KR101833433B1 - 돼지 t 세포 및 b 세포 면역결핍 세포주 생산 및 그의 제조 방법 - Google Patents
돼지 t 세포 및 b 세포 면역결핍 세포주 생산 및 그의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주는 T 세포 및 B 세포 면역결핍과 연관된 IL2RG(Interleukin2 receptor, gamma) 유전자를 RGEN(RNA-guided Endonuclease) 시스템을 이용하여 표적 염기서열을 선택하여 IL2RG 돌연변이를 발현하는 표적 벡터를 제작하였고, 상동 재조합에 의해 형질전환된 세포를 선별하여 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주를 구축함으로써, 상기 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주를 면역 거부 반응을 극복하는 이종장기이식용 돼지에 형질전환하여, 이종장기이식시 면역 거부 반응을 극복하는데 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
Description
본 발명은 돼지 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주 생산 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
의학의 발달로 기능이 저하되거나 손상된 장기를 다른 사람의 장기 이식으로 대체하는 것이 가능해 졌지만 적합한 장기 제공자를 찾는 것이 커다란 장애 요인이 되고 있으며, 이 같은 수요와 공급의 불균형으로 매년 많은 사람들이 장기를 이식받지 못해 사망하고 있다. 이러한 불균형을 해소하기 위해 여러 가지 방법들이 연구 개발되고 있으며, 인간과 생리학적으로 가까운 돼지의 장기를 이식하는 이종장기 이식 분야도 그동안 많은 연구 성과를 이루었다. 최근에는 국내외적으로 이러한 장기부족현상을 해결하기 위해 바이오 이종장기, 인공장기, 줄기세포 분화, 생체 조직공학을 이용한 조직 재생법 등의 연구가 전임상 및 임상단계에서 진행되고 있다. 이 중 바이오 이종장기이식은 부족한 장기를 무한정 공급할 수 있을 뿐 아니라 유전공학적 기법을 이용한 환자 맞춤형 형질전환장기의 생산이 가능하다는 점에서 타분야에 비해 현실적으로 장기 부족문제를 가장 빠르게 해결할 수 있는 방법이라 할 수 있다.
이종장기이식의 가장 근본적인 문제점은 면역학적 거부반응이다. 면역학적 거부반응에는 초급성면역거부반응(HAR: hyperacute rejection)과 체액성면역거부반응(AHXR: acute humoral xenograft rejection)인 항체면역과 세포-매개성 면역이 모두 관여한다. HAR은 돼지의 혈관 내피 에피톱인 Galα 1-3 Galβ 1-4 GlcNAc(α 1,3 Gal)에 대한 인간의 자연 항체들에 의해 매개되는 것으로, 돼지를 포함한 모든 동물종에 존재하는 α 1,3 Gal을 합성하는 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라아제(α 1,3-galactosyltransferase, α 1,3 GalT)가 사람과 일부 영장류에는 존재하지 않아서 생기는 문제이다. α 1,3 Gal은 여러 미생물들에도 존재하기 때문에 여기에 노출된 사람과 일부 영장류들은 이에 대한 자연 항체를 갖게 되고, 이 항체들이 이식된 장기의 혈관 내피에 결합하면 보체계가 활성화되어 응고 과정이 활성화되어 HAR 이라 부르는 초급성(몇 분에서 몇 시간 이내) 거부반응이 일어난다. HAR은 α 1,3 Gal에 대한 자연 항체의 제거 또는 보체의 억제 등으로 효과적으로 예방할 수 있으며, HAR이 차단되면, 이식 후 며칠 혹은 몇 주 이내에 체액성면역거부반응(AHXR)이 일어난다.
RGEN(RNA-guided Endonuclease) 기술은 CRISPR/Cas 시스템을 이용한 새로운 유전자 가위 기술로서, 원하는 DNA 서열에 이중 나선 절단(Double Strand Breaks, DSBs)을 일으킬 수 있도록 유도하고, 유도된 DSB의 수리(repair) 과정을 통해 표적자리에 변이 또는 재배열을 일으킬 수 있는 기술이다.
이전의 연구를 통해 인간 배양 세포에서 RGEN 기술을 이용한 유전자 편집이 가능하다는 것이 알려진 이후 여러 동물 및 식물에서 RGEN 기술을 이용해 높은 효율로 간편하게 유전체 편집이 가능함이 밝혀졌고, 앞으로 유전공학뿐만 아니라 바이오산업 및 의학 등의 분야에서 널리 이용될 것으로 각광받고 있다. 유전자 가위를 세포에 도입할 때, 원하지 않는 DNA를 무작위로 자르게 되면 독성을 일으키거나 여러 가지 염색체 변이를 유발할 수 있기 때문에 선택적으로 표적 DNA만을 자르는 것이 매우 중요하다. RGEN의 경우, 빈번하게 표적자리 외의 DNA를 자를 수도 있다는 사실이 보고되어 다양한 분야에 응용하는데 있어서 걸림돌이 되고 있다(Seung Woo Cho et al., Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res . November 19, 2013).
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-CRISPR 관련된(CAS) 시스템은 박테리아와 고세균에서 파지와 플라스미드 침입에 대한 적응 면역 반응을 유도한다(Wiedenheft B et al., 2012. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature 482: 331.338). 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes)로부터 유래된 Cas9 단백질은 염기서열이 파지(phage)와 플라스미드(plasmid)로부터 유래된 CRISPR RNA(crRNA)와 복합체(complex)를 이루고, PAM(protospacer adjacent motif) 염기서열을 인식한다. crRNA와 tracrRNA(trans-activating crRNA)의 융합에 의해 생성된 sgRNA(single-guide RNA)도 작동하고, 특정 DNA 염기서열을 절단하는 Cas9 단백질을 재프로그램할 수 있다(Jinek M et al., 2012. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337: 816.821). 따라서, Cas9는 DNA 위치-특이적(site-specifically) 분해하는 파지와 플라스미드의 침입으로부터 미생물 세포를 보호하여 외부 유전적 요소로부터 숙주 세포의 제한 엔도뉴클레아제 매개 보호(restiction endonuclease-mediated protection)하는 RGEN이다. 제한 엔도뉴클레아제와는 달리 Cas9 특이성은 crRNA를 대체하여 쉽게 재프로그램하고, 고진핵 세포 및 생물체에서 유전자 공학을 위한 뉴클레아제(nucleases)를 생산한다. sgRNA가 상보적인 염기서열을 인지하여 결합하고, Cas9이 PAM을 인지하면, Cas9에 의해 DNA가 잘리게 된다.
최근의 연구는 Cas9으로 유래된 RGEN이 ZFN(zinc finger nucleases) 및 TALEN(transcription activator-like effector nucleases)을 포함하는 유전자 편집 뉴클레아제의 성장 패밀리(family)의 새로운 멤버가 실제로 있음을 보여 주었다(Bassett AR et al., 2013. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep 4: 220.228, Chang N et al., 2013. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res 23: 465.472, Cho SW et al., 2013a. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol 31: 230.232). 이 프로그램된 뉴클레아제는 세포에서 위치-특이적인 DNA 이중 나선 절단을 유도하고, 높은-정확도의 상동 재조합 또는 오류가 발생하기 쉬운 비상동성 말단 접합(NHEJ, non-homologousd end-joining)을 대상으로 돌연변이 또는 염색체 재배열을 발생시킨다(Bibikova M et al., 2003. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science 300: 764, Kim HJ et al., 2009. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res 19: 1279.1288, Lee HJ et al., 2009. Targeted chromosomal deletions in human cells using zinc finger nucleases. Genome Res 20: 81.89).
IL2RG(Interleukin2 receptor, gamma) 유전자(GenBank 등록번호: NM_214083)는 일반적으로 감마 체인이라는 단백질을 만들게 되는데, 이 단백질은 면역 체계의 기능에 관여하는 여러 가지 다른 수용체의 구성 요소이며 수용체에 결합하여 핵으로 신호를 전달하고 세포 내부의 일련의 화학 반응을 유발한다. 이 단백질은 수용체에 결합하여 T 세포, B 세포 및 NK세포(natural killer cell)의 증식 및 성숙을 조절한다. 이러한 세포는 바이러스를 죽이는 항체를 만들고, 전체 면역 체계를 조절하는데 도움을 준다.
이에, 본 발명자들은 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주를 생산하기 위해 연구하던 중, T 세포 및 B 세포 면역결핍과 연관된 IL2RG 유전자를 RGEN 시스템을 이용하여 표적 염기서열을 선택하여 IL2RG 돌연변이를 발현하는 표적 벡터를 제작하였고, 상동 재조합에 의해 형질전환된 세포를 선별하여 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주를 구축함으로써, 상기 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주를 면역 거부 반응을 극복하는 이종장기이식용 돼지에 형질전환하여, 이종장기이식시 면역 거부 반응을 극복하는데 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 IL2RG(Interleukin2 receptor, gamma) 유전자 또는 이의 단편, 및 Cas9 유전자가 포함된 벡터로 돼지 세포에 형질전환된 형질전환 세포주를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IL2RG(Interleukin2 receptor, gamma) 유전자 또는 이의 단편, 및 Cas9 유전자가 포함된 벡터로 돼지 세포에 형질전환된 형질전환 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 벡터 및 선택 마커(selection marker)를 포함하는 벡터를 돼지 세포에 공동 형질전환시키는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 공동 형질전환된 세포를 배양한 후 상동 재조합(homologous recombination)이 된 세포를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 돼지 세포주의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 벡터를 세포에 도입하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 벡터가 도입된 세포를 선별한 후 체세포 핵치환을 수행하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 핵치환된 세포를 발달시키는 단계를 포함하는 T 세포 및 B 세포 면역 결핍 돼지 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 T 세포 및 B 세포 면역 결핍 돼지를 제공한다.
본 발명의 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주는 T 세포 및 B 세포 면역결핍과 연관된 IL2RG(Interleukin2 receptor, gamma) 유전자를 RGEN(RNA-guided Endonuclease) 시스템을 이용하여 표적 염기서열을 선택하여 IL2RG 돌연변이를 발현하는 표적 벡터를 제작하였고, 상동 재조합에 의해 형질전환된 세포를 선별하여 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주를 구축함으로써, 상기 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주를 면역 거부 반응을 극복하는 이종장기이식용 돼지에 형질전환하여, 이종장기이식시 면역 거부 반응을 극복하는데 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
도 1은 IL2RG(Interleukin2 receptor, gamma) 유전자의 엑손(exon) 5번 낙아웃(knock-out) 시키기 위한 디자인을 나타낸 도이다:
파란색 : 확인용 프라이머(서열번호 : 12 내지 13);
초록색 : 표적 사이트(target site);
빨간색 : PAM 염기서열.
도 2는 Cas9 벡터에 표적 염기서열을 넣어 제조한 벡터를 나타낸 도이다.
도 3은 제조한 표적 벡터의 효율을 확인한 도이다:
C : 벡터를 넣지않은 야생형(wild type).
도 4는 낙인(knock-in) 벡터 디자인 및 낙인 벡터를 확인한 도이다.
도 5는 표적 벡터와 낙인 벡터의 모식도와 확인용 프라이머의 위치를 나타낸 도이다.
도 6는 구축된 세포주를 전기영동으로 확인한 도이다.
파란색 : 확인용 프라이머(서열번호 : 12 내지 13);
초록색 : 표적 사이트(target site);
빨간색 : PAM 염기서열.
도 2는 Cas9 벡터에 표적 염기서열을 넣어 제조한 벡터를 나타낸 도이다.
도 3은 제조한 표적 벡터의 효율을 확인한 도이다:
C : 벡터를 넣지않은 야생형(wild type).
도 4는 낙인(knock-in) 벡터 디자인 및 낙인 벡터를 확인한 도이다.
도 5는 표적 벡터와 낙인 벡터의 모식도와 확인용 프라이머의 위치를 나타낸 도이다.
도 6는 구축된 세포주를 전기영동으로 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 IL2RG(Interleukin2 receptor, gamma) 유전자 또는 이의 단편, 및 Cas9 유전자가 포함된 벡터로 돼지 세포에 형질전환된 형질전환 세포주를 제공한다.
상기 IL2RG 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하고, 상기 단편은 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하다.
상기 벡터는 U6 프로모터, IL2RG 유전자 또는 이의 단편, CBh 프로모터 및 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes) Cas9 유전자를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 벡터는 서열번호 2로 기재되는 IL2RG 유전자 단편이 결합된 PX330-Cas9 벡터인 것이 바람직하다.
상기 돼지 세포는 돼지 섬유아세포(fibroblast)인 것이 바람직하다.
상기 돼지 세포에 벡터의 도입은 형질전환(transfection), 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), 미세주입(microinjection) 또는 총알식 도입(ballistic introduction) 방법이 모두 이용가능하며 본 발명에서는 형질전환을 이용하였다. 상기 형질전환을 위해 벡터에 혼합하는 리포좀은 리포펙틴(lipofectin), 리포펙타민(lipofectamine), 올리고펙틴(oligofectin), 도탑(dotap), 수퍼펙트(superfect)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있으며 본 발명에서는 리포펙타민을 이용하였다.
상기 벡터는 RGEN(RNA-guided Endonuclease) 기술을 이용하는 것이 바람직하고, IL2RG 유전자에 표적 염기서열을 정하여 디자인하고, PAM(protospacer adjacent motif) 염기서열을 인식하여 표적 염기서열을 절단하도록 Cas9 단백질을 포함한 벡터를 제작하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 이로 인해 위치-특이적으로 Cas9 단백질이 지정한 위치의 IL2RG 유전자를 절단하도록 유도한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 돼지 X 염색체(X-chromosome) 내에 서열번호 1로 기재되는 IL2RG 유전자의 엑손(exon) 5번을 낙아웃(knock-out) 시키기 위해 도 1과 같이 RGEN 표적 디자인하였다(도 1 참조).
또한, 본 발명자들은 실시예 <1-1>에서 정한 표적 부분에 상보적인 염기서열을 제작하여, 혼성화(hybridization) 시키고, 이렇게 얻은 생성물과 PX330-U6-cas9 벡터(addgene)를 제한효소(BbsⅠ)로 자른 후, 결합시켜서(ligation) 각각의 타켓 벡터를 제조하였다. 이렇게 제조한 벡터는 시퀀싱을 통하여 확인하였다(도 2 참조).
또한, 본 발명자들은 제조한 벡터의 효율을 확인한 결과, 서열번호 2로 기재되는 타켓 염기서열을 갖는 1번 표적 벡터가 가장 효율이 높은 것을 확인하였고(도 3 참조), 네오마이신 선택 마커(selection marker)가 들어있는 벡터를 이용하여 표적 부분 양쪽 5', 3' arm(3A, 5A)의 염기서열을 넣어 낙인(knock-in) 벡터(LFNFTDT-pIL2RG3A-5A)를 디자인하였다(도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 PX330-cas9 표적 벡터와 낙인 벡터(LFNFTDT-pIL2RG3A-5A)를 PEF 세포에 Amaxa 전기천공법(electroporation)으로 형질전환한 후, G418(Gibco)을 300 ng/ml로 처리하여 네오마이신 내성 유전자가 들어있는 세포를 48시간마다 배지를 교체해주면서 선별하였다(도 5 참조). 이렇게 선별된 세포를 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후 전기영동으로 확인한 결과, PX330-cas9 표적 벡터와 낙인 벡터(LFNFTDT-pIL2RG3A-5A)가 모두 들어가서 디자인한 대로 IL2RG의 표적 부분이 낙아웃된 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주를 구축하였다(도 6 참조).
따라서, 본 발명의 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주는 T 세포 및 B 세포 면역결핍과 연관된 IL2RG 유전자를 RGEN 시스템을 이용하여 표적 염기서열을 선택하여 IL2RG 돌연변이를 발현하는 표적 벡터를 제작하였고, 상동 재조합에 의해 형질전환된 세포를 선별하여 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주를 구축함으로써, 상기 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주를 면역 거부 반응을 극복하는 이종장기이식용 돼지에 형질전환하여, 이종장기이식시 면역 거부 반응을 극복하는데 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은
1) 상기 벡터 및 선택 마커를 포함하는 벡터를 돼지 세포에 공동 형질전환시키는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 공동 형질전환된 세포를 배양한 후 상동 재조합(homologous recombination)이 된 세포를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 돼지 세포주의 제조 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 선택 마커는 네오마이신(neomycin), 퓨로마이신(puromycin), 히그로마이신(hygromycin) 및 제오신(zeocin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 네오마이신, 퓨로마이신 및 히그로마이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 보다 바람직하며, 네오마이신인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주 제조 방법은 T 세포 및 B 세포 면역결핍과 연관된 IL2RG 유전자를 RGEN 시스템을 이용하여 표적 염기서열을 선택하여 IL2RG 돌연변이를 발현하는 표적 벡터를 제작하였고, 상동 재조합에 의해 형질전환된 세포를 선별하여 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주를 구축함으로써, 상기 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주 제조 방법으로 제조한 세포주를 면역 거부 반응을 극복하는 이종장기이식용 돼지에 형질전환하여, 이종장기이식시 면역 거부 반응을 극복하는데 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은
1) 상기 벡터를 세포에 도입하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 벡터가 도입된 세포를 선별한 후 체세포 핵치환을 수행하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 핵치환된 세포를 발달시키는 단계를 포함하는 T 세포 및 B 세포 면역 결핍 돼지 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 T 세포 및 B 세포 면역 결핍 돼지를 제공한다.
본 발명의 T 세포 및 B 세포 면역결핍 돼지 제조 방법 및 이로 인해 제조된 돼지는 T 세포 및 B 세포 면역결핍과 연관된 IL2RG 유전자를 RGEN 시스템을 이용하여 표적 염기서열을 선택하여 IL2RG 돌연변이를 발현하는 표적 벡터를 제작하였고, 상동 재조합에 의해 형질전환된 세포를 선별하여 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주를 구축함으로써, 상기 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주 제조 방법으로 제조한 세포주를 면역 거부 반응을 극복하는 이종장기이식용 돼지에 형질전환하여 제조하는 T 세포 및 B 세포 면역결핍 돼지 제조 방법 및 이로 인해 제조된 돼지는 이종장기이식시 면역 거부 반응을 극복하는데 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
IL2RG
(
Interleukin2
receptor
,
gamma
)
낙아웃
(
knock
-
out
) 벡터 디자인 및 제작
<1-1>
IL2RG
유전자에서의
RNA
유전자 가위(
RNA
-
guided
Endonuclease
, RGEN) 표적 디자인
돼지 X 염색체(X-chromosome) 내에 서열번호 1로 기재되는 IL2RG 유전자의 엑손(exon) 5번을 낙아웃 시키기 위해 도 1과 같이 디자인하여 하기 표 1과 같이 표적 염기서열을 정하였다(도 1).
| IL2RG | 표적 염기서열(5'→3') | PAM 염기서열 | 서열번호 |
| 1 | ACAAAGCTTCTCTCTGCCTAGTG | TGG | 서열번호 : 2 |
| 2 | AGCTCTACACATTCCGTGTT | CGG | 서열번호 : 3 |
| 3 | AGCCGCTATAACCCGCTCTG | TGG | 서열번호 : 4 |
| 4 | GCGCTCAGCGTTGGAGCGAC | TGG | 서열번호 : 5 |
| 5 | CCACTGGGGCAACACTTCAA | AGG | 서열번호 : 6 |
<1-2>
IL2RG
낙아웃
벡터 제작
상기 실시예 <1-1>에서 정한 표적 부분에 상보적인 염기서열을 제작하여(하기 표 2), 혼성화(hybridization) 시키고, 이렇게 얻은 생성물과 PX330-U6-cas9 벡터(addgene)를 제한효소(BbsⅠ)로 자른 후, 결합시켜서(ligation) 각각의 타켓 벡터를 제조하였다. 이렇게 제조한 벡터는 시퀀싱을 통하여 확인하였다(도 2).
| IL2RG | 상보적인 염기서열(5'→3') | 서열번호 |
| I_1 | CACTAGGCAGAGAGAAGCTTTGT | 서열번호 : 7 |
| I_2 | AACACGGAATGTGTAGAGCT | 서열번호 : 8 |
| I_3 | CAGAGCGGGTTATAGCGGCT | 서열번호 : 9 |
| I_4 | GTCGCTCCAACGCTGAGCGC | 서열번호 : 10 |
| I_5 | TTGAAGTGTTGCCCCAGTGG | 서열번호 : 11 |
<
실시예
2>
IL2RG
낙아웃
벡터 확인
상기 실시예 <1-2>에서 제조한 벡터를 확인하였다.
구체적으로, 돼지 귀 섬유아세포(porcine ear fibroblast, PEF)는 10% FBS(Hyclone, USA), 0.001% 젠타마이신(Gibco, USA) 및 1% MEM 비필수 아미노산(Gibco)를 포함하는 DMEM(Gibco)으로 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하고 배양액은 2 내지 3일마다 교환하였다. 배양한 세포에 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 벡터를 리포펙타민(lipofectamine) LTX(Invitrogen)를 사용하여 제조사에 공지된 실험방법을 이용하여 형질주입 하였다. 형질주입 후 72시간 동안 배양한 후, 벡터를 넣지않은 야생형(wild type)과 PX330-cas9 벡터를 형질주입한 세포를 모아 genomic DNA(gDNA)를 분리한다. 이렇게 얻은 gDNA를 프라이머(정방향 : 5'-AGA CAC CCA ACT TTC TCT CAC-3' 서열번호 : 12, 역방향 : 5'-CAT GCG TCA GTG GCA CAG TGG-3' 서열번호 : 13)를 사용하여 95℃ 5분 전변성(predenature)하고, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분(35 사이클 반복), 72℃ 20분 후연장(post elongation) 단계로 PCR을 수행하였다. PCR 결과물과 야생형, 또는 벡터를 형질주입한 샘플을 150 ng씩 섞어서 혼성화 시킨 후, T7 엔도뉴클라아제 Ⅰ(T7 endonuclease Ⅰ)을 처리하여 37℃ 배양기에 2시간 동안 반응시킨다. 반응시킨 각 샘플을 전기 영동하여 확인하였다.
그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 서열번호 2로 기재되는 타켓 염기서열을 갖는 1번 표적 벡터가 가장 효율이 높은 것을 확인하였다(도 3). 이에, 이 후 실험에 1번 표적 벡터를 사용하였다.
<
실시예
3> T 세포 면역결핍 세포주 구축
<3-1> 낙인(
knock
-
in
) 벡터 제작
네오마이신(neomycin) 선택 마커(selection marker)가 들어있는 벡터를 이용하여 표적 부분 양쪽 5', 3' arm의 염기서열을 넣어 낙인 벡터(LFNFTDT-pIL2RG3A-5A)를 디자인하였다(도 4).
구체적으로, 하기 표 3의 프라이머를 이용하여 PCR을 하였고, 또한, 클로닝할 때 수월하기 위해 제한효소 위치(enzyme site)를 넣어주었다. 이렇게 얻은 PCR 결과물과 벡터를 제한효소로 잘라준 후 결합시켜서 낙인 벡터(LFNFTDT-pIL2RG3A-5A)를 제조하였다. 또한, 제조한 낙인 벡터(LFNFTDT-pIL2RG3A-5A)가 제대로 클로닝 되었는지 확인하기 위해 전기영동하여 확인하였다.
| IL2RG | 프라이머 서열(5'→3') | 제한효소 | 서열번호 |
| 5'arm_F | GCG GCC GCT GGA CTG TGG AAT CTG TGG T | NotⅠ | 서열번호 : 14 |
| 5'arm_R | TTA ATT AAA ACT GCT GCC CCT CCC | PacⅠ | 서열번호 : 15 |
| 3'arm_F | GCT GAC GCA TGA GAC CAG TAC CC | SalⅠ | 서열번호 : 16 |
| 3'arm_R | GGC GCG CCG TTG ACG AGA CCG CAG TCT | AscⅠ | 서열번호 : 17 |
그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 예상했던 크기와 마찬가지의 크기로 제한효소로 절단되는 것을 확인하여, 낙인 벡터(LFNFTDT-pIL2RG3A-5A)가 제대로 클로닝된 것을 확인하였다(도 4).
<3-2> 세포주 구축
상기 실시예 <1-2>에서 제조하여 효율을 확인한 Cas9 표적 벡터와 상기 실시예 <3-1>에서 제조한 낙인 벡터를 가지고 세포주를 구축하였다.
구체적으로, PX330-cas9 표적 벡터와 낙인 벡터(LFNFTDT-pIL2RG3A-5A)를 PEF 세포에 Amaxa 전기천공법(electroporation)으로 형질전환하였다. 그 후, G418(Gibco)을 300 ng/ml로 처리하여 네오마이신 내성 유전자가 들어있는 세포를 48시간마다 배지를 교체해주면서 선별하였다. 이렇게 선별된 세포를 하기 표 4의 프라이머를 이용하여 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 PCR을 수행한 후 전기영동으로 확인하였다. PCR 프라이머는 유전자 내 또는 벡터 내에서 디자인하였다(도 5).
| IL2RG | 프라이머 서열(5'→3') | 디자인 위치 | 서열번호 |
| 5'_F | CTC CAG CCT ACC AAC CTA ACT | IL2RG 엑속 2 내 | 서열번호 : 18 |
| 5'_R | CGG TGT TGG GTC GTT TGT TCA | 벡터 내 | 서열번호 : 19 |
| 3'_F | GCT TTG CAT ACT TCT GCC TGC TGG | 벡터 내 | 서열번호 : 20 |
| 3'_R | CCA CCA AGC TAG GAT CAG TTC TCC | IL2RG 엑손 7-8 사이 | 서열번호 : 21 |
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, PX330-cas9 표적 벡터와 낙인 벡터(N-LFNDT-pIL2RG-5'&3' arm)가 모두 들어가서 디자인한 대로 IL2RG의 표적 부분이 낙아웃된 T 세포 및 B 세포 면역결핍 세포주를 구축하였다(도 6).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> Production of cell line for porcine T-cell and B-cell
immunodeficiency and a method of manufacturing
<130> 2014P-06-052
<160> 21
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1107
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 1
atgttgaagc caccattgcc agtcaaatcc ctcttattcc tgcagctgcc tctgctgggg 60
gtgggactga acccgaaggt cctcacgcac agtgggaatg aagacatcac agctgatttc 120
ctcctgctct ctacaccccc tgggactctc aacgtttcca ctctacccct cccaaaggtt 180
cagtgttttg tgttcaatgt tgagtacatg aattgcactt ggaacagcag ctctgagctc 240
cagcctacca acctaactct gcactactgg tacaagacct ctaatgatga taaagtccag 300
gagtgtggcc actatctatt ctctgaaggg atcacttctg gctgttggtt tggaaaagag 360
gagatccgcc tctaccaaac atttgttgtc cagctccagg acccacggga acccaggagg 420
caggacccac agacgctaaa actacaggat ctggtgatcc cctgggcgcc ggcgaatctg 480
acccttcgca ccctgagtga atcccagcta gaactcaact ggagcaaccg atacttggac 540
cactgtttgg agcacctcgt gcaataccgg agtgaccggg accgcagctg gactgaacaa 600
tcagtggatc acagacaaag cttctctctg cctagtgtgg atgcgcagaa gctctacaca 660
ttccgtgttc ggagccgcta taacccgctc tgtggaagcg ctcagcgttg gagcgactgg 720
agccacccga tccactgggg caacacttca aaggagaatc ctctgctgtt tgcattggaa 780
gctgtgctta tcccgcttgg ctccatggga ctgattgtcg gcctcatgtg tgtgtattgc 840
tggctggaac ggaccatgcc ccgaattcct accctcaaga acctagagga tctggttact 900
gaatatcatg ggaacttttc ggcctggagt ggtgtgtcta agggattggc cgagagtctg 960
cagccagact acagtgaacg gctctgccac gtcagtgaga tttccccaaa aggaggagct 1020
cttggggaag ggcctggggg ctccccctgc agtcagcata gcccctactg ggctccccca 1080
tgttacaccc tgaaacctga aacctga 1107
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 2
acaaagcttc tctctgccta gtg 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 3
agctctacac attccgtgtt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 4
agccgctata acccgctctg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 5
gcgctcagcg ttggagcgac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 6
ccactggggc aacacttcaa 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I_1
<400> 7
cactaggcag agagaagctt tgt 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I_2
<400> 8
aacacggaat gtgtagagct 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I_3
<400> 9
cagagcgggt tatagcggct 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I_4
<400> 10
gtcgctccaa cgctgagcgc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I_5
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ttgaagtgtt gccccagtgg 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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agacacccaa ctttctctca c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gDNA_R
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catgcgtcag tggcacagtg g 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'arm_F
<400> 14
gcggccgctg gactgtggaa tctgtggt 28
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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ttaattaaaa ctgctgcccc tccc 24
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3'arm_F
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gctgacgcat gagaccagta ccc 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3'arm_R
<400> 17
ggcgcgccgt tgacgagacc gcagtct 27
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'_F
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ctccagccta ccaacctaac t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 19
cggtgttggg tcgtttgttc a 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3'_F
<400> 20
gctttgcata cttctgcctg ctgg 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3'_R
<400> 21
ccaccaagct aggatcagtt ctcc 24
Claims (10)
1) PX330-Cas9 벡터에 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성된 IL2RG (Interleukin2 receptor, gamma) 유전자 단편이 결합된 벡터; 및
2) 서열번호 14 및 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭된 IL2RG 유전자 단편과, 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭된 IL2RG 유전자 단편, 및 선택마커(selection marker)가 포함된 낙인(knock in)벡터가 돼지 세포에 형질전환된 형질전환 세포주.
2) 서열번호 14 및 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭된 IL2RG 유전자 단편과, 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭된 IL2RG 유전자 단편, 및 선택마커(selection marker)가 포함된 낙인(knock in)벡터가 돼지 세포에 형질전환된 형질전환 세포주.
제 1항에 있어서, 상기 IL2RG 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포주.
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 돼지 세포는 돼지 섬유아세포(fibroblast)인 것을 특징으로 하는 형질전환 세포주.
제 1항에 있어서, 상기 선택 마커는 네오마이신(neomycin), 퓨로마이신(puromycin), 히그로마이신(hygromycin) 및 제오신(zeocin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형질전환 세포주.
1) PX330-Cas9 벡터에 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성된 IL2RG (Interleukin2 receptor, gamma) 유전자 단편이 결합된 벡터; 및 서열번호 14 및 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭된 IL2RG 유전자 단편과, 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭된 IL2RG 유전자 단편, 및 선택마커(selection marker)가 포함된 낙인(knock in)벡터를 돼지 세포에 공동 형질전환시키는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 공동 형질전환된 세포를 배양한 후 상동 재조합(homologous recombination)이 된 세포를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 돼지 세포주의 제조 방법.
2) 상기 단계 1)의 공동 형질전환된 세포를 배양한 후 상동 재조합(homologous recombination)이 된 세포를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 돼지 세포주의 제조 방법.
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Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140165575A KR101833433B1 (ko) | 2014-11-25 | 2014-11-25 | 돼지 t 세포 및 b 세포 면역결핍 세포주 생산 및 그의 제조 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140165575A KR101833433B1 (ko) | 2014-11-25 | 2014-11-25 | 돼지 t 세포 및 b 세포 면역결핍 세포주 생산 및 그의 제조 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20160062605A KR20160062605A (ko) | 2016-06-02 |
| KR101833433B1 true KR101833433B1 (ko) | 2018-02-28 |
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ID=56135721
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020140165575A KR101833433B1 (ko) | 2014-11-25 | 2014-11-25 | 돼지 t 세포 및 b 세포 면역결핍 세포주 생산 및 그의 제조 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101833433B1 (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| WO2014093712A1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation |
-
2014
- 2014-11-25 KR KR1020140165575A patent/KR101833433B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| WO2014093712A1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NCBI: NM_214083.2, 2014.01.10. |
| Shunichi Suzuki 등. Cell Stem Cell, 2012, vol. 10, pp. 753-758.* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20160062605A (ko) | 2016-06-02 |
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