CN110885868B - 一种利用细胞色素P450酶合成2α-羟基化类固醇化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用细胞色素P450酶合成2‑羟基化类固醇化合物的方法，属于生物技术领域，该方法首先构建了来自阿维链霉菌的CYP154C2基因与还原伴侣RhFRED基因共表达载体，在大肠杆菌中表达；经过培养后，利用静息细胞法喂养底物睾酮、雄烯二酮进行生物转化，获得2α位羟基化产物。此反应具有严格的区域选择性和立体选择性，产生唯一产物，使产物的分离纯化更加快速、效率。

Description

一种利用细胞色素P450酶合成2α-羟基化类固醇化合物的 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用细胞色素P450酶合成2α-羟基化类固醇化合物的方法，具体说，是通过利用新型细胞色素P450酶CYP154C2与还原伴侣RhFRED的共表达重组菌进行生物转化获得2α羟基睾酮和2α羟基雄烯二酮的方法。

背景技术

细胞色素P450酶是一类含硫醇-血红素的末端单加氧酶，广泛存在于动物、植物及微生物中。P450酶在温和条件下即可对结构复杂的化合物起到高效的催化作用，研究发现P450酶识别的底物结构类型有脂肪酸类、萜类、多肽类、大环内酯类、生物碱、甾体化合物及芳香族化合物等，催化的反应类型有羟基化反应、环氧化反应、脱烷基反应、脱氨基反应和脱硫反应等。鉴于P450酶的高效催化活性和对底物选择的多样性，越来越多的P450酶作为生物催化剂被应用于制药领域，合成药物及药物中间方面的应用是细胞色素P450酶产业化的一个重要方向，并且已有如青篙酸，普伐他汀等药物中间体及药物通过P450酶催化合成的工业化成功案例。

类固醇类化合物以环戊烷多氢菲为母核，由三个六元环和一个五元环组成，分别称为A,B,C,D环，此类化合物在生物代谢、生殖发育、免疫调节、癌症治疗等方面均具有独特的生理功能，在医药领域占有重要地位。通过生物转化对类固醇类化合物进行结构修饰可能会造成物理化学和药物性质发生巨大变化。例如，11-脱氧可的松的11β位发生羟基化得到重要的激素类药物可的松；16位羟基化能显著提高糖皮质激素的活性。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种利用细胞色素P450酶合成2α-羟基化类固醇化合物的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：1、一种利用细胞色素P450酶合成2-羟基化类固醇化合物的方法，包括以下步骤：

(1)制备共表达重组大肠杆菌：利用无缝克隆技术将pET28b-CYP154C2与RhFRED基因连在一起，得到重组质粒pET28b-CYP154C2-RhFRED，将所述质粒转入到大肠杆菌BL21(DE₃)，构建重组大肠杆菌。所述pET28b-CYP154C2的基因序列如SEQ ID NO.1所示，pET28b-CYP154C2-RhFRED基因序列如SEQ ID NO.2所示，其中CYP154C2的基因序列如SEQ ID NO.3所示，RhFRED的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

(2)重组大肠杆菌的前培养和扩大培养：将步骤1构建的重组大肠杆菌加入LB培养基中，在37℃条件下培养16小时，得重组大肠杆菌的种子液。将所述种子液接种到M9培养基中，所述种子液和M9培养基的体积比为1:100，在37℃条件下进行扩大培养，直至菌液OD₆₀₀值达到0.8，然后加入IPTG和5-氨基乙酰丙酸盐诱导菌体表达蛋白，同时将温度降低至20℃，继续培养20-24h，离心收集菌体。所述IPTG在M9培养基中的浓度为0.2mM，所述5-氨基乙酰丙酸盐在M9培养基中的浓度为0.5mM。

(3)生物转化合成2-羟基化类固醇化合物：将收集的菌体悬浮在磷酸钠缓冲液中，保持pH为7.2，加入底物进行生物转化，在30℃振荡反应16h后，对发酵液进行提取、分离，得到2-羟基化类固醇化合物。所述底物在磷酸钠缓冲液中的浓度为100μM，所述底物为睾酮或雄烯二酮。

进一步地，所述磷酸钠缓冲液由终浓度为1mM的EDTA、终浓度为2mM二硫苏糖醇、甘油组成，甘油体积为所述磷酸钠缓冲液的10％。

进一步地，步骤3中所述底物为睾酮，经生物转化，得到的2-羟基化类固醇化合物为2α-羟基睾酮。

进一步地，步骤3中所述底物为雄烯二酮，经生物转化，得到的2-羟基化类固醇化合物为2α-羟基雄烯二酮。

本发明的有益效果是：①本发明涉及的CYP154C2为未公开的新酶，其重组菌可转化睾酮及雄烯二酮产生2α位羟基化产物，此产物现阶段只能从化学合成方法获得；②CYP154C2酶对类固醇类化合物具有严格的区域选择性和立体选择性，生产唯一产物即2α位羟基睾酮或2α位羟基雄烯二酮，可提高分离提取的效率；③本发明构建的催化体系可以在温和条件下选择性地进行氧化反应，相比于传统化学反应的复杂工艺流程，其在生物制药领域具有很大的应用价值；④利用重组菌的生物转化可大大减少副反应产物，易于分离出所要的产物，因此达到高效率。

附图说明

图1为CYP154C2与底物生物转化的流程图；

图2为实验样品的HPLC图谱，其中图2A为睾酮，图2B为雄烯二酮；

图3为底物睾酮及其反应16小时的产物对应的质谱图：图3a为睾酮，图3b为其反应16小时的产物；

图4为底物雄烯二酮及其反应16小时的产物对应的质谱图：图4a为雄烯二酮，图4b为其反应16小时的产物。

具体实施方式

以下结合实施例详细对本发明作进一步地说明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。

实施例1

图1为CYP154C2与底物生物转化的流程图，具体包括如下步骤：

1、制备共表达重组大肠杆菌：

CYP154C2的编码基因sav3882序列如SEQ ID NO.3所示，通过PCR得到，模板是阿维链霉菌MA4680的全基因组，所用正向引物序列为SEQ ID NO.5具体为：5′-GGAATTCCATATGACGACTCGTATCGCCCTGGACCCGT-3′，所用反向引物序列为SEQ ID NO.6，具体为：5′-CCGCTCGAGTCAGCCCAGCCGCACCGGCAG-3′。将克隆得到的基因片段插入pET28的两个酶切位点NdeI和XhoI之间，最后得到重组质粒pET28b-CYP154C2，编码的CYP154C2的N端带6个His标签，所述pET28b-CYP154C2的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

用XhoI将pET28b-CYP154C2线性化，扩增RhFRED基因(5′和3′末端分别带有和线性化载体两末端一致的基因序列)，所用正向引物序列为SEQ ID NO.7，具体为：5′-AGCTGCCGGTGCGGCTGGGCGTGCTGCACCGGCATCAACC-3′，所用反向引物序列为SEQ ID NO.8，具体为：5′-TGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGAGTCGCAGGGCCAGCC-3′，之后将PCR产物和线性化载体按一定比例混合后，在

II重组酶的催化下，37℃反应30min，得到重组质粒pET28b-CYP154C2-RhFRED，所述pET28b-CYP154C2-RhFRED基因序列如SEQ ID NO.2所示。将重组质粒pET28b-CYP154C2-RhFRED转入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，利用含有卡那霉素的LB固体培养基筛选出单克隆，得到多酶共表达的重组大肠杆菌。所述RhFRED的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

2、重组大肠杆菌的前培养和扩大培养：

将共表达重组大肠杆菌接种到LB液体培养基中，在pH为7.4-7.6范围内，温度为37℃、转速为220rpm条件下培养16小时，得到重组大肠杆菌的种子液。将种子液接种到M9培养基中进行扩大培养、发酵；种子液和M9培养基的体积比为1:100，接种后，重组的大肠杆菌继续在37℃下培养，直至菌液OD₆₀₀值达到0.8，然后加入IPTG和5-氨基乙酰丙酸盐诱导菌体大量表达蛋白，同时将温度降低至20℃，继续培养20h，离心收集菌体。所述IPTG在M9培养基中的浓度为0.2mM，所述5-氨基乙酰丙酸盐在M9培养基中的浓度为0.5mM。

其中，M9培养基是在M9盐溶液中添加质量浓度为1％的酪蛋白氨基酸、质量浓度为0.4％的葡萄糖、0.1mM氯化钙、1mM氯化镁、0.1mM三氯化铁。

3、生物转化合成2α-羟基睾酮：

用磷酸钠缓冲液对步骤2所得菌体洗涤两次，收集洗涤后的菌体，并将菌体悬浮于磷酸钠缓冲液中，保持pH为7.2，所述磷酸钠缓冲液由终浓度为1mM的EDTA、终浓度为2mM二硫苏糖醇和甘油组成，甘油体积为所述磷酸钠缓冲液的10％。加入睾酮，在30℃振荡反应16h后，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，收集合并乙酸乙酯层，待乙酸乙酯彻底挥干后，得到2α-羟基睾酮。所述菌体与磷酸钠缓冲液的质量比为1:10，所述睾酮在磷酸钠缓冲液中的浓度为100μM。

实施例2

将实施例1步骤3中的底物换成雄烯二酮，所述雄烯二酮在磷酸钠缓冲液中的浓度为100μM，其余条件不变，最终得到2α-羟基雄烯二酮。

实施例3

向实施例1得到的2α-羟基睾酮或实施例2获得的2α-羟基雄烯二酮中加入100μL甲醇溶解，进行HPLC检测分析和LC/MS分析。本发明中HPLC分析采用的是日本的LC-20AT HPLC体系和COSMOSIL填充柱，流动相采用的是45vt％-100vt％甲醇-水梯度洗脱20min，检测波长是240nm，流速是1ml/min。

LC/MS分析所采用的是Agilent 6230飞行时间质谱，色谱柱采用的是安捷伦的反向ODS柱，流动相采用的是45vt％-100vt％甲醇-水梯度洗脱40min，流速是0.6mL/min，检测波长是240nm，MS分析选用正离子模式。

图2为实验样品的HPLC图谱，其中图2A为睾酮的标准品和反应16个小时后获得的2α-羟基睾酮图谱，睾酮和2α-羟基睾酮的保留时间分别为18.428min和14.520min；图2B为雄烯二酮的标准品和反应16个小时后获得的2α-羟基雄烯二酮图谱，雄烯二酮和和2α-羟基雄烯二酮保留时间分别为17.018min和13.362min。此结果显示获得的产物为唯一产物，说明了较严格的底物选择性。

图3为睾酮和其反应16小时的产物对应的质谱图，图3a为睾酮，图3b为反应16小时的产物；保留时间在18.428min和14.520min的[M+Na]⁺分子量分别为311.1978和327.1923；图4为雄烯二酮和其反应16小时的产物对应的质谱图，图4a为雄烯二酮，图4b为其反应16小时的产物，保留时间在17.018min和13.362min的[M+Na]⁺分子量分别为309.1824和325.1766。由此可知，反应16小时的产物相对于底物都增加了一个羟基基团的分子量，所以可以推测转化产物为羟基化产物，并通过核磁鉴定反应16小时的化合物，图3b对应的产物为2α-羟基睾酮，图4b对应的产物为2α-羟基雄烯二酮。

通过此催化体系所获得的产物2α-羟基化类固醇化合物有望在生物制药领域具有较好的应用价值，相比于传统化学合成的复杂工艺流程，具有更好的经济效益和环境效益。

序列表

<110> 浙江理工大学

<120> 一种利用细胞色素P450酶合成2α-羟基化类固醇化合物的方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6496

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtcagccc agccgcaccg 180

gcagctcgaa caggtcgttc tgggtcacca ccggcttgtt gcggagttcc gccgccggga 240

ccgccaggtc cagcttcggg aagcgggcgt agagggccgg cagtgcgacg cccgcctcca 300

gacgggacag cgccgcgccc gggcacacgt gcgggccgtg gccgaaggag atgtgccggt 360

tctccgtgga gcgcgtgatg tcgaactcgc ccgccgtcgg cccgtgcgcc gcctcgtcgc 420

ggccgagggc gccgtacgac acgatcagcg cgtcacccgc cgggagcacc ttgtccccga 480

ccgggacgtc ctcggtcgcg aagcggatca ggacgtggga ggtcggcgtc gagtagcgca 540

gcgtctcctc gaccaccgac gaccagtccg cctcgccgga caggacgagg gcgcgctgct 600

cggggtgcgt ggagaggttg acgaccgcgt tgacgatgag ggagatcgtc gtctcgtggc 660

cggccgcgac catcagctgg agcgtggaga cgatctccgc gtcggtgagg tggtcgccgt 720

cctcggaggc caggatcagc gcgctggtca ggtcgtcgcc cggtgccgcc cgcttggcgg 780

ccaccgtctc cgccatgatc ccggcgagct cggtgagggt ggcgatgacc tcggccggcg 840

gggtctgggt cgagaagaac ttctcgaaca gctcccccag ccgggggagt ctcgcctcgt 900

cgatgcccat gaggtcggcg acgacgtaca tgggcagggg gtaggcgaag tcggccttca 960

ggtcgacgac ctcgccggtg agccggtcga ggagctcctc cgtcagcttg gtgatccgct 1020

cccgcatctg ctccacacgc cggggcgtga gcgcctgcgc gaccagggtg cgcatccggc 1080

ggtggtccgc gccgtccacc gtgagcatgg agcggccggg gttggccagg ccgatcagcg 1140

gccagtccgg ggctatctca ccgcgctgcc aggcgcccca gacgttgatg tccttcacca 1200

gccggggatc cgtgaggagc ttcttggcct cggcgtggtg cgtcaccgcc cacacgggca 1260

ccccgccggg cagttcgacg gcggcgagcg gacccgcggc gcgcagggcg gcgctctcag 1320

cctccaggtc ggagacgaac gggtccaggg cgatacgagt cgtcatatgg ctgccgcgcg 1380

gcaccaggcc gctgctgtga tgatgatgat gatggctgct gcccatggta tatctccttc 1440

ttaaagttaa acaaaattat ttctagaggg gaattgttat ccgctcacaa ttcccctata 1500

gtgagtcgta ttaatttcgc gggatcgaga tctcgatcct ctacgccgga cgcatcgtgg 1560

ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg 1620

gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg 1680

caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg ccatctcctt gcatgcacca ttccttgcgg 1740

cggcggtgct caacggcctc aacctactac tgggctgctt cctaatgcag gagtcgcata 1800

agggagagcg tcgagatccc ggacaccatc gaatggcgca aaacctttcg cggtatggca 1860

tgatagcgcc cggaagagag tcaattcagg gtggtgaatg tgaaaccagt aacgttatac 1920

gatgtcgcag agtatgccgg tgtctcttat cagaccgttt cccgcgtggt gaaccaggcc 1980

agccacgttt ctgcgaaaac gcgggaaaaa gtggaagcgg cgatggcgga gctgaattac 2040

attcccaacc gcgtggcaca acaactggcg ggcaaacagt cgttgctgat tggcgttgcc 2100

acctccagtc tggccctgca cgcgccgtcg caaattgtcg cggcgattaa atctcgcgcc 2160

gatcaactgg gtgccagcgt ggtggtgtcg atggtagaac gaagcggcgt cgaagcctgt 2220

aaagcggcgg tgcacaatct tctcgcgcaa cgcgtcagtg ggctgatcat taactatccg 2280

ctggatgacc aggatgccat tgctgtggaa gctgcctgca ctaatgttcc ggcgttattt 2340

cttgatgtct ctgaccagac acccatcaac agtattattt tctcccatga agacggtacg 2400

cgactgggcg tggagcatct ggtcgcattg ggtcaccagc aaatcgcgct gttagcgggc 2460

ccattaagtt ctgtctcggc gcgtctgcgt ctggctggct ggcataaata tctcactcgc 2520

aatcaaattc agccgatagc ggaacgggaa ggcgactgga gtgccatgtc cggttttcaa 2580

caaaccatgc aaatgctgaa tgagggcatc gttcccactg cgatgctggt tgccaacgat 2640

cagatggcgc tgggcgcaat gcgcgccatt accgagtccg ggctgcgcgt tggtgcggat 2700

atctcggtag tgggatacga cgataccgaa gacagctcat gttatatccc gccgttaacc 2760

accatcaaac aggattttcg cctgctgggg caaaccagcg tggaccgctt gctgcaactc 2820

tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag ctgttgcccg tctcactggt gaaaagaaaa 2880

accaccctgg cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg 2940

cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt 3000

aagttagctc actcattagg caccgggatc tcgaccgatg cccttgagag ccttcaaccc 3060

agtcagctcc ttccggtggg cgcggggcat gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt 3120

ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc ggcagcgctc tgggtcattt tcggcgagga 3180

ccgctttcgc tggagcgcga cgatgatcgg cctgtcgctt gcggtattcg gaatcttgca 3240

cgccctcgct caagccttcg tcactggtcc cgccaccaaa cgtttcggcg agaagcaggc 3300

cattatcgcc ggcatggcgg ccccacgggt gcgcatgatc gtgctcctgt cgttgaggac 3360

ccggctaggc tggcggggtt gccttactgg ttagcagaat gaatcaccga tacgcgagcg 3420

aacgtgaagc gactgctgct gcaaaacgtc tgcgacctga gcaacaacat gaatggtctt 3480

cggtttccgt gtttcgtaaa gtctggaaac gcggaagtca gcgccctgca ccattatgtt 3540

ccggatctgc atcgcaggat gctgctggct accctgtgga acacctacat ctgtattaac 3600

gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt tctctggtcc cgccgcatcc ataccgccag 3660

ttgtttaccc tcacaacgtt ccagtaaccg ggcatgttca tcatcagtaa cccgtatcgt 3720

gagcatcctc tctcgtttca tcggtatcat tacccccatg aacagaaatc ccccttacac 3780

ggaggcatca gtgaccaaac aggaaaaaac cgcccttaac atggcccgct ttatcagaag 3840

ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa cgagctggac gcggatgaac aggcagacat 3900

ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga gctttaccgc agctgcctcg cgcgtttcgg 3960

tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta 4020

agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg 4080

gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg tatactggct taactatgcg 4140

gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 4200

gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 4260

gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 4320

ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 4380

ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 4440

atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 4500

aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 4560

gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 4620

ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 4680

ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 4740

acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 4800

gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 4860

ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 4920

ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 4980

gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 5040

ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgaacaa taaaactgtc tgcttacata 5100

aacagtaata caaggggtgt tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg ctctaggccg 5160

cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc 5220

gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt 5280

ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt cagactaaac 5340

tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat 5400

gcatggttac tcaccactgc gatccccggg aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat 5460

cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg 5520

attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa 5580

tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg taatggctgg 5640

cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat aaacttttgc cattctcacc ggattcagtc 5700

gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa attaataggt 5760

tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg 5820

aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt 5880

gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt tttctaagaa 5940

ttaattcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 6000

gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga aattgtaaac gttaatattt tgttaaaatt 6060

cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat 6120

cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa 6180

gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg 6240

cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa 6300

agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc 6360

gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag 6420

tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg 6480

cgcgtcccat tcgcca 6496

<210> 2

<211> 7483

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtcagagt cgcagggcca 180

gccggtcgcc acaggcacgc gagcagcagg tcatcatctg ccggttcgcc gcccgctcgg 240

ccttggtcag caccgtgtcg cgatggtcga cctcgccgtc gaggacggcg acctcgcacg 300

agccgcagag gccttcctcg cagtcgctgg gcacgtcgat gttgttggcg cgcaacgcgt 360

cgaggacggt ctgggtgggt tcgacccgca cggtcagccc cgagtcacgc agttcgaggt 420

cgaaggcgtg ctcgacgtcc ggatcgagcg ccgcgaggga cgaggtgaag tgctcgacgt 480

gcagcgcccc gtcgggccag ttccggctcg cgtcctcgag tccggcgagc agccgcccgg 540

gcccgcacgc gtagatctgg acgccggggg cgggctcggc gaggagggcg gcgaggtcga 600

tccgggtgcc ttcctcggac acgtgcaggg cggcccggtc accgtgcccg gcgacacgct 660

cgagataggc catgccggaa cggtttcggc cgcagtagtg cagttcgtag ctccaccccc 720

gggcgcgggc gtggtcggcc atggccagga ctggggtgat gccgatgccg ccggcgacga 780

acacgtagtg ctcggcgccg gggtcgagcg cgaaatggtt ccgagggccg cgcatccgga 840

gcgggcttcc cacctcgagc tgttcgtgga tgtagcgcga accgccgcgg ctctcgggat 900

ccaggtgcac ggcaatctcg tagctcggcg catcgggcgc gccgcacagg gagtactggc 960

gcgacagcgc gccgaggtcg aggtcgatat gggcgccggg agtccacgtg ggcaatgtct 1020

ttccgccggc gtcgcgcagg acgaggcgca gcacgtcgtc ggcgatccgg tccaggcgct 1080

cgacggtgac ggtgcgggac accgcccggg cggcgggttc tccgatggtg accggttgat 1140

gccggtgcag cacgcccagc cgcaccggca gctcgaacag gtcgttctgg gtcaccaccg 1200

gcttgttgcg gagttccgcc gccgggaccg ccaggtccag cttcgggaag cgggcgtaga 1260

gggccggcag tgcgacgccc gcctccagac gggacagcgc cgcgcccggg cacacgtgcg 1320

ggccgtggcc gaaggagatg tgccggttct ccgtggagcg cgtgatgtcg aactcgcccg 1380

ccgtcggccc gtgcgccgcc tcgtcgcggc cgagggcgcc gtacgacacg atcagcgcgt 1440

cacccgccgg gagcaccttg tccccgaccg ggacgtcctc ggtcgcgaag cggatcagga 1500

cgtgggaggt cggcgtcgag tagcgcagcg tctcctcgac caccgacgac cagtccgcct 1560

cgccggacag gacgagggcg cgctgctcgg ggtgcgtgga gaggttgacg accgcgttga 1620

cgatgaggga gatcgtcgtc tcgtggccgg ccgcgaccat cagctggagc gtggagacga 1680

tctccgcgtc ggtgaggtgg tcgccgtcct cggaggccag gatcagcgcg ctggtcaggt 1740

cgtcgcccgg tgccgcccgc ttggcggcca ccgtctccgc catgatcccg gcgagctcgg 1800

tgagggtggc gatgacctcg gccggcgggg tctgggtcga gaagaacttc tcgaacagct 1860

cccccagccg ggggagtctc gcctcgtcga tgcccatgag gtcggcgacg acgtacatgg 1920

gcagggggta ggcgaagtcg gccttcaggt cgacgacctc gccggtgagc cggtcgagga 1980

gctcctccgt cagcttggtg atccgctccc gcatctgctc cacacgccgg ggcgtgagcg 2040

cctgcgcgac cagggtgcgc atccggcggt ggtccgcgcc gtccaccgtg agcatggagc 2100

ggccggggtt ggccaggccg atcagcggcc agtccggggc tatctcaccg cgctgccagg 2160

cgccccagac gttgatgtcc ttcaccagcc ggggatccgt gaggagcttc ttggcctcgg 2220

cgtggtgcgt caccgcccac acgggcaccc cgccgggcag ttcgacggcg gcgagcggac 2280

ccgcggcgcg cagggcggcg ctctcagcct ccaggtcgga gacgaacggg tccagggcga 2340

tacgagtcgt catatggctg ccgcgcggca ccaggccgct gctgtgatga tgatgatgat 2400

ggctgctgcc catggtatat ctccttctta aagttaaaca aaattatttc tagaggggaa 2460

ttgttatccg ctcacaattc ccctatagtg agtcgtatta atttcgcggg atcgagatct 2520

cgatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg 2580

gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga 2640

gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca 2700

tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg 2760

gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg agatcccgga caccatcgaa 2820

tggcgcaaaa cctttcgcgg tatggcatga tagcgcccgg aagagagtca attcagggtg 2880

gtgaatgtga aaccagtaac gttatacgat gtcgcagagt atgccggtgt ctcttatcag 2940

accgtttccc gcgtggtgaa ccaggccagc cacgtttctg cgaaaacgcg ggaaaaagtg 3000

gaagcggcga tggcggagct gaattacatt cccaaccgcg tggcacaaca actggcgggc 3060

aaacagtcgt tgctgattgg cgttgccacc tccagtctgg ccctgcacgc gccgtcgcaa 3120

attgtcgcgg cgattaaatc tcgcgccgat caactgggtg ccagcgtggt ggtgtcgatg 3180

gtagaacgaa gcggcgtcga agcctgtaaa gcggcggtgc acaatcttct cgcgcaacgc 3240

gtcagtgggc tgatcattaa ctatccgctg gatgaccagg atgccattgc tgtggaagct 3300

gcctgcacta atgttccggc gttatttctt gatgtctctg accagacacc catcaacagt 3360

attattttct cccatgaaga cggtacgcga ctgggcgtgg agcatctggt cgcattgggt 3420

caccagcaaa tcgcgctgtt agcgggccca ttaagttctg tctcggcgcg tctgcgtctg 3480

gctggctggc ataaatatct cactcgcaat caaattcagc cgatagcgga acgggaaggc 3540

gactggagtg ccatgtccgg ttttcaacaa accatgcaaa tgctgaatga gggcatcgtt 3600

cccactgcga tgctggttgc caacgatcag atggcgctgg gcgcaatgcg cgccattacc 3660

gagtccgggc tgcgcgttgg tgcggatatc tcggtagtgg gatacgacga taccgaagac 3720

agctcatgtt atatcccgcc gttaaccacc atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa 3780

accagcgtgg accgcttgct gcaactctct cagggccagg cggtgaaggg caatcagctg 3840

ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc accctggcgc ccaatacgca aaccgcctct 3900

ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc 3960

gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtaag ttagctcact cattaggcac cgggatctcg 4020

accgatgccc ttgagagcct tcaacccagt cagctccttc cggtgggcgc ggggcatgac 4080

tatcgtcgcc gcacttatga ctgtcttctt tatcatgcaa ctcgtaggac aggtgccggc 4140

agcgctctgg gtcattttcg gcgaggaccg ctttcgctgg agcgcgacga tgatcggcct 4200

gtcgcttgcg gtattcggaa tcttgcacgc cctcgctcaa gccttcgtca ctggtcccgc 4260

caccaaacgt ttcggcgaga agcaggccat tatcgccggc atggcggccc cacgggtgcg 4320

catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta 4380

gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac tgctgctgca aaacgtctgc 4440

gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg 4500

gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc gcaggatgct gctggctacc 4560

ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa gcgctggcat tgaccctgag tgatttttct 4620

ctggtcccgc cgcatccata ccgccagttg tttaccctca caacgttcca gtaaccgggc 4680

atgttcatca tcagtaaccc gtatcgtgag catcctctct cgtttcatcg gtatcattac 4740

ccccatgaac agaaatcccc cttacacgga ggcatcagtg accaaacagg aaaaaaccgc 4800

ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg cttctggaga aactcaacga 4860

gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt cacgaccacg ctgatgagct 4920

ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 4980

cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 5040

cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag 5100

cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 5160

atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt 5220

ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 5280

ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 5340

tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 5400

tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 5460

gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 5520

ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 5580

tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 5640

agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 5700

atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 5760

acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 5820

actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 5880

tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 5940

tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga 6000

tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 6060

tgaacaataa aactgtctgc ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat gagccatatt 6120

caacgggaaa cgtcttgctc taggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat 6180

gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat 6240

gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat 6300

gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc 6360

aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccgggaaa 6420

acagcattcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg 6480

gcagtgttcc tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat 6540

cgcgtatttc gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt 6600

gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataaa 6660

cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt 6720

atttttgacg aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac 6780

cgataccagg atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag 6840

aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat 6900

ttgatgctcg atgagttttt ctaagaatta attcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 6960

ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgaaat 7020

tgtaaacgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt 7080

taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga ccgagatagg 7140

gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt 7200

caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc 7260

aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg 7320

atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa 7380

aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc 7440

cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg cca 7483

<210> 3

<211> 1203

<212> DNA

<213> Streptomyces avermitilis

<400> 3

atgacgactc gtatcgccct ggacccgttc gtctccgacc tggaggctga gagcgccgcc 60

ctgcgcgccg cgggtccgct cgccgccgtc gaactgcccg gcggggtgcc cgtgtgggcg 120

gtgacgcacc acgccgaggc caagaagctc ctcacggatc cccggctggt gaaggacatc 180

aacgtctggg gcgcctggca gcgcggtgag atagccccgg actggccgct gatcggcctg 240

gccaaccccg gccgctccat gctcacggtg gacggcgcgg accaccgccg gatgcgcacc 300

ctggtcgcgc aggcgctcac gccccggcgt gtggagcaga tgcgggagcg gatcaccaag 360

ctgacggagg agctcctcga ccggctcacc ggcgaggtcg tcgacctgaa ggccgacttc 420

gcctaccccc tgcccatgta cgtcgtcgcc gacctcatgg gcatcgacga ggcgagactc 480

ccccggctgg gggagctgtt cgagaagttc ttctcgaccc agaccccgcc ggccgaggtc 540

atcgccaccc tcaccgagct cgccgggatc atggcggaga cggtggccgc caagcgggcg 600

gcaccgggcg acgacctgac cagcgcgctg atcctggcct ccgaggacgg cgaccacctc 660

accgacgcgg agatcgtctc cacgctccag ctgatggtcg cggccggcca cgagacgacg 720

atctccctca tcgtcaacgc ggtcgtcaac ctctccacgc accccgagca gcgcgccctc 780

gtcctgtccg gcgaggcgga ctggtcgtcg gtggtcgagg agacgctgcg ctactcgacg 840

ccgacctccc acgtcctgat ccgcttcgcg accgaggacg tcccggtcgg ggacaaggtg 900

ctcccggcgg gtgacgcgct gatcgtgtcg tacggcgccc tcggccgcga cgaggcggcg 960

cacgggccga cggcgggcga gttcgacatc acgcgctcca cggagaaccg gcacatctcc 1020

ttcggccacg gcccgcacgt gtgcccgggc gcggcgctgt cccgtctgga ggcgggcgtc 1080

gcactgccgg ccctctacgc ccgcttcccg aagctggacc tggcggtccc ggcggcggaa 1140

ctccgcaaca agccggtggt gacccagaac gacctgttcg agctgccggt gcggctgggc 1200

tga 1203

<210> 4

<211> 990

<212> DNA

<213> Rhodococcus sp. NCIMB 9784

<400> 4

gtgctgcacc ggcatcaacc ggtcaccatc ggagaacccg ccgcccgggc ggtgtcccgc 60

accgtcaccg tcgagcgcct ggaccggatc gccgacgacg tgctgcgcct cgtcctgcgc 120

gacgccggcg gaaagacatt gcccacgtgg actcccggcg cccatatcga cctcgacctc 180

ggcgcgctgt cgcgccagta ctccctgtgc ggcgcgcccg atgcgccgag ctacgagatt 240

gccgtgcacc tggatcccga gagccgcggc ggttcgcgct acatccacga acagctcgag 300

gtgggaagcc cgctccggat gcgcggccct cggaaccatt tcgcgctcga ccccggcgcc 360

gagcactacg tgttcgtcgc cggcggcatc ggcatcaccc cagtcctggc catggccgac 420

cacgcccgcg cccgggggtg gagctacgaa ctgcactact gcggccgaaa ccgttccggc 480

atggcctatc tcgagcgtgt cgccgggcac ggtgaccggg ccgccctgca cgtgtccgag 540

gaaggcaccc ggatcgacct cgccgccctc ctcgccgagc ccgcccccgg cgtccagatc 600

tacgcgtgcg ggcccgggcg gctgctcgcc ggactcgagg acgcgagccg gaactggccc 660

gacggggcgc tgcacgtcga gcacttcacc tcgtccctcg cggcgctcga tccggacgtc 720

gagcacgcct tcgacctcga actgcgtgac tcggggctga ccgtgcgggt cgaacccacc 780

cagaccgtcc tcgacgcgtt gcgcgccaac aacatcgacg tgcccagcga ctgcgaggaa 840

ggcctctgcg gctcgtgcga ggtcgccgtc ctcgacggcg aggtcgacca tcgcgacacg 900

gtgctgacca aggccgagcg ggcggcgaac cggcagatga tgacctgctg ctcgcgtgcc 960

tgtggcgacc ggctggccct gcgactctga 990

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggaattccat atgacgactc gtatcgccct ggacccgt 38

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgctcgagt cagcccagcc gcaccggcag 30

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agctgccggt gcggctgggc gtgctgcacc ggcatcaacc 40

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tggtggtggt ggtggtgctc gagtcagagt cgcagggcca gcc 43

Claims (4)

1.一种利用细胞色素P450酶合成2-羟基化类固醇化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备共表达重组大肠杆菌：利用无缝克隆技术将pET28b-CYP154C2与RhFRED基因连在一起，得到重组质粒pET28b-CYP154C2-RhFRED，将所述质粒转入到大肠杆菌BL21(DE₃)，构建重组大肠杆菌；所述pET28b-CYP154C2的基因序列如SEQ ID NO.1所示，pET28b-CYP154C2-RhFRED基因序列如SEQ ID NO.2所示，其中CYP154C2的基因序列如SEQ ID NO.3所示，RhFRED的基因序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)重组大肠杆菌的前培养和扩大培养：将步骤1构建的重组大肠杆菌加入LB培养基中，在37℃条件下培养16小时，得重组大肠杆菌的种子液；将所述种子液接种到M9培养基中，所述种子液和M9培养基的体积比为1:100，在37℃条件下进行扩大培养，直至菌液OD₆₀₀值达到0.8，然后加入IPTG和5-氨基乙酰丙酸盐诱导菌体表达蛋白，同时将温度降低至20℃，继续培养20-24h，离心收集菌体；所述IPTG在M9培养基中的浓度为0.2mM，所述5-氨基乙酰丙酸盐在M9培养基中的浓度为0.5mM；

(3)生物转化合成2-羟基化类固醇化合物：将收集的菌体悬浮在磷酸钠缓冲液中，保持pH为7.2，加入底物进行生物转化，在30℃振荡反应16h后，对发酵液进行提取、分离，得到2-羟基化类固醇化合物；所述底物在磷酸钠缓冲液中的浓度为100μM，所述底物为睾酮或雄烯二酮。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述磷酸钠缓冲液由终浓度为1mM的EDTA、终浓度为2mM二硫苏糖醇、甘油组成，甘油体积为所述磷酸钠缓冲液的10％。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3中所述底物为睾酮，经生物转化，得到的2-羟基化类固醇化合物为2α-羟基睾酮。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3中所述底物为雄烯二酮，经生物转化，得到的2-羟基化类固醇化合物为2α-羟基雄烯二酮。

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