CN108707621B - 一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法 - Google Patents

一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法。本发明以水稻ALS基因为研究对象，构建了同源重组载体。将RCR1‑RCR2‑RDR片段进行体外转录，通过RNP方法，以RNA转录本作为修复模板，在水稻愈伤中实现了目的基因的同源重组修复。同时，利用基因枪方法将载体导入水稻愈伤中，获得了ALS基因定点修饰的水稻植株。结果表明，以RNA作为修复模板可成功介导目的基因的同源重组，为农作物育种提供了新思路，因此在农业育种方面具有强大的应用潜力。

Description

一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源 重组方法
技术领域
本发明涉及一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法。
背景技术
CRISPR/Cpf1极大拓展了基因编辑范围，已开始应用于农作物遗传改良研究中。利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术进行基因敲除，已经在水稻等农作物中得到应用。但是，由于植物中同源重组频率低，利用CRISPR/Cas9介导的同源重组，在农作物中实现基因定点替换或定点整合却少有报道。目前，利用CRISPR/Cpf1系统介导的目的基因片段替换尚未有报道。
有假设提出RNA转录本可作为修复模板参与到DNA双链断裂(DSBs)导致的DNA同源重组修复(HDR)中去，而在酵母和人类细胞中，此假设已被证实。2014年，在一项酵母的研究中，RNA为修复模板介导基因组DNA的同源重组修复的有效性进一步被证实。然而，在酵母和人类细胞中，这一技术并未被广泛应用，主要由于在酵母和人类细胞中DNA修复模板可通过电转化、显微注射或转染等转化方法高效进入细胞，从而介导DNA的重组修复。但是在植物细胞中，由于细胞壁的存在，这些转化方法均不适用，尤其对于一些作物品种如：玉米、小麦、水稻等单子叶植物而言。因此在农作物中通过CRISPR/Cas系统实现目的基因的同源重组修复有很大难度，主要因为：1)在植物细胞中，DSBs主要通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)的方式进行修复，同源重组介导的修复(homology-directed repair，HDR)发生几率极其小；2)将修复模板转入植物细胞中的量十分有限，目前有两种方法可以提高修复模板的量，但效果仍不理想，一种方式为通过基因枪转化法将修复模板片段导入细胞内；另外一种方法是将修复模板连入病毒来源的replicon载体中，将载体转化细胞，从而增加修复模板的量。
发明内容
本发明的目的是提供一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法。
本发明提供了一种用于取代植物基因组中的目标片段的表达盒甲，包括启动子甲和终止子，其特征在于：在启动子甲和终止子之间包括如下三个区段：区段Ⅰ、区段Ⅱ和区段Ⅲ；区段Ⅲ为区段Ⅲ-1或区段Ⅲ-2；
区段Ⅰ中具有两个核酸酶的编码序列和一个位于它们之间的crRNA1的编码序列；
区段Ⅱ中具有两个核酸酶的编码序列和一个位于它们之间的crRNA2的编码序列；
区段Ⅲ-1中具有两个核酸酶的编码序列和位于它们之间的模板区段；
区段Ⅲ-2中具有两个靶标序列和位于它们之间的模板区段；
所述模板区段包括上游同源臂、供体片段序列和下游同源臂；
所述目标片段的一个末端为区段Ⅰ中crRNA1的靶标序列，另一个末端为区段Ⅱ中crRNA2的靶标序列；
供体片段与目标片段具有如下差异：①预期在目标片段中引入的差异核苷酸；②将crRNA1的靶标中的TTTN突变为非TTTN；③将crRNA2的靶标中的TTTN突变为非TTTN。
区段Ⅰ自5’至3’端依次具有Hammerhead型核酸酶的编码序列、crRNA1的编码序列和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列。
区段Ⅱ自5’至3’端依次具有Hammerhead型核酸酶的编码序列、crRNA2的编码序列和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列。
区段Ⅲ-1中自5’至3’端依次具有Hammerhead型核酸酶的编码序列、上游同源臂、供体片段序列、下游同源臂和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列。
区段Ⅲ-2中自5’至3’端依次具有crRNA1的靶标序列、上游同源臂、供体片段序列、下游同源臂和crRNA2的靶标序列。
所述目标片段中，crRNA1的靶标和crRNA2的靶标之间具有限制性内切酶的识别序列；所述供体片段与目标片段的区别还包括如下④：将所述限制性内切酶的识别序列突变为非识别序列。
所述Hammerhead型核酸酶的编码序列如序列表中序列1自5’端第394至436位所示或序列表的序列1自5’端第724至766位所示。
所述丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列如序列表中序列1自5’端第481至548位所示。
所述crRNA1的编码序列如序列表的序列1自5’端第437至480位所示。
所述crRNA2的编码序列如序列表的序列1自5’端第602至645位所示。
所述上游同源臂如序列表的序列1自5’端第767至863位所示。
所述下游同源臂如序列表的序列1自5’端第1245至1365位所示。
所述供体片段序列如序列表的序列1自5’端第864至1244位所示。
所述区段Ⅰ如序列表的序列1自5’端第394至548位所示。
所述区段Ⅱ如序列表的序列1自5’端第559至713位所示。
crRNA1的靶标序列如序列表的序列2自5’端第709至735位所示。
crRNA2的靶标序列如序列表的序列2自5’端第1335至1361位所示。
所述区段Ⅲ-1如序列表的序列1自5’端第724-1433位所示。
所述区段Ⅲ-2如序列表的序列2自5’端第709-1361位所示。
所述启动子甲为OsU3启动子。所述OsU3启动子如序列表的序列1自5’端第13至393位所示。
所述终止子为Nos终止子。所述Nos终止子的序列如序列表的序列1自5’端第1434至1686位所示。
所述表达盒甲如序列表的序列1自5’端第13-1686位所示。
所述表达盒甲如序列表的序列2所示。
所述目标片段具体可为植物基因组中ALS基因中序列表的序列6所示的片段。
本发明还保护含有以上任一所述表达盒甲的重组载体。
所述重组载体还包括表达盒乙；所述表达盒乙中由启动子乙启动LbCpf1核酸酶的编码基因表达。
所述启动子乙为Ubi启动子。所述Ubi启动子的反向互补序列如序列表的序列1自5’端第5912至7897位所示。
所述LbCpf1核酸酶的编码基因的反向互补序列如序列表的序列1自5’端第2061至5909位所示。
所述表达盒乙还包括终止子。所述所述终止子为Nos终止子。所述Nos终止子的反向互补序列如序列表的序列1自5’端第1789至2041位所示。
所述表达盒乙的反向互补序列如序列表的1自5’端1789至7897位所示。
所述重组载体为序列表的序列1所示的环形质粒。
所述重组载体为采用序列2所示的双链DNA分子替代序列1自5’端第13-1686位得到的环形质粒。
本发明还保护以上任一所述表达盒甲，或，以上任一所述的重组载体在实现植物中以RNA转录本为模板进行靶基因同源重组中的应用。
本发明一种植物中以RNA转录本为模板进行靶基因同源重组的方法，包括如下步骤：将以上任一所述的重组载体导入出发植物，实现植物中靶基因同源重组。
以上任一所述靶基因为ALS基因。
以上任一所述植物可为1)或2)或3)或4)或5)：1)单子叶植物；2)双子叶植物；3)禾本科植物；4)水稻；5)水稻品种中花11(Japonica cv.)。
本发明以水稻ALS基因为研究对象，构建了同源重组载体：pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-RDR-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos和pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-armed donor(with targets)-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos。将RCR1-RCR2-RDR片段进行体外转录，通过RNP方法，以RNA转录本作为修复模板，在水稻愈伤中实现了目的基因的同源重组修复。同时，利用基因枪方法将载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-RDR-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos、pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-armed donor(with targets)-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos和pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-Ubi-LbCpf1-Nos-armeddonor(with targets)分别导入水稻愈伤中，获得了ALS基因定点修饰的水稻植株，其中pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-Ubi-LbCpf1-Nos-armed donor(with targets)为DNA修复模板的对照载体。研究结果表明，以RNA作为修复模板可成功介导目的基因的同源重组，为农作物育种提供了新思路，因此在农业育种方面具有强大的应用潜力。
附图说明
图1为三个载体框架图。
图2为水稻愈伤组织中目的基因的测序鉴定结果。
图3为转基因植株中目的基因的测序鉴定结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的用于水稻转化的水稻材料为中花11(Japonica cv.)，由中国农业科学院作物科学研究所提供。
质粒pCXUN-Cas9记载于如下文献中：He et al.，2017和Sun et al.，2016；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
质粒pRS316-RCR-GFP记载于如下文献中：Zhang et al.，2017；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
LbCpf1-OsU6载体记载于如下文献中：Wang et al.，2017；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
pCXUN-Cas9-OsU3记载于如下文献中：Sun et al.，2016；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
下述实施例中所用的内切酶、试剂盒和PCR酶均购自试剂公司。其它试剂均为国产分析纯。
下述实施例中的引物、DNA合成及测序均由华大公司完成。
下述实施例中所用的引物如表1。
表1引物序列
Figure BDA0001642184940000041
Figure BDA0001642184940000051
实施例1、利用CRISPR/Cpf1系统实现以RNA转录本作为修复模板介导的ALS基因的精确修饰
一、表达载体的构建
1、质粒pCXUN-LbCpf1-Nos的构建
(1)用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切质粒pCXUN-Cas9，得到约9282bp的载体骨架1。
(2)用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切LbCpf1-OsU6载体，得到约5846bp的Ubi-LbCpf1表达盒。
(3)将载体骨架1和Ubi-LbCpf1表达盒用T4连接酶连接，得到质粒pCXUN-LbCpf1-Nos。
2、OsU3-RCR1-RCR2表达盒的构建
(1)以质粒pRS316-RCR-GFP为模板，采用引物RCR1F2和引物RCR-common-R组成的引物对进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物。
(2)以步骤(1)得到的第一轮PCR扩增产物为模板，采用引物RCRF1和引物RCR-common-R组成的引物对进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物(RCR1)。
(3)以质粒pRS316-RCR-GFP为模板，采用引物RCR2-F2和引物RCR-common-R组成的引物对进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物。
(4)以步骤(3)得到的第一轮PCR扩增产物为模板，采用引物RCR-F1和引物RCR-common-R组成的引物对进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物(RCR2)。
(5)以pCXUN-Cas9-OsU3为模板，采用引物OsU3F和引物OsU3-RCR1R组成的引物对进行PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物(OsU3启动子序列)。
(6)以步骤(2)得到的第二轮PCR扩增产物(RCR1)为模板，采用引物RCR-Common-F和引物RCR1-10random-R组成的引物对进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物。
(7)将步骤(5)得到的第一轮PCR扩增产物(OsU3启动子序列)和步骤(6)得到的第二轮PCR扩增产物按照摩尔比1:1混合后作为模板，采用引物OsU3F和引物RCR1-10 random-R组成的引物对进行第三轮PCR扩增，得到第三轮PCR产物(OsU3-RCR1表达盒)。
(8)以步骤(4)得到的第二轮PCR扩增产物(RCR2)为模板，采用引物RCR2-10random-F和引物SacI-RCR2-R组成的引物对进行第四轮PCR扩增，得到第四轮PCR扩增产物。
(9)将步骤(7)得到的第三轮PCR产物(OsU3-RCR1表达盒)和步骤(8)得到的第四轮PCR扩增产物按照摩尔比1:1混合后作为模板，采用引物SacI-OsU3-F和引物SacI-RCR2-R进行第五轮PCR扩增，得到第五轮PCR扩增产物(OsU3-RCR1-RCR2表达盒)。
3、RDR片段的合成
(1)将引物HHF和引物HHR退火形成HH片段(第一轮产物)。
(2)以化学合成定点修饰的ALS基因片段(序列表的序列4)为模板，采用引物donor-HH-F和引物donor-HH-F组成的引物对进行PCR扩增，得到第二轮产物。
(3)以质粒pRS316-RGR-GFP为模板，采用引物HDVF和引物HDVR组成的引物对进行PCR扩增，得到第三轮产物。
(4)以质粒pCXUN-Cas9为模板，采用引物Nos-HDVF和引物KPN-NosR组成的引物对进行PCR扩增，得到第四轮产物
(5)将第一轮产物、第二轮产物、第三轮产物和第四轮产物按照摩尔比1:1:1:1进行混合后，采用引物Kpn-HHF和引物Kpn-NosR组成的引物对进行PCR扩增，得到RDR片段。
4、armed donor(with targets)-Nos片段的合成
(1)以化学合成定点修饰的ALS基因片段(序列表的序列4)为模板，采用引物Kpn-donorF和引物donor-R组成的引物对进行PCR扩增，得到第一轮产物。
(2)以pCXUN-Ubi-LbCpf1-Nos质粒为模板，采用引物Nos-donorF和引物Kpn-NosR组成的引物对进行PCR扩增，得到第二轮产物。
(3)将第一轮产物和第二轮产物按照摩尔比1:1混合后作为模板采用引物Kpn-donorF和引物Kpn-NosR组成的引物对进行PCR扩增，得到armed donor(with targets)-Nos片段。
5、载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-RDR-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos的合成
将步骤2制备的OsU3-RCR1-RCR2表达盒和步骤1制备的质粒pCXUN-LbCpf1-Nos利用同源重组酶(全式金,北京,中国)进行连接获得重组载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-Ubi-LbCpf1-Nos，将步骤3得到的RDR片段插入重组载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-Ubi-LbCpf1-Nos的KpnI位点中，得到载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-RDR-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos。
载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-RDR-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos经测序如序列表的序列1所示。序列表中序列1自5’末端起，第13至713位为OsU3-RCR1-RCR2表达盒的核苷酸序列，其中，第13至393位为OsU3启动子的核苷酸序列，第394至436位和第559至601位均为Hammerhead(HH)型核酸酶的核苷酸序列，第481至548位和第646至713位均为丁型肝炎病毒(HDV)核酸酶的核苷酸序列，第437至480位为crRNA1的核苷酸序列，第602至645位为crRNA2的核苷酸序列。序列表中序列1自5’末端起，第724至1433位为RDR片段，其中，第724至766位为Hammerhead(HH)型核酸酶的核苷酸序列，第1366至1433位为丁型肝炎病毒(HDV)核酸酶的核苷酸序列，第767至1365位为DRT序列。序列表中序列1自5’末端起，第1434至1686位为Nos终止子的核苷酸序列，第1789至2041位为Nos终止子的核苷酸序列的反向互补序列；第2061至5909位为编码LbCpf1的核苷酸序列的反向互补序列，第5912至7897位为Ubi启动子的核苷酸序列的反向互补序列。
RDR片段中，第767至863位为上游同源臂，第864至1244位为突变区段，第1245至1365位为下游同源臂。
6、载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-armed donor(with targets)-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos的合成
将步骤2制备的OsU3-RCR1-RCR2表达盒和步骤1制备的质粒pCXUN-LbCpf1-Nos利用同源重组酶(全式金,北京,中国)进行连接获得重组载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-Ubi-LbCpf1-Nos，将步骤4得到的armed donor(with targets)-Nos片段插入重组载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-Ubi-LbCpf1-Nos的KpnI位点中，得到载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-armeddonor(with targets)-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos。
经测序，载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-armed donor(with targets)-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos与载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-RDR-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos的区别在于：采用序列表的序列2所示的片段替代了序列表的序列1自5’端第13-1686位。
序列2所示的片段，自5’端第1至701位为OsU3-RCR1-RCR2表达盒的核苷酸序列，其中，第1至381位为OsU3启动子的核苷酸序列，第382至424位和第547至589位均为Hammerhead(HH)型核酸酶的核苷酸序列，第469至536位和第634至701位为丁型肝炎病毒(HDV)核酸酶的核苷酸序列，第425至468位为crRNA1的核苷酸序列，第590至453位为crRNA2的核苷酸序列。序列表中序列2自5’末端起，第709至1361位为armeddonor(with targets)片段，其中，第709至735位为靶点1的核苷酸序列，第1335至1361位为靶点2的核苷酸序列，第736至1334位为DRT序列。序列表中序列2自5’末端起，第1362至1614位为Nos终止子的核苷酸序列的核苷酸序列。
DRT序列中，第736至832为上游同源臂，第833至1213位为突变区段，第1214至1334位为下游同源臂。
7、载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-Ubi-LbCpf1-Nos-armed donor(with targets)的合成
以化学合成定点修饰的ALS基因片段(序列表的序列4)为模板，采用引物Pme-donorF和引物Pme-donorR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(armed-DRT)。
将步骤2制备的OsU3-RCR1-RCR2表达盒和步骤1制备的质粒pCXUN-LbCpf1利用同源重组酶(全式金,北京,中国)进行连接获得重组载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2，将armed-DRT插入重组载体pCXUN-LbCpf1-OsU3-RCR1-RCR2的PmeI位点中，得到载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-Ubi-LbCpf1-Nos-armed donor(with targets)。
载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-Ubi-LbCpf1-Nos-armed donor(with targets)经测序如序列表的序列3所示。序列表中序列3自5’末端起，第13至713位为OsU3-RCR1-RCR2表达盒的核苷酸序列，第13至393位为OsU3启动子的核苷酸序列，第394至436位和第559至601位均为Hammerhead(HH)型核酸酶的核苷酸序列，第481至548位和第646至713位为丁型肝炎病毒(HDV)核酸酶的核苷酸序列，第437至480位为crRNA1的核苷酸序列，第602至645位为crRNA2的核苷酸序列，第817至1069位为Nos终止子的核苷酸序列的反向互补序列；第1089至4937位为编码LbCpf1的核苷酸序列的反向互补序列，第4940至6925位为Ubi启动子的核苷酸序列的反向互补序列，第7217至7886位为DNA修复模板armed-DRT。
DNA修复模板armed-DRT中，第7225至7251位为crRNA1的靶标序列，第7252至7348位为上游同源臂，第7349至7729位为突变区段，第7730至7850位为下游同源臂，第7851-7877位为crRNA2的靶标序列。
载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-RDR-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos、载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-armed donor(with targets)-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos和载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-Ubi-LbCpf1-Nos-armed donor(with targets)(对照载体)部分元件结构示意图见图1。
载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-RDR-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos通过OsU3启动的基因转录，可获得转录本RCR1-RCR2-RDR片段，其中的HH和HDV核酶对转录本进行自剪切，crRNAs和RNA修复模板被精确释放。
载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-armed donor(with targets)-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos通过OsU3启动的基因转录，可获得转录本RCR1-RCR2-armed donor(with targets)片段，其中的HH和HDV核酶对转录本进行自剪切，crRNAs与armed donor(with targets)分开，crRNAs被精确释放，LbCpf1蛋白可在RNA水平armed donor(with targets)片段进行切割，从而获得精确的修复模板。
二、水稻愈伤中RNA作为修复模板介导的DNA重组修复活性检测
1、选取饱满的中花11水稻种子，剥去种皮，灭菌洗涤后，均匀的点入在含有2毫克/升2,4-D的灭菌NB固体培养基中，28℃黑暗培养40-50天以诱导愈伤组织的产生。
2、将步骤1得到的愈伤组织在含有0.3M甘露醇和0.3M山梨醇的MS培养基中高渗处理4-6小时。
3、以pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-RDR-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos载体为模板，利用引物T7-F和引物T7-Nos-R组成的引物对进行PCR扩增，获得体外转录模板RCR1-RCR2-RDR片段，根据HiScribe T7Quick High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)说明书要求，配制如下体系，37℃孵育6h，进行体外转录，获得转录产物(crRNAs与RNA修复模板)。
反应体系：
模板 2μL(400ng)
NTP Buffer Mix 10μL
T7RNA polymerase Mix 2μL
RNase-Free ddH2O 6μL
总体系 20μL
4、将步骤3得到的转录产物加入2μLDNase I和30μL RNase-Free ddH2O进行处理，去除DNA，并经试剂盒纯化后与LbCpf1蛋白(序列表的序列7所示)进行组装，室温放置15min，形成RNP，组装体系如下：
组装体系：
LbCpf1蛋白 10μg
转录产物 10μg
10×Buffer 3 2μL
RNaseinhibitior 1μL
RNase-Free ddH2O xμL
总体系 20μL
5、将步骤4得到的RNP通过基因枪转化水稻愈伤，采用0.6μm金粉，轰击压力为900psi进行轰击。
6、完成步骤5后，将水稻愈伤28℃暗培养36h后提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物ALSTestF和引物T2MR组成的引物对进行PCR扩增，将扩增产物测序检测是否发生ALS基因同源重组。
结果如图2所示。其中，WT ALS为野生型ALS基因(序列表的序列6)；Donor为修复模板序列(序列表的序列5)；下划线序列分别为靶点1和靶点2序列；斜体的碱基为定点突变的PAM位点及EcoRV酶切位点，斜体加粗的碱基为目标替换成的碱基。
结果显示，得到的愈伤组织中，愈伤RDR35中检测到有完整同源重组，RDR41愈伤有部分同源重组。结果表明，以RNA作为修复模板，可成功介导基因组DNA的同源重组修复。
三、转基因水稻的获得
1、选取饱满的中花11水稻种子，剥去种皮，灭菌洗涤后，均匀的点入在含有2毫克/升2,4-D的灭菌NB固体培养基中，28℃黑暗培养40-50天以诱导愈伤组织的产生。
2、将步骤1得到的愈伤组织在含有0.3M甘露醇和0.3M山梨醇的MS培养基中高渗处理4-6小时后，将pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-RDR-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos通过基因枪轰击水稻愈伤，采用0.6μm金粉，轰击压力为900psi进行轰击，轰击后在含有0.3M甘露醇和0.3M山梨醇的MS培养基上28℃暗培养16小时后转移至NB筛选培养基(含有2毫克/升的2,4-D和50毫克/升的潮霉素的NB固体培养基)中，28℃持续暗培养2周。
3、完成步骤2后，选取生长良好呈嫩黄色的阳性愈伤组织，用无菌镊子移至NB预分化培养基(含有1毫克/升NAA、5毫克/升ABA、2毫克/升kinetin和50毫克/升的潮霉素的NB固体培养基)上，28℃持续暗培养2周。
4、完成步骤3后，挑选生长旺盛的愈伤组织转入MS分化培养基(含有0.02毫克/升NAA、2毫克/升kinetin和0.4μM双草醚钠盐的MS固体培养基)中，28℃持续光照培养。
5、完成步骤4后，待分化出来的幼苗长至2至5毫米，转入MS固体培养基中28℃光照培养2到3周，之后移入土中置于温室生长(温度28-30℃，16小时光照/8小时黑暗)，得到T0代转基因植株(转pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-RDR-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos)。
6、采用pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-armed donor(with targets)-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos替代pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-RDR-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos，按照步骤1-5进行操作，得到T0代转基因植株(转pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-armed donor(with targets)-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos)。
7、采用pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-Ubi-LbCpf1-Nos-armed donor(with targets)替代pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-RDR-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos，按照步骤1-5进行操作，得到T0代转基因植株(转pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-Ubi-LbCpf1-Nos-armed donor(with targets))。
四、转基因水稻的基因型鉴定
待测植株：野生型中花11水稻(WT)、T0代转基因植株(转pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-RDR-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos)、T0代转基因植株(转pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-armed donor(with targets)-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos)和T0代转基因植株(转pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-Ubi-LbCpf1-Nos-armed donor(with targets))。
提取待测植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物ALStestF和引物ALStestR组成的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物采用EcoRV酶切，野生对照可以被EcoRV切开并产生481bp和322bp两种类型片段，不能被EcoRV完全酶切的植株鉴定为同源重组成功植株。将完全没有或者部分切开PCR产物进行克隆测序。统计结果见表2和图3。
表2转基因水稻的基因型鉴定统计结果
Figure BDA0001642184940000101
图3中，图3A为T0代转基因植株(转pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-RDR-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos)的检测结果，图3B为T0代转基因植株(转pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-armed donor(withtargets)-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos)的检测结果。其中，WT ALS为野生型ALS基因(序列表的序列6)；Donor为修复模板序列(序列表的序列5)；下划线序列分别为靶点1和靶点2序列；斜体的碱基为定点突变的PAM位点及EcoRV酶切位点，斜体加粗的碱基为目标替换成的碱基。
对于载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-RDR-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos而言，共获得58棵植株。对58棵植株PCR产物用EcoRV酶切鉴定后结果表明，288-6一条链为完整同源重组，另一条链为野生型。289-4和293-1一条链为部分同源重组，另一条链为野生型。。
对于载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-armed donor(with targets)-Nos-Ubi-LbCpf1-Nos而言，共获得87棵植株183-2,185-5和278-4一条链为完整同源重组，另一条链为野生型。198-1一条链为完整同源重组，另一条链为部分同源重组。193一条链为部分同源重组并伴随28bp缺失，另一条链为野生型。
载体pCXUN-OsU3-RCR1-RCR2-Ubi-LbCpf1-Nos-armed donor(with targets)未得到重组植株。
五、脱靶分析
本实验对8颗植株进行PCR靶点1和靶点2的脱靶进行鉴定，PCR产物克隆并测序结果表明，本实验所设计的crRNA1和crRNA2并不存在脱靶情况。
对8颗植株进行靶标1和靶标2的脱靶情况的鉴定，具体步骤为：提取植株的基因组DNA，采用特异引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序。
靶标1存在三个可能脱靶的位点，ALS1-OFF1、ALS1-OFF2和ALS1-OFF3。
靶标2存在两个可能脱靶的位点，ALS2-OFF4和ALS2-OFF5。
用于各个脱靶位点的引物对见表1。
表3脱靶分析统计结果
Figure BDA0001642184940000111
注：PAM位点用下划线表示，错配碱基用斜体表示。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16802
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcgagc tcaaggaatc tttaaacata cgaacagatc acttaaagtt cttctgaagc 60
aacttaaagt tatcaggcat gcatggatct tggaggaatc agatgtgcag tcagggacca 120
tagcacaaga caggcgtctt ctactggtgc taccagcaaa tgctggaagc cgggaacact 180
gggtacgttg gaaaccacgt gatgtgaaga agtaagataa actgtaggag aaaagcattt 240
cgtagtgggc catgaagcct ttcaggacat gtattgcagt atgggccggc ccattacgca 300
attggacgac aacaaagact agtattagta ccacctcggc tatccacata gatcaaagct 360
gatttaaaag agttgtgcag atgatccgtg gcaaaattac tgatgagtcc gtgaggacga 420
aacgagtaag ctcgtctaat ttctactaag tgtagatggt atggtggtgc aatgggagga 480
ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg caacatgctt cggcatggcg 540
aatgggacga atacgaccaa attactgatg agtccgtgag gacgaaacga gtaagctcgt 600
ctaatttcta ctaagtgtag atacctgaat gacccataaa gagtgggccg gcatggtccc 660
agcctcctcg ctggcgccgg ctgggcaaca tgcttcggca tggcgaatgg gaccggtacc 720
acacatcaac tgatgagtcc gtgaggacga aacgagtaag ctcgtcttga tggggatggt 780
agcttcctca tgaacattca ggagctggca ttgatccgca ttgagaacct ccctgtgaag 840
gtgatggtgt tgaacaacca acacctaggc atggtcgtcc agttggagga taggttttac 900
aaggcgaata gggcgcatac atacttgggc aacccggaat gtgagagcga gatatatcca 960
gattttgtga ctattgctaa ggggttcaat attcctgcag tccgtgtaac aaagaagagt 1020
gaagtccgtg ccgccatcaa gaagatgctc gagactccag ggccatactt gttggacatc 1080
atcgtcccgc accaggagca tgtgctgcct atgatcccaa ttgggggcgc attcaaggac 1140
atgatcctgg atggtgatgg caggactgtg tattaatcta taatctgtat gttggcaaag 1200
caccagcccg gcctatgtct gacgtgaatg actcataaag agtggtatgc ctatgatgtt 1260
tgtatgtgct ctatcaataa ctaaggtgtc aactatgaac catatgctct tctgttttac 1320
ttgtttgatg tgcttggcat ggtaatccta attagcttcc tgctgggccg gcatggtccc 1380
agcctcctcg ctggcgccgg ctgggcaaca tgcttcggca tggcgaatgg gacgatcgtt 1440
caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta 1500
tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt 1560
tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag 1620
aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac 1680
tagatcggta cccctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc 1740
agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gaattcccga tctagtaaca 1800
tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg ttttctatcg 1860
cgtattaaat gtataattgc gggactctaa tcataaaaac ccatctcata aataacgtca 1920
tgcattacat gttaattatt acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat atgataatca 1980
tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg tttgaacgat 2040
cggggaaatt cggatcctta ctttttcttt tttgcctggc cggccttttt cgtggccgcc 2100
ggccttttgt gcttcacgct ggtctgggcg tactccagcc actccttgtt agagatggcg 2160
atcttcacct tatccagctt ctcgtcctcg gccttcttga actggccgat ggcccacagc 2220
acctttctgg cgatgttata ggcgccattg gcgtcggcgt tctttggcag gatggcattc 2280
tcctgggcct catagttccg gctatcgtag aagatgccgt cggagttctt cacagggctg 2340
atcagaaaat ccacgtcggt gcggcctgtg atgctgttcc gcatctgcag catcaggctc 2400
atcagggcca taaagctaga gtagaaggcc ttgtcggact gctcgcacag cagggctctg 2460
atatcgccct gctgataatt gatgccgtac ttgttgaaca gctccttata ggcgctggtc 2520
aggcacacct cctcccagtc gaacacgttg ttcttcttag gattccggaa gattctgatc 2580
cggttgccgt aggagtacag cttccacttc ttgatgtaat cggcgtctgt gcgagagaag 2640
ttcttatagt ccagggcaaa ctcgaacaga tcctcctcgg gcacgtacat gatcctgtca 2700
aaggagctga tgaacttctt ggaatcggcg atgctggtat acttggtttt cagcaggttc 2760
acaaagccgg tagatggatc gatcttggat gtcagccagg cagggatgta aaagatgaag 2820
ccgttctggg tagacatgga cttaaagctc tcgaacttat tggtgatctg atagcccttc 2880
agggcgccgc ctgttgcaca aggattagac ttcttgtcca ccatgtagtt cagcttatcg 2940
atcagcatct tctcgaactt ctgatacacc tgcttctcca ccttcacgcg gctattctta 3000
aagccagagt tcaggtcctc cagggcgatc acggcatcgt acttctccac cagctcgcag 3060
atcttgtgca ccacctgaga gatatagccg gccttcagct ccttgatatt ctcgatggag 3120
gtccagttct ggcgggcctc gaacctctcc ttctccttct tgtccagcag agagtggtaa 3180
tctgtcttga tcctgatgcc gttgaagttg ttgatgatct cgttcaggga atactgctcc 3240
acgatgttgc ccttgccgtc caccaccacg atatacagca gattgcgctc gcccctatcg 3300
atgccgatca cataggggtt atcgtcgtgc ttcagcagca cgcgcacctc tgtattgatc 3360
ttgaagatgt tcttggggca cttattgatg gcgattggga tgtgcagctc gtactggtcc 3420
tcagaaaacc tcttatcctt atacacgtcg taggacaggg ttgtggtttt cttgggatta 3480
tctggattct tgttggcgat aggggagttg gctgggtgca ccaccagctc ctccttcttc 3540
agggaggcgc gcctcatgaa cagctctgct cctccgctca gcctgatctg tccgtgattg 3600
ttctcgtcaa acagcagctt gaagtacatg gtgtgcagat tgggtgtgcc gtgagactta 3660
tcggaaaagt ccttgttata gatctggaac atatacagct tgccctcctc caccagctta 3720
tccacctcct tcttgctggc agactcgaag ctcaccttat agccctgctc ctccacctct 3780
ctgtaaaagc cggcgatgtc cttatacttc tctgtctcag aaaagttgaa atcgtaggca 3840
ttggaccact ttggataccg ggagatgcta tccttaaaga agtcgatcag cttgtgacag 3900
tcattcaggt taaacatatc gcccttcttg aatgtgccat tcttgtagat cttctggatg 3960
tcctcgctgg ggttatagta ggccatccac ttcttagaaa agaacacctt tggcagcatc 4020
ttattagggc cgggcagcag cttatagttg atcttctcgt aattgccgtt cacatcgtcc 4080
ttgtcgatct tctgcaggca cttggcgtac ttcttatcca tgatggccag atagtacttg 4140
gagccgtatc tcaggatggt ggcccgatag tctgtctcct tatccttgtc ccagccgccc 4200
atgaactgag ggttctgaaa atacagcttg aacttatcct tagagtaggg cttctgggtc 4260
acataattgc ggatggcatc gtagatgtgg tccaccttca gcaggatgtc gtaggccagc 4320
acaaaatcgc catagaagga ctcgtccctg tttgtctcct tgccctcgcc aaagaaggcc 4380
ttgatgtaat tctcgaagct cttcacagaa tccagcaggt ccttcatgat ggccaccacg 4440
gcgtcgttct tcttcaggct cttctccagc acaaaatcgg cgtcgaacag cttctcagag 4500
gagccataca ccttgtagat ctcatccacc ttctggatga tgatctcctt cagcttctcc 4560
accacagaca gatcggcgtc ggcgtactcc tgcagctgct ccagagaaaa ggagccgatc 4620
ttcttgaagg actttctccg atcgtcctcg tacttctcgg tcaccacggc cttcttcttc 4680
aggtggatat cgtcatactc ggcattccac ttgtcccgga tcacgttcca ctcgccgaag 4740
atatccttgg agattgtgct gatggcgggg ccgttcttca caaagatgcc ggcgctagag 4800
tactcgtcaa aattcttgaa cagcttctcc agcttcttga tggagctgaa gatctcgctg 4860
ttcttgttca gggtgtttct aaacacctcc agcacctcct catcggatgt atagccctcg 4920
ccgtagaagc tcagagactc ccgatcgctc agcacctgct tatacagtgg cttaaactta 4980
ggcagcttct gcttggtttt ctgattatac aggttgatgt actcgttcag gcccttgatc 5040
ttctcgccgc tctcggtcac gaagccgccg atgatggcgt tatacacgtc gatgccctcc 5100
tgtgtcagca caaagttaaa gaactcgccc tcaaagaaat cctccacatc atagtcgctg 5160
ttcaggatct tctccttgat ctcctgcacc tcgtgcttat caaagatggc gtccaccttc 5220
tcgaagatgt ccatattaga gatgtagcgg gtcagattct cgttgataca cctgaaggcg 5280
atggatgtgc tcttggcctc ctcggaaaac atattctctc tgttatcaaa gaagccggtg 5340
aaggctgtgg taaagccatt gaagctgttc accagggcga tctcgtcctt atcgtccagg 5400
aactctggca ggattgtctc gatgatatcc ttcttaaaca gggacttgta gccctcgttg 5460
cccttgaagg ccttggcgat ctccttccgc agattgatct ccaggttctc cagctcctta 5520
ttctccttct cggttctggt tttcttccgg aacaggctga tgtaattgtt cagattcttc 5580
agcttgatgc tgtgcagcac gtcgttgata aaagacagat agtagcgatc cagcagcttc 5640
ttcacgccct tataatcctc ggctctcttc tcgtcctcca ccagcagccg cttattgtcg 5700
atgttctcct gggtcttgcc cacagggatg gccttgaacc tcagggtctt agacagggag 5760
tagcagtttg taaacttctc cagcttgctg gctgctggga ctccgtggat accgaccttc 5820
cgcttcttct ttggggccat cttatcgtca tcgtctttgt aatcaatatc atgatccttg 5880
tagtctccgt cgtggtcctt atagtccatg gctgcagaag taacaccaaa caacagggtg 5940
agcatcgaca aaagaaacag taccaagcaa ataaatagcg tatgaaggca gggctaaaaa 6000
aatccacata tagctgctgc atatgccatc atccaagtat atcaagatca aaataattat 6060
aaaacatact tgtttattat aatagatagg tactcaaggt tagagcatat gaatagatgc 6120
tgcatatgcc atcatgtata tgcatcagta aaacccacat caacatgtat acctatccta 6180
gatcgatatt tccatccatc ttaaactcgt aactatgaag atgtatgaca cacacataca 6240
gttccaaaat taataaatac accaggtagt ttgaaacagt attctactcc gatctagaac 6300
gaatgaacga ccgcccaacc acaccacatc atcacaacca agcgaacaaa aagcatctct 6360
gtatatgcat cagtaaaacc cgcatcaaca tgtataccta tcctagatcg atatttccat 6420
ccatcatctt caattcgtaa ctatgaatat gtatggcaca cacatacaga tccaaaatta 6480
ataaatccac caggtagttt gaaacagaat tctactccga tctagaacga ccgcccaacc 6540
agaccacatc atcacaacca agacaaaaaa aagcatgaaa agatgacccg acaaacaagt 6600
gcacggcata tattgaaata aaggaaaagg gcaaaccaaa ccctatgcaa cgaaacaaaa 6660
aaaatcatga aatcgatccc gtctgcggaa cggctagagc catcccagga ttccccaaag 6720
agaaacactg gcaagttagc aatcagaacg tgtctgacgt acaggtcgca tccgtgtacg 6780
aacgctagca gcacggatct aacacaaaca cggatctaac acaaacatga acagaagtag 6840
aactaccggg ccctaaccat ggaccggaac gccgatctag agaaggtaga gagggggggg 6900
gggggaggac gagcggcgta ccttgaagcg gaggtgccga cgggtggatt tgggggagat 6960
ctggttgtgt gtgtgtgcgc tccgaacaac acgaggttgg ggaaagaggg tgtggagggg 7020
gtgtctattt attacggcgg gcgaggaagg gaaagcgaag gagcggtggg aaaggaatcc 7080
cccgtagctg ccgtgccgtg agaggaggag gaggccgcct gccgtgccgg ctcacgtctg 7140
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atgtactaaa aaaattagtc tataaaaacc attaacccta aaccctaaat ggatgtacta 7560
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catgtctaac tgttcattta tatgattctc taaaacactg atattattgt agtactatag 7740
attatattat tcgtagagta aagtttaaat atatgtataa agatagataa actgcacttc 7800
aaacaagtgt gacaaaaaaa atatgtggta attttttata acttagacat gcaatgctca 7860
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taatgaggta aagagaaaat gagcaaaagc acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc 10140
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ac 16802
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gacatggact taaagctctc gaacttattg gtgatctgat agcccttcag ggcgccgcct 1920
gttgcacaag gattagactt cttgtccacc atgtagttca gcttatcgat cagcatcttc 1980
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ttgccgtcca ccaccacgat atacagcaga ttgcgctcgc ccctatcgat gccgatcaca 2340
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tttgtagaga gagactggtg atttcagcgt gtcctctcca aatgaaatga acttccttat 15720
atagaggaag gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg tcagtggaga 15780
tatcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc 15840
tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tgaacgatag 15900
cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt aggtgccacc ttccttttct actgtccttt 15960
tgatgaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag gtttcccgat attacccttt 16020
gttgaaaagt ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt atctttgata ttcttggagt 16080
agacgagagt gtcgtgctcc accatgttat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg 16140
ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac 16200
tgtcggcaga ggcatcttga acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg 16260
tgccaccttc cttttctact gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc 16320
cgaggaggtt tcccgatatt accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg 16380
agactgtatc tttgatattc ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttggcaa 16440
gctgctctag ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 16500
ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 16560
ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 16620
tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attac 16675
<210> 4
<211> 670
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaccaacatt tgggtatggt ggtgcaatgg gaggattgat ggggatggta gcttcctcat 60
gaacattcag gagctggcat tgatccgcat tgagaacctc cctgtgaagg tgatggtgtt 120
gaacaaccaa cacctaggca tggtcgtcca gttggaggat aggttttaca aggcgaatag 180
ggcgcataca tacttgggca acccggaatg tgagagcgag atatatccag attttgtgac 240
tattgctaag gggttcaata ttcctgcagt ccgtgtaaca aagaagagtg aagtccgtgc 300
cgccatcaag aagatgctcg agactccagg gccatacttg ttggacatca tcgtcccgca 360
ccaggagcat gtgctgccta tgatcccaat tgggggcgca ttcaaggaca tgatcctgga 420
tggtgatggc aggactgtgt attaatctat aatctgtatg ttggcaaagc accagcccgg 480
cctatgtctg acgtgaatga ctcataaaga gtggtatgcc tatgatgttt gtatgtgctc 540
tatcaataac taaggtgtca actatgaacc atatgctctt ctgttttact tgtttgatgt 600
gcttggcatg gtaatcctaa ttagcttcct gctgtttgac ctgaatgacc cataaagagt 660
ggtatgccta 670
<210> 5
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctaggcatg gtcgtccagt tggaggatag gttttacaag gcgaataggg cgcatacata 60
cttgggcaac ccggaatgtg agagcgagat atatccagat tttgtgacta ttgctaaggg 120
gttcaatatt cctgcagtcc gtgtaacaaa gaagagtgaa gtccgtgccg ccatcaagaa 180
gatgctcgag actccagggc catacttgtt ggacatcatc gtcccgcacc aggagcatgt 240
gctgcctatg atcccaattg ggggcgcatt caaggacatg atcctggatg gtgatggcag 300
gactgtgtat taatctataa tctgtatgtt ggcaaagcac cagcccggcc tatgtctgac 360
gtgaatgact cataaagagt ggta 384
<210> 6
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttgggtatg gtggtgcaat gggaggatag gttttacaag gcgaataggg cgcatacata 60
cttgggcaac ccggaatgtg agagcgagat atatccagat tttgtgacta ttgctaaggg 120
gttcaatatt cctgcagtcc gtgtaacaaa gaagagtgaa gtccgtgccg ccatcaagaa 180
gatgctcgag actccagggc catacttgtt ggatatcatc gtcccgcacc aggagcatgt 240
gctgcctatg atcccaagtg ggggcgcatt caaggacatg atcctggatg gtgatggcag 300
gactgtgtat taatctataa tctgtatgtt ggcaaagcac cagcccggcc tatgtttgac 360
ctgaatgacc cataaagagt ggta 384
<210> 7
<211> 1260
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala
1 5 10 15
Ala Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr
20 25 30
Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile Asp
35 40 45
Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Lys
50 55 60
Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn Asp
65 70 75 80
Val Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu Asn Asn Tyr Ile Ser Leu
85 90 95
Phe Arg Lys Lys Thr Arg Thr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
100 105 110
Leu Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Tyr Lys Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Ile Glu Thr Ile Leu
130 135 140
Pro Glu Phe Leu Asp Asp Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Asn Ser Phe
145 150 155 160
Asn Gly Phe Thr Thr Ala Phe Thr Gly Phe Phe Asp Asn Arg Glu Asn
165 170 175
Met Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala Phe Arg Cys Ile
180 185 190
Asn Glu Asn Leu Thr Arg Tyr Ile Ser Asn Met Asp Ile Phe Glu Lys
195 200 205
Val Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu Lys
210 215 220
Ile Leu Asn Ser Asp Tyr Asp Val Glu Asp Phe Phe Glu Gly Glu Phe
225 230 235 240
Phe Asn Phe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn Ala Ile
245 250 255
Ile Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn
260 265 270
Glu Tyr Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys Thr Lys Gln Lys Leu Pro Lys
275 280 285
Phe Lys Pro Leu Tyr Lys Gln Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Leu Ser
290 295 300
Phe Tyr Gly Glu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val Phe
305 310 315 320
Arg Asn Thr Leu Asn Lys Asn Ser Glu Ile Phe Ser Ser Ile Lys Lys
325 330 335
Leu Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly Ile
340 345 350
Phe Val Lys Asn Gly Pro Ala Ile Ser Thr Ile Ser Lys Asp Ile Phe
355 360 365
Gly Glu Trp Asn Val Ile Arg Asp Lys Trp Asn Ala Glu Tyr Asp Asp
370 375 380
Ile His Leu Lys Lys Lys Ala Val Val Thr Glu Lys Tyr Glu Asp Asp
385 390 395 400
Arg Arg Lys Ser Phe Lys Lys Ile Gly Ser Phe Ser Leu Glu Gln Leu
405 410 415
Gln Glu Tyr Ala Asp Ala Asp Leu Ser Val Val Glu Lys Leu Lys Glu
420 425 430
Ile Ile Ile Gln Lys Val Asp Glu Ile Tyr Lys Val Tyr Gly Ser Ser
435 440 445
Glu Lys Leu Phe Asp Ala Asp Phe Val Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys
450 455 460
Asn Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser Val Lys
465 470 475 480
Ser Phe Glu Asn Tyr Ile Lys Ala Phe Phe Gly Glu Gly Lys Glu Thr
485 490 495
Asn Arg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr Asp Ile
500 505 510
Leu Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile Arg Asn Tyr Val Thr
515 520 525
Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Leu Tyr Phe Gln Asn Pro
530 535 540
Gln Phe Met Gly Gly Trp Asp Lys Asp Lys Glu Thr Asp Tyr Arg Ala
545 550 555 560
Thr Ile Leu Arg Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile Met Asp Lys
565 570 575
Lys Tyr Ala Lys Cys Leu Gln Lys Ile Asp Lys Asp Asp Val Asn Gly
580 585 590
Asn Tyr Glu Lys Ile Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met
595 600 605
Leu Pro Lys Val Phe Phe Ser Lys Lys Trp Met Ala Tyr Tyr Asn Pro
610 615 620
Ser Glu Asp Ile Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys Gly
625 630 635 640
Asp Met Phe Asn Leu Asn Asp Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe Lys
645 650 655
Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Pro Lys Trp Ser Asn Ala Tyr Asp Phe Asn
660 665 670
Phe Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Lys Asp Ile Ala Gly Phe Tyr Arg Glu
675 680 685
Val Glu Glu Gln Gly Tyr Lys Val Ser Phe Glu Ser Ala Ser Lys Lys
690 695 700
Glu Val Asp Lys Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr Met Phe Gln Ile
705 710 715 720
Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His Gly Thr Pro Asn Leu His
725 730 735
Thr Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly Gln Ile
740 745 750
Arg Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser Leu Lys
755 760 765
Lys Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala Asn Lys
770 775 780
Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Val Tyr
785 790 795 800
Lys Asp Lys Arg Phe Ser Glu Asp Gln Tyr Glu Leu His Ile Pro Ile
805 810 815
Ala Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile Asn Thr Glu Val
820 825 830
Arg Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly Ile Asp
835 840 845
Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly Lys Gly
850 855 860
Asn Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile Ile Asn Asn Phe Asn
865 870 875 880
Gly Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys Glu
885 890 895
Lys Glu Arg Phe Glu Ala Arg Gln Asn Trp Thr Ser Ile Glu Asn Ile
900 905 910
Lys Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys Ile Cys
915 920 925
Glu Leu Val Glu Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Glu Asp Leu Asn
930 935 940
Ser Gly Phe Lys Asn Ser Arg Val Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln
945 950 955 960
Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Met Val Asp Lys
965 970 975
Lys Ser Asn Pro Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Lys Gly Tyr Gln Ile
980 985 990
Thr Asn Lys Phe Glu Ser Phe Lys Ser Met Ser Thr Gln Asn Gly Phe
995 1000 1005
Ile Phe Tyr Ile Pro Ala Trp Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser Thr
1010 1015 1020
Gly Phe Val Asn Leu Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ser Ile Ala Asp Ser
1025 1030 1035 1040
Lys Lys Phe Ile Ser Ser Phe Asp Arg Ile Met Tyr Val Pro Glu Glu
1045 1050 1055
Asp Leu Phe Glu Phe Ala Leu Asp Tyr Lys Asn Phe Ser Arg Thr Asp
1060 1065 1070
Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Tyr Gly Asn Arg Ile
1075 1080 1085
Arg Ile Phe Arg Asn Pro Lys Lys Asn Asn Val Phe Asp Trp Glu Glu
1090 1095 1100
Val Cys Leu Thr Ser Ala Tyr Lys Glu Leu Phe Asn Lys Tyr Gly Ile
1105 1110 1115 1120
Asn Tyr Gln Gln Gly Asp Ile Arg Ala Leu Leu Cys Glu Gln Ser Asp
1125 1130 1135
Lys Ala Phe Tyr Ser Ser Phe Met Ala Leu Met Ser Leu Met Leu Gln
1140 1145 1150
Met Arg Asn Ser Ile Thr Gly Arg Thr Asp Val Asp Phe Leu Ile Ser
1155 1160 1165
Pro Val Lys Asn Ser Asp Gly Ile Phe Tyr Asp Ser Arg Asn Tyr Glu
1170 1175 1180
Ala Gln Glu Asn Ala Ile Leu Pro Lys Asn Ala Asp Ala Asn Gly Ala
1185 1190 1195 1200
Tyr Asn Ile Ala Arg Lys Val Leu Trp Ala Ile Gly Gln Phe Lys Lys
1205 1210 1215
Ala Glu Asp Glu Lys Leu Asp Lys Val Lys Ile Ala Ile Ser Asn Lys
1220 1225 1230
Glu Trp Leu Glu Tyr Ala Gln Thr Ser Val Lys His Lys Arg Pro Ala
1235 1240 1245
Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1250 1255 1260

Claims (6)

1.一种用于取代植物基因组中的目标片段的表达盒甲，包括启动子甲和终止子，其特征在于：在启动子甲和终止子之间包括如下三个区段：区段Ⅰ、区段Ⅱ和区段Ⅲ；区段Ⅲ为区段Ⅲ-1或区段Ⅲ-2；
所述启动子甲为OsU3启动子；
区段Ⅰ自5’至3’端依次具有Hammerhead型核酸酶的编码序列、crRNA1的编码序列和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列；
区段Ⅱ自5’至3’端依次具有Hammerhead型核酸酶的编码序列、crRNA2的编码序列和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列；
区段Ⅲ-1中自5’至3’端依次具有Hammerhead型核酸酶的编码序列、上游同源臂、供体片段序列、下游同源臂和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列；
区段Ⅲ-2中自5’至3’端依次具有crRNA1的靶标序列、上游同源臂、供体片段序列、下游同源臂和crRNA2的靶标序列；
所述目标片段的一个末端为区段Ⅰ中crRNA1的靶点序列，另一个末端为区段Ⅱ中crRNA2的靶点序列；
供体片段与目标片段具有如下差异：①预期在目标片段中引入的差异核苷酸；②将crRNA1中的PAM序列TTTN突变为非TTTN；③将crRNA2的PAM序列TTTN突变为非TTTN；
Figure DEST_PATH_IMAGE002
将crRNA1和crRNA2中的靶点序列进行同义突变；
所述表达盒甲如序列表的序列1自5’端第13-1686位所示，或，所述表达盒甲如序列表的序列2所示。
2.含有权利要求1所述表达盒甲的重组载体。
3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体还包括表达盒乙；所述表达盒乙中由启动子乙启动LbCpf1核酸酶的编码基因表达，所述启动子乙为Ubi启动子。
4.如权利要求2或3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为序列表的序列1所示的环形质粒，或，所述重组载体为采用序列2所示的双链DNA分子替代序列1自5’端第13-1686位得到的环形质粒。
5.权利要求1所述表达盒甲或权利要求2至4任一所述的重组载体在实现植物中以RNA转录本为模板进行靶基因同源重组中的应用；所述植物为水稻。
6.一种植物中以RNA转录本为模板进行靶基因同源重组的方法，包括如下步骤：将权利要求2至4任一所述的重组载体导入出发植物，实现植物中靶基因同源重组；所述植物为水稻。
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