CN110373427A - 一种人源tlr4基因3′非翻译区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用 - Google Patents

一种人源tlr4基因3′非翻译区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用，属于分子遗传学领域。本发明双荧光素酶报告基因载体为pGLTlr4/PSV40/3UTR，载体的DNA序列如SEQ ID NO.5所示；双荧光素酶报告基因载体包含人源TLR4基因3'非翻译区序列，人源TLR4基因3'非翻译区序列如SEQ ID NO:3所示，人源TLR4基因3'非翻译区序列克隆至双荧光素酶报告载体pGL3‑Promoter中luc基因下游。本发明人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体可用于检测TLR4基因3'非翻译区上SNP位点对TLR4基因表达的影响以及用于检测TLR4基因3'非翻译区上SNP位点与miRNA的靶向关系。

Description

一种人源TLR4基因3′非翻译区的双荧光素酶报告基因载体及 其构建方法与应用
技术领域
本发明公开了一种人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用，属于分子遗传学领域。
背景技术
Toll样受体(Toll-Like receptor，TLRs)是模式识别受体(pattern recognitionreceptor,PRRs)，是炎症信号传递的门户蛋白，在生理状态下与其对应的配体结合后会引发细胞信号转导，引起下游多种与炎症反应相关基因的高表达，促进多种炎性细胞因子的释放，从而在对抗入侵病原体的过程中起到了至关重要的作用，能够有效激活天然免疫和获得性免疫应答。其中，TLR4是第一个被发现的Toll样受体蛋白，属于I型跨膜蛋白，它由胞外的氨基端、跨膜区以及胞内的羧基端三部分组成，大量表达在抗原提呈细胞的表面。大量研究发现，TLR4参与生物体内的多种炎症调节、免疫应答以及肿瘤发生的进程，与许多疾病的发生发展过程密切相关。TLR4受体激活引发的下游炎症级联反应往往会使疾病向不利的方向转化，虽然目前有大量研究工作着落在阻断或抑制TLR4信号通路各个节点基因表达上，但是目前仍然没有研发出特别有效的药物或治疗方法能够精准靶向TLR4信号通路而达到确切治疗疾病的目的。因此，深入研究TLR4基因表达调控机制实乃当务之急。
非翻译区(Untranslated Region,UTR)，是指位于mRNA链编码区两端不翻译为蛋白质的片段，位于编码区上游的mRNA片段被称为5'非翻译区(5'-untranslated region，5'-UTR)，位于编码区下游则被称为3'非翻译区(3'-untranslated region，3'-UTR)。大量研究表明非翻译区密切调控基因转录前和转录后的表达，5'非翻译区能够影响基因的mRNA的翻译效率、稳定性以及出核转运，从而导致蛋白表达水平的改变；3'非翻译区则主要影响mRNA的稳定性和翻译。其中，miRNA靶向结合至3'-UTR而负调控目的基因表达水平为近年来非编码区调控研究的一大热点。2017年，斯坦福大学Jin Billy Li课题组和中山大学张锐课题组共同报道了3'-UTR的编辑位点可能通过介导mRNA的降解来调控基因表达，这一研究对认识RNA编辑的进化和功能提供了新思路，特别是揭示了非编码区RNA编辑位点的功能重要性。此外，大量研究报道大量分布在非翻译区的单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)位点能够影响基因的表达量，从而与肿瘤、免疫性疾病和心血管疾病等密切相关。
荧光素酶报告基因系统是指通过定量荧光素酶催化荧光素氧化为氧化荧光素所发出的生物荧光来间接筛选影响目的基因表达的潜在调控因子并定量其调控活性的一种方法。传统方法构建的报告基因载体存在如下缺陷：首先，由于大多数目的基因的全长3'-UTR长度较长(几百至几千个碱基不等)，存在很多相同的限制性酶切位点相互干扰，所以传统的荧光素酶报告基因载体只能将3'-UTR中的一小段DNA序列(200至300个碱基)通过酶切连接的方法插入到商业化荧光素酶报告载体的多克隆位点中，无法实现全长序列的构建；其次，插入片段通过酶切连接的方法插入到商业化荧光素酶报告载体的多克隆位点后，通常会在荧光素酶luc基因和目的插入片段之间残留一段限制性内切酶识别位点等多余序列，这段序列可能会影响实验结果的准确性；最后，因为传统荧光素酶报告载体没有插入完整目的基因的非翻译区，只是截取一小段序列构建至荧光素酶基因的下游，这种结构组成和体内真实情况存在较大差别，因此筛选出的调控因子往往不能在体内生理状态下发挥作用，正如苏小平等人通过miRIP的方法发现传统荧光素酶报告基因系统筛选出的互作miRNA只有极少数与内体真实情况相同。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，提供了一种基于人TLR4基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用，通过设计5'末端包含接口上下游序列同源臂的引物TPprimer3和TPprimer4，扩增得到TLR4基因3'非翻译区完整片段，使用XbaI单酶切pGL3-Promoter质粒后回收线性化产物，将所得片段进行Gibson组装后构建双荧光素酶报告基因载体pGLTlr4/PSV40/3UTR。本发明将TLR4基因3'非翻译区完整片段无缝克隆至萤火虫荧光素酶luc基因的下游，使得载体的结构组成比传统荧光素酶报告质粒更加接近体内真实情况，基于该载体进行相应点突变后，可用于检测3'非翻译区上的所有SNP位点对TLR4基因表达的影响和其与miRNA的靶向关系，进而初步阐明其作用机制，能够极大地帮助加快人类TLR4基因表达异常免疫性疾病的研究进程。
一种人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体，双荧光素酶报告基因载体为pGLTlr4/PSV40/3UTR，载体的DNA序列如SEQ ID NO.5所示。
所述双荧光素酶报告基因载体包含人源TLR4基因3'非翻译区序列，人源TLR4基因3'非翻译区序列如SEQ ID NO:3所示，人源TLR4基因3'非翻译区序列克隆至双荧光素酶报告载体pGL3-Promoter中luc基因下游。
人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体的构建方法，具体步骤如下：
(1)设计5'端包含接口上下游序列同源臂的引物对TPprimer3/TPprimer4，TPprimer3的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，TPprimer4的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)以人基因组DNA为模板，利用引物对TPprimer3/TPprimer4PCR扩增出TLR4基因3'非翻译区序列，TLR4基因3'非翻译区序列如SEQ ID NO:3所示；
(3)使用限制性内切酶XbaI单酶切pGL3-Promoter质粒，通过琼脂糖凝胶回收酶切产物，利用Gibson组装方法将TLR4基因3'非翻译区序列、酶切产物进行同源组装；
(4)将组装产物转入感受态细胞中，涂布至氨苄青霉素抗性LB平板，过夜培养后挑取单克隆，扩增后提取质粒，分别进行电泳验证、酶切验证和测序验证，得到载体pGLTlr4/PSV40/3UTR即人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体，载体的DNA序列如SEQID NO.5所示。
所述步骤(2)PCR反应条件为：在98℃预变性2min；再在98℃变性10s，然后在62℃退火30s，再在72℃延伸90s，进行30个循环；最后在72℃复延伸5min。
所述步骤(1)引物TPprimer3的5'端和酶切产物的3'端具有30bp的同源序列；TPprimer4的5'端和酶切产物的5'端具有28bp的同源序列；酶切产物的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
所述步骤(3)使用限制性内切酶XbaI单酶切pGL3-Basic质粒的酶切体系为10×MBuffer10μl、pGL3-Promoter质粒(250ng/μl)20μl、0.1％BSA 10μl、XbaI 5μl、ddH2O 55μl。
所述酶切反应条件为37℃水浴反应2h，65℃失活20min。
所述人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体可用于检测TLR4基因3'非翻译区上SNP位点对TLR4基因表达的影响：人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体pGLTlr4/PSV40/3UTR，分别在对应TLR4基因3'UTR上rs7873784(G>C)和rs7873784(G>A)的位点进行定点突变，构建两个突变载体mut/rs784_G>C和mut/rs784_G>A；将pGLTlr4/PSV40/3UTR、mut/rs784_G>C和mut/rs784_G>A分别转染HEK293T细胞后通过双荧光素酶实验发现rs7873784(G>A)突变后能够显著提升相对荧光素酶表达活性(P<0.05)，而rs7873784(G>C)突变则不影响相对荧光素酶表达活性，证明rs7873784(G>A)能够上调TLR4基因表达水平；
所述人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体可用于检测TLR4基因3'非翻译区上SNP位点与miRNA的靶向关系：使用生物信息学的方法同时筛查三个miRNA相关数据库：http://www.bioguo.org/miRNASNP2/、http://www.targetscan.org/vert_71/和https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/，预测了hsa-let-7d-3p与TLR4基因3'-UTR结合的靶位点为“TCGTATA”，而rs7873784则定位于其中的下划线碱基G；将hsa-let-7d-3p的模拟物/抑制剂和pGLTlr4/PSV40/3UTR或mut/rs784_G>A共转染HEK293T细胞后通过双荧光素酶实验证明hsa-let-7d-3p能够靶向结合TLR4基因3'-UTR而下调TLR4基因表达，其保守靶位点为“TCGTATA”，而rs7873784(G>A)突变后失去与hsa-let-7d-3p的结合能力，最终会引起TLR4基因表达水平上调。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过设计5'末端包含接口上下游序列同源臂的引物TPprimer3和TPprimer4，扩增得到TLR4基因3'非翻译区完整片段，使用XbaI单酶切pGL3-Promoter质粒后回收线性化产物，将所得片段进行Gibson组装后构建双荧光素酶报告基因载体pGLTlr4/PSV40/3UTR。本发明将TLR4基因3'非翻译区完整片段无缝克隆至萤火虫荧光素酶luc基因的下游，使得载体的结构组成比传统荧光素酶报告质粒更加接近体内真实情况，基于该载体进行相应点突变后，可用于检测3'非翻译区上的所有SNP位点对TLR4基因表达的影响和其与miRNA的靶向关系，进而初步阐明其作用机制，能够极大地帮助加快人类TLR4基因表达异常免疫性疾病的研究进程；
(2)本发明人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体可用于检测TLR4基因3'非翻译区上SNP位点对TLR4基因表达的影响以及用于检测TLR4基因3'非翻译区上SNP位点与miRNA的靶向关系。
附图说明
图1为pGLTlr4/PSV40/3UTR载体构建方法和载体应用流程图，其中虚线框外为双荧光素酶报告基因载体pGLTlr4/PSV40/3UTR的构建流程图，虚线框内的内容为pGLTlr4/PSV40/3UTR的应用；
图2为Gibson组装各DNA片段电泳图，图A中泳道M为1kb plus DNA ladder，泳道1为TLR4基因3'-UTR序列PCR产物；图B中泳道M为1kb plus DNA ladder，泳道1为pGL3-Promoter经XbaI单酶切后酶切产物；
图3为pGLTlr4/PSV40/3UTR载体电泳图，图中泳道M为1kb plus DNA ladder，泳道1为pGLTlr4/PSV40/3UTR载体电泳条带；
图4为pGLTlr4/PSV40/3UTR载体酶切验证电泳图，图中泳道M为1kb plus DNAladder，泳道1为载体经XhoI单酶验证电泳条带；
图5为荧光素酶报告基因载体pGLTlr4/PSV40/3UTR的结构图谱；
图6为pGLTlr4/PSV40/3UTR的多克隆位点、主要结构和组装接口测序结果示意图；
图7为pGLTlr4/PSV40/3UTR、mut/rs784_G>C和mut/rs784_G>A在rs7873784处点突变原始测序峰对比图；
图8为pGL3-Promoter、pGLTlr4/PSV40/3UTR、mut/rs784_G>C和mut/rs784_G>A转染HEK293T细胞后相对荧光素酶检测结果，图中纵坐标Relative luciferase activity表示相对荧光素酶活性值，*表示P<0.05；
图9为预测hsa-let-7d-3p靶向TLR4基因3'-UTR结合位点示意图；
图10为hsa-let-7d-3p的模拟物/抑制剂和pGLTlr4/PSV40/3UTR或mut/rs784_G>A共转染HEK293T细胞后相对荧光素酶检测结果图，图中纵坐标Relative luciferaseactivity表示相对荧光素酶活性值，*表示P<0.05。
具体实施方式
本发明公开了一种人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。
人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体构建方法和载体应用流程图见图1，其中虚线框外为双荧光素酶报告基因载体pGLTlr4/PSV40/3UTR的构建流程图，虚线框内的内容为pGLTlr4/PSV40/3UTR的应用；
实施例1：一种人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体，双荧光素酶报告基因载体为pGLTlr4/PSV40/3UTR，载体的DNA序列如SEQ ID NO.5所示；
双荧光素酶报告基因载体包含人源TLR4基因3'非翻译区序列，人源TLR4基因3'非翻译区序列如SEQ ID NO:3所示，人源TLR4基因3'非翻译区序列克隆至双荧光素酶报告载体pGL3-Promoter中luc基因下游；
人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体的构建方法，具体步骤如下：
(1)参考GeneBank中人TLR4基因的DNA序列(登录号NG_011475)和pGL3-Promoter荧光素酶报告载体序列，使用引物设计软件Primer Premier 5.0设计5'端包含接口上下游序列同源臂的引物对TPprimer3/TPprimer4，TPprimer3的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，TPprimer4的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；
引物设计：TPprimer3的5'端和酶切产物SEQ ID NO:4序列的3'端具有30bp的同源序列；TPprimer4的5'端和酶切产物SEQ ID NO:4序列的5'端具有28bp的同源序列；引物的同源序列如附图6中的浅色碱基所示；
引物送由华大基因合成，纯化方式为PAGEplus；
(2)模板准备：使用血液基因组DNA提取试剂盒(购自天根公司)提取冻存人血液总DNA(取自昆明医科大学第一附属医院)，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后使用Nanodrop 2000c(ThermoFisher)测定DNA浓度为86ng/μl，OD260/OD280为1.81，冻存于-20℃低温冰箱备用；
PCR扩增：使用的高保真DNA聚合酶为Cobuddy DNA Polymerase(购自康为世纪，CW2396S)，以人基因组DNA为模板，利用引物对TPprimer3/TPprimer4扩增出TLR4基因的完整3'-UTR序列，产物大小为2893bp(见图2A)，TLR4基因的完整3'-UTR序列如SEQ ID NO:3所示；
PCR扩增反应体系为：
5×Cobuddy HF Buffer 10μl
Template(85ng/μl)1μl
dNTP(10mM each,TAKARA,4019)1μl
Primer 各2.5μl
ddH2O 32.5μl
Cobuddy DNA Polymerase 0.5μl
PCR扩增条件：
PCR扩增条件：
PCR产物纯化：将PCR扩增产物上样至1％的TAE琼脂糖凝胶进行电泳，对如附图2中泳道1所示的DNA产物进行精确切胶回收，对应TLR4基因的完整3'-UTR序列PCR产物；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司(DP209-02)，完全按照该试剂盒操作；
(3)pGL3-Promoter载体扩增和单酶切反应：pGL3-Promoter载体(购自Promega)经转化至大肠杆菌JM109扩增后，使用无内毒素质粒小提中量提取试剂盒Ⅱ(购自Omega)按照试剂盒说明书所述方法进行质粒提取；使用限制性内切酶XbaI(购自TAKARA)单酶切pGL-Promoter载体，产生大小为5010bp的酶切产物(见图2B)，酶切产物的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；
酶切反应体系为：
反应条件为：37℃水浴反应2h，65℃失活20min；
将酶切产物上样至1％的TAE琼脂糖凝胶进行电泳，通过琼脂糖凝胶对酶切产物纯化回收；
Gibson组装：利用Gibson组装方法将TLR4基因完整3'-UTR序列PCR片段、酶切产物进行同源组装；组装所用各DNA片段电泳图如图2所示；
Gibson组装试剂的配制方法为：
1)先配6ml 5X ISO Buffer:
加ddH2O至6ml，充分混匀后冻存于-20℃备用；
2)组装试剂的配制
取500μl 5X ISO buffer，加入1μl 10u/μl T5exo配成混合物I；取160μl混合物I(其余-20℃保存留用)，加入10μl 2u/μl Phusion pol配成混合物II；取34μl混合物II(其余-20度保存留用)，加入16μl 40u/μl Taq lig配成混合物III；混合物III加ddH2O 30μl至总体积80μl；充分混匀后10μl每管分装，-20度保存备用；
Gibson组装反应体系为：
组装试剂 10μl
3'-UTR序列PCR片段(21ng/μl) 2μl
pGL3-Promoter酶切产物(9.3ng/μl) 8μl
反应条件为：50℃反应1h；
(4)组装产物的转化与鉴定筛选：将组装产物转入感受态细胞中，涂布至氨苄青霉素抗性LB平板，过夜培养后挑取单克隆，扩增后提取质粒，分别进行电泳验证、酶切验证和测序验证，得到载体pGLTlr4/PSV40/3UTR即人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体，载体的DNA序列如SEQ ID NO.5所示；
转化JM109感受态细胞
1)将提前制作并保存在-80℃冰箱的100μl JM109氯化钙感受态细胞插到冰上，待其解冻；
2)加入10μl组装产物，轻轻混匀；
3)将加入组装产物的感受态细胞置于冰上，冰浴30min；
4)置于42℃水浴锅热激1min，然后立即置于冰上静置2min；
5)加入500μl液体LB培养基，37℃摇动培养30min；
6)取全部菌液涂布在含有氨苄青霉素钠(终浓度100μg/ml，生工，A100339-0005)的固体LB平板上，37℃倒置培养过夜；
筛选阳性克隆并进行验证
1)挑取单菌落，转接至含100μg/ml氨苄青霉素钠的液体LB培养基中，37℃、220rpm摇动培养过夜培养后提质粒；
2)使用1％浓度的琼脂糖凝胶电泳鉴定载体大小(图3)；
3)将大小正确的质粒使用XhoI单酶切进行酶切鉴定(图4)，正确的酶切产物电泳带型为2481bp+5358bp；
4)将酶切验证正确的质粒送至生工生物进行全序列测序验证；
该验证正确的质粒命名为pGLTlr4/PSV40/3UTR，即为人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示，其结构图谱如图5所示，其多克隆位点、主要结构和组装接口测序结果如图6所示。
实施例2：双荧光素酶报告基因载体pGLTlr4/PSV40/3UTR的应用(用于检测TLR4基因3'非翻译区上SNP位点对TLR4基因表达的影响)
确定待研究SNP位点
通过使用Ferret-master遗传变异信息分析工具，结合相关资料的查阅，将rs7873784(G>C)和rs7873784(G>A)确定为可能影响TLR4基因的表达的待研SNP位点；
构建突变载体
按照申请号为201711203895.9的文献《在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法》所描述的方法，基于双荧光素酶报告基因载体pGLTlr4/PSV40/3UTR分别在对应rs7873784(G>C)和rs7873784(G>A)的位点上进行定点突变，构建mut/rs784_G>C和mut/rs784_G>A共2个突变载体；突变载体全部送至生工生物进行全序列测序验证，SNP位点突变前后的原始测序峰对比图如图7所示；突变所用引物序列如下(其中下划线标记的碱基为引入的突变碱基)：
rs7873784_G/C_F:AGCAGAGTTCCTATAATGAACAATA
rs7873784_G/A_F:AGCAGAGTTCATATAATGAACAATA
rs7873784_G/C/A_R:ATACAGCTGATCTTTAGAGCTAATT
将HEK293T细胞以4×104每孔，于转染前一天铺于24孔板，并加入完全培养基(DMEM培养基加10％胎牛血清和1％链霉素-青霉素双抗)至每孔总体积为500μl；
第二天待细胞汇合度达到70％左右时，严格按照转染试剂Lipofectamine3000Reagent(购自ThermoFisher)说明书的操作进行转染实验；将350ng pGL3-Promoter、pGLTlr4/PSV40/3UTR、mut/rs784_G>C和mut/rs784_G>A分别和17.5ng海肾荧光素酶表达质粒pRL-TK(购自Promega)共转染HEK293T细胞，每组做三个生物学重复，转染时间为48h；
双荧光素酶活性检测
用PBS润洗细胞两遍，然后按照双荧光素酶检测试剂盒(Reporter Assay System，购自Promega)说明书的操作，使用多功能酶标仪(iD5)进行双荧光素酶活性检测；
用萤火虫荧光值与海肾荧光值的比值作为该组的相对荧光活性，然后使用软件GraphPad Prism 7对检测结果进行统计分析；
荧光素酶活性检测实验结果如图8所示，与pGLTlr4/PSV40/3UTR相比，mut/rs784_G>C的相对荧光素酶表达活性基本没有变化，而mut/rs784_G>A的相对荧光素酶表达活性表现为显著的上调趋势(P<0.05)；实验结果证明：rs7873784(G>A)突变后能够显著提升TLR4基因表达水平，而rs7873784(G>C)突变则基本不影响TLR4基因表达水平。
实施例3：双荧光素酶报告基因载体pGLTlr4/PSV40/3UTR的应用(检测TLR4基因3'非翻译区上SNP位点与miRNA的靶向关系)
使用生物信息学的方法同时筛查三个miRNA相关数据库：http://www.bioguo.org/miRNASNP2/、http://www.targetscan.org/vert_71/和https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/，预测到miRNA hsa-let-7d-3p能够靶向TLR4基因3'-UTR，结合的靶位点为“TCGTATA”，而rs7873784则定位于其中的下划线碱基G；当rs7873784(G>A)突变后，该miRNA只有6nt能够与靶位点结合，这种突变可能导致该miRNA失去与TLR4基因3'UTR的结合能力(见图9)；
共转染和双荧光素酶活性检测
将HEK293T细胞以4×104每孔，于转染前一天铺于24孔板，并加入完全培养基(DMEM培养基加10％胎牛血清和1％链霉素-青霉素双抗)至每孔总体积为500μl；第二天待细胞汇合度达到70％左右时，严格按照转染试剂Lipofectamine 3000Reagent(购自ThermoFisher)说明书的操作进行转染实验；将miR-control、hsa-let-7d-3p-mimic、hsa-let-7d-3p-inhibitor分别与350ng pGLTlr4/PSV40/3UTR载体或mut/rs784_G>A突变载体共转染HEK293T细胞，同时每孔再共转入17.5ng海肾荧光素酶表达质粒pRL-TK，每孔做三组生物学重复，共转染48h，其中control和mimic所用的转染浓度为20nM，inhibitor所用的转染浓度为100nM；
所用的miR-control、hsa-let-7d-3p-mimic、hsa-let-7d-3p-inhibitor均购自上海吉玛制药技术有限公司；
双荧光素酶活性检测
按照实施例1所述的方法，进行双荧光素酶活性检测实验，然后使用软件GraphPadPrism7对检测结果进行统计分析；
荧光素酶活性检测实验结果如图10所示，pGLTlr4/PSV40/3UTR与hsa-let-7d-3p-inhibitor共转染组的相对荧光素酶表达活性显著高于pGLTlr4/PSV40/3UTR与hsa-let-7d-3p-mimic共转染组(P<0.05)，hsa-let-7d-3p-inhibitor能够显著上调pGLTlr4/PSV40/3UTR的荧光强度能够证明：hsa-let-7d-3p-inhibitor和细胞内的内源性hsa-let-7d-3p竞争性结合后，导致和TLR4基因3'-UTR结合的hsa-let-7d-3p降低，最终减少对荧光素酶的抑制，使其表达显著上调；此外，mut/rs784_G>A与hsa-let-7d-3p-mimic共转染组的相对荧光素酶表达活性显著高于pGLTlr4/PSV40/3UTR与hsa-let-7d-3p-mimic共转染组(P<0.05)，表明hsa-let-7d-3p-mimic能够抑制GG等位基因的，不能抑制AA等位基因，同时也证明了突变可能导致该miRNA失去与TLR4基因3'UTR的结合能力，rs7873784(G>A)突变后，导致hsa-let-7d-3p失去与TLR4基因3'-UTR的结合能力，解除了其对TLR4基因表达的抑制作用，最终引起TLR4基因表达上调。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 云南大学
<120> 一种人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
ccaagaaggg cggaaagatc gccgtgtaat agaggaaaaa taaaaacctc ctgag 55
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
tctgctcgaa gcggccggcc gccccgacag agagaaagaa agagatcaca ttca 54
<210> 3
<211> 2893
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
ccaagaaggg cggaaagatc gccgtgtaat agaggaaaaa taaaaacctc ctgaggcatt 60
tcttgcccag ctgggtccaa cacttgttca gttaataagt attaaatgct gccacatgtc 120
aggccttatg ctaagggtga gtaattccat ggtgcactag atatgcaggg ctgctaatct 180
caaggagctt ccagtgcaga gggaataaat gctagactaa aatacagagt cttccaggtg 240
ggcatttcaa ccaactcagt caaggaaccc atgacaaaga aagtcatttc aactcttacc 300
tcatcaagtt gaataaagac agagaaaaca gaaagagaca ttgttctttt cctgagtctt 360
ttgaatggaa attgtattat gttatagcca tcataaaacc attttggtag ttttgactga 420
actgggtgtt cactttttcc tttttgattg aatacaattt aaattctact tgatgactgc 480
agtcgtcaag gggctcctga tgcaagatgc cccttccatt ttaagtctgt ctccttacag 540
aggttaaagt ctagtggcta attcctaagg aaacctgatt aacacatgct cacaaccatc 600
ctggtcattc tcgagcatgt tctatttttt aactaatcac ccctgatata tttttatttt 660
tatatatcca gttttcattt ttttacgtct tgcctataag ctaatatcat aaataaggtt 720
gtttaagacg tgcttcaaat atccatatta accactattt ttcaaggaag tatggaaaag 780
tacactctgt cactttgtca ctcgatgtca ttccaaagtt attgcctact aagtaatgac 840
tgtcatgaaa gcagcattga aataatttgt ttaaaggggg cactctttta aacgggaaga 900
aaatttccgc ttcctggtct tatcatggac aatttgggct agaggcagga aggaagtggg 960
atgacctcag gaggtcacct tttcttgatt ccagaaacat atgggctgat aaacccgggg 1020
tgacctcatg aaatgagttg cagcagaagt ttattttttt cagaacaagt gatgtttgat 1080
ggacctctga atctctttag ggagacacag atggctggga tccctcccct gtacccttct 1140
cactgccagg agaactacgt gtgaaggtat tcaaggcagg gagtatacat tgctgtttcc 1200
tgttgggcaa tgctccttga ccacattttg ggaagagtgg atgttatcat tgagaaaaca 1260
atgtgtctgg aattaatggg gttcttataa agaaggttcc cagaaaagaa tgttcatcca 1320
gcctcctcag aaacagaaca ttcaagaaaa ggacaatcag gatgtcatca gggaaatgaa 1380
aataaaaacc acaatgagat atcaccttat accaggtaga atggctacta taaaaaaatg 1440
aagtgtcatc aaggatatag agaaattgga acccttcttc actgctggag ggaatggaaa 1500
atggtgtagc cgttatgaaa aacagtacgg aggtttctca aaaattaaaa atagaactgc 1560
tatatgatcc agcaatctca cttctgtata tatacccaaa ataattgaaa tcagaatttc 1620
aagaaaatat ttacactccc atgttcattg tggcactctt cacaatcact gtttccaaag 1680
ttatggaaac aacccaaatt tccattgaaa aataaatgga caaagaaaat gtgcatatac 1740
gtacaatggg atattattca gcctaaaaaa agggggaatc ctgttattta tgacaacatg 1800
aataaacccg gaggccatta tgctatgtaa aatgagcaag taacagaaag acaaatactg 1860
cctgatttca tttatatgag gttctaaaat agtcaaactc atagaagcag agaatagaac 1920
agtggttcct agggaaaagg aggaagggag aaatgaggaa atagggagtt gtctaattgg 1980
tataaaatta tagtatgcaa gatgaattag ctctaaagat cagctgtata gcagagttcg 2040
tataatgaac aatactgtat tatgcactta acattttgtt aagagggtac ctctcatgtt 2100
aagtgttctt accatataca tatacacaag gaagcttttg gaggtgatgg atatatttat 2160
taccttgatt gtggtgatgg tttgacaggt atgtgactat gtctaaactc atcaaattgt 2220
atacattaaa tatatgcagt tttataatat caattatgtc tgaatgaagc tataaaaaag 2280
aaaagacaac aaaattcagt tgtcaaaact ggaaatatga ccacagtcag aagtgtttgt 2340
tactgagtgt ttcagagtgt gtttggtttg agcaggtcta gggtgattga acatccctgg 2400
gtgtgtttcc atgtctcatg tactagtgaa agtagatgtg tgcatttgtg cacatatccc 2460
tatgtatccc tatcagggct gtgtgtattt gaaagtgtgt gtgtccgcat gatcatatct 2520
gtatagaaga gagtgtgatt atatttcttg aagaatacat ccatttgaaa tggatgtcta 2580
tggctgtttg agatgagttc tctactcttg tgcttgtaca gtagtctccc cttatccctt 2640
atgcttggtg gatacgttct tagaccccaa gtggatctct gagaccgcag atggtaccaa 2700
acctcatata tgcaatattt tttcctatac ataaatacct aagataaagt tcatcttctg 2760
aattaggcac agtaagagat taacaataac taacaataaa attgaatagt tataataata 2820
tattgtaata aaagttatgt gaatgtgatc tctttctttc tctctgtcgg ggcggccggc 2880
cgcttcgagc aga 2893
<210> 4
<211> 5010
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
ctagagtcgg ggcggccggc cgcttcgagc agacatgata agatacattg atgagtttgg 60
acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat 120
tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca 180
ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta 240
caaatgtggt aaaatcgata aggatccgtc gaccgatgcc cttgagagcc ttcaacccag 300
tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc cgcacttatg actgtcttct 360
ttatcatgca actcgtagga caggtgccgg cagcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 420
tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 480
cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 540
aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 600
gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 660
agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 720
cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 780
cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 840
ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 900
gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 960
tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga 1020
acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 1080
tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 1140
attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 1200
gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 1260
ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 1320
taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 1380
ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 1440
ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 1500
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atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 1800
gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 1860
tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 1920
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agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 2040
ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 2100
tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 2160
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agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc 2460
tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg 2520
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aacaaaatat taacgcttac aatttgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa 2820
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aatattaagg tacgggaggt acttggagcg gccgcaataa aatatcttta ttttcattac 2940
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atctgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc 3180
taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatcgctg actaattttt tttatttatg 3240
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tcaaagtgcg ctgctggtgc caaccctatt ctccttcttc gccaaaagca ctctgattga 4260
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<210> 5
<211> 7839
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
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gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 120
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ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 240
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aagaaaggcc cggcgccatt ctatccgctg gaagatggaa ccgctggaga gcaactgcat 360
aaggctatga agagatacgc cctggttcct ggaacaattg cttttacaga tgcacatatc 420
gaggtggaca tcacttacgc tgagtacttc gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg 480
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agggacaaga caattgcact gatcatgaac tcctctggat ctactggtct gcctaaaggt 900
gtcgctctgc ctcatagaac tgcctgcgtg agattctcgc atgccagaga tcctattttt 960
ggcaatcaaa tcattccgga tactgcgatt ttaagtgttg ttccattcca tcacggtttt 1020
ggaatgttta ctacactcgg atatttgata tgtggatttc gagtcgtctt aatgtataga 1080
tttgaagaag agctgtttct gaggagcctt caggattaca agattcaaag tgcgctgctg 1140
gtgccaaccc tattctcctt cttcgccaaa agcactctga ttgacaaata cgatttatct 1200
aatttacacg aaattgcttc tggtggcgct cccctctcta aggaagtcgg ggaagcggtt 1260
gccaagaggt tccatctgcc aggtatcagg caaggatatg ggctcactga gactacatca 1320
gctattctga ttacacccga gggggatgat aaaccgggcg cggtcggtaa agttgttcca 1380
ttttttgaag cgaaggttgt ggatctggat accgggaaaa cgctgggcgt taatcaaaga 1440
ggcgaactgt gtgtgagagg tcctatgatt atgtccggtt atgtaaacaa tccggaagcg 1500
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tcttatcatg gacaatttgg gctagaggca ggaaggaagt gggatgacct caggaggtca 2880
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cgtgtgaagg tattcaaggc agggagtata cattgctgtt tcctgttggg caatgctcct 3120
tgaccacatt ttgggaagag tggatgttat cattgagaaa acaatgtgtc tggaattaat 3180
ggggttctta taaagaaggt tcccagaaaa gaatgttcat ccagcctcct cagaaacaga 3240
acattcaaga aaaggacaat caggatgtca tcagggaaat gaaaataaaa accacaatga 3300
gatatcacct tataccaggt agaatggcta ctataaaaaa atgaagtgtc atcaaggata 3360
tagagaaatt ggaacccttc ttcactgctg gagggaatgg aaaatggtgt agccgttatg 3420
aaaaacagta cggaggtttc tcaaaaatta aaaatagaac tgctatatga tccagcaatc 3480
tcacttctgt atatataccc aaaataattg aaatcagaat ttcaagaaaa tatttacact 3540
cccatgttca ttgtggcact cttcacaatc actgtttcca aagttatgga aacaacccaa 3600
atttccattg aaaaataaat ggacaaagaa aatgtgcata tacgtacaat gggatattat 3660
tcagcctaaa aaaaggggga atcctgttat ttatgacaac atgaataaac ccggaggcca 3720
ttatgctatg taaaatgagc aagtaacaga aagacaaata ctgcctgatt tcatttatat 3780
gaggttctaa aatagtcaaa ctcatagaag cagagaatag aacagtggtt cctagggaaa 3840
aggaggaagg gagaaatgag gaaataggga gttgtctaat tggtataaaa ttatagtatg 3900
caagatgaat tagctctaaa gatcagctgt atagcagagt tcgtataatg aacaatactg 3960
tattatgcac ttaacatttt gttaagaggg tacctctcat gttaagtgtt cttaccatat 4020
acatatacac aaggaagctt ttggaggtga tggatatatt tattaccttg attgtggtga 4080
tggtttgaca ggtatgtgac tatgtctaaa ctcatcaaat tgtatacatt aaatatatgc 4140
agttttataa tatcaattat gtctgaatga agctataaaa aagaaaagac aacaaaattc 4200
agttgtcaaa actggaaata tgaccacagt cagaagtgtt tgttactgag tgtttcagag 4260
tgtgtttggt ttgagcaggt ctagggtgat tgaacatccc tgggtgtgtt tccatgtctc 4320
atgtactagt gaaagtagat gtgtgcattt gtgcacatat ccctatgtat ccctatcagg 4380
gctgtgtgta tttgaaagtg tgtgtgtccg catgatcata tctgtataga agagagtgtg 4440
attatatttc ttgaagaata catccatttg aaatggatgt ctatggctgt ttgagatgag 4500
ttctctactc ttgtgcttgt acagtagtct ccccttatcc cttatgcttg gtggatacgt 4560
tcttagaccc caagtggatc tctgagaccg cagatggtac caaacctcat atatgcaata 4620
ttttttccta tacataaata cctaagataa agttcatctt ctgaattagg cacagtaaga 4680
gattaacaat aactaacaat aaaattgaat agttataata atatattgta ataaaagtta 4740
tgtgaatgtg atctctttct ttctctctgt cggggcggcc ggccgcttcg agcagacatg 4800
ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 4860
atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 4920
gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt 4980
ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcg ataaggatcc gtcgaccgat 5040
gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt 5100
cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct 5160
cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 5220
cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 5280
acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 5340
ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 5400
ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 5460
gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 5520
gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 5580
ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 5640
actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 5700
gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 5760
ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 5820
ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 5880
gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 5940
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 6000
tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 6060
aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 6120
aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 6180
tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 6240
gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 6300
agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 6360
aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 6420
gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 6480
caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 6540
cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 6600
ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 6660
ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 6720
gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 6780
cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 6840
gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 6900
caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 6960
tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 7020
acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 7080
aagtgccacc tgacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc 7140
gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt 7200
cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag 7260
ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt 7320
cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt 7380
tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt 7440
cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt 7500
aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct tacaatttgc cattcgccat 7560
tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc 7620
ccaagctacc atgataagta agtaatatta aggtacggga ggtacttgga gcggccgcaa 7680
taaaatatct ttattttcat tacatctgtg tgttggtttt ttgtgtgaat cgatagtact 7740
aacatacgct ctccatcaaa acaaaacgaa acaaaacaaa ctagcaaaat aggctgtccc 7800
cagtgcaagt gcaggtgcca gaacatttct ctatcgata 7839

Claims (9)

1.一种人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体，其特征在于：双荧光素酶报告基因载体为pGLTlr4/PSV40/3UTR，载体的DNA序列如SEQ ID NO.5所示。
2.权利要求1所述人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体，其特征在于：双荧光素酶报告基因载体包含人源TLR4基因3'非翻译区序列，人源TLR4基因3'非翻译区序列如SEQ ID NO:3所示，人源TLR4基因3'非翻译区序列克隆至双荧光素酶报告载体pGL3-Promoter中luc基因下游。
3.人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)设计5'端包含接口上下游序列同源臂的引物对TPprimer3/TPprimer4，TPprimer3的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，TPprimer4的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)以人基因组DNA为模板，利用引物对TPprimer3/TPprimer3 PCR扩增出TLR4基因3'非翻译区序列，TLR4基因3'非翻译区序列如SEQ ID NO:3所示；
(3)使用限制性内切酶XbaI单酶切pGL3-Promoter质粒，通过琼脂糖凝胶回收酶切产物，利用Gibson组装方法将TLR4基因3'非翻译区序列、酶切产物进行同源组装；
(4)将组装产物转入感受态细胞中，挑取单克隆进行电泳验证、酶切验证和测序鉴定，得到载体pGLTlr4/PSV40/3UTR即人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体，载体的DNA序列如SEQ ID NO.5所示。
4.权利要求3所述人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体的构建方法，其特征在于：步骤(2)PCR反应条件为：在98℃预变性2min；再在98℃变性10s，然后在62℃退火30s，再在72℃延伸90s，进行30个循环；最后在72℃复延伸5min。
5.权利要求3或4所述人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体的构建方法，其特征在于：步骤(1)引物TPprimer3的5'端和酶切产物的3'端具有30bp的同源序列；TPprimer4的5'端和酶切产物的5'端具有28bp的同源序列；酶切产物的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
6.权利要求3所述人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体的构建方法，其特征在于：步骤(3)使用限制性内切酶XbaI单酶切pGL3-Basic质粒的酶切体系为10×MBuffer 10μl、pGL3-Promoter质粒(250ng/μl)20μl、0.1％BSA 10μl、XbaI 5μl、ddH2O 55μl。
7.权利要求6所述人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体的构建方法，其特征在于：酶切反应条件为37℃水浴反应2h，65℃失活20min。
8.权利要求1所述人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体在检测TLR4基因3'非翻译区上SNP位点对TLR4基因表达的影响中的应用。
9.权利要求1所述人源TLR4基因3'非翻译区的双荧光素酶报告基因载体在检测TLR4基因3'非翻译区上SNP位点与miRNA的靶向关系中的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111073884A (zh) * 2020-02-14 2020-04-28 昆明理工大学 提高非编码区域距离＜50bp的SNP中具有功能效应的SNP位点检测准确率的方法
CN111440823A (zh) * 2020-04-23 2020-07-24 湖北省农业科学院粮食作物研究所 一种重组载体及其构建方法和应用
CN113151355A (zh) * 2021-04-01 2021-07-23 吉林省农业科学院 鸡strn3基因3’utr的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107868780A (zh) * 2017-11-27 2018-04-03 云南大学 在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107868780A (zh) * 2017-11-27 2018-04-03 云南大学 在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAYO SATO等: "A Single Nucleotide Polymorphism in 3 -Untranslated Region Contributes to the Regulation of Toll-like Receptor 4 Translation", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
NCBI: "SNP (refSNP) Cluster Report: rs7873784", 《DBSNP》 *
乔艳: "遗传变异与结直肠癌和非霍奇金淋巴瘤易感性及直肠癌术后同步放化疗副反应的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
朱进 等: "应用Gibson Assembly法快速构建人组蛋白甲基化转移酶启动子荧光素酶报告载体", 《临床与病理杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111073884A (zh) * 2020-02-14 2020-04-28 昆明理工大学 提高非编码区域距离＜50bp的SNP中具有功能效应的SNP位点检测准确率的方法
CN111440823A (zh) * 2020-04-23 2020-07-24 湖北省农业科学院粮食作物研究所 一种重组载体及其构建方法和应用
CN111440823B (zh) * 2020-04-23 2020-12-01 湖北省农业科学院粮食作物研究所 一种重组载体及其构建方法和应用
CN113151355A (zh) * 2021-04-01 2021-07-23 吉林省农业科学院 鸡strn3基因3’utr的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用

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