CN113817719A - 一种基因突变引物及其设计方法和设计突变质粒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基因突变引物及其设计方法和设计突变质粒的方法，涉及基因定点突变技术领域。本发明改变了基因突变引物的设计思路，尤其是改变了下游引物设计思路，下游引物不包含要突变的序列，位于要突变的序列的上游。本发明设计的下游引物可大大降低下游引物长度，提高扩增效率和转化效率。基于本发明所述基因突变引物可方便快捷地设计突变质粒。

Description

一种基因突变引物及其设计方法和设计突变质粒的方法
技术领域
本发明属于基因定点突变技术领域，具体涉及一种基因突变引物及其设计方法和设计突变质粒的方法。
背景技术
基因的定点突变是生物学实验中常用的一种载体、基因改造和优化的方法，是通过聚合酶链式反应(PCR)等方法对目的基因进行碱基单点多点突变、缺失、插入、替换等。体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间关系的有力工具。蛋白质的结构决定其功能，对某个已知基因的特定碱基进行定点突变、缺失、插入、替换，可以改变对应氨基酸的序列和蛋白的结构和功能，改变酶的活性或者动力学特征。
根据不同的目的设计相应的引物，引入要突变的碱基，经过PCR后将产物用DpnI或者其它甲基化模板消化酶消化处理，由于原模板质粒来源于大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，会被切碎(DpnI识别甲基化的GATC，从而将模板质粒消化掉)。而体外扩增的PCR产物由于没有甲基化而不被切开，在随后的转化中得以成功转化，得到突变质粒的克隆。
现有的基因定点突变、插入、替换上下游引物都包含有要替换或者插入的基因序列，并且下游的3’末端要超过上游的5’末端至少10个碱基，上游的3’末端要超过下游的5’末端，也就是上下游引物长度要超越互补区域，这样上下游引物延伸产物退火后配对成为带缺刻的环状质粒，经甲基化模板消化酶消化处理后，转化到菌内通过菌内DNA修复机制修复缺刻，形成完整的质粒。这样造成上下游引物都比较长，存在扩增失败的风险，尤其是要插入或者替换的片段较长，引物合成耗时长、费用高，扩增成功率也低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基因突变引物及其设计方法和设计突变质粒的方法，利用更短的下游引物实现简单、高效的基因突变的设计。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基因突变引物的设计方法，包括以下步骤：下游引物依据突变的序列上游设计。
优选的，所述基因突变包括点突变、缺失、插入或替换。
优选的，所述下游引物的3’末端不超过上游引物的5’末端，整个下游引物包含在互补区之内。
优选的，所述下游引物的3’末端超过上游的5’末端，但不包含基因突变的序列。
本发明还提供了利用上述设计方法设计得到的基因突变引物。
本发明还提供了上述基因突变引物在设计突变质粒中的应用。
本发明还提供了一种获得突变质粒的方法，包括以下步骤：根据上述设计方法，基于目标序列设计基因突变引物；
以包含目标序列的质粒为模板，利用基因突变引物进行PCR扩增；
将扩增产物转化至感受态细胞，培养后挑取单克隆，得突变基因，利用突变基因转化宿主，得突变质粒；所述感受态细胞能够体内降解甲基化质粒模板。
优选的，所述PCR扩增的程序包括：95℃预变性5min；95℃变性20s，(Tm-5)℃退火20s，72℃延伸时间为质粒大小/DNA聚合酶合成速度，变性到延伸25～35个循环；72℃再延伸5～10min。
优选的，得扩增产物后，还包括去除原模板质粒。
本发明还提供了利用上述基因突变引物或上述方法获得的突变质粒。
有益效果：
本发明改变了基因突变引物的设计思路，尤其是改变了下游引物设计思路，下游引物不包含要突变的序列，位于要突变的序列的上游，具体包括两种设计方法：第一种下游引物设计方法为下游3’末端不超过上游的5’末端，整个下游引物(R1)包含在互补区之内，大大降低了下游引物的长度，降低引物合成成本，提高扩增效率，后续的转化效率也大大提高；第二种下游引物设计方法为下游引物(R2)的3’末端超过上游的5’末端，与常规引物设计方法的区别是该设计不包含要突变、缺失、插入、替换的序列。
本发明设计的下游引物R1包含在同源臂之内，上游引物不变，扩增出来的PCR产物是两边含有同源序列的线状双链DNA，转化到菌内通过同源重组形成完整的环状质粒。实验结果表明，该方法大大降低下游引物长度，提高扩增效率和转化效率。本发明设计的下游引物R2与常规引物突变原理一致，都是形成带缺刻的环状质粒，不同的是该方法设计的引物短，不受要插入、替换的序列长度的影响。
附图说明
图1为本发明基因突变引物的设计方法，其中F表示上游引物，包括互补区，要突变、替换、插入区，以及延伸区；R1表示本发明第一种引物设计方法设计的下游引物，包含在互补区域内；R2表示本发明第二种引物设计方法设计的下游引物，跨越互补区，不包含要突变、替换或插入的序列；R3表示常规引物设计方法设计的下游引物，跨越互补区，包含要突变、替换或插入的序列；
图2为Mmp9-Q279R-R1和Mmp9-Q279R-R2的PCR结果；
图3为Mmp9-Q279R-R1和Mmp9-Q279R-R2的转化结果比较，其中左侧图表示Mmp9-Q279R-R1，右侧图表示Mmp9-Q279R-R2；
图4为Mmp9点突变的测序比对结果；
图5为Mog10pruoflagq1-R1和Mog10pruoflagq1-R2的PCR结果；
图6为Mog10pruoflagq1-R1和Mog10pruoflagq1-R2的转化结果比较，其中左侧图表示Mog10pruoflagq1-R1，右侧图表示Mog10pruoflagq1-R2；
图7为Mog缺失突变测序比对结果；
图8为Mmp9-10his-R1和Mmp9-10his-R2的PCR结果；
图9为Mmp9-10his-R1和Mmp9-10his-R2的转化结果比较，其中左侧图表示Mmp9-10his-R1，右侧图表示Mmp9-10his-R2；
图10为Mmp9插入突变的测序比对结果；
图11为Dok7-1-R1、Dok7-1-R2和Dok7-1-R3的PCR结果；
图12为Dok7-1-R1、Dok7-1-R2和Dok7-1-R3的转化结果比较，其中左侧图表示Dok7-1-R1，中间图表示Dok7-1-R2，右侧图表示Dok7-1-R3；
图13为Dok7替换突变的测序比对结果。
具体实施方式
本发明提供了一种基因突变引物的设计方法，包括以下步骤：下游引物依据突变的序列上游设计。
本发明所述基因突变优选包括点突变、缺失、插入或替换。在本发明中，所述设计方法包括两种情况，具体设计思路如图1所示，第一种设计方法优选包括：所述下游引物的3’末端不超过上游引物的5’末端，整个下游引物包含在互补区之内，大大降低了下游引物的长度，降低引物合成成本，经实施例证实，利用第一种设计方法设计的基因突变引物扩增出来的PCR产物是两边含有同源序列的线状双链DNA，转化到菌内通过同源重组形成完整的环状质粒，该方法大大降低下游引物长度，提高扩增效率和转化效率。
第二种设计方法优选包括：所述下游引物的3’末端超过上游的5’末端，但不包含基因突变的序列。本发明利用第二种设计方法设计得到的下游引物与常规引物扩增的产物均为带缺刻的开环质粒，与常规方法不同的是该方法设计的引物短，不受要插入、替换的序列长度的影响，转化到菌内通过菌内DNA修复机制修复缺刻，形成完整的质粒。
本发明还提供了利用上述设计方法设计得到的基因突变引物。
利用本发明所述基因突变引物可用于设计突变质粒，优选包括点突变、缺失、插入或替换。
本发明还提供了上述基因突变引物在设计突变质粒中的应用。
本发明还提供了一种获得突变质粒的方法，包括以下步骤：根据上述设计方法，基于目标序列设计基因突变引物；
以包含目标序列的质粒为模板，利用基因突变引物进行PCR扩增；
将扩增产物转化至感受态细胞，培养后挑取单克隆，得突变基因，利用突变基因转化宿主，得突变质粒；所述感受态细胞能够体内降解甲基化质粒模板。
本发明所述PCR扩增的程序优选包括：95℃预变性5min；95℃变性20s，(Tm-5)℃退火20s，72℃延伸时间为质粒大小/DNA聚合酶合成速度，变性到延伸25～35个循环；72℃再延伸5～10min。
本发明在得扩增产物后，优选还包括去除原模板质粒，更优选用甲基化模板消化酶处理以去除原模板质粒，从而减少原模板质粒的转化影响。
本发明还提供了利用上述基因突变引物或上述方法获得的突变质粒。
下面结合实施例对本发明提供的一种基因突变引物及其设计方法和设计突变质粒的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1点突变
将MMP9基因序列(NM_004994.3)中279位谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R)，即将836位a突变为g。
引物设计
上游引物Mmp9-Q279R-F(SEQ ID NO.1)：5’tgccccagcgagagactctacacccGggacggcaatgctgatggga3’；
下游引物Mmp9-Q279R-R1(SEQ ID NO.2)：3’cagcgagagactctacaccc5’；
反向互补(SEQ ID NO.3)：5’gggtgtagagtctctcgctg3’；
Mmp9-Q279R-R2(SEQ ID NO.4)：3’accggtttggcttctgccccagcgagagactctacaccc5’；
反向互补(SEQ ID NO.5)：5’gggtgtagagtctctcgctggggcagaagccaaaccggt3’。
以含有目的基因MMP9(2124bp)的质粒(将MMP9连接入5428bp的pcDNA3.1(+)载体的NheI和NotI酶切位点之间)为模板，上游引物Mmp9-Q279R-F，下游引物Mmp9-Q279R-R1/R2，PCR扩增出全长质粒；
PCR扩增体系(50μl)：模板50ng、Mmp9-Q279R-F(0.2μM)1μl、Mmp9-Q279R-R1/R2(0.2μM)1μl、FastPfu DNA Polymerase(2.5units)1μl、5×FastPfu buffer 10μl、2.5mMdNTP4μl和余量的Nuclease-freeWater。
PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸3min30s，变性到延伸35个循环；72℃再延伸5min；4℃保存。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可成功扩增出条带，如图2所示；
将PCR产物用甲基化模板消化酶DMT 37℃处理1h，去除原模板质粒；
将处理后的PCR产物转化至可以体内降解甲基化质粒模板的感受态细胞(DMTChemically Competent Cell)，37℃培养箱过夜培养；
挑取单克隆至氨苄抗性的LB培养基，37℃摇床过夜培养；
利用是本发明第一种引物设计方法设计的下游引物Mmp9-Q279R-R1和第二种引物设计方法设计的下游引物Mmp9-Q279R-R2，引物扩增效率和转化效率相当(图3)，分别挑取5个单克隆，提取质粒，送苏州金唯智生物科技有限公司测序，测序结果均为阳性，如图4所示。
实施例2缺失
将MOG基因(NM_001363610.2)序列中375bp片段缺失掉，序列CCTCCAAGTGTCTTCCAGCTATGCA和gtgctggttctcctcgcggt之间有375bp的片段，将该片段缺失掉。
引物设计
Mog10pruoflagq1-F(SEQ ID NO.6)：5’CCTCCAAGTGTCTTCCAGCTATGCAgtgctggttctcctcgcggt3’；
Mog10pruoflagq1-R1(SEQ ID NO.7)：3’AAGTGTCTTCCAGCTATGCA5’；
反向互补(SEQ ID NO.8)：5’TGCATAGCTGGAAGACACTT3’；
Mog10pruoflagq1-R2(SEQ ID NO.9)：5’gctccttcctcctcctcctcctCCTCCAAGTGTCTTCCAGCTATGCA3’；
反向互补(SEQ ID NO.10)：5’TGCATAGCTGGAAGACACTTGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAAGGAGC3’。
以含有目的基因MOG(888bp)的质粒(以同源重组的方式将MOG基因连接到pcDNA3.1(+)载体的NheI和NotI之间)为模板，上游引物Mog10pruoflagq1-F，下游引物Mog10pruoflagq1-R1/R2，PCR扩增出全长质粒。
PCR扩增体系(50μl)：模板50ng、Mog10pruoflagq1-F(0.2μM)1μl、Mog10pruoflagq1-R1/R2(0.2μM)1μl、FastPfu DNA Polymerase(2.5units)1μl、5×FastPfu buffer 10μl、2.5mM dNTP 4μl和余量的Nuclease-free Water。
PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸3min，变性到延伸35个循环；72℃再延伸5min；4℃保存。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，成功扩增出条带，如图所示5；
将PCR产物用甲基化模板消化酶DMT 37℃处理1h，去除原模板质粒；
将处理后的PCR产物转化至可以体内降解甲基化质粒模板的感受态细胞(DMTChemically Competent Cell)，37℃培养箱过夜培养；
挑取单克隆至氨苄抗性的LB培养基，37℃摇床过夜培养；
Mog10pruoflagq1-R1是本发明第一种引物设计方法设计的下游引物，扩增效率和转化效率明显高于第二种设计方法设计的下游引物Mog10pruoflagq1-R2；并且Mog10pruoflagq1-R1序列更短，在这组实验中，第一种引物设计方法优于第二种引物设计方法。如图6所示，左侧图的菌斑数多于右侧图的菌斑数，分别挑取5个单克隆，提取质粒，送苏州金唯智生物科技有限公司测序，测序结果均为阳性，如图7所示。
实施例3插入
在基因Mmp9(同实施例1)终止密码子之前插入30bp的10×his(SEQ ID NO11：CATCATCATCATCATCACCATCATCATCAT)，即在序列tgacatcctgcagtgccctgaggac和序列taggcggccgctcgagtcta之间插入10×his序列。
引物设计
Mmp9-10his-F：(SEQ ID NO.12)：5’tgacatcctgcagtgccctgaggacCATCATCATCATCATCACCATCATCATCATtaggcggccgctcgagtcta3’；
Mmp9-10his-R1(SEQ ID NO.13)：3’tcctgcagtgccctgaggac5’；
反向互补(SEQ ID NO.14)：5’gtcctcagggcactgcagga3’；
Mmp9-10his-R2(SEQ ID NO.15)：3’acgtgacctatgacatcctgcagtgccctgaggac5’
以含有目的基因Mmp9的质粒(同实施例1)为模板，上游引物Mmp9-10his-F，下游引物Mmp9-10his-R1/R2，PCR扩增出全长质粒；
PCR扩增体系(50μl)：模板50ng，Mmp9-10his-F(0.2μM)1μl，Mmp9-10his-R1/R2(0.2μM)1μl，FastPfu DNA Polymerase(2.5units)1μl，5×FastPfu buffer 10μl，2.5mMdNTP 4μl和余量的Nuclease-free Water。
PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸3.5min，变性到延伸35个循环；72℃再延伸5min；4℃保存。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，成功扩增出条带，如图8所示；
将PCR产物用甲基化模板消化酶DMT 37℃处理1h，去除原模板质粒；
将处理后的PCR产物转化至可以体内降解甲基化质粒模板的感受态细胞(DMTChemically Competent Cell)，37℃培养箱过夜培养；
挑取单克隆至氨苄抗性的LB培养基，37℃摇床过夜培养；
Mmp9-10his-R1是本发明第一种引物设计方法设计的下游引物，Mmp9-10his-R2是本发明第二种引物设计方法设计的下游引物，3’末端跨越互补区，Mmp9-10his-R1扩增效率和转化效率明显高于Mmp9-10his-R2(图9)；并且Mmp9-10his-R1序列更短，在这组实验中，第一种引物设计方法(图9左侧图)优于第二种引物设计(图9右侧图)方法。分别挑取5个单克隆，提取质粒，送苏州金唯智生物科技有限公司测序，测序结果均为阳性，如图10所示。
实施例4替换
DOK7基因(NM_001301071.2)构建在pcDNA3.1上，记为DOK7-pcDNA3.1，将序列tgtccagtctgtggaggactcaagg与载体序列gcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctc之间的329bp序列替换成序列SEQ ID NO.16：TAAACCCCCCTCCTTGA。
引物设计
Dok7-1-F1(SEQ ID NO.17)：5’tgtccagtctgtggaggactcaaggTAAACCCCCCTCCTTGAgcggccgctcgagtctagag3’；
Dok7-1-R1(SEQ ID NO.18)：3’agtctgtggaggactcaagg5’；
反向互补(SEQ ID NO.19)：5’ccttgagtcctccacagact3’；
Dok7-1-R2(SEQ ID NO.20)：3’CCGGCTTTCTTTTCGGCAtgtccagtctgtggaggactcaagg5’；
反向互补(SEQ ID NO.21)：5’ccttgagtcctccacagactggacatgccgaaaagaaagccgg3’；
Dok7-1-R3(SEQ ID NO.22)：3’CCGGCTTTCTTTTCGGCAtgtccagtctgtggaggactcaaggTAAACCCCCCTCCTTGA5’；
反向互补(SEQ ID NO.23)：5’tcaaggaggggggtttaccttgagtcctccacagactggacatgccgaaaagaaagccgg3’。
以DOK7-pcDNA3.1质粒(DOK7基因1515bp，载体pcDNA3.1(+)，大小为5428bp，DOK7所用酶切位点为NheI、NotI，将DOK7-1基因以同源重组的方式连接到pcDNA3.1(+)载体上)为模板，上游引物Dok7-1-F1，下游引物Dok7-1-R1/Dok7-1-R2/Dok7-1-R3，PCR扩增出全长质粒；
PCR扩增体系(50μl)：DOK7-pcDNA3.1模板50ng，Dok7-1-F1(0.2μM)1μl，Dok7-1-R1/R2/R3(0.2μM)1μl，FastPfu DNA Polymerase(2.5units)1μl，5×FastPfu buffer 10μl，2.5mM dNTP 4μl和余量的Nuclease-free Water。
PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸3min，变性到延伸35个循环；72℃再延伸5min；4℃保存。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，成功扩增出条带，如图11所示；
将PCR产物用甲基化模板消化酶DMT 37℃处理1h，去除原模板质粒；
将处理后的PCR产物转化至可以体内降解甲基化质粒模板的感受态细胞(DMTChemically Competent Cell)，37℃培养箱过夜培养；
挑取单克隆至氨苄抗性的LB培养基，37℃摇床过夜培养；
8、提取质粒，测序，比对结果。
9、实验结果：Dok7-1-R3是常规替换引物设计方法设计的下游引物，包含要替换的序列，结果未能扩增出目的条带；Dok7-1-R1是本发明第一种引物设计方法设计的下游引物，Dok7-1-R2是本发明第二种引物设计方法设计的下游引物，不包含要替换的序列；Dok7-1-R2扩增效率与Dok7-1-R1相当，转化效率却明显低于Dok7-1-R1；Dok7-1-R1序列最短，转化效率最高(图12)。分别挑取5个单克隆，提取质粒，送苏州金唯智生物科技有限公司测序，测序结果均为阳性，如图13所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 陕西脉元生物科技有限公司
<120> 一种基因突变引物及其设计方法和设计突变质粒的方法
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgccccagcg agagactcta cacccgggac ggcaatgctg atggga 46
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagcgagaga ctctacaccc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggtgtagag tctctcgctg 20
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accggtttgg cttctgcccc agcgagagac tctacaccc 39
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggtgtagag tctctcgctg gggcagaagc caaaccggt 39
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctccaagtg tcttccagct atgcagtgct ggttctcctc gcggt 45
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aagtgtcttc cagctatgca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgcatagctg gaagacactt 20
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctccttcct cctcctcctc ctcctccaag tgtcttccag ctatgca 47
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgcatagctg gaagacactt ggaggaggag gaggaggagg aaggagc 47
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
catcatcatc atcatcacca tcatcatcat 30
<210> 12
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgacatcctg cagtgccctg aggaccatca tcatcatcat caccatcatc atcattaggc 60
ggccgctcga gtcta 75
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcctgcagtg ccctgaggac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtcctcaggg cactgcagga 20
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acgtgaccta tgacatcctg cagtgccctg aggac 35
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
taaacccccc tccttga 17
<210> 17
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgtccagtct gtggaggact caaggtaaac ccccctcctt gagcggccgc tcgagtctag 60
ag 62
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agtctgtgga ggactcaagg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccttgagtcc tccacagact 20
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccggctttct tttcggcatg tccagtctgt ggaggactca agg 43
<210> 21
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ccttgagtcc tccacagact ggacatgccg aaaagaaagc cgg 43
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ccggctttct tttcggcatg tccagtctgt ggaggactca aggtaaaccc ccctccttga 60
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tcaaggaggg gggtttacct tgagtcctcc acagactgga catgccgaaa agaaagccgg 60

Claims (10)

1.一种基因突变引物的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：下游引物依据突变的序列上游设计。
2.根据权利要求1所述设计方法，其特征在于，所述基因突变包括点突变、缺失、插入或替换。
3.根据权利要求1所述设计方法，其特征在于，所述下游引物的3’末端不超过上游引物的5’末端，整个下游引物包含在互补区之内。
4.根据权利要求1所述设计方法，其特征在于，所述下游引物的3’末端超过上游的5’末端，但不包含基因突变的序列。
5.利用权利要求1～4任一项所述设计方法设计得到的基因突变引物。
6.权利要求5所述基因突变引物在设计突变质粒中的应用。
7.一种获得突变质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：根据权利要求1～4任一项所述设计方法，基于目标序列设计基因突变引物；
以包含目标序列的质粒为模板，利用基因突变引物进行PCR扩增；
将扩增产物转化至感受态细胞，培养后挑取单克隆，得突变基因，利用突变基因转化宿主，得突变质粒；所述感受态细胞能够体内降解甲基化质粒模板。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序包括：95℃预变性5min；95℃变性20s，(Tm-5)℃退火20s，72℃延伸时间为质粒大小/DNA聚合酶合成速度，变性到延伸25～35个循环；72℃再延伸5～10min。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，得扩增产物后，还包括去除原模板质粒。
10.利用权利要求5所述基因突变引物或权利要求7～9任一项所述方法获得的突变质粒。
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周楠: "基于中心重合引物的PCR诱变技术新进展", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 基础科学辑》 *

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