CN102816781A - 一种辛德毕斯病毒xj-160缺陷型复制子及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种辛德毕斯病毒XJ-160缺陷型复制子及其构建方法和应用，其构建包括：XJ-160病毒质粒型复制子载体pVa-XJ的构建；含报告基因的XJ-160质粒型复制子pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC的构建；XJ-160缺陷型复制子的构建：利用Acl I限制性内切酶分别单酶切pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC，构建非结构基因处存在1139个碱基缺失的缺陷型质粒pVaXJ-EGFPΔ和pVaXJ-GLUCΔ。本发明的机理是：由于非结构基因区域存在部分缺失，该缺陷型复制子导入细胞后报告基因不能正常大量表达，而当细胞中存在甲病毒感染时，病毒表达的非结构蛋白可以弥补并反式作用于缺陷型复制子导致报告基因的大量表达。本XJ-160缺陷型复制子能够检测多种甲病毒，对于非甲病毒无反应，特异性高；具有较高灵敏度，可以检测到1PFU的病毒；操作简单快速，所需仪器少；可持续性强，检测时不需杀死病毒，适于快速监别甲病毒。

Description

一种辛德毕斯病毒XJ-160缺陷型复制子及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种辛德毕斯病毒XJ-160缺陷型复制子及其构建方法和应用，特别是涉及一种含有报告基因的辛德毕斯病毒缺陷型复制子及其构建过程，以及利用该缺陷型复制子进行甲病毒检测的方法

背景技术

甲病毒属病毒(Alphavirus)是一类由蚊虫传播的虫媒病毒，包括30多个成员，可引起人类或哺乳动物发热、皮疹、关节炎、严重脑炎症状乃至神经错乱或死亡，是一类对人类健康和公共卫生危害严重的病原体。该属病毒具有世界性分布的特点，经常引起大流行，例如基孔肯亚病毒(Chikungunya Virus，CHIK)引发的基孔肯亚热自1999年以来在非洲、亚洲和印度次大陆多次暴发；又如西部马脑炎、东部马脑炎和委内瑞拉马脑炎常年流行于北美洲。另外，西部马脑炎病毒(Western Equine Encephalitis Virus，WEEV)、东部马脑炎病毒(Eastern Equine Encephalitis Virus，EEEV)和委内瑞拉马脑炎病毒(VenezuelanEquine Encephalitis Virus，VEEV)等烈性甲病毒被列为病毒性生物战剂。因此，建立针对所有甲病毒病原体的早期快速甄别和筛查技术具有重要意义。

辛德毕斯病毒(Sindbisvirus，SINV)是甲病毒属的代表病毒。SINV的形态、结构、复制和翻译等功能及发病机理均集中体现了动物病毒的特征，已成为研究动物病毒基本规律的模型病毒。SINV基因组为单股正链RNA，全长约11.7kb。全基因组共有两个开放读码框架，非结构蛋白开放读码框位于基因组5′端前2/3区，编码非结构蛋白；结构蛋白开放读码框位于病毒基因组3′端1/3区，编码结构蛋白，即衣壳蛋白、包膜蛋白E1、E2。甲病毒的非结构蛋白在病毒复制及结构蛋白的表达中起着非常重要作用。

XJ-160病毒是1990年夏天从我国新疆维吾尔自治区伊犁地区霍城县境内捕获的按蚊(Anopheles)中分离到的一株辛德毕斯病毒。我们课题组对该病毒株进行了全基因组序列测定(GenBankAF103728)，构建了该病毒的感染性克隆(见CN 200310115457.9XJ-160病毒感染性全基因组cDNA克隆)。为了建立一种针对所有甲病毒的快速检测方法，我们构建了含有报告基因的非结构基因区域部分缺失的XJ-160病毒缺陷型复制子。经检索，未发现有关利用缺陷型辛德毕斯病毒复制子进行甲病毒检测的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种辛德毕斯病毒XJ-160缺陷型复制子及其构建方法和应用，本检测方法有较好的广谱性，能够检测多种甲病毒感染；操作简单快速，所需仪器少，适于快速初筛；特异性高，只对甲病毒感染有反应，对其它病毒感染没有反应；较高灵敏度，可以检测到1PFU的病毒；直观性强，可在荧光显微镜下直接观察病毒感染情况；可持续性强，检测时不需杀死病毒，可以对病毒继续进行培养并分离活的病毒进行下一步分析。

为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的机理是：由于非结构基因区域存在部分缺失，该缺陷型复制子导入细胞后报告基因不能正常大量表达，而当细胞中存在甲病毒感染时，病毒表达的非结构蛋白可以弥补并反式作用于缺陷型复制子导致报告基因的大量表达。因此，本系统可以用于甲病毒感染的快速检测。

XJ-160缺陷型复制子的构建方案为：

①XJ-160病毒质粒型复制子载体的构建：将辛德毕斯病毒XJ-160的全基因组序列中的结构基因替换为多克隆位点(multiple clone sites，MCS)，将该片段克隆到真核表达质粒pVAX1中构建XJ-160病毒质粒型复制子载体pVa-XJ；

②含报告基因的XJ-160质粒型复制子的构建：在质粒型复制子载体的多克隆位点处分别插入两种报告基因，即绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorecent protein，EGFP)和海肾荧光素酶基因(Gaussia Luciferase，GLUC)，构建XJ-160病毒报告基因标记型复制子质粒pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC；

③XJ-160缺陷型复制子的构建：利用Acl I限制性内切酶分别单酶切pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC，构建非结构基因处存在1139个碱基缺失的缺陷型质粒pVaXJ-EGFPΔ和pVaXJ-GLUCΔ。

一、缺陷型复制子pVaXJ-EGFPΔ的序列：

GACTCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA  60

ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA  120

ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT  180

AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA  240

CTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC  300

CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT  360

ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT  420

GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG  480

TCTCCACCCC ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC  540

AAAATGTCGT AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA  600

GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT GGCTTATCGA  660

AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCCA AGCTGGCTAG CATTGACGGC GTAGTACACA  720

CTATTGAATC AAACAGCCGA CCAATAGCAC TACCATCATA ATGGAGAGGC CTGTAGTTAA  780

CGTAGACGTA GACCCCCAGA GTCCGTTTGT CGCTCAACTG CAAAAGAGCT TCCCGCAATT  840

CGAGGTAGTA GCACAGCAGG CCACACCAAA TGACCATGCT AATGCCAGAG CATTTTCGCA  900

TCTGGCTAGT AAATTAATCG AGCTGGAGGT TCCTACCACA GCGACGATTT TGGACATAGG  960

CAGCGCACCG GCTCGTAGAA TGTTTTCCGA GCACCACTAT CACTGCGTCT GCCCTATGCG  1020

GAGCCCCGAA GATCCCGACC GTATGATGAA ATACGCCAAT AAGTTGGCGG AGAAGGCAAA  1080

TAAGATTACT AATAAAAATT TGCATGAGAA GATTAAAGAC CTCCGGATCG TACTCGATAC  1140

TCCGGATGCT GAGACACCGT CGCTCTGCTT CCATAATGAC GTTACCTGCA GTACGCGTGC  1200

AGAGTACTCC GTTATGCAAG ATGTGTATAT TAATGCACCC GGAACTATTT ACCATCAAGC  1260

TATGAAAGGC GTGCGGACAC TTTACTGGAT TGGGTTTGAC ACCACTCAGT TCATGTTCTC  1320

GGCTATGGCA GGATCATATC CTGCCTATAA TACTAACTGG GCCGATGAAA AAGTCCTTGA  1380

AGCACGCAAT ATTGGACTCT GTAGTACCAA GTTGAGCGAA GGCCGTATAG GAAAGTTGTC  1440

AATAATGAGG AAAAAGGAGT TGAAGCCCGG GTCACGGGTC TACTTCTCAG TGGGATCAAC  1500

ACTCTACCCA GAATATAGGG ACAGCTTACA GAGCTGGCAC CTCCCATCAG TGTTCCATCT  1560

GAAAGGAAAG CAATCGTATA CATGCCGCTG TGATACAGTG GTAAGTTGCG AAGGCTACGT  1620

AGTGAAGAAG ATCACTATTA GTCCCGGGAT TACGGGAGAA ACCGTGGGAT ACGCGGTTAC  1680

AAACAATAGC GAGGGTTTCT TGCTATGTAA AGTTACTGAC ACAGTAAAAG GGGAACGGGT  1740

CTCGTTCCCC GTGTGCACGT ATATCCCGGC CACCATATGC GACCAGATGA CAGGTATAAT  1800

GGCCACGGAT ATTTCACCTG ACGATGCACA GAAGCTTCTG GTTGGGCTCA ACCAGAGGAT  1860

TGTCATTAAC GGTAAAACCA ACAGGAACAC TAACACCATG CAAAACTACC TTCTACCGAT  1920

TATAGCACAA GGCTTCAGCA AGTGGGCTAA AGAGCGCAAA GAAGATCTTG ATAATGAAAA  1980

GAAGCTGGGC ACTAGGGAGC GTAAGCTTAT TTACGGGTGT CTATGGGCGG TTCGTACTAA  2040

GAAAGTGCAC TCGTTTTACC GCCCGCCCGG AACGCAGACC AGCGTGAAAG TCCCGGCATC  2100

TTTTAGCGCT TTTCCAATGT CATCTGTATG GACAACCTCA CTACCCATGT CGCTGAGGCA  2160

GAAGATAAAA TTGGTACTAC AACCGAAAAA GGAGGAGAAA TTACTGCAGG TCTCAGAAGA  2220

GTTAGTTGCG GAGGCTAAAG CGGCCTTTGA AGATGCACAG GAGGAGATCA GAGCGGAGCA  2280

ACTCCGTGAA GCACTTCCAC CACTGGTAGC AGACAAAGGT ATTGAAGCCG CTGCAGAAGT  2340

CGTCTGTGAA GTGGAAGGGC TTCAAGCTGA TATAGGAGCA GCTCTTGTTG AGACGCCACG  2400

AGGGCATGTA AGGATTATAC CTCAAGTAAC AGACCGCATG ATTGGGCAGT ACATCGTGGT  2460

CTCACCAACC TCCGTGCTTA AGAACGCCAA ATTAACACCT GTTCACCCTT TGGCTGACCA  2520

AGTCAAAATT ATAACACATT CAGGGAGGAC AGGAAGATTC GCGGTGGAGC CGTATGATGC  2580

TAAAGTGTTG ATGCCAGCAG GTAGCGCCGT TCCATGGCCT GAGTTCCTGG CGTTAAGTGA  2640

AAGCGCCACG CTAGTGTATA ACGAAAGAGA ATTTGTCAAC CGCAAACTTT ACCATATCGC  2700

CATACATGGT CCCGCGAAGA ATACTGAAGA GGAGCAGTAT AAAGTCACTA AAGCCGAACT  2760

CGCAGAAACA GAGTATGTAT TTGATGTCGA CAAGAAGCGT TGCGTTAAGA AGGAAGAGGC  2820

CTCGGGGCTG GTTCTCTCGG GAGAACTAAC TAACCCACCG TATCATGAAA TGGCGCTTGA  2880

GGGGCTGAAG ACTCGACCCG CTGTTCCGTA TAAGGTCGAA ACAATAGGAG TAATAGGCAC  2940

ACCAGGATCA GGCAAGTCTG CGATTATTAA ATCGACCGTT ACCGTACGAG ATCTTGTTAC  3000

CAGCGGAAAG AAGGAAAACT GCCGTGAAAT TGAAACTGAC GTGTTGAGGT TGAGAGGTAT  3060

GCAGATCACG TCAAGGACGG TAGACTCAGT CATGCTTAAC GGATGCCATA AAGCCGTTGA  3120

GGTGCTATAC GTTGATGAAG CATTTGCGTG CCATGCTGGT ACGTTGCTTG CCTTGATCGC  3180

TATTGTTAGA CCCCGAAAGA AGGTAGTACT TCGCGGGGAT CCTAAGCAGT GTGGTTTTTT  3240

CAATATGATG CAGCTCAAAG TACATTTTAA TCACCCTGAA AAAGATATAT GTACTAAGAC  3300

GTTTTACAAA TTCATCTCTC GACGCTGCAC GCAACCAGTA ACGGCGATTG TTTCAACACT  3360

TCATTACGAC GGAAAGATGA AGACTACAAA CCCCTGCAAG AAGAGCATTG AGATAGATAT  3420

TACAGGTACT ACGAAGCCGA AGCCCGGGGA CCTCGTTTTG ACGTGCTTCC GCGGATGGGT  3480

CAAGCAGCTA CAGATCGATT ACGCGGGAAA TGAAGTGATG ACGGCTGCTG CCTCGCAGGG  3540

ACTGACTAGA AAGGGTGTTT ACGCCGTTCG GCAAAAAGTT AATGAGAATC CACTGTACGC  3600

GATTACGTCG GAGCACGTGA ACGTGTTACT CACCCGTACT GAGGATAGAT TAGTGTGGAA  3660

GACCTTACAG GGCGATCCAT GGATCAAACA ACTTACTAAC ATTCCGAAAG GAAACTTCCA  3720

AGCTACTATT GAGGACTGGG AAGCTGAACA TAAGGGGATC ATCGCTGCAA TAAACAGCCC  3780

AACCCCTCGT ATAAACCCGT TCAGCTGTAA GACTAATGTG TGCTGGGCGA AGGCACTGGA  3840

ACCGATACTG GCCACAGCCG GTATTGTCCT CACCGGTTGC CAGTGGAGTG AGCTGTTTCC  3900

ACAGTTCGTA GATGATAAAC CCCACTCAGC TATCTACGCC CTAGATGTGA TTTGTATTAA  3960

GTTCTTTGGT ATGGATCTGA CAAGCGGTCT ATTTTCAAAG CAGAGCATCC CTCTGACGTA  4020

CCACCCTGCG GACTCTGCAA GGCCAGTGGC GCATTGGGAC AACAGTCCAG GAACCCGAAA  4080

GTATGGATAC GATCATGCGG TTGCTGCCGA ATTGTCTCGT AGATTCCCGG TGTTCCAACT  4140

TGCTGGAAAA GGCACACAGC TTGACTTGCA GACTGGTAGA ACCAGAGTCG TTTCCGCGCA  4200

GTGTAACTTG GTCCCAGTGA ACCGTAACCT CCCGCACGCT CTTGTCCCCG AGTATAAAGA  4260

GAAACAACCC GGCCCGATTA AAAATTTTTT AAATCAGTTT AAGCATCACT CCATACTTGT  4320

AGTATCAGAA ACGAAAATCG AAGTTCCCAA TAAGCGCATC GAATGGATTG CACCGCTTGG  4380

CATAGCTGGT GCAGATAAGA GCTACAACCT GGCCTTCGGA TTTCCACCGC AGGCACGGTA  4440

TGATATGGTG TTTATCAATA TAGGAACAAA ATATAGAAAC CACCATTTTC AACAGTGTGA  4500

AGACCATGCG GCGACTTTGA AGACTCTTTC CCGCTCGGCT CTGAATTGCC TCAACCCTGG  4560

AGGCACCTTA GTGGTGAAAT CCTATGGATA TGCTGATCGC AATAGCGAGG ACGTAGTCAC  4620

CGCACTTGCC AGGAAGTTTG TTAGAGTGTC TGCGGCCAGG CCAGAGTGCG TCTCAAGTAA  4680

CACAGAAATG TACCTAATCT TTCGGCAATT AGATAATAGC CGTACACGGC AGTTCACTCC  4740

ACATCATTTG AACTGTGTAA TCTCGTCGGT GTATGAAGGC ACGAGAGAAG GAGTCGGAGC  4800

TGCGCCATCC TACCGTGTGA AACGGGAAAA TATTGCAGAC TGCCATGAGG AAGCAATCGT  4860

CAACGCCGCT AACTCGCTGG GTAAACCAGG TGAAGGAGTT TGCCGCGCCG TCTACAAGCG  4920

TTGGCCGAGC AGCTTTATGG ATTCCGCCAC AGAAACGGGT ACGGCTAAAT TAACTGTAAG  4980

CCAAGGAATG AAAGTGATAC ACGCGGTCGG CCCTGACTTC CGTAAGTATC CTGAGGCGGA  5040

AGCTTTGAAG CTGCTGCAAA ACGCTTACCA TGCAGTGGCG GACTTGGTTA ACAAACACAA  5100

CATTAAGTCC ATTGCTATCC CGCTACTATC AACAGGTATA TATGCAGCTG GTAAGGATCG  5160

CTTGGAAGTT TCGCTCAATT GCCTGACCAC CGCACTAGAC AGGACCGATG CAGATGTAAC  5220

TATTTATTGT TTGGATAAGA AATGGAAAGA GAGAATTGAC GCGGTGTTGC AACTTAAGGA  5280

GTCAGTGACA GAACTGAAGG ACGAGGACAT GGAAATCGAT GACGAATTGG TATGGATTCA  5340

TCCGGATAGT TGTCTAAAAG GGAGAAAGGG ATACAGTACT ACAAAAGGAA AGCTATATTC  5400

GTACTTTGAG GGTACTAAAT TTCACCAAGC AGCCAAAGAT ATGGCTGAAA TAAAAGTGCT  5460

GTTTCCGGAC GACCAGGAAA GCAACGAACA GTTATGCGCT TACATACTGG GCGAAACCAT  5520

GGAAGCAATT CGTGAAAAAT GCCCAGTTGA TCGTAACCCG TCATCCAGTC CTCCGAAGAC  5580

GCTGCCTTGC CTTTGCATGT ATGCAATGAC TCCGGAAAGA GTTCATAGGC TCAGAAGTAA  5640

CAATGTTAAA GAAATTACTG TGTGCTCCTC GACCCCGCTT CCAAAATATA AGATTAAGAA  5700

CGTCCAGAAA GTCCAGTGCA CTAAAGTAGT CCTGTTTAAC CCGCACACTC CTACTTTTGT  5760

CCCGGCCCGT AAATATGTGG AAGTGCCAGA ATCACCTGCC ATCACACCTG TACAGGCCGA  5820

CACGCTAGAT CAGCCACCTG CCGCGGACGG AATTCCGCTT GATGTTACGG ACATTTCATT  5880

AAATATGGAA GATAGTAGCG AAGGATTGTC CATTTTAGAT TTCCACGGGT CAGAAAGTTC  5940

CATTTTTAGC ATGGATAGCT GGTCGTCAGG AACCAGTTCT TTGGGGCCAG AGGACAATAG  6000

AAGGCAAGTA GTGACAGTCG ATGTCCACTC CACCCAAGAG GATACTCCCA TTCCTCCTCC  6060

AAGGTTAAAG AAACTGGCCC GGTTAGCGGC GGCGAAACAG ACCCCAGTAG CACTTACCGT  6120

ATCGAATGAT GTGGGCTCAA TGGATGAGTC CCTCTGCCTT TCATTTGGCA GCGTATCCAT  6180

GTCTTTTGGA TCTTTTTCCG ACGGTGAGAT CGATGAAATA AGTCGTATGA AGACTGAGTC  6240

AGAACCCGTT TTATTTGGAA CTTTTGAACC TGGAGAAGTT AATTCCATTA TATCGTCTCG  6300

ATCAGCCGTG TCTTTTCCAC CGCTAAGGCA GAGACGTAGA CGTAGGAACA AGCGGACTGA  6360

ATACTGACTA ACCGGGGTAG GTGGGTACAT ATTTTCGACG GATACAGGGC CAGGACATCT  6420

GCAAAAGAAG TCTGTCTTGC AGAATCAATT TTCCGAACCG ACCTTGGAGC GTAACGTGCT  6480

GGAAAAGATA TACGCTCCGA CGCTTGATAC GTCGAAAGAA GAACTACTCA AATTTAGATA  6540

CCAAATGATG CCCACCGAAG CCAATAAGAG CAGGTACCAG TCCCGCAAAG TCGAAAATCA  6600

AAAAGCCGTC ACCACTGAGC GTTTGCTTTC AGGGTTACGG CTATATACCT CGGCAACTGA  6660

TCAGCCTGAA TGTTATAAAA TTACTTACCC GAAACCTTTG TATTCCAGCA GTGTACCAGC  6720

AAGTTACTCC GACCCGAAGT TCGCAGTTGC CGTCTGCAAT AACTACTTGC ATGAAAACTA  6780

CCCAACGGTA GCGTCCTACC AGATTACTGA TGAATACGAC GCTTACCTCG ATATGGTGGA  6840

TGGGACTGTC GCTTGCCTGG ACACCGCAAC ATTCTGCCCG GCTAAACTCA GAAGTTATCC  6900

AAAGAGGCAT GAGTATCGCG CACCGAATAT CCGTAGCGCA GTCCCGTCTG CTATGCAGAA  6960

CACGTTGCAA AACGTGCTCA TCGCTGCAAC CAAGAGGAAC TGCAACGTTT GCCCAGAGCA  7020

AAAATTCGTT TCAGGCCATT AGAGGAGAAA TAAAGCAACT CTACGGTGGT CCTAAATAGT  7080

CAGCATAGCA TATTTTATCT GACTAATACT GTAACACCCC TACTGCGGCC GCGATCGGCC  7140

GGCCCGCCAC CATGGTGAGC AAGGGCGAGG AGCTGTTCAC CGGGGTGGTG CCCATCCTGG  7200

TCGAGCTGGA CGGCGACGTA AACGGCCACA AGTTCAGCGT GTCCGGCGAG GGCGAGGGCG  7260

ATGCCACCTA CGGCAAGCTG ACCCTGAAGT TCATCTGCAC CACCGGCAAG CTGCCCGTGC  7320

CCTGGCCCAC CCTCGTGACC ACCCTGACCT ACGGCGTGCA GTGCTTCAGC CGCTACCCCG  7380

ACCACATGAA GCAGCACGAC TTCTTCAAGT CCGCCATGCC CGAAGGCTAC GTCCAGGAGC  7440

GCACCATCTT CTTCAAGGAC GACGGCAACT ACAAGACCCG CGCCGAGGTG AAGTTCGAGG  7500

GCGACACCCT GGTGAACCGC ATCGAGCTGA AGGGCATCGA CTTCAAGGAG GACGGCAACA  7560

TCCTGGGGCA CAAGCTGGAG TACAACTACA ACAGCCACAA CGTCTATATC ATGGCCGACA  7620

AGCAGAAGAA CGGCATCAAG GTGAACTTCA AGATCCGCCA CAACATCGAG GACGGCAGCG  7680

TGCAGCTCGC CGACCACTAC CAGCAGAACA CCCCCATCGG CGACGGCCCC GTGCTGCTGC  7740

CCGACAACCA CTACCTGAGC ACCCAGTCCG CCCTGAGCAA AGACCCCAAC GAGAAGCGCG  7800

ATCACATGGT CCTGCTGGAG TTCGTGACCG CCGCCGGGAT CACTCTCGGC ATGGACGAGC  7860

TGTACAAGTA AGGCGCGCCT CTTTTATCAA TTAACCAAAA TTTTGTTTTT AACATTTCAA  7920

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAGGGCCCG TTTAAACCCG CTGATCAGCC  7980

TCGACTGTGC CTTCTAGTTG CCAGCCATCT GTTGTTTGCC CCTCCCCCGT GCCTTCCTTG  8040

ACCCTGGAAG GTGCCACTCC CACTGTCCTT TCCTAATAAA ATGAGGAAAT TGCATCGCAT  8100

TGTCTGAGTA GGTGTCATTC TATTCTGGGG GGTGGGGTGG GGCAGGACAG CAAGGGGGAG  8160

GATTGGGAAG ACAATAGCAG GCATGCTGGG GATGCGGTGG GCTCTATGGC TTCTACTGGG  8220

CGGTTTTATG GACAGCAAGC GAACCGGAAT TGCCAGCTGG GGCGCCCTCT GGTAAGGTTG  8280

GGAAGCCCTG CAAAGTAAAC TGGATGGCTT TCTCGCCGCC AAGGATCTGA TGGCGCAGGG  8340

GATCAAGCTC TGATCAAGAG ACAGGATGAG GATCGTTTCG CATGATTGAA CAAGATGGAT  8400

TGCACGCAGG TTCTCCGGCC GCTTGGGTGG AGAGGCTATT CGGCTATGAC TGGGCACAAC  8460

AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCCGTGT TCCGGCTGTC AGCGCAGGGG CGCCCGGTTC  8520

TTTTTGTCAA GACCGACCTG TCCGGTGCCC TGAATGAACT GCAAGACGAG GCAGCGCGGC  8580

TATCGTGGCT GGCCACGACG GGCGTTCCTT GCGCAGCTGT GCTCGACGTT GTCACTGAAG  8640

CGGGAAGGGA CTGGCTGCTA TTGGGCGAAG TGCCGGGGCA GGATCTCCTG TCATCTCACC  8700

TTGCTCCTGC CGAGAAAGTA TCCATCATGG CTGATGCAAT GCGGCGGCTG CATACGCTTG  8760

ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCACCAAG CGAAACATCG CATCGAGCGA GCACGTACTC  8820

GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG ATCTGGACGA AGAGCATCAG GGGCTCGCGC  8880

CAGCCGAACT GTTCGCCAGG CTCAAGGCGA GCATGCCCGA CGGCGAGGAT CTCGTCGTGA  8940

CCCATGGCGA TGCCTGCTTG CCGAATATCA TGGTGGAAAA TGGCCGCTTT TCTGGATTCA  9000

TCGACTGTGG CCGGCTGGGT GTGGCGGACC GCTATCAGGA CATAGCGTTG GCTACCCGTG  9060

ATATTGCTGA AGAGCTTGGC GGCGAATGGG CTGACCGCTT CCTCGTGCTT TACGGTATCG  9120

CCGCTCCCGA TTCGCAGCGC ATCGCCTTCT ATCGCCTTCT TGACGAGTTC TTCTGAATTA  9180

TTAACGCTTA CAATTTCCTG ATGCGGTATT TTCTCCTTAC GCATCTGTGC GGTATTTCAC  9240

ACCGCATACA GGTGGCACTT TTCGGGGAAA TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTTTATTTTT  9300

CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA  9360

ATAGCACGTG CTAAAACTTC ATTTTTAATT TAAAAGGATC TAGGTGAAGA TCCTTTTTGA  9420

TAATCTCATG ACCAAAATCC CTTAACGTGA GTTTTCGTTC CACTGAGCGT CAGACCCCGT  9480

AGAAAAGATC AAAGGATCTT CTTGAGATCC TTTTTTTCTG CGCGTAATCT GCTGCTTGCA  9540

AACAAAAAAA CCACCGCTAC CAGCGGTGGT TTGTTTGCCG GATCAAGAGC TACCAACTCT  9600

TTTTCCGAAG GTAACTGGCT TCAGCAGAGC GCAGATACCA AATACTGTCC TTCTAGTGTA  9660

GCCGTAGTTA GGCCACCACT TCAAGAACTC TGTAGCACCG CCTACATACC TCGCTCTGCT  9720

AATCCTGTTA CCAGTGGCTG CTGCCAGTGG CGATAAGTCG TGTCTTACCG GGTTGGACTC  9780

AAGACGATAG TTACCGGATA AGGCGCAGCG GTCGGGCTGA ACGGGGGGTT CGTGCACACA  9840

GCCCAGCTTG GAGCGAACGA CCTACACCGA ACTGAGATAC CTACAGCGTG AGCTATGAGA  9900

AAGCGCCACG CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC GGACAGGTAT CCGGTAAGCG GCAGGGTCGG  9960

AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCTTCCAGG GGGAAACGCC TGGTATCTTT ATAGTCCTGT  10020

CGGGTTTCGC CACCTCTGAC TTGAGCGTCG ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG GGGGGCGGAG  10080

CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCTT TTTACGGTTC CTGGGCTTTT GCTGGCCTTT  10140

TGCTCACATG TTCTT                                                   10155

其中：

702-7124             为病毒非结构基因序列

7004-7009            为Acl I酶切位点

7137-7144            为Fse I酶切位点

7152-7871            为EGFP基因序列

7872-7879            为Asc I酶切位点

7919-7953            为poly A位点

1-701及7959-10155    为骨架质粒PVAX1序列

二、缺陷型复制子pVaXJ-GLUCΔ的序列：

GACTCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA  60

ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA  120

ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT  180

AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA  240

CTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC  300

CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT  360

ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT  420

GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG  480

TCTCCACCCC ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC  540

AAAATGTCGT AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA  600

GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT GGCTTATCGA  660

AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCCA AGCTGGCTAG CATTGACGGC GTAGTACACA  720

CTATTGAATC AAACAGCCGA CCAATAGCAC TACCATCATA ATGGAGAGGC CTGTAGTTAA  780

CGTAGACGTA GACCCCCAGA GTCCGTTTGT CGCTCAACTG CAAAAGAGCT TCCCGCAATT  840

CGAGGTAGTA GCACAGCAGG CCACACCAAA TGACCATGCT AATGCCAGAG CATTTTCGCA  900

TCTGGCTAGT AAATTAATCG AGCTGGAGGT TCCTACCACA GCGACGATTT TGGACATAGG  960

CAGCGCACCG GCTCGTAGAA TGTTTTCCGA GCACCACTAT CACTGCGTCT GCCCTATGCG  1020

GAGCCCCGAA GATCCCGACC GTATGATGAA ATACGCCAAT AAGTTGGCGG AGAAGGCAAA  1080

TAAGATTACT AATAAAAATT TGCATGAGAA GATTAAAGAC CTCCGGATCG TACTCGATAC  1140

TCCGGATGCT GAGACACCGT CGCTCTGCTT CCATAATGAC GTTACCTGCA GTACGCGTGC  1200

AGAGTACTCC GTTATGCAAG ATGTGTATAT TAATGCACCC GGAACTATTT ACCATCAAGC  1260

TATGAAAGGC GTGCGGACAC TTTACTGGAT TGGGTTTGAC ACCACTCAGT TCATGTTCTC  1320

GGCTATGGCA GGATCATATC CTGCCTATAA TACTAACTGG GCCGATGAAA AAGTCCTTGA  1380

AGCACGCAAT ATTGGACTCT GTAGTACCAA GTTGAGCGAA GGCCGTATAG GAAAGTTGTC  1440

AATAATGAGG AAAAAGGAGT TGAAGCCCGG GTCACGGGTC TACTTCTCAG TGGGATCAAC  1500

ACTCTACCCA GAATATAGGG ACAGCTTACA GAGCTGGCAC CTCCCATCAG TGTTCCATCT  1560

GAAAGGAAAG CAATCGTATA CATGCCGCTG TGATACAGTG GTAAGTTGCG AAGGCTACGT  1620

AGTGAAGAAG ATCACTATTA GTCCCGGGAT TACGGGAGAA ACCGTGGGAT ACGCGGTTAC  1680

AAACAATAGC GAGGGTTTCT TGCTATGTAA AGTTACTGAC ACAGTAAAAG GGGAACGGGT  1740

CTCGTTCCCC GTGTGCACGT ATATCCCGGC CACCATATGC GACCAGATGA CAGGTATAAT  1800

GGCCACGGAT ATTTCACCTG ACGATGCACA GAAGCTTCTG GTTGGGCTCA ACCAGAGGAT  1860

TGTCATTAAC GGTAAAACCA ACAGGAACAC TAACACCATG CAAAACTACC TTCTACCGAT  1920

TATAGCACAA GGCTTCAGCA AGTGGGCTAA AGAGCGCAAA GAAGATCTTG ATAATGAAAA  1980

GAAGCTGGGC ACTAGGGAGC GTAAGCTTAT TTACGGGTGT CTATGGGCGG TTCGTACTAA  2040

GAAAGTGCAC TCGTTTTACC GCCCGCCCGG AACGCAGACC AGCGTGAAAG TCCCGGCATC  2100

TTTTAGCGCT TTTCCAATGT CATCTGTATG GACAACCTCA CTACCCATGT CGCTGAGGCA  2160

GAAGATAAAA TTGGTACTAC AACCGAAAAA GGAGGAGAAA TTACTGCAGG TCTCAGAAGA  2220

GTTAGTTGCG GAGGCTAAAG CGGCCTTTGA AGATGCACAG GAGGAGATCA GAGCGGAGCA  2280

ACTCCGTGAA GCACTTCCAC CACTGGTAGC AGACAAAGGT ATTGAAGCCG CTGCAGAAGT  2340

CGTCTGTGAA GTGGAAGGGC TTCAAGCTGA TATAGGAGCA GCTCTTGTTG AGACGCCACG  2400

AGGGCATGTA AGGATTATAC CTCAAGTAAC AGACCGCATG ATTGGGCAGT ACATCGTGGT  2460

CTCACCAACC TCCGTGCTTA AGAACGCCAA ATTAACACCT GTTCACCCTT TGGCTGACCA  2520

AGTCAAAATT ATAACACATT CAGGGAGGAC AGGAAGATTC GCGGTGGAGC CGTATGATGC  2580

TAAAGTGTTG ATGCCAGCAG GTAGCGCCGT TCCATGGCCT GAGTTCCTGG CGTTAAGTGA  2640

AAGCGCCACG CTAGTGTATA ACGAAAGAGA ATTTGTCAAC CGCAAACTTT ACCATATCGC  2700

CATACATGGT CCCGCGAAGA ATACTGAAGA GGAGCAGTAT AAAGTCACTA AAGCCGAACT  2760

CGCAGAAACA GAGTATGTAT TTGATGTCGA CAAGAAGCGT TGCGTTAAGA AGGAAGAGGC  2820

CTCGGGGCTG GTTCTCTCGG GAGAACTAAC TAACCCACCG TATCATGAAA TGGCGCTTGA  2880

GGGGCTGAAG ACTCGACCCG CTGTTCCGTA TAAGGTCGAA ACAATAGGAG TAATAGGCAC  2940

ACCAGGATCA GGCAAGTCTG CGATTATTAA ATCGACCGTT ACCGTACGAG ATCTTGTTAC  3000

CAGCGGAAAG AAGGAAAACT GCCGTGAAAT TGAAACTGAC GTGTTGAGGT TGAGAGGTAT  3060

GCAGATCACG TCAAGGACGG TAGACTCAGT CATGCTTAAC GGATGCCATA AAGCCGTTGA  3120

GGTGCTATAC GTTGATGAAG CATTTGCGTG CCATGCTGGT ACGTTGCTTG CCTTGATCGC  3180

TATTGTTAGA CCCCGAAAGA AGGTAGTACT TCGCGGGGAT CCTAAGCAGT GTGGTTTTTT  3240

CAATATGATG CAGCTCAAAG TACATTTTAA TCACCCTGAA AAAGATATAT GTACTAAGAC  3300

GTTTTACAAA TTCATCTCTC GACGCTGCAC GCAACCAGTA ACGGCGATTG TTTCAACACT  3360

TCATTACGAC GGAAAGATGA AGACTACAAA CCCCTGCAAG AAGAGCATTG AGATAGATAT  3420

TACAGGTACT ACGAAGCCGA AGCCCGGGGA CCTCGTTTTG ACGTGCTTCC GCGGATGGGT  3480

CAAGCAGCTA CAGATCGATT ACGCGGGAAA TGAAGTGATG ACGGCTGCTG CCTCGCAGGG  3540

ACTGACTAGA AAGGGTGTTT ACGCCGTTCG GCAAAAAGTT AATGAGAATC CACTGTACGC  3600

GATTACGTCG GAGCACGTGA ACGTGTTACT CACCCGTACT GAGGATAGAT TAGTGTGGAA  3660

GACCTTACAG GGCGATCCAT GGATCAAACA ACTTACTAAC ATTCCGAAAG GAAACTTCCA  3720

AGCTACTATT GAGGACTGGG AAGCTGAACA TAAGGGGATC ATCGCTGCAA TAAACAGCCC  3780

AACCCCTCGT ATAAACCCGT TCAGCTGTAA GACTAATGTG TGCTGGGCGA AGGCACTGGA  3840

ACCGATACTG GCCACAGCCG GTATTGTCCT CACCGGTTGC CAGTGGAGTG AGCTGTTTCC  3900

ACAGTTCGTA GATGATAAAC CCCACTCAGC TATCTACGCC CTAGATGTGA TTTGTATTAA  3960

GTTCTTTGGT ATGGATCTGA CAAGCGGTCT ATTTTCAAAG CAGAGCATCC CTCTGACGTA  4020

CCACCCTGCG GACTCTGCAA GGCCAGTGGC GCATTGGGAC AACAGTCCAG GAACCCGAAA  4080

GTATGGATAC GATCATGCGG TTGCTGCCGA ATTGTCTCGT AGATTCCCGG TGTTCCAACT  4140

TGCTGGAAAA GGCACACAGC TTGACTTGCA GACTGGTAGA ACCAGAGTCG TTTCCGCGCA  4200

GTGTAACTTG GTCCCAGTGA ACCGTAACCT CCCGCACGCT CTTGTCCCCG AGTATAAAGA  4260

GAAACAACCC GGCCCGATTA AAAATTTTTT AAATCAGTTT AAGCATCACT CCATACTTGT  4320

AGTATCAGAA ACGAAAATCG AAGTTCCCAA TAAGCGCATC GAATGGATTG CACCGCTTGG  4380

CATAGCTGGT GCAGATAAGA GCTACAACCT GGCCTTCGGA TTTCCACCGC AGGCACGGTA  4440

TGATATGGTG TTTATCAATA TAGGAACAAA ATATAGAAAC CACCATTTTC AACAGTGTGA  4500

AGACCATGCG GCGACTTTGA AGACTCTTTC CCGCTCGGCT CTGAATTGCC TCAACCCTGG  4560

AGGCACCTTA GTGGTGAAAT CCTATGGATA TGCTGATCGC AATAGCGAGG ACGTAGTCAC  4620

CGCACTTGCC AGGAAGTTTG TTAGAGTGTC TGCGGCCAGG CCAGAGTGCG TCTCAAGTAA  4680

CACAGAAATG TACCTAATCT TTCGGCAATT AGATAATAGC CGTACACGGC AGTTCACTCC  4740

ACATCATTTG AACTGTGTAA TCTCGTCGGT GTATGAAGGC ACGAGAGAAG GAGTCGGAGC  4800

TGCGCCATCC TACCGTGTGA AACGGGAAAA TATTGCAGAC TGCCATGAGG AAGCAATCGT  4860

CAACGCCGCT AACTCGCTGG GTAAACCAGG TGAAGGAGTT TGCCGCGCCG TCTACAAGCG  4920

TTGGCCGAGC AGCTTTATGG ATTCCGCCAC AGAAACGGGT ACGGCTAAAT TAACTGTAAG  4980

CCAAGGAATG AAAGTGATAC ACGCGGTCGG CCCTGACTTC CGTAAGTATC CTGAGGCGGA  5040

AGCTTTGAAG CTGCTGCAAA ACGCTTACCA TGCAGTGGCG GACTTGGTTA ACAAACACAA  5100

CATTAAGTCC ATTGCTATCC CGCTACTATC AACAGGTATA TATGCAGCTG GTAAGGATCG  5160

CTTGGAAGTT TCGCTCAATT GCCTGACCAC CGCACTAGAC AGGACCGATG CAGATGTAAC  5220

TATTTATTGT TTGGATAAGA AATGGAAAGA GAGAATTGAC GCGGTGTTGC AACTTAAGGA  5280

GTCAGTGACA GAACTGAAGG ACGAGGACAT GGAAATCGAT GACGAATTGG TATGGATTCA  5340

TCCGGATAGT TGTCTAAAAG GGAGAAAGGG ATACAGTACT ACAAAAGGAA AGCTATATTC  5400

GTACTTTGAG GGTACTAAAT TTCACCAAGC AGCCAAAGAT ATGGCTGAAA TAAAAGTGCT  5460

GTTTCCGGAC GACCAGGAAA GCAACGAACA GTTATGCGCT TACATACTGG GCGAAACCAT  5520

GGAAGCAATT CGTGAAAAAT GCCCAGTTGA TCGTAACCCG TCATCCAGTC CTCCGAAGAC  5580

GCTGCCTTGC CTTTGCATGT ATGCAATGAC TCCGGAAAGA GTTCATAGGC TCAGAAGTAA  5640

CAATGTTAAA GAAATTACTG TGTGCTCCTC GACCCCGCTT CCAAAATATA AGATTAAGAA  5700

CGTCCAGAAA GTCCAGTGCA CTAAAGTAGT CCTGTTTAAC CCGCACACTC CTACTTTTGT  5760

CCCGGCCCGT AAATATGTGG AAGTGCCAGA ATCACCTGCC ATCACACCTG TACAGGCCGA  5820

CACGCTAGAT CAGCCACCTG CCGCGGACGG AATTCCGCTT GATGTTACGG ACATTTCATT  5880

AAATATGGAA GATAGTAGCG AAGGATTGTC CATTTTAGAT TTCCACGGGT CAGAAAGTTC  5940

CATTTTTAGC ATGGATAGCT GGTCGTCAGG AACCAGTTCT TTGGGGCCAG AGGACAATAG  6000

AAGGCAAGTA GTGACAGTCG ATGTCCACTC CACCCAAGAG GATACTCCCA TTCCTCCTCC  6060

AAGGTTAAAG AAACTGGCCC GGTTAGCGGC GGCGAAACAG ACCCCAGTAG CACTTACCGT  6120

ATCGAATGAT GTGGGCTCAA TGGATGAGTC CCTCTGCCTT TCATTTGGCA GCGTATCCAT  6180

GTCTTTTGGA TCTTTTTCCG ACGGTGAGAT CGATGAAATA AGTCGTATGA AGACTGAGTC  6240

AGAACCCGTT TTATTTGGAA CTTTTGAACC TGGAGAAGTT AATTCCATTA TATCGTCTCG  6300

ATCAGCCGTG TCTTTTCCAC CGCTAAGGCA GAGACGTAGA CGTAGGAACA AGCGGACTGA  6360

ATACTGACTA ACCGGGGTAG GTGGGTACAT ATTTTCGACG GATACAGGGC CAGGACATCT  6420

GCAAAAGAAG TCTGTCTTGC AGAATCAATT TTCCGAACCG ACCTTGGAGC GTAACGTGCT  6480

GGAAAAGATA TACGCTCCGA CGCTTGATAC GTCGAAAGAA GAACTACTCA AATTTAGATA  6540

CCAAATGATG CCCACCGAAG CCAATAAGAG CAGGTACCAG TCCCGCAAAG TCGAAAATCA  6600

AAAAGCCGTC ACCACTGAGC GTTTGCTTTC AGGGTTACGG CTATATACCT CGGCAACTGA  6660

TCAGCCTGAA TGTTATAAAA TTACTTACCC GAAACCTTTG TATTCCAGCA GTGTACCAGC  6720

AAGTTACTCC GACCCGAAGT TCGCAGTTGC CGTCTGCAAT AACTACTTGC ATGAAAACTA  6780

CCCAACGGTA GCGTCCTACC AGATTACTGA TGAATACGAC GCTTACCTCG ATATGGTGGA  6840

TGGGACTGTC GCTTGCCTGG ACACCGCAAC ATTCTGCCCG GCTAAACTCA GAAGTTATCC  6900

AAAGAGGCAT GAGTATCGCG CACCGAATAT CCGTAGCGCA GTCCCGTCTG CTATGCAGAA  6960

CACGTTGCAA AACGTGCTCA TCGCTGCAAC CAAGAGGAAC TGCAACGTTT GCCCAGAGCA  7020

AAAATTCGTT TCAGGCCATT AGAGGAGAAA TAAAGCAACT CTACGGTGGT CCTAAATAGT  7080

CAGCATAGCA TATTTTATCT GACTAATACT GTAACACCCC TACTGCGGCC GCGATCGGCC  7140

GGCCCGCCAC CATGGGAGTC AAAGTTCTGT TTGCCCTGAT CTGCATCGCT GTGGCCGAGG  7200

CCAAGCCCAC CGAGAACAAC GAAGACTTCA ACATCGTGGC CGTGGCCAGC AACTTCGCGA  7260

CCACGGATCT CGATGCTGAC CGCGGGAAGT TGCCCGGCAA GAAGCTGCCG CTGGAGGTGC  7320

TCAAAGAGAT GGAAGCCAAT GCCCGGAAAG CTGGCTGCAC CAGGGGCTGT CTGATCTGCC  7380

TGTCCCACAT CAAGTGCACG CCCAAGATGA AGAAGTTCAT CCCAGGACGC TGCCACACCT  7440

ACGAAGGCGA CAAAGAGTCC GCACAGGGCG GCATAGGCGA GGCGATCGTC GACATTCCTG  7500

AGATTCCTGG GTTCAAGGAC TTGGAGCCCA TGGAGCAGTT CATCGCACAG GTCGATCTGT  7560

GTGTGGACTG CACAACTGGC TGCCTCAAAG GGCTTGCCAA CGTGCAGTGT TCTGACCTGC  7620

TCAAGAAGTG GCTGCCGCAA CGCTGTGCGA CCTTTGCCAG CAAGATCCAG GGCCAGGTGG  7680

ACAAGATCAA GGGGGCCGGT GGTGACTAAG GCGCGCCTCT TTTATCAATT AACCAAAATT  7740

TTGTTTTTAA CATTTCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AGGGCCCGTT  7800

TAAACCCGCT GATCAGCCTC GACTGTGCCT TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC  7860

TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT  7920

GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG TGTCATTCTA TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG  7980

CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC  8040

TCTATGGCTT CTACTGGGCG GTTTTATGGA CAGCAAGCGA ACCGGAATTG CCAGCTGGGG  8100

CGCCCTCTGG TAAGGTTGGG AAGCCCTGCA AAGTAAACTG GATGGCTTTC TCGCCGCCAA  8160

GGATCTGATG GCGCAGGGGA TCAAGCTCTG ATCAAGAGAC AGGATGAGGA TCGTTTCGCA  8220

TGATTGAACA AGATGGATTG CACGCAGGTT CTCCGGCCGC TTGGGTGGAG AGGCTATTCG  8280

GCTATGACTG GGCACAACAG ACAATCGGCT GCTCTGATGC CGCCGTGTTC CGGCTGTCAG  8340

CGCAGGGGCG CCCGGTTCTT TTTGTCAAGA CCGACCTGTC CGGTGCCCTG AATGAACTGC  8400

AAGACGAGGC AGCGCGGCTA TCGTGGCTGG CCACGACGGG CGTTCCTTGC GCAGCTGTGC  8460

TCGACGTTGT CACTGAAGCG GGAAGGGACT GGCTGCTATT GGGCGAAGTG CCGGGGCAGG  8520

ATCTCCTGTC ATCTCACCTT GCTCCTGCCG AGAAAGTATC CATCATGGCT GATGCAATGC  8580

GGCGGCTGCA TACGCTTGAT CCGGCTACCT GCCCATTCGA CCACCAAGCG AAACATCGCA  8640

TCGAGCGAGC ACGTACTCGG ATGGAAGCCG GTCTTGTCGA TCAGGATGAT CTGGACGAAG  8700

AGCATCAGGG GCTCGCGCCA GCCGAACTGT TCGCCAGGCT CAAGGCGAGC ATGCCCGACG  8760

GCGAGGATCT CGTCGTGACC CATGGCGATG CCTGCTTGCC GAATATCATG GTGGAAAATG  8820

GCCGCTTTTC TGGATTCATC GACTGTGGCC GGCTGGGTGT GGCGGACCGC TATCAGGACA  8880

TAGCGTTGGC TACCCGTGAT ATTGCTGAAG AGCTTGGCGG CGAATGGGCT GACCGCTTCC  8940

TCGTGCTTTA CGGTATCGCC GCTCCCGATT CGCAGCGCAT CGCCTTCTAT CGCCTTCTTG  9000

ACGAGTTCTT CTGAATTATT AACGCTTACA ATTTCCTGAT GCGGTATTTT CTCCTTACGC  9060

ATCTGTGCGG TATTTCACAC CGCATACAGG TGGCACTTTT CGGGGAAATG TGCGCGGAAC  9120

CCCTATTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC AAATATGTAT CCGCTCATGA GACAATAACC  9180

CTGATAAATG CTTCAATAAT AGCACGTGCT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA  9240

GGTGAAGATC CTTTTTGATA ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA  9300

CTGAGCGTCA GACCCCGTAG AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG  9360

CGTAATCTGC TGCTTGCAAA CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA  9420

TCAAGAGCTA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA  9480

TACTGTCCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC  9540

TACATACCTC GCTCTGCTAA TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG  9600

TCTTACCGGG TTGGACTCAA GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC  9660

GGGGGGTTCG TGCACACAGC CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT  9720

ACAGCGTGAG CTATGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC  9780

GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG  9840

GTATCTTTAT AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG  9900

CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT  9960

GGGCTTTTGC TGGCCTTTTG CTCACATGTT CTT  9993

其中：

702-7124             为病毒非结构基因序列

7004-7009            为Acl I酶切位点

7137-7144            为Fse I酶切位点

7152-7709            为GLUC基因序列

7710-7717            为Asc I酶切位点

7757-7791            为poly A位点

1-701及7798-9993     为骨架质粒PVAX1序列

本发明的使用方法：

①细胞培养：在24孔板中培养BHK细胞，细胞铺满80％～90％时待用；

②转染缺陷型复制子质粒：使用罗氏公司的

HD转染试剂将0.5ug的缺陷型复制子转入BHK细胞，分为两组，一组转染pVaXJ-EGFPΔ，另一组转染pVaXJ-GLUCΔ。同时设立不转染复制子也不感染病毒的空白对照和只转染复制子不感染病毒的对照。

③样品感染：细胞转染6小时后，取200uL待测样品加入细胞，吸附1小时后，每孔补加300uL培养基。

④收样：转染pVaXJ-GLUCΔ的组，每隔一定时间从细胞板的各孔中吸取20uL上清液加入1.5mL的EP管中，置于-20℃冰箱，用于荧光素酶GLUC活性测定；转染pVaXJ-EGFPΔ的组，不需要定时收样，可以直接把细胞板拿到显微镜下观察绿色荧光。

⑤GLUC活性测定或EGFP绿色荧光观察：转染pVaXJ-GLUCΔ的组进行GLUC活性测定；转染了pVaXJ-EGFPΔ的组在荧光显微镜下进行绿色荧光观察。

本发明的优点：

①较好的广谱性，能够检测多种甲病毒感染；

②操作简单快速，所需仪器少，适于快速初筛；

③特异性高，只对甲病毒感染有反应，对其它病毒感染没有反应；

④较高灵敏度，可以检测到1PFU的病毒；

⑤直观性强，可在荧光显微镜下直接观察病毒感染情况；

⑥可持续性强，检测时不需杀死病毒，可以对病毒继续进行培养并分离活的病毒进行下一步分析。

鉴于如上优点，本发明具有较高的应用价值。

附图说明

图1.XJ-160质粒型复制子载体的构建流程图。

图2.含报告基因的XJ-160质粒型复制子载体的构建图。

图3.XJ-160缺陷型复制子的构建示意图。

图4.XJ-160缺陷型复制子的构建流程图。

图5A.转染pVaXJ-EGFP后EGFP表达图；

图5B.转染缺陷型复制子pVaXJ-EGFPΔ后EGFP表达图；

图5C.转染pVaXJ-GLUC或缺陷型复制子pVaXJ-GLUCΔ后GLUC表达检测图。

图6A.转染pV-EGFPΔ并感染XJ-160病毒后EGFP表达图；

图6B.转染pV-EGFPΔ对照后EGFP表达图；

图6C.转染pVaXJ-GLUCΔ并感染XJ-160病毒或转染缺陷型复制子pVaXJ-GLUCΔ对照后GLUC表达检测图。

图7A.转染pVaXJ-GLUCΔ并分别感染5种甲病毒(XJ-160、YN87448、MSP、CHIKV和GETV)和非甲病毒JEV后GLUC表达检测图；

图7B.转染pVaXJ-EGFPΔ并分别感染XJ-160后EGFP表达图；

图7C.转染pVaXJ-EGFPΔ并分别感染YN87448后EGFP表达图；

图7D.转染pVaXJ-EGFPΔ并分别感染MSP后EGFP表达图；

图7E.转染pVaXJ-EGFPΔ并分别感染CHIKV后EGFP表达图；

图7F.转染pVaXJ-EGFPΔ并分别感染GETV后EGFP表达图；

图7G..转染pVaXJ-EGFPΔ并分别感染JEV后EGFP表达图；。

图8.XJ-160缺陷型复制子对不同稀释度甲病毒感染的检测图。

具体实施方式

一、XJ-160病毒质粒型复制子载体的构建

(一)方法概述：

以XJ-160病毒感染性全基因克隆pBR-XJ160为模板，用XJ₁(+)和XJ₁(-)、XJ₂(+)和XJ₂(-)、XJ₃(+)和XJ₃(-)三对引物进行PCR，将病毒非结构基因序列分为三个片段扩增：XJ1(1-2527nt)，XJ2(2527-5161nt)，XJ3(5161-7562nt)，克隆所用的引物序列为：

XJ₁(+)    GCTAGCATTGACGGCGTAGTACACAC(NheI位点)     1-20nt

XJ₁(-)    TGCTTAGGATCCCCGCGAAGTAC   (BamHI位点)    2527-2505nt

XJ₂(+)    TTCGCGGGGATCCTAAGCAGT     (BamHI位点)    2509-2529nt

XJ₂(-)    GAATTCCGTCCGCGGCAGGTGGC   (EcoRI位点)    5161-5138nt

XJ₃(+)    ATCCTGCCGCGGACGGAATTCCGCTT(EcoRI位点)    5148-5174nt

XJ₃(-)    GCGGCCGCAGTAGGGGTGTTACAG  (NotI位点)     7562-7539nt

采用分步克隆的方法将其依次克隆至真核表达载体pVAX1 CMV启动子下游，所用单一限制性内切酶分别为：NheI/BamHI，BamHI/ EcoRI和EcoRI/NotI。用合成的MCS(+)和MCS(-)经退火获得复制子载体的多克隆位点(multiple clone sites，MCS)片段，用MCS取代XJ-160病毒的结构基因克隆至非结构基因之后，MCS由NotI，PvuI，FseI，PacI和AscI五种单一限制性内切酶酶切位点序列构成。质粒型复制子的构建过程见图1。MCS的序列信息如下：

*黑体部分为保护碱基

*MCS由NotI，PvuI，FseI，PacI，AscI五种酶酶切位点序列构成

(二)具体方法：

1PCR扩增构建载体所用基因片段

1.1XJ1片段(1-2527nt)扩增

在0.2mlPCR管中配制50μl的反应体系

条件：94℃预变性3min；94℃ 15S，58℃ 45S，72℃ 2min40s，35个循环，72℃延伸10min。

1.2XJ2片段(2527-5161nt)扩增

在0.2mlPCR管中配制50μl的反应体系

条件：94℃预变性3min；94℃ 15S，60℃ 45S，72℃ 3min，35个循环，72℃延伸10min1.3XJ3片段(5161-7562nt)扩增

在0.2mlPCR管中配制50μl的反应体系

条件：94℃预变性3min；94℃ 15S，62℃ 45S，72℃ 2min 30s，35个循环，72℃延伸10min

1.4退火获得MCS片段

两条互补长引物NotI-ApaI和ApaI-NotI均稀释至10pmol/μl，各取15μl制成退火体系，于95℃3min，85℃3min，72℃5min，60℃3min，50℃3min，37℃3min，4℃条件下进行退火获得MCS片段。

2.基因片段的亚克隆

2.1PCR产物切胶纯化

PCR产物回收使用凝胶回收试剂盒/PCR产物纯化试剂盒(

Gel ExtractionKit/PCR Purification Kit)从琼脂糖凝胶中回收，方法如下：50μl PCR产物在TAE缓冲液条件下电泳，切下含目的片段的琼脂糖凝胶，加入3倍于胶体积的Buffer QG 50℃水浴10min直至胶完全溶解，将溶解液灌柱12000r/min离心1min弃掉滤液，再向柱中加入500μl Buffer QG 12000r/min离心1min弃掉滤液，加入750μl Buffer PE(含无水乙醇)洗柱12000r/min离心1min弃掉滤液，空柱12000r/min离心1min后将柱子移至新的Ep管中，向柱中加入30μl DEPC水溶2～3min，12000r/min离心1min弃掉柱子获得纯化的PCR产物。

2.2基因片段的T-A亚克隆

按下列体系进行PCR产物连接：

反应体系10μl

混匀后，置于16℃连接过夜

转化连接产物：取上述连接产物10μl加入100μl DH5α感受态细胞内，置冰浴40min后，42℃热休克90s，再置冰浴3min，加入无氨苄青霉素的LB约700μl，在37℃摇床150r/min摇菌60min；取200μl菌液加入40μl X-gal及4μl IPTG，混匀后涂含氨苄青霉素(100μg/ml)LB琼脂平板，于37℃倒置培养约14-16h，直到可见清晰的蓝色和白色菌落。

2.3T-A克隆的PCR鉴定

挑取白色菌落于3ml已加入氨苄青霉素的LB培养液中37℃摇菌过夜，用质粒小提试剂盒(来自Takara公司)提取质粒30μl，取1μl作为PCR鉴定的模板进行质粒的PCR鉴定，PCR体系(25μl)如下：10×buffer 2.5μl，2.5mmol/ldNTPs 3.5μl，模板质粒1μl，上下游引物各1μl，聚合酶0.5μl，补ddH₂O至25μl。PCR程序同前，鉴定正确的克隆送质粒进行测序，同时用75％的甘油保存菌液。测序正确的克隆分别命名为T-XJ1，T-XJ2，T-XJ3，T-C，T-E。

3.复制子载体的组装

用Nhe I/BamH I双酶切质粒T-XJ1和目的载体pVAX1分别纯化获得XJ1片段和线性pVAX1，按摩尔比3∶1混匀，加缓冲液1μl、T4DNA连接酶1U，于10μl体系中16℃连接过夜。连接产物10μl转化大肠杆菌DH5α后，提取少量重组质粒DNA进行酶切鉴定。酶切鉴定正确的重组质粒由上海生物工程公司进行序列测定。酶切及序列测定正确的重组质粒命名为pVa-XJ1。

用BamH I/EcoR I双酶切质粒T-XJ2和质粒pVa-XJ1分别纯化获得XJ2片段和线性pVa-XJ1，按摩尔比3∶1混匀，加缓冲液1μl、T4DNA连接酶1U，于10μl体系中16℃连接过夜。连接产物10μl转化大肠杆菌DH5α后，提取少量重组质粒DNA进行酶切鉴定。酶切鉴定正确的重组质粒由上海生物工程公司进行序列测定。酶切及序列测定正确的重组质粒命名为pVa-XJ1/2。

用EcoR I/Not I双酶切质粒T-XJ3和质粒pVa-XJ1/2分别纯化获得XJ3片段和线性pVa-XJ1/2，按摩尔比3∶1混匀，加缓冲液1μl、T4DNA连接酶1U，于10μl体系中16℃连接过夜。连接产物10μl转化大肠杆菌DH5α后，提取少量重组质粒DNA进行酶切鉴定。酶切鉴定正确的重组质粒由上海生物工程公司进行序列测定。酶切及序列测定正确的重组质粒命名为pVa-XJ1/2/3。

将Not I/Apa I双酶切MCS片段和质粒pVa-XJ1/2/3分别纯化后，按摩尔比3∶1混匀，加缓冲液1μl、T4DNA连接酶1U，于10μl体系中16℃连接过夜。连接产物10μl转化大肠杆菌DH5α后，提取少量重组质粒DNA进行酶切鉴定。酶切鉴定正确的重组质粒由上海生物工程公司进行序列测定。酶切及序列测定正确的重组质粒即为复制子载体pVa-XJ。

(三)结果：

成功构建了XJ-160病毒质粒型复制子载体pVa-XJ，复制子载体的构建过程见图1。用引入的单一限制性内切酶NotI，PvuI，FseI，PacI和AscI均可以将载体质粒线性化，可获得长约10.5kb的线性载体片段；用NheI/BamHI，BamHI/EcoRI和EcoRI/NotI双酶切均可获得长度约为2.5kb和8kb的线性片段，基因测序结果也表明所构建的载体序列正确。

二、含报告基因的XJ-160质粒型复制子载体的构建

(一)方法概述：

将绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorecent protein，EGFP)报告基因及海肾荧光素酶(Gaussia Luciferase，GLUC)报告基因分别插入复制子载体的多克隆位点构建了含有报告基因的表达质粒pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC，所用限制性内切酶双酶切位点为：FseI和AscI。含报告基因的XJ-160质粒型复制子载体的构建过程见图2。将报告基因表达质粒转染BHK-21细胞观察绿色荧光蛋白的表达情况及检测海肾荧光素酶的活性，对含报告基因的XJ-160质粒型复制子载体的功能进行鉴定。

(二)具体方法：

1.PCR扩增基因片段

1.1引物设计

根据重组质粒pEGFP-N1(Genbank no.U55762)和pCMV-GLUC-1(GenBank no.BC006663)设计XJ-160病毒载体系统表达质粒构建所需引物，并交由上海生物工程公司合成。如下表所示，EGFP(+)和EGFP(-)用于构建EGFP表达质粒，其位置根据pEGFP-N1给出，GLUC(+)和GLUC(-)用于构建GLUC表达质粒，其位置根据pCMV-GLUC-1给出。

EGFP(+)  ggccggccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC  (FseI位点)    679-700nt

EGFP(-)  ggcgcgccTTACTTGTACAGCTCGTCCATG  (AscI位点)    1398-1377nt

GLUC(+)  ggccggccGGATCCAGCCACCATG(FseI位点)    907-923nt

GLUC(-)  ggcgcgccATGCATGCTCGAGCGG(AscI位点)    1481-1497nt

1.2PCR扩增报告基因

(1)EGFP片段(679-1398nt)扩增

在0.2mlPCR管中配制50μl的反应体系

条件：94℃预变性3min；94℃15S，65℃30S，72℃1min，35个循环，72℃延伸10min。

(2)GLUC片段(907-1497nt)扩增

在0.2mlPCR管中配制50μl的反应体系

条件：94℃预变性3min；94℃ 15S，63℃ 30S，72℃ 1min，35个循环，72℃延伸10min。

2.基因片段的T-A亚克隆

按下列体系进行PCR产物连接：

反应体系10μl

混匀后，置于16℃连接过夜

转化连接产物：取上述连接产物10μl加入100μl DH5α感受态细胞内，置冰浴40min后，42℃热休克90s，再置冰浴3min，加入无氨苄青霉素的LB约700μl，在37℃摇床150r/min摇菌60min；取200μl菌液加入40μl X-gal及4μl IPTG，混匀后涂含氨苄青霉素(100μg/ml)LB琼脂平板，于37℃倒置培养约14-16h，直到可见清晰的蓝色和白色菌落。

挑取白色菌落于3ml已加入氨苄青霉素的LB培养液中37℃摇菌过夜，用质粒小提试剂盒(来自Takara公司)提取质粒30μl，取1μl作为PCR鉴定的模板进行质粒的PCR鉴定，PCR体系(25μl)如下：10×buffer 2.5μl，2.5mmol/l dNTPs 3.5ul，模板质粒1μl，上下游引物各1μl，聚合酶0.5μl，补ddH2O至25μl。PCR程序同前，鉴定正确的克隆送质粒进行测序，同时用75％的甘油保存菌液。测序正确的克隆分别命名为T-EGFP，T-G.LUC。

3.EGFP报告基因表达载体的构建

用Fse I/Asc I双酶切质粒T-EGFP和复制子载体质粒pVa-XJ分别纯化获得EGFP片段和线性pVa-XJ，按摩尔比3∶1混匀，加缓冲液1μl、T4DNA连接酶1U，于10μl体系中16℃连接过夜。连接产物10μl转化大肠杆菌DH5α后，提取少量重组质粒DNA进行酶切鉴定。酶切鉴定正确的重组质粒由上海生物工程公司进行序列测定。酶切及序列测定正确的重组质粒即为能够表达绿色荧光蛋白报告基因的复制子载体pVaXJ-EGFP。

4.GLUC报告基因表达载体的构建

用Fse I/Asc I双酶切质粒T-GLUC和复制子载体质粒pVa-XJ分别纯化获得GLUC片段和线性pVa-XJ，按摩尔比3∶1混匀，加缓冲液1μl、T4DNA连接酶1U，于10μl体系中16℃连接过夜。连接产物10μl转化大肠杆菌DH5α后，提取少量重组质粒DNA进行酶切鉴定。酶切鉴定正确的重组质粒由上海生物工程公司进行序列测定。酶切及序列测定正确的重组质粒即为能够表达绿色荧光蛋白报告基因的复制子载体pVaXJ-GLUC。

5报告基因表达的检测

5.1细胞转染

1.在24孔板中培养BHK细胞，细胞铺满80％～90％时待用；

2.将各待转质粒进行浓度测定；

3.用无抗生素无血清的培养基洗细胞一次。加入500ml无血清无抗生素的培养基。

4.加0.5μg质粒于25μL无血清DMEM培养基中，混匀；

5.取0.75μL或2μL FuGENE HD Transfection Reagent转染试剂于步骤3含质粒的培养基中(不要接触管壁)，混匀，室温放置15min或不放置；

6.将如上混合液加入种有细胞的24孔板中，轻轻摇晃混匀；

7.将24孔板放入CO₂培养箱中继续培养6h。

8.每孔补加50ul血清。继续培养。

5.2EGFP基因表达的检测

将绿色荧光蛋白基因表达质粒pVaXJ-EGFP转染BHK-21细胞后，在荧光显微镜观察EGFP的表达，并用荧光显微镜扫描记录细胞形态。

5.3GLUC基因表达的检测

在海肾荧光素酶表达质粒pVaXJ-GLUC转染BHK-21细胞后的不同时间点，收集细胞上清液，置于-70℃保存待检。使用NEB公司的海肾荧光素酶检测试剂盒(BioLux^TM GaussiaLuciferase Assay Kit)进行荧光素酶表达检测，操作方法见试剂盒说明书。在GloMax发光检测仪上检测G.luc活性，反应体系为每20μl细胞上清液加入50μl反应液，检测参数：2sec预读延迟，10sec检测时间。

(三)结果：

成功构建了含报告基因的XJ-160质粒型复制子pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC，构建过程见图2。用限制性内切酶FseI和AscI对构建的pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC进行双酶切鉴定，可得到长约0.7kb的EGFP基因片段、0.59kb的GLUC基因片段、和长约10.5kb的线性pVa-XJ。基因测序结果也表明所构建的载体序列正确。pVaXJ-EGFP转染BHK-21细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达，pVaXJ-GLUC转染BHK-21细胞后也检测到了活性GLUC的表达。表明构建的含报告基因的XJ-160质粒型复制子载体的功能正常。报告基因的表达检测情况见图5。

三、缺陷型XJ-160复制子载体的构建

(一)方法概述：

XJ-160病毒复制子载体的非结构基因区域存在2个AclI酶切位点，分别位于7005和8144碱基处。使用内切酶AclI对构建的pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC分别进行单酶切，弃掉切下的1139个碱基的片段，将酶切后的骨架质粒回收，使用T4连接酶进行连接，构建非结构基因部分缺失的缺陷型复制子pVaXJ-EGFPΔ和pVaXJ-GLUCΔ。缺陷型复制子的构建过程见图3和图4。将缺陷型复制子pVaXJ-EGFPΔ和pVaXJ-GLUCΔ分别转染BHK细胞，观察和测定报告基因的表达，并与非缺陷型复制子pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC进行比较。

(二)具体方法：

1.缺陷型复制子的构建

1.1AclI酶切含报告基因的XJ160复制子

使用内切酶AclI对构建的pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC分别进行单酶切。

单酶切反应体系：

1.2回收纯化骨架质粒

使用Qiagen的胶回收纯化试剂盒对酶切后的骨架质粒pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC进行回收纯化。纯化过程按试剂盒说明书进行。具体方法如下：

1.0％琼脂糖凝胶分离PCR产物；将割下的胶块放入1.5mL eppendorf管中；按每100mg琼脂糖加入300μL P1液，置55℃水浴10min，使琼脂糖完全熔化，每2min颠倒混匀一次；将熔化的琼脂糖液移入吸附柱，离心1min，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管；在吸附柱中加入500μL Wash buffer液，离心15sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管；在收集管中加入500μL Wash buffer液，静置1min，离心15sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管；离心1min；将吸附柱放入一个1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入30μL无菌水，静置1min后，离心1min，将得到的DNA储存备用。

1.3骨架质粒的连接

弃掉切下的1139个碱基的片段，将回收的酶切后的骨架质粒使用T4连接酶进行连接，

连接反应体系：

连接反应在16℃进行。

1.4连接质粒转化大肠杆菌

连接后的质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。

从-80℃冰箱取出100或200μL感受态DH5α菌体，在冰上放置5min，使其融化后加入10μL连接产物，冰浴60min，42℃热休克2min，迅速放回冰上冷却3min，加800μLLB液体培养基，在37℃，恒温摇床中175rpm震荡培养2.0h。

将转化后振荡培养的菌液8000rpm离心4min，在超净台中弃掉部分上清，留下约400μL培养基，将菌体沉淀吹打起来，均匀涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃恒温培养箱培养16h(先正着放30-60min，而后反过来放置)。

1.5.构建质粒的提取和鉴定：

挑取转化板上的单菌落，接种于5mL LB液体培养基中(含50μg/mL卡那霉素)，37℃，165rpm振荡培养过夜。使用Qiagen的质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取方法见试剂盒说明书。将提取的质粒送去北京博迈德公司进行测序鉴定。

2.报告基因表达检测

将缺陷型复制子pVaXJ-EGFPΔ和pVaXJ-GLUCΔ分别转染BHK细胞，观察和测定报告基因的表达，并与非缺陷型复制子pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC进行比较。具体方法参见含报告基因复制子载体构建具体方法的5。

(三)结果：

成功构建了含报告基因的缺陷型复制子pVaXJ-EGFPΔ和pVaXJ-GLUCΔ。缺陷型XJ-160复制子的构建流程见图3和图4。测序结果表明所构建的复制子质粒序列正确。报告基因的表达检测结果表明，与pVaXJ-EGFP相比，缺陷型复制子pVaXJ-EGFPΔ中EGFP表达明显受到影响，观察不到绿色荧光(图5A，5B)；同样，与pVaXJ-GLUC相比，缺陷型复制子pVaXJ-GLUCΔ中荧光素酶活性显著降低(图5C)，表明构建的缺陷型复制子中报告基因表达明显受到抑制，缺陷型复制子构建成功。

四、缺陷型复制子的功能验证

(一)方法：

为了对缺陷型复制子的甲病毒检测功能进行验证，使用构建的缺陷型复制子pVaXJ-EGFPΔ和pVaXJ-GLUCΔ对辛德毕斯病毒XJ-160感染进行检测。步骤如下：

①分别将0.5ug缺陷型复制子pVaXJ-EGFPΔ和pVaXJ-GLUCΔ转染24孔板中的BHK细胞，同时设立不转染复制子也不感染病毒的空白对照和只转染复制子不感染病毒的对照；

②转染6小时后，接入200uL XJ-160病毒，病毒吸附1小时后，补加300uL培养基；

③每隔一定时间吸取20uL培养上清液置于-20℃冰箱；

④用荧光素酶测定仪测定不同时间点吸取的样品中的荧光素酶活性，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况。

(二)结果：

荧光素酶测定结果表明，XJ-160病毒感染后6到44小时，GLUC表达量直线上升，之后逐渐下降，且与没有感染病毒的对照pVaXJ-GLUCΔ相比，GULC表达量明显升高，在感染后44小时，GLUC表达量约为pVaXJ-GLUCΔ中GLUC表达量的10倍(图6C)；同样，荧光显微镜观察结果显示，感染XJ-160病毒后，出现较多绿色荧光蛋白点(图6A)，而没有感染病毒的对照pVaXJ-EGFPΔ没有观察到绿色荧光蛋白表达(图6B)。该结果表明，基于缺陷型复制子的甲病毒检测系统功能正常，可以用于后续的甲病毒检测。五、缺陷型复制子的广谱性和特异性检测

(一)方法：

为了确定所建立的甲病毒检测系统的广谱性和特异性，对多种甲病毒及非甲病毒感染进行检测，使用本实验室保存的病毒株，其中甲病毒有辛德毕斯病毒(XJ-160、YN87448和MSP)、基孔肯雅病毒(chikungunya virus，CHIKV)和盖塔病毒(Getah virus，GETV)，非甲病毒为乙脑病毒(Japanese Encephalitis virus，JEV)。步骤如下：

①分别将0.5ug缺陷型复制子pVaXJ-EGFPΔ和pVaXJ-GLUCΔ转染24孔板中的BHK细胞，同时设立不转染复制子也不感染病毒的空白对照和只转染复制子不感染病毒的对照；

②转染6小时后，分别接入200uL XJ-160病毒、YN87448病毒、MSP病毒、CHIKV病毒、GETV病毒和JEV，病毒吸附1小时后，补加300uL培养基；

③病毒感染40小时后吸取20uL培养上清液置于-20℃冰箱；

④用荧光素酶测定仪测定吸取的样品中的荧光素酶活性，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况。

(二)结果：

荧光素酶测定结果表明，与没有感染病毒的对照pVaXJ-GLUCΔ相比，甲病毒感染后，GLUC表达量明显升高，XJ-160病毒、YN87448病毒、MSP病毒、CHIK病毒和GET病毒感染后GLUC活性分别为对照pVaXJ-GLUCΔ的10.2倍、9.2倍、7.4倍、5.6倍和5.3倍；而非甲病毒JEV感染后，GLUC活性仅为对照pVaXJ-GLUCΔ的0.39倍(图7A)。同样，荧光显微镜观察结果显示，各种甲病毒感染后，绿色荧光蛋白EGFP出现不同程度的增强表达，而非甲病毒JEV则没有可检测到的绿色荧光(图7B-7G)。如上结果表明，该甲病毒检测系统可以检测到多种甲病毒感染，具有较好的广谱性，同时该系统只对甲病毒感染有反应，而对同为RNA病毒的非甲病毒感染没有反应，具有较好的特异性。

六、缺陷型复制子的灵敏性检测

(一)方法：

为了确定所建立的甲病毒检测系统的灵敏性，对不同稀释度的多种甲病毒进行检测，使用本实验室保存的甲病毒株，有辛德毕斯病毒(XJ-160、YN87448和MSP)、基孔肯雅病毒(chikungunya virus，CHIKV)和盖塔病毒(Getah virus，GETV)。各甲病毒的滴度均约为10⁵PFU/mL。步骤如下：

①分别将0.5ug缺陷型复制子pVaXJ-EGFPΔ和pVaXJ-GLUCΔ转染24孔板中的BHK细胞，同时设立不转染复制子也不感染病毒的空白对照和只转染复制子不感染病毒的对照；

②转染6小时后，分别接入200uL不同稀释度的XJ-160病毒、YN87448病毒、MSP病毒、CHIK病毒和GET病毒，病毒吸附1小时后，补加300uL培养基；

③病毒感染40小时后吸取20uL培养上清液置于-20℃冰箱；

④用荧光素酶测定仪测定吸取的样品中的荧光素酶活性。

(二)结果：

荧光素酶测定结果表明，从10^-1到10^-7随着病毒稀释度的增加，荧光素酶GLUC的活性逐渐降低，到10^-6时降低到与对照pVaXJ-GLUCΔ相同的水平，因而该甲病毒检测系统最低能检测到10^-5稀释度的病毒，即可以检测到1PFU的病毒(见图8)。如上结果表明该甲病毒检测系统具有较好的灵敏性。

本发明中材料来源：

大肠杆菌DH5α感受态细胞购于TaKaRa公司；pBR-XJ160为本室构建的XJ-160病毒感染性全长cDNA克隆；pVAX1真核表达质粒购于Invitrogen公司；PCR高保真酶(Easy-AHigh-Fidelity PCR Cloning Enzyme)购自Stratagene公司；pMD^TM 19-T Simple Vector及质粒提取试剂盒购自TAKARA公司；T4DNA连接酶及各种限制性内切酶购自NEB公司；凝胶回收试剂盒/PCR产物纯化试剂盒(

Gel Extraction Kit /PCR PurificationKit)购自Qiagen公司；含有绿色荧光蛋白(Enhanced green-fluorescent protein，EGFP)报告基因的载体pEGFP-N1购于Clontech公司；含有海肾荧光素酶(Gaussia luciferase，GLUC)报告基因的载体pCMV-GLUC-1购于NEB公司；BHK-21细胞为本室保存；海肾荧光素酶检测试剂盒(Gaussia Luciferase Assay Kit)购于NEB公司。

XJ-160病毒感染性克隆pBR-XJ160序列(Genbank no.AY526355)。

参考文献

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8.杨益良，梁国栋，付士红，何海怀，李晓宇，邓娟，苏乃伦，王力华，侯云德.中国首次分离的辛德毕斯病毒xj-160病毒株感染性全基因组cdna克隆的构建与分析.病毒学报.2005；21：173-180

Claims (6)

1.一种辛德毕斯病毒XJ-160缺陷型复制子pVaXJ-EGFPΔ，其特征在于：

其序列为：

GACTCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA  60

ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA  120

ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT  180

AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA  240

CTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC  300

CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT  360

ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT  420

GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG  480

TCTCCACCCC ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC  540

AAAATGTCGT AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA  600

GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT GGCTTATCGA  660

AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCCA AGCTGGCTAG CATTGACGGC GTAGTACACA  720

CTATTGAATC AAACAGCCGA CCAATAGCAC TACCATCATA ATGGAGAGGC CTGTAGTTAA  780

CGTAGACGTA GACCCCCAGA GTCCGTTTGT CGCTCAACTG CAAAAGAGCT TCCCGCAATT  840

CGAGGTAGTA GCACAGCAGG CCACACCAAA TGACCATGCT AATGCCAGAG CATTTTCGCA  900

TCTGGCTAGT AAATTAATCG AGCTGGAGGT TCCTACCACA GCGACGATTT TGGACATAGG  960

CAGCGCACCG GCTCGTAGAA TGTTTTCCGA GCACCACTAT CACTGCGTCT GCCCTATGCG  1020

GAGCCCCGAA GATCCCGACC GTATGATGAA ATACGCCAAT AAGTTGGCGG AGAAGGCAAA  1080

TAAGATTACT AATAAAAATT TGCATGAGAA GATTAAAGAC CTCCGGATCG TACTCGATAC  1140

TCCGGATGCT GAGACACCGT CGCTCTGCTT CCATAATGAC GTTACCTGCA GTACGCGTGC  1200

AGAGTACTCC GTTATGCAAG ATGTGTATAT TAATGCACCC GGAACTATTT ACCATCAAGC  1260

TATGAAAGGC GTGCGGACAC TTTACTGGAT TGGGTTTGAC ACCACTCAGT TCATGTTCTC  1320

GGCTATGGCA GGATCATATC CTGCCTATAA TACTAACTGG GCCGATGAAA AAGTCCTTGA  1380

AGCACGCAAT ATTGGACTCT GTAGTACCAA GTTGAGCGAA GGCCGTATAG GAAAGTTGTC  1440

AATAATGAGG AAAAAGGAGT TGAAGCCCGG GTCACGGGTC TACTTCTCAG TGGGATCAAC  1500

ACTCTACCCA GAATATAGGG ACAGCTTACA GAGCTGGCAC CTCCCATCAG TGTTCCATCT  1560

GAAAGGAAAG CAATCGTATA CATGCCGCTG TGATACAGTG GTAAGTTGCG AAGGCTACGT  1620

AGTGAAGAAG ATCACTATTA GTCCCGGGAT TACGGGAGAA ACCGTGGGAT ACGCGGTTAC  1680

AAACAATAGC GAGGGTTTCT TGCTATGTAA AGTTACTGAC ACAGTAAAAG GGGAACGGGT  1740

CTCGTTCCCC GTGTGCACGT ATATCCCGGC CACCATATGC GACCAGATGA CAGGTATAAT  1800

GGCCACGGAT ATTTCACCTG ACGATGCACA GAAGCTTCTG GTTGGGCTCA ACCAGAGGAT  1860

TGTCATTAAC GGTAAAACCA ACAGGAACAC TAACACCATG CAAAACTACC TTCTACCGAT  1920

TATAGCACAA GGCTTCAGCA AGTGGGCTAA AGAGCGCAAA GAAGATCTTG ATAATGAAAA  1980

GAAGCTGGGC ACTAGGGAGC GTAAGCTTAT TTACGGGTGT CTATGGGCGG TTCGTACTAA  2040

GAAAGTGCAC TCGTTTTACC GCCCGCCCGG AACGCAGACC AGCGTGAAAG TCCCGGCATC  2100

TTTTAGCGCT TTTCCAATGT CATCTGTATG GACAACCTCA CTACCCATGT CGCTGAGGCA  2160

GAAGATAAAA TTGGTACTAC AACCGAAAAA GGAGGAGAAA TTACTGCAGG TCTCAGAAGA  2220

GTTAGTTGCG GAGGCTAAAG CGGCCTTTGA AGATGCACAG GAGGAGATCA GAGCGGAGCA  2280

ACTCCGTGAA GCACTTCCAC CACTGGTAGC AGACAAAGGT ATTGAAGCCG CTGCAGAAGT  2340 

CGTCTGTGAA GTGGAAGGGC TTCAAGCTGA TATAGGAGCA GCTCTTGTTG AGACGCCACG  2400

AGGGCATGTA AGGATTATAC CTCAAGTAAC AGACCGCATG ATTGGGCAGT ACATCGTGGT  2460

CTCACCAACC TCCGTGCTTA AGAACGCCAA ATTAACACCT GTTCACCCTT TGGCTGACCA  2520

AGTCAAAATT ATAACACATT CAGGGAGGAC AGGAAGATTC GCGGTGGAGC CGTATGATGC  2580

TAAAGTGTTG ATGCCAGCAG GTAGCGCCGT TCCATGGCCT GAGTTCCTGG CGTTAAGTGA  2640

AAGCGCCACG CTAGTGTATA ACGAAAGAGA ATTTGTCAAC CGCAAACTTT ACCATATCGC  2700

CATACATGGT CCCGCGAAGA ATACTGAAGA GGAGCAGTAT AAAGTCACTA AAGCCGAACT  2760

CGCAGAAACA GAGTATGTAT TTGATGTCGA CAAGAAGCGT TGCGTTAAGA AGGAAGAGGC  2820

CTCGGGGCTG GTTCTCTCGG GAGAACTAAC TAACCCACCG TATCATGAAA TGGCGCTTGA  2880

GGGGCTGAAG ACTCGACCCG CTGTTCCGTA TAAGGTCGAA ACAATAGGAG TAATAGGCAC  2940

ACCAGGATCA GGCAAGTCTG CGATTATTAA ATCGACCGTT ACCGTACGAG ATCTTGTTAC  3000

CAGCGGAAAG AAGGAAAACT GCCGTGAAAT TGAAACTGAC GTGTTGAGGT TGAGAGGTAT  3060

GCAGATCACG TCAAGGACGG TAGACTCAGT CATGCTTAAC GGATGCCATA AAGCCGTTGA  3120

GGTGCTATAC GTTGATGAAG CATTTGCGTG CCATGCTGGT ACGTTGCTTG CCTTGATCGC  3180

TATTGTTAGA CCCCGAAAGA AGGTAGTACT TCGCGGGGAT CCTAAGCAGT GTGGTTTTTT  3240

CAATATGATG CAGCTCAAAG TACATTTTAA TCACCCTGAA AAAGATATAT GTACTAAGAC  3300

GTTTTACAAA TTCATCTCTC GACGCTGCAC GCAACCAGTA ACGGCGATTG TTTCAACACT  3360

TCATTACGAC GGAAAGATGA AGACTACAAA CCCCTGCAAG AAGAGCATTG AGATAGATAT  3420

TACAGGTACT ACGAAGCCGA AGCCCGGGGA CCTCGTTTTG ACGTGCTTCC GCGGATGGGT  3480

CAAGCAGCTA CAGATCGATT ACGCGGGAAA TGAAGTGATG ACGGCTGCTG CCTCGCAGGG  3540

ACTGACTAGA AAGGGTGTTT ACGCCGTTCG GCAAAAAGTT AATGAGAATC CACTGTACGC  3600

GATTACGTCG GAGCACGTGA ACGTGTTACT CACCCGTACT GAGGATAGAT TAGTGTGGAA  3660

GACCTTACAG GGCGATCCAT GGATCAAACA ACTTACTAAC ATTCCGAAAG GAAACTTCCA  3720

AGCTACTATT GAGGACTGGG AAGCTGAACA TAAGGGGATC ATCGCTGCAA TAAACAGCCC  3780

AACCCCTCGT ATAAACCCGT TCAGCTGTAA GACTAATGTG TGCTGGGCGA AGGCACTGGA  3840

ACCGATACTG GCCACAGCCG GTATTGTCCT CACCGGTTGC CAGTGGAGTG AGCTGTTTCC  3900

ACAGTTCGTA GATGATAAAC CCCACTCAGC TATCTACGCC CTAGATGTGA TTTGTATTAA  3960

GTTCTTTGGT ATGGATCTGA CAAGCGGTCT ATTTTCAAAG CAGAGCATCC CTCTGACGTA  4020

CCACCCTGCG GACTCTGCAA GGCCAGTGGC GCATTGGGAC AACAGTCCAG GAACCCGAAA  4080

GTATGGATAC GATCATGCGG TTGCTGCCGA ATTGTCTCGT AGATTCCCGG TGTTCCAACT  4140

TGCTGGAAAA GGCACACAGC TTGACTTGCA GACTGGTAGA ACCAGAGTCG TTTCCGCGCA  4200

GTGTAACTTG GTCCCAGTGA ACCGTAACCT CCCGCACGCT CTTGTCCCCG AGTATAAAGA  4260

GAAACAACCC GGCCCGATTA AAAATTTTTT AAATCAGTTT AAGCATCACT CCATACTTGT  4320

AGTATCAGAA ACGAAAATCG AAGTTCCCAA TAAGCGCATC GAATGGATTG CACCGCTTGG  4380

CATAGCTGGT GCAGATAAGA GCTACAACCT GGCCTTCGGA TTTCCACCGC AGGCACGGTA  4440

TGATATGGTG TTTATCAATA TAGGAACAAA ATATAGAAAC CACCATTTTC AACAGTGTGA  4500

AGACCATGCG GCGACTTTGA AGACTCTTTC CCGCTCGGCT CTGAATTGCC TCAACCCTGG  4560

AGGCACCTTA GTGGTGAAAT CCTATGGATA TGCTGATCGC AATAGCGAGG ACGTAGTCAC  4620

CGCACTTGCC AGGAAGTTTG TTAGAGTGTC TGCGGCCAGG CCAGAGTGCG TCTCAAGTAA  4680

CACAGAAATG TACCTAATCT TTCGGCAATT AGATAATAGC CGTACACGGC AGTTCACTCC  4740

ACATCATTTG AACTGTGTAA TCTCGTCGGT GTATGAAGGC ACGAGAGAAG GAGTCGGAGC  4800

TGCGCCATCC TACCGTGTGA AACGGGAAAA TATTGCAGAC TGCCATGAGG AAGCAATCGT  4860

CAACGCCGCT AACTCGCTGG GTAAACCAGG TGAAGGAGTT TGCCGCGCCG TCTACAAGCG  4920

TTGGCCGAGC AGCTTTATGG ATTCCGCCAC AGAAACGGGT ACGGCTAAAT TAACTGTAAG  4980 

CCAAGGAATG AAAGTGATAC ACGCGGTCGG CCCTGACTTC CGTAAGTATC CTGAGGCGGA  5040

AGCTTTGAAG CTGCTGCAAA ACGCTTACCA TGCAGTGGCG GACTTGGTTA ACAAACACAA  5100

CATTAAGTCC ATTGCTATCC CGCTACTATC AACAGGTATA TATGCAGCTG GTAAGGATCG  5160

CTTGGAAGTT TCGCTCAATT GCCTGACCAC CGCACTAGAC AGGACCGATG CAGATGTAAC  5220

TATTTATTGT TTGGATAAGA AATGGAAAGA GAGAATTGAC GCGGTGTTGC AACTTAAGGA  5280

GTCAGTGACA GAACTGAAGG ACGAGGACAT GGAAATCGAT GACGAATTGG TATGGATTCA  5340

TCCGGATAGT TGTCTAAAAG GGAGAAAGGG ATACAGTACT ACAAAAGGAA AGCTATATTC  5400

GTACTTTGAG GGTACTAAAT TTCACCAAGC AGCCAAAGAT ATGGCTGAAA TAAAAGTGCT  5460

GTTTCCGGAC GACCAGGAAA GCAACGAACA GTTATGCGCT TACATACTGG GCGAAACCAT  5520

GGAAGCAATT CGTGAAAAAT GCCCAGTTGA TCGTAACCCG TCATCCAGTC CTCCGAAGAC  5580

GCTGCCTTGC CTTTGCATGT ATGCAATGAC TCCGGAAAGA GTTCATAGGC TCAGAAGTAA  5640

CAATGTTAAA GAAATTACTG TGTGCTCCTC GACCCCGCTT CCAAAATATA AGATTAAGAA  5700

CGTCCAGAAA GTCCAGTGCA CTAAAGTAGT CCTGTTTAAC CCGCACACTC CTACTTTTGT  5760

CCCGGCCCGT AAATATGTGG AAGTGCCAGA ATCACCTGCC ATCACACCTG TACAGGCCGA  5820

CACGCTAGAT CAGCCACCTG CCGCGGACGG AATTCCGCTT GATGTTACGG ACATTTCATT  5880

AAATATGGAA GATAGTAGCG AAGGATTGTC CATTTTAGAT TTCCACGGGT CAGAAAGTTC  5940

CATTTTTAGC ATGGATAGCT GGTCGTCAGG AACCAGTTCT TTGGGGCCAG AGGACAATAG  6000

AAGGCAAGTA GTGACAGTCG ATGTCCACTC CACCCAAGAG GATACTCCCA TTCCTCCTCC  6060

AAGGTTAAAG AAACTGGCCC GGTTAGCGGC GGCGAAACAG ACCCCAGTAG CACTTACCGT  6120

ATCGAATGAT GTGGGCTCAA TGGATGAGTC CCTCTGCCTT TCATTTGGCA GCGTATCCAT  6180

GTCTTTTGGA TCTTTTTCCG ACGGTGAGAT CGATGAAATA AGTCGTATGA AGACTGAGTC  6240

AGAACCCGTT TTATTTGGAA CTTTTGAACC TGGAGAAGTT AATTCCATTA TATCGTCTCG  6300

ATCAGCCGTG TCTTTTCCAC CGCTAAGGCA GAGACGTAGA CGTAGGAACA AGCGGACTGA  6360

ATACTGACTA ACCGGGGTAG GTGGGTACAT ATTTTCGACG GATACAGGGC CAGGACATCT  6420

GCAAAAGAAG TCTGTCTTGC AGAATCAATT TTCCGAACCG ACCTTGGAGC GTAACGTGCT  6480

GGAAAAGATA TACGCTCCGA CGCTTGATAC GTCGAAAGAA GAACTACTCA AATTTAGATA  6540

CCAAATGATG CCCACCGAAG CCAATAAGAG CAGGTACCAG TCCCGCAAAG TCGAAAATCA  6600

AAAAGCCGTC ACCACTGAGC GTTTGCTTTC AGGGTTACGG CTATATACCT CGGCAACTGA  6660

TCAGCCTGAA TGTTATAAAA TTACTTACCC GAAACCTTTG TATTCCAGCA GTGTACCAGC  6720

AAGTTACTCC GACCCGAAGT TCGCAGTTGC CGTCTGCAAT AACTACTTGC ATGAAAACTA  6780

CCCAACGGTA GCGTCCTACC AGATTACTGA TGAATACGAC GCTTACCTCG ATATGGTGGA  6840

TGGGACTGTC GCTTGCCTGG ACACCGCAAC ATTCTGCCCG GCTAAACTCA GAAGTTATCC  6900

AAAGAGGCAT GAGTATCGCG CACCGAATAT CCGTAGCGCA GTCCCGTCTG CTATGCAGAA  6960

CACGTTGCAA AACGTGCTCA TCGCTGCAAC CAAGAGGAAC TGCAACGTTT GCCCAGAGCA  7020

AAAATTCGTT TCAGGCCATT AGAGGAGAAA TAAAGCAACT CTACGGTGGT CCTAAATAGT  7080

CAGCATAGCA TATTTTATCT GACTAATACT GTAACACCCC TACTGCGGCC GCGATCGGCC  7140

GGCCCGCCAC CATGGTGAGC AAGGGCGAGG AGCTGTTCAC CGGGGTGGTG CCCATCCTGG  7200

TCGAGCTGGA CGGCGACGTA AACGGCCACA AGTTCAGCGT GTCCGGCGAG GGCGAGGGCG  7260

ATGCCACCTA CGGCAAGCTG ACCCTGAAGT TCATCTGCAC CACCGGCAAG CTGCCCGTGC  7320

CCTGGCCCAC CCTCGTGACC ACCCTGACCT ACGGCGTGCA GTGCTTCAGC CGCTACCCCG  7380

ACCACATGAA GCAGCACGAC TTCTTCAAGT CCGCCATGCC CGAAGGCTAC GTCCAGGAGC  7440

GCACCATCTT CTTCAAGGAC GACGGCAACT ACAAGACCCG CGCCGAGGTG AAGTTCGAGG  7500

GCGACACCCT GGTGAACCGC ATCGAGCTGA AGGGCATCGA CTTCAAGGAG GACGGCAACA  7560

TCCTGGGGCA CAAGCTGGAG TACAACTACA ACAGCCACAA CGTCTATATC ATGGCCGACA  7620 

AGCAGAAGAA CGGCATCAAG GTGAACTTCA AGATCCGCCA CAACATCGAG GACGGCAGCG  7680

TGCAGCTCGC CGACCACTAC CAGCAGAACA CCCCCATCGG CGACGGCCCC GTGCTGCTGC  7740

CCGACAACCA CTACCTGAGC ACCCAGTCCG CCCTGAGCAA AGACCCCAAC GAGAAGCGCG  7800

ATCACATGGT CCTGCTGGAG TTCGTGACCG CCGCCGGGAT CACTCTCGGC ATGGACGAGC  7860

TGTACAAGTA AGGCGCGCCT CTTTTATCAA TTAACCAAAA TTTTGTTTTT AACATTTCAA  7920

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAGGGCCCG TTTAAACCCG CTGATCAGCC  7980

TCGACTGTGC CTTCTAGTTG CCAGCCATCT GTTGTTTGCC CCTCCCCCGT GCCTTCCTTG  8040

ACCCTGGAAG GTGCCACTCC CACTGTCCTT TCCTAATAAA ATGAGGAAAT TGCATCGCAT  8100

TGTCTGAGTA GGTGTCATTC TATTCTGGGG GGTGGGGTGG GGCAGGACAG CAAGGGGGAG  8160

GATTGGGAAG ACAATAGCAG GCATGCTGGG GATGCGGTGG GCTCTATGGC TTCTACTGGG  8220

CGGTTTTATG GACAGCAAGC GAACCGGAAT TGCCAGCTGG GGCGCCCTCT GGTAAGGTTG  8280

GGAAGCCCTG CAAAGTAAAC TGGATGGCTT TCTCGCCGCC AAGGATCTGA TGGCGCAGGG  8340

GATCAAGCTC TGATCAAGAG ACAGGATGAG GATCGTTTCG CATGATTGAA CAAGATGGAT  8400

TGCACGCAGG TTCTCCGGCC GCTTGGGTGG AGAGGCTATT CGGCTATGAC TGGGCACAAC  8460

AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCCGTGT TCCGGCTGTC AGCGCAGGGG CGCCCGGTTC  8520

TTTTTGTCAA GACCGACCTG TCCGGTGCCC TGAATGAACT GCAAGACGAG GCAGCGCGGC  8580

TATCGTGGCT GGCCACGACG GGCGTTCCTT GCGCAGCTGT GCTCGACGTT GTCACTGAAG  8640

CGGGAAGGGA CTGGCTGCTA TTGGGCGAAG TGCCGGGGCA GGATCTCCTG TCATCTCACC  8700

TTGCTCCTGC CGAGAAAGTA TCCATCATGG CTGATGCAAT GCGGCGGCTG CATACGCTTG  8760

ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCACCAAG CGAAACATCG CATCGAGCGA GCACGTACTC  8820

GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG ATCTGGACGA AGAGCATCAG GGGCTCGCGC  8880

CAGCCGAACT GTTCGCCAGG CTCAAGGCGA GCATGCCCGA CGGCGAGGAT CTCGTCGTGA  8940

CCCATGGCGA TGCCTGCTTG CCGAATATCA TGGTGGAAAA TGGCCGCTTT TCTGGATTCA  9000

TCGACTGTGG CCGGCTGGGT GTGGCGGACC GCTATCAGGA CATAGCGTTG GCTACCCGTG  9060

ATATTGCTGA AGAGCTTGGC GGCGAATGGG CTGACCGCTT CCTCGTGCTT TACGGTATCG  9120

CCGCTCCCGA TTCGCAGCGC ATCGCCTTCT ATCGCCTTCT TGACGAGTTC TTCTGAATTA  9180

TTAACGCTTA CAATTTCCTG ATGCGGTATT TTCTCCTTAC GCATCTGTGC GGTATTTCAC  9240

ACCGCATACA GGTGGCACTT TTCGGGGAAA TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTTTATTTTT  9300

CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA  9360

ATAGCACGTG CTAAAACTTC ATTTTTAATT TAAAAGGATC TAGGTGAAGA TCCTTTTTGA  9420

TAATCTCATG ACCAAAATCC CTTAACGTGA GTTTTCGTTC CACTGAGCGT CAGACCCCGT  9480

AGAAAAGATC AAAGGATCTT CTTGAGATCC TTTTTTTCTG CGCGTAATCT GCTGCTTGCA  9540

AACAAAAAAA CCACCGCTAC CAGCGGTGGT TTGTTTGCCG GATCAAGAGC TACCAACTCT  9600

TTTTCCGAAG GTAACTGGCT TCAGCAGAGC GCAGATACCA AATACTGTCC TTCTAGTGTA  9660

GCCGTAGTTA GGCCACCACT TCAAGAACTC TGTAGCACCG CCTACATACC TCGCTCTGCT  9720

AATCCTGTTA CCAGTGGCTG CTGCCAGTGG CGATAAGTCG TGTCTTACCG GGTTGGACTC  9780

AAGACGATAG TTACCGGATA AGGCGCAGCG GTCGGGCTGA ACGGGGGGTT CGTGCACACA  9840

GCCCAGCTTG GAGCGAACGA CCTACACCGA ACTGAGATAC CTACAGCGTG AGCTATGAGA  9900

AAGCGCCACG CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC GGACAGGTAT CCGGTAAGCG GCAGGGTCGG  9960

AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCTTCCAGG GGGAAACGCC TGGTATCTTT ATAGTCCTGT  10020

CGGGTTTCGC CACCTCTGAC TTGAGCGTCG ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG GGGGGCGGAG  10080

CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCTT TTTACGGTTC CTGGGCTTTT GCTGGCCTTT  10140

TGCTCACATG TTCTT                                                   10155 

其中：

702-7124             为病毒非结构基因序列

7004-7009            为Acl I酶切位点

7137-7144            为Fse I酶切位点

7152-7871            为EGFP基因序列

7872-7879            为Asc I酶切位点

7919-7953            为poly A位点

1-701及7959-10155    为骨架质粒PVAX1序列。

2.一种辛德毕斯病毒XJ-160缺陷型复制子pVaXJ-GLUCΔ，其特征在于：

GACTCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA  60

ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA  120

ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT  180

AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA  240

CTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC  300

CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT  360

ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT  420

GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG  480

TCTCCACCCC ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC  540

AAAATGTCGT AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA  600

GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT GGCTTATCGA  660

AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCCA AGCTGGCTAG CATTGACGGC GTAGTACACA  720

CTATTGAATC AAACAGCCGA CCAATAGCAC TACCATCATA ATGGAGAGGC CTGTAGTTAA  780

CGTAGACGTA GACCCCCAGA GTCCGTTTGT CGCTCAACTG CAAAAGAGCT TCCCGCAATT  840

CGAGGTAGTA GCACAGCAGG CCACACCAAA TGACCATGCT AATGCCAGAG CATTTTCGCA  900

TCTGGCTAGT AAATTAATCG AGCTGGAGGT TCCTACCACA GCGACGATTT TGGACATAGG  960

CAGCGCACCG GCTCGTAGAA TGTTTTCCGA GCACCACTAT CACTGCGTCT GCCCTATGCG  1020

GAGCCCCGAA GATCCCGACC GTATGATGAA ATACGCCAAT AAGTTGGCGG AGAAGGCAAA  1080

TAAGATTACT AATAAAAATT TGCATGAGAA GATTAAAGAC CTCCGGATCG TACTCGATAC  1140

TCCGGATGCT GAGACACCGT CGCTCTGCTT CCATAATGAC GTTACCTGCA GTACGCGTGC  1200

AGAGTACTCC GTTATGCAAG ATGTGTATAT TAATGCACCC GGAACTATTT ACCATCAAGC  1260

TATGAAAGGC GTGCGGACAC TTTACTGGAT TGGGTTTGAC ACCACTCAGT TCATGTTCTC  1320

GGCTATGGCA GGATCATATC CTGCCTATAA TACTAACTGG GCCGATGAAA AAGTCCTTGA  1380

AGCACGCAAT ATTGGACTCT GTAGTACCAA GTTGAGCGAA GGCCGTATAG GAAAGTTGTC  1440

AATAATGAGG AAAAAGGAGT TGAAGCCCGG GTCACGGGTC TACTTCTCAG TGGGATCAAC  1500

ACTCTACCCA GAATATAGGG ACAGCTTACA GAGCTGGCAC CTCCCATCAG TGTTCCATCT  1560

GAAAGGAAAG CAATCGTATA CATGCCGCTG TGATACAGTG GTAAGTTGCG AAGGCTACGT  1620

AGTGAAGAAG ATCACTATTA GTCCCGGGAT TACGGGAGAA ACCGTGGGAT ACGCGGTTAC  1680

AAACAATAGC GAGGGTTTCT TGCTATGTAA AGTTACTGAC ACAGTAAAAG GGGAACGGGT  1740

CTCGTTCCCC GTGTGCACGT ATATCCCGGC CACCATATGC GACCAGATGA CAGGTATAAT  1800

GGCCACGGAT ATTTCACCTG ACGATGCACA GAAGCTTCTG GTTGGGCTCA ACCAGAGGAT  1860

TGTCATTAAC GGTAAAACCA ACAGGAACAC TAACACCATG CAAAACTACC TTCTACCGAT  1920

TATAGCACAA GGCTTCAGCA AGTGGGCTAA AGAGCGCAAA GAAGATCTTG ATAATGAAAA  1980

GAAGCTGGGC ACTAGGGAGC GTAAGCTTAT TTACGGGTGT CTATGGGCGG TTCGTACTAA  2040 

GAAAGTGCAC TCGTTTTACC GCCCGCCCGG AACGCAGACC AGCGTGAAAG TCCCGGCATC  2100

TTTTAGCGCT TTTCCAATGT CATCTGTATG GACAACCTCA CTACCCATGT CGCTGAGGCA  2160

GAAGATAAAA TTGGTACTAC AACCGAAAAA GGAGGAGAAA TTACTGCAGG TCTCAGAAGA  2220

GTTAGTTGCG GAGGCTAAAG CGGCCTTTGA AGATGCACAG GAGGAGATCA GAGCGGAGCA  2280

ACTCCGTGAA GCACTTCCAC CACTGGTAGC AGACAAAGGT ATTGAAGCCG CTGCAGAAGT  2340

CGTCTGTGAA GTGGAAGGGC TTCAAGCTGA TATAGGAGCA GCTCTTGTTG AGACGCCACG  2400

AGGGCATGTA AGGATTATAC CTCAAGTAAC AGACCGCATG ATTGGGCAGT ACATCGTGGT  2460

CTCACCAACC TCCGTGCTTA AGAACGCCAA ATTAACACCT GTTCACCCTT TGGCTGACCA  2520

AGTCAAAATT ATAACACATT CAGGGAGGAC AGGAAGATTC GCGGTGGAGC CGTATGATGC  2580

TAAAGTGTTG ATGCCAGCAG GTAGCGCCGT TCCATGGCCT GAGTTCCTGG CGTTAAGTGA  2640

AAGCGCCACG CTAGTGTATA ACGAAAGAGA ATTTGTCAAC CGCAAACTTT ACCATATCGC  2700

CATACATGGT CCCGCGAAGA ATACTGAAGA GGAGCAGTAT AAAGTCACTA AAGCCGAACT  2760

CGCAGAAACA GAGTATGTAT TTGATGTCGA CAAGAAGCGT TGCGTTAAGA AGGAAGAGGC  2820

CTCGGGGCTG GTTCTCTCGG GAGAACTAAC TAACCCACCG TATCATGAAA TGGCGCTTGA  2880

GGGGCTGAAG ACTCGACCCG CTGTTCCGTA TAAGGTCGAA ACAATAGGAG TAATAGGCAC  2940

ACCAGGATCA GGCAAGTCTG CGATTATTAA ATCGACCGTT ACCGTACGAG ATCTTGTTAC  3000

CAGCGGAAAG AAGGAAAACT GCCGTGAAAT TGAAACTGAC GTGTTGAGGT TGAGAGGTAT  3060

GCAGATCACG TCAAGGACGG TAGACTCAGT CATGCTTAAC GGATGCCATA AAGCCGTTGA  3120

GGTGCTATAC GTTGATGAAG CATTTGCGTG CCATGCTGGT ACGTTGCTTG CCTTGATCGC  3180

TATTGTTAGA CCCCGAAAGA AGGTAGTACT TCGCGGGGAT CCTAAGCAGT GTGGTTTTTT  3240

CAATATGATG CAGCTCAAAG TACATTTTAA TCACCCTGAA AAAGATATAT GTACTAAGAC  3300

GTTTTACAAA TTCATCTCTC GACGCTGCAC GCAACCAGTA ACGGCGATTG TTTCAACACT  3360

TCATTACGAC GGAAAGATGA AGACTACAAA CCCCTGCAAG AAGAGCATTG AGATAGATAT  3420

TACAGGTACT ACGAAGCCGA AGCCCGGGGA CCTCGTTTTG ACGTGCTTCC GCGGATGGGT  3480

CAAGCAGCTA CAGATCGATT ACGCGGGAAA TGAAGTGATG ACGGCTGCTG CCTCGCAGGG  3540

ACTGACTAGA AAGGGTGTTT ACGCCGTTCG GCAAAAAGTT AATGAGAATC CACTGTACGC  3600

GATTACGTCG GAGCACGTGA ACGTGTTACT CACCCGTACT GAGGATAGAT TAGTGTGGAA  3660

GACCTTACAG GGCGATCCAT GGATCAAACA ACTTACTAAC ATTCCGAAAG GAAACTTCCA  3720

AGCTACTATT GAGGACTGGG AAGCTGAACA TAAGGGGATC ATCGCTGCAA TAAACAGCCC  3780

AACCCCTCGT ATAAACCCGT TCAGCTGTAA GACTAATGTG TGCTGGGCGA AGGCACTGGA  3840

ACCGATACTG GCCACAGCCG GTATTGTCCT CACCGGTTGC CAGTGGAGTG AGCTGTTTCC  3900

ACAGTTCGTA GATGATAAAC CCCACTCAGC TATCTACGCC CTAGATGTGA TTTGTATTAA  3960

GTTCTTTGGT ATGGATCTGA CAAGCGGTCT ATTTTCAAAG CAGAGCATCC CTCTGACGTA  4020

CCACCCTGCG GACTCTGCAA GGCCAGTGGC GCATTGGGAC AACAGTCCAG GAACCCGAAA  4080

GTATGGATAC GATCATGCGG TTGCTGCCGA ATTGTCTCGT AGATTCCCGG TGTTCCAACT  4140

TGCTGGAAAA GGCACACAGC TTGACTTGCA GACTGGTAGA ACCAGAGTCG TTTCCGCGCA  4200

GTGTAACTTG GTCCCAGTGA ACCGTAACCT CCCGCACGCT CTTGTCCCCG AGTATAAAGA  4260

GAAACAACCC GGCCCGATTA AAAATTTTTT AAATCAGTTT AAGCATCACT CCATACTTGT  4320

AGTATCAGAA ACGAAAATCG AAGTTCCCAA TAAGCGCATC GAATGGATTG CACCGCTTGG  4380

CATAGCTGGT GCAGATAAGA GCTACAACCT GGCCTTCGGA TTTCCACCGC AGGCACGGTA  4440

TGATATGGTG TTTATCAATA TAGGAACAAA ATATAGAAAC CACCATTTTC AACAGTGTGA  4500

AGACCATGCG GCGACTTTGA AGACTCTTTC CCGCTCGGCT CTGAATTGCC TCAACCCTGG  4560

AGGCACCTTA GTGGTGAAAT CCTATGGATA TGCTGATCGC AATAGCGAGG ACGTAGTCAC  4620

CGCACTTGCC AGGAAGTTTG TTAGAGTGTC TGCGGCCAGG CCAGAGTGCG TCTCAAGTAA  4680 

CACAGAAATG TACCTAATCT TTCGGCAATT AGATAATAGC CGTACACGGC AGTTCACTCC  4740

ACATCATTTG AACTGTGTAA TCTCGTCGGT GTATGAAGGC ACGAGAGAAG GAGTCGGAGC  4800

TGCGCCATCC TACCGTGTGA AACGGGAAAA TATTGCAGAC TGCCATGAGG AAGCAATCGT  4860

CAACGCCGCT AACTCGCTGG GTAAACCAGG TGAAGGAGTT TGCCGCGCCG TCTACAAGCG  4920

TTGGCCGAGC AGCTTTATGG ATTCCGCCAC AGAAACGGGT ACGGCTAAAT TAACTGTAAG  4980

CCAAGGAATG AAAGTGATAC ACGCGGTCGG CCCTGACTTC CGTAAGTATC CTGAGGCGGA  5040

AGCTTTGAAG CTGCTGCAAA ACGCTTACCA TGCAGTGGCG GACTTGGTTA ACAAACACAA  5100

CATTAAGTCC ATTGCTATCC CGCTACTATC AACAGGTATA TATGCAGCTG GTAAGGATCG  5160

CTTGGAAGTT TCGCTCAATT GCCTGACCAC CGCACTAGAC AGGACCGATG CAGATGTAAC  5220

TATTTATTGT TTGGATAAGA AATGGAAAGA GAGAATTGAC GCGGTGTTGC AACTTAAGGA  5280

GTCAGTGACA GAACTGAAGG ACGAGGACAT GGAAATCGAT GACGAATTGG TATGGATTCA  5340

TCCGGATAGT TGTCTAAAAG GGAGAAAGGG ATACAGTACT ACAAAAGGAA AGCTATATTC  5400

GTACTTTGAG GGTACTAAAT TTCACCAAGC AGCCAAAGAT ATGGCTGAAA TAAAAGTGCT  5460

GTTTCCGGAC GACCAGGAAA GCAACGAACA GTTATGCGCT TACATACTGG GCGAAACCAT  5520

GGAAGCAATT CGTGAAAAAT GCCCAGTTGA TCGTAACCCG TCATCCAGTC CTCCGAAGAC  5580

GCTGCCTTGC CTTTGCATGT ATGCAATGAC TCCGGAAAGA GTTCATAGGC TCAGAAGTAA  5640

CAATGTTAAA GAAATTACTG TGTGCTCCTC GACCCCGCTT CCAAAATATA AGATTAAGAA  5700

CGTCCAGAAA GTCCAGTGCA CTAAAGTAGT CCTGTTTAAC CCGCACACTC CTACTTTTGT  5760

CCCGGCCCGT AAATATGTGG AAGTGCCAGA ATCACCTGCC ATCACACCTG TACAGGCCGA  5820

CACGCTAGAT CAGCCACCTG CCGCGGACGG AATTCCGCTT GATGTTACGG ACATTTCATT  5880

AAATATGGAA GATAGTAGCG AAGGATTGTC CATTTTAGAT TTCCACGGGT CAGAAAGTTC  5940

CATTTTTAGC ATGGATAGCT GGTCGTCAGG AACCAGTTCT TTGGGGCCAG AGGACAATAG  6000

AAGGCAAGTA GTGACAGTCG ATGTCCACTC CACCCAAGAG GATACTCCCA TTCCTCCTCC  6060

AAGGTTAAAG AAACTGGCCC GGTTAGCGGC GGCGAAACAG ACCCCAGTAG CACTTACCGT  6120

ATCGAATGAT GTGGGCTCAA TGGATGAGTC CCTCTGCCTT TCATTTGGCA GCGTATCCAT  6180

GTCTTTTGGA TCTTTTTCCG ACGGTGAGAT CGATGAAATA AGTCGTATGA AGACTGAGTC  6240

AGAACCCGTT TTATTTGGAA CTTTTGAACC TGGAGAAGTT AATTCCATTA TATCGTCTCG  6300

ATCAGCCGTG TCTTTTCCAC CGCTAAGGCA GAGACGTAGA CGTAGGAACA AGCGGACTGA  6360

ATACTGACTA ACCGGGGTAG GTGGGTACAT ATTTTCGACG GATACAGGGC CAGGACATCT  6420

GCAAAAGAAG TCTGTCTTGC AGAATCAATT TTCCGAACCG ACCTTGGAGC GTAACGTGCT  6480

GGAAAAGATA TACGCTCCGA CGCTTGATAC GTCGAAAGAA GAACTACTCA AATTTAGATA  6540

CCAAATGATG CCCACCGAAG CCAATAAGAG CAGGTACCAG TCCCGCAAAG TCGAAAATCA  6600

AAAAGCCGTC ACCACTGAGC GTTTGCTTTC AGGGTTACGG CTATATACCT CGGCAACTGA  6660

TCAGCCTGAA TGTTATAAAA TTACTTACCC GAAACCTTTG TATTCCAGCA GTGTACCAGC  6720

AAGTTACTCC GACCCGAAGT TCGCAGTTGC CGTCTGCAAT AACTACTTGC ATGAAAACTA  6780

CCCAACGGTA GCGTCCTACC AGATTACTGA TGAATACGAC GCTTACCTCG ATATGGTGGA  6840

TGGGACTGTC GCTTGCCTGG ACACCGCAAC ATTCTGCCCG GCTAAACTCA GAAGTTATCC  6900

AAAGAGGCAT GAGTATCGCG CACCGAATAT CCGTAGCGCA GTCCCGTCTG CTATGCAGAA  6960

CACGTTGCAA AACGTGCTCA TCGCTGCAAC CAAGAGGAAC TGCAACGTTT GCCCAGAGCA  7020

AAAATTCGTT TCAGGCCATT AGAGGAGAAA TAAAGCAACT CTACGGTGGT CCTAAATAGT  7080

CAGCATAGCA TATTTTATCT GACTAATACT GTAACACCCC TACTGCGGCC GCGATCGGCC  7140

GGCCCGCCAC CATGGGAGTC AAAGTTCTGT TTGCCCTGAT CTGCATCGCT GTGGCCGAGG  7200

CCAAGCCCAC CGAGAACAAC GAAGACTTCA ACATCGTGGC CGTGGCCAGC AACTTCGCGA  7260

CCACGGATCT CGATGCTGAC CGCGGGAAGT TGCCCGGCAA GAAGCTGCCG CTGGAGGTGC  7320 

TCAAAGAGAT GGAAGCCAAT GCCCGGAAAG CTGGCTGCAC CAGGGGCTGT CTGATCTGCC  7380

TGTCCCACAT CAAGTGCACG CCCAAGATGA AGAAGTTCAT CCCAGGACGC TGCCACACCT  7440

ACGAAGGCGA CAAAGAGTCC GCACAGGGCG GCATAGGCGA GGCGATCGTC GACATTCCTG  7500

AGATTCCTGG GTTCAAGGAC TTGGAGCCCA TGGAGCAGTT CATCGCACAG GTCGATCTGT  7560

GTGTGGACTG CACAACTGGC TGCCTCAAAG GGCTTGCCAA CGTGCAGTGT TCTGACCTGC  7620

TCAAGAAGTG GCTGCCGCAA CGCTGTGCGA CCTTTGCCAG CAAGATCCAG GGCCAGGTGG  7680

ACAAGATCAA GGGGGCCGGT GGTGACTAAG GCGCGCCTCT TTTATCAATT AACCAAAATT  7740

TTGTTTTTAA CATTTCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AGGGCCCGTT  7800

TAAACCCGCT GATCAGCCTC GACTGTGCCT TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC  7860

TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT  7920

GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG TGTCATTCTA TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG  7980

CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC  8040

TCTATGGCTT CTACTGGGCG GTTTTATGGA CAGCAAGCGA ACCGGAATTG CCAGCTGGGG  8100

CGCCCTCTGG TAAGGTTGGG AAGCCCTGCA AAGTAAACTG GATGGCTTTC TCGCCGCCAA  8160

GGATCTGATG GCGCAGGGGA TCAAGCTCTG ATCAAGAGAC AGGATGAGGA TCGTTTCGCA  8220

TGATTGAACA AGATGGATTG CACGCAGGTT CTCCGGCCGC TTGGGTGGAG AGGCTATTCG  8280

GCTATGACTG GGCACAACAG ACAATCGGCT GCTCTGATGC CGCCGTGTTC CGGCTGTCAG  8340

CGCAGGGGCG CCCGGTTCTT TTTGTCAAGA CCGACCTGTC CGGTGCCCTG AATGAACTGC  8400

AAGACGAGGC AGCGCGGCTA TCGTGGCTGG CCACGACGGG CGTTCCTTGC GCAGCTGTGC  8460

TCGACGTTGT CACTGAAGCG GGAAGGGACT GGCTGCTATT GGGCGAAGTG CCGGGGCAGG  8520

ATCTCCTGTC ATCTCACCTT GCTCCTGCCG AGAAAGTATC CATCATGGCT GATGCAATGC  8580

GGCGGCTGCA TACGCTTGAT CCGGCTACCT GCCCATTCGA CCACCAAGCG AAACATCGCA  8640

TCGAGCGAGC ACGTACTCGG ATGGAAGCCG GTCTTGTCGA TCAGGATGAT CTGGACGAAG  8700

AGCATCAGGG GCTCGCGCCA GCCGAACTGT TCGCCAGGCT CAAGGCGAGC ATGCCCGACG  8760

GCGAGGATCT CGTCGTGACC CATGGCGATG CCTGCTTGCC GAATATCATG GTGGAAAATG  8820

GCCGCTTTTC TGGATTCATC GACTGTGGCC GGCTGGGTGT GGCGGACCGC TATCAGGACA  8880

TAGCGTTGGC TACCCGTGAT ATTGCTGAAG AGCTTGGCGG CGAATGGGCT GACCGCTTCC  8940

TCGTGCTTTA CGGTATCGCC GCTCCCGATT CGCAGCGCAT CGCCTTCTAT CGCCTTCTTG  9000

ACGAGTTCTT CTGAATTATT AACGCTTACA ATTTCCTGAT GCGGTATTTT CTCCTTACGC  9060

ATCTGTGCGG TATTTCACAC CGCATACAGG TGGCACTTTT CGGGGAAATG TGCGCGGAAC  9120

CCCTATTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC AAATATGTAT CCGCTCATGA GACAATAACC  9180

CTGATAAATG CTTCAATAAT AGCACGTGCT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA  9240

GGTGAAGATC CTTTTTGATA ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA  9300

CTGAGCGTCA GACCCCGTAG AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG  9360

CGTAATCTGC TGCTTGCAAA CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA  9420

TCAAGAGCTA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA  9480

TACTGTCCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC  9540

TACATACCTC GCTCTGCTAA TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG  9600

TCTTACCGGG TTGGACTCAA GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC  9660

GGGGGGTTCG TGCACACAGC CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT  9720

ACAGCGTGAG CTATGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC  9780

GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG  9840

GTATCTTTAT AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG  9900

CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT  9960 

GGGCTTTTGC TGGCCTTTTG CTCACATGTT CTT    9993

其中：

702-7124             为病毒非结构基因序列

7004-7009            为Acl I酶切位点

7137-7144            为Fse I酶切位点

7152-7709            为GLUC基因序列

7710-7717            为Asc I酶切位点

7757-7791            为poly A位点

1-701及7798-9993     为骨架质粒PVAX1序列。

3.一种权利要求1或2所述的一种辛德毕斯病毒XJ-160缺陷型复制子的构建方法，其特征在于：

①XJ-160病毒质粒型复制子载体的构建：将辛德毕斯病毒XJ-160的全基因组序列中的结构基因替换为多克隆位点MCS，将该片段克隆到真核表达质粒pVAX1中构建XJ-160病毒质粒型复制子载体pVa-XJ；

②含报告基因的XJ-160质粒型复制子的构建：在质粒型复制子载体的多克隆位点处分别插入两种报告基因，即绿色荧光蛋白基因EGFP和海肾荧光素酶基因GLUC，构建XJ-160病毒报告基因标记型复制子质粒pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC；

③XJ-160缺陷型复制子的构建：利用Acl I限制性内切酶分别单酶切pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC，构建非结构基因处存在1139个碱基缺失的缺陷型质粒pVaXJ-EGFPΔ和pVaXJ-GLUCΔ。

4.根据权利要求3所述的缺陷型复制子的构建方法，其特征在于：所述的MCS序列为

5’-CTCGAGCGCGCGGCCGCGATCGGCCGGCCTTAATTAAGGCGCGCCTCTTTTA TCAATTAACCAAAATTTTGTTTTTAACATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAGGGCCCCCTTT-3’。

5.一种应用权利要求1或2所述的缺陷型复制子检测甲病毒的方法。

6.根据权利要求5所述的缺陷型复制子检测甲病毒的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

1)细胞培养：在24孔板中培养BHK细胞，细胞铺满80％～90％时待用；

2)转染缺陷型复制子质粒：使用罗氏公司的 

HD转染试剂将0.5ug的缺陷型复制子转入BHK细胞，分为两组，一组转染pVaXJ-EGFPΔ，另一组转染pVaXJ-GLUCΔ，同时设立不转染复制子也不感染病毒的空白对照和只转染复制子不感染病毒的对照；

3)样品感染：细胞转染6小时后，取200uL待测样品加入细胞，吸附1小时后，每孔补加300uL培养基。 

4)收样：转染pVaXJ-GLUCΔ的组，每隔一定时间从细胞板的各孔中吸取20uL上清液加入1.5mL的EP管中，置于-20℃冰箱，用于荧光素酶GLUC活性测定；

5)转染pVaXJ-GLUCΔ的组进行GLUC活性测定；转染了pVaXJ-EGFPΔ的组在荧光显微镜下进行绿色荧光观察。 

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