해 변형된 영역의 서열이다. d는 야생형(wt) 및 EMX1 표적 1 유전자좌에서의 닉카아제(D10A) SpCas9-매개의 삽입-결실에 대한 서베이어 검정(n=3)이다. 화살표는 예상되는 단편 크기의 위치를 나타낸다.
일부 구현예에서, Cas9 닉카아제는 가이드 서열(들), 예를 들어, 각각 DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 표적화하는 2개의 가이드 서열과 병용하여 사용될 수 있다. 이러한 조합은 둘 모두의 가닥에 닉(nick)이 생기게 하고, NHEJ를 유도하는데 사용되게 한다. 본 발명자들은 돌연변이유발 NHEJ의 유도에서 2개의 닉카아제 표적(즉, DNA의 동일한 위치에, 그러나, 상이한 가닥에 표적화된 sgRNA)의 효능을 입증하였다(데이터 미도시). 단일의 닉카아제(단일의 sgRNA가 있는 Cas9-D10A)는 NHEJ를 유도하고, 삽입-결실을 생성할 수 없지만, 본 발명자들은 이중 닉카아제(Cas9-D10A 및 동일한 위치에서 상이한 가닥에 표적화된 2개의 sgRNA)가 인간 배아 줄기 세포(hESC)에서 그럴 수 있음을 보였다. 효율은 hESC에서 뉴클레아제(즉, D10 돌연변이가 없는 보통의 Cas9)의 약 50%이다.
추가의 예로서, Cas9의 2개 이상의 촉매 도메인(RuvC I, RuvC II 및 RuvC III)을 돌연변이시켜, 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 돌연변이된 Cas9를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, D10A 돌연변이를 H840A, N854A 또는 N863A 돌연변이 중 하나 이상과 조합하여, 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 Cas9 효소를 생성한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 돌연변이된 효소의 DNA 절단 활성이 비-돌연변이 형태에 대하여 약 25%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% 이하인 경우 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 것으로 여겨진다. 다른 돌연변이가 유용할 수 있으며; 여기서, Cas9 또는 다른 CRISPR 효소는 스트렙토코커스 피오게네스 이외의 종으로부터의 것이며, 유사한 효과를 달성하기 위하여 상응하는 아미노산의 돌연변이가 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR 효소를 인코딩하는 효소 코딩 서열은 특정 세포, 예를 들어, 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 진핵 세포는 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 개 또는 비인간 영장류를 포함하나 이들에 한정되지 않는 특정 유기체, 예를 들어, 포유동물의 것이거나 그로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 고유 서열의 적어도 하나의 코돈(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상의 코돈)을 숙주 세포의 유전자에 더욱 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하면서, 고유 아미노산 서열을 유지함으로써 대상 숙주 세포에서의 발현의 증진을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대한 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향(유기체 간의 코돈 사용의 차이)은 종종 전령 RNA(mRNA)의 번역의 효율과 상호관련되며, 이는 차례로, 다른 것들 중에, 번역되는 코돈의 특성 및 특정 운반 RNA(tRNA) 분자의 이용가능성에 좌우되는 것으로 여겨진다. 세포에서의 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영하는 것이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서의 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다. 코돈 사용 표는 예를 들어, "코돈 사용 데이터베이스"에서 용이하게 이용가능하며, 이들 표는 다수의 방식으로 적합하게 될 수 있다. 문헌[Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)]을 참조한다. 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 특정 서열을 코돈 최적화시키는 컴퓨터 알고리즘도 또한 이용가능하며, 예를 들어, 진 포르지(Gene Forge)(압타젠(Aptagen); 미국 펜실베니아주 야코부스)도 또한 이용가능하다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소를 인코딩하는 효소 내의 하나 이상의 코돈(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대하여 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 상응한다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고, 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하기에 충분한, 표적 폴리뉴클레오티드 서열과의 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열과 그의 상응하는 표적 서열 간의 상보성의 정도는 적절한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되는 경우, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기에 적절한 임의의 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있으며, 그의 비제한적인 예는 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러 트랜스폼(Burrows-Wheeler Transform)에 기초한 알고리즘(예를 들어, 버로우즈 휠러 얼라이너(Burrows Wheeler Aligner)), ClustalW, Clustal X, BLAT, 노보얼라인(Novoalign)(노보크라프트 테크놀로지즈(Novocraft Technologies), ELAND(일루미나(Illumina), 미국 캘리포니아주 샌 디에고), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용가능) 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 이용가능)를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적절한 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험되는 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체를 형성하기에 충분한 CRISPR 시스템의 성분은 예를 들어, CRISPR 서열의 성분을 인코딩하는 벡터로의 트랜스펙션 후에, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 서베이어 검정에 의한 표적 서열 내의 우선적인 절단의 평가에 의해서와 같이, 상응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포로 제공될 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 표적 서열, 시험되는 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체의 성분을 제공하고, 표적 서열에서 시험 및 대조군 가이드 서열 반응 간의 결합 또는 절단 비율을 비교함으로써 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 검정이 가능하며, 당업자에게 떠오를 것이다.
가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내의 서열이다. 예시적인 표적 서열은 표적 게놈에서 독특한 것들을 포함한다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9에 대하여, 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNNXGG(N은 A, G, T 또는 C이며; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG의 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNXGG(N은 A, G, T 또는 C이며; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR1 Cas9에 대하여, 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW(SEQ ID NO: 1)의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNNXXAGAAW(SEQ ID NO: 2)(N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있으며; W는 A 또는 T임)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW(SEQ ID NO: 3)의 스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR1 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNXXAGAAW(SEQ ID NO: 4) (N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있으며; W는 A 또는 T임)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9에 대하여, 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNNXGGXG(N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG의 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNXGGXG(N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 이들 서열 각각에서, "M"은 A, G, T 또는 C일 수 있으며, 서열을 독특한 것으로 확인하는데 고려될 필요는 없다.
일부 구현예에서, 가이드 서열은 가이드 서열 내의 2차 구조의 정도를 감소시키기 위해 선택된다. 2차 구조는 임의의 적절한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 일부 프로그램은 최소 깁스(Gibbs) 자유 에너지의 계산에 기초한다. 이러한 알고리즘의 일 예는 문헌[Zuker and Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148)]에 기술된 바와 같은 mFold이다. 다른 예시적인 폴딩 알고리즘은 센트로이드 구조 예측 알고리즘(예를 들어, 문헌[A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24]; 및 문헌[PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62] 참조)을 사용하는 비엔나 대학의 이론 화학 기관에서 개발된 온라인 웹서버 RNAfold이다. 추가의 알고리즘은 본원에 참조로 포함되는 미국 출원 번호 61/836,080(대리인 사건 번호 44790.11.2022; 브로드 참조번호 BI-2013/004A)에서 찾을 수 있다.
일반적으로, tracr 메이트 서열은 다음 중 하나 이상을 증진시키기에 충분한, tracr 서열과의 상보성을 갖는 임의의 서열을 포함한다: (1) 상응하는 tracr 서열을 함유하는 세포에서 tracr 메이트 서열이 측부 배치된 가이드 서열의 절제; 및 (2) 표적 서열에서의 CRISPR 복합체의 형성으로서, CRISPR 복합체가 tracr 서열에 혼성화되는 tracr 메이트 서열을 포함하는 표적 서열에서의 CRISPR 복합체의 형성. 일반적으로, 상보성의 정도는 2개의 서열 중 더 짧은 서열의 길이에 따른 tracr 메이트 서열과 tracr 서열의 최적의 정렬을 참조한다. 최적의 정렬은 임의의 적절한 정렬 알고리즘에 의해 결정될 수 있으며, tracr 서열 또는 tracr 메이트 서열 중 어느 하나에서의 자가-상보성과 같이 2차 구조를 추가로 설명할 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 중 보다 짧은 것의 길이를 따른 tracr 서열과 tracr 메이트 서열 간의 상보성의 정도는 최적으로 정렬되는 경우, 약 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. tracr 서열과 tracr 메이트 서열 간의 최적의 정렬의 예시는 도 10b 및 도 11B에 제공되어 있다. 일부 구현예에서, tracr 서열은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, tracr 서열 및 tracr 메이트 서열은 2개 간의 혼성화가 헤어핀과 같은 2차 구조를 갖는 전사물을 생성하도록 단일의 전사물 내에 함유된다. 헤어핀 구조에 사용하기에 바람직한 루프 형성 서열은 4개 뉴클레오티드 길이이며, 바람직하게는 서열 GAAA를 갖는다. 그러나, 대안적인 서열과 같이 더 길거나 더 짧은 루프 서열이 사용될 수 있다. 서열은 바람직하게는 뉴클레오티드 트리플렛(예를 들어, AAA) 및 추가의 뉴클레오티드(예를 들어, C 또는 G)를 포함한다. 루프 형성 서열의 예는 CAAA 및 AAAG를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 전사물 또는 전사된 폴리뉴클레오티드 서열은 적어도 2개 이상의 헤어핀을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 전사물은 2, 3, 4 또는 5개의 헤어핀을 갖는다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 전사물은 최대 5개의 헤어핀을 갖는다. 일부 구현예에서, 단일의 전사물은 전사 종결 서열을 더 포함하며; 바람직하게는 이것은 폴리T 서열, 예를 들어, 6개의 T 뉴클레오티드이다. 이러한 헤어핀 구조의 예는 도 11B의 하부에 제공되며, 여기서, 루프의 상류 및 마지막 "N"의 5' 서열의 부분은 tracr 메이트 서열에 상응하며, 루프의 3' 서열의 부분은 tracr 서열에 상응한다. 가이드 서열, tracr 메이트 서열 및 tracr 서열을 포함하는 단일의 폴리뉴클레오티드의 추가의 비제한적인 예는 하기와 같으며(5'에서 3'으로 표기), 여기서, "N"은 가이드 서열의 염기를 나타내고, 소문자의 제1 블록은 tracr 메이트 서열을 나타내며, 소문자의 제2 블록은 tracr 서열을 나타내고, 마지막 폴리-T 서열은 전사 종결자를 나타낸다:
Figure pct00001
Figure pct00002
일부 구현예에서, 서열 (1) 내지 (3)은 스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR1 유래의 Cas9와 함께 사용된다. 일부 구현예에서, 서열 (4) 내지 (6)은 스트렙토코커스 피오게네스 유래의 Cas9와 함께 사용된다. 일부 구현예에서, tracr 서열은 tracr 메이트 서열을 포함하는 전사물과 별개의 전사물이다(예를 들어, 도 11B의 상부에 예시).
일부 구현예에서, CRISPR 효소는 하나 이상의 이종 단백질 도메인(예를 들어, CRISPR 효소에 더하여 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 도메인)을 포함하는 융합 단백질의 부분이다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가의 단백질 서열 및 선택적으로 임의의 2개 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는 비제한적으로 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열 및 하기의 활성 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함한다: 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. CRISPR 효소는 DNA 분자에 결합하거나, 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인(DBD) 융합체, GAL4 DNA 결합 도메인 융합체 및 단순 포진 바이러스(HSV) BP16 단백질 융합체를 포함하나 이들에 한정되지 않는 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 인코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 부분을 형성할 수 있는 추가의 도메인은 본원에 참조로 포함되는 US20110059502호에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 태그가 부착된 CRISPR 효소를 사용하여 표적 서열의 위치를 확인한다.
본 발명의 일 양태에서, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 호스라디시 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함하나 이들에 제한되지 않는 리포터 유전자는 유전자 산물을 인코딩하는 세포로 도입될 수 있으며, 이는 유전자 산물의 발현의 변경 또는 변형을 측정하기 위한 마커로 소용된다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자는 벡터를 통해 세포로 도입될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 유전자 산물은 루시퍼라제이다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 유전자 산물의 발현이 감소된다.
일부 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 또는 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 벡터, 그의 하나 이상의 전사물 및/또는 그로부터 전사된 하나의 단백질 또는 단백질들을 숙주 세포로 전달하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 DNA-기반의 게놈의 표적화된 변형을 가능하게 하기 위한 기본 플랫폼으로서 제공된다. 그것은 바이러스, 리포솜, 전기천공법, 미세주입 및 컨쥬게이션을 포함하나 이들에 한정되지 않는 많은 전달 시스템과 결부될 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명은 이러한 방법에 의해 생성된 세포, 및 이러한 세포를 포함하거나 이로부터 생성된 유기체(예를 들어, 동물, 식물 또는 진균)를 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열과 조합된(선택적으로 복합체화된) CRISPR 효소는 세포로 전달된다. 통상의 바이러스 및 비-바이러스 기반의 유전자 운반 방법을 사용하여 핵산을 포유동물 세포 또는 표적 조직에 도입할 수 있다. 이러한 방법을 사용하여 CRISPR 시스템의 성분을 인코딩하는 핵산을 배양물 중의 또는 숙주 유기체 내의 세포로 투여할 수 있다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, RNA(예를 들어, 본원에 기술된 벡터의 전사물), 네이키드(naked) 핵산 및 전달 비히클, 예를 들어, 리포솜과 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이는 세포로의 전달 후에 에피솜 또는 통합된 게놈을 갖는다. 유전자 치료법 절차의 개요에 대해서는 문헌[Anderson, Science 256:808-813 (1992)]; 문헌[Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993)]; 문헌[Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993)]; 문헌[Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993)]; 문헌[Miller, Nature 357:455-460 (1992)]; 문헌[Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988)]; 문헌[Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995)]; 문헌[Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995)]; 문헌[Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Boehm (eds) (1995)]; 및 문헌[Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)]을 참조한다.
핵산의 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션(lipofection), 뉴클레오펙션(nucleofection), 미세주입, 비올리스틱스(biolistics), 비로좀(virosome), 리포솜, 면역리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 컨쥬게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온 및 작용제-증진된 DNA의 흡수를 포함한다. 리포펙션은 예를 들어, 미국 특허 제5,049,386호, 제4,946,787호; 및 제4,897,355호에 기술되어 있으며, 리포펙션 시약은 상업적으로 시판된다(예를 들어, 트랜스펙탐(Transfectam)™ 및 리포펙틴(Lipofectin)™). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적절한 양이온 및 중성 지질은 펠그너(Felgner)의 WO 91/17424호; WO 91/16024호의 것들을 포함한다. 전달은 세포로(예를 들어, 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직으로(예를 들어, 생체내 투여) 이루어질 수 있다.
표적화된 리포솜, 예를 들어, 면역지질 복합체를 포함하는 지질:핵산 복합체의 제제는 당업자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Crystal, Science 270:404-410 (1995)]; 문헌[Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995)]; 문헌[Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994)]; 문헌[Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994)]; 문헌[Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995)]; 문헌[Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)]; 미국 특허 제4,186,183호, 제4,217,344호, 제4,235,871호, 제4,261,975호, 제4,485,054호, 제4,501,728호, 제4,774,085호, 제4,837,028호 및 제4,946,787호 참조).
핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반의 시스템의 사용은 바이러스를 체내의 특정 세포에 표적화하고, 바이러스 페이로드(payload)를 핵에 수송하기 위한 고도로 발달된 과정을 이용한다. 바이러스 벡터를 환자에게 직접 투여하거나(생체내), 그들을 사용하여 시험관내에서 세포를 처리할 수 있으며, 변형된 세포가 선택적으로 환자에게 투여될 수 있다(생체외). 통상의 바이러스 기반의 시스템에는 유전자 운반을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 및 단순 포진 바이러스 벡터가 포함될 수 있다. 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스 유전자 운반 방법을 사용하여 숙주 게놈으로의 통합이 가능하며, 종종 삽입된 트랜스유전자의 장기간 발현을 야기한다. 또한, 높은 형질도입 효율이 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 관찰되었다.
레트로바이러스의 편향성은 외래 외피 단백질을 혼입시키고, 잠재적 표적 집단의 표적 세포를 증식시킴으로써 변경될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포에 형질도입할 수 있거나, 그를 감염시킬 수 있으며, 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스 벡터이다. 따라서, 레트로바이러스 유전자 운반 시스템의 선택은 표적 조직에 따라 달라질 것이다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6 내지 10kb의 외래 서열에 대하여 패키징 능력을 갖는 시스-작용성 긴 말단 반복부로 이루어진다. 최소 시스-작용성 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 이는 이어서, 치료적 유전자를 표적 세포로 통합시켜, 영구적인 트랜스유전자 발현을 제공하는데 사용된다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 쥣과 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GaLV), 원숭이 면역 결핍 바이러스(SIV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 및 그들의 조합에 기초한 것들을 포함한다(예를 들어, 문헌[Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992)]; 문헌[Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992)]; 문헌[Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990)]; 문헌[Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989)]; 문헌[Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991)]; PCT/US94/05700호 참조). 일시적 발현이 바람직한 출원에서, 아데노바이러스 기반의 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반의 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율을 가질 수 있으며, 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터를 사용하여, 높은 역가 및 발현 수준이 수득된다. 이러한 벡터는 비교적 간단한 시스템에서 대량 생성될 수 있다. 예를 들어, 핵산 및 펩티드의 시험관내 생성에서, 그리고 생체내 및 생체외 유전자 치료법 절차를 위하여, 아데노-관련 바이러스("AAV") 벡터를 사용하여, 표적 핵산으로 세포를 형질도입시킬 수도 있다(예를 들어, 문헌[West et al., Virology 160:38-47 (1987)]; 미국 특허 제4,797,368호; WO 93/24641호; 문헌[Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)]; 문헌[Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)] 참조). 재조합 AAV 벡터의 작제는 미국 특허 제5,173,414호; 문헌[Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)]; 문헌[Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984)]; 문헌[Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984)]; 및 문헌[Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)]을 포함하는 수많은 간행물에 기술되어 있다.
패키징 세포는 전형적으로 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하기 위해 사용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징하는 293 세포, 레트로바이러스를 패키징하는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 치료법에 사용되는 바이러스 벡터는 통상적으로 핵산 벡터를 바이러스 입자로 패키징하는 세포주를 생성함으로써 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 이후의 숙주로의 통합에 필요한 최소 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 폴리뉴클레오티드(들)에 대한 발현 카세트로 대체된다. 소실 바이러스 기능은 전형적으로 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 치료법에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 게놈으로의 통합에 필요한 AAV 게놈 유래의 ITR 서열만을 갖는다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉, rep 및 cap을 인코딩하나 ITR 서열이 결여된 헬퍼 플라스미드를 함유하는 세포주에서 패키징된다. 또한, 세포주는 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염될 수 있다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진시킨다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인해 충분한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스로의 오염은 예를 들어, 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다. 세포로의 핵산의 전달을 위한 추가의 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 US20030087817호를 참조한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 하나 이상의 벡터로 일시적으로 또는 비-일시적으로 트랜스펙션된다. 일부 구현예에서, 세포는 그것이 대상체에서 천연적으로 발생한 대로 트랜스펙션된다. 일부 구현예에서, 트랜스펙션되는 세포는 대상체로부터 취해진다. 일부 구현예에서, 세포는 세포주와 같이 대상체로부터 취해진 세포로부터 유래된다. 조직 배양을 위한 매우 다양한 세포주가 당업계에 공지되어 있다. 세포주의 예는 C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, BS-C-1 원숭이 신장 상피, BALB/3T3 마우스 배아 섬유아세포, 3T3 Swiss, 3T3-L1, 132-d5 인간 태아 섬유아세포; 10.1 마우스 섬유아세포, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, BCP-1 세포, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, JY 세포, K562 세포, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, OPCN / OPCT 세포주, Peer, PNT-1A / PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, Saos-2 세포, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, THP1 세포주, U373, U87, U937, VCaP, Vero 세포, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR 및 그의 트랜스제닉 변이형을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 세포주는 당업자에게 공지되어 있는 다양한 공급원으로부터 입수가능하다(예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; ATCC)(미국 버지니아주 머내서스 소재) 참조). 일부 구현예에서, 본원에 기술된 하나 이상의 벡터로 트랜스펙션된 세포를 사용하여 하나 이상의 벡터-유래 서열을 포함하는 신규 세포주를 확립한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 CRISPR 시스템의 성분이 일시적으로 트랜스펙션되고(예를 들어, 하나 이상의 벡터의 일시적 트랜스펙션 또는 RNA로의 트랜스펙션에 의해), CRISPR 복합체의 활성을 통해 변형된 세포를 사용하여, 변형을 포함하나 임의의 다른 외인성 서열이 결여된 세포를 포함하는 신규 세포주를 확립한다. 일부 구현예에서, 일시적으로 또는 비-일시적으로 본원에 기술된 하나 이상의 벡터로 트랜스펙션된 세포 또는 이러한 세포로부터 유래된 세포주가 하나 이상의 시험 화합물의 평가에서 사용된다.
본 발명의 양태는 질병의 유전 변이의 연구를 위한 동질 유전자형 포유동물 세포주의 생성에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 양태는 트랜스제닉 또는 바이러스-매개의 전달 중 어느 하나의 유전자-변형 동물 모델의 생성에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생물의학에서, 농업에서 그리고 산업에서 유용한 산물의 생성을 위한 미생물, 세포, 식물, 동물 또는 합성 유기체의 게놈 변형을 이해한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 유전자 치료법을 이해한다. 본 발명은 게놈을 이해하기 위한, 예를 들어, 유전자 녹아웃 연구를 위한 생물학적 연구 도구로서 사용될 수 있다. 본 발명은 게놈의 DNA 내용물을 교정하고 재작성하는 기본 능력 및 DNA-기반의 유기체의 표적화된 불활성화에 좌우되는 많은 다른 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 박테리아 감염, 바이러스 감염 등이 있는 특정 균주를 표적화하기 위한 치료제로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 하나 이상의 벡터를 사용하여 비-인간 트랜스제닉 동물 또는 트랜스제닉 식물을 생성한다. 일부 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 포유동물, 예를 들어, 마우스, 랫트 또는 토끼이다. 특정 구현예에서, 유기체 또는 대상체는 식물이다. 특정 구현예에서, 유기체 또는 대상체 또는 식물은 조류이다. 트랜스제닉 식물 및 동물의 생성 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 본원에 기술된 바와 같은 세포 트랜스펙션 방법으로 시작한다. 또한, 트랜스제닉 식물, 특히 농작물 및 조류와 같이, 트랜스제닉 동물도 제공된다. 트랜스제닉 동물 또는 식물은 질병 모델을 제공하는 것 이외의 응용에 유용할 수 있다. 이들은 예를 들어, 보통 야생형에서 관찰될 것보다 높은 단백질, 탄수화물, 영양소 또는 비타민 수준의 발현을 통한 식품 또는 사료 생성을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 트랜스제닉 식물, 특히, 두류 및 덩이줄기, 및 동물, 특히, 포유동물, 예를 들어, 가축(소, 양, 염소 및 돼지)뿐 아니라 가금류 및 식용 곤충도 바람직하다.
트랜스제닉 조류 또는 다른 식물, 예를 들어, 유채가 예를 들어, 식물유 또는 바이오연료, 예를 들어, 알코올(특히, 메탄올 및 에탄올)의 생성에 특히 유용할 수 있다. 이들은 오일 또는 바이오연료 산업에 사용하기 위한 높은 수준의 오일 또는 알코올을 발현하거나 과발현하도록 조작될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 생체내, 생체외 또는 시험관내 존재할 수 있는, 진핵 세포 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 변형 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인간 또는 비인간 동물 또는 식물(미세-조류 포함)로부터 세포 또는 세포 집단을 샘플링하는 단계, 및 세포(들)를 변형시키는 단계를 포함한다. 배양은 생체외에서 임의의 단계에서 일어날 수 있다. 세포(들)는 심지어 비-인간 동물 또는 식물(미세-조류 포함)로 재도입될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 진핵 세포에서의 표적 폴리뉴클레오티드의 변형 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CRISPR 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하게 하여, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 초래하여, 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서, CRISPR 복합체는 상기 표적 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화된 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하고, 상기 가이드 서열은 tracr 메이트 서열에 연결되며, tracr 메이트 서열은 차례로 tracr 서열에 혼성화된다.
일 양태에서, 본 발명은 진핵 세포에서의 표적 폴리뉴클레오티드의 발현의 변경 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CRISPR 복합체가 폴리뉴클레오티드에 결합하여, 상기 결합이 상기 폴리뉴클레오티드의 발현 증가 또는 감소를 야기하도록 하는 단계를 포함하며; 여기서, CRISPR 복합체는 상기 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하며, 상기 가이드 서열은 tracr 메이트 서열에 연결되며, tracr 메이트 서열은 차례로 tracr 서열에 혼성화된다.
작물 유전체학의 최근의 진전으로, 효율적이며 비용 효율이 높은 유전자 교정 및 조작을 수행하기 위한 CRISPR-Cas 시스템의 사용 능력은 단일 및 다중 유전자 조작의 신속한 선택과 비교를 가능하게 하여, 향상된 생성 및 증진된 특성을 위해 이러한 게놈을 형질전환시킬 것이다. 이와 관련하여, 다음의 미국 특허 및 간행물을 참조한다: 각각의 모든 내용 및 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제6,603,061호(Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method); 미국 특허 제7,868,149호(Plant Genome Sequences and Uses Thereof) 및 US 2009/0100536호(Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits). 본 발명의 실시에 있어서, 문헌[Morrell et al "Crop genomics:advances and applications" Nat Rev Genet. 2011 Dec 29;13(2):85-96]의 내용 및 개시내용도 또한 그들 전문이 본원에 참조로 포함된다.
식물에서, 병원체는 종종 숙주-특이적이다. 예를 들어, 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) f. sp. 리코페르시시(lycopersici)는 토마토 시듦을 야기하나 오직 토마토만을 공격하고, 푸사리움 옥시스포룸 f. 디안티이 푸키니아 그라미니스(dianthii Puccinia graminis) f. sp. 트리티시(tritici)는 오직 밀만을 공격한다. 식물은 대부분의 병원체에 저항하는 기존의 방어 및 유도된 방어를 갖는다. 식물 세대에 걸친 돌연변이 및 재조합 사건은 유전적 변이를 야기하며, 이는 특히 병원체가 식물보다 더 많은 빈도로 재생되기 때문에, 감수성이 생기게 한다. 식물에서는 비-숙주 저항성이 존재할 수 있는데, 예를 들어 숙주 및 병원체는 양립불가능하다. 또한, 수평 저항성, 예를 들어, 통상적으로 많은 유전자에 의해 제어되는 모든 종류의 병원체에 대한 불완전한 저항성, 및 수직 저항성, 예를 들어, 통상 소수의 유전자에 의해 제어되는 일부 종류의 병원체에 대해서는 완전하지만 다른 종류에 대해서는 그렇지 않은 저항성이 존재할 수 있다. 유전자 대 유전자(Gene-for-Gene) 수준에 있어서, 식물 및 병원체는 함께 진화하며, 하나의 균형의 유전적 변화는 다른 것을 변화시킨다. 따라서, 천연 가변성을 사용하여, 육종자는 수율, 품질, 균일성, 내한성, 저항성에 대해 가장 유용한 유전자를 조합한다. 저항성 유전자의 공급원은 고유 또는 외래 품종, 토종(Heirloom) 품종, 야생 식물 동류 및 유도된 돌연변이, 예를 들어 돌연변이유발 작용제로 식물 물질을 처리하는 것을 포함한다. 본 발명을 사용하여, 식물 육종자에게 돌연변이를 유도하는 신규 도구가 제공된다. 따라서, 당업자는 저항성 유전자 공급원의 게놈을 분석할 수 있으며, 요망되는 특징 또는 특성을 갖는 품종에서 본 발명을 이용하여 이전의 돌연변이유발 작용제보다 더 큰 정밀도로 저항성 유전자의 발생을 유도하여, 이에 따라 식물 육종 프로그램을 가속화시키고 향상시킨다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 방법 및 조성물에 개시된 임의의 하나 이상의 요소를 함유하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 벡터 시스템 및 키트의 사용을 위한 지침서를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 시스템은 (a) tracr 메이트 서열, 및 tracr 메이트 서열의 상류에 하나 이상의 가이드 서열을 삽입하기 위한 하나 이상의 삽입 부위에 작동가능하게 연결된 제1 조절 요소로서, 가이드 서열은 발현되는 경우, 진핵 세포 내의 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하고, CRISPR 복합체는 (1) 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열, 및 (2) tracr 서열에 혼성화되는 tracr 메이트 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하는 제1 조절 요소; 및/또는 (b) 핵 국소화 서열을 포함하는 상기 CRISPR 효소를 인코딩하는 효소-코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제2 조절 요소를 포함한다. 요소는 개별적으로 또는 조합하여 제공될 수 있으며, 임의의 적절한 용기, 예를 들어, 바이얼, 병 또는 튜브에 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 1가지 이상의 언어, 예를 들어, 1가지 초과의 언어의 지침서를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 본원에 기술된 요소 중 하나 이상을 사용하는 과정에 사용하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 시약은 임의의 적절한 용기에 제공될 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나 이상의 반응 또는 저장 완충제를 제공할 수 있다. 시약은 특정 검정에 사용가능한 형태 또는 사용 전에 하나 이상의 다른 성분의 첨가를 필요로 하는 형태(예를 들어, 농축물 또는 동결건조 형태)로 제공될 수 있다. 완충제는 탄산나트륨 완충제, 중탄산나트륨 완충제, 붕산염 완충제, 트리스(Tris) 완충제, MOPS 완충제, HEPES 완충제 및 그들의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않는 임의의 완충제일 수 있다. 일부 구현예에서, 완충제는 알칼리성이다. 일부 구현예에서, 완충제는 약 7 내지 약 10의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 키트는 가이드 서열과 조절 요소를 작동가능하게 연결하도록, 벡터에 삽입하기 위한 가이드 서열에 상응하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 상동성 재조합 주형 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 CRISPR 복합체는 효율적인 표적 폴리뉴클레오티드의 변형 수단을 제공한다. 본 발명의 CRISPR 복합체는 다수의 세포 유형에서 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는(예를 들어, 결실시키는, 삽입하는, 전위시키는, 불활성화시키는, 활성화시키는) 것을 포함하는 매우 다양한 유용성을 갖는다. 이와 같이, 본 발명의 CRISPR 복합체는 예를 들어, 유전자 치료법, 약물 스크리닝, 질병 진단 및 예후에서 넓은 스펙트럼의 응용을 갖는다. 예시적인 CRISPR 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열과 복합체화되는 CRISPR 효소를 포함한다. 가이드 서열은 tracr 메이트 서열에 연결되며, tracr 메이트 서열은 차례로 tracr 서열에 혼성화된다.
CRISPR 복합체의 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포에 대해 내인성이거나 외인성인 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포의 핵에 존재하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 유전자 산물(예를 들어, 단백질)을 코딩하는 서열 또는 비-코딩 서열(예를 들어, 조절 폴리뉴클레오티드 또는 정크(junk) DNA)일 수 있다. 이론에 구속되지 않으면서, 표적 서열이 PAM(프로토스페이서 인접 모티프); 즉, CRISPR 복합체에 의해 인식되는 짧은 서열과 회합되어야 하는 것으로 여겨진다. PAM에 대한 정밀한 서열 및 길이 요건은 사용되는 CRISPR 효소에 따라 달라지지만, PAM은 전형적으로 프로토스페이서(즉, 표적 서열)에 인접한 2 내지 5개 염기쌍 서열이다. PAM 서열의 예는 하기 실시예 섹션에 제공되어 있으며, 당업자는 주어진 CRISPR 효소와 함께 사용하기 위한 추가의 PAM 서열을 확인할 수 있을 것이다.
CRISPR 복합체의 표적 폴리뉴클레오티드는 모두의 내용이 본원에 참조로 포함되는, 각각 브로드 참조번호 BI-2011/008/WSGR 사건 번호 44063-701.101 및 BI-2011/008/WSGR 사건 번호 44063-701.102를 갖고, 둘 모두 명칭이 SYSTEMS METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION이고, 각각 2012년 12월 12일 및 2013년 1월 2일에 출원된 미국 가출원 제61/736,527호 및 제61/748,427호에 열거된 바와 같은 다수의 질병-관련 유전자 및 폴리뉴클레오티드, 및 신호전달 생화학 경로-관련 유전자 및 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드의 예는 신호전달 생화학 경로와 관련된 서열, 예를 들어, 신호전달 생화학적 경로-관련 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드의 예는 질병 관련 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "질병-관련" 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 질병이 없는 대조군의 조직 또는 세포와 비교하여, 질병-발생 조직으로부터 유래된 세포에서 비정상적인 수준 또는 비정상적인 형태로 전사 또는 번역 산물을 생성하는 임의의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 그것은 비정상적으로 높은 수준으로 발현되는 유전자일 수 있으며; 그것은 비정상적으로 낮은 수준으로 발현되는 유전자일 수 있고, 여기서, 변경된 발현은 질병의 발생 및/또는 진행과 관련이 있다. 또한, 질병-관련 유전자는 질병의 병인에 직접적인 원인이 있거나, 그에 원인이 있는 유전자(들)와 연관 불균형이 있는 돌연변이(들) 또는 유전적 변이를 갖는 유전자를 지칭한다. 전사 또는 번역된 산물은 공지된 것이거나 미공지된 것일 수 있으며, 정상 또는 비정상 수준으로 존재할 수 있다.
질병-관련 유전자 및 폴리뉴클레오티드의 예는 맥쿠식-네이선스 유전의학연구소(McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine), 존스 홉킨스 대학(Johns Hopkins University)(미국 메릴랜드주 볼티모어) 및 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information), 국립 의학 도서관(미국 메릴랜드주 베데스다)로부터 이용가능하며, 월드 와이드 웹에서 이용가능하다.
질병-관련 유전자 및 폴리뉴클레오티드의 예는 표 A 및 B에 열거되어 있다. 질병 특이적 정보는 맥쿠식-네이선스 유전의학연구소, 존스 홉킨스 대학(미국 메릴랜드주 볼티모어) 및 미국 국립생물공학정보센터, 국립 의학 도서관(미국 메릴랜드주 베데스다)로부터 이용가능하며, 월드 와이드 웹에서 이용가능하다. 신호전달 생화학 경로-관련 유전자 및 폴리뉴클레오티드의 예는 표 C에 열거되어 있다.
이들 유전자 및 경로의 돌연변이는 기능에 영향을 미치는 부적절한 단백질 또는 부적절한 양의 단백질의 생성을 야기할 수 있다. 유전자, 질병 및 단백질의 추가의 예는 2012년 12월 12일에 출원된 미국 가출원 제61/736,527호 및 2013년 1월 2일에 출원된 제61/748,427호로부터 본원에 참고로 포함된다. 이러한 유전자, 단백질 및 경로는 CRISPR 복합체의 표적 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
표 A
Figure pct00003
Figure pct00004
표 B:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
표 C:
Figure pct00009
Figure pct00010
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Figure pct00013
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Figure pct00015
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Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
또한, 본 발명의 구현예는 유전자의 녹아웃, 유전자의 증폭 및 DNA 반복부 불안정성 및 신경계 장애와 관련된 특정 돌연변이의 수복에 관한 방법 및 조성물에 관한 것이다(문헌[Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Second Edition, Academic Press, Oct 13, 2011 - Medical]). 연쇄 반복(tandem repeat) 서열의 특정 양태는 20개 초과의 인간 질병의 원인이 되는 것으로 관찰되었다(반복부 불안정성의 새로운 이해: RNA·DNA 하이브리드의 역할. 문헌[McIvor EI, Polak U, Napierala M. RNA Biol. 2010 Sep-Oct;7(5):551-8]). CRISPR-Cas 시스템은 이들 게놈 불안정성의 결함을 교정하도록 이용될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 라포라 질병(Lafora disease)과 관련이 있는 것으로 확인된 EMP2A 및 EMP2B 유전자의 결함을 교정하기 위하여 CRISPR-Cas 시스템을 사용하는 것에 관한 것이다. 라포라 질병은 청소년기에 간질성 발작으로 시작할 수 있는 진행성 간대성근경련 간질을 특징으로 하는 상염색체 열성 질환이다. 소수의 경우의 질병이 아직 확인되지 않은 유전자의 돌연변이에 의해 유발될 수 있다. 질병은 발작, 근육연축, 보행곤란, 치매 및 결국에는 사망을 야기한다. 질병 진행에 대하여 효율적인 것으로 입증된 치료법이 현재 존재하지 않는다. 또한, 간질과 관련된 다른 유전자 이상은 CRISPR-Cas 시스템에 의해 표적화될 수 있으며, 근본이 되는 유전학은 문헌[Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies, edited by Giuliano Avanzini, Jeffrey L. Noebels, Mariani Foundation Paediatric Neurology:20; 2009]에 추가로 기술되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, CRISPR-Cas 시스템을 사용하여 문헌[Genetic Diseases of the Eye, Second Edition, edited by Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, 2012]에 추가로 기술된 몇몇 유전자 돌연변이로부터 야기되는 안구 결함을 교정할 수 있다.
본 발명의 몇몇 추가의 양태는 토픽 세부항목 유전 장애하에 국립보건원의 웹사이트(health.nih.gov/topic/GeneticDisorders의 웹사이트)에 추가로 기술된 매우 다양한 유전 질병과 관련된 결함을 교정하는 것에 관한 것이다. 유전적 뇌 질병은 부신백질이영양증, 뇌들보 무발생, 에카르디 증후군, 알퍼스병, 알츠하이머병, 바르트 증후군, 배튼병, CADASIL, 소뇌변성, 파브리병, 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커 병, 헌팅톤병 및 기타 3중 반복 장애, 라이병, 레슈-니한 증후군, 멘케스 질병, 사립체성 근병증 및 NINDS 거대후두각을 포함할 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 이들 질병은 세부항목 유전 뇌 장애하에 국립보건원의 웹사이트에 추가로 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 질환은 신생물일 수 있다. 일부 구현예에서, 질환이 신생물인 경우, 표적화될 유전자는 표 A에 열거된 것들 중 임의의 것이다(이러한 경우에, PTEN 등). 일부 구현예에서, 질환은 연령-관련 황반 변성일 수 있다. 일부 구현예에서, 질환은 정신분열 장애일 수 있다. 일부 구현예에서, 질환은 트리뉴클레오티드 반복 장애일 수 있다. 일부 구현예에서, 질환은 유약 X 증후군일 수 있다. 일부 구현예에서, 질환은 세크레타제 관련 장애일 수 있다. 일부 구현예에서, 질환은 프리온-관련 장애일 수 있다. 일부 구현예에서, 질환은 ALS일 수 있다. 일부 구현예에서, 질환은 약물 중독일 수 있다. 일부 구현예에서, 질환은 자폐증일 수 있다. 일부 구현예에서, 질환은 알츠하이머병일 수 있다. 일부 구현예에서, 질환은 염증일 수 있다. 일부 구현예에서, 질환은 파킨슨병일 수 있다.
파킨슨병과 관련된 단백질의 예는 α-시누클레인, DJ-1, LRRK2, PINK1, Parkin, UCHL1, 신필린(Synphilin)-1 및 NURR1을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
중독 관련 단백질의 예는 예를 들어, ABAT를 포함할 수 있다.
염증-관련 단백질의 예는 예를 들어, Ccr2 유전자에 의해 인코딩된 단핵구 화학주성 단백질-1(MCP1), Ccr5 유전자에 의해 인코딩된 C-C 케모카인 수용체 5형(CCR5), Fcgr2b 유전자에 의해 인코딩된 IgG 수용체 IIB(FCGR2b, CD32로도 명명) 또는 Fcer1g 유전자에 의해 인코딩된 Fc 엡실론(epsilon) R1g(FCER1g) 단백질을 포함할 수 있다.
심혈관 질병 관련 단백질의 예는 예를 들어, IL1B(인터류킨 1, 베타), XDH(잔틴 데하이드로게나제), TP53(종양 단백질 p53), PTGIS(프로스타글란딘 I2(프로스타사이클린(prostacyclin)) 신타제), MB(미오글로빈), IL4(인터류킨 4), ANGPT1(안지오포이에틴 1), ABCG8(ATP-결합 카세트, 하위-과 G(WHITE), 구성원 8) 또는 CTSK(카텝신 K)를 포함할 수 있다.
알츠하이머병 관련 단백질의 예는 예를 들어, VLDLR 유전자에 의해 인코딩되는 극저밀도 리포단백질 수용체 단백질(VLDLR), UBA1 유전자에 의해 인코딩되는 유비퀴틴-유사 변형 활성화 효소(UBA1) 또는 UBA3 유전자에 의해 인코딩되는 NEDD8-활성화 효소 E1 촉매 서브유닛 단백질(UBE1C)을 포함할 수 있다.
자폐 스펙트럼 장애와 관련된 단백질의 예는 예를 들어, BZRAP1 유전자에 의해 인코딩되는 벤조디아자핀 수용체(주변) 관련 단백질 1(BZRAP1), AFF2 유전자(MFR2로도 명명)에 의해 인코딩되는 AF4/FMR2 과 구성원 2 단백질(AFF2), FXR1 유전자에 의해 인코딩되는 유약 X 정신 지체 상염색체 상동체 1 단백질(FXR1) 또는 FXR2 유전자에 의해 인코딩되는 유약 X 정신 지체 상염색체 상동체 2 단백질(FXR2)을 포함할 수 있다.
황반 변성과 관련된 단백질의 예는 예를 들어, ABCR 유전자에 의해 인코딩되는 ATP-결합 카세트, 하위과 A(ABC1) 구성원 4 단백질(ABCA4), APOE 유전자에 의해 인코딩되는 아포리포단백질 E 단백질(APOE) 또는 CCL2 유전자에 의해 인코딩되는 케모카인(C-C 모티프) 리간드 2 단백질(CCL2)을 포함할 수 있다.
정신분열증 관련 단백질의 예는 NRG1, ErbB4, CPLX1, TPH1, TPH2, NRXN1, GSK3A, BDNF, DISC1, GSK3B 및 그들의 조합을 포함할 수 있다.
종양 저해에 수반되는 단백질의 예는 예를 들어, ATM(돌연변이된 혈관확장성 운동실조증), ATR(혈관확장성 운동실조증 및 Rad3 관련), EGFR(상피 성장 인자 수용체), ERBB2(v-erb-b2 적혈모구성 백혈병 바이러스 암유전자 상동체 2), ERBB3(v-erb-b2 적혈모구성 백혈병 바이러스 암유전자 상동체 3), ERBB4(v-erb-b2 적혈모구성 백혈병 바이러스 암유전자 상동체 4), Notch 1, Notch2, Notch 3 또는 Notch 4를 포함할 수 있다.
세크레타제 장애와 관련된 단백질의 예는 예를 들어, PSENEN(프레세닐린 인핸서 2 상동체(C. 엘레간스(C. elegans)), CTSB(카텝신 B), PSEN1(프레세닐린 1), APP(아밀로이드 베타(A4) 전구체 단백질), APH1B(앞인두 결함 1 상동체 B(C. 엘레간스)), PSEN2(프레세닐린 2(알츠하이머병 4)) 또는 BACE1(베타-부위 APP-절단 효소 1)을 포함할 수 있다.
근위축성 측삭 경화증과 관련된 단백질의 예는 SOD1(슈퍼옥시드 디스뮤타제(dismutase) 1), ALS2(근위축성 측삭 경화증 2), FUS(육종에서 융합), TARDBP(TAR DNA 결합 단백질), VAGFA(혈관 내피 성장 인자 A), VAGFB(혈관 내피 성장 인자 B) 및 VAGFC(혈관 내피 성장 인자 C) 및 그들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
프리온 질병과 관련된 단백질의 예는 SOD1(슈퍼옥시드 디스뮤타제 1), ALS2(근위축성 측삭 경화증 2), FUS(육종에서 융합), TARDBP(TAR DNA 결합 단백질), VAGFA(혈관 내피 성장 인자 A), VAGFB(혈관 내피 성장 인자 B) 및 VAGFC(혈관 내피 성장 인자 C) 및 그들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
프리온 장애에서의 신경변성 질환과 관련된 단백질의 예는 예를 들어, A2M(알파-2-마크로글로불린), AATF(아폽토시스 길항작용 전사 인자), ACPP(전립선 산 포스파타제), ACTA2(액틴 알파 2 평활근 대동맥), ADAM22(ADAM 메탈로펩티다제 도메인), ADORA3(아데노신 A3 수용체) 또는 ADRA1D(알파-1D 아드레노수용체에 대한 알파-1D 아드레날린 작용성 수용체)를 포함할 수 있다.
면역결핍과 관련된 단백질의 예는 예를 들어, A2M[알파-2-마크로글로불린]; AANAT[아릴알킬아민 N-아세틸트랜스퍼라제]; ABCA1[ATP-결합 카세트, 하위과 A(ABC1), 구성원 1]; ABCA2[ATP-결합 카세트, 하위과 A(ABC1), 구성원 2]; 또는 ABCA3[ATP-결합 카세트, 하위과 A(ABC1), 구성원 3];을 포함할 수 있다.
트리뉴클레오티드 반복 장애와 관련된 단백질의 예는 예를 들어, AR(안드로겐 수용체), FMR1(유약 X 정신 지체 1), HTT(헌팅틴) 또는 DMPK(근긴장성 이영양증-단백질 키나제), FXN(프라탁신(frataxin)), ATXN2(아탁신(ataxin) 2)를 포함한다.
신경전달 장애와 관련된 단백질의 예는 예를 들어, SST(소마토스타틴), NOS1(산화질소 신타제 1(뉴런)), ADRA2A(아드레날린 작용성, 알파-2A-, 수용체), ADRA2C(아드레날린 작용성, 알파-2C-, 수용체), TACR1(타키키닌 수용체 1) 또는 HTR2c(5-하이드록시트립타민(세로토닌) 수용체 2C)를 포함한다.
신경발달-관련 서열의 예는 예를 들어, A2BP1[아탁신 2-결합 단백질 1], AADAT[아미노아디페이트 아미노트랜스퍼라제], AANAT[아릴알킬아민 N-아세틸트랜스퍼라제], ABAT[4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제], ABCA1[ATP-결합 카세트, 하위과 A(ABC1), 구성원 1] 또는 ABCA13[ATP-결합 카세트, 하위과 A(ABC1), 구성원 13]을 포함한다.
본 발명의 시스템으로 치료가능한 바람직한 질환의 추가의 예는 에카르디 고우티에레스(Aicardi-Goutieres) 증후군; 알렉산더병; 알란-헌든-두들리(Allan-Herndon-Dudley) 증후군; POLG-관련 장애; 알파-만노시도시스(Alpha-Mannosidosis)(II 및 III형); 알스트스트롬(Alstrom) 증후군; 안젤만(Angelman); 증후군; 혈관확장성 운동실조증; 신경 세로이드 리포푸신증; 베타-지중해빈혈; 양쪽성 시신경위축 및 (영아) 1형 시신경위축; 망막모세포종(양쪽성); 캐너번병; 뇌-눈-얼굴-골격 증후군 1[COFS1]; 뇌힘줄황색종증; 코넬리아디란지 증후군; MAPT-관련 장애; 유전적 프리온 질병; 드라벳 증후군; 조기-발병 가족성 알츠하이머병; 프리드리히 운동실조[FRDA]; 프린스 증후군; 푸코시드 축적증; 후쿠야마형 선천성 근이영양증; 갈락토시알리도시스; 고셰병; 유기 산혈증; 혈구탐식성 림프조직구증; 허친슨-길포오드 조로증 증후군; II형 뮤코리피드증; 유아 유리 시알산 축적병; PLA2G6-관련 신경변성; 제벨 랑쥐-닐슨 증후군; 연접부 수포성 표피박리증; 헌팅톤병; 크라베병(유아); 미토콘드리아 DNA-관련 레이 증후군 및 NARP; 레슈-니한 증후군; LIS1-관련 뇌회결손; 로우 증후군; 단풍시럽뇨병; MECP2 중복 증후군; ATP7A-관련 구리 수송 장애; LAMA2-관련 근이영양증; 아릴설파타제 A 결핍; I, II 또는 III형 점액다당류증; 퍼옥시좀 생물발생 장애; 젤웨거 증후군 스펙트럼; 뇌 철 축적 장애가 있는 신경변성; 산 스핑고미엘리나제 결핍; C형 니만 픽병; 글리신 뇌병증; ARX-관련 장애; 요소 사이클 장애; COL1A1/2-관련 불완전골형성; 미토콘드리아 DNA 결실 증후군; PLP1-관련 장애; 페리(Perry) 증후군; 펠란-맥더미드 증후군; II형 글리코겐 축적병(폼페병)(유아); MAPT-관련 장애; MECP2-관련 장애; 1형 어깨엉덩관절 점상 연골형성이상; 로버츠 증후군; 샌드호프병; 쉰들러병 - 1형; 아데노신 탈아미노효소 결핍; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 척수성 근위축; 유아-발병 척수소뇌성 실조증; 헥소사미니다제 A 결핍; 1형 치사성 이형성증; VI형 콜라겐-관련 장애; I형 어셔 증후군; 선천성 근이영양증; 울프-허쉬호른 증후군; 리소좀산 리파제 결핍; 및 색소성 건피증으로부터 선택될 수 있다.
명백한 바와 같이, 본 발명의 시스템이 임의의 대상 폴리뉴클레오티드 서열을 표적화하기 위해 사용될 수 있음이 예상된다. 본 발명의 시스템을 사용하여 유용하게 치료될 수 있는 질환 또는 질병의 일부 예는 상기 표에 포함되어 있으며, 그들 질환과 현재 관련되어 있는 유전자의 예도 또한 거기에 제공된다. 그러나, 예시된 유전자는 배타적인 것은 아니다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명의 다양한 구현예를 예시할 목적으로 제공되며, 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하고자 하지 않는다. 본원에 기술된 방법과 함께 본 발명의 실시예는 본원에서 바람직한 구현예를 대표하는 것이며, 예시적이고, 본 발명의 범주에 대한 제한으로 의도되지 않는다. 거기에서의 변화 및 다른 용도는 청구범위의 범주에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 목적에 포함되며, 당업자에게 수행될 것이다.
실시예 1: 진핵 세포의 핵에서의 CRISPR 복합체 활성
예시적인 II형 CRISPR 시스템은 스트렙토코커스 피오게네스 SF370 유래의 II형 CRISPR 유전자좌이며, 이는 4개 유전자, Cas9, Casl, Cas2 및 Csn1의 클러스터 뿐 아니라 2개의 비-코딩 RNA 요소, tracrRNA, 및 비-반복 서열의 짧은 스트레치(스페이서, 각각 30bp)에 의해 산재된 반복 서열의 특징적 어레이(직접 반복부)를 포함한다. 이러한 시스템에서, 표적화된 DNA 이중-가닥 파단(DSB)은 4개의 순차적 단계로 생성된다(도 2a). 먼저, 2개의 비-코딩 RNA, pre-crRNA 어레이 및 tracrRNA를 CRISPR 유전자좌로부터 전사시킨다. 두번째로, tracrRNA를 pre-crRNA 의 직접 반복부에 혼성화시키고, 이어서 개별 스페이서 서열을 함유하는 성숙 crRNA로 가공한다. 세 번째로, 성숙 crRNA:tracrRNA 복합체는 crRNA의 스페이서 영역과 프로토스페이서 DNA 사이의 헤테로듀플렉스 형성을 통해 Cas9를 프로토스페이서 및 상응하는 PAM으로 구성된 DNA 표적으로 유도한다. 마지막으로, Cas9는 PAM의 상류의 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내에 DSB를 생성한다(도 2a). 이러한 실시예는 진핵 세포의 핵에서 CRISPR 복합체 활성을 유도하기 위해 이러한 RNA-프로그램화가능 뉴클레아제 시스템을 조정하는 예시적인 과정을 기술한다.
세포 배양 및 트랜스펙션
인간 배아 신장(HEK) 세포주 HEK 293FT(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies))를 10% 우태아혈청(하이클론(HyClone)), 2mM GlutaMAX(라이프 테크놀로지즈), 100U/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 둘베코 개질 이글스 배지(DMEM)에서 37℃에서 5% C02 인큐베이션과 함께 유지시켰다. 마우스 neuro2A(N2A) 세포주(ATCC)를 37℃에서 5% C02와 함께, 5% 우태아혈청(하이클론), 2mM GlutaMAX(라이프 테크놀로지즈), 100U/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 DMEM으로 유지시켰다.
트랜스펙션 1일 전, 웰당 200,000개 세포의 밀도로 HEK 293FT 또는 N2A 세포를 24-웰 플레이트(코닝(Corning))에 씨딩하였다. 세포를 제조사의 권고 프로토콜에 따라 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(라이프 테크놀로지즈)을 사용하여 트랜스펙션시켰다. 24-웰 플레이트의 각 웰에 대해 총 800 ng의 플라스미드를 사용하였다.
게놈 변형에 대한 서베이어 검정 및 시퀀싱 분석
HEK 293FT 또는 N2A 세포를 상기 기술한 바와 같이 플라스미드 DNA로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후에, 게놈 DNA 추출 전 72시간 동안 37℃에서 세포를 인큐베이션시켰다. 게놈 DNA를 제조사의 프로토콜에 따라 퀵익스트랙트(QuickExtract) DNA 추출 키트(에피센트레(Epicentre))를 사용하여 추출하였다. 간략하게, 세포를 퀵익스트랙트 용액에 재현탁시키고, 65℃에서 15분 동안, 그리고 98℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 추출된 게놈 DNA를 바로 처리하거나 -20℃에서 보관하였다.
각 유전자에 대한 CRISPR 표적 부위의 주변의 게놈 영역을 PCR 증폭시키고, 산물을 제조사의 프로토콜에 따라 퀴아퀵 스핀 컬럼(QiaQuick Spin Column)(퀴아젠(Qiagen))을 사용하여 정제하였다. 총 400ng의 정제된 PCR 산물을 2㎕ 10X Taq 중합효소 PCR 완충제(엔자이머틱스(Enzymatics)) 및 초순수와 총 20㎕ 부피로 혼합하고, 재어닐링 과정을 거치게 하여 헤테로듀플렉스가 형성되게 하였다: 95℃에서 10 분, 95℃에서 85℃(-2℃/초로 램핑(ramping)), 85℃에서 25℃(-0.25℃/초), 및 25℃에서 1분 유지. 재어닐링 후, 산물을 제조사의 권고 프로토콜에 따라 서베이어 뉴클레아제 및 서베이어 인핸서 S(트랜스게노믹스(Transgenomics))로 처리하고, 4-20% 노벡스(Novex) TBE 폴리-아크릴아미드 겔(라이프 테크놀로지즈)에서 분석하였다. 겔을 SYBR 골드(Gold) DNA 염색제(라이프 테크놀로지즈)로 30분 동안 염색하고, Gel Doc 겔 영상화 시스템(바이오-라드(Bio-rad))으로 영상화하였다. 정량화는 절단된 DNA의 분율의 척도로서 상대적 밴드 세기를 기반으로 하였다. 도 7은 이러한 서베이어 검정의 개략적 예시를 제공한다.
상동성 재조합의 검출을 위한 제한 단편 길이 다형성 검정
HEK 293FT 및 N2A 세포를 플라스미드 DNA로 트랜스펙션시키고, 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션시킨 후 상기 기재한 바와 같이 게놈 DNA를 추출하였다. 표적 게놈 영역을 상동성 재조합(HR) 주형의 상동성 암(arm) 외측의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 산물을 1% 아가로오스 겔 상에서 분리하고 MinElute GelExtraction 키트(퀴아젠)를 사용하여 추출하였다. 정제된 산물을 HindIII(퍼멘터스(Fermentas))로 분해시키고 6% 노벡스 TBE 폴리-아크릴아미드 겔(라이프 테크놀로지즈)에서 분석하였다.
RNA 2차 구조 예측 및 분석
센트로이드 구조 예측 알고리즘을 사용하는 비엔나 대학의 이론 화학 기관에서 개발된 온라인 웹서버 RNAfold를 사용하여 RNA 2차 구조 예측을 수행하였다(예를 들어, 문헌[A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24]; 및 문헌[PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62] 참조).
RNA 정제
HEK 293FT 세포를 상기 언급한 바와 같이 유지시키고 트랜스펙션시켰다. 세포를 트립신처리에 의해 수집한 후 인산 완충 염수(PBS)로 세척하였다. 전체 세포 RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 TRI 시약(시그마(Sigma))으로 추출하였다. 추출한 전체 RNA를 나노드롭(Naonodrop)(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 사용하여 정량화하고 동일 농도로 정규화하였다.
포유류 세포 내의 crRNA 및 tracrRNA 발현의 노던 블롯 분석
RNA를 동일 부피의 2X 로딩 완충제(앰비온(Ambion))와 혼합하고, 5분 동안 95℃로 가열하고, 1분 동안 얼음 상에서 냉각시킨 후, 적어도 30분 동안 겔을 사전-전개시킨 후 8% 변성 폴리아크릴아미드 겔(SequaGel, 내셔널 디아그노스틱스(National Diagnostics)) 상에 로딩하였다. 샘플을 40W 한도에서 1.5시간 동안 전기영동하였다. 그 후, RNA를 실온에서 1.5시간 동안 반-건조 운반 장치(바이오-라드) 내에서 300 mA에서 하이본드(Hybond) N+ 멤브레인(지이 헬쓰케어(GE Healthcare)) 에 옮겼다. RNA를 스트라타진(Stratagene) UV 가교제 스트라타링커(Stratalinker)(스트라타진) 상의 자동가교 버튼을 사용하여 멤브레인에 가교시켰다. 멤브레인을 ULTRAhyb-Oligo 혼성화 완충제(앰비온) 중에서 30분 동안, 42℃에서 회전시키면서 사전-혼성화한 후, 프로브를 첨가하고 밤새 혼성화하였다. 프로브를 IDT에서 주문하고 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))와 함께 [감마-32P] ATP(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))로 표지하였다. 멤브레인을 사전가온된(42℃) 2xSSC, 0.5% SDS로 1분 동안 1회 세척한 후 42℃ 에서 2회 30분 세척하였다. 멤브레인을 1시간 동안 또는 밤새 실온에서 인광체 스크린에 노출시킨 후 포스포르이미저(phosphorimager)(타이푼(Typhoon))로 스캔하였다.
박테리아 CRISPR 시스템 작제 및 평가
tracrRNA, Cas9 및 리더를 포함하는 CRISPR 유전자좌 요소를 깁슨 조립을 위한 측부 배치 상동성 암과 함께, 스트렙토코커스 피오게네스 SF370 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시켰다. 2개의 BsaI IIS형 부위를 2개의 직접 반복부 사이에 도입하여, 용이한 스페이서의 삽입을 가능하게 하였다(도 8). PCR 산물을 깁슨 조립 마스터 믹스(NEB)를 사용하여 tet 프로모터의 하류에 EcoRV-분해 pACYC184 내로 클로닝하였다. Csn2의 마지막 50bp를 제외하고 다른 내인성 CRISPR 시스템 요소를 생략하였다. 상보성 오버행을 지니는 스페이서를 인코딩하는 올리고(인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지(Integrated DNA Technology))를 BsaI-분해 벡터 pDC000(NEB) 내로 클로닝한 다음, T7 리가제(엔자이머틱스)를 사용하여 라이게이션시켜, pCRISPR 플라스미드를 생성하였다. PAM이 있는 스페이서를 함유하는 챌린지 플라스미드의
포유동물 세포에서의 발현(도 6b에 나타낸 서베이어 검정의 결과에 의해 결정되는 바와 같은 작용성이 있는 도 6a에 예시된 발현 작제물). 전사 시작 부위는 +1로 표시되며, 전사 종결자 및 노던 블롯에 의해 프로빙되는 서열도 또한 표시되어 있다. 가공된 tracrRNA의 발현도 또한 노던 블롯에 의해 확인하였다. 도 6c는 긴 또는 짧은 tracrRNA, 및 SpCas9 및 DR-EMX1(1)-DR을 지니는 U6 발현 작제물이 트랜스펙션된 293FT 세포로부터 추출된 전체 RNA의 노던 블롯 분석의 결과를 보여준다. 좌측 및 우측 패널은 각각 SpRNase III의 부재 또는 존재 하에 트랜스펙션된 293FT 세포로부터의 것이다. U6은 인간 U6 snRNA를 표적화하는 프로브로 블롯팅된 로딩 대조군을 나타낸다. 짧은 tracrRNA 발현 작제물의 트랜스펙션은 풍부한 수준의 tracrRNA의 가공된 형태를 야기한다(약 75 bp). 매우 소량의 긴 tracrRNA가 노던 블롯에서 검출된다.
정밀한 전사 개시를 촉진시키기 위하여 RNA 중합효소 III 기반의 U6 프로모터를 선택하여, tracrRNA의 발현을 유도하였다(도 2c). 유사하게, U6 프로모터 기반의 작제물을 2개의 직접 반복부(DR, 또한 용어 "tracr-메이트 서열"에 포함; 도 2c)가 측부 배치된 단일의 스페이서로 구성된 pre-crRNA 어레이를 발현하도록 발생시켰다. 초기 스페이서를 대뇌 피질의 발생의 주요 유전자인 인간 EMX1 유전자좌 내의 33-염기-쌍(bp) 표적 부위(30-bp 프로토스페이서 + Cas9의 NGG 인식 모티프를 만족시키는 3-bp CRISPR 모티프(PAM) 서열)를 표적화하도록 설계하였다(도 2c).
포유동물 세포에서 CRISPR 시스템(SpCas9, SpRNase III, tracrRNA 및 pre-crRNA)의 이종 발현이 포유동물 염색체의 표적화된 절단을 달성할 수 있는지를 시험하기 위하여, HEK 293FT 세포를 CRISPR 성분의 조합으로 트랜스펙션시켰다. 포유동물 핵에서 DSB가 삽입-결실의 형성을 야기하는 비-상동 말단 연결(NHEJ) 경로에 의해 부분적으로 수복되기 때문에, 서베이어 검정을 사용하여, 표적 EMX1 유전자좌에서 잠재적인 절단 활성을 검출하였다(도 7)(예를 들어, 문헌[Guschin et al., 2010, Methods Mol Biol 649: 247] 참조). 모든 4개의 CRISPR 성분의 동시-트랜스펙션은 프로토스페이서 최대 5.0% 절단을 유도할 수 있었다(도 2d 참조). 또한, SpRNase III을 제한 모든 CRISPR 성분의 동시-트랜스펙션에 의해, 프로토스페이서에서 최대 4.7% 삽입-결실이 유도되었으며, 이는 crRNA 성숙을 보조할 수 있는 내인성 포유동물 RNase, 예를 들어, 관련 Dicer 및 Drosha 효소가 존재할 수 있음을 시사한다. 남아 있는 3개 성분 중 임의의 것의 제거에 의해, CRISPR 시스템의 게놈 절단 활성이 없어졌다(도 2d). 표적 유전자좌를 함유하는 앰플리콘(amplicon)의 생거(Sanger) 시퀀싱에 의해, 절단 활성이 입증되었으며: 43개의 시퀀싱된 클론 중에, 5개의 돌연변이된 대립형질(11.6%)이 관찰되었다. 다양한 가이드 서열을 사용하는 유사한 실험에 의해, 29%만큼 높은 삽입-결실 백분율을 생성하였다(도 3 내지 6, 10 및 11 참조). 이들 결과는 포유동물 세포에서의 효율적인 CRISPR-매개의 게놈 변형을 위한 3-성분 시스템을 정의한다. 절단 효율을 최적화시키기 위하여, 본 발명자들은 또한 상이한 아이소형의 tracrRNA가 절단 효율에 영향을 미치는지를 시험하였으며, 이러한 예시적인 시스템에서, 오직 짧은(89-bp) 전사물 형태만이 인간 EMX1 게놈 유전자좌의 절단을 매개할 수 있는 것이 관찰되었다(도 6b).
도 12는 포유동물 세포에서의 crRNA 가공의 추가의 노던 블롯 분석을 제공한다. 도 12A는 2개의 직접 반복부가 측부 배치된 단일의 스페이서(DR-EMX1(1)-DR)에 대한 발현 벡터를 보여주는 개략도를 예시한다. 인간 EMX1 유전자좌 프로토스페이서 1을 표적화하는 30 bp 스페이서(도 6 참조) 및 직접 반복부 서열은 도 12A 아래의 서열에 나타나 있다. 선은 역-상보 서열을 사용하여 EMX1(1) crRNA 검출을 위한 노던 블롯 프로브를 생성한 영역을 나타낸다. 도 12B는 DR-EMX1(1)-DR을 지니는 U6 발현 작제물로 트랜스펙션된 293FT 세포로부터 추출된 전체 RNA의 노던 블롯 분석을 보여준다. 좌측 및 우측 패널은 각각 SpRNase III의 부재 또는 존재 하에 트랜스펙션된 293FT 세포로부터의 것이다. DR-EMX1(1)-DR은 SpCas9 및 짧은 tracrRNA의 존재 하에서만 성숙 crRNA로 처리되었고, SpRNase III의 존재에 따라 달라지지 않았다. 트랜스펙션된 293FT 전체 RNA로부터 검출된 성숙 crRNA는 약 33 bp이며, 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 39 내지 42 bp 성숙 crRNA보다 더 짧다. 이들 결과는 CRISPR 시스템이 진핵 세포로 이식될 수 있으며, 내인성 포유동물 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 용이하게 하도록 재프로그램화될 수 있음을 보여준다.
도 2는 이러한 실시예에 기술된 박테리아 CRISPR 시스템을 예시한다. 도 2a는 스트렙토코커스 피오게네스 SF370으로부터의 CRISPR 유전자좌 1 및 이러한 시스템에 의한 제안된 CRISPR-매개의 DNA 절단의 메카니즘을 보여주는 개략도를 예시한다. 직접 반복부-스페이서 어레이로부터 가공된 성숙 crRNA는 Cas9를 상보성 프로토스페이서 및 프로토스페이서-인접 모티프(PAM)로 구성된 게놈 표적에 지향시킨다. 표적-스페이서 염기 쌍형성 시에, Cas9는 표적 DNA에서 이중 가닥 파단을 매개한다. 도 2b는 포유동물 핵으로의 유입을 가능하게 하는 핵 국소화 신호(NLS)가 있는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9(SpCas9) 및 RNase III(SpRNase III)의 조작을 예시한다. 도 2c는 정밀한 전사 개시 및 종결을 촉진하기 위한 구성성 EF1a 프로모터에 의해 유도되는 SpCas9 및 SpRNase III 및 RNA Pol3 프로모터 U6에 의해 유도되는 tracrRNA 및 pre-crRNA 어레이(DR-스페이서-DR)의 포유동물 발현을 예시한다. 만족스러운 PAM 서열이 있는 인간 EMX1 유전자좌로부터의 프로토스페이서는 pre-crRNA 검정에서 스페이서로 사용된다. 도 2d는 SpCas9-매개의 최소 삽입 및 결실을 위한 서베이어 뉴클레아제 검정을 예시한다. SpRNase III, tracrRNA 및 EMX1-표적 스페이서를 지니는 pre-crRNA 어레이의 존재 및 부재 하에 SpCas9를 발현시켰다. 도 2e는 표적 유전자좌와 EMX1-표적화 crRNA 사이의 염기 쌍형성의 개략적 표현, 및 SpCas9 절단 부위에 인접한 마이크로 결실을 보이는 예시적인 크로마토그램을 예시한다. 도 2f는 다양한 마이크로 삽입 및 결실을 보이는 43개의 클론 앰플리콘의 시퀀싱 분석으로부터 확인된 돌연변이된 대립형질을 예시한다. 줄표는 결실된 염기를 나타내며, 비-정렬 또는 미스매치된 염기는 삽입 또는 돌연변이를 나타낸다. 스케일 바(scale bar) = 10 ㎛.
3-성분 시스템을 더욱 단순화시키기 위하여, 키메라 crRNA-tracrRNA 하이브리드 설계를 조정하였으며, 여기서, 성숙 crRNA(가이드 서열 포함)는 스템-루프를 통해 부분 tracrRNA에 융합되어, 천연 crRNA:tracrRNA 듀플렉스를 모방할 수 있다. 동시-전달 효율을 증가시키기 위하여, 비시스트로닉 발현 벡터를 생성하여, 트랜스펙션된 세포에서 키메라 RNA 및 SpCas9의 동시-발현을 유도하였다. 병행하여, 비시스트로닉 벡터를 사용하여 SpCas9와 함께 pre-crRNA(DR-가이드 서열-DR)를 발현하여, 따로 발현되는 tracrRNA와 함께 crRNA로 가공되도록 유도하였다(도 11B 상부 및 하부 비교). 도 8은 hSpCas9가 있는 pre-crRNA 어레이(도 8A) 또는 키메라 crRNA(도 8B에서 가이드 서열 삽입 부위의 하류 및 EF1α 프로모터의 상류에 짧은 선으로 표현)에 대한 비시스트로닉 발현 벡터의 개략적 표현을 제공하며, 다양한 요소의 위치 및 가이드 서열 삽입 점을 보여준다. 도 8B에서 가이드 서열 삽입 부위의 위치 주위의 확대된 서열은 또한 부분 DR 서열(GTTTTAGAGCTA)(SEQ ID NO: 11) 및 부분 tracrRNA 서열(TAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTT)(SEQ ID NO: 12)을 보여준다. 가이드 서열은 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 BbsI 부위 사이에 삽입될 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 서열 설계는 도 8에서 개략적 표현 밑에 나타나 있으며, 적절한 라이게이션 어댑터가 표기되어 있다. WPRE는 우드척(Woodchuck) 간염 바이러스 전사후 조절 요소를 나타낸다. 키메라 RNA-매개의 절단의 효율을 상기 기술된 동일한 EMX1 유전자좌를 표적화함으로써 시험하였다. 앰플리콘의 서베이어 검정 및 생거 시퀀싱 둘 모두를 사용하여, 본 발명자들은 키메라 RNA 설계가 대략 4.7% 변형률로, 인간 EMX1 유전자좌의 절단을 용이하게 하는 것을 확인하였다(도 3).
인간 EMX1 및 PVALB, 및 마우스 Th 유전자좌 내의 다수의 영역을 표적화하는 키메라 RNA를 설계하여 인간 및 마우스 세포 둘 모두에서 추가의 게놈 유전자좌를 표적화함으로써 진핵 세포에서 CRISPR-매개의 절단의 일반화가능성을 시험하였다. 도 13은 인간 PVALB(도 13A) 및 마우스 Th(도 13B) 유전자좌에서의 일부 추가의 표적화된 프로토스페이서의 선택을 예시한 것이다. 유전자좌의 개략도 및 각각의 마지막 엑손 내의 3개의 프로토스페이서의 위치가 제공된다. 밑줄이 있는 서열은 30 bp의 프로토스페이서 서열 및 3' 말단에서 PAM 서열에 상응하는 3 bp를 포함한다. 센스 및 안티-센스 가닥 상의 프로토스페이서는 각각 DNA 서열 상측 및 하측에 표기되어 있다. 인간 PVALB 및 마우스 Th 유전자좌 각각에 대하여 6.3% 및 0.75%의 변형률이 달성되었으며, 이는 다수의 유기체에 걸쳐 상이한 유전자좌의 변형에서의 CRISPR 시스템의 넓은 응용가능성을 입증한다(도 5). 키메라 작제물을 사용하여 각 유전자좌에 대하여 3개의 스페이서 중 1개에서만 절단이 검출되었지만, 동시-발현되는 pre-crRNA 배열을 사용하는 경우 27%에 미치는 삽입-결실 생성 효율로, 모든 표적 서열이 절단되었다(도 6 및 도 13).
도 11은 SpCas9가 포유동물 세포에서 다수의 게놈 유전자좌를 표적화하도록 재프로그램화될 수 있다는 추가의 예시를 제공한다. 도 11A는 5개의 프로토스페이서의 위치를 밑줄이 있는 서열로 나타내어 보여주는 인간 EMX1 유전자좌의 개략도를 제공한다. 도 11B는 pre-crRNA의 직접 반복부 영역과 tracrRNA 간의 혼성화를 보여주는 pre-crRNA/trcrRNA 복합체의 개략도(상측) 및 20 bp 가이드 서열, 및 헤어핀 구조로 혼성화되는 부분 직접 반복부 및 tracrRNA 서열로 구성된 tracr 메이트 서열 및 tracr 서열을 포함하는 키메라 RNA 설계의 개략도(하측)를 제공한다. 인간 EMX1 유전자좌 내의 5개의 프로토스페이서에서의 Cas9-매개의 절단의 효능을 비교하는 서베이어 검정의 결과는 도 11C에 예시되어 있다. 각각의 프로토스페이서는 가공된 pre-crRNA/tracrRNA 복합체(crRNA) 또는 키메라 RNA(chiRNA)를 사용하여 표적화된다.
RNA의 2차 구조가 분자간 상호작용에 결정적일 수 있기 때문에, 최소 자유 에너지 및 볼쯔만(Boltzmann)-가중 구조 앙상블에 기초한 구조 예측 알고리즘을 사용하여 게놈 표적화 실험에 사용되는 모든 가이드 서열의 추정상 2차 구조를 비교하였다(예를 들어, 문헌[Gruber et al., 2008, Nucleic Acids Research, 36: W70] 참조). 분석에 의해, 대부분의 경우에, 키메라 crRNA 맥락에서 효율적인 가이드 서열에 2차 구조 모티프가 실질적으로 없지만, 비효율적인 가이드 서열은 표적 프로토스페이서 DNA와의 염기 쌍형성을 막을 수 있는 내부 2차 구조를 형성할 가능성이 더 큰 것으로 드러났다. 따라서, 키메라 crRNA를 사용하는 경우, 스페이서 2차 구조의 가변성이 CRISPR-매개 간섭의 효율에 영향을 미칠 수 있다.
SpCas9에 대한 추가의 벡터 설계는 도 22에 나타나 있으며, 이는 가이드 올리고에 대한 삽입 부위에 연결된 U6 프로모터 및 SpCas9 코딩 서열에 연결된 Cbh 프로모터를 혼입한 단일의 발현 벡터를 예시한다. 도 22b에 나타낸 벡터는 H1 프로모터에 연결된 tracrRNA 코딩 서열을 포함한다.
박테리아 검정에서, 모든 스페이서는 효율적인 CRISPR 간섭을 촉진시켰다(도 3c). 이들 결과는 포유동물 세포에서 CRISPR 활성의 효율에 영향을 미치는 추가의 인자가 존재할 수 있음을 시사한다.
CRISPR-매개의 절단의 특이성을 조사하기 위하여, 포유동물 게놈에서 프로토스페이서 절단에 대한 가이드 서열 내의 단일-뉴클레오티드 돌연변이의 영향을, 단일의 점 돌연변이가 있는 일련의 EMX1-표적화 키메라 crRNA를 사용하여 분석하였다(도 3a). 도 3b는 상이한 돌연변이 키메라 RNA와 쌍을 형성하는 경우, Cas9의 절단 효율을 비교하는 서베이어 뉴클레아제 검정의 결과를 예시한다. PAM의 최대 12-bp 5'의 단일-염기 미스매치는 SpCas9에 의한 게놈 절단을 없애는 한편, 더 먼 상류 위치에 돌연변이가 있는 스페이서는 원래의 프로토스페이서 표적에 대한 활성을 보유하였다(도 3b). PAM에 더하여, SpCas9는 마지막 12-bp의 스페이서 내에 단일-염기 특이성을 갖는다. 또한, CRISPR은 동일한 EMX1 프로토스페이서를 표적화하는 TALE 뉴클레아제(TALEN)의 쌍만큼 효율적으로 게놈 절단을 매개할 수 있다. 도 3c는 EMX1을 표적화하는 TALEN의 설계를 보여주는 개략도를 제공하며, 도 3d는 TALEN 및 Cas9의 효율을 비교하는 서베이어 겔을 보여준다(n=3).
오류-유발 NHEJ 메카니즘을 통해 포유동물 세포에서 CRISPR-매개의 유전자 교정을 달성하기 위한 성분의 세트를 확립하면, 상동성 재조합(HR), 게놈에서 정밀한 교정을 이루기 위한 고충실도 유전자 수복 경로를 자극하는 CRISPR의 능력을 시험하였다. 야생형 SpCas9는 부위-특이적 DSB를 매개할 수 있는데, 이는 NHEJ 및 HR 둘 모두를 통해 수복될 수 있다. 또한, SpCas9의 RuvC I 촉매 도메인에서의 아스파르트산염에서 알라닌으로의 치환(D10A)을 조작하여 뉴클레아제를 닉카아제로 전환시켜(SpCas9n; 도 4a에 예시)(예를 들어, 문헌[Sapranausaks et al., 2011, Nucleic Acids Research, 39: 9275]; 문헌[Gasiunas et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109:E2579] 참조), 닉이 있는 게놈 DNA가 고-충실도 상동성-유도 수복(HDR)을 겪게 하였다. 서베이어 검정에 의해, SpCas9n이 EMX1 프로토스페이서 표적에서 삽입-결실을 생성하지 않음이 확인되었다. 도 4b에 예시된 바와 같이, EMX1-표적화 키메라 crRNA와 SpCas9의 동시-발현에 의해, 표적 부위에서 삽입-결실이 생성되는 한편, SpCas9n과의 동시-발현은 그렇지 않았다(n=3). 또한, 327개 앰플리콘의 시퀀싱에 의해, SpCas9n에 의해 유도되는 임의의 삽입-결실이 검출되지 않았다. 동일한 유전자좌를 선택하여, HEK 293FT 세포를 EMX1, hSpCas9 또는 hSpCas9n을 표적화하는 키메라 RNA, 및 프로토스페이서 근처에 제한 부위(HindIII 및 NheI)의 쌍을 도입하기 위한 HR 주형으로 동시-트랜스펙션시킴으로써 CRISPR-매개의 HR을 시험하였다. 도 4c는 재조합 지점 및 프라이머 어닐링 서열(화살표)의 상대적 위치와 함께, HR 전략의 개략적 예시를 제공한다. SpCas9 및 SpCas9n은 실제로 HR 주형이 EMX1 유전자좌로 통합되는 것을 촉매작용시킨다. 표적 영역의 PCR 증폭 후에, HindIII를 사용한 제한 분해에 의해, 예상되는 단편 크기(도 4d에 나타낸 제한 단편 길이 다형성 겔 분석에서 화살표)에 상응하는 절단 산물이 나타났으며, SpCas9 및 SpCas9n은 유사한 수준의 HR 효율을 매개한다. 본 발명자들은 게놈 앰플리콘의 생거 시퀀싱을 사용하여 HR을 추가로 입증하였다(도 4e). 이들 결과는 포유동물 게놈 내로의 표적화된 유전자 삽입을 촉진시키기 위한 CRISPR의 유용성을 입증한다. 야생형 SpCas9의 14-bp(스페이서로부터 12-bp 및 PAM으로부터 2-bp) 표적 특이성을 고려하여, 단일 가닥 파단이 오류-유발 NHEJ 경로에 대한 기질이 아니기 때문에, 닉카아제의 이용가능성은 표적외 변형 가능성을 상당히 감소시킬 수 있다.
배열된 스페이서가 있는 CRISPR 유전자좌의 천연 구조를 모방하는 발현 작제물(도 2a)을 작제하여, 다중 서열 표적화의 가능성을 시험하였다. EMX1- 및 PVALB-표적화 스페이서의 쌍을 인코딩하는 단일의 CRISPR 어레이를 사용하여, 둘 모두의 유전자좌에서의 효율적인 절단이 검출되었다(도 4f, crRNA 어레이의 개략적 설계 및 효율적인 절단의 매개를 보여주는 서베이어 블롯을 보여줌). 119 bp 만큼 이격된 EMX1 내의 2개의 표적에 대한 스페이서를 사용하여 동시 발생 DSB을 통한 보다 큰 게놈 영역의 표적화된 결실도 또한 시험하고, 1.6% 결실 효능(182개 앰플리콘 중 3개; 도 4g)을 검출하였다. 이는 CRISPR 시스템이 단일의 게놈 내에서 다중화 교정을 매개할 수 있음을 나타낸다.
실시예 2: CRISPR 시스템 변형 및 대안
서열-특이적 DNA 절단을 프로그램화시키기 위하여 RNA를 사용하는 능력은 다양한 연구 및 산업 응용을 위한 신규한 부류의 게놈 조작 도구를 정한다. CRISPR 시스템의 몇몇 양태를 추가로 향상시켜, CRISPR 표적화의 효율 및 다능성을 증가시킬 수 있다. 최적의 Cas9 활성은 포유동물 핵에 존재하는 것보다 더 높은 수준의 유리 Mg2 +의 이용가능성에 따라 달라질 수 있으며(예를 들어, 문헌[Jinek et al., 2012, Science, 337:816] 참조), 프로토스페이서의 인접 하류 NGG 모티프에 대한 선호는 인간 게놈에서 평균하여 12-bp 마다를 표적화하는 능력을 제한한다(도 9, 인간 염색체 서열의 + 및 - 가닥 둘 모두를 평가). 이들 제약 중 일부는 미생물 메타게놈에 걸친 CRISPR 유전자좌의 다양성을 연구함으로써 극복될 수 있다(예를 들어, 문헌[Makarova et al., 2011, Nat Rev Microbiol, 9:467] 참조). 다른 CRISPR 유전자좌는 실시예 1에 기술된 것과 유사한 과정에 의해 포유동물 세포 환경으로 이식될 수 있다. 예를 들어, 도 10은 CRISPR-매개의 게놈 교정을 달성하기 위한, 포유동물 세포에서의 이종 발현을 위한 스트렙토코커스 써모필러스 LMD-9의 CRISPR 1으로부터의 II형 CRISPR 시스템의 조정을 예시한다. 도 10a는 스트렙토코커스 써모필러스 LMD-9 유래의 CRISPR 1의 개략적 표현을 제공한다. 도 10b는 스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR 시스템에 대한 발현 시스템의 설계를 예시한다. 인간 코돈-최적화 hStCas9는 구성성 EF1α 프로모터를 사용하여 발현된다. 성숙 버전의 tracrRNA 및 crRNA는 U6 프로모터를 사용하여 발현되어, 정밀한 전사 개시를 조장한다. 성숙 crRNA 및 tracrRNA로부터의 서열이 예시되어 있다. crRNA 서열에서 소문자 "a"로 표기된 단일의 염기를 사용하여 RNA polIII 전사 종결자로 제공되는 polyU 서열을 제거한다. 도 10c는 인간 EMX1 유전자좌를 표적화하는 가이드 서열을 보여주는 개략도를 제공한다. 도 10d는 서베이어 검정을 사용한 표적 유전자좌에서의 hStCas9-매개의 절단의 결과를 보여준다. RNA 가이드 스페이서 1 및 2는 각각 14% 및 6.4%를 유도하였다. 이들 2개의 프로토스페이서 부위에서의 생물학적 반복 검증에 걸친 절단 활성의 통계적 분석도 또한 도 5에 제공된다. 도 14는 인간 EMX1 유전자좌에서의 스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR 시스템의 추가의 프로토스페이서 및 상응하는 PAM 서열 표적의 개략도를 제공한다. 2개의 프로토스페이서 서열이 강조표시되어 있으며, NNAGAAW 모티프를 만족시키는 그들의 상응하는 PAM 서열은 상응하는 강조표시된 서열에 대하여 3'에 밑줄을 침으로써 표기된다. 둘 모두의 프로토스페이서는 안티-센스 가닥을 표적화한다.
실시예 3: 샘플 표적 서열 선택 알고리즘
소프트웨어 프로그램을 설계하여, 특정 CRISPR 효소에 대하여 요망되는 가이드 서열 길이 및 CRISPR 모티프 서열(PAM)에 기초하여 투입 DNA 서열의 둘 모두의 가닥에서 후보 CRISPR 표적 서열을 확인한다. 예를 들어, PAM 서열 NGG가 있는 스트렙토코커스 피오게네스 유래의 Cas9에 대한 표적 부위는 투입 서열, 및 투입 서열의 역-상보물 둘 모두에서 5'-Nx-NGG-3'을 검색함으로써 확인될 수 있다. 마찬가지로, PAM 서열 NNAGAAW가 있는 스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR1의 Cas9에 대한 표적 부위는 투입 서열, 및 투입 서열의 역-상보물 둘 모두에서 5'-Nx-NNAGAAW-3'을 검색함으로써 확인될 수 있다. 마찬가지로, PAM 서열 NGGNG가 있는 스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR3의 Cas9에 대한 표적 부위는 투입 서열, 및 투입 서열의 역-상보물 둘 모두에서 5'-Nx-NGGNG-3'을 검색함으로써 확인될 수 있다. Nx에서 값 "x"는 프로그램에 의해 고정되거나, 사용자에 의해 지정될 수 있으며, 예를 들어, 20일 수 있다.
게놈에서의 DNA 표적 부위의 다수의 존재가 비특이적인 게놈 교정을 야기할 수 있기 때문에, 모든 가능한 부위를 확인한 후에, 프로그램은 그들이 관련 참조 게놈에 나타나는 횟수에 기초하여 서열을 필터링한다. 서열 특이성이 '씨드(seed)' 서열, 예를 들어, PAM 서열 그 자체를 포함하여 PAM 서열로부터 5'의 11 내지 12 bp에 의해 결정되는 CRISPR 효소에 있어서, 필터링 단계는 씨드 서열에 기초하여 이루어질 수 있다. 따라서, 추가의 게놈 유전자좌에서 교정을 피하기 위하여, 결과는 관련 게놈에서의 씨드:PAM 서열의 발생 수에 기초하여 필터링된다. 사용자가 씨드 서열의 길이를 선택하게 할 수 있다. 또한, 필터를 통과시키기 위하여, 사용자가 게놈 내의 씨드:PAM 서열의 발생 수를 지정하게 할 수 있다. 디폴트는 독특한 서열에 대하여 스크리닝하는 것이다. 여과 수준은 씨드 서열의 길이와 게놈에서의 서열의 발생 수 둘 모두를 변화시킴으로써 변경된다. 프로그램은 추가로 또는 대안적으로, 확인된 표적 서열(들)의 역 상보물을 제공함으로써 보고된 표적 서열(들)에 상보적인 가이드 서열의 서열을 제공할 수 있다. 인간 게놈 내의 일부 표적 부위의 예시적인 가시화는 도 18에 제공되어 있다.
서열 선택을 최적화시키기 위한 방법 및 알고리즘의 추가의 상세사항은 본원에 참조로 포함되는 미국 출원 제61/064,798호(대리인 사건 번호 44790.11.2022; 브로드 참조번호 BI-2012/084)에서 찾을 수 있다.
실시예 4: 다중 키메라 crRNA-tracrRNA 하이브리드의 평가
본 실시예는 상이한 길이의 야생형 tracrRNA 서열이 혼입된 tracr 서열을 갖는 키메라 RNA(chiRNA; 단일의 전사물에 가이드 서열, tracr 메이트 서열 및 tracr 서열을 포함)에 대해 수득된 결과를 기술한다. 도 16a는 키메라 RNA 및 Cas9에 대한 비시스트로닉 발현 벡터의 개략도를 예시한다. Cas9는 CBh 프로모터에 의해 유도되며, 키메라 RNA는 U6 프로모터에 의해 유도된다. 키메라 가이드 RNA는 표기된 바와 같은 다양한 위치에서 절단되는 tracr 서열(하부 가닥의 처음 "U"에서 전사물의 마지막까지 계속)에 연결된 20 bp 가이드 서열(N)로 구성된다. 가이드 및 tracr 서열은 tracr-메이트 서열 GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO: 13)에 이어서 루프 서열 GAAA에 의해 분리된다. 인간 EMX1 및 PVALB 유전자좌에서의 Cas9-매개의 삽입-결실에 대한 서베이어 검정의 결과는 각각 도 16b 및 도 16c에 예시되어 있다. 화살표는 예상된 서베이어 단편을 나타낸다. chiRNA는 그들의 "+n" 표기로 표시되며, crRNA는 가이드 및 tracr 서열이 개별 전사물로서 발현되는 하이브리드 RNA를 지칭한다. 3벌로 수행되는 이들 결과의 정량화는 각각 도 16b 및 도 16c에 상응하는 도 17a 및 도 17b의 히스토그램에 의해 예시되어 있다("N.D."는 삽입-결실이 검출되지 않음을 나타낸다). 프로토스페이서 ID 및 그들의 상응하는 게놈 표적, 프로토스페이서 서열, PAM 서열 및 가닥 위치는 표 D에 제공되어 있다. 하이브리드 시스템에서 개별 전사물의 경우에는 전체 프로토스페이서 서열에 상보적이거나, 키메라 RNA의 경우에는 밑줄이 있는 부분에만 상보성이도록 가이드 서열을 설계하였다.
Figure pct00022
가이드 서열을 최적화시키기 위한 추가의 상세사항은 본원에 참조로 포함되는 미국 출원 제61/836,127호(대리인 사건 번호 44790.08.2022; 브로드 참조번호 BI-2013/004G)에서 찾을 수 있다.
먼저, 인간 HEK 293FT 세포에서 EMX1 유전자좌 내의 3개의 부위를 표적화시켰다. 각 chiRNA의 게놈 변형 효율을 서베이어 뉴클레아제 검정을 사용하여 평가하였으며, 이 검정은 DNA 이중-가닥 파단(DSB) 및 비-상동성 말단 연결(NHEJ) DNA 손상 수복 경로에 의한 그들의 이후의 수복으로부터 야기되는 돌연변이를 검출한다. chiRNA(+n)로 표기된 작제물은 야생형 tracrRNA의 최대 +n 뉴클레오티드가 키메라 RNA 작제물에 포함되는 것을 나타내며, 48, 54, 67 및 85의 값이 n에 대해 사용된다. 보다 긴 야생형 tracrRNA의 단편을 함유하는 키메라 RNA(chiRNA(+67) 및 chiRNA(+85))는 모든 3개의 EMX1 표적 부위에서 DNA 절단을 매개하며, chiRNA(+85)는 특히 개별 전사물에서 가이드 및 tracr 서열을 발현하는 상응하는 crRNA/tracrRNA 하이브리드보다 상당히 더 높은 수준의 DNA 절단을 나타낸다(도 16b 및 도 17a). 또한, 하이브리드 시스템(개별 전사물로 발현되는 가이드 서열 및 tracr 서열)을 사용하여 검출가능한 절단을 제공하지 않는 PVALB 유전자좌 내의 2개의 부위를 chiRNA를 사용하여 표적화하였다. chiRNA(+67) 및 chiRNA(+85)는 2개의 PVALB 프로토스페이서에서 상당한 절단을 매개할 수 있었다(도 16c 및 도 17b).
EMX1 및 PVALB 유전자좌 내의 모든 5개의 표적에 있어서, tracr 서열 길이의 증가와 일치하는 게놈 변형 효율의 증가가 관찰되었다. 임의의 이론에 구속되지 않고, tracrRNA의 3' 말단에 의해 형성되는 2차 구조는 CRISPR 복합체 형성 비율을 향상시키는데 역할을 수행할 수 있다.
실시예 5: Cas9 다양성
CRISPR-Cas 시스템은 박테리아 및 조류에 걸쳐 다양한 종에 의해 사용되는 침투하는 외인성 DNA에 대한 적응 면역 메카니즘이다. II형 CRISPR-Cas9 시스템은 CRISPR 유전자좌로의 외래 DNA의 "획득"을 담당하는 단백질을 암호화하는 유전자의 세트 및 DNA 절단 메카니즘의 "실행"을 암호화하는 유전자의 세트로 구성되며; 이들은 DNA 뉴클레아제(Cas9), 비-코딩 트랜스활성화 cr-RNA(tracrRNA), 및 직접 반복부가 측부에 배치된 외래 DNA-유래 스페이서의 어레이(crRNAs)를 포함한다. Cas9에 의한 성숙 시에, tracRNA 및 crRNA 듀플렉스는 Cas9 뉴클레아제를 스페이서 가이드 서열에 의해 특정되는 표적 DNA 서열로 안내하며, 절단에 필요하며 각각의 CRISPR-Cas 시스템에 특이적인 표적 DNA 내의 짧은 서열 모티프 근처의 DNA에서 이중 가닥 파단을 매개한다. II형 CRISPR-Cas 시스템이 박테리아 계에서 관찰되며, Cas9 단백질 서열 및 크기, tracrRNA 및 crRNA 직접 반복부 서열, 이들 요소의 게놈 구성 및 표적 절단을 위한 모티프 요건이 매우 다양하다. 하나의 종이 다중의 별개의 CRISPR-Cas 시스템을 가질 수 있다.
본 발명자들은 공지된 Cas9에 대한 서열 상동성 및 공지된 하위도메인에 이종상동성인 구조에 기초하여 확인된 박테리아 종으로부터, HNH 엔도뉴클레아제 도메인 및 RuvC 엔도뉴클레아제 도메인을 포함하는 207개의 추정의 Cas9를 평가하였다[유진 쿠닌(Eugene Koonin) 및 키라 마카로바(Kira Makarova)로부터의 정보]. 이러한 세트의 단백질 서열 보존에 기초한 계통발생 분석에 의해, 3개 그룹의 큰 Cas9(약 1400개 아미노산) 및 2개의 작은 Cas9(약 1100개 아미노산)를 포함하는 5개 과의 Cas9가 드러났다(도 19 및 도 20a 내지 도 20f).
Cas9, 및 닉카아제 또는 DNA 결합 단백질로 전환시키기 위한 Cas9 효소의 돌연변이, 및 변경된 작용성을 갖는 그의 용도의 추가의 상세사항은 본원에 참고로 포함된 미국 출원 제61/836,101호 및 제61/835,936호(각각 대리인 사건 번호 44790.09.2022 및 4790.07.2022, 및 브로드 참조번호 BI-2013/004E 및 BI-2013/004F)에서 찾을 수 있다.
실시예 6: Cas9 오솔로그
본 출원인은 관련 PAM 서열 및 상응하는 키메라 가이드 RNA를 확인하기 위하여 Cas9 오솔로그를 분석하였다. 확대된 세트의 PAM이 있기 때문에, 게놈에 걸친 더욱 넓은 표적화가 제공되며, 또한 독특한 표적 부위의 수가 상당히 증가되고, 게놈에서 특이성 수준이 증가된 신규한 Cas9를 확인할 가능성이 제공된다.
Cas9 오솔로그의 특이성은 가이드 RNA와 그의 DNA 표적 간의 미스매치를 허용하는 각각의 Cas9의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, SpCas9의 특이성은 절단 효율에 대한 가이드 RNA 내의 돌연변이의 영향을 시험함으로써 특성화된다. 가이드 서열과 표적 DNA 간에 단일의 또는 다중의 미스매치가 있는 가이드 RNA의 라이브러리를 제조하였다. 이들 관찰에 기초하여, SpCas9에 대한 표적 부위는 하기의 지침에 기초하여 선택될 수 있다:
특정 유전자를 교정하기 위하여 SpCas9 특이성을 최대화시키기 위하여, 가능한 '오프-표적' 게놈 서열이 하기의 4개의 제약을 따르도록 대상 유전자좌 내에서 표적 부위를 선택해야 한다: 다른 무엇보다도 더, 그들은 5'-NGG 또는 NAG 서열 중 어느 하나를 갖는 PAM이 뒤따르지 않아야 한다. 두번째로, 표적 서열에 대한 그들의 전체 서열 유사성은 최소화되어야 한다. 세번째로, 최대 개수의 미스매치는 오프-표적 부위의 PAM-근위 영역 내에 있어야 한다. 마지막으로, 최대 개수의 미스매치는 연속적이거나, 4개 미만의 염기만큼 떨어져 이격되어야 한다.
다른 Cas9 오솔로그의 특이성을 평가하고, 표적 종의 게놈 내의 특정 표적 부위의 선택을 위한 기준을 확립하기 위해 유사한 방법을 사용할 수 있다. 이전에 언급된 바와 같이, 이러한 세트의 단백질 서열 보존에 기초한 계통 분석에 의해, 3개 그룹의 큰 Cas9(약 1400개 아미노산) 및 2개의 작은 Cas9(약 1100개 아미노산)를 포함하는 5개 과의 Cas9가 드러났다(도 19 및 도 20a 내지 도 20f 참조). Cas 오솔로그에 대한 추가의 상세사항은 본원에 참조로 포함된 미국 출원 제61/836,101호 및 제61/835,936호(각각 대리인 사건 번호 44790.09.2022 및 4790.07.2022, 및 브로드 참조번호 BI-2013/004E 및 BI-2013/004F)에서 찾을 수 있다.
실시예 7: 식물 유전자를 표적화하고 이를 조작하기 위한 Cas9를 사용한 식물(미세-조류)의 조작
Cas9의 전달 방법
방법 1: 본 발명자들은 구성성 프로모터, 예를 들어, Hsp70A-Rbc S2 또는 베타2-투불린의 제어 하에 Cas9를 발현하는 벡터를 사용하여 Cas9 및 가이드 RNA를 전달한다.
방법 2: 본 발명자들은 구성성 프로모터, 예를 들어, Hsp70A-Rbc S2 또는 베타2-투불린의 제어 하에 Cas9 및 T7 중합효소를 발현하는 벡터를 사용하여 Cas9 및 T7 중합효소를 전달한다. 가이드 RNA는 가이드 RNA를 유도하는 T7 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 전달될 것이다.
방법 3: 본 발명자들은 Cas9 mRNA 및 시험관내 전사된 가이드 RNA를 조류 세포로 전달한다. RNA는 시험관내 전사될 수 있다. Cas9 mRNA는 Cas9에 대한 코딩 영역, 및 Cop1으로부터의 3'UTR로 구성되어, Cas9 mRNA의 안정화를 보장할 것이다.
상동성 재조합을 위하여, 본 발명자들은 추가의 상동성 유도 수복 주형을 제공한다.
베타-2 투불린 프로모터에 이어서 Cop1의 3' UTR의 제어 하에 Cas9의 발현을 유도하는 카세트에 대한 서열
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
베타-2 투불린 프로모터에 이어서 Cop1의 3' UTR의 제어 하에 T7 중합효소의 발현을 유도하는 카세트에 대한 서열:
Figure pct00026
Figure pct00027
T7 프로모터에 의해 유도되는 가이드 RNA의 서열(T7 프로모터, N은 표적화 서열을 나타낸다):
Figure pct00028
유전자 전달:
클라미도모나스(Chlamydomonas) 자원 센터로부터의 클라미도모나스 라인하르티이(Chlamydomonas reinhardtii) 균주 CC-124 및 CC-125는 전기천공법을 위해 사용될 것이다. 전기천공법 프로토콜은 진아트(GeneArt) 클라미도모나스 조작 키트로부터의 표준 권고 프로토콜을 따른다.
또한, 본 발명자들은 Cas9를 구성적으로 발현하는 클라미도모나스 라인하르티이의 세포주를 생성한다. 이는 pChlamy1(PvuI을 사용하여 선형화)을 사용하고, 하이그로마이신 내성 콜로니를 선택하여 행해질 수 있다. Cas9를 함유하는 pChlamy1에 대한 서열은 하기에 나타나 있다. 이러한 방식으로 유전자 녹아웃을 달성하기 위하여, 간단하게 가이드 RNA를 위해 RNA를 전달할 필요가 있다. 상동성 재조합을 위하여, 본 발명자들은 가이드 RNA 및 선형화된 상동성 재조합 주형을 전달한다.
pChlamy1-Cas9:
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
모든 변형된 클라미도모나스 라인하르티이 세포에 있어서, 본 발명자들은 PCR, 서베이어 뉴클레아제 검정 및 DNA 시퀀싱을 사용하여, 성공적인 변형을 확인한다.
본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 나타나고 기술되어 있지만, 이러한 구현예가 오직 예시로만 제공되는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 수많은 변이, 변화 및 치환이 이제 본 발명으로부터 벗어남 없이, 당업자에게 일어날 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 하기의 청구범위가 본 발명의 범주를 한정하며, 이들 청구범위의 범주 내의 방법 및 구조, 및 그들의 등가물이 그에 의해 커버되는 것으로 의도된다.
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
SEQUENCE LISTING <110> THE BROAD INSTITUTE, INC. MASSACHUSETTS INSTITUTE OF TECHNOLOGY <120> CRISPR-CAS SYSTEMS AND METHODS FOR ALTERING EXPRESSION OF GENE PRODUCTS <130> 44790.99.2044 <140> PCT/US2013/074743 <141> 2013-12-12 <150> 14/054,414 <151> 2013-10-15 <150> 61/842,322 <151> 2013-07-02 <150> 61/835,931 <151> 2013-06-17 <150> 61/791,409 <151> 2013-03-15 <150> 61/748,427 <151> 2013-01-02 <150> 61/736,527 <151> 2012-12-12 <160> 181 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (21)..(22) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 1 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagaaw 27 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(12) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (13)..(14) 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DNA <213> Homo sapiens <400> 168 gtcgtggact ac 12 <210> 169 <211> 12 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 169 ggtcgtcatc aa 12 <210> 170 <211> 12 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 170 gttaacagcg tg 12 <210> 171 <211> 12 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 171 tagctaaccg tt 12 <210> 172 <211> 12 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 172 agtaaaggcg ct 12 <210> 173 <211> 12 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 173 ggtaatttcg tg 12 <210> 174 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 174 cagaagaaga agggc 15 <210> 175 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 175 ccaatgggga ggacatcgat gtcacctcca atgactaggg tggtgggcaa c 51 <210> 176 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 176 ctctggccac tccct 15 <210> 177 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 177 acatcgatgt cacctccaat gacaagcttg ctagcggtgg gcaaccacaa ac 52 <210> 178 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> 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Claims (27)

  1. Cas 단백질 및 DNA 분자를 표적화하는 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 조작된 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자를 함유하고 이를 발현하는 세포로 도입하여, 상기 하나 이상의 가이드 RNA가 상기 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌를 표적화하고, 상기 Cas 단백질이 상기 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌를 절단하여, 하나 이상의 유전자 산물의 발현을 변경시키는 단계를 포함하되, 상기 Cas 단백질 및 상기 가이드 RNA가 천연적으로 함께 발생하지 않는, 하나 이상의 유전자 산물의 발현의 변경 방법.
  2. a) 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌 내의 표적 서열과 혼성화하는 하나 이상의 CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA에 작동가능하게 연결된 제1 조절 요소,
    b) Cas 단백질에 작동가능하게 연결된 제2 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 조작된 비-천연 발생 벡터 시스템을 상기 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자를 함유하고 이를 발현하는 세포로 도입하는 단계를 포함하되,
    성분 (a) 및 (b)가 상기 시스템의 동일한 또는 상이한 벡터에 배치되어,
    상기 가이드 RNA가 상기 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌를 표적화하고, 상기 Cas 단백질이 상기 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌를 절단하여, 상기 하나 이상의 유전자 산물의 발현을 변경시키고; 상기 Cas 단백질 및 상기 가이드 RNA가 천연적으로 함께 발생하지 않는, 하나 이상의 유전자 산물의 발현의 변경 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2개 이상의 유전자 산물의 발현이 변경되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템의 벡터 또는 Cas 단백질이 하나 이상의 NLS(들)를 더 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 tracr 서열에 융합된 가이드 서열을 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 진핵 세포인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 진핵 세포가 포유동물 세포인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 인간 세포인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 단백질인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 산물의 발현이 감소되는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 산물이 단백질인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포로의 도입이 바이러스 입자, 리포솜, 전기천공법, 미세주입 또는 컨쥬게이션을 포함할 수 있는 전달 시스템에 의한 것인 방법.
  14. a) 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌 내의 표적 서열과 혼성화되는 하나 이상의 CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA에 작동가능하게 연결된 제1 조절 요소,
    b) Cas 단백질에 작동가능하게 연결된 제2 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 조작된 비-천연 발생 벡터 시스템으로서,
    성분 (a) 및 (b)가 상기 시스템의 동일한 또는 상이한 벡터에 배치되어,
    상기 가이드 RNA가 세포 내의 상기 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌를 표적화하고, 상기 Cas 단백질이 상기 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌를 절단하여, 상기 하나 이상의 유전자 산물의 발현을 변경시키며; 상기 Cas 단백질 및 상기 가이드 RNA가 천연적으로 함께 발생하지 않는, 조작된 비-천연 발생 벡터 시스템.
  15. Cas 단백질, 및 세포 내의 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌를 표적화하는 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 프로그램화가능한 조작된 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템으로서, 상기 Cas 단백질이 상기 하나 이상의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자의 게놈 유전자좌를 절단하여, 상기 하나 이상의 유전자 산물의 발현을 변경시키고; 상기 Cas 단백질 및 상기 가이드 RNA가 천연적으로 함께 발생하지 않는, 프로그램화가능한 조작된 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 2개 이상의 유전자 산물의 발현이 변경되는 시스템.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템이 하나 이상의 NLS(들)를 더 포함하는 시스템.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 tracr 서열에 융합된 가이드 서열을 포함하는 시스템.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 진핵 세포인 시스템.
  20. 제19항에 있어서, 상기 진핵 세포가 포유동물 세포인 시스템.
  21. 제20항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 인간 세포인 시스템.
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRISPR-Cas 시스템이 II형 CRISPR-Cas 시스템인 시스템.
  23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 단백질인 시스템.
  24. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 시스템.
  25. 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 산물의 발현이 감소되는 시스템.
  26. 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 산물이 단백질인 시스템.
  27. 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템이 바이러스 입자, 리포솜, 전기천공법, 미세주입 또는 컨쥬게이션을 포함하는 전달 시스템에 의해 상기 세포로 도입되는 시스템.
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