CN112852855A - 一种简便的基因缺失突变体的载体构建方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种简便的基因缺失突变体的载体构建方法和试剂盒，包括如下步骤：(1)根据目的载体上要缺失的目的基因，设计PCR扩增引物对，上游引物包括：引物5’端部分为目的载体上要缺失的目的基因之前的20～35bp同源臂序列，引物3’端部分为要缺失的目的基因之后的20～35bp同源臂序列；下游引物为上游引物的反向互补序列；(2)目的载体作为模板，进行常规PCR反应；(3)去除PCR反应产物中多余的模板质粒；(4)转化大肠杆菌，得到单克隆菌落，摇菌提取质粒，鉴定得到缺失了目的基因的正确重组质粒。本发明的试剂盒包括前述的PCR扩增引物对。本发明只需要一步PCR即可实现对目的基因的全部删除或者部分删除。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种新的基因缺失方法，特别是涉及一种简便的基因缺失突变体的载体构建方法及试剂盒。
背景技术
载体构建是目前分子生物学的常用技术，在基因工程中，人们常用质粒作为载体，将目的基因插入到质粒中，这样质粒就可以将基因分子运送到受体细胞中去。因此质粒可以用来保存基因或者表达基因产物用于功能性研究。因此载体构建是科学研究和基因工程产业中用到最广泛的一种技术。
目前载体构建的主流方法有2种，一是酶切连接，利用载体上自带的多克隆酶切位点，选择合适的酶切位点组合，将基因定向插入到载体中；二是同源重组，利用T3/T5外切酶的活性，对末端带有目标载体同源臂序列的外源PCR产物和线性化的载体DNA双链进行3’/5’端外切，形成了相同的粘性末端，通过连接反应，将外源DNA插入到质粒中去。酶切连接是传统的方法，目前DNA的限制性内切酶发展得非常成熟，酶切位点种类多，内切酶活性和特异性高。酶切连接法具有标准化的操作流程，因此成为载体构建的主流选择。而同源重组法，是近些年来开发的新技术，它利用了核酸外切酶来制造粘性末端的特点，基因和载体产生匹配的粘性末端，并连接成环形质粒，因此它的本质还是粘性末端的连接反应，但是由于它能够产生更长的粘性末端一般具有更好的连接效率，得到的克隆数会大大提高，另外它能够避免基因内部存在限制性酶切位点而不能选择使用的情况，所以它降低了载体构建对酶切位点的挑剔，因而也受到了越来越多的人关注。例如适用于多片段连接的gibsonassembly也是同源重组的范畴。
尽管酶切连接和同源重组这两种技术已经使用非常普遍了，但是它们还是存在自身的缺点。酶切连接存在酶切位点选择的局限性，比如有些基因内部含有较多的限制性酶切位点，限制了双酶切的酶切位点组合的选择；另外不同基因构建经常选择不同的酶切位点组合，这样不利于多个基因载体构建的同时进行。同源重组基本不存在酶切位点的限制，并且也能够批量生产，但是它的问题是需要使用线性化的载体片段进行构建，不管是通过酶切还是PCR获得，增加了额外操作的步骤。因此我们发明的重叠延伸PCR载体构建法，它可以实现无缝连接，不存在酶切位点的制约，同时以环形质粒作为模板，通过PCR的方法直接将基因片段整合到载体的任何部位删除原有载体的任何一段序列，操作方便、高效，具有重要的应用价值。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的第一方面，提供一种简便的基因缺失突变体的载体构建法，包括如下步骤：
(1)根据目的载体上要缺失的目的基因，设计PCR扩增引物对，引物设计时带上目的载体上要缺失目的基因之前(即目的基因5’端之前)和之后(即目的基因3’端之后)的同源臂序列，上游引物包括两部分：引物5’端部分为目的载体上要缺失的目的基因之前的20～35bp同源臂序列，引物3’端部分为要缺失的目的基因之后的20～35bp同源臂序列；下游引物为上游引物的反向互补序列；优选所述同源臂序列为23～27bp；
(2)用目的载体作为模板，用设计的PCR扩增引物对进行常规PCR反应；
(3)消化PCR产物，去除PCR反应产物中多余的模板质粒；
(4)取消化之后的PCR产物转化大肠杆菌，得到单克隆菌落，摇菌提取质粒，鉴定得到缺失了目的基因的正确重组质粒。
所述PCR的反应体系包括：DNA聚合酶、PCR扩增引物对、目的载体、ddH2O。
所述DNA聚合酶为KOD DNA Polymerase，所述PCR的反应体系还包括MgSO4、KODDNA Polymerase缓冲液、dNTPs。
PCR的反应程序为：94℃预变性2min；98℃变性10sec，55℃退火20sec，68℃延伸、持续时间按照1min/kb设定，12～15个循环；最后68℃延伸。
优选地，所述目的载体为pEGFP-N1-LGI1，所述要缺失的目的基因为LGI1的315-559aa，PCR扩增引物对为LGI1-del-F/LGI1-del-R，引物序列分别如SEQ ID NO:1和2所示；
或者，所述目的载体为pEGFP-N1-ADAM23，所述要缺失的目的基因为GFP，PCR扩增引物对为ADAM23-dGFP-F/ADAM23-dGFP-R，引物序列分别如SEQ ID NO:5和6所示。
优选地，PCR的反应程序中循环数为12个。
优选地，所述步骤(3)采用Dpn1消化PCR产物；优选所述目的载体小于10kbp。
本发明的第二方面提供一种简便的基因缺失突变体的载体构建试剂盒，包括PCR扩增特异引物对，所述引物对的上游引物结构为：
5’-目的载体上要缺失的目的基因之前的20～35bp同源臂序列+目的基因之后的20～35bp同源臂序列-3’，
下游引物序列为和上游引物完全反向互补的序列。
所述试剂盒还包括DNA聚合酶、目的载体模板。
所述试剂盒还包括MgSO4、Dpn1、大肠杆菌感受态细胞、dNTPs；优选所述DNA聚合酶为KOD DNA Polymerase，所述试剂盒还包括KOD DNA Polymerase的缓冲液。
本发明的有益效果是：只需要一步PCR即可实现对目的基因的全部删除或者部分删除(图1是本发明方法的原理图)，操作简单、标准化，成功率高，突破了传统载体构建技术的局限性，例如用传统方法，对于删除基因内部的部分序列的亚克隆，只能采取分段PCR，再使用搭桥法拼接两个基因片段，操作繁琐，且容易失败。另外该方法能够实现快速批量生产，非常有利于推广使用。
附图说明
图1是本发明方法的原理图。
图2是实施例1的PCR产物电泳结果图。
图3是实施例1中PCR产物转化大肠杆菌后在LB固体培养平板上培养得到的单克隆菌落。
图4是实施例1中重组质粒的电泳检测结果图，其中，M：代表marker，1代表模板质粒，2-4代表重组质粒。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、简便的基因缺失突变体的载体构建法(一轮PCR)
一、主要试剂、仪器及来源：
PCR酶：KOD DNA Polymerase(品牌Toyobo，产品编号KOD-201)；
胶回收试剂盒：Omega Gel Extraction Kit；
质粒：pEGFP-N1-LGI1：由通用生物系统(安徽)有限公司合成并亚克隆，将LGI1基因插入pEGFP-N1(购自Clontech公司，货号6085-1)中，LGI1插入在Nhe1和Xho1之间；
质粒提取试剂盒：Omega plasmid mini kit；
纯水仪：Millipore
5UV Water Purification System；
移液器：eppendorf；
PCR仪：Bio-Rad T100。
二、实验方法
已有研究表明LGI1蛋白的C端氨基酸序列会增加LGI1蛋白的分泌，导致LGI1在细胞内表达降低，为了提高LGI1在细胞内的表达，我们通过新载体构建的方法得到去除了LGI1 C端序列(315-557aa)、只含有LGI1基因N端的表达质粒。
1、引物设计：
正向引物LGI1-del-F(SEQ ID NO:1)的左同源臂和保留的LGI1序列匹配，右同源臂和保留的GFP序列一致。反向引物LGI1-del-R(SEQ ID NO:2)为正向引物的反向互补序列。
引物由金唯智公司合成。
2、按浓度将引物LGI1-del-F、LGI1-del-R稀释到终浓度10μM。
3、一步法PCR反应
1)混合PCR体系如下所示：
| 试剂 | 体积(μl) |
| KOD buffer | 5 |
| 2mM dNTPs | 5 |
| 25mM MgSO<sub>4</sub> | 2 |
| 10μM LGI1-del-F | 1.5 |
| 10μM LGI1-del-R | 1.5 |
| 10-50ng/μl模板DNA(pEGFP-N1-LGI1) | 1 |
| KOD DNA Polymerase | 1 |
| ddH<sub>2</sub>O | 33 |
| 总体积 | 50 |
2)PCR反应程序如下所示：
4、PCR结束之后，取5μl的PCR产物进行电泳检测，结果如图2所示，图中，左边的泳道为marker，右边的泳道为PCR产物，右边泳道中靠近点样孔的条带是基因片段去除之后的产物，远离点样孔的条带是剩余的引物形成的二聚体。
5、Dpn1消化：PCR反应结束后在反应管中加入1μl Dpn1酶，37℃反应1-2h，彻底清除PCR反应体系中的模板质粒。
6、转化：取8μl Dpn1消化之后的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，复苏之后涂到Kan抗性的LB固体培养平板上培养得到单克隆菌落(如图3所示)。
7、挑取单菌落，加入含有Kan抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜培养。
8、提取质粒，进行电泳检测，如图4所示，图中，M：代表marker，1代表模板质粒，2-4代表重组质粒，重组质粒比模板质粒迁移更快。将重组质粒送测序公司测序，比对测序结果筛选正确的重组子，测序结果显示，重组质粒中去除了LGI1 C端序列315-557aa的LGI1序列如SEQ ID NO:3所示，相比LGI1原序列(如SEQ ID NO:4所示)缺少了LGI1 C端序列，LGI1的C端对应的序列的946-1671bp被成功删除。
实施例2、GFP基因的删除
一、主要试剂、仪器及来源：
PCR酶：KOD DNA Polymerase(Toyobo，KOD-201)；
胶回收试剂盒：Omega Gel Extraction Kit；
质粒：pEGFP-N1-ADAM23，购自通用生物系统(安徽)有限公司，G0157776-3(ADAM23基因插入在pEGFP-N1质粒的Nhe1和Xho1之间)；
质粒提取试剂盒：Omega plasmid mini kit；
纯水仪：Millipore
5UV Water Purification System；
移液器：eppendorf；
PCR仪：Bio-Rad T100。
二、实验方法
现有的pEGFP-N1-ADAM23质粒带有GFP tag，为了去除GFP tag，我们对原质粒进行去除修改。
1、引物设计：
ADAM23-dGFP-F(SEQ ID NO:5)左同源臂为ADAM23的C末端的24bp碱基，右同源臂为pEGFP-N1-ADAM23上GFP tag之后的终止密码子及后续序列，共29bp。ADAM23-dGFP-R(SEQID NO:6)为正向引物的反向互补序列。
引物由金唯智公司合成。
2、按浓度将引物ADAM23-dGFP-F、ADAM23-dGFP-R稀释到终浓度10μM。
3、一步法PCR反应
1)混合PCR体系如下所示：
2)PCR反应程序如下所示：
| 预变性: | 94℃,2min. |
| 变性: | 98℃,10sec. |
| 退火: | 55℃,20sec. |
| 延伸: | 68℃,8min30s |
| 循环数: | 12个循环 |
| 延伸: | 68℃,10min |
| 保存条件： | 10℃ |
4、PCR结束之后，取5μl的PCR产物进行电泳检测，检测结果显示得到了目标条带。
5、Dpn1消化：PCR反应结束后在反应管中加入1μl Dpn1酶，37℃反应1-2h，彻底清除PCR反应体系中的模板质粒。
6、转化：取8μl Dpn1消化之后的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，复苏之后涂到Kan抗性的LB固体培养平板上培养。
7、挑取单菌落，加入含有Kan抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜培养。
8、提取质粒，送测序公司测序，比对测序结果筛选正确的重组子。测序结果显示，重组质粒中GFP基因被成功删除。
序列表
<110> 北京瑞海泰晟生物科技有限公司
<120> 一种简便的基因缺失突变体的载体构建方法及试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcca 600
ccatggaatc agaaagaagc aaaaggatgg gaaatgcctg cattcccctg aaaagaattg 660
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cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg 3360
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gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca 3840
tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc 3900
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<400> 6
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Claims (10)
1.一种简便的基因缺失突变体的载体构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据目的载体上要缺失的目的基因，设计PCR扩增引物对，引物设计时带上目的载体上目的基因之前和之后的同源臂序列，上游引物包括两部分：引物5’端部分为目的载体上要缺失的目的基因之前的20～35bp同源臂序列，引物3’端部分为要缺失的目的基因之后的20～35bp同源臂序列；下游引物为上游引物的反向互补序列；
优选所述同源臂序列为23～27bp；
(2)用目的载体作为模板，用设计的PCR扩增引物对进行常规PCR反应；
(3)Dpn1消化PCR产物，去除PCR反应产物中多余的模板质粒；
(4)取消化之后的PCR产物转化大肠杆菌，得到单克隆菌落，摇菌提取质粒，鉴定得到缺失了目的基因的正确重组质粒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR的反应体系包括：DNA聚合酶、PCR扩增引物对、目的载体、ddH2O。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述DNA聚合酶为KOD DNA Polymerase，所述PCR的反应体系还包括MgSO4、KOD DNA Polymerase缓冲液、dNTPs。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：PCR的反应程序为：94℃预变性2min；98℃变性10sec，55℃退火20sec，68℃延伸、持续时间按照1min/kb设定，12～15个循环；最后68℃延伸10min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述目的载体为pEGFP-N1-LGI1，所述要缺失的目的基因为LGI1的315-559aa，PCR扩增引物对为LGI1-del-F/LGI1-del-R，引物序列分别如SEQ ID NO:1和2所示；
或者，所述目的载体为pEGFP-N1-ADAM23，所述要缺失的目的基因为GFP，PCR扩增引物对为ADAM23-dGFP-F/ADAM23-dGFP-R，引物序列分别如SEQ ID NO:5和6所示。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：PCR的反应程序中循环数为12个。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)采用Dpn1消化PCR产物；
优选所述目的载体小于10kbp。
8.一种简便的基因缺失突变体的载体构建试剂盒，其特征在于：包括PCR扩增特异引物对，所述引物对的上游引物结构为：
5’-目的载体上要缺失的目的基因之前的20～35bp同源臂序列+目的基因之后的20～35bp同源臂序列-3’，
下游引物序列为和上游引物完全反向互补的序列。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：还包括DNA聚合酶、目的载体模板。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：还包括MgSO4、Dpn1、大肠杆菌感受态细胞、dNTPs；
优选所述DNA聚合酶为KOD DNA Polymerase，所述试剂盒还包括KOD DNA Polymerase的缓冲液。
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| CN202110161267.9A Active CN112852855B (zh) | 2021-02-05 | 2021-02-05 | 一种简便的基因缺失突变体的载体构建方法及试剂盒 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113817719A (zh) * | 2021-09-23 | 2021-12-21 | 陕西脉元生物科技有限公司 | 一种基因突变引物及其设计方法和设计突变质粒的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110592129A (zh) * | 2019-09-16 | 2019-12-20 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法 |
| CN111434771A (zh) * | 2019-01-15 | 2020-07-21 | 四川大学 | 一种线性化载体自重组的质粒构建方法 |
| CN112011496A (zh) * | 2020-08-25 | 2020-12-01 | 西南大学 | 一种伪结核棒状杆菌pld基因无痕缺失株的构建方法 |
-
2021
- 2021-02-05 CN CN202110161267.9A patent/CN112852855B/zh active Active
Patent Citations (3)
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| CN112852855B (zh) | 2023-12-01 |
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