CN107868780A - 在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法：a)设计带突变位点的引物A和与之紧邻的反向引物B；b)多聚核苷酸激酶分别磷酸化A和B的5'末端；c) 选用无5'‑3'外切核酸酶活性且扩增产物3'端不带有“A”碱基的DNA聚合酶进行PCR扩增，将所得目的片段通过琼脂糖凝胶进行回收；d) DNA连接酶环化回收产物并转入感受态细胞，筛选突变质粒。本发明的优点在于，通过对引物5'末端进行磷酸化，提高线型突变体自身环化的效率；通过选择特殊DNA聚合酶，保证了扩增片段上突变位点的稳定性。本方法可实现在大于10kb的环状DNA大分子上稳定、高效地定点突变，并且能同时适用于甲基化和非甲基化的DNA模板，在11kb左右的质粒上单点突变阳性率高达87%以上。

Description

在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体地说是一种在大于10kb的环状DNA大分子上高效稳定实现定点突变的方法。

背景技术

体外定点突变技术在分子生物学领域是十分重要的研究方法，该方法通过改变DNA序列上特定位点的碱基序列，结合相关分析，有助于阐明包括单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)位点在内的碱基突变对基因乃至蛋白质结构和功能的影响，有助于揭示启动子调节基因的靶向位点，也有助于阐明基因变异对疾病的影响及可能的影响机制。

目前已有报道的、用于在DNA序列中引入点突变的方法大致可分为酶切位点依赖型定点突变和PCR介导的定点突变两大类。酶切位点依赖型定点突变适用于突变位点附近含有合适的限制性内切酶识别位点的情况，该方法通过核酸内切酶将DNA序列切割成线性化的特异性片段，然后重新连接入新的载体序列，最终通过一系列的筛选程序得到正确的目的突变克隆。这种方法操作复杂，受突变位点周围序列影响较大，因此不能适用于所有突变实验。PCR介导的定点突变最早由Horton等人在1989年首次报道，它通过包含一个或多个错配碱基的突变引物直接引入突变，具有突变引入高效、不受待突变碱基周围序列影响、价格低廉、操作简单、快速等优点，而且经过发展改进，该技术得到了良好的派生，例如形成了重叠延伸PCR（overlap extension PCR，OE-PCR）、大引物PCR（megaprimer PCR）、不对称重叠延伸PCR（asymmetrical overlap extension PCR，AOE-PCR）等多种PCR介导的定点突变方法。

基于上述定点突变技术的积累，目前用于环状DNA分子定点突变的常用方法有：

1）以甲基化的环状DNA作为模板，设计互补的带突变位点引物对，使用非甲基化dNTP进行PCR扩增后将混合物全部转化进甲基化酶缺陷型大肠杆菌后，甲基化的模板DNA分子复制受到抑制，而有两个开口的非甲基化双链环状突变体DNA可以复制生成完整的双链环状突变体，最终筛选得到突变后的质粒；

2）以非甲基化的环状DNA作为模板，设计一条带突变位点的引物，在PCR反应体系中使用甲基化的胞嘧啶和腺嘌呤分别替代正常的胞嘧啶和腺嘌呤，然后用甲基化敏感性限制性内切酶消化PCR产物混合物，使得非甲基化的模板DNA被消化而包含甲基化的胞嘧啶和腺嘌呤的突变体DNA被保留，最后将消化产物转入大肠杆菌感受态细胞进行筛选鉴定；

3）以甲基化的环状DNA作为模板，设计一条带突变位点的引物，在PCR反应体系中使用非甲基化dNTP并按照一定比例同时加入高温DNA聚合酶和高温DNA连接酶进行扩增，然后利用只识别并切割甲基化DNA的限制性内切酶DpnI 消化掉混合物中的模板DNA，最后将环状单链DNA突变体得到保留的消化产物转入大肠杆菌感受态细胞进行复制，最终得到突变后的质粒。

上述三种方法各有优点，方法1）不需要花费额外步骤消化模板DNA，可以省力、省时，同时高效的完成定点突变；方法2）高效的适用于非甲基化的环状DNA模板；方法3）适用于甲基化的环状DNA模板；且方法2）和方法3）都不受所用感受态细胞是否为甲基化缺陷型的限制。

但是，它们也存在着共同的缺点，如：对于10kb以上的环状子大分子DNA突变效率低，不能通用于甲基化和非甲基化环状DNA模版。此外，方法1）需要额外购买甲基化酶缺陷型大肠杆菌；方法2）需要额外购买甲基化的胞嘧啶和腺嘌呤以及甲基化敏感性限制性内切酶；方法3）需要购买限制性内切酶DpnI；增加实验限制和花费，需要较高成本才能完成定点突变实验。

因此，发明一种能够稳定高效地适用于10kb以上的环状DNA大分子、且同时适用于甲基化和非甲基化DNA模板的定点突变方法必要且亟需。

发明内容

目前已有的环状DNA分子定点突变方法均只能在小于5kb大小的DNA片段上有效操作，针对大片段（特别是大于10kb）尚无稳定的人工定点突变方法。本发明提供了一种可在大于10kb的环状DNA大分子上稳定、快速、高效、节约地实现定点突变的方法，且该方法可同时适用于甲基化和非甲基化的环状DNA分子。

本发明的技术步骤为：

a) 设计带突变位点的突变引物A和与之紧紧相邻的反向引物B；

b) 用多聚核苷酸激酶按照引物磷酸化条件分别磷酸化引物A和B的5'末端；

c) 在大于10kb的环状DNA大分子模板上，使用特殊DNA聚合酶按照优化后的PCR条件进行扩增，并通过琼脂糖凝胶对目的片段进行精确回收；

d) 用DNA连接酶对回收产物进行自身环化反应后转入高效感受态细胞，筛选目的突变质粒。

步骤a)在设计引物时，要保证引物A和引物B的 5'端紧紧相邻，3'端方向相反，并且用突变后的碱基替代引物A所对应模板DNA的碱基。

步骤b)中所用的多核苷酸激酶为T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotidekinase)。

步骤b)中所述的引物磷酸化条件为：每磷酸化150 pmol引物需要1个活力单位T4多聚核苷酸激酶和10 nmol ATP，具体的反应体系为：100 µM引物7.5µl，T4polynucleotide kinase Reaction Buffer (10×) 1µl，10 mM ATP 1µl，10 units/µl T4polynucleotide kinase 0.5µl，37℃反应1h。

步骤b)中磷酸化反应后的引物不必回收和纯化，但必须65℃热失活20min，用于失活T4 polynucleotide kinase，然后加入65µl去离子水将引物浓度稀释至10 µM后直接用于PCR反应。

步骤c)中的所述的大于10kb的环状DNA大分子模板可以是甲基化或非甲基化DNA。

步骤c)中使用的特殊DNA聚合酶为：有3'-5'外切核酸酶活性，无5'-3'外切核酸酶活性，扩增产物的3'端不带有“A”碱基的DNA聚合酶。

步骤c)中PCR条件为：98℃预变性2min；98℃变性10s，以“引物平均Tm值加4℃”作为退火温度退火30s，以“模板长度kb值除以3”作为延伸时间（min）进行72℃延伸，反应30个循环后72℃再延伸7min。

步骤c)中精确回收的扩增产物需溶解于去离子水中。

步骤d)中的DNA连接酶为T4 DNA ligase。

步骤d)中每50 ng扩增产物的自身环化需加入50 ng扩增产物和5个活性单位的T4DNA ligase。

本发明的核心优点之一是稳定地适用于大分子环状DNA上的定点突变，本发明设计了对引物的5'末端寡核苷酸进行磷酸化，使得含突变位点的目的片段末端磷酸化效率大大提高，极大地提高了线状目的片段自身环化的成功率，从而能有效提高在大分子环状DNA上的点突变成功率，例如，我们对于8kb左右的质粒单点突变阳性率高达91%以上，对于11kb左右的质粒单点突变阳性率达87%以上；优点之二是通用于甲基化和非甲基化的DNA模板，本发明使用切胶回收的方式来分离环状模板DNA和PCR扩增的线状DNA突变体，可以使模板DNA不受是否甲基化的限制，同时也不受是否具备甲基化的胞嘧啶和腺嘌呤、是否具备甲基化敏感性限制性内切酶、是否具备限制性内切酶DpnI或甲基化酶缺陷型大肠杆菌等实验条件的限制；所有实验步骤操作简单、快速，至转化感受态细胞以前的所有实验只需一天时间就可以完成，且方法稳定。

附图说明

附图1是本发明的原理和操作简要示意图。

附图2是实施例1中对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶回收时的电泳图。

附图3是实施例1中挑取23个单菌落提质粒后的电泳图。

附图4是实施例1中突变引物和模板以及点突变后3个单菌落DNA测序结果的序列比对图。

附图5是实施例1中点突变后3个单菌落测序原始峰图。

附图6是实施例2中对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶回收时的电泳图。

附图7是实施例2中挑取23个单菌落提质粒后的电泳图。

附图8是实施例2中突变引物和模板以及点突变后3个单菌落DNA测序结果的序列比对图。

附图9是实施例2中点突变后3个单菌落测序原始峰图。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，下文将结合实施例对本发明的实施方案进行描述，这部分内容不代表本发明的权利要求限制。

下述实例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料、试剂、仪器等如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1

本实施例以大小为7.8kb的重组质粒pGL3-TLR4-3'UTR（序列1）的单点突变为例，将DNA序列1自5'末端第3183位G突变为C得到突变质粒pGL3-mtTLR4-3'UTR。

一、模板准备

pGL3-TLR4_3'UTR为将TLR4 基因的3'非编码区序列无缝连接至pGL3-promoter载体上荧光素酶报告基因Luciferase gene (luc+)的3'末端所构建的重组质粒，其大小为7839bp。构建的重组质pGL3-TLR4_3'UTR由华大基因进行测序验证后作为本实施例的模板。

二、引物设计与合成

引物设计原则：保证引物A和引物B的 5'端紧紧相邻，3'端方向相反；根据待突变位点附近的序列排布和GC含量，可选择将突变碱基引入正向引物或者反向引物；在所突变碱基前后保留至少3个碱基；避免引物的3'末端出现错配，3'末端碱基需要至少一个G或者C。

使用引物设计软件Primer Premier 5.0，根据引物设计原则设计本实施例所用引物对，名称和序列如下：

PrimerA：AAAACAATGTGTCTGGAATTAATG

PrimerB：CTCAATGATAACATCCACTGTTCC

引物PrimerB为反向引物，其中下划线标记的G为突变后的碱基。

引物送由华大基因合成，纯化方式为PAGEplus。

三、引物磷酸化

使用T4多核苷酸激酶分别磷酸化引物PrimerA和PrimerB 的5'末端。

T4多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase，T4 PNK) 购自NEW ENGLANDBioLsbs (M0201S)。

磷酸化反应体系为：

PrimerA/PrimerB (100 µM) 7.5 µl

T4 PNK Reaction Buffer (10×) 1 µl

ATP (10 mM) 1 µl

T4 PNK 0.5 µl

反应条件：37℃反应1小时。

将反应体系置于水浴锅中65℃热失活20min，用于失活T4 polynucleotidekinase。

反应完成后分别向PrimerA和PrimerB的磷酸化体系中加入65 µl去离子水，将引物浓度全部稀释至10 µM后直接用于PCR反应。

四、PCR扩增突变体DNA片段

DNA聚合酶选择原则：本实施例不能选择扩增产物3'端带有“A”碱基的DNA聚合酶；此外，为了避免PCR扩增过程中DNA聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性校正PrimerB中的突变碱基G，所以本实施例必须选用无5'-3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶。

本实施选择的DNA聚合酶为Cobuddy DNA Polymerase，购自康为世纪（CW2396S）。

PCR扩增反应体系为：

5×Cobuddy HF Buffer 10 µl

Template (pGL3-TLR4_3'UTR, 10 ng/µl) 1 µl

dNTP (10mM each, TAKARA, 4019) 1 µl

PrimerA (10 µM, preprocessed in the previous step ) 2.5 µl

PrimerB (10 µM, preprocessed in the previous step ) 2.5 µl

ddH2O 32.5 µl

Cobuddy DNA Polymerase 0.5 µl

PCR扩增条件：

98℃ 2 min

98℃ 10 s，61℃ 30 s，72℃ 3 min 36 s；30 cycles

72℃ 7 min。

五、凝胶回收突变体DNA片段

将PCR扩增产物上样至1%的TAE琼脂糖凝胶进行电泳，对如图2中所示的线状突变体DNA片段进行精确切胶回收。

琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司（DP209-02），完全按照该试剂盒操作。

使用Nanodrop 2000c测定回收后的片段浓度为58 ng/µl，OD260/OD280为1.86。

六、连接和转化

1、使用T4 DNA连接酶对回收片段进行自身环化反应

T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）购自BBI Life Sciences (B600511)。

连接反应体系：凝胶回收后的DNA片段（58 ng/µl），1 µl；Ligase buffer (10×)，5 µl；T4 DNA ligase，1 µl；ddH2O，43 µl。

反应条件：22摄氏度孵育2小时，65℃热失活10分钟。

2、转化JM109感受态细胞

1) 将提前制作并保存在-80℃冰箱的100 µl JM109氯化钙感受态细胞插到冰上，待其解冻。

2) 加入10 µl步骤1的连接产物，轻轻混匀。

3) 将加入连接产物的感受态细胞置于冰上，冰浴30分钟。

4) 置于42℃水浴锅热激1分钟，然后立即置于冰上静置2分钟。

5) 加入500 µl液体LB培养基，37℃摇动培养30分钟。

6) 取全部菌液涂布在含有氨苄青霉素钠（终浓度100µg/ml，生工，A100339-0005）的固体LB平板上，37℃倒置培养过夜。

七、鉴定筛选

挑取23个单菌落，提质粒后以pGL3-TLR4-3'UTR作为对照电泳分析（如图3）。

选取20个大小与pGL3-TLR4-3'UTR相同的单克隆质粒进行测序验证，经过比对后发现有1个克隆未发生突变，证明本实施例的突变率高达91%。

本次测序全部送由华大基因完成，所用测序引物见序列2-12。

实施例2

本实施例以大小为11.3kb的重组质粒-3493LUC-3'UTR（序列13）的单点突变为例，将DNA序列2自5'端起第7427位G突变为A得到突变质粒-3493LUC-mt3'UTR。

一、模板准备

-3493LUC-3'UTR为将TLR4 基因的-3493至+234启动子序列和3'非编码区序列连接至pGL3-basic载体上所构建的重组质粒，其大小为11323bp。

构建的重组质粒-3493LUC-3'UTR由华大基因进行测序验证后作为本实施例的模板。

二、引物设计与合成

按照上文中本发明的引物设计原则，使用引物设计软件Primer Premier 5.0设计本实施例所用引物对，名称和序列如下：

PrimerC：AGCAGAGTTCATATAATGAACAATA

PrimerD：ATACAGCTGATCTTTAGAGCTAATT

PrimerC中下划线标记的A为突变后的碱基。

引物送由华大基因合成，纯化方式为PAGEplus。

三、引物磷酸化

使用和实施例1相同的方法分别磷酸化引物PrimerC和PrimerD 的5'末端，反应完成后分别向PrimerC和PrimerD的磷酸化体系中加入65 µl去离子水，将引物浓度全部稀释至10µM，然后可直接用于PCR反应。

四、PCR扩增突变体DNA片段

使用Cobuddy DNA Polymerase（康为世纪，CW2396S），按照如下体系进行PCR扩增：

5×Cobuddy HF Buffer 10 µl

Template (-3493LUC-3'UTR, 10 ng/µl) 1 µl

dNTP (10mM each, TAKARA, 4019) 1 µl

PrimerC (10 µM, preprocessed in the previous step ) 2.5 µl

PrimerD (10 µM, preprocessed in the previous step ) 2.5 µl

ddH2O 32.5 µl

Cobuddy DNA Polymerase 0.5 µl

PCR扩增条件：

98℃ 2 min

98℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 4 min 48 s；30 cycles

72℃ 7 min。

五、凝胶回收突变体DNA片段

将PCR扩增产物上样至1%的TAE琼脂糖凝胶进行电泳，对如图6中所示的线状突变体DNA片段进行精确切胶回收。

琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司（DP209-02），完全按照该试剂盒操作。

使用Nanodrop 2000c测定回收后的片段浓度为113 ng/µl，OD260/OD280为1.85。

六、连接和转化

1、使用T4 DNA连接酶对回收片段进行自身环化反应

T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）购自BBI Life Sciences (B600511)。

环化反应体系：凝胶回收后的DNA片段（113 ng/µl），0.5 µl；Ligase buffer (10×)，5 µl；T4 DNA ligase，1 µl；ddH2O，43.5 µl。

反应条件：22摄氏度孵育2小时，65℃热失活10分钟。

2、使用和实施例完全相同的方法将反应产物转化JM109感受态细胞。

七、鉴定筛选

挑取23个单菌落，提质粒后以-3493LUC-3'UTR作为对照电泳分析（如图7）。

选取20个大小与-3493LUC-3'UTR相同的单克隆质粒进行测序验证，经过比对后发现全部正确，证明本实施例的突变率高达87%。

本次测序全部送由华大基因完成，所用测序引物见序列2-12和14-16。

序列表

<110> 云南大学

<120> 在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7839

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcccgg gctcgagatc tgcgatctgc atctcaatta 60

gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 120

cgcccattct ccgccccatc gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 180

ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 240

caaaaagctt ggcattccgg tactgttggt aaagccacca tggaagacgc caaaaacata 300

aagaaaggcc cggcgccatt ctatccgctg gaagatggaa ccgctggaga gcaactgcat 360

aaggctatga agagatacgc cctggttcct ggaacaattg cttttacaga tgcacatatc 420

gaggtggaca tcacttacgc tgagtacttc gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg 480

aaacgatatg ggctgaatac aaatcacaga atcgtcgtat gcagtgaaaa ctctcttcaa 540

ttctttatgc cggtgttggg cgcgttattt atcggagttg cagttgcgcc cgcgaacgac 600

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ttatgctatg taaaatgagc aagtaacaga aagacaaata ctgcctgatt tcatttatat 3780

gaggttctaa aatagtcaaa ctcatagaag cagagaatag aacagtggtt cctagggaaa 3840

aggaggaagg gagaaatgag gaaataggga gttgtctaat tggtataaaa ttatagtatg 3900

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gattaacaat aactaacaat aaaattgaat agttataata atatattgta ataaaagtta 4740

tgtgaatgtg atctctttct ttctctctgt cggggcggcc ggccgcttcg agcagacatg 4800

ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 4860

atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 4920

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<212> DNA

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tgatttataa gggattttgc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcccgg gctcgagata gatctgataa ccaaggggct 60

tacagtttct aatttgtatt tgacacatgg tctgccttct ggaagagcaa catagaacct 120

agatgtcttt gattaaggtc agtaaatgat tgagtgttaa tcccattcat ttcccaggaa 180

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caggaagact tctataaaac acatgtatta acatctccga aaacatagtt gaaaggactt 300

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acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 9960

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cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 10080

ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 10140

tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 10200

atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 10260

tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 10320

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aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 10440

ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 10500

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cagcccaagc taccatgata agtaagtaat attaaggtac gggaggtact tggagcggcc 11160

gcaataaaat atctttattt tcattacatc tgtgtgttgg ttttttgtgt gaatcgatag 11220

tactaacata cgctctccat caaaacaaaa cgaaacaaaa caaactagca aaataggctg 11280

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<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

caacatgaat aaacccggag g 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

ttatcggagt tgcagttgcg cc 22

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

gttccatttt ttgaagcgaa g 21

Claims (6)

1.在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法，其核心特征为：用T4多聚核苷酸激酶分别磷酸化带突变位点的成对引物，在大于10kb的环状DNA大分子模板上，使用特殊DNA聚合酶按照优化后的PCR条件进行扩增，环化线型扩增产物并转入感受态细胞后最终得到点突变质粒。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征1是：所述的磷酸化是使用T4多聚核苷酸激酶按照引物磷酸化条件分别磷酸化引物对的5'末端。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征2是：所述的环状DNA大分子为大于10kb的环状甲基化DNA或环状非甲基化DNA。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征3是：所述的特殊DNA聚合酶是有3'-5'外切核酸酶活性，无5'-3'外切核酸酶活性，扩增产物的3'端不带有“A”碱基的DNA聚合酶。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征4是：所述的优化后的PCR条件为——98℃预变性2 min；98℃变性10 s，以“引物平均Tm值加4℃”作为退火温度退火30 s，以“模板长度kb值除以3”作为延伸时间（min）进行72℃延伸，反应30个循环后72℃再延伸7 min。

6.按照权利要求1或2所述的方法，其特征是：所述的引物磷酸化条件为——按照每磷酸化150 pmol引物需要1个活力单位T4多聚核苷酸激酶和10 nmol ATP的定量关系，具体的反应体系为：100 µM引物 7.5 µl，T4 polynucleotide kinase Reaction Buffer (10×)1 µl，10 mM ATP 1 µl，10 units/µl T4 polynucleotide kinase 0.5 µl，37℃反应1 h；65℃热失活20 min；加入65 µl去离子水将引物浓度稀释至10 µM后直接用于PCR反应。