CN109749987B - 一种通过悬浮震荡共培养制备重构胚胎的方法及其专用组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过悬浮震荡共培养制备重构胚胎的方法及其专用组合物。本发明提供了一种制备重构胚胎(命名为ETX‑胚胎样结构)的方法，包括如下步骤：将三种干细胞进行悬浮震荡共培养，形成(自组聚合形成)重构胚胎(胚胎样结构)；所述三种干细胞为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、滋养层干细胞(trophoblast stem cells,TSCs)和胚外内胚层干细胞(extra‑embryonic endoderm stem cells,XENCs)。ETX‑胚胎样结构发生了与正常胚胎发生和发育相似的分子和形态发生事件。本发明提供ETX‑胚胎样结构为研究胚胎发育和胚胎着床提供了一个强大的新模型系统，可用于研究胚胎发生和发育的分子机制。

Description

一种通过悬浮震荡共培养制备重构胚胎的方法及其专用组 合物

技术领域

本发明涉及一种通过悬浮震荡共培养制备重构胚胎的方法及其专用组合物。

背景技术

哺乳动物受精卵经历了一系列重要的变化最终形成了囊胚，包括合子基因组激活和谱系特化等。囊胚由滋养外胚层(TE)和内细胞团(ICM)组成，ICM包括表胚层(Epiblast，EPI)和原始内胚层(PE)。在胚胎植入子宫期间，囊胚从胚泡样结构转化为了圆柱形原肠胚结构。

原肠胚结构主要由5部分组成：(1)外胎盘椎；(2)表胚层；(3)胚外外胚层(ExE)；(4)包裹EPI和ExE的脏内胚层(visceral endoderm，VE)；(5)包裹整个胎儿的壁卵黄囊,Reichert膜和滋养巨细胞层。在原肠化过程中胚胎组织间的相互作用导致了表胚层发生极化和成腔最终形成中空的莲花样结构；而滋养外胚层继续发育分化形成胚外外胚层最终形成了第二个腔；最终胚胎和胚外组织的两个腔融合形成了一个大腔，叫做前羊膜腔。从而胚胎打破了对称发育模式，起始了中胚层和原始生殖细胞的特化。脏内胚层是胚胎模式建立的非常重要的信号来源。前原条期胚胎末梢的远端脏内胚层(distal visceral endoderm，DVE)细胞迁移到了近侧形成了近侧脏内胚层(anterior visceral endoderm，AVE)。DVE是胚胎前后轴分化起始的重要信号来源，它可以分泌信号分子抑制Nodal和Wnt信号等。在原肠化末期中内外三个胚层逐渐建立并发育为整个胎儿。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过悬浮震荡共培养制备重构胚胎的方法及其专用组合物。

本发明提供了一种制备重构胚胎(命名为ETX-胚胎样结构)的方法，包括如下步骤：将三种干细胞进行悬浮震荡共培养，形成(自我聚合形成)重构胚胎(胚胎样结构)；所述三种干细胞为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、滋养层干细胞(trophoblaststem cells,TSCs)和胚外内胚层干细胞(extra-embryonic endoderm stem cells,XENCs)。胚胎干细胞来源于表胚层。滋养层干细胞来源于滋养层。胚外内胚层干细胞来源于原始内胚层。ETX-胚胎样结构具有如下特定空间结构：XEN细胞来源的组织位于外层，ES细胞来源的组织和TS细胞来源的组织位于内部，XEN细胞来源的组织包裹ES细胞来源的组织和TS细胞来源的组织，ES细胞来源的组织和TS细胞来源的组织分别聚集于内部两端且比例相当且紧密连接。所述共培养的时间可为3小时以上。所述共培养的时间可为12小时以上。所述共培养的时间可为12-96小时。所述共培养的时间可为12-84小时。所述悬浮震荡共培养中需要避免细胞贴壁，因此具体采用非粘附水平悬浮震荡共培养。所述悬浮震荡共培养具体可为：在非粘附细胞培养皿中，50rpm-90rpm(具体可为60rpm)水平振荡培养。所述共培养采用液体培养基。所述共培养具体采用胚胎培养基。所述共培养具体采用重组胚胎培养基。

本发明还保护三种干细胞在制备重构胚胎(ETX-胚胎样结构)中的应用；所述三种干细胞为胚胎干细胞、滋养层干细胞和胚外内胚层干细胞。

本发明还保护一种用于制备重构胚胎(ETX-胚胎样结构)的组合物，包括三种干细胞；所述三种干细胞为胚胎干细胞、滋养层干细胞和胚外内胚层干细胞。所述组合物还包括悬浮震荡培养体系。所述悬浮震荡培养体系为采用液相培养基在非粘附细胞培养皿中进行的50rpm-150rpm(具体可为60rpm)水平振荡培养的体系。所述液相培养基具体为胚胎培养基。所述液相培养基具体为重组胚胎培养基。

本发明还保护三种干细胞和悬浮震荡培养体系在制备重构胚胎(ETX-胚胎样结构)中的应用；所述三种干细胞为胚胎干细胞、滋养层干细胞和胚外内胚层干细胞。所述悬浮震荡培养体系为采用液相培养基在非粘附细胞培养皿中进行的50rpm-150rpm(具体可为60rpm)水平振荡培养的体系。所述液相培养基具体为胚胎培养基。所述液相培养基具体为重组胚胎培养基。

胚胎干细胞、滋养层干细胞和胚外内胚层干细胞的数量配比依次可为：0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-3。胚胎干细胞、滋养层干细胞和胚外内胚层干细胞的数量配比依次可为：0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-2.4。胚胎干细胞、滋养层干细胞和胚外内胚层干细胞的数量配比依次可为：0.9-1.1:0.9-1.1:1.8-2.2。胚胎干细胞、滋养层干细胞和胚外内胚层干细胞的数量配比依次可为：1:1:2。

本发明还保护一种制备重构胚胎(命名为EXE-胚胎样结构)的方法，包括如下步骤：将两种干细胞进行悬浮震荡共培养，形成(自组聚合形成)重构胚胎(胚胎样结构)；所述两种干细胞为胚胎干细胞和胚外内胚层干细胞。EXE-胚胎样结构具有如下特定空间结构：XEN细胞来源的组织位于外层，ES细胞来源的组织位于内部，XEN细胞来源的组织包裹ES细胞来源的组织。所述共培养的时间可为3小时以上。所述共培养的时间可为3-240小时。所述共培养的时间可为12小时以上。所述共培养的时间可为12-108小时。所述共培养的时间可为12-120小时。所述悬浮震荡共培养中需要避免细胞贴壁，因此具体采用非粘附水平悬浮震荡共培养。所述悬浮震荡共培养具体可为：在非粘附细胞培养皿中，50rpm-150rpm(具体可为60rpm)水平振荡培养。所述共培养采用液体培养基。所述共培养具体采用胚胎培养基。所述共培养具体采用重组胚胎培养基。

本发明还保护两种干细胞在制备重构胚胎(EXE-胚胎样结构)中的应用；所述两种干细胞为胚胎干细胞和胚外内胚层干细胞。

本发明还保护两种干细胞和悬浮震荡培养体系在制备重构胚胎(EXE-胚胎样结构)中的应用；所述两种干细胞为胚胎干细胞和胚外内胚层干细胞。所述悬浮震荡培养体系为采用液相培养基在非粘附细胞培养皿中进行的50rpm-150rpm(具体可为60rpm)水平振荡培养的体系。所述液相培养基具体为胚胎培养基。所述液相培养基具体为重组胚胎培养基。

胚胎干细胞和胚外内胚层干细胞的数量配比依次可为：0.8-1.2:0.8-3。胚胎干细胞和胚外内胚层干细胞的数量配比依次可为：0.8-1.2:0.8-2.4。胚胎干细胞和胚外内胚层干细胞的数量配比依次可为：0.9-1.1:1.8-2.2。胚胎干细胞和胚外内胚层干细胞的数量配比依次可为：1:1。

所述重组胚胎培养基中不含有如下五种物质：FGF4、heparin、LIF、PD0325901和CHIR99021。具体来说，每1L重组胚胎培养基的组成为：RPMI 1640培养基391.6mL、DMEM培养基391.6mL、胎牛血清175mL、谷氨酰胺10mL、丙酮酸钠10mL、MEM非必需氨基酸10mL、β-巯基乙醇1.8ml、青霉素-链霉素10mL。

以上任一所述胚胎干细胞为非人胚胎干细胞，例如鼠胚胎干细胞，例如野生型ESCs(G4cell line)、DsRED-ESCs(G4-DsRed-MST ESCs)或BVSC ESCs(Blimp1-mVenus andStella-ECFP[BVSC]double-transgenic ESC line)。以上任一所述滋养层干细胞为非人滋养层干细胞，例如鼠滋养层干细胞，例如野生型TSCs(从CD1雌鼠体内的囊胚中分离获得的TSCs)或EGFP-TSCs。以上任一所述胚外内胚层干细胞为非人胚外内胚层干细胞，例如鼠胚外内胚层干细胞，例如野生型XENCs(129雌鼠体内的囊胚中分离获得的XENCs)、EGFP-XENCs(从Actin-EGFP雌鼠体内的囊胚中分离获得的XENCs)或Lefty1-mCherry XENCs。以上任一所述重组胚胎具体可为鼠胚胎。

以上任一所述方法制备得到的重构胚胎也属于本发明的保护范围。

ETX-胚胎样结构发生了与正常胚胎发生和发育相似的分子和形态发生事件：ES部分成腔极化后形成了莲花样样结构，这个结构与正常胚胎EPI发育形成的结构非常相似；ETX-胚胎样结构可以发生成腔，非对称表达中胚层和原始生殖细胞(Primordial germcell，PGC)的前体细胞的标志基因并且能形成AVE/DVE样结构；从聚合开始到PGC-specification Blimp1表达的时间长度与正常胚胎发育(E4.5至E6.5)时长相当；移植到小鼠子宫后，ETX-胚胎样结构有效起始了胚胎着床反应并诱导子宫形成了蜕膜组织。本发明提供ETX-胚胎样结构为研究胚胎发育和胚胎着床提供了一个强大的新模型系统，可用于研究胚胎发生和发育的分子机制。

附图说明

图1为实施例1的步骤一中ETX-胚胎样结构的照片。

图2为实施例1的步骤一中代表性的非规则胚胎样结构的照片。

图3为实施例1的步骤一中选择前后ETX-胚胎样在体视荧光显微镜下的照片。

图4为实施例1的步骤三中野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作的ETX-胚胎样结构的照片。

图5为实施例1的步骤三中EGFP-XENCs、DsRED-ESCs和野生型TSCs制作的ETX-胚胎样结构的照片。

图6为实施例1的步骤三中野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作的ETX-胚胎样结构免疫荧光染色后的照片。

图7为实施例1的步骤三中培养后的E4.5囊胚和E5.75胚胎免疫荧光染色后的照片。

图8为实施例1的步骤三中单细胞中Pou5f1基因、Tfap2c基因和Gata6基因的表达水平检测结果。

图9为实施例1的步骤四中野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构，免疫荧光染色(Oct4抗体)后的照片。

图10为实施例1的步骤四中野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构，免疫荧光染色(E-cadherin抗体)后的照片。

图11为实施例1的步骤四中培养后的E4.5囊胚和E5.75胚胎免疫荧光染色(Oct4抗体和Eomes抗体)后的照片。

图12为实施例1的步骤四中野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构，免疫荧光染色(PCX抗体)后的照片。

图13为实施例1的步骤四中各个时间点PCX荧光强度。

图14为实施例1的步骤四中ETX-胚胎样结构中ESC部分和TSC部分的腔的平均直径。

图15为实施例1的步骤四中培养过程的不同时间点，免疫荧光染色(Oct4抗体)后的照片。

图16为实施例1的步骤四中培养过程的不同时间点，免疫荧光染色(E-cadherin抗体)后的照片。

图17为实施例1的步骤四中野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构，以及E5.75胚胎，免疫荧光染色(采用Laminins抗体)后的照片。

图18为实施例1的步骤四中野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构，以及E5.75胚胎，免疫荧光染色(采用caspase-3抗体)后的照片。

图19为实施例1的步骤五中Lefty1-mCherry XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构的照片(72小时)。

图20为实施例1的步骤五中Lefty1-mCherry XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构代表性的3D max照片(72小时)。

图21为实施例1的步骤五中Lefty1-mCherry XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构的照片(84小时)。

图22为实施例1的步骤五中Lefty1-mCherry XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构代表性的3D max照片(84小时)。

图23为实施例1的步骤五中百分率统计的结果。

图24为实施例1的步骤五中ETX-胚胎样结构左侧和右侧的Lefty1-mCherry阳性细胞数量统计结果。

图25为实施例1的步骤五中mCherry阴性细胞和mCherry阳性细胞中DVE/AVE标记基因表达水平。

图26为实施例1的步骤五中mCherry阴性细胞中VE后部基因表达水平。

图27为实施例1的步骤六中野生型XENCs、BVSC ESCs和野生型TSCs制作ETX-胚胎样结构，免疫荧光染色(Oct4抗体)后的照片。

图28为实施例1的步骤六中野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构，免疫荧光染色(Cripto抗体)后的照片。

图29为实施例1的步骤六中BV-和BV+细胞中naive ESC和EPI标记基因表达水平。

图30为实施例1的步骤六中BV+和BV-中PGC标记基因的表达水平。

图31为实施例1的步骤六中BV+和BV-细胞中Slc7a3基因和Pou3f1基因表达水平。

图32为实施例1的步骤六中BV+和BV-细胞中胚层和前部EPI标记基因表达水平。

图33为实施例1的步骤七中囊胚激活和胚胎植入相关基因的表达情况。

图34为实施例1的步骤七中着床点的照片。

图35为实施例1的步骤七中每个小鼠子宫着床点百分比。

图36为实施例1的步骤七中发生着床的小鼠百分比。

图37为实施例1的步骤七中蜕膜的照片。

图38为实施例1的步骤七中蜕膜体积。

图39为实施例1的步骤七中蜕膜标志基因Dtprp原位杂交的照片。

图40为实施例1的步骤七中移植48小时后的蜕膜的切片以及正常E5.5胚胎的蜕膜的切片HE染色图。

图41为实施例1的步骤七中着床点进行免疫荧光染色(采用CK抗体)的照片。

图42为实施例1的步骤七中移植72h后着床点进行免疫荧光染色(采用COX2抗体和PL1抗体)的照片。

图43为实施例1的步骤七中移植72h后着床点进行免疫荧光染色(采用CK抗体和PL1抗体)的照片。

图44为实施例1的步骤七中移植48h后胚胎样结构进行免疫荧光染色(采用Gata4抗体和Laminin抗体)的照片。

图45为实施例3中野生型XNECs和野生型ESCs制作EXE-胚胎样结构，免疫荧光染色(采用Oct4抗体和Gata4抗体)后的照片。

图46为实施例3中EPI部分体外培养后的免疫荧光染色(采用Oct4抗体和Gata4抗体)的照片。

图47为实施例3中培养过程的不同时间点进行免疫荧光染色(采用Oct4抗体和Gata4抗体)后的照片。

图48为实施例3中培养过程的不同时间点进行免疫荧光染色(采用Lminin抗体和PCX抗体)后的照片。

图49为实施例3中培养过程的不同时间点进行免疫荧光染色(采用E-Cadherin抗体)后的照片。

图50为实施例3中各个时间点EXE-胚胎样结构的平均外径和腔的平均内径。

图51为实施例3中Lefty1-mCherry XENCs和野生型ESCs制作EXE-胚胎样结构的照片。

图52为实施例3中野生型XENCs和BVSC ESCs制作EXE-胚胎样结构的照片

图53为实施例4的步骤一的照片。

图54为实施例4的步骤二中各组体视荧光显微镜下观察的照片。

图55为实施例4的步骤二中ETS-胚胎样结构的照片。

图56为实施例4的步骤二中代表性的非规则胚胎样结构的照片。

图57为实施例4的步骤三的照片。

图58为实施例4的步骤四的照片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中均设置三次重复试验，每次试验统计5-40个样本，照片为示例性照片(各个样本结果一致)，定量试验取平均值±标准差。

Gata4是XEN细胞的标志物，Oct4是ES细胞的标志物，Cdx2和Eomes均为TS细胞的标志物。Cripto是中胚层的标志物。Gata4抗体、Oct4抗体、Cdx2抗体、Eomes抗体、E-cadherin抗体、PCX抗体、Laminins抗体、caspase-3抗体、Cripto抗体、CK抗体等均为市售抗体。

E4.5囊胚、E5.5胚胎、E5.75胚胎、E6.5胚胎均是CD-1小鼠的自然胚胎。

每1L重组胚胎培养基的组成：RPMI 1640培养基391.6mL、DMEM培养基391.6mL、胎牛血清175mL、谷氨酰胺10mL、丙酮酸钠10mL、MEM非必需氨基酸10mL、β-巯基乙醇1.8ml、青霉素-链霉素10mL。RPMI 1640培养基采用RPMI 1640Medium，Thermo Fisher Scientific，货号11875-093。DMEM培养基采用高糖无谷氨酰胺的DMEM培养基，即“DMEM,High Glucose,no Glutamine”，Thermo Fisher Scientific，货号11960-069。胎牛血清(FBS)，Gibco，货号为100999-141。谷氨酰胺采用GlutaMAX^TM Supplement，规格100×(200mM)，Thermo FisherScientific，货号35050-061。丙酮酸钠采用Sodium Pyruvate Solution，规格100×(100mM)，Thermo Fisher Scientific，货号11360-070。MEM非必需氨基酸采用MEM Non-Essential Amino Acids Solution，规格100×，Thermo Fisher Scientific，货号11140-050。β-巯基乙醇采用2-Mercaptoethanol，规格55mM，Thermo Fisher Scientific，货号21985-023。青霉素-链霉素采用Penicillin-Streptomycin Liquid，规格100×，含10000units/mL penicillin和10000μg/mL streptomycin，Thermo Fisher Scientific，货号15140-122。

实施例中涉及的ESCs：

野生型ESCs即文献中的“G4cell line；文献：Wang,Y.,Li,J.,Xiang,J.,Wen,B.,Mu,H.,Zhang,W.,and Han,J.(2016).Highly efficient generation of biallelicreporter gene knock-in mice via CRISPR-mediated genome editing ofESCs.Protein&cell 7,152-156.。

DsRED-ESCs即文献中的the G4-DsRed-MST ESCs，又称G4-ACTB-dsRED-MST ESCs；文献：Xiang,J.,Cao,S.,Zhong,L.,Wang,H.,Pei,Y.,Wei,Q.,Wen,B.,Mu,H.,Zhang,S.,Yue,L.,et al.(2017).Pluripotent stem cells secrete Activin A to improve theirepiblast competency after injection into recipient embryos.Protein&cell。

BVSC ESCs即文献中的“Blimp1-mVenus and Stella-ECFP[BVSC]double-transgenic ESC line”，为Blimp1-mVenus和Stella-ECFP双转基因ESC系，表达由Prdm1(Blimp1)调控元件调控的膜定位Venus(mVenus)及Dppa3(Stella/Pgc7)调控的CFP(ECFP)的BVSC细胞系；文献：Zhou,Q.,Wang,M.,Yuan,Y.,Wang,X.,Fu,R.,Wan,H.,Xie,M.,Liu,M.,Guo,X.,Zheng,Y.,et al.(2016).Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells In Vitro.Cell stem cell 18,330-340.。

实施例中涉及的TSCs：

野生型TSCs即从CD1雌鼠体内的E3.5囊胚(由CD1雄鼠提供精子)中分离获得的TSCs；

EGFP-TSCs：野生型TSCs中转染PB-UBC-EGFP质粒(PB-UBC-EGFP质粒如序列表的序列1所示，第1653-2372为EGPF基因)获得的表达EGPF基因的重组细胞。

实施例中涉及的XENCs：

野生型XENCs即从129雌鼠体内的E3.5囊胚(由129雄鼠提供精子)中分离获得的XENCs。

EGFP-XENCs：从Actin-EGFP雌鼠体内的囊胚(由Actin-EGFP雄鼠提供精子)，即actin-GFP囊胚中分离获得的XENCs。提及携带actin-GFP的囊胚(embryos carryingactin-GFP)的文献：Xiang,J.,Cao,S.,Zhong,L.,Wang,H.,Pei,Y.,Wei,Q.,Wen,B.,Mu,H.,Zhang,S.,Yue,L.,et al.(2017).Pluripotent stem cells secrete Activin A toimprove their epiblast competency after injection into recipientembryos.Protein&cell.。

Lefty1-mCherry XENCs：野生型XENCs中共转染PT2-Puro-mCherry-Lefty1和pCMV(CAT)T7-SB100，得到的表达Lefty1-mCherry融合蛋白的重组细胞。PT2-Puro-mCherry-Lefty1如序列表的序列2所示(第7642-7660位为lefty1启动子，第7689-8399为mcherry基因)。pCMV(CAT)T7-SB100为市售质粒(Addgene，#34879)。

实施例1、ETX-胚胎样结构的制备和发育

一、聚合形成ETX-胚胎样结构的方法和形成比率

在直径35mm的非粘附细胞培养皿中制作重组胚胎。向培养皿中加入野生型XENCs、DsRED-ESCs和EGFP-TSCs，野生型XENCs的细胞数为2×10⁵个，DsRED-ESCs的细胞数为1×10⁵个，EGFP-TSCs的细胞数为1×10⁵个。置于37℃、5％CO₂和100％湿度培养箱中，60rpm水平振荡培养。采用重组胚胎培养基(每个培养皿2ml)，每天更换新鲜的重组胚胎培养基。

培养72小时后，在倒置荧光显微镜下观察。通过视觉评价，将胚胎样结构分为规则胚胎样结构和非规则胚胎样结构。规则胚胎样结构的空间结构为：XENC衍生的组织位于外层，ESC衍生的组织和TSC衍生的组织被XENC衍生的组织包裹于内部，ESC衍生的组织和TSC衍生的组织分别聚集于内部的两端且比例相当紧密连接。将规则胚胎样结构命名为ETX-胚胎样结构。统计ETX-胚胎样结构占总胚胎样结构的百分比，为23％。ETX-胚胎样结构的照片见图1。图1中：TSCs衍生组织，绿色；ESC衍生组织，红色。各种代表性的非规则胚胎样结构的照片见图2。图2中：TSCs衍生组织，绿色；ESC衍生组织，红色；2显示胚胎样结构的ESC部分过度生长，3显示胚胎样结构的TSC部分过度生长，5显示胚胎样结构的ESC部分和TSC部分不紧密连接，6显示胚胎样结构有两个ESC部分；比例尺＝20μm。

培养72小时后，在体视荧光显微镜下选择ETX-胚胎样结构转移到新的培养皿中，再次在体视荧光显微镜下进行观察。选择前的照片见图3A，选择后的照片见图3B。图3中：TSCs衍生组织，绿色；ESC衍生组织，红色；比例尺＝100μm。

二、ETX-胚胎样结构的制备方法

在直径35mm的非粘附细胞培养皿中制作ETX-胚胎样结构。向培养皿中加入XNECs、ESCs和TSCs，XNECs的细胞数为2×10⁵个，ESCs的细胞数为1×10⁵个，TSCs的细胞数为1×10⁵个。置于37℃、5％CO₂和100％湿度培养箱中，60rpm水平振荡培养。采用重组胚胎培养基(每个培养皿2ml)，每天更换新鲜的重组胚胎培养基。

本实施例的后续步骤中，均采用步骤二的方法制备ETX-胚胎样结构。

三、观察ETX-胚胎样结构

采用野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养72小时后进行免疫荧光染色(采用Oct4抗体或Gata4抗体)，然后在激光共聚焦显微镜下观察。示例性照片见图4。图4中，A为采用Oct4抗体进行免疫荧光染色(DAPI，蓝色；TSC来源组织，绿色；Oct4，红色)，B为采用Gata4抗体进行免疫荧光染色(DAPI，蓝色；TSC来源组织，绿色；Gata4，红色)。

采用EGFP-XENCs、DsRED-ESCs和野生型TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养72小时后在激光共聚焦显微镜下观察。示例性照片见图5(DAPI，蓝色；XENCs衍生组织，绿色；ESC衍生组织，红色；比例尺＝50μm；白线线条内的区域为TSC衍生组织)。ETX-胚胎样结构中，ESC衍生的组织的体积为561424μm³，TSC衍生的组织的体积为577639μm³。

采用野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养72小时后进行免疫荧光染色(采用Cdx2抗体或Eomes抗体)，然后在激光共聚焦显微镜下观察。示例性照片见图6。图6中，A为采用Cdx2抗体进行免疫荧光染色(DAPI，蓝色；TSC来源组织，绿色；Cdx2，红色)，B为采用Eomes抗体进行免疫荧光染色(DAPI，蓝色；TSC来源组织，绿色；Eomes，红色)，比例尺＝20μm。

取E4.5囊胚，采用重组胚胎培养基体外培养60小时(每天更换新鲜的重组胚胎培养基)，然后进行免疫荧光染色(采用Oct4抗体和Eomes抗体)，然后在激光共聚焦显微镜下观察。示例性照片见图7A。取E5.75胚胎，进行免疫荧光染色(采用Oct4抗体和Eomes抗体)，然后在激光共聚焦显微镜下观察。示例性照片见图7B。图7中：Oct4，红色；Eomes，绿色；DAPI，蓝色。E5.75胚胎中，ESC衍生的组织的体积为544137μm³，TSC衍生的组织的体积为573468μm³。

结果表明，XEN细胞、ES细胞和TS细胞共培养，自组聚合形成了与正常胚胎结构非常相似的ETX-胚胎样结构。ETX-胚胎样结构的形态学类似于正常胚胎的卵圆柱形，XENC衍生的组织位于外层，ESC衍生的组织和TSC衍生的组织被XENC衍生的组织包裹于内部，ESC衍生的组织和TSC衍生的组织分别聚集于内部的两端，呈现出合适的比例、位置和体积大小。

采用野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养84小时后，从ETX-胚胎样结构中分离XENCs衍生组织、ESC衍生组织、TSC衍生组织，分别从各组织中分离获得单细胞，检测单细胞中Pou5f1基因、Tfap2c基因和Gata6基因的表达水平。箱形图见图8，箱形区域代表基因表达水平的50％,箱形区域横线代表中位数；以Ct＝24为背景获得基因表达水平，两尾T检验；n＝11(从ESC衍生组织分离的单细胞)、11(从XENCs衍生组织分离的单细胞)和11(从TSC衍生组织分离的单细胞)；***P<0.001。单细胞特异谱系基因表达水平检测证实了三个组分分别是ES细胞来源、TS细胞来源和XEN细胞来源。

四、ETX-胚胎样结构形成过程中前羊膜腔的形成

采用野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养84小时后进行免疫荧光染色(采用Oct4抗体或E-cadherin抗体)，然后在激光共聚焦荧光显微镜下观察。采用Oct4抗体的示例性照片见图9。图9中：DAPI，蓝色；TSC来源组织，绿色；Oct4，红色。采用E-cadherin抗体的示例性照片见图10。图10中：DAPI，蓝色；TSC来源组织，绿色；E-cadherin，红色。取E4.5囊胚，采用重组胚胎培养基体外培养60小时(每天更换新鲜的重组胚胎培养基)，然后进行免疫荧光染色(采用Oct4抗体和Eomes抗体)，然后在倒置荧光显微镜下观察。示例性照片见图11A。图11A中：Oct4，红色；Eomes，绿色；DAPI，蓝色。取E5.75胚胎，进行免疫荧光染色(采用E-cadherin抗体)，然后在激光共聚焦荧光显微镜下观察。图11B中：E-cadherin，红色。结果显示，体外培养84h的ETX-胚胎样结构和体外培养60h的正常胚胎与E5.75胚胎结构非常相似，并且这些胚胎中间都是DAPI阴性，证明了腔的形成。

采用野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养过程的不同时间点进行免疫荧光染色(采用PCX抗体)，然后在激光共聚焦荧光显微镜下观察。照片见图12(PCX，红色；DAPI，蓝色；TSC来源组织,绿色；比例尺＝20μm)。各个时间点PCX荧光强度见图13。ETX-胚胎样结构中ESC部分和TSC部分的腔的平均直径见图14。培养60h时PCX已经积聚在ES部分内侧，在72h时在TS部分内侧积聚PCX，在84h时PCX在大的腔的内侧表达。采用野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养过程的不同时间点，进行免疫荧光染色(采用Oct4抗体或E-cadherin抗体)，然后在激光共聚焦荧光显微镜下观察。采用Oct4抗体的示例性照片见图15(DAPI，蓝色；TSC来源组织，绿色；Oct4，红色)。采用E-cadherin抗体的示例性照片见图16(DAPI，蓝色；TSC来源组织，绿色；E-cadherin，红色)。结果表明，ETX-胚胎样结构，首先在ES细胞部分形成小腔，然后在TS细胞部分再形成一个小腔，最后两个小腔融合为一个大腔，胚胎腔的形成过程与正常胚胎发育形成前羊膜腔的过程非常相似。

采用野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养84小时后进行免疫荧光染色(采用Laminins抗体)，然后在激光共聚焦显微镜下观察。示例性照片见图17A(Laminin，红色；DAPI，蓝色；TSC来源组织，绿色)。取E5.75胚胎，进行免疫荧光染色(采用Laminins抗体)，然后在激光共聚焦显微镜下观察。示例性照片见17B(Laminin，红色；DAPI,蓝色)。在体外培养84h的ETX-胚胎样结构与E5.75天胚胎的Laminins的分布情况相似，都是在胚胎外侧形成了一层Laminins阳性的基膜。

采用野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养84小时后进行免疫荧光染色(采用caspase-3抗体)，然后在激光共聚焦显微镜下观察。示例性照片见图18A(caspase-3，红色；DAPI,蓝色；TSC来源组织,绿色)。取E5.75胚胎，进行免疫荧光染色(采用caspase-3抗体)，然后在激光共聚焦显微镜下观察。示例性照片见18B(caspase-3，绿色；DAPI，蓝色)。细胞凋亡信号caspase-3不仅在ES形成的组织部分和TS形成的组织部分表达，而是在各个胚层都有表达，说明腔的形成不是由细胞凋亡形成的。

图9至图18中，比例尺均为20μm。

五、ETX-胚胎样结构发生和发育过程中VE的区域化

在正常胚胎起始原肠化过程中，VE中可以看到基因的非对称表达模式。导致了DVE细胞向胚胎前侧迁移最终E6.5天胚胎形成AVE。来自于AVE的信号分子，例如Lefty1和Cerl，抑制EPI部分Nodal信号从而导致基因的非对称表达和AP轴的形成。为了检测ETX-胚胎样结构中XEN形成的组织是否能够模拟正常胚胎中DVE/AVE的形成，使用Lefty1-mCherry XENCs监控Lefty1的表达。

采用Lefty1-mCherry XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构。

培养72小时后在激光共聚焦荧光显微镜下观察。示例性照片见图19(mCherry，红色；DAPI,蓝色；TSC来源组织,绿色)。代表性的3D max照片见图20。ETX-胚胎样结构中Lefty1-mCherry不对称表达，培养72小时后ETX-胚胎样结构形成DVE样组织(红色)。

培养84小时后在激光共聚焦荧光显微镜下观察。示例性照片见图21(mCherry，红色；DAPI，蓝色；TSC来源组织，绿色)，代表性的3D max照片见图22。培养84小时后ETX-胚胎样结构形成AVE样组织(红色)。

培养84小时后，统计具有DVE/AVE样组织(具有DVE组织和/或AVE样组织)的ETX-胚胎样结构占总ETX-胚胎样结构的百分率(A)、mCherry荧光信号位置呈随机性的ETX-胚胎样结构占总ETX-胚胎样结构的百分率(B)以及无mCherry荧光信号出现的ETX-胚胎样结构占总ETX-胚胎样结构的百分率(C)，结果见图23(进行三次试验，每次试验对50个ETX-胚胎样结构进行统计)。培养84小时后，统计具有DVE/AVE样组织(具有DVE组织和/或AVE样组织)的ETX-胚胎样结构中，中间线(见图24B中的虚线线条)左侧和右侧的Lefty1-mCherry阳性细胞数量，结果见图24A(9个胚胎样结构的平均值；双尾T检验,***P<0.001)。

培养72小时后，将10个具有DVE样组织的ETX-胚胎样结构挑选出来进行培养，12小时后具有DVE和AVE样组织的ETX-胚胎样结构的数量平均为5.3个。

结果表明：在培养72-84h时23％的ETX-胚胎样结构在XEN细胞层一侧有少量细胞表达Lefty1-mCherry；ETX-胚胎样结构中Lefty1-mCherry阳性XEN细胞数统计结果表明，ETX-胚胎样结构与正常E5.5-E6.5胚胎中DVE/AVE Lefty1阳性细胞非对称表达分布情况相似；体外培养72小时时具有DVE的ETX-胚胎样结构，再培养12小时后有约有53％的mCherry阳性XEN细胞迁移到了ETX-胚胎样结构的另一侧，这与正常胚胎DVE/AVE细胞迁移现象非常相似。

培养84小时后，取具有DVE/AVE样组织(具有DVE组织和/或AVE样组织)的ETX-胚胎样结构，分离XENCs衍生组织，从中分离mCherry阴性细胞和mCherry阳性细胞，进行单细胞qPCR，检测DVE/AVE标记基因表达水平，箱形图见图25。与mCherry阴性细胞相比,mCherry阳性细胞中DVE/AVE标记基因(Foxa1、Lefty1、Cer1、Otx2、Sfrp5)表达上调.

培养24小时后，取ETX-胚胎样结构，分离XENCs衍生组织，从中分离mCherry阴性细胞。培养84小时后，取具有DVE/AVE样组织(具有DVE组织和/或AVE样组织)的ETX-胚胎样结构，分离XENCs衍生组织，从中分离mCherry阴性细胞。进行单细胞qPCR，检测VE后部基因表达水平，箱形图见图26。图26中：使用Ct＝26为背景来获得基因表达水平；n＝16个单细胞(24小时，LC-)和19个(84小时，LC-)；双尾T检验,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。与24小时相比,84小时mCherry阴性细胞中后部标记基因(Bmp2、Fgf5)上调。

图19至图22中，比例尺均为20μm。

六、ETX-胚胎样结构发育过程中中胚层与PGC前体特异基因的不对称表达

在小鼠胚胎发生与发育过程中的一个关键事件是基因的对称性表达被打破。这在胚胎模式形成中起着重要作用，将会导致EPI部分区域化中胚层和特定PGCs的形成。本步骤用于确定是否在ETX-胚胎样结构中诱导发生了中胚层和PGC细胞。Blimp1(也被称为Prdm1)在PGC前体和VE中表达，是PGC形成的关键调节子，定位表达在近端后侧EPI部分。Blimp1阳性细胞也可以表达许多与胚胎发育(尤其是中胚层诱导)有关的基因。为了识别类似于中胚层和PGC前体的细胞，采用BVSC ESCs制备ETX-胚胎样结构。

采用野生型XENCs、BVSC ESCs和野生型TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养84h后，进行免疫荧光染色(采用Oct4抗体)，然后在激光共聚焦荧光显微镜下观察。照片见图27(Oct4，红色，显示ESC衍生的组织,箭头指向Blimp1-mVenus阳性组织(绿色),比例尺＝20μm)。ETX-胚胎样结构中，Blimp1-mVenus阳性细胞呈现非对称表达，而定位在ESC和TSC交界部分的ES细胞没有检测到ECFP的表达。

采用野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养84h后，进行免疫荧光染色(采用Cripto抗体)，然后在激光共聚焦显微镜下观察。照片见图28。图28中，C、D分别为B图中左侧和右侧白框区域的放大图。左前方细胞Cripto阴性,右后方细胞Cripto阳性。通过对中胚层marker Cripto的免疫染色进一步证实了中胚层的形成，Cripto非对称表达在ESC部分后侧。

采用野生型XENCs、BVSC ESCs和野生型TSC制作ETX-胚胎样结构。分别于培养24小时或培养84小时后，分离ESC衍生组织，从中分离BV-和BV+细胞，进行单细胞qPCR，检测naive ESC标记基因(Klf4、Nanog、Sox2)和EPI标记基因(Fgf5、Fgf4、Fgfr1、Gdf3、Cripto)表达水平，小提琴图见图29(背景Ct＝26)。与正常胚胎促原肠化过程中EPI细胞的基因表达模式一致，原始态ESC marker Nanog、Klf4、Sox2等下调，EPI marker Fgf5、Fgf4、Fgfr1、Gdf3和Cripto等上调。结果表明ESCs多能性随着其分化表达下降。培养84小时后，分离ESC衍生组织，从中分离BV+和BV-细胞，进行单细胞qPCR，检测PGC标记基因的表达水平(Blimp1、Prdm14、Stella、Tfap2c和Dnmt3b)，箱式图见图30。图30中：n＝11个单细胞(BV-)和16个单细胞(BV⁺)；*P<0.05,***P<0.001。mVenus阳性细胞中Blimp1、Prdm14、Stella、Tfap2c等PGCmarker表达增高，而Dnmt3b有下调的趋势。培养84小时后，分离ESC衍生组织，从中分离BV+和BV-细胞，进行单细胞qPCR，检测Slc7a3基因和Pou3f1基因表达水平(这些基因已知在E6.5正常胚胎中胚层对侧区域中上调)，箱式图见图31。图31中：n＝11个单细胞(BV-)和16个单细胞(BV⁺)；*P<0.05。培养84小时后，分离ESC衍生组织，从中分离BV+和BV-细胞，进行单细胞qPCR，检测胚层标记基因(Flk1、Hhex和Hand1)和前部EPI标记基因(Fgf4和Mixl1)表达水平，箱型图见图32。图32中：n＝11个单细胞(BV-)和16个单细胞(BV+)；*P<0.05,**P<0.001,***P<0.001。与BV-细胞相比，BV+细胞的中胚层标marker如Flk1、Hhex和H和1上调，BV+细胞胚胎后侧EPI标志物上调。这些结果表明，在ETX-胚胎中形成了区域化的中胚层与PGC前体样细胞。

七、ETX-胚胎样结构起始着床

取EGFP-TSCs，进行单细胞qPCR，检测囊胚激活和胚胎植入相关基因的表达情况(0h)。采用野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养24小时后，从ETX-胚胎样结构的TSC部分分离单细胞，进行单细胞qPCR，检测囊胚激活和胚胎植入相关基因的表达情况(24h)。箱式图见图33。图33中：Ct＝26作为背景值用于计算表达水平；n＝18个(0h)和n＝16个(24h)；***P<0.001。与TSCs单细胞相比，从ETX-胚胎样结构的TSC部分分离单细胞中，Alk2、Erk2、Gata3、Cb1、Cb2、ErBb1、ErBb4、Igf2等已知在围着床期升高的标志物表达上升。结果表明，将ETX-胚胎样结构移植到假孕母鼠子宫后可能会起始着床。

采用野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养36小时后，取ETX-胚胎样结构移植到受体鼠的子宫中。将E6.5胚胎(自然胚胎)、ETS-胚胎样结构(采用野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETS-胚胎样结构；向培养皿中加入野生型ESCs和EGFP-TSCs，野生型ESCs的细胞数为1×10⁵个，EGFP-TSCs的细胞数为1×10⁵个。置于37℃、5％CO₂和100％湿度培养箱中，60rpm水平振荡培养；采用供试胚胎培养基，每个培养皿2ml，每天更换新鲜的供试胚胎培养基)或EXE-胚胎样结构(采用Lefty1-mCherry XENCs和野生型ESCs制作EXE-胚胎样结构；向培养皿中加入野生型XENCs和野生型ESCs，野生型XENCs的细胞数为1×10⁵个，野生型ESCs的细胞数为1×10⁵；置于37℃、5％CO₂和100％湿度培养箱中，60rpm水平振荡培养；采用重组胚胎培养基，每个培养皿2ml，每天更换新鲜的重组胚胎培养基)移植到受体鼠的子宫中。受体鼠为3.5dpc假孕鼠(CD1小鼠)。移植84小时后blue dye染色确定着床点(IS)，示例性照片见图34(比例尺＝2mm)。移植84小时统计每个小鼠子宫着床点百分比(每种胚胎样结构五只受体鼠为一组，每只受体鼠移植20个胚胎样结构)，见图35(*P＝0.0193,***P＝0.0003)。移植108小时内检测发生着床的小鼠百分比(含有着床点小鼠占总移植小鼠的比例；括号中的分子和分母分别表示含有着床点的小鼠数和受体小鼠数)，见图36。移植84小时，蜕膜的照片见图37。图37中：正常胚胎(n＝60),ETX胚胎(n＝395),ETS胚胎(n＝92)和EXE胚胎(n＝30)；黑色比例尺＝500μm,白色比例尺＝200μm。移植84小时，蜕膜体积见图38。图38中：n＝10个正常胚胎,131个ETX胚胎,18个ETS胚胎,17个EXE胚胎。蜕膜中蜕膜标志基因Dtprp原位杂交的照片见图39。图39中：正常胚胎(n＝5),ETX胚胎(n＝5),ETS胚胎(n＝5)和EXE胚胎(n＝5)；比例尺＝500μm。与ETS-胚胎样结构或EXE-胚胎样结构相比，ETX-胚胎样结构的着床率最高。三种胚胎样结构的蜕膜组织的平均大小具有可比性。Dtprp原位杂交证实了蜕膜组织。

哺乳动物胚胎植入后发育的标志事件是子宫-胚胎胚轴的协调形成和蜕膜重构。采用野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养36小时后，取ETX-胚胎样结构移植到受体鼠的子宫中。移植48小时后的蜕膜的切片HE染色图(B)以及正常E5.5胚胎的蜕膜的切片HE染色图(A)见图40。图40中：左图比例尺＝500μm,右图比例尺＝50μm。HE染色显示ETX-胚胎样结构建立了正确的子宫-胚胎胚轴方向。

采用野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养36小时后，取ETX-胚胎样结构移植到受体鼠的子宫中。移植72h后着床点进行免疫荧光染色(采用CK抗体)，然后在激光共聚焦荧光显微镜下观察，示例性照片见图41B。E6.5正常胚胎着床点进行免疫荧光染色(采用CK抗体)，然后在激光共聚焦荧光显微镜下观察，示例性照片见图41A。图41中：红色，CK；蓝色，DAPI；右图为左图虚线方框部位的放大图(腔上皮CK表达)，黄色虚线线条表示胚胎轴，AM表示对系膜侧，M表示系膜侧；左图比例尺＝500μm，右图比例尺＝50μm。符合子宫AM轴。

采用野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养36小时后，取ETX-胚胎样结构移植到受体鼠的子宫中。移植72h后着床点进行免疫荧光染色(采用COX2抗体和PL1抗体)，然后在激光共聚焦荧光显微镜下观察，示例性照片见图42B。E6.5正常胚胎着床点进行免疫荧光染色(采用COX2抗体和PL1抗体)，然后在激光共聚焦荧光显微镜下观察，示例性照片见图42A。图42中：红色，CK；绿色，PL1；蓝色DAPI；比例尺＝500μm。移植72h后着床点进行免疫荧光染色(采用CK抗体和PL1抗体)，然后在激光共聚焦荧光显微镜下观察，示例性照片见图43。图43中：右图为左图虚线方框部位(PL1和CK阳性细胞)的放大图；左图比例尺＝50μm，右图比例尺＝10μm。

采用野生型XENCs、野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETX-胚胎样结构。培养36小时后，取ETX-胚胎样结构移植到受体鼠的子宫中。移植48h后胚胎样结构进行免疫荧光染色(采用Gata4抗体和Laminin抗体)，然后在激光共聚焦荧光显微镜下观察，示例性照片见图44B。E5.5正常胚胎进行免疫荧光染色(采用Gata4抗体和Laminin抗体)，然后在激光共聚焦荧光显微镜下观察，示例性照片见图44A。图44中：红色，Gata4；绿色，Laminin；蓝色，DAPI；比例尺＝50μm。

滋养巨细胞marker Cyclooxygenase-2(COX2)和Placental Lactogen-I(PL1)。子宫上皮marker Cytokeratin(CK)。这些基因ETX-胚胎着床位点表达模式与正常胚胎相似。这些结果表明，ETX-胚胎模拟了胚胎子宫植入的关键事件，如蜕膜化、血管通透性、Dtprp在蜕膜中的模式表达、子宫腔上皮清除等。

实施例2、XEN细胞和TS细胞聚合

取直径35mm的非粘附细胞培养皿，加入野生型XENCs和野生型TSCs，野生型XENCs的细胞数为1×10⁵个，野生型TSCs的细胞数为1×10⁵个。置于37℃、5％CO₂和100％湿度培养箱中，60rpm水平振荡培养。采用重组胚胎培养基(每个培养皿2ml)，每天更换新鲜的重组胚胎培养基。

经过连续84小时的观察，XEN细胞和TS细胞聚合不能形成任何结构。

实施例3、XEN细胞和ES细胞聚合制备EXE-胚胎样结构

在直径35mm的非粘附细胞培养皿中制作重组胚胎。向培养皿中加入XNECs和ESCs，XNECs的细胞数为1×10⁵个，ESCs的细胞数为1×10⁵。置于37℃、5％CO₂和100％湿度培养箱中，60rpm水平振荡培养。采用重组胚胎培养基(每个培养皿2ml)，每天更换新鲜的重组胚胎培养基。

采用野生型XNECs和野生型ESCs制作重组胚胎。培养60小时后进行免疫荧光染色(采用Oct4抗体和Gata4抗体)，然后在激光共聚焦显微镜下观察，示例性照片见图45。图45中：DAPI,蓝色；Gata4,绿色；Oct4,红色。部分胚胎样结构为XEN细胞层包裹中间ES细胞的结构(外侧的一层Gata阳性细胞包裹中间的Oct4阳性细胞结构)，将满足该结构的胚胎样结构命名为EXE-胚胎样结构。统计EXE-胚胎样结构占总胚胎样结构的百分比，为97％以上。从CD1小鼠母鼠体内取5.5天的正常胚胎，将EPI部分切下在体外培养24小时后免疫荧光染色(采用Oct4抗体和Gata4抗体)，然后在激光共聚焦荧光显微镜下观察，照片见图46。图46中：DAPI,蓝色；Gata4,绿色；Oct4,红色。EXE-胚胎样结构与正常胚胎EPI-explant结构非常相似，均是由外侧的一层Gata阳性细胞包裹中间的Oct4阳性细胞结构。培养过程的不同时间点进行免疫荧光染色(采用Oct4抗体和Gata4抗体)，然后在立体激光共聚焦显微镜下观察。照片见图47。图47中：DAPI,蓝色；Gata4,绿色；Oct4,红色；比例尺＝20μm。EXE-胚胎样结构的ES部分被XEN层包围住。培养过程的不同时间点进行免疫荧光染色(采用Lminin抗体和PCX抗体)，然后在激光共聚焦显微镜下观察。照片见图48。图48中：Laminin，绿色(基膜，有这个说明正常，如果没有该基膜小鼠胚胎会发育致死)；PCX，红色(显示腔)；比例尺＝20μm。Laminin和PCX免疫荧光染色展示了EXE-胚胎样结构中基底层,腔的形成以及随时间不断变大的过程。培养过程的不同时间点进行免疫荧光染色(采用E-Cadherin抗体)，然后在激光共聚焦显微镜下观察。照片见图49。图49中：E-cadherin，绿色；比例尺＝20μm。免疫荧光染色表明EXE-胚胎样结构中腔随时间变大的过程。各个时间点EXE-胚胎样结构的平均外径和腔的平均内径见图50。在48h检测到了腔的形成，随着培养时间的延长腔的大小逐渐变大。E-Cadherin免疫染色结果显示，ES细胞部分显示沿着腔内侧整齐排列，并且形态发生步骤与EPI-explants非常相似。在胚胎着床期，VE分泌的Lminin会形成基膜微环境从而有利于EPI极性的确立。实验结果显示在体外聚合ES和XEN细胞可以形成EXE-胚胎样结构，并且能够模拟正常胚胎的发生和发育过程，包括基膜的形成，细胞极性和腔的诱导和形成。

采用Lefty1-mCherry XENCs和野生型ESCs制作EXE-胚胎样结构。向培养皿中加入Lefty1-mCherry XENCs和野生型ESCs，Lefty1-mCherry XENCs的细胞数为1×10⁵个，野生型ESCs的细胞数为1×10⁵。置于37℃、5％CO₂和100％湿度培养箱中，60rpm水平振荡培养。采用重组胚胎培养基(每个培养皿2ml)，每天更换新鲜的重组胚胎培养基。培养72小时后在激光共聚焦荧光显微镜下观察。示例性照片见图51(mCherry，红色；比例尺＝20μm)。与ETX-胚胎样结构中Lefty1-mCherry阳性XEN细胞非对称分布情况不同，EXE-胚胎样结构中Lefty1-mCherry阳性XEN细胞呈现随机分布。

采用野生型XENCs和BVSC ESCs制作EXE-胚胎样结构。向培养皿中加入野生型XENCs和野生型ESCs，野生型XENCs的细胞数为1×10⁵个，野生型ESCs的细胞数为1×10⁵。置于37℃、5％CO₂和100％湿度培养箱中，60rpm水平振荡培养。采用重组胚胎培养基(每个培养皿2ml)，每天更换新鲜的重组胚胎培养基。培养60小时后在激光共聚焦荧光显微镜下观察。示例性照片见图52(比例尺＝20μm)。

实施例4、ESCs和TSCs聚合制备ETS-胚胎样结构

一、制备重组胚胎

在直径35mm的非粘附细胞培养皿中制作重组胚胎。向培养皿中加入野生型ESCs和EGFP-TSCs，野生型ESCs的细胞数为1×10⁵个，EGFP-TSCs的细胞数为1×10⁵个。置于37℃、5％CO₂和100％湿度培养箱中，60rpm水平振荡培养。采用重组胚胎培养基(每个培养皿2ml)，每天更换新鲜的重组胚胎培养基。培养64小时后进行免疫荧光染色(采用Oct4抗体)，然后在激光共聚焦显微镜下观察，照片见图53。图53中：DAPI，蓝色；TSC来源组织，绿色；Oct4，红色；比例尺＝20μm。当ES细胞和TS细胞聚合到一起时，形成了圆柱形结构。

二、起始细胞数、细胞比例对胚胎形成效率的影响

在直径35mm的非粘附细胞培养皿中制作重组胚胎。向培养皿中加入DsRED-ESCs和EGFP-TSCs。置于37℃、5％CO₂和100％湿度培养箱中，60rpm水平振荡培养。采用重组胚胎培养基(每个培养皿2ml)，每天更换新鲜的重组胚胎培养基。

第一组：每个培养皿中加入的DsRED-ESCs的细胞数为5×10⁵个，EGFP-TSCs的细胞数为1×10⁵个。第二组：每个培养皿中加入的DsRED-ESCs的细胞数为3×10⁵个，EGFP-TSCs的细胞数为1×10⁵个。第三组：每个培养皿中加入的DsRED-ESCs的细胞数为1×10⁵个，EGFP-TSCs的细胞数为1×10⁵个。第四组：每个培养皿中加入的DsRED-ESCs的细胞数为1×10⁵个，EGFP-TSCs的细胞数为3×10⁵个。第五组：每个培养皿中加入的DsRED-ESCs的细胞数为1×10⁵个，EGFP-TSCs的细胞数为5×10⁵个。培养64小时后，在体视荧光显微镜下观察，照片见图54。

通过视觉评价，将胚胎样结构分为规则胚胎样结构(ESC衍生的组织和TSC衍生的组织分别聚集于内部的两端且比例相当紧密连接)和非规则胚胎样结构。将规则胚胎样结构命名为ETS-胚胎样结构。第三组形成ETS-胚胎的效率最高，为35％。第三组中ETS-胚胎样结构的照片见图55。各组中，代表性的非规则胚胎样结构的照片见图56。

三、培养基成分对胚胎形成效率的影响

在直径35mm的非粘附细胞培养皿中制作制作ETS-胚胎样结构。向培养皿中加入DsRED-ESCs和EGFP-TSCs，DsRED-ESCs的细胞数为1×10⁵个，EGFP-TSCs的细胞数为1×10⁵个。置于37℃、5％CO₂和100％湿度培养箱中，60rpm水平振荡培养。采用供试胚胎培养基(每个培养皿2ml)，每天更换新鲜的供试胚胎培养基。

供试胚胎培养基甲：重组胚胎培养基。

供试胚胎培养基乙：含25ng/ml FGF4(Recombinant Human FGF4,RH FGF4,北京强欣博瑞代理公司购买，R&D system公司生产，货号235-F4-025)和1μg/ml heparin(heparinsolution，北京强欣博瑞代理公司，stem celll公司生产，货号07980)的重组胚胎培养基。

供试胚胎培养基丙：含0.01μg/ml LIF(mouse LIF,leukemia inhibitoryfactor，133-099-895,北京利冰生物公司代理购买，Miltenyi Biotec公司生产，浓度10μg/ml，1000×)的重组胚胎培养基。

供试胚胎培养基丁：含3μM PD0325901(生产厂家Selleck，货号S1036)和2μMCHIR99021(生产厂家Selleck，货号252917)的重组胚胎培养基。

培养64小时后，在体视荧光显微镜下观察，照片见图57。图57中：TSCs衍生组织，绿色；ESC衍生组织，红色；比例尺＝100μm。培养基中添加小分子会抑制ES和TS细胞的分化，从而影响ETS-胚胎样结构的形成。因此，培养体系中建议不添加这些小分子。

四、ETS-胚胎样结构不遵循胚胎发生的时空事件或无法获得植入后胚胎的特征性结构

采用野生型ESCs和EGFP-TSCs制作ETS-胚胎样结构。向培养皿中加入野生型ESCs和EGFP-TSCs，野生型ESCs的细胞数为1×10⁵个，EGFP-TSCs的细胞数为1×10⁵个。置于37℃、5％CO₂和100％湿度培养箱中，60rpm水平振荡培养。采用供试胚胎培养基(每个培养皿2ml)，每天更换新鲜的供试胚胎培养基。

培养过程72小时后进行免疫荧光染色(采用Lminin抗体、PCX抗体或E-Cadherin抗体)，然后在激光共聚焦显微镜下观察。采用E-Cadherin抗体的照片见图58a(DAPI，蓝色；TSC来源组织，绿色；E-cadherin，红色；比例尺＝20μm)。采用PCX抗体的照片见图58b(DAPI，蓝色；TSC来源组织，绿色；PCX，红色；比例尺＝20μm)。采用Lminin抗体的照片见图58c(DAPI，蓝色；TSC来源组织，绿色；Lminin，红色；比例尺＝20μm)。免疫组化分析显示，ETS-胚胎样结构没有获得形态学特征。这表明ES部分和TS细胞部分间的相互作用不足以在ETS-胚胎样结构中起始腔的形成。Laminins的分布结果显示分泌的Laminins不足以包裹住ETS-胚胎样结构本身。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 一种通过悬浮震荡共培养制备重构胚胎的方法及其专用组合物

<130> GNCYX190017

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7235

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatagatc cttttttgta gaaatgtctt ggtgtcctcg tccaatcagg tagccatctc 240

tgaaatatct ggctccgttg caactccgaa cgacctgctg gcaacgtaaa attctccggg 300

gtaaaactta aatgtggagt aatggaacca gaaacgtctc ttcccttctc tctccttcca 360

ccgcccgtta ccgtccctag gaaattttac tctgctggag agcttcttct acggccccct 420

tgcagcaatg ctcttcccag cattacgttg cgggtaaaac ggaagtcgtg tacccgacct 480

agcagcccag ggatggaaaa gtcccggccg tcgctggcaa taatagcggg cggacgcatg 540

tcatgagatt attggaaacc accagaatcg aatataaaag gcgaacacct ttcccaattt 600

tggtttctcc tgacccaaag actttaaatt taatttattt gtccctattt caatcaattg 660

aacaactatc aagaattcga gctcggtacc atggcaagta tagttttccg tacaagtccc 720

ttgctggtct gcttctctat tcaatgtatt tgtactaacc ctagtaggtt acaattggaa 780

acgcacatga tgacctaatc catgacgccg ttctagatta ctatggacgt cgactggcca 840

cctgttcatc ggacaagaca atcaagattt ttgagatcga tggggagaac caacgattgg 900

tggaaacttt aatcggacac gaaggacctg tgtggcaagt tgcatgggcc catcctaaat 960

ttggagtcat tcttgcctcg tgttcttatg acggtaaagt tttgatttgg aaagaagaca 1020

acggtgtatg gaacaaagtg gctgaacatt ccgttcatca ggcatctgtt aatagtgttt 1080

cctgggcacc tcatgaatac ggtcctgttt tgctctgtgc ttccagtgat gggaagatat 1140

ccattgtcga attcaaggac ggaggagcct tggaacctat tgtcatccaa ggtcacgcta 1200

taggcgtgaa tgctgcctct tgggctccaa tttcattgcc cgataatacg aggcggtttg 1260

tttctggtgg ctgtgacaat ctagtcaaaa tttggagata cgatgacgcc gcaaaaacat 1320

ttatcgaaga agaagctttt caaggacatt ccgactgggt cagagatgtg gcatggtctc 1380

cttctcgttt atcaaagtca tacattgcca ctgcctcaca agatcgtaca gtattgattt 1440

ggactaaaga tggaaaatct aacaaatggg aaaaacagcc tttaacaaag gaaaaattcc 1500

ccgatgtttg ttggagagcc agctggtctc ttagtggaaa tgtattggcc atttcgggtg 1560

gtgataataa ggtcactttg tggaaggaaa acatccaggg caaatgggag tccgctggcg 1620

aagtcgatca aagggatcca ccggtcgcca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca 1680

ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg 1740

tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca 1800

ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc 1860

agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc 1920

ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc 1980

gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg 2040

acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca 2100

acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc 2160

acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg 2220

gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc aagctgagca 2280

aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga 2340

tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aaagcggccg cgactctagt ctcgagctgc 2400

aggcatgcaa gcttcttaga catgactgtt cctcagttca agttgggcac ttacgagaag 2460

accggtcttg ctagattcta atcaagagga tgtcagaatg ccatttgcct gagagatgca 2520

ggcttcattt ttgatacttt tttatttgta acctatatag tataggattt tttttgtcat 2580

tttgtttctt ctcgtacgag cttgctcctg atcagcctat ctcgcagctg atgaatatct 2640

tgtggtaggg gtttgggaaa atcattcgag tttgatgttt ttcttggtat ttcccacaca 2700

tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 2760

tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 2820

gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 2880

ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 2940

tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 3000

agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 3060

atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 3120

acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 3180

actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 3240

tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 3300

tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga 3360

tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 3420

tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat 3480

caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg 3540

cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt 3600

agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag 3660

acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc 3720

gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag 3780

ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca 3840

tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa 3900

ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga 3960

tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata 4020

attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca 4080

agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg 4140

ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg 4200

ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg 4260

cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag 4320

gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac 4380

tcttcctttt tcaatgatct cctgatgact gactcactga taataaaaat acggcttcag 4440

aatttctcaa gactacactc actgtccgac ttcaagtatg acatttccct tgctacctgc 4500

atacgcaagt gttgcagagt ttgataattc cttgagtttg gtaggaaaag ccgtgtttcc 4560

ctatgctgct gaccagctgc acaacctgat caagttcact caatcgactg agcttcaagt 4620

taatgtgcaa gttgagtcat ccgttacaga ggaccaattt gaggagctga tcgacaactt 4680

gctcaagttg tacaataatg gtatcaatga agtgattttg gacctagatt tggcagaaag 4740

agttgtccaa aggatgatcc caggcgctag ggttatctat aggaccctgg ttgataaagt 4800

tgcatccttg cccgctaatg ctagtatcgc tgtgcctttt tcttctccac tgggcgattt 4860

gaaaagtttc actaatggcg gtagtagaac tgtttatgct ttttctgaga ccgcaaagtt 4920

ggtagatgtg acttccactg ttgcttctgg tataatcccc attattgatg ctcggcaatt 4980

gactactgaa tacgaacttt ctgaagatgt caaaaagttc cctgtcagtg aaattttgtt 5040

ggcgtctttg actactgacc gccccgatgg tctattcact actttggtgg ctgactcttc 5100

taattactcg ttgggcctgg tgtactcgtc caaaaagtct attccggagg ctataaggac 5160

acaaactgga gtctaccaat ctcgtcgtca cggtttgtgg tataaaggtg ctacatctgg 5220

agcaactcaa aagttgctgg gtatcgaatt ggattgtgat ggagactgct tgaaatttgt 5280

ggttgaacaa acaggtgttg gtttctgtca cttggaacgc acttcctgtt ttggccaatc 5340

aaagggtctt agagccatgg aagccacctt gtgggatcgt aagagcaatg ctccagaagg 5400

ttcttatacc aaacggttat ttgacgacga agttttgttg aacgctaaaa ttagggagga 5460

agctgatgaa cttgcagaag ctaaatccaa ggaagatata gcctgggaat gtgctgactt 5520

attttatttt gcattagtta gatgtgccaa gtacggtgtg acgttggacg aggtggagag 5580

aaacctggat atgaagtccc taaaggtcac tagaaggaaa ggagatgcca agccaggata 5640

caccaaggaa caacctaaag aagaatccaa acctaaagaa gtcccttctg aaggtcgtat 5700

tgaattgtgc aaaattgacg tttctaaggc ctcctcacaa gaaattgaag atgcccttcg 5760

tcgtcctatc cagaaaacgg aacagattat ggaattagtc aaaccaattg tcgacaatgt 5820

tcgtcaaaat ggtgacaaag cccttttaga actaactgcc aagtttgatg gagtcgcttt 5880

gaagacacct gtgttagaag ctcctttccc agaggaactt atgcaattgc cagataacgt 5940

taagagagcc attgatctct ctatagataa cgtcaggaaa ttccatgaag ctcaactaac 6000

ggagacgttg caagttgaga cttgccctgg tgtagtctgc tctcgttttg caagacctat 6060

tgagaaagtt ggcctctata ttcctggtgg aaccgcaatt ctgccttcca cttccctgat 6120

gctgggtgtt cctgccaaag ttgctggtcg caaagaaatt gtttttgcat ctccacctaa 6180

gaaggatggc acccttaccc cagaagtcat ctacgttgcc cacaaggttg gtgctaagtg 6240

tatcgtgcta gcaggaggcg cccaggcagt agctgctatg gcttacggaa cagaaactgt 6300

tcctaagtgt gacaaaatat ttggtccagg aaaccagttc gttactgctg ccaagatgat 6360

ggttcaaaat gacacatcag ccctgtgtag tattgacatg cctgctgggc cttctgaagt 6420

tctagttatt gctgataaat acgctgatcc agatttcgtt gcctcagacc ttctgtctca 6480

agctgaacat ggtattgatt cccaggtgat tctgttggct gtcgatatga cagacaagga 6540

gcttgccaga attgaagatg ctgttcacaa ccaagctgtg cagttgccaa gggttgaaat 6600

tgtacgcaag tgtattgcac actctacaac cctatcggtt gcaacctacg agcaggcttt 6660

ggaaatgtcc aatcagtacg ctcctgaaca cttgatcctg caaatcgaga atgcttcttc 6720

ttatgttgat caagtacaac acgctggatc tgtgtttgtt ggtgcctact ctccagagag 6780

ttgtggagat tactcctccg gcaccaacca cactttgcca acgtacggat atgcccgtca 6840

atacagcgga gttaacactg caaccttcca gaagttcatc acttcacaag acgtaactcc 6900

tgagggactg aaacatattg gccaagcagt gatggatctg gctgctgttg aaggtctaga 6960

tgctcaccgc aatgctgtta aggttcgtat ggagaaactg ggacttattt aattatttag 7020

agattttaac ttacatttag attcgataga tcattattga agcatttatc agggttattg 7080

tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 7140

cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 7200

ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 7235

<210> 2

<211> 8399

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga 60

tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg 120

cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa 180

cctctacaaa tgtggtactt aagagggatc gataaggatc tagcttgtgg aaggctactc 240

gaaatgtttg acccaagtta aacaatttaa aggcaatgct accaaatact aattgagtgt 300

atgtaaactt ctgacccact gggaatgtga tgaaagaaat aaaagctgaa atgaatcatt 360

ctctctacta ttattctgat atttcacatt cttaaaataa agtggtgatc ctaactgacc 420

taagacaggg aatttttact aggattaaat gtcaggaatt gtgaaaaagt gagtttaaat 480

gtatttggct aaggtgtatg taaacttccg acttcaactg tatagggatc ctctagctag 540

agtcgacctc gagggggggc ccggtaccca gcttttgttc cctttagtga gggttaattt 600

cgagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa 660

ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga 720

gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 780

gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct 840

cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 900

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acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 1020

ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 1080

ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 1140

gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 1200

gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 1260

ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 1320

actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 1380

gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 1440

ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 1500

ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 1560

gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 1620

tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 1680

tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 1740

aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 1800

aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 1860

tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 1920

gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 1980

agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 2040

aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 2100

gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 2160

caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 2220

cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 2280

ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 2340

ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 2400

gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 2460

cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 2520

gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 2580

caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 2640

tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 2700

acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 2760

aagtgccacc tgacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc 2820

gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt 2880

cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag 2940

ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt 3000

cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt 3060

tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt 3120

cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt 3180

aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct tacaatttcc attcgccatt 3240

caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct 3300

ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc 3360

acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt 3420

ggagctcgga tccctataca gttgaagtcg gaagtttaca tacacttaag ttggagtcat 3480

taaaactcgt ttttcaacta ctccacaaat ttcttgttaa caaacaatag ttttggcaag 3540

tcagttagga catctacttt gtgcatgaca caagtcattt ttccaacaat tgtttacaga 3600

cagattattt cacttataat tcactgtatc acaattccag tgggtcagaa gtttacatac 3660

actaagttga ctgtgccttt aaacagcttg gaaaattcca gaaaatgatg tcatggcttt 3720

agaagcttac cggtaggcgc caaccggctc cgttctttgg tggccccttc gcgccacctt 3780

ctactcctcc cctagtcagg aagttccccc ccgccccgca gctcgcgtcg tgcaggacgt 3840

gacaaatgga agtagcacgt ctcactagtc tcgtgcagat ggacagcacc gctgagcaat 3900

ggaagcgggt aggcctttgg ggcagcggcc aatagcagct ttgctccttc gctttctggg 3960

ctcagaggct gggaaggggt gggtccgggg gcgggctcag gggcgggctc aggggcgggg 4020

cgggcgcccg aaggtcctcc ggaggcccgg cattctgcac gcttcaaaag cgcacgtctg 4080

ccgcgctgtt ctcctcttcc tcatctccgg gcctttcgac ctgcagccca agctagctta 4140

ccatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg cgacgacgtc cccagggccg 4200

tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact accccgccac gcgccacacc gtcgatccgg 4260

accgccacat cgagcgggtc accgagctgc aagaactctt cctcacgcgc gtcgggctcg 4320

acatcggcaa ggtgtgggtc gcggacgacg gcgccgcggt ggcggtctgg accacgccgg 4380

agagcgtcga agcgggggcg gtgttcgccg agatcggccc gcgcatggcc gagttgagcg 4440

gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg aaggcctcct ggcgccgcac cggcccaagg 4500

agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg tctcgcccga ccaccagggc aagggtctgg 4560

gcagcgccgt cgtgctcccc ggagtggagg cggccgagcg cgccggggtg cccgccttcc 4620

tggagacctc cgcgccccgc aacctcccct tctacgagcg gctcggcttc accgtcaccg 4680

ccgacgtcga ggtgcccgaa ggaccgcgca cctggtgcat gacccgcaag cccggtgcct 4740

gacgcccgcc ccacgacccg cagcgcccga ccgaaaggag cgcacgaccc catgcagccc 4800

gggggatcca ctagttgaat tcgtccggtg gggaatcaca ttcagaagtt ggaggctagc 4860

tgataggaca tagtgaaacc ccgactctta aattaaattg ggactggact atagcttagt 4920

ggcagagtac atgcttagca tccttaaggc cctgggttca gtctcagcat tgtgtgtgtg 4980

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tttgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgacaaaa caaaaacaaa 5040

ctcacaaaac aaaacagaac atatcttcac acacacccca gaacactcca catcaaaaac 5100

ccaaataaac aacattcccc tgctgtcaaa tctgtaaaga tgatttttta aaaactaaaa 5160

aatttaaaaa cataggtgct gggggggggt agggcatggg ggacttttgg gatagcattg 5220

gaaatgtaaa tgaagaaaat acctaattaa aataaaataa aattaaatta aaaattaaaa 5280

aaaaacatag gtgcaaataa cggttgttaa taaaatctgc ctgacgagga aaccattcca 5340

tgttgtctgc aagagaggca gagaatggtg cgcaggagga gcaaaggaag agcctgtctc 5400

ttcccacact ccttccttcc acagatctga atgttcctga attctaatta tttttaagag 5460

agttaaaaag aaaagaaaag aaaagaaaag aaaagaaaag aaaagaaaaa gagaaagaaa 5520

gagagtcaag ttacatctta gaaatttcac ctctcaagta tgttaacagt gtaagaggca 5580

gctagaattt cttgagcacc tactgtgtac caagaggctt gccaggaatt ctgggaacat 5640

ggtggttaaa tggctaattt ctggggtctg ttttcccaga gggaaactgg aatcgccttg 5700

agaagactct catttcccac agtggattta tgtcacattg aggagggtct gagatctgca 5760

gaacttgtga gtgtggtaca gcaagggttt gaattcaaac ctgcaggaag gagaaggagc 5820

caacagccta acacgctctc tatatccctg tctgtacctg agatgctctg ggagaacacg 5880

gagtccacca gggcatgtct ggaagtccct ctgcactgcc caccagaagc cacatggcct 5940

cgggcagggg ttaggatctc cacatgtggg gccagactgc ccatggcacc tgggctggcc 6000

ttggagtact tgctaagaga acacaaagtg tctgctctgc tcagtgaggg catcctagac 6060

accaggagct agcctgcaaa gactgtcctg gactttagct tccctgacct cagaggccct 6120

tgggtctgat cctatgccta atgttagcca tacacttaac tctgcaagtc ccaagatgac 6180

ttctgttccc attgcagtgt ttgccccagc agcccaacct ctgtttggag acagagagtg 6240

gtaggaaaca ccaggcttct tttcttactt agccctcatt tccctcgtga ttgggccact 6300

gaccacccct gggtccttta cactggtctc gagccaagaa aggcagcgca tcgtgtcaga 6360

agctgcagac ttcattccag ggcccccctc tcctggtttg gggcctgctt tccaatctca 6420

agcctgacct gggtcagacc tgggcaggag ccatggggaa ggcagctgct cttctgcata 6480

acaaagggtg gccctgctgg agagccaggg aacacaccag ggacgagtct tacaatccac 6540

tatggtttct tcatctatcc cccgactaag attgtctgaa tctgcaaata aaacctctag 6600

atactggtgt aatgcaaatc ccaggtaaac agtgactgat atattgtgta accaagtccc 6660

agattcagta cgggttttat ttggcagccc tacccctggc agcttgctca attttatttc 6720

tccagcgcac aaagccacaa attcacactc gggtatccca gctgtgtctt ggagaaggct 6780

tagcatatta ctggtgtata gccacacacc cttgtcccca ccccagccac atgcccctgt 6840

ccccaaccca gccacacacc ctgtccccac cccagacaca cacccctggg caggacttag 6900

cagaaaataa ttggagctgt ggaaagccct tcgtgggcac cgatcttaac tatgttgccc 6960

ctcgtctgag ccgatgtact ctggctcaga gattgggatg gggtagattt tcaattctcc 7020

tacagcaaga aagggaaagg ataggttgct cattggcgag tcccaggctt tgcaaccaag 7080

gaaggtcccc cagcccccaa agtggagaag cctcactctt atcagcccta gaaaagtctt 7140

ttgcacacct gggaagcaag tcagttggag agcccaggtg ttgattgaca tctggttctc 7200

tccagggttt agaagcagtg atggacaaga ctacaggtgc acattccaga cactgggagc 7260

aggcatccag cagagaacgt gagacctccg cgtcgtctcc aggacccacc ttccatccca 7320

tgctgggatt gaatttaggg cttcacgtgt gcagggccgg tgctgctcta ccactgagct 7380

attaccaccc ctgtcctgaa tgtcctaatt ggtcagacac ccttaagtca atggtgaagt 7440

atatggctaa cagacagcgg tgaccagatg ttctcagtcc agacaggctt ttgtgtcctt 7500

tctagacagc ccctcctcag gactcagggg cttgtttcat gctgagctcc caggaggtcc 7560

caggggtgtg acctctcttc ttcctccctg ccccccaccc caggaccagc tataaagctg 7620

ttccgtaccg taccattcct ccgcagactc aagacccttt gaattccgaa gatctaccgg 7680

tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagg ataacatggc catcatcaag gagttcatgc 7740

gcttcaaggt gcacatggag ggctccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg 7800

gcgagggccg cccctacgag ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc aagggtggcc 7860

ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc ctcagttcat gtacggctcc aaggcctacg 7920

tgaagcaccc cgccgacatc cccgactact tgaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt 7980

gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag gactcctccc 8040

tgcaggacgg cgagttcatc tacaaggtga agctgcgcgg caccaacttc ccctccgacg 8100

gccccgtaat gcagaagaag accatgggct gggaggcctc ctccgagcgg atgtaccccg 8160

aggacggcgc cctgaagggc gagatcaagc agaggctgaa gctgaaggac ggcggccact 8220

acgacgctga ggtcaagacc acctacaagg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggcgcct 8280

acaacgtcaa catcaagttg gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggaac 8340

agtacgaacg cgccgagggc cgccactcca ccggcggcat ggacgagctg tacaagtag 8399

Claims (5)

1.一种制备重构胚胎的方法，包括如下步骤：将三种干细胞进行悬浮震荡共培养，形成重构胚胎；所述三种干细胞为鼠胚胎干细胞、鼠滋养层干细胞和鼠胚外内胚层干细胞；

所述悬浮震荡共培养为：在非粘附细胞培养皿中，50rpm-90rpm水平振荡培养；

鼠胚胎干细胞、鼠滋养层干细胞和鼠胚外内胚层干细胞的数量配比依次为：0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-3；

所述形成为自我聚合形成；

所述共培养采用重组胚胎培养基；所述重组胚胎培养基中不含有如下五种物质：FGF4、heparin、LIF、PD0325901和CHIR99021。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述共培养的时间为12小时以上。

3.三种干细胞和悬浮震荡培养体系在制备重构胚胎中的应用；所述三种干细胞为鼠胚胎干细胞、鼠滋养层干细胞和鼠胚外内胚层干细胞；

鼠胚胎干细胞、鼠滋养层干细胞和鼠胚外内胚层干细胞的数量配比依次为：0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-3；

所述悬浮震荡培养体系为采用液相培养基在非粘附细胞培养皿中进行的50rpm-150rpm水平振荡培养的体系；所述液相培养基为重组胚胎培养基；所述重组胚胎培养基中不含有如下五种物质：FGF4、heparin、LIF、PD0325901和CHIR99021。

4.一种制备重构胚胎的方法，包括如下步骤：将两种干细胞进行悬浮震荡共培养，形成重构胚胎；所述两种干细胞为鼠胚胎干细胞和鼠胚外内胚层干细胞；

所述悬浮震荡共培养为：在非粘附细胞培养皿中，50rpm-90rpm水平振荡培养；

鼠胚胎干细胞和鼠胚外内胚层干细胞的数量配比依次为：0.8-1.2:0.8-3；

所述形成为自我聚合形成；

所述共培养采用重组胚胎培养基；所述重组胚胎培养基中不含有如下五种物质：FGF4、heparin、LIF、PD0325901和CHIR99021。

5.两种干细胞和悬浮震荡培养体系在制备重构胚胎中的应用；所述两种干细胞为鼠胚胎干细胞和鼠胚外内胚层干细胞；

鼠胚胎干细胞和鼠胚外内胚层干细胞的数量配比依次为：0.8-1.2:0.8-3；

所述悬浮震荡培养体系为采用液相培养基在非粘附细胞培养皿中进行的50rpm-150rpm水平振荡培养的体系；所述液相培养基为重组胚胎培养基；所述重组胚胎培养基中不含有如下五种物质：FGF4、heparin、LIF、PD0325901和CHIR99021。

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