CN1621527A - XJ－160病毒感染性全基因组cDNA克隆 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种XJ－160病毒感染性全基因组cDNA克隆pBR－XJ160，该克隆由骨架质粒pBR、含11620个碱基对的病毒基因组全长cDNA、基因组5’端的SP6启动子序列和基因组3’端的35个连续的A组成。其中所述的骨架质粒pBR由线性化的质粒pBR322与含单酶切位点的连接子连接而成；所述的病毒基因组全长cDNA由三个cDNA组装片段通过所述单酶切位点插入骨架质粒pBR组装而成，三个组装片段顺次连接，覆盖了XJ－160病毒的全长基因组；所述的SP6启动子序列位于基因组5’端上游紧邻第一个核苷酸A，所述的35个连续的A紧邻基因组3’末端核甘酸C，该克隆可在宿主菌中稳定传代，其RNA转录体转染宿主细胞后可以产生恢复病毒(BR－XJ160)，并可以通过遗传标记的鉴定区分恢复病毒与亲本病毒。恢复病毒(BR－XJ160)较好的重现了XJ－160病毒的各种生物学特征，该感染性全基因组cDNA克隆是理想的XJ－160病毒的反向遗传学系统。

Description

XJ-160病毒感染性全基因组cDNA克隆

技术领域

本发明涉及一种XJ-160病毒的反向遗传学系统，特别是涉及XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆及其构建方法。

背景技术

近二十年来随着反向遗传学技术的发展，RNA病毒的研究取得了重大突破。简单来说，反向遗传学技术就是首先利用逆转录PCR(RT-PCR)技术将病毒的RNA基因组转化为cDNA，然后在DNA水平上完成对RNA病毒基因组的操作，如：进行人为修饰和改造等，最后利用体内/外转录技术或其它的方法将基因组cDNA转回到RNA状态，成为改造后新的病毒基因组，并最终利用宿主细胞获得具有目的表型的重组病毒。反向遗传学技术使研究人员对RNA病毒基因组的操作成为可能，大大方便了RNA病毒的研究。目前该技术已经广泛应用于各类RNA病毒的研究中，为研究RNA病毒的生命机理、致病机制和病毒与宿主细胞之间关系提供了关键的技术平台⁽¹⁾。

感染性克隆是利用反向遗传学技术建立的一种反向遗传学系统，其表现形式是将RNA病毒的全长基因组cDNA克隆到一个载体中，获得一个稳定的含有全长基因组cDNA的克隆，利用这样的克隆转录得到新的病毒RNA基因组，从而实现对RNA病毒的操作。由于正链RNA病毒的RNA基因组可行使mRNA的功能，单一的裸露RNA即具有感染性的特性，使感染性克隆这种反向遗传学技术在正链RNA病毒的研究中应用更为普遍⁽²⁾。正链RNA病毒成员较多，分别属于小RNA病毒科、披膜病毒科、黄病毒科、杯状病毒科、冠状病毒科等，对于每一种病毒来说，其各种机理的阐明很大程度上得益于建立的感染性克隆。获得RNA病毒感染性cDNA克隆可以大大提高对RNA病毒研究的潜力，借助基因组感染性克隆可以进一步揭示病毒基因组的分子特征，使单个功能基因的研究不再是脱离病毒整体的孤立研究。从整个基因组水平来研究错综复杂、相互关联的病毒与宿主的关系具有独特的优势。RNA病毒感染性克隆也为新型病毒疫苗的研制和新型病毒载体的开发提供了极好的分子生物学研究工具。

披膜病毒作为一类正链RNA病毒，含有成员众多并主要集中在甲病毒属，在各大洲均有分布。甲病毒属包含一类导致严重脑炎的病毒如：东部马脑炎病毒(Eastern EquineEncephalitis Virus，EEE)、西部马脑炎病毒(Western Equine Encephalitis Virus，WEE)和委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis Virus，VEE)和另一类引起发热、皮疹和关节炎的病毒如辛德毕斯病毒(Sindbis virus，SIN)、西门利克森林病毒(Semliki Foiestvirus，SFV)、罗斯河病毒(RossRiver virus，RR)等。其中SIN、SFV、RR、VEE等多种病毒株的感染性克隆的建立^{(3，4，5，6)}及应用为甲病毒的基因功能、调控模式和病毒的致病机理的阐明提供了重要的研究手段。特别是辛德毕斯病毒作为披膜病毒科甲病毒属的代表病毒，在病毒形态、基因组结构、病毒复制等方面均集中表现了动物病毒的基本特性，成为研究动物病毒的模式病毒。辛德毕斯病毒感染性克隆在甲病毒的研究和开发中起着重要作用，而且来自不同地域的分离株的感染性克隆都将有利于从多角度充分揭示甲病毒的生命机理。

XJ-160病毒是我国于1990年首次分离的病毒，全基因组核苷酸序列测定⁽⁷⁾表明该病毒株具有典型的辛德毕斯病毒基因组结构，除5’帽子结构和3’polyA尾外，基因组全长总共11626个核苷酸，全序列已经录入GenBank(AF103728)。同源性分析表明该病毒株与目前国际上已知的辛德毕斯病毒株相比，其核苷酸和氨基酸的变异较大，提示XJ-160病毒为辛德毕斯病毒新亚型⁽⁸⁾。该XJ-160病毒已申请中国发明专利(申请号为98120692.1)。

为了从基因组水平研究XJ-160病毒与国外同类病毒的差异性，以及进一步深入阐明XJ-160病毒的复制机制和致病机理，为病毒性传染病的预防和控制提供理论依据，我们构建了XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆。

发明内容

本发明目的是提供XJ-160病毒感染性全基因组cDNA克隆，它包括XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆及其构建方法，还提供一种可作为制备RNA病毒全长基因组感染性cDNA克隆的骨架质粒以及用途。本发明是利用低拷贝质粒作骨架构建而成的，其克隆的稳定性好；该感染性克隆具有清晰的遗传学背景，感染性克隆来源的恢复病毒较好的重现了XJ-160病毒的各种生物学特征。

为达到上述目的本发明采用以下技术方案：

本发明中感染性cDNA克隆的构建方案是：首先获得覆盖病毒基因组全长的cDNA片段，然后选择适合的克隆载体，将若干cDNA片段在载体上组装成病毒基因组全长cDNA；同时在病毒基因组序列5’端加上RNA聚合酶启动子序列，在3’端加上polyA尾序列和单一限制性内切酶识别序列；通过体外转录获得转录体RNA，然后转染到宿主细胞中，通过细胞病变、噬斑检测、间接免疫荧光等多项指标来检测转染RNA后是否产生恢复病毒。

本发明提供了一种XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆，该克隆由骨架质粒pBR、含11620个碱基对的病毒基因组全长cDNA、基因组5’端的SP6启动子序列和基因组3’端的35个连续的A组成。其中所述的骨架质粒pBR由线性化的质粒pBR322与含单酶切位点的连接子连接而成；所述的病毒基因组全长cDNA由三个cDNA组装片段通过所述单酶切位点插入骨架质粒pBR组装而成，三个组装片段顺次连接，覆盖了XJ-160病毒的全长基因组；所述的SP6启动子序列位于基因组5’端上游紧邻第一个核苷酸A，所述的35个连续的A紧邻基因组3’末端核甘酸C。

其感染性全基因组cDNA的序列为：

1   ATTGACGGCG TAGTACACAC TATTGAATCA AACAGCCGAC CAATAGCACT

51  ACCATCATAA TGGAGAGGCC TGTAGTTAAC GTAGACGTAG ACCCCCAGAG

101 TCCGTTTGTC GCTCAACTGC AAAAGAGCTT CCCGCAATTC GAGGTAGTAG

151 CACAGCAGGC CACACCAAAT GACCATGCTA ATGCCAGAGC ATTTTCGCAT

201 CTGGCTAGTA AATTAATCGA GCTGGAGGTT CCTACCACAG CGACGATTTT

251 GGACATAGGC AGCGCACCGG CTCGTAGAAT GTTTTCCGAG CACCACTATC

301 ACTGCGTCTG CCCTATGCGG AGCCCCGAAG ATCCCGACCG TATGATGAAA

351 TACGCCAATA AGTTGGCGGA GAAGGCAAAT AAGATTACTA ATAAAAATTT

401 GCATGAGAAG ATTAAAGACC TCCGGATCGT ACTCGATACT CCGGATGCTG

451 AGACACCGTC GCTCTGCTTC CATAATGACG TTACCTGCAG TACGCGTGCA

501   GAGTACTCCG  TTATGCAAGA  TGTGTATATT  AATGCACCCG  GAACTATTTA

551   CCATCAAGCT  ATGAAAGGCG  TGCGGACACT  TTACTGGATT  GGGTTTGACA

601   CCACTCAGTT  CATGTTCTCG  GCTATGGCAG  GATCATATCC  TGCCTATAAT

651   ACTAACTGGG  CCGATGAAAA  AGTCCTTGAA  GCACGCAATA  TTGGACTCTG

701   TAGTACCAAG  TTGAGCGAAG  GCCGTATAGG  AAAGTTGTCA  ATAATGAGGA

751   AAAAGGAGTT  GAAGCCCGGG  TCACGGGTCT  ACTTCTCAGT  GGGATCAACA

801   CTCTACCCAG  AATATAGGGA  CAGCTTACAG  AGCTGGCACC  TCCCATCAGT

851   GTTCCATCTG  AAAGGAAAGC  AATCGTATAC  ATGCCGCTGT  GATACAGTGG

901   TAAGTTGCGA  AGGCTACGTA  GTGAAGAAGA  TCACTATTAG  TCCCGGGATT

951   ACGGGAGAAA  CCGTGGGATA  CGCGGTTACA  AACAATAGCG  AGGGTTTCTT

1001  GCTATGTAAA  GTTACTGACA  CAGTAAAAGG  GGAACGGGTC  TCGTTCCCCG

1051  TGTGCACGTA  TATCCCGGCC  ACCATATGCG  ACCAGATGAC  AGGTATAATG

1101  GCCACGGATA  TTTCACCTGA  CGATGCACAG  AAGCTTCTGG  TTGGGCTCAA

1151  CCAGAGGATT  GTCATTAACG  GTAAAACCAA  CAGGAACACT  AACACCATGC

1201  AAAACTACCT  TCTACCGATT  ATAGCACAAG  GCTTCAGCAA  GTGGGCTAAA

1251  GAGCGCAAAG  AAGATCTTGA  TAATGAAAAG  AAGCTGGGCA  CTAGGGAGCG

1301  TAAGCTTATT  TACGGGTGTC  TATGGGCGGT  TCGTACTAAG  AAAGTGCACT

1351  CGTTTTACCG  CCCGCCCGGA  ACGCAGACCA  GCGTGAAAGT  CCCGGCATCT

1401  TTTAGCGCTT  TTCCAATGTC  ATCTGTATGG  ACAACCTCAC  TACCCATGTC

1451  GCTGAGGCAG  AAGATAAAAT  TGGTACTACA  ACCGAAAAAG  GAGGAGAAAT

1501  TACTGCAGGT  CTCAGAAGAG  TTAGTTGCGG  AGGCTAAAGC  GGCCTTTGAA

1551  GATGCACAGG  AGGAGATCAG  AGCGGAGCAA  CTCCGTGAAG  CACTTCCACC

1601  ACTGGTAGCA  GACAAAGGTA  TTGAAGCCGC  TGCAGAAGTC  GTCTGTGAAG

1651  TGGAAGGGCT  TCAAGCTGAT  ATAGGAGCAG  CTCTTGTTGA  GACGCCACGA

1701  GGGCATGTAA  GGATTATACC  TCAAGTAACA  GACCGCATGA  TTGGGCAGTA

1751  CATCGTGGTC  TCACCAACCT  CCGTGCTTAA  GAACGCCAAA  TTAACACCTG

1801  TTCACCCTTT  GGCTGACCAA  GTCAAAATTA  TAACACATTC  AGGGAGGACA

1851  GGAAGATTCG  CGGTGGAGCC  GTATGATGCT  AAAGTGTTGA  TGCCAGCAGG

1901  TAGCGCCGTT  CCATGGCCTG  AGTTCCTGGC  GTTAAGTGAA  AGCGCCACGC

1951  TAGTGTATAA  CGAAAGAGAA  TTTGTCAACC  GCAAACTTTA  CCATATCGCC

2001  ATACATGGTC  CCGCGAAGAA  TACTGAAGAG  GAGCAGTATA  AAGTCACTAA

2051  AGCCGAACTC  GCAGAAACAG  AGTATGTATT  TGATGTCGAC  AAGAAGCGTT

2101  GCGTTAAGAA  GGAAGAGGCC  TCGGGGCTGG  TTCTCTCGGG  AGAACTAACT

2151  AACCCACCGT  ATCATGAAAT  GGCGCTTGAG  GGGCTGAAGA  CTCGACCCGC

2201  TGTTCCGTAT  AAGGTCGAAA  CAATAGGAGT  AATAGGCACA  CCAGGATCAG

2251  GCAAGTCTGC  GATTATTAAA  TCGACCGTTA  CCGTACGAGA  TCTTGTTACC

2301  AGCGGAAAGA  AGGAAAACTG  CCGTGAAATT  GAAACTGACG  TGTTGAGGTT

2351  GAGAGGTATG  CAGATCACGT  CAAGGACGGT  AGACTCAGTC  ATGCTTAACG

2401  GATGCCATAA  AGCCGTTGAG  GTGCTATACG  TTGATGAAGC  ATTTGCGTGC

2451  CATGCTGGTA  CGTTGCTTGC  CTTGATCGCT  ATTGTTAGAC  CCCGAAAGAA

2501  GGTAGTACTT  CGCGGGGATC  CTAAGCAGTG  TGGTTTTTTC  AATATGATGC

2551  AGCTCAAAGT  ACATTTTAAT  CACCCTGAAA  AAGATATATG  TACTAAGACG

2601  TTTTACAAAT  TCATCTCTCG  ACGCTGCACG  CAACCAGTAA  CGGCGATTGT

2651  TTCAACACTT  CATTACGACG  GAAAGATGAA  GACTACAAAC  CCCTGCAAGA

2701  AGAGCATTGA  GATAGATATT  ACAGGTACTA  CGAAGCCGAA  GCCCGGGGAC

2751  CTCGTTTTGA  CGTGCTTCCG  CGGATGGGTC  AAGCAGCTAC  AGATCGATTA

2801  CGCGGGAAAT  GAAGTGATGA  CGGCTGCTGC  CTCGCAGGGA  CTGACTAGAA

2851  AGGGTGTTTA  CGCCGTTCGG  CAAAAAGTTA  ATGAGAATCC  ACTGTACGCG

2901  ATTACGTCGG  AGCACGTGAA  CGTGTTACTC  ACCCGTACTG  AGGATAGATT

2951  AGTGTGGAAG  ACCTTACAGG  GCGATCCATG  GATCAAACAA  CTTACTAACA

3001  TTCCGAAAGG  AAACTTCCAA  GCTACTATTG  AGGACTGGGA  AGCTGAACAT

3051  AAGGGGATCA  TCGCTGCAAT  AAACAGCCCA  ACCCCTCGTA  TAAACCCGTT

3101  CAGCTGTAAG  ACTAATGTGT  GCTGGGCGAA  GGCACTGGAA  CCGATACTGG

3151  CCACAGCCGG  TATTGTCCTC  ACCGGTTGCC  AGTGGAGTGA  GCTGTTTCCA

3201  CAGTTCGTAG  ATGATAAACC  CCACTCAGCT  ATCTACGCCC  TAGATGTGAT

3251  TTGTATTAAG  TTCTTTGGTA  TGGATCTGAC  AAGCGGTCTA  TTTTCAAAGC

3301  AGAGCATCCC  TCTGACGTAC  CACCCTGCGG  ACTCTGCAAG  GCCAGTGGCG

3351  CATTGGGACA  ACAGTCCAGG  AACCCGAAAG  TATGGATACG  ATCATGCGGT

3401  TGCTGCCGAA  TTGTCTCGTA  GATTCCCGGT  GTTCCAACTT  GCTGGAAAAG

3451  GCACACAGCT  TGACTTGCAG  ACTGGTAGAA  CCAGAGTCGT  TTCCGCGCAG

3501  TGTAACTTGG  TCCCAGTGAA  CCGTAACCTC  CCGCACGCTC  TTGTCCCCGA

3551  GTATAAAGAG  AAACAACCCG  GCCCGATTAA  AAATTTTTTA  AATCAGTTTA

3601  AGCATCACTC  CATACTTGTA  GTATCAGAAA  CGAAAATCGA  AGTTCCCAAT

3651  AAGCGCATCG  AATGGATTGC  ACCGCTTGGC  ATAGCTGGTG  CAGATAAGAG

3701  CTACAACCTG  GCCTTCGGAT  TTCCACCGCA  GGCACGGTAT  GATATGGTGT

3751  TTATCAATAT  AGGAACAAAA  TATAGAAACC  ACCATTTTCA  ACAGTGTGAA

3801  GACCATGCGG  CGACTTTGAA  GACTCTTTCC  CGCTCGGCTC  TGAATTGCCT

3851  CAACCCTGGA  GGCACCTTAG  TGGTGAAATC  CTATGGATAT  GCTGATCGCA

3901  ATAGCGAGGA  CGTAGTCACC  GCACTTGCCA  GGAAGTTTGT  TAGAGTGTCT

3951  GCGGCCAGGC  CAGAGTGCGT  CTCAAGTAAC  ACAGAAATGT  ACCTAATCTT

4001  TCGGCAATTA  GATAATAGCC  GTACACGGCA  GTTCACTCCA  CATCATTTGA

4051  ACTGTGTAAT  CTCGTCGGTG  TATGAAGGCA  CGAGAGAAGG  AGTCGGAGCT

4101  GCGCCATCCT  ACCGTGTGAA  ACGGGAAAAT  ATTGCAGACT  GCCATGAGGA

4151  AGCAATCGTC  AACGCCGCTA  ACTCGCTGGG  TAAACCAGGT  GAAGGAGTTT

4201  GCCGCGCCGT  CTACAAGCGT  TGGCCGAGCA  GCTTTATGGA  TTCCGCCACA

4251  GAAACGGGTA  CGGCTAAATT  AACTGTAAGC  CAAGGAATGA  AAGTGATACA

4301  CGCGGTCGGC  CCTGACTTCC  GTAAGTATCC  TGAGGCGGAA  GCTTTGAAGC

4351  TGCTGCAAAA  CGCTTACCAT  GCAGTGGCGG  ACTTGGTTAA  CAAACACAAC

4401  ATTAAGTCCA  TTGCTATCCC  GCTACTATCA  ACAGGTATAT  ATGCAGCTGG

4451  TAAGGATCGC  TTGGAAGTTT  CGCTCAATTG  CCTGACCACC  GCACTAGACA

4501  GGACCGATGC  AGATGTAACT  ATTTATTGTT  TGGATAAGAA  ATGGAAAGAG

4551  AGAATTGACG  CGGTGTTGCA  ACTTAAGGAG  TCAGTGACAG  AACTGAAGGA

4601  CGAGGACATG  GAAATCGATG  ACGAATTGGT  ATGGATTCAT  CCGGATAGTT

4651  GTCTAAAAGG  GAGAAAGGGA  TACAGTACTA  CAAAAGGAAA  GCTATATTCG

4701  TACTTTGAGG  GTACTAAATT  TCACCAAGCA  GCCAAAGATA  TGGCTGAAAT

4751  AAAAGTGCTG  TTTCCGGACG  ACCAGGAAAG  CAACGAACAG  TTATGCGCTT

4801  ACATACTGGG  CGAAACCATG  GAAGCAATTC  GTGAAAAATG  CCCAGTTGAT

4851  CGTAACCCGT  CATCCAGTCC  TCCGAAGACG  CTGCCTTGCC  TTTGCATGTA

4901  TGCAATGACT  CCGGAAAGAG  TTCATAGGCT  CAGAAGTAAC  AATGTTAAAG

4951  AAATTACTGT  GTGCTCCTCG  ACCCCGCTTC  CAAAATATAA  GATTAAGAAC

5001  GTCCAGAAAG  TCCAGTGCAC  TAAAGTAGTC  CTGTTTAACC  CGCACACTCC

5051  TACTTTTGTC  CCGGCCCGTA  AATATGTGGA  AGTGCCAGAA  TCACCTGCCA

5101  TCACACCTGT  ACAGGCCGAC  ACGCTAGATC  AGCCACCTGC  CGCGGACGGT

5151  ATACCGCTTG  ATGTTACGGA  CATTTCATTA  AATATGGAAG  ATAGTAGCGA

5201  AGGATTGTCC  ATTTTAGATT  TCCACGGGTC  AGAAAGTTCC  ATTTTTAGCA

5251  TGGATAGCTG  GTCGTCAGGA  ACCAGTTCTT  TGGGGCCAGA  GGACAATAGA

5301   AGGCAAGTAG  TGACAGTCGA  TGTCCACTCC  ACCCAAGAGG  ATACTCCCAT

5351   TCCTCCTCCA  AGGTTAAAGA  AACTGGCCCG  GTTAGCGGCG  GCGAAACAGA

5401   CCCCAGTAGC  ACTTACCGTA  TCGAATGATG  TGGGCTCAAT  GGATGAGTCC

5451   CTCTGCCTTT  CATTTGGCAG  CGTATCCATG  TCTTTTGGAT  CTTTTTCCGA

5501   CGGTGAGATC  GATGAAATAA  GTCGTATGAA  GACTGAGTCA  GAACCCGTTT

5551   TATTTGGAAC  TTTTGAACCT  GGAGAAGTTA  ATTCCATTAT  ATCGTCTCGA

5601   TCAGCCGTGT  CTTTTCCACC  GCTAAGGCAG  AGACGTAGAC  GTAGGAACAA

5651   GCGGACTGAA  TACTGACTAA  CCGGGGTAGG  TGGGTACATA  TTTTCGACGG

5701   ATACAGGGCC  AGGACATCTG  CAAAAGAAGT  CTGTCTTGCA  GAATCAATTT

5751   TCCGAACCGA  CCTTGGAGCG  TAACGTGCTG  GAAAAGATAT  ACGCTCCGAC

5801   GCTTGATACG  TCGAAAGAAG  AACTACTCAA  ATTTAGATAC  CAAATGATGC

5851   CCACCGAAGC  CAATAAGAGC  AGGTACCAGT  CCCGCAAAGT  CGAAAATCAA

5901   AAAGCCGTCA  CCACTGAGCG  TTTGCTTTCA  GGGTTACGGC  TATATACCTC

5951   GGCAACTGAT  CAGCCTGAAT  GTTATAAAAT  TACTTACCCG  AAACCTTTGT

6001   ATTCCAGCAG  TGTACCAGCA  AGTTACTCCG  ACCCGAAGTT  CGCAGTTGCC

6051   GTCTGCAATA  ACTACTTGCA  TGAAAACTAC  CCAACGGTAG  CGTCCTACCA

6101   GATTACTGAT  GAATACGACG  CTTACCTCGA  TATGGTGGAT  GGGACTGTCG

6151   CTTGCCTGGA  CACCGCAACA  TTCTGCCCGG  CTAAACTCAG  AAGTTATCCA

6201   AAGAGGCATG  AGTATCGCGC  ACCGAATATC  CGTAGCGCAG  TCCCGTCTGC

6251   TATGCAGAAC  ACGTTGCAAA  ACGTGCTCAT  CGCTGCAACC  AAGAGGAACT

6301   GCAACGTTAC  ACAAATGCGT  GAACTACCAA  CGCTGGACTC  AGCGACGTTT

6351   AACGTCGAGT  GCTTTAAAAA  ATATGCGTGC  AACAATGAAT  ACTGGGAAGA

6401   GTTTGCCCGT  AAACCAATTA  GAATTACCAC  GGAGTTCGTT  ACTGCGTATG

6451   TAGCCAGACT  GAAAGGACCA  AAGGCAGCAG  CCTTATTTGC  AAAGACGTAC

6501   AATTTGGTCC  CATTGCAAGA  GGTACCCATG  GATAGGTTTG  TTATGGATAT

6551   GAAAAGAGAT  GTGAAAGTCA  CACCAGGTAC  CAAGCACACC  GAAGAGAGAC

6601   CAAAGGTGCA  GGTAATCCAA  GCTGCAGAGC  CACTAGCGAC  GGCATATTTG

6651   TGCGGAATCC  ATCGCGAGTT  GGTGCGTAGA  CTTACGGCGG  TGTTGCTACC

6701   TAACATTCAT  ACACTTTTTG  ATATGTCAGC  AGAGGACTTT  GACGCTATTA

6751   TAGCCGAACA  CTTTAAACAT  GGCGATCCGG  TGCTGGAGAC  AGATATTGCT

6801   TCATTCGATA  AGAGCCAAGA  TGACGCTATG  GCGTTGACTG  GCCTGATGAT

6851   CTTGGAAGAT  CTAGGCGTGG  ATCACCTACT  ACTCGACTTA  ATTGAGTGTG

6901   CCTTTGGTGA  AATATCGTCA  ACACACTTGC  CCACGGGCAC  TCGTTTCAAA

6951   TTTGGTGCAA  TGATGAAATC  CGGAATGTTT  CTTACATTAT  TCGTTAACAC

7001   AGTTTTGAAT  GTTGTGATCG  CCTGCAGAGT  ACTAGAGGAA  AGGCTTAAGA

7051   TGTCGAGATG  CGCGGCGTTT  ATCGGCGACG  ATAACATTAT  ACACGGGGTA

7101   GTGTCTGATA  AGGTGATGGC  AGAGAGGTGC  GCCACCTGGC  TTAACATGGA

7151   AGTTAAGATT  ATCGACGCCA  TTATCGGTGA  GAGACCACCG  TATTTTTGCG

7201   GTGGATTTAT  TCTGCAAGAC  TCAGTCACTT  CCACAGCGTG  CCGCGTGGCC

7251   GACCCACTGA  AAAGATTATT  TAAGCTTGGT  AAACCGCTAC  CAGCCGACGA

7301   CGAGCAAGAC  GAAGATAGAA  GGCGAGCTTT  ATTGGACGAA  ACAAAGGCGT

7351   GGTTCAGAGT  GGGCATTACT  GATACTTTAG  CAACTGCTGT  AGCAACCCGG

7401   TACGAGGTAG  ATAATATCAC  ACCTGTCTTA  TTGGCATTGA  GAACGTTTGC

7451   CCAGAGCAAA  AATTCGTTTC  AGGCCATTAG  AGGAGAAATA  AAGCAACTCT

7501   ACGGTGGTCC  TAAATAGTCA  GCATAGCATA  TTTTATCTGA  CTAATACTGT

7551   AACACCCCTA  CTATGAATAG  AGGATTCTTT  AACATGCTTG  GCCGCCGCCC

7601   CTTCCCGGCC  CCCACTTCTA  TGTGGAGGCC  ACGTAGAAGG  AGGCAGGCGG

7651   CCCCGATGCC  CGCCCGCAAC  GGGTTGGCTT  CCCAAATTCA  GCAGCTTACC

7701  ACAGCAGTTA  GCGCCTTGGT  TATAGGACAG  GCAGCTAGAC  CTCAACAGCC

7751  ACGTCCTCGC  CCGCCACCCC  GCCAAAAGAA  GCAGCCGCCA  AAGCAATTAC

7801  CAAAACCGAA  GAAACCGAAA  ACACAGGATA  AGAAGAAGCG  ACAGCCCGCG

7851  AAGCCGAAAC  CTGGAAAGAG  GCAGCGCATG  GCGCTTAAGC  TAGAGGCCGA

7901  CAGACTGTTT  GATGTTAAGA  ACGAGAATGG  TGATGTCATC  GGACATGCTC

7951  TGGCCATGGA  AGGAAAAGTA  ATGAAACCAC  TCCACGTGAA  AGGAACTATA

8001  GATCACCCAG  TGCTGTCGAA  GCTTAAATTC  ACCAAGTCGT  CGGCATATGA

8051  CATGGAGTTT  GCACAACTTC  CTGTCAATAT  GCGAAGCGAA  GCTTTCACGT

8101  ACACCAGCGA  GCACCCAGAA  GGATTCTATA  ACTGGCACCA  TGGCGCAGTG

8151  CAGTATAGTG  GAGGTAGATT  CACTATTCCG  CGTGGAGTAG  GAGGCAGAGG

8201  TGACAGCGGC  CGCCCGATTA  TGGACAACGC  AGGCCGCGTC  GTCGCTATCG

8251  TCCTCGGAGG  AGCTGATGAG  GGAACACGTA  CTGCCCTCTC  GGTAGTTACC

8301  TGGAACAGTA  AAGGAAAAAC  GATTAAGACA  TCCCCTGAGG  GAACTGAAGA

8351  GTGGTCCGCA  GCACCGCTGG  TTACGGCCAT  GTGCTTACTT  GGAAATGTAA

8401  GCTTCCCTTG  CAACCGTCCG  CCTACTTGCT  ACACCCGCGA  ACCATCTAGA

8451  GCGTTAGATA  TCCTGGAAGA  GAATGTGAAC  CATGAGGACT  ACGACACTTT

8501  GCTCGACGCT  ATACTGCGAT  GCGATTTTTC  CGGTAGAAAT  AAAAGAAGTG

8551  TTACCGGCGA  CTTTACCTTG  ACCAGCCCGT  ACCTAGGTAC  ATGTCCATAC

8601  TGTCACCATA  CCGAGCCGTG  CTTTAGTCCG  ATAAAGATCG  AGCAGGTCTG

8651  GGATGAAGCG  GATGACACCA  CTATACGCAT  CCAGACCTCT  GCCCAATTTG

8701  GGTACGATCA  GAGTGGAGCG  ACAAGCGTAA  ATAAATACCG  CTACATGTCG

8751  TTCGATCAGG  ATCATACTGT  GAAAGAAGGC  CAGATGGACG  ATATTAAGAT

8801  CAGTACTTCA  GGACCGTGCA  GAAGACTTGG  CCATAAAGGT  TACTTCCTCC

8851  TTGCGAAATG  TCCGCCCGGG  GACAGCGTGA  CGGTCAGTAT  AGTGAGCAGC

8901  AGTTCAACTA  CATCATGCAC  GTTGGCACGT  AAGATAAAAC  CGAAGTTTGT

8951  GGGACGGGAA  CGGTATGATC  TGCCCCCCGT  TTACGGAAAG  AACATCCCTT

9001  GCAGAATGTA  CGACCGTCTG  AAAGAAACGT  CTGCTGGCTA  TATTACTATG

9051  CACAGACCTG  GCCCACATGC  CTACACGTCC  TATCTGGAGG  AAGCGTCCGG

9101  AAAAATTTAC  GCTAAGCCAC  CATCCGGAAA  GAATATTACC  TACGAGTGTA

9151  AATGCGGAGA  CTATAAAACA  GGAACGGTAA  AAACCCGCAC  TGAAATTACT

9201  GGCTGCACTG  CCATTAAGCA  GTGTGTCGCT  TATAAGAGCG  ACCAAACGAA

9251  GTGGGTCTTT  AACTCACCCG  ACCTGATAAG  GCATGCCGAT  CACGCTGCAC

9301  AAGGAAAGTT  GCATTTACCT  TTTAGATTGG  TCCCGAGTTC  CTGCAAGGTC

9351  CCAGTGGCTC  ACGCACCGAG  TGTAGTGCAC  GGCTTCAAAC  ACATTAGCCT

9401  CCAACTGGAT  ACGGACCACC  TGACACTGCT  CACCACCAGG  AGACTAGGAG

9451  CGAATCCCGA  ACCAACCTCC  GAATGGATTA  TCGGTAAGAC  TGTTAGAAAT

9501  TTTTCTGTTG  GACGGGACGG  CTTGGAGTAT  ACGTGGGGCA  ACCACGACCC

9551  GGTAAGAGTT  TACGCTCAAG  AATCAGCGCC  TGGCGATCCC  CATGGATGGC

9601  CTCATGAGAT  AATACAGCAT  TACTATCACC  GCCATCCTGC  GTATACCATC

9651  CTAACCGTTG  TCTCAGCTGC  CGTTGCAGTG  CTTATCGGCT  TGACCGTTGC

9701  AGCACTGTGT  ACGTGTAAAG  CGCGACGTGA  ATGTTTAACA  CCGTATGCCC

9751  TAGCCCCGAA  TGCCGTTGTT  CCGACTTCGA  TAGCGCTCCT  ATGTTGCATT

9801  AGATCGGCTA  ACGCTGAAAC  ATTTTCTGAG  ACGATGAGCT  ACCTGTGGTC

9851  AAACAGTCAG  CCGTTCTTTT  GGGCTCAGTT  GTGTATCCCC  TTAGCCGCTG

9901  TTGTCATCCT  TGTGCGTTAC  TGTTCATGTT  GCTTGCCTTT  TTTAGTGGTT

9951  GCCGGCGTCT  ACCTGGGGAA  GGTAGACGCC  TACGAACATG  CGACCACCAT

10001 TCCAAATGTG  CCGAAGATTC  CGTATAAAGC  ACTTGTAGAA  CGGTCTGGCT

10051 ACGCCCCGCT  TAACTTAGAG  ATCACCGTCG  TGTCGTCGCA  GGTTTTACCA

10101  TCTACTAATC  AAGAGTATAT  CACCTGCAAG  TTTACTACTG  TAGTCCCCTC

10151  CCCGAAAGTC  AAATGTTGCG  GCTCCTTGGA  ATGTCAGCCC  GCCGCTCACG

10201  CCGACTATAA  CTGCAAAGTT  TTTGGAGGGG  TTTACCCATT  CATGTGGGGA

10251  GGAGCACAGT  GTTTTTGCGA  CAGCGAGAAC  ACCCAGATGA  GCGAGGCGTA

10301  CGTCAAACTG  TCAGCGGACT  GCGTAACGGA  TTACGCACAG  GCAGTTAAGG

10351  TGCATACTGC  TGCAATGAAG  GTAGGACTAC  GCATAGTGTA  TGGGAATACC

10401  ACCAGCTATT  TAGATGTGTA  CGTGAATGGA  GTCACGCCGG  GGACATCCAA

10451  AGATCTAAAA  GTCATAGCTG  GGCCAGTTTC  GTCCTCCTTT  ACGCCGTTTA

10501  ATCATAAGGT  TGTCATCTAC  CGTGGTTTAG  TCTATAATTA  TGACTTCCCT

10551  GAATACGGCG  CAATGAAACC  TGGAGTGTTC  GGAGACATCC  AAGCTACCTC

10601  CTTGACCAGT  AGAGACCTTA  TTGCAAGCAC  GGACATTAGA  TTGCTTAAGC

10651  CTTCCGTTAA  AAACGTGCAC  GTCCCGTACA  CGCAAGCTGC  TTCAGGATTC

10701  GAGATGTGGA  AGAACAACTC  AGGTCGACCA  CTGCAGGAAA  CCGCTCCTTT

10751  TGGGTGTAAG  ATTGCAGTCA  ACCCGCTACG  AGCGGTGGAC  TGTTCGTACG

10801  GTAATATTCC  TATCTCCATC  GATATCCCAA  ATGCCGCCTT  CATTAGGATA

10851  TCGGATGCGC  CGCTAGTTTC  GACGGTTAAA  TGTGAGGTCA  GCGAATGTAC

10901  CTATTCAGCT  GATTTTGGTG  GTATGGCAAC  CCTGCAGTAT  GTGTCGGACC

10951  GCGAAGGACA  ATGCCCCGTG  CACTCTCACT  CAAGCACAGC  AACACTTCAG

11001  GAATCGACAG  TGCATGTCCT  GGAGAAAGGG  GCGGTGACCG  TGCACTTTAG

11051  TACCGCCAGC  CCACAGGCTA  ATTTCATTAT  ATCGCTGTGT  GGCAAGAAAA

11101  CAACATGCAA  CGCGGAATGT  AAGCCACCTG  CGGACCACAT  TGTGAGTACA

11151  CCGCACAAAA  TCGATCAGGA  GTTCCAAACC  GCTATTTCAA  AAACATCATG

11201  GAGCTGGTTA  CTGGCACTCT  TTGGCGGCGC  CTCGTCGCTA  TTAATTATAG

11251  GACTCATGAT  TTTTACTTGC  AGCATGTTGC  TGACAAGCAC  CCGGAGATGA

11301  CCGCTATGTC  CCAATGACCC  GACCAGCAAA  ACTCGACGTA  TTTCCGAGGA

11351  ACTGATGTGC  ATAATGCATC  AGGCTGGTAT  ATTAGATCCC  CGCTCATCGC

11401  GGGCACTATA  GCAACAATGA  AACTCGATGT  ATTTCCGAGG  ATGCGCAGTG

11451  CATAATGCTG  CGCCGTGTTG  CCATATAATC  ATTTTATTAA  TCAACTATTT

11501  AGCAGACGCT  AAAACTCAAT  GTATTTCTGA  GGAAGCGTGG  TGCATAATGC

11551  CATGCAGCGT  CTGTATAATT  TCTTTTATTA  TTCTTTTATC  AATTAACCAA

11601  AATTTTGTTT  TTAACATTTC  AAAAAAAAAA  AAAAAAAAAA  AAAAAAAAAA

11651  AAAAACTCGA  GCAATTCTTG  AAGACGAAAG  GGCCTCGTGA  TACGCCTATT

11701  TTTATAGGTT  AATGTCATGA  TAATAATGGT  TTCTTAGACG  TCAGGTGGCA

11751  CTTTTCGGGG  AAATGTGCGC  GGAACCCCTA  TTTGTTTATT  TTTCTAAATA

11801  CATTCAAATA  TGTATCCGCT  CATGAGACAA  TAACCCTGAT  AAATGCTTCA

11851  ATAATATTGA  AAAAGGAAGA  GTATGAGTAT  TCAACATTTC  CGTGTCGCCC

11901  TTATTCCCTT  TTTTGCGGCA  TTTTGCCTTC  CTGTTTTTGC  TCACCCAGAA

11951  ACGCTGGTGA  AAGTAAAAGA  TGCTGAAGAT  CAGTTGGGTG  CACGAGTGGG

12001  TTACATCGAA  CTGGATCTCA  ACAGCGGTAA  GATCCTTGAG  AGTTTTCGCC

12051  CCGAAGAACG  TTTTCCAATG  ATGAGCACTT  TTAAAGTTCT  GCTATGTGGC

12101  GCGGTATTAT  CCCGTGTTGA  CGCCGGGCAA  GAGCAACTCG  GTCGCCGCAT

12151  ACACTATTCT  CAGAATGACT  TGGTTGAGTA  CTCACCAGTC  ACAGAAAAGC

12201  ATCTTACGGA  TGGCATGACA  GTAAGAGAAT  TATGCAGTGC  TGCCATAACC

12251  ATGAGTGATA  ACACTGCGGC  CAACTTACTT  CTGACAACGA  TCGGAGGACC

12301  GAAGGAGCTA  ACCGCTTTTT  TGCACAACAT  GGGGGATCAT  GTAACTCGCC

12351  TTGATCGTTG  GGAACCGGAG  CTGAATGAAG  CCATACCAAA  CGACGAGCGT

12401  GACACCACGA  TGCCTGCAGC  AATGGCAACA  ACGTTGCGCA  AACTATTAAC

12451  TGGCGAACTA  CTTACTCTAG  CTTCCCGGCA  ACAATTAATA  GACTGGATGG

12501   AGGCGGATAA  AGTTGCAGGA  CCACTTCTGC  GCTCGGCCCT  TCCGGCTGGC

12551   TGGTTTATTG  CTGATAAATC  TGGAGCCGGT  GAGCGTGGGT  CTCGCGGTAT

12601   CATTGCAGCA  CTGGGGCCAG  ATGGTAAGCC  CTCCCGTATC  GTAGTTATCT

12651   ACACGACGGG  GAGTCAGGCA  ACTATGGATG  AACGAAATAG  ACAGATCGCT

12701   GAGATAGGTG  CCTCACTGAT  TAAGCATTGG  TAACTGTCAG  ACCAAGTTTA

12751   CTCATATATA  CTTTAGATTG  ATTTAAAACT  TCATTTTTAA  TTTAAAAGGA

12801   TCTAGGTGAA  GATCCTTTTT  GATAATCTCA  TGACCAAAAT  CCCTTAACGT

12851   GAGTTTTCGT  TCCACTGAGC  GTCAGACCCC  GTAGAAAAGA  TCAAAGGATC

12901   TTCTTGAGAT  CCTTTTTTTC  TGCGCGTAAT  CTGCTGCTTG  CAAACAAAAA

12951   AACCACCGCT  ACCAGCGGTG  GTTTGTTTGC  CGGATCAAGA  GCTACCAACT

13001   CTTTTTCCGA  AGGTAACTGG  CTTCAGCAGA  GCGCAGATAC  CAAATACTGT

13051   CCTTCTAGTG  TAGCCGTAGT  TAGGCCACCA  CTTCAAGAAC  TCTGTAGCAC

13101   CGCCTACATA  CCTCGCTCTG  CTAATCCTGT  TACCAGTGGC  TGCTGCCAGT

13151   GGCGATAAGT  CGTGTCTTAC  CGGGTTGGAC  TCAAGACGAT  AGTTACCGGA

13201   TAAGGCGCAG  CGGTCGGGCT  GAACGGGGGG  TTCGTGCACA  CAGCCCAGCT

13251   TGGAGCGAAC  GACCTACACC  GAACTGAGAT  ACCTACAGCG  TGAGCTATGA

13301   GAAAGCGCCA  CGCTTCCCGA  AGGGAGAAAG  GCGGACAGGT  ATCCGGTAAG

13351   CGGCAGGGTC  GGAACAGGAG  AGCGCACGAG  GGAGCTTCCA  GGGGGAAACG

13401   CCTGGTATCT  TTATAGTCCT  GTCGGGTTTC  GCCACCTCTG  ACTTGAGCGT

13451   CGATTTTTGT  GATGCTCGTC  AGGGGGGCGG  AGCCTATGGA  AAAACGCCAG

13501   CAACGCGGCC  TTTTTACGGT  TCCTGGCCTT  TTGCTGGCCT  TTTGCTCACA

13551   TGTTCTTTCC  TGCGTTATCC  CCTGATTCTG  TGGATAACCG  TATTACCGCC

13601   TTTGAGTGAG  CTGATACCGC  TCGCCGCAGC  CGAACGACCG  AGCGCAGCGA

13651   GTCAGTGAGC  GAGGAAGCGG  AAGAGCGCCT  GATGCGGTAT  TTTCTCCTTA

13701   CGCATCTGTG  CGGTATTTCA  CACCGCATAT  GGTGCACTCT  CAGTACAATC

13751   TGCTCTGATG  CCGCATAGTT  AAGCCAGTAT  ACACTCCGCT  ATCGCTACGT

13801   GACTGGGTCA  TGGCTGCGCC  CCGACACCCG  CCAACACCCG  CTGACGCGCC

13851   CTGACGGGCT  TGTCTGCTCC  CGGCATCCGC  TTACAGACAA  GCTGTGACCG

13901   TCTCCGGGAG  CTGCATGTGT  CAGAGGTTTT  CACCGTCATC  ACCGAAACGC

13951   GCGAGGCAGC  TGCGGTAAAG  CTCATCAGCG  TGGTCGTGAA  GCGATTCACA

14001   GATGTCTGCC  TGTTCATCCG  CGTCCAGCTC  GTTGAGTTTC  TCCAGAAGCG

14051   TTAATGTCTG  GCTTCTGATA  AAGCGGGCCA  TGTTAAGGGC  GGTTTTTTCC

14101   TGTTTGGTCA  CTGATGCCTC  CGTGTAAGGG  GGATTTCTGT  TCATGGGGGT

14151   AATGATACCG  ATGAAACGAG  AGAGGATGCT  CACGATACGG  GTTACTGATG

14201   ATGAACATGC  CCGGTTACTG  GAACGTTGTG  AGGGTAAACA  ACTGGCGGTA

14251   TGGATGCGGC  GGGACCAGAG  AAAAATCACT  CAGGGTCAAT  GCCAGCGCTT

14301   CGTTAATACA  GATGTAGGTG  TTCCACAGGG  TAGCCAGCAG  CATCCTGCGA

14351   TGCAGATCCG  GAACATAATG  GTGCAGGGCG  CTGACTTCCG  CGTTTCCAGA

14401   CTTTACGAAA  CACGGAAACC  GAAGACCATT  CATGTTGTTG  CTCAGGTCGC

14451   AGACGTTTTG  CAGCAGCAGT  CGCTTCACGT  TCGCTCGCGT  ATCGGTGATT

14501   CATTCTGCTA  ACCAGTAAGG  CAACCCCGCC  AGCCTAGCCG  GGTCCTCAAC

14551   GACAGGAGCA  CGATCATGCG  CACCCGTGGC  CAGGACCCAA  CGCTGCCCGA

14601   GAGCTCGATT  TAGGTGACAC  TATAG

其中：1-11620          病毒核苷酸序列

      11621-11655      polyA序列

      11656-11661      XhoI酶切位点

      11656-14606      pBR骨架质粒序列

      14601-14606      SaCI酶切位点

14607-14625  SP6启动子序列

本发明提供了能够保证全长基因组cDNA克隆在宿主细胞内稳定性的骨架质粒。由于基因组cDNA在低拷贝克隆载体中稳定，所以本发明选用低拷贝质粒pBR322来制备适用于本发明的骨架质粒。本发明中用一对互补寡核苷酸退火形成的连接子替换pBR322质粒中的EcoR I-Ava I片段(86-1268nt)，去除质粒中的Tet^r基因，得到骨架质粒。具体步骤包括：首先将pBR322质粒线性化，然后将线性化后的质粒与含单酶切位点的连接子用本领域常规方法连接制得骨架质粒。

在本发明的一个具体实施方案中，是用EcoR I和Ava I双酶切除去质粒pBR322中四环素抗性基因Tet^r，得到2934bp的线性化的质粒。

本发明中将XJ-160病毒的基因组分成三个组装片段进行组装，因此，本发明中所述的连接子中设计含有单酶切位点，以便利用相应酶切位点将病毒基因组引入骨架质粒中。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的连接子由两个互补的寡核苷酸片段SX-和SX+经退火获得，其中SX-和SX+的序列分别为：

SX-：5’AATTG CTCGAG GTACC TCTAGA CTAGT GAATTC GCATGC GGATCC

        AAGCTT GAGCTC 3’；

SX+：3’C GAGCTC CATGG AGATCT GATCA CTTAAG CGTACG CCTAGG TTCGAA

        CTCGAG AGCC 5’

寡核苷酸片段SX-和SX+退火后生成的连接子中含有单酶切位点Sac I，Hind III，BamH I，Sph I，EcoR I，Spe I，Xba I，Kpn I和Xho I，该连接子长度为61bp，末端为粘性末端，分别与用EcoR I和Ava I酶切后得到的2934bp的线性化质粒的粘性末端互补。

在本发明的一个具体实施方案中，将得到的2934bp的线性化质粒和61bp的连接子用本领域常规方法连接得到构建感染性cDNA克隆使用的骨架质粒，本发明中命名为pBR。

本发明中以三个cDNA组装片段的方式将XJ-160病毒病毒全基因组cDNA引入到骨架质粒中。XJ-160病毒基因组全长11626个核苷酸，本发明中将基因组8453位核苷酸C突变为T，产生Xba I单酶切位点(8451-8456 TCCAGA→T^↓CTAGA)，结合位于基因组2517位的BamHI单酶切位点，将XJ-160病毒全基因组序列分为NS1(1-2516nt)、6K(2517-8451nt)和S2(8452-11626nt)三个组装片段。在病毒基因组cDNA序列5’端上游紧邻第一个核苷酸A引入SP6启动子序列和Sac I酶切位点，SP6用于以起始病毒RNA的转录，Sac I用于片段组装；在病毒基因组3’末端核苷酸C后引入polyA序列(35个A组成)和一个单酶切位点Xho I，Xho I用于线性化全基因克隆质粒制备体外转录模板。引入的Xba I酶切位点作为全基因克隆的遗传标记，用于鉴别恢复病毒的来源。利用Sac I、BamHI、Xba I和Xho I四个酶切位点，将病毒全基因组分为三片段，以pBR质粒作骨架进行全长cDNA片段组装。

另一方面，本发明提供了骨架质粒pBR作为制备RNA病毒全长基因组感染性cDNA克隆的载体的用途。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明所述的骨架质粒pBR作为制备XJ-160病毒病毒全长基因组感染性cDNA克隆的载体。

另一方面，本发明还提供了一种XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆的构建方法，该方法包括：

(1)从感染XJ-160病毒的小鼠脑组织提取RNA；

(2)用三对引物通过RT-PCR扩增，得到覆盖病毒基因组全长的三个cDNA组装片段；

(3)制备上述三个cDNA组装片段的T载体克隆；

(4)经亚克隆操作构建得到XJ-160病毒的全长基因组cDNA克隆；

(5)体外转录制备病毒基因组全长RNA；

(6)用脂质体转染的方法将上述全长RNA导入哺乳动物细胞；

(7)收取含恢复病毒的细胞上清；

(8)对恢复病毒进行遗传标记的鉴定；

(9)比较恢复病毒与亲本病毒的生物学特性。

其中病毒RNA的提取和RT-PCR的操作均采用本技术领域的常规方法。

从cDNA克隆合成感染性转录体，有效的RNA聚合酶启动子是必须的。本发明选用噬菌体启动子SP6，合成的引物Sp6f2中包含有SP6启动子序列。

制备上述三个cDNA组装片段的T载体克隆，简而言之，包括下述步骤：(1)制备含有下列成分的反应体系：pGEMT载体、PCR产物(NS1、6K或S2)、T4 DNA连接酶和连接缓冲液，4℃连接过夜；(2)将连接产物转化入感受态细胞；(3)筛选出阳性克隆(pGEMT-NS1、pGEMT-6K和pGEMT-S2)，用于下列亚克隆操作。

病毒基因组全长cDNA片段的亚克隆操作，包括下述步骤：(1)Xba I/Xho I双酶切pGEMT-S2质粒和pBR骨架质粒，得到S2片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-S2；(2)BamH I/Xba I双酶切pGEMT-6K质粒和pBR-S2质粒，得到6kb片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-6K-S2；(3)Sac I/BamH I双酶切pGEMT-NS1质粒和pBR-6K-S2质粒，得到NS1片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-NS1-6K-S2，该质粒即为XJ-160病毒全基因组cDNA克隆质粒，命名为pBR-XJ160。

获得RNA转录体是鉴定全基因克隆感染性的必须步骤。首先制备符合转录要求的完全线性化的质粒DNA模板，然后用SP6RNA聚合酶合成5’端带帽子结构的RNA转录体。步骤包括：(1)酶切使全基因组质粒线性化制备转录模板，在本发明的具体实施方案中，使用XhoI酶切全基因组质粒成线性；(2)制备RNA转录体，在本发明的具体实施方案中，使用mMESSAGE mMACHINE^TM transcription SP6 Kit(Ambion)，具体操作在厂商推荐方法基础上稍作改动。

使用脂质体转染方法，将RNA转录体导入哺乳动物细胞。本发明的具体实施方案中使用的哺乳动物细胞是BHK细胞。

将转染后的哺乳动物细胞按本领域常规方法进行培养，当细胞出现明显病变且超过80％时收获细胞及其上清，冻存备用，该病毒为第一代恢复病毒；冻存前，吸取上清重复上述培养操作得到第二代恢复病毒，依此类推。全基因克隆来源的病毒称作恢复病毒(BR-XJ160)。

为了区分恢复病毒(BR-XJ160)和亲本病毒XJ-160，需要对获得的病毒进行遗传标记的鉴定。在本发明的具体实施方案中，在构建全基因组cDNA克隆时在基因组8453nt引入一个碱基突变(C→T)，创建出Xba I酶切识别序列(8451-8456 TCCAGA→T^↓CTAGA)，所以用Xba I消化来自两种病毒的RT-PCR产物，对酶切结果进行比较。

为了鉴定本发明制备的感染性全基因组cDNA克隆是否可作为理想的反向遗产学系统，对感染性全基因组cDNA克隆pBR-XJ160的稳定性进行了鉴定，并对感染性克隆来源的恢复病毒(BR-XJ160)与亲本病毒XJ-160的多项生物学特性进行了比较。恢复病毒和亲本病毒的生物学性状表明在细胞病变效应、病毒的抗原性、病毒颗粒的形态、病毒噬斑形态和病毒在宿主细胞生长动力以及病毒毒力等方面没有明显的区别。感染性克隆来源的恢复病毒(BR-XJ160)较好的重现了XJ-160病毒的各种生物学特征。其中包括：(1)pBR-XJ160克隆质粒在宿主菌中多次传代后，经限制性内切酶消化，各代质粒的酶切图谱不变，表明了该克隆的传代稳定性；各代克隆质粒的RNA转录体转染宿主细胞后均可产生恢复病毒，表明克隆的感染性是稳定的。(2)用间接免疫荧光测定法(9)鉴定病毒的抗原性。(3)电镜负染观察病毒颗粒。(4)用标准的噬斑检测方法(9)检测病毒在宿主细胞上形成的空斑。(5)用噬斑法检测病毒在感染培养的哺乳动物细胞后，于不同时间细胞上清中产生的子代病毒的滴度，用滴度的对数绘制曲线。(6)在乳鼠的脑组织接种病毒，检测病毒的致病能力。

所述的骨架质粒pBR作为制备RNA病毒全长基因组感染性cDNA克隆的载体的用途，上述的RNA病毒为披膜病毒科(Togaviridae)病毒或者是为甲病毒属(Alphavirus)病毒或者是辛德毕斯病毒(Sindbis virus)。

附图说明

图1低拷贝骨架质粒pBR的构建图

图2.XJ-160病毒全基因克隆构建策略图

图3组装片段的RT-PCR电泳图

图中1 DL15000 2 NS1 36K 4 S2 5DL15000

图4全基因克隆pBR-XJ160构建过程图

图5间接免疫荧光检测恢复病毒和XJ-160病毒感染的BHK细胞图

图中A恢复病毒(BR-XJ160)B正常BHK细胞(阴性对照)C XJ-160病毒(阳性对照)

图6恢复病毒(BR-XJ160)的遗传标记鉴定图

图中A遗传标记分析示意图    B遗传标记的琼脂糖凝胶电泳分析

图7全基因克隆pBR-XJ160质粒的稳定性分析图

图中A→H8次传代DH5α菌提取质粒经Sac I/Xho I双酶切产生11.6kb和2.9kb片段

图8恢复病毒(BR-XJ160)与亲本病毒XJ-160的噬斑比较图

图中A恢复病毒(BR-XJ160)B XJ-160病毒

图9电镜观察XJ-160病毒和恢复病毒(BR-XJ160)的形态图(负染色)

图中A恢复病毒(BR-XJ160)(×69000×2)B XJ-160病毒(×69000×2)

注：箭头所示病毒颗粒的放大图像位于右上

图10恢复病毒(BR-XJ160)和XJ-160病毒在BHK细胞中的生长动力曲线

本发明的优点：本发明涉及的XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆pBR-XJ160是利用低拷贝质粒作骨架构建而成的，克隆的稳定性好；在基因组cDNA克隆过程中引入了遗传标记有利于区分恢复病毒和亲本病毒；同时由于引入的遗传标记突变位点并未影响全基因克隆的感染性，为今后在感染性克隆进行基因突变研究提供了借鉴。该感染性克隆具有清晰的遗传学背景，感染性克隆来源的恢复病毒较好的重现了XJ-160病毒的各种生物学特征。本发明的感染性克隆作为有效的XJ-160病毒的反向遗传学系统，可在XJ-160病毒的进一步研究和开发中用作分子生物学工具。

具体实施方式

一、低拷贝骨架质粒pBR的构建

选择低拷贝质粒pBR322(TaKaRa公司)作为全基因克隆的骨架质粒。但要对pBR322质粒进行改造，使其成为适合本研究所用的工作质粒pBR。用一对互补的寡核苷酸退火形成的连接子替换pBR322质粒中的EcoR I-Ava I片段(86-1268nt)，去除质粒中的Tet基因，构建成只含有氨苄青霉素抗性的质粒，作为病毒全基因组cDNA克隆的骨架质粒(见图1)。

1、合成一对互补的寡核苷酸(上海生工)，进行等摩尔退火反应，获得连接子片段寡核苷酸：

SX-5’AATTG CTCGAG GTACC TCTAGA CTAGT GAATTC GCATGC GGATCCAAGCTT GAGCTC 3’，

SX+3’C GAGCTC CATGG AGATCT GATCA CTTAAG CGTACG CCTAGG TTCGAACTCGAG AGCC 5’。

退火反应条件：20ul体系47uM SX-，9ul，47uM SX+9ul，0.1MNaCl 0.2ul混匀，放于95℃水浴中，关闭水浴锅电源，使温度自然降至室温，即可使用。

2、骨架质粒pBR的获得

用EcoR I和Ava I双酶切消化pBR322质粒，回收得到2934bp的线性质粒。酶切反应参照各内切酶说明书(Promega公司和TakaRa公司)。依次在1.5mlEppendof管内加入DNA、10x相应缓冲液和内切酶EcoR I和Ava I，用ddH₂O补充到总体积20ul，37℃消化2小时，取3ul反应液于0.8-1％的琼脂糖凝胶中，进行100W恒压水平电泳，紫外灯下观察酶切结果。

利用T4 DNA连接酶将2934bp的线性质粒和上述得到的61bp的连接子进行连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，经克隆筛选后得到骨架质粒pBR。

所得质粒pBR的核甘酸序列中消除了pBR322原有EcoR I位点，而将EcoR I位点移至多克隆位点(连接子)中。多克隆位点含有单酶切位点：Sac I，Hind III，BamH I，SphI，EcoR I，Spe I，Xba I，Kpn I，Xho I。这些单酶切位点用于病毒全基因cDNA克隆的构建。

二、XJ-160病毒全长基因组cDNA合成和克隆

1.克隆构建策略(见图2)

XJ-160病毒基因组全长11626个核苷酸，将基因组8453位核苷酸C突变为T，产生XbaI单酶切位点(8451-8456 TCCAGA→T^↓CTAGA)，结合位于基因组2517位的BamH I单酶切位点，将XJ-160病毒全基因组序列分为NS1(1-2516nt)、6K(2517-8451nt)和S2(8452-11626nt)三个片段进行拼接组装。在病毒基因组cDNA序列5’端上游紧邻第一个核苷酸A引入SP6启动子序列和Sac I酶切位点，SP6用于以起始病毒RNA的转录，Sac I用于片段组装；在病毒基因组3’末端核苷酸C后引入polyA序列(35个A组成)和一个单酶切位点Xho I，Xho I用于线性化全基因克隆质粒制备体外转录模板。引入的Xba I酶切位点作为全基因克隆的遗传标记，用于鉴别恢复病毒的来源。利用pBR质粒作骨架，将病毒全基因组分为三片段，利用Sac I、BamH I、Xba I和Xho I四个酶切位点进行全长cDNA片段组装。

2.病毒培养及病毒RNA提取

取-80℃贮存的经三轮单斑纯化后保存在冻干鼠脑悬液中的XJ-160病毒，将毒种接种乳鼠脑组织进行病毒扩增，用TriZol液(Invitrogen)从感染病毒的脑组织中提取病毒RNA(操作方法参见厂商说明书)。

3.RT-PCR获得病毒cDNA片段

利用反转录试剂盒SUPERSCRIPT^TMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen公司)和PCR试剂盒Expand High fidelity PCR System(Roche公司)进行病毒基因组全长cDNA组装片段的扩增(操作方法参见生产商提供的说明书)。

cDNA片段扩增条件：94℃预变性5min；94℃ 30 Sec，55℃ 30 Sec，72℃3min，30个循环，72℃延伸10min

cDNA片段的电泳结果见图3。

                表1 XJ-160病毒基因组cDNA片段扩增所用引物

引物                       引物序列^a                            扩增片段^b

Sp6f2   c gagctcgatttaggtgacactatagATTGACGGCGTAGTACACACTATTG     SacI-BamHI(NS1)

        1-25nt  (Sac I)

BamR2   CTTGCAGGGGTTTGTAGTCTTCAT    2699nt-2676nt

P5      CG GGATCCTAAGCAGTGTGG        2514nt-2533nt(BamH I)       BamH I-XbaI(6K)

XbR     C TCTaGATGGTTCGCGGGTG        8457nt-8438nt

XbF     CA TCtAGAGCGTTAGATATCCTG     8449nt-8471nt(Xba I)        Xba I-Xho I(S2)

X2      cc gctcgagTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAAT

        GTTAAAAACAAAATTTTGGTTAATTG  11626nt-11596nt(Xho I)

a大写字母表示病毒序列，小写字母表示非病毒序列，下划线代表限制性内切酶识别序列

b用于构建全长克隆的cDNA片段见图2

c斜体小写字母表示SP6启动子序列

4.三个组装片段的T载体克隆

PCR产物与pGEMT载体的连接反应体系10ul：5ul快速连接缓冲液，1ulpGEMT载体，3ul PCR产物和1ul T4 DNA连接酶。混匀后，置于4℃连接过夜。

转化连接产物：取上述连接产物5ul加入100ulDH5α感受态细胞内，置冰浴60min后，42℃热休克90秒，再置冰浴数分钟，加入无氨苄青霉素的LB约0.7ml，在37℃摇床150rpm摇菌60min；取200ul菌液加入40ul X-gal及4ul IPTG，混匀后涂含氨苄青霉素(100ug/ml)LB琼脂平板，于37℃倒置培养约14-16小时，直到可见清晰的蓝色和白色菌落。挑取白色菌落摇菌、提取质粒、进行酶切鉴定。

每一个PCR产物至少获得三个独立的T-A克隆(插入方向不同，或来自不同的转化试验)。

5.病毒基因组全长cDNA组装的亚克隆操作

利用NS1、6K、S2片段组装成全基因组cDNA，构建过程(见图4)：(1)Xba I/XhoI双酶切pGEMT-S2质粒和pBR骨架质粒，得到S2片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-S2；(2)BamH I/Xba I双酶切pGEMT-6K质粒和pBR-S2质粒，得到6kb片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-6K-S2；(3)Sac I/BamH I双酶切pGEMT-NS1质粒和pBR-6K-S2质粒，得到NS1片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-NS1-6K-S2，该质粒即为XJ-160病毒全基因组cDNA克隆质粒，命名为pBR-XJ160。

DNA片段的克隆操作参见冷泉港第三版《分子克隆》⁽¹⁰⁾。

三、全基因组cDNA克隆的感染性鉴定

1.体外转录制备病毒基因组全长RNA

制备转录模板：用Xho I单酶切全基因质粒pBR-XJ160，酶切反应体系50ul：10×缓冲液5ul，pBR-XJ160质粒20ug，Xho I酶50IU，用ddH₂O补足至50ul，混匀。37℃水浴至少3小时，取少许反应液进行电泳，鉴定酶切是否完全。加入5％SDS和1/10体积的蛋白酶K(20mg/ml)，于50℃水浴至少30分钟，用等体积酚：氯仿抽提一次，然后加入1/10体积的5M醋酸铵和2倍体积的无水乙醇沉淀线性质粒DNA，4℃10000rpm离心10分钟，弃上清，室温干燥，用无RNase的ddH₂O溶解使其浓度为0.5ug/ul。

制备RNA转录体：用mMESSAGE mMACHINE^TM transcription SP6 Kit(Ambion)完成体外转录。反应体系20ul：Nuclease-free water2ul，2×NTP/Cap10ul，10×Reaction Buffer2ul，20mMGTP2ul，线性全基因质粒(0.5ug/ul)2ul，Enzyme Mix 2ul。混匀后于37℃水浴2小时，然后取1ul反应液加入3ul上样缓冲液混匀，于85℃水浴3-4min，取出后置于冰上，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的合成效率。

转录体RNA的纯化：在反应液中加入1ul Nuclease-free的DNase I，于37℃水浴15min，去除质粒DNA模板；然后加入30ul Nuclease-free water和25ul 2.5MliCl，混匀后置于-20℃，沉淀RNA，至少30min；4℃10000rpm离心15分钟，弃上清，用70％乙醇(DEPC处理的去离子水配制)洗涤一次，离心弃上清，室温干燥，用无RNase的ddH₂O溶解至适当体积，用分光光度计检测RNA的浓度，然后分装后于-70℃贮存。一般含有1ug线性化模板DNA的20ul反应体系可产生大约20ugRNA。

2.将转录体RNA转染哺乳动物细胞

在35mm细胞培养皿中接种10⁵BHK细胞，37℃孵育24-48小时待细胞生长至50-80％融合时用于RNA转染。转染操作过程：(1)弃去细胞上清，用无血清Eagle’s培养液洗涤细胞一次；(2)配制脂质体-RNA复合物：首先在无RNase的Ependorf管中加入1ml无血清无抗生素的Eagle’s培养液，然后加入转染试剂DMRIE-C(GiBcol公司)10ul，在振荡器上振荡混匀，最后加入约5ug纯化的转录体RNA，在振荡器上充分混匀；(3)立刻将脂质体-RNA复合物转移至洗涤好的BHK-21细胞上，于37℃5％CO₂孵箱中孵育4-5小时；(4)弃去转染上清，更换Eagle’s完全培养基2.5ml(含10％小牛血清，2％青霉素链霉素，1％谷氨酰胺)，37℃5％CO₂继续孵育，逐日观察细胞变化。该实验设立阴性对照为步骤(2)不加RNA，其它条件相同。

在转染转录体RNA后12h、24h、36h、48h、60h、72h六个时间点连续观察细胞变化。当细胞完全病变时，收获细胞和上清冻存于-20℃。

用10ul脂质体DMRIE-C包裹约5ugRNA转染大约105个BHK细胞(在35mm培养皿中细胞生长达70-80％)，在转染后24小时即可在显微镜下观察到细胞病变效应，但不是很明显，只有很少量的细胞呈现圆缩，其折光所产生的表象与XJ-160病毒导致的BHK细胞病变极为相似，这些细胞在显微镜视野中成灶状分布，随时间发展这种圆缩的细胞越来越多；转染48小时后细胞呈现明显的细胞病变，几乎80％的细胞呈现圆缩，有少许细胞开始脱落。而没有转染转录体RNA的阴性对照细胞形态一直保持良好。

3.恢复病毒扩增和定量

当大方瓶中的单层BHK细胞长到80-90％融合成片时，弃去培养液，用Eagle’s培养液洗涤一次，加入0.2ml转染转录体RNA后的细胞上清，用Eagle’s培养液补足到1ml，置于37℃5％CO₂孵箱中使病毒充分吸附细胞，吸附1小时后弃去吸附上清，加入10ml维持液(含2％小牛血清的Eagle’s培养液)，于37℃5％CO₂孵箱中孵育，连续观察细胞变化。当细胞出现明显病变且超过80％时收获细胞，冻存于-20℃，该病毒视为第一代恢复病毒。在冻存之前，吸取上清0.2ml，继续上述过程，得到第二代恢复病毒。同样的方法由第二代恢复病毒传代得到第三代恢复病毒，将恢复病毒的第三代病毒作为鉴定恢复病毒生物学特性的后续实验毒种，以200ul为单位将第三代恢复病毒细胞上清分装贮存于-70℃冰箱。

噬斑法测定恢复病毒滴度：选择生长良好融合成片的单层BHK细胞(六孔细胞培养板)，用Eagle’s培养液洗涤细胞一次；将需测定的病毒悬液作10倍系列稀释(10^-1-10^-10)，在每个培养孔分别接种各稀释度(根据检测的病毒选择稀释度范围10^-4-^10-8或10^-5-10^-9)的病毒悬液0.5ml，同时设不含病毒的Eagle’s培养液的空白对照，于37℃孵育吸附1小时，弃掉吸附病毒液，用Hank’s液洗涤一次，覆盖含1％低熔点琼脂糖的固体培养基(含4％小牛血清的2×Eagle’s培养液与等体积2％低熔点琼脂糖混合配制而成)，于37℃5％CO₂孵箱中孵育，连续观察细胞变化；当在显微镜下可以观察到局部区域出现明显细胞病变时覆盖第二层含0.3％中性红(Sigma公司)的固体培养基，于37℃5％CO₂孵箱继续培养，约6个小时后观察空斑的形态并计算每个细胞孔的噬斑数量。病毒滴度计算：每孔噬斑数/接种的病毒悬液体积×稀释度。

当细胞病变接近完全时，同时收获对照细胞和转染RNA细胞的上清，在BHK细胞连续传代三次，后者在三次传代细胞中均出现典型的细胞病变，前者均未出现任何细胞病变。对转染RNA后的细胞上清以及三次传代细胞上清进行了病毒滴度检测，结果见表2。当恢复病毒传第三代后病毒的滴度基本达到XJ-160病毒的水平(10⁸PFU/ml)。

           表2恢复病毒滴度检测

细胞上清                  病毒滴度(PFU/ml)

转染RNA细胞               1.5×10⁷

传第一代细胞              2×10⁷

传第二代细胞              5×10⁷

传第三代细胞              2.6×10⁸

上述结果提示以全基因克隆pBR-XJ160作为模板合成的转录体RNA具有感染性，转染BHK细胞后可产生病毒。将全基因克隆来源的病毒称作恢复病毒，命名为BR-XJ160。

4.间接免疫荧光测定法(IFA)鉴定病毒的抗原性

IFA操作过程：(1)用PBS洗涤玻璃片一次，用冷丙酮固定15分钟，吹干；(2)滴加50ulXJ-160病毒小鼠免疫腹水(效价1∶1240，1∶100稀释)(本室自制)，37℃湿盒作用30分钟，PBS冲洗2-3次，吹干；(3)滴加50ul FITC标记的羊抗小鼠抗体(1∶100稀释原液)，37℃湿盒作用30分钟，PBS冲洗3次；(4)用90％甘油封片，荧光显微镜下观察。

为了鉴定来自全基因克隆的恢复病毒(BR-XJ160)的抗原性，分别用恢复病毒(BR-XJ160)和XJ-160病毒感染BHK细胞，感染后24小时细胞完全病变时用抗XJ-160病毒的小鼠免疫血清进行间接免疫荧光检测(IFA)。结果显示两种病毒感染的细胞均表现出相同的荧光(见图5)。该结果提示恢复病毒(BR-XJ160)具有与XJ-160病毒相同的抗原性。

5.恢复病毒(BR-XJ160)的遗传学鉴定

为了区分恢复病毒和亲本病毒XJ-160，在构建XJ-160病毒的全基因克隆时在基因组8453nt引入一个碱基突变(C→T)，创建出Xba I酶切识别序列(8451-8456 TCCAGA→TCTAGA)，将该酶切位点作为XJ-160病毒感染性克隆的遗传标记(见图2)。将转染转录体RNA后的细胞上清和亲本病毒分别感染BHK细胞，待出现明显的细胞病变后，分别收获细胞，提取细胞总RNA。利用RT-PCR方法扩增病毒基因组含有Xba I位点(8451-8456nt)的基因片段(7567-9821nt，2255bp)。用Xba I消化来自两种病毒的RT-PCR产物，应得到不同的酶切结果(见图6A)。

上游引物7568f(5’GGATCCACTATGAATAGAGGATTC 3’7567-7584nt)

下游引物E3-E2r(5’TTACGGTACCGTAGCGTTAGCCGATCTAATGC 3’9821-9802nt)。

将Xba I酶消化后的RT-PCR产物，在1％琼脂糖凝胶上进行电泳分析。

电泳结果(见图6B)显示恢复病毒的RT-PCR产物可被Xba I酶切产生885bp和1368bp两条片段，而XJ-160病毒的PCR产物不能被Xba I酶切割为两片段。这一结果明确了恢复病毒(BR-XJ160)来自全基因克隆pBR-XJ160，由其感染性全长RNA转录体转染细胞后得到，而不是受亲本病毒XJ-160污染所致。

6.具有感染性的全基因克隆的遗传稳定性鉴定

将经鉴定具有感染性的全基因克隆质粒转化宿主菌E.coli DH5α，挑单菌落接种Amp+LB液体培养基，37℃摇菌12小时，碱裂解法提取质粒，作为第一次扩增的质粒；将第一次扩增质粒的菌液以1∶1000稀释后转接，摇菌12小时，提取质粒作为第二次扩增的质粒；依此类推，这样连续得到8次扩增的质粒。每一次质粒扩增相当于复制20代。将8次扩增所得质粒同时用Sac I/Xho I双酶切消化2-3小时，于0.8％琼脂糖凝胶电泳，观察8次扩增质粒的酶切图谱是否有变化。

结果显示8代质粒的酶切图谱完全相同，Sac I/Xho I双酶切pBR-XJ160质粒得到长11.6kb的全长基因组cDNA片段和2.9kb载体片段(见图7)。这些结果提示该全基因克隆pBR-XJ160质粒在DH5α宿主菌中可以稳定传代。

用第8次扩增的全基因克隆质粒制备转录模板，经体外转录获得转录体RNA，在经脂质体转染BHK细胞后48小时即可观察到细胞圆缩、脱落等细胞病变效应。将转染后的细胞上清再次感染BHK细胞，24小时后细胞完全病变。以上结果表明全基因克隆pBR-XJ160质粒的感染性也是稳定的。

四、恢复病毒(BR-XJ160)的生物学性状鉴定

1.病毒在BHK细胞上的空斑

病毒的噬斑检测方法上面已有描述。

对恢复病毒(BR-XJ160)和亲本病毒XJ-160在BHK细胞上形成的空斑进行比较，结果发现：在长满BHK细胞的35mm培养皿中分别感染100pfu病毒后约48小时均形成清晰可见的病毒噬斑，二者的形状大小没有明显的区别。见图8

2.电镜观察病毒形态

电镜负染色检查操作：(1)取感染病毒后细胞完全病变的细胞上清20ul滴于石蜡膜上，将铜网反扣于上清上约10min；(2)吸取20ul磷钨酸负染试剂滴于石蜡膜上，将铜网再反扣于负染试剂上约10min；(3)取下铜网，室温晾干，即可通过透射电镜观察病毒形态。

电镜负染色观察恢复病毒(BR-XJ160)和亲本病毒的形态：在XJ-160病毒和恢复病毒感染的细胞上清中，负染色均可以观察到病毒颗粒，多呈圆形，外周可见到排列整齐的棘突，直径大约在60-80nm之间(N＞10)。两种病毒颗粒在形态上没有明显的区别。见图9

3.病毒的生长动力检测

取已知病毒滴度的亲本病毒和恢复病毒，以0.01mol感染单层BHK细胞，每一种病毒平行试验三孔。分别于感染后4h、8h、12h、16h、20h、24h、30h、36h吸取细胞上清，用噬斑法测定各时间点的细胞上清的病毒滴度，计算每个时间点上清病毒滴度的平均值，绘制病毒感染BHK细胞后的生长动力曲线。

感染病毒后连续观察细胞病变，两种病毒产生的细胞病变过程和程度基本相同：于感染后12小时可见到零星的细胞出现圆缩、突起和细胞折光改变；于感染后16小时局部细胞呈现较明显的细胞病变效应(CPE)；20小时细胞呈现典型的细胞病变效应；24小时细胞几乎全部病变。对不同时间点的细胞上清样品进行病毒滴度测定显示：两种病毒在BHK细胞中的生长动力曲线是相似的(见图10)。以上结果提示恢复病毒和亲本病毒在BHK细胞中的复制能力和播散能力没有显著区别。

4.病毒对乳小鼠的致病性

用保存于-70℃的第三代恢复病毒(BR-XJ160)和XJ-160病毒，对出生2-3日龄的乳小鼠进行脑内接种，每只小鼠接种0.02ml。逐日观察乳鼠是否发病及发病时间、发病特征、是否死亡。同时设阴性对照，接种Eagle’s培养液0.02ml。每组共8只乳鼠。

接种病毒的两组乳鼠均在4天后出现轻微的临床症状，表现为拒乳、后肢麻痹，两组乳鼠的症状相似并逐渐加重，第6天开始有乳鼠死亡，至第8天接种病毒的两组乳鼠全部死亡。而对照组乳鼠生长状态良好，未见任何临床症状，全部存活。

以上结果表明恢复病毒(BR-XJ160)和亲本病毒XJ160对乳小鼠的致病性没有明显区别。

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                       序列表

<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120>辛德毕斯病毒感染性全基因组cDNA克隆

<130>

<160>9

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>14625

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

attgacggcg tagtacacac tattgaatca aacagccgac caatagcact accatcataa    60

tggagaggcc tgtagttaac gtagacgtag acccccagag tccgtttgtc gctcaactgc    120

aaaagagctt cccgcaattc gaggtagtag cacagcaggc cacaccaaat gaccatgcta    180

atgccagagc attttcgcat ctggctagta aattaatcga gctggaggtt cctaccacag    240

cgacgatttt ggacataggc agcgcaccgg ctcgtagaat gttttccgag caccactatc    300

actgcgtctg ccctatgcgg agccccgaag atcccgaccg tatgatgaaa tacgccaata    360

agttggcgga gaaggcaaat aagattacta ataaaaattt gcatgagaag attaaagacc    420

tccggatcgt actcgatact ccggatgctg agacaccgtc gctctgcttc cataatgacg    480

ttacctgcag tacgcgtgca gagtactccg ttatgcaaga tgtgtatatt aatgcacccg    540

gaactattta ccatcaagct atgaaaggcg tgcggacact ttactggatt gggtttgaca    600

ccactcagtt catgttctcg gctatggcag gatcatatcc tgcctataat actaactggg    660

ccgatgaaaa agtccttgaa gcacgcaata ttggactctg tagtaccaag ttgagcgaag    720

gccgtatagg aaagttgtca ataatgagga aaaaggagtt gaagcccggg tcacgggtct    780

acttctcagt gggatcaaca ctctacccag aatataggga cagcttacag agctggcacc   840

tcccatcagt gttccatctg aaaggaaagc aatcgtatac atgccgctgt gatacagtgg   900

taagttgcga aggctacgta gtgaagaaga tcactattag tcccgggatt acgggagaaa   960

ccgtgggata cgcggttaca aacaatagcg agggtttctt gctatgtaaa gttactgaca   1020

cagtaaaagg ggaacgggtc tcgttccccg tgtgcacgta tatcccggcc accatatgcg   1080

accagatgac aggtataatg gccacggata tttcacctga cgatgcacag aagcttctgg   1140

ttgggctcaa ccagaggatt gtcattaacg gtaaaaccaa caggaacact aacaccatgc   1200

aaaactacct tctaccgatt atagcacaag gcttcagcaa gtgggctaaa gagcgcaaag   1260

aagatcttga taatgaaaag aagctgggca ctagggagcg taagcttatt tacgggtgtc   1320

tatgggcggt tcgtactaag aaagtgcact cgttttaccg cccgcccgga acgcagacca   1380

gcgtgaaagt cccggcatct tttagcgctt ttccaatgtc atctgtatgg acaacctcac   1440

tacccatgtc gctgaggcag aagataaaat tggtactaca accgaaaaag gaggagaaat   1500

tactgcaggt ctcagaagag ttagttgcgg aggctaaagc ggcctttgaa gatgcacagg   1560

aggagatcag agcggagcaa ctccgtgaag cacttccacc actggtagca gacaaaggta   1620

ttgaagccgc tgcagaagtc gtctgtgaag tggaagggct tcaagctgat ataggagcag   1680

ctcttgttga gacgccacga gggcatgtaa ggattatacc tcaagtaaca gaccgcatga   1740

ttgggcagta catcgtggtc tcaccaacct ccgtgcttaa gaacgccaaa ttaacacctg   1800

ttcacccttt ggctgaccaa gtcaaaatta taacacattc agggaggaca ggaagattcg   1860

cggtggagcc gtatgatgct aaagtgttga tgccagcagg tagcgccgtt ccatggcctg   1920

agttcctggc gttaagtgaa agcgccacgc tagtgtataa cgaaagagaa tttgtcaacc   1980

gcaaacttta ccatatcgcc atacatggtc ccgcgaagaa tactgaagag gagcagtata   2040

aagtcactaa agccgaactc gcagaaacag agtatgtatt tgatgtcgac aagaagcgtt   2100

gcgttaagaa ggaagaggcc tcggggctgg ttctctcggg agaactaact aacccaccgt    2160

atcatgaaat ggcgcttgag gggctgaaga ctcgacccgc tgttccgtat aaggtcgaaa    2220

caataggagt aataggcaca ccaggatcag gcaagtctgc gattattaaa tcgaccgtta    2280

ccgtacgaga tcttgttacc agcggaaaga aggaaaactg ccgtgaaatt gaaactgacg    2340

tgttgaggtt gagaggtatg cagatcacgt caaggacggt agactcagtc atgcttaacg    2400

gatgccataa agccgttgag gtgctatacg ttgatgaagc atttgcgtgc catgctggta    2460

cgttgcttgc cttgatcgct attgttagac cccgaaagaa ggtagtactt cgcggggatc    2520

ctaagcagtg tggttttttc aatatgatgc agctcaaagt acattttaat caccctgaaa    2580

aagatatatg tactaagacg ttttacaaat tcatctctcg acgctgcacg caaccagtaa    2640

cggcgattgt ttcaacactt cattacgacg gaaagatgaa gactacaaac ccctgcaaga    2700

agagcattga gatagatatt acaggtacta cgaagccgaa gcccggggac ctcgttttga    2760

cgtgcttccg cggatgggtc aagcagctac agatcgatta cgcgggaaat gaagtgatga    2820

cggctgctgc ctcgcaggga ctgactagaa agggtgttta cgccgttcgg caaaaagtta    2880

atgagaatcc actgtacgcg attacgtcgg agcacgtgaa cgtgttactc acccgtactg    2940

aggatagatt agtgtggaag accttacagg gcgatccatg gatcaaacaa cttactaaca    3000

ttccgaaagg aaacttccaa gctactattg aggactggga agctgaacat aaggggatca    3060

tcgctgcaat aaacagccca acccctcgta taaacccgtt cagctgtaag actaatgtgt    3120

gctgggcgaa ggcactggaa ccgatactgg ccacagccgg tattgtcctc accggttgcc    3180

agtggagtga gctgtttcca cagttcgtag atgataaacc ccactcagct atctacgccc    3240

tagatgtgat ttgtattaag ttctttggta tggatctgac aagcggtcta ttttcaaagc    3300

agagcatccc tctgacgtac caccctgcgg actctgcaag gccagtggcg cattgggaca    3360

acagtccagg aacccgaaag tatggatacg atcatgcggt tgctgccgaa ttgtctcgta    3420

gattcccggt gttccaactt gctggaaaag gcacacagct tgacttgcag actggtagaa    3480

ccagagtcgt ttccgcgcag tgtaacttgg tcccagtgaa ccgtaacctc ccgcacgctc    3540

ttgtccccga gtataaagag aaacaacccg gcccgattaa aaatttttta aatcagttta    3600

agcatcactc catacttgta gtatcagaaa cgaaaatcga agttcccaat aagcgcatcg    3660

aatggattgc accgcttggc atagctggtg cagataagag ctacaacctg gccttcggat    3720

ttccaccgca ggcacggtat gatatggtgt ttatcaatat aggaacaaaa tatagaaacc    3780

accattttca acagtgtgaa gaccatgcgg cgactttgaa gactctttcc cgctcggctc    3840

tgaattgcct caaccctgga ggcaccttag tggtgaaatc ctatggatat gctgatcgca    3900

atagcgagga cgtagtcacc gcacttgcca ggaagtttgt tagagtgtct gcggccaggc    3960

cagagtgcgt ctcaagtaac acagaaatgt acctaatctt tcggcaatta gataatagcc    4020

gtacacggca gttcactcca catcatttga actgtgtaat ctcgtcggtg tatgaaggca    4080

cgagagaagg agtcggagct gcgccatcct accgtgtgaa acgggaaaat attgcagact    4140

gccatgagga agcaatcgtc aacgccgcta actcgctggg taaaccaggt gaaggagttt    4200

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cggctaaatt aactgtaagc caaggaatga aagtgataca cgcggtcggc cctgacttcc    4320

gtaagtatcc tgaggcggaa gctttgaagc tgctgcaaaa cgcttaccat gcagtggcgg    4380

acttggttaa caaacacaac attaagtcca ttgctatccc gctactatca acaggtatat    4440

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ggaccgatgc agatgtaact atttattgtt tggataagaa atggaaagag agaattgacg    4560

cggtgttgca acttaaggag tcagtgacag aactgaagga cgaggacatg gaaatcgatg    4620

acgaattggt atggattcat ccggatagtt gtctaaaagg gagaaaggga tacagtacta    4680

caaaaggaaa gctatattcg tactttgagg gtactaaatt tcaccaagca gccaaagata    4740

tggctgaaat aaaagtgctg tttccggacg accaggaaag caacgaacag ttatgcgctt    4800

acatactggg cgaaaccatg gaagcaattc gtgaaaaatg cccagttgat cgtaacccgt    4860

catccagtcc tccgaagacg ctgccttgcc tttgcatgta tgcaatgact ccggaaagag    4920

ttcataggct cagaagtaac aatgttaaag aaattactgt gtgctcctcg accccgcttc    4980

caaaatataa gattaagaac gtccagaaag tccagtgcac taaagtagtc ctgtttaacc    5040

cgcacactcc tacttttgtc ccggcccgta aatatgtgga agtgccagaa tcacctgcca    5100

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atgttacgga catttcatta aatatggaag atagtagcga aggattgtcc attttagatt    5220

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tggggccaga ggacaataga aggcaagtag tgacagtcga tgtccactcc acccaagagg    5340

atactcccat tcctcctcca aggttaaaga aactggcccg gttagcggcg gcgaaacaga    5400

ccccagtagc acttaccgta tcgaatgatg tgggctcaat ggatgagtcc ctctgccttt    5460

catttggcag cgtatccatg tcttttggat ctttttccga cggtgagatc gatgaaataa    5520

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attccattat atcgtctcga tcagccgtgt cttttccacc gctaaggcag agacgtagac    5640

gtaggaacaa gcggactgaa tactgactaa ccggggtagg tgggtacata ttttcgacgg    5700

atacagggcc aggacatctg caaaagaagt ctgtcttgca gaatcaattt tccgaaccga    5760

ccttggagcg taacgtgctg gaaaagatat acgctccgac gcttgatacg tcgaaagaag    5820

aactactcaa atttagatac caaatgatgc ccaccgaagc caataagagc aggtaccagt    5880

cccgcaaagt cgaaaatcaa aaagccgtca ccactgagcg tttgctttca gggttacggc    5940

tatatacctc ggcaactgat cagcctgaat gttataaaat tacttacccg aaacctttgt    6000

attccagcag tgtaccagca agttactccg acccgaagtt cgcagttgcc gtctgcaata    6060

actacttgca tgaaaactac ccaacggtag cgtcctacca gattactgat gaatacgacg    6120

cttacctcga tatggtggat gggactgtcg cttgcctgga caccgcaaca ttctgcccgg    6180

ctaaactcag aagttatcca aagaggcatg agtatcgcgc accgaatatc cgtagcgcag    6240

tcccgtctgc tatgcagaac acgttgcaaa acgtgctcat cgctgcaacc aagaggaact    6300

gcaacgttac acaaatgcgt gaactaccaa cgctggactc agcgacgttt aacgtcgagt    6360

gctttaaaaa atatgcgtgc aacaatgaat actgggaaga gtttgcccgt aaaccaatta    6420

gaattaccac ggagttcgtt actgcgtatg tagccagact gaaaggacca aaggcagcag    6480

ccttatttgc aaagacgtac aatttggtcc cattgcaaga ggtacccatg gataggtttg    6540

ttatggatat gaaaagagat gtgaaagtca caccaggtac caagcacacc gaagagagac    6600

caaaggtgca ggtaatccaa gctgcagagc cactagcgac ggcatatttg tgcggaatcc    6660

atcgcgagtt ggtgcgtaga cttacggcgg tgttgctacc taacattcat acactttttg    6720

atatgtcagc agaggacttt gacgctatta tagccgaaca ctttaaacat ggcgatccgg    6780

tgctggagac agatattgct tcattcgata agagccaaga tgacgctatg gcgttgactg    6840

gcctgatgat cttggaagat ctaggcgtgg atcacctact actcgactta attgagtgtg    6900

cctttggtga aatatcgtca acacacttgc ccacgggcac tcgtttcaaa tttggtgcaa    6960

tgatgaaatc cggaatgttt cttacattat tcgttaacac agttttgaat gttgtgatcg    7020

cctgcagagt actagaggaa aggcttaaga tgtcgagatg cgcggcgttt atcggcgacg    7080

ataacattat acacggggta gtgtctgata aggtgatggc agagaggtgc gccacctggc    7140

ttaacatgga agttaagatt atcgacgcca ttatcggtga gagaccaccg tatttttgcg    7200

gtggatttat tctgcaagac tcagtcactt ccacagcgtg ccgcgtggcc gacccactga    7260

aaagattatt taagcttggt aaaccgctac cagccgacga cgagcaagac gaagatagaa    7320

ggcgagcttt attggacgaa acaaaggcgt ggttcagagt gggcattact gatactttag    7380

caactgctgt agcaacccgg tacgaggtag ataatatcac acctgtctta ttggcattga    7440

gaacgtttgc ccagagcaaa aattcgtttc aggccattag aggagaaata aagcaactct    7500

acggtggtcc taaatagtca gcatagcata ttttatctga ctaatactgt aacaccccta    7560

ctatgaatag aggattcttt aacatgcttg gccgccgccc cttcccggcc cccacttcta    7620

tgtggaggcc acgtagaagg aggcaggcgg ccccgatgcc cgcccgcaac gggttggctt    7680

cccaaattca gcagcttacc acagcagtta gcgccttggt tataggacag gcagctagac    7740

ctcaacagcc acgtcctcgc ccgccacccc gccaaaagaa gcagccgcca aagcaattac    7800

caaaaccgaa gaaaccgaaa acacaggata agaagaagcg acagcccgcg aagccgaaac    7860

ctggaaagag gcagcgcatg gcgcttaagc tagaggccga cagactgttt gatgttaaga    7920

acgagaatgg tgatgtcatc ggacatgctc tggccatgga aggaaaagta atgaaaccac    7980

tccacgtgaa aggaactata gatcacccag tgctgtcgaa gcttaaattc accaagtcgt    8040

cggcatatga catggagttt gcacaacttc ctgtcaatat gcgaagcgaa gctttcacgt    8100

acaccagcga gcacccagaa ggattctata actggcacca tggcgcagtg cagtatagtg    8160

gaggtagatt cactattccg cgtggagtag gaggcagagg tgacagcggc cgcccgatta    8220

tggacaacgc aggccgcgtc gtcgctatcg tcctcggagg agctgatgag ggaacacgta    8280

ctgccctctc ggtagttacc tggaacagta aaggaaaaac gattaagaca tcccctgagg    8340

gaactgaaga gtggtccgca gcaccgctgg ttacggccat gtgcttactt ggaaatgtaa    8400

gcttcccttg caaccgtccg cctacttgct acacccgcga accatctaga gcgttagata    8460

tcctggaaga gaatgtgaac catgaggact acgacacttt gctcgacgct atactgcgat    8520

gcgatttttc cggtagaaat aaaagaagtg ttaccggcga ctttaccttg accagcccgt    8580

acctaggtac atgtccatac tgtcaccata ccgagccgtg ctttagtccg ataaagatcg    8640

agcaggtctg ggatgaagcg gatgacacca ctatacgcat ccagacctct gcccaatttg    8700

ggtacgatca gagtggagcg acaagcgtaa ataaataccg ctacatgtcg ttcgatcagg    8760

atcatactgt gaaagaaggc cagatggacg atattaagat cagtacttca ggaccgtgca    8820

gaagacttgg ccataaaggt tacttcctcc ttgcgaaatg tccgcccggg gacagcgtga    8880

cggtcagtat agtgagcagc agttcaacta catcatgcac gttggcacgt aagataaaac    8940

cgaagtttgt gggacgggaa cggtatgatc tgccccccgt ttacggaaag aacatccctt    9000

gcagaatgta cgaccgtctg aaagaaacgt ctgctggcta tattactatg cacagacctg    9060

gcccacatgc ctacacgtcc tatctggagg aagcgtccgg aaaaatttac gctaagccac    9120

catccggaaa gaatattacc tacgagtgta aatgcggaga ctataaaaca ggaacggtaa    9180

aaacccgcac tgaaattact ggctgcactg ccattaagca gtgtgtcgct tataagagcg    9240

accaaacgaa gtgggtcttt aactcacccg acctgataag gcatgccgat cacgctgcac    9300

aaggaaagtt gcatttacct tttagattgg tcccgagttc ctgcaaggtc ccagtggctc    9360

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tgacactgct caccaccagg agactaggag cgaatcccga accaacctcc gaatggatta    9480

tcggtaagac tgttagaaat ttttctgttg gacgggacgg cttggagtat acgtggggca    9540

accacgaccc ggtaagagtt tacgctcaag aatcagcgcc tggcgatccc catggatggc    9600

ctcatgagat aatacagcat tactatcacc gccatcctgc gtataccatc ctaaccgttg    9660

tctcagctgc cgttgcagtg cttatcggct tgaccgttgc agcactgtgt acgtgtaaag    9720

cgcgacgtga atgtttaaca ccgtatgccc tagccccgaa tgccgttgtt ccgacttcga    9780

tagcgctcct atgttgcatt agatcggcta acgctgaaac attttctgag acgatgagct    9840

acctgtggtc aaacagtcag ccgttctttt gggctcagtt gtgtatcccc ttagccgctg    9900

ttgtcatcct tgtgcgttac tgttcatgtt gcttgccttt tttagtggtt gccggcgtct    9960

acctggggaa ggtagacgcc tacgaacatg cgaccaccat tccaaatgtg ccgaagattc    10020

cgtataaagc acttgtagaa cggtctggct acgccccgct taacttagag atcaccgtcg  10080

tgtcgtcgca ggttttacca tctactaatc aagagtatat cacctgcaag tttactactg  10140

tagtcccctc cccgaaagtc aaatgttgcg gctccttgga atgtcagccc gccgctcacg  10200

ccgactataa ctgcaaagtt tttggagggg tttacccatt catgtgggga ggagcacagt  10260

gtttttgcga cagcgagaac acccagatga gcgaggcgta cgtcaaactg tcagcggact  10320

gcgtaacgga ttacgcacag gcagttaagg tgcatactgc tgcaatgaag gtaggactac  10380

gcatagtgta tgggaatacc accagctatt tagatgtgta cgtgaatgga gtcacgccgg  10440

ggacatccaa agatctaaaa gtcatagctg ggccagtttc gtcctccttt acgccgttta  10500

atcataaggt tgtcatctac cgtggtttag tctataatta tgacttccct gaatacggcg  10560

caatgaaacc tggagtgttc ggagacatcc aagctacctc cttgaccagt agagacctta  10620

ttgcaagcac ggacattaga ttgcttaagc cttccgttaa aaacgtgcac gtcccgtaca  10680

cgcaagctgc ttcaggattc gagatgtgga agaacaactc aggtcgacca ctgcaggaaa  10740

ccgctccttt tgggtgtaag attgcagtca acccgctacg agcggtggac tgttcgtacg  10800

gtaatattcc tatctccatc gatatcccaa atgccgcctt cattaggata tcggatgcgc  10860

cgctagtttc gacggttaaa tgtgaggtca gcgaatgtac ctattcagct gattttggtg  10920

gtatggcaac cctgcagtat gtgtcggacc gcgaaggaca atgccccgtg cactctcact  10980

caagcacagc aacacttcag gaatcgacag tgcatgtcct ggagaaaggg gcggtgaccg  11040

tgcactttag taccgccagc ccacaggcta atttcattat atcgctgtgt ggcaagaaaa  11100

caacatgcaa cgcggaatgt aagccacctg cggaccacat tgtgagtaca ccgcacaaaa  11160

tcgatcagga gttccaaacc gctatttcaa aaacatcatg gagctggtta ctggcactct  11220

ttggcggcgc ctcgtcgcta ttaattatag gactcatgat ttttacttgc agcatgttgc  11280

tgacaagcac ccggagatga ccgctatgtc ccaatgaccc gaccagcaaa actcgacgta  11340

tttccgagga actgatgtgc ataatgcatc aggctggtat attagatccc cgctcatcgc    11400

gggcactata gcaacaatga aactcgatgt atttccgagg atgcgcagtg cataatgctg    11460

cgccgtgttg ccatataatc attttattaa tcaactattt agcagacgct aaaactcaat    11520

gtatttctga ggaagcgtgg tgcataatgc catgcagcgt ctgtataatt tcttttatta    11580

ttcttttatc aattaaccaa aattttgttt ttaacatttc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    11640

aaaaaaaaaa aaaaactcga gcaattcttg aagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt    11700

tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg    11760

aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct    11820

catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat    11880

tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc    11940

tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg    12000

ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg    12060

ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga    12120

cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta    12180

ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc    12240

tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc    12300

gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg    12360

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acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct    12540

tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat    12600

cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg    12660

gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat  12720

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tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat  12840

cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc  12900

ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct  12960

accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg  13020

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cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc  13140

tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga  13200

taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac  13260

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agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag  13380

ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg  13440

acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag  13500

caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc  13560

tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc  13620

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gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct  13740

cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat acactccgct atcgctacgt  13800

gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct  13860

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cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc tgcggtaaag ctcatcagcg  13980

tggtcgtgaa gcgattcaca gatgtctgcc tgttcatccg cgtccagctc gttgagtttc  14040

tccagaagcg ttaatgtctg gcttctgata aagcgggcca tgttaagggc ggttttttcc  14100

tgtttggtca ctgatgcctc cgtgtaaggg ggatttctgt tcatgggggt aatgataccg  14160

atgaaacgag agaggatgct cacgatacgg gttactgatg atgaacatgc ccggttactg  14220

gaacgttgtg agggtaaaca actggcggta tggatgcggc gggaccagag aaaaatcact  14280

cagggtcaat gccagcgctt cgttaataca gatgtaggtg ttccacaggg tagccagcag  14340

catcctgcga tgcagatccg gaacataatg gtgcagggcg ctgacttccg cgtttccaga  14400

ctttacgaaa cacggaaacc gaagaccatt catgttgttg ctcaggtcgc agacgttttg  14460

cagcagcagt cgcttcacgt tcgctcgcgt atcggtgatt cattctgcta accagtaagg  14520

caaccccgcc agcctagccg ggtcctcaac gacaggagca cgatcatgcg cacccgtggc  14580

caggacccaa cgctgcccga gagctcgatt taggtgacac tatag                  14625

<210>2

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aattgctcga ggtacctcta gactagtgaa ttcgcatgcg gatccaagct tgagctc         57

<210>3

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cgagctccat ggagatctga tcacttaagc gtacgcctag gttcgaactc gagagcc         57

<210>4

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cgagctcgat ttaggtgaca ctatagattg acggcgtagt acacactatt g         51

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cttgcagggg tttgtagtct tcat                                       24

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cgggatccta agcagtgtgg                                           20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ctctagatgg ttcgcgggtg                                           20

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

catctagagc gttagatatc ctg                                       23

<210>9

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ccgctcgagt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttgaaatg ttaaaaacaa    60

aattttggtt aattg                                                     75

Claims (12)

1.一种XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆，其特征在于：该克隆由低拷贝骨架质粒pBR、病毒基因组全长cDNA片段、基因组5’端的SP6启动子序列和基因组3’端的35个连续的A组成。其中所述的骨架质粒pBR是线性化的质粒pBR322与含单酶切位点的连接子连接而成；所述的病毒基因组全长cDNA片段含有11620个核甘酸，通过所述单酶切位点将覆盖病毒全长基因组的cDNA片段插入到骨架质粒pBR中；所述的SP6启动子序列位于基因组5’端上游紧邻第一个核苷酸A，所述的35个连续的A紧邻基因组3’末端核甘酸C。该感染性全基因组cDNA克隆序列为：

   1 ATTGACGGCG TAGTACACAC TATTGAATCA AACAGCCGAC CAATAGCACT

  51 ACCATCATAA TGGAGAGGCC TGTAGTTAAC GTAGACGTAG ACCCCCAGAG

 101 TCCGTTTGTC GCTCAACTGC AAAAGAGCTT CCCGCAATTC GAGGTAGTAG

 151 CACAGCAGGC CACACCAAAT GACCATGCTA ATGCCAGAGC ATTTTCGCAT

 201 CTGGCTAGTA AATTAATCGA GCTGGAGGTT CCTACCACAG CGACGATTTT

 251 GGACATAGGC AGCGCACCGG CTCGTAGAAT GTTTTCCGAG CACCACTATC

 301 ACTGCGTCTG CCCTATGCGG AGCCCCGAAG ATCCCGACCG TATGATGAAA

 351 TACGCCAATA AGTTGGCGGA GAAGGCAAAT AAGATTACTA ATAAAAATTT

 401 GCATGAGAAG ATTAAAGACC TCCGGATCGT ACTCGATACT CCGGATGCTG

 451 AGACACCGTC GCTCTGCTTC CATAATGACG TTACCTGCAG TACGCGTGCA

 501 GAGTACTCCG TTATGCAAGA TGTGTATATT AATGCACCCG GAACTATTTA

 551 CCATCAAGCT ATGAAAGGCG TGCGGACACT TTACTGGATT GGGTTTGACA

 601 CCACTCAGTT CATGTTCTCG GCTATGGCAG GATCATATCC TGCCTATAAT

 651 ACTAACTGGG CCGATGAAAA AGTCCTTGAA GCACGCAATA TTGGACTCTG

 701 TAGTACCAAG TTGAGCGAAG GCCGTATAGG AAAGTTGTCA ATAATGAGGA

 751 AAAAGGAGTT GAAGCCCGGG TCACGGGTCT ACTTCTCAGT GGGATCAACA

 801 CTCTACCCAG AATATAGGGA CAGCTTACAG AGCTGGCACC TCCCATCAGT

 851 GTTCCATCTG AAAGGAAAGC AATCGTATAC ATGCCGCTGT GATACAGTGG

 901 TAAGTTGCGA AGGCTACGTA GTGAAGAAGA TCACTATTAG TCCCGGGATT

 951 ACGGGAGAAA CCGTGGGATA CGCGGTTACA AACAATAGCG AGGGTTTCTT

1001 GCTATGTAAA GTTACTGACA CAGTAAAAGG GGAACGGGTC TCGTTCCCCG

1051 TGTGCACGTA TATCCCGGCC ACCATATGCG ACCAGATGAC AGGTATAATG

1101 GCCACGGATA TTTCACCTGA CGATGCACAG AAGCTTCTGG TTGGGCTCAA

1151 CCAGAGGATT GTCATTAACG GTAAAACCAA CAGGAACACT AACACCATGC

1201 AAAACTACCT TCTACCGATT ATAGCACAAG GCTTCAGCAA GTGGGCTAAA

1251 GAGCGCAAAG AAGATCTTGA TAATGAAAAG AAGCTGGGCA CTAGGGAGCG

1301 TAAGCTTATT TACGGGTGTC TATGGGCGGT TCGTACTAAG AAAGTGCACT

1351 CGTTTTACCG CCCGCCCGGA ACGCAGACCA GCGTGAAAGT CCCGGCATCT

1401 TTTAGCGCTT TTCCAATGTC ATCTGTATGG ACAACCTCAC TACCCATGTC

1451 GCTGAGGCAG AAGATAAAAT TGGTACTACA ACCGAAAAAG GAGGAGAAAT

1501 TACTGCAGGT CTCAGAAGAG TTAGTTGCGG AGGCTAAAGC GGCCTTTGAA

1551 GATGCACAGG AGGAGATCAG AGCGGAGCAA CTCCGTGAAG CACTTCCACC

1601 ACTGGTAGCA GACAAAGGTA TTGAAGCCGC TGCAGAAGTC GTCTGTGAAG

1651 TGGAAGGGCT TCAAGCTGAT ATAGGAGCAG CTCTTGTTGA GACGCCACGA

1701 GGGCATGTAA GGATTATACC TCAAGTAACA GACCGCATGA TTGGGCAGTA

1751 CATCGTGGTC TCACCAACCT CCGTGCTTAA GAACGCCAAA TTAACACCTG

1801 TTCACCCTTT GGCTGACCAA GTCAAAATTA TAACACATTC AGGGAGGACA

1851 GGAAGATTCG CGGTGGAGCC GTATGATGCT AAAGTGTTGA TGCCAGCAGG

1901 TAGCGCCGTT CCATGGCCTG AGTTCCTGGC GTTAAGTGAA AGCGCCACGC

1951 TAGTGTATAA CGAAAGAGAA TTTGTCAACC GCAAACTTTA CCATATCGCC

2001 ATACATGGTC CCGCGAAGAA TACTGAAGAG GAGCAGTATA AAGTCACTAA

2051 AGCCGAACTC GCAGAAACAG AGTATGTATT TGATGTCGAC AAGAAGCGTT

2101 GCGTTAAGAA GGAAGAGGCC TCGGGGCTGG TTCTCTCGGG AGAACTAACT

2151 AACCCACCGT ATCATGAAAT GGCGCTTGAG GGGCTGAAGA CTCGACCCGC

2201 TGTTCCGTAT AAGGTCGAAA CAATAGGAGT AATAGGCACA CCAGGATCAG

2251 GCAAGTCTGC GATTATTAAA TCGACCGTTA CCGTACGAGA TCTTGTTACC

2301 AGCGGAAAGA AGGAAAACTG CCGTGAAATT GAAACTGACG TGTTGAGGTT

2351 GAGAGGTATG CAGATCACGT CAAGGACGGT AGACTCAGTC ATGCTTAACG

2401 GATGCCATAA AGCCGTTGAG GTGCTATACG TTGATGAAGC ATTTGCGTGC

2451 CATGCTGGTA CGTTGCTTGC CTTGATCGCT ATTGTTAGAC CCCGAAAGAA

2501 GGTAGTACTT CGCGGGGATC CTAAGCAGTG TGGTTTTTTC AATATGATGC

2551 AGCTCAAAGT ACATTTTAAT CACCCTGAAA AAGATATATG TACTAAGACG

2601 TTTTACAAAT TCATCTCTCG ACGCTGCACG CAACCAGTAA CGGCGATTGT

2651 TTCAACACTT CATTACGACG GAAAGATGAA GACTACAAAC CCCTGCAAGA

2701 AGAGCATTGA GATAGATATT ACAGGTACTA CGAAGCCGAA GCCCGGGGAC

2751 CTCGTTTTGA CGTGCTTCCG CGGATGGGTC AAGCAGCTAC AGATCGATTA

2801 CGCGGGAAAT GAAGTGATGA CGGCTGCTGC CTCGCAGGGA CTGACTAGAA

2851 AGGGTGTTTA CGCCGTTCGG CAAAAAGTTA ATGAGAATCC ACTGTACGCG

2901 ATTACGTCGG AGCACGTGAA CGTGTTACTC ACCCGTACTG AGGATAGATT

2951 AGTGTGGAAG ACCTTACAGG GCGATCCATG GATCAAACAA CTTACTAACA

3001 TTCCGAAAGG AAACTTCCAA GCTACTATTG AGGACTGGGA AGCTGAACAT

3051 AAGGGGATCA TCGCTGCAAT AAACAGCCCA ACCCCTCGTA TAAACCCGTT

3101 CAGCTGTAAG ACTAATGTGT GCTGGGCGAA GGCACTGGAA CCGATACTGG

3151 CCACAGCCGG TATTGTCCTC ACCGGTTGCC AGTGGAGTGA GCTGTTTCCA

3201 CAGTTCGTAG ATGATAAACC CCACTCAGCT ATCTACGCCC TAGATGTGAT

3251 TTGTATTAAG TTCTTTGGTA TGGATCTGAC AAGCGGTCTA TTTTCAAAGC

3301 AGAGCATCCC TCTGACGTAC CACCCTGCGG ACTCTGCAAG GCCAGTGGCG

3351 CATTGGGACA ACAGTCCAGG AACCCGAAAG TATGGATACG ATCATGCGGT

3401 TGCTGCCGAA TTGTCTCGTA GATTCCCGGT GTTCCAACTT GCTGGAAAAG

3451 GCACACAGCT TGACTTGCAG ACTGGTAGAA CCAGAGTCGT TTCCGCGCAG

3501 TGTAACTTGG TCCCAGTGAA CCGTAACCTC CCGCACGCTC TTGTCCCCGA

3551 GTATAAAGAG AAACAACCCG GCCCGATTAA AAATTTTTTA AATCAGTTTA

3601 AGCATCACTC CATACTTGTA GTATCAGAAA CGAAAATCGA AGTTCCCAAT

3651 AAGCGCATCG AATGGATTGC ACCGCTTGGC ATAGCTGGTG CAGATAAGAG

3701 CTACAACCTG GCCTTCGGAT TTCCACCGCA GGCACGGTAT GATATGGTGT

3751 TTATCAATAT AGGAACAAAA TATAGAAACC ACCATTTTCA ACAGTGTGAA

3801 GACCATGCGG CGACTTTGAA GACTCTTTCC CGCTCGGCTC TGAATTGCCT

3851 CAACCCTGGA GGCACCTTAG TGGTGAAATC CTATGGATAT GCTGATCGCA

3901 ATAGCGAGGA CGTAGTCACC GCACTTGCCA GGAAGTTTGT TAGAGTGTCT

3951 GCGGCCAGGC CAGAGTGCGT CTCAAGTAAC ACAGAAATGT ACCTAATCTT

4001 TCGGCAATTA GATAATAGCC GTACACGGCA GTTCACTCCA CATCATTTGA

4051 ACTGTGTAAT CTCGTCGGTG TATGAAGGCA CGAGAGAAGG AGTCGGAGCT

4101 GCGCCATCCT ACCGTGTGAA ACGGGAAAAT ATTGCAGACT GCCATGAGGA

4151 AGCAATCGTC AACGCCGCTA ACTCGCTGGG TAAACCAGGT GAAGGAGTTT

4201 GCCGCGCCGT CTACAAGCGT TGGCCGAGCA GCTTTATGGA TTCCGCCACA

4251 GAAACGGGTA CGGCTAAATT AACTGTAAGC CAAGGAATGA AAGTGATACA

4301 CGCGGTCGGC CCTGACTTCC GTAAGTATCC TGAGGCGGAA GCTTTGAAGC

4351 TGCTGCAAAA CGCTTACCAT GCAGTGGCGG ACTTGGTTAA CAAACACAAC

4401 ATTAAGTCCA TTGCTATCCC GCTACTATCA ACAGGTATAT ATGCAGCTGG

4451 TAAGGATCGC TTGGAAGTTT CGCTCAATTG CCTGACCACC GCACTAGACA

4501 GGACCGATGC AGATGTAACT ATTTATTGTT TGGATAAGAA ATGGAAAGAG

4551 AGAATTGACG CGGTGTTGCA ACTTAAGGAG TCAGTGACAG AACTGAAGGA

4601 CGAGGACATG GAAATCGATG ACGAATTGGT ATGGATTCAT CCGGATAGTT

4651 GTCTAAAAGG GAGAAAGGGA TACAGTACTA CAAAAGGAAA GCTATATTCG

4701 TACTTTGAGG GTACTAAATT TCACCAAGCA GCCAAAGATA TGGCTGAAAT

4751 AAAAGTGCTG TTTCCGGACG ACCAGGAAAG CAACGAACAG TTATGCGCTT

4801 ACATACTGGG CGAAACCATG GAAGCAATTC GTGAAAAATG CCCAGTTGAT

4851 CGTAACCCGT CATCCAGTCC TCCGAAGACG CTGCCTTGCC TTTGCATGTA

4901 TGCAATGACT CCGGAAAGAG TTCATAGGCT CAGAAGTAAC AATGTTAAAG

4951 AAATTACTGT GTGCTCCTCG ACCCCGCTTC CAAAATATAA GATTAAGAAC

5001 GTCCAGAAAG TCCAGTGCAC TAAAGTAGTC CTGTTTAACC CGCACACTCC

5051 TACTTTTGTC CCGGCCCGTA AATATGTGGA AGTGCCAGAA TCACCTGCCA

5101 TCACACCTGT ACAGGCCGAC ACGCTAGATC AGCCACCTGC CGCGGACGGT

5151 ATACCGCTTG ATGTTACGGA CATTTCATTA AATATGGAAG ATAGTAGCGA

5201 AGGATTGTCC ATTTTAGATT TCCACGGGTC AGAAAGTTCC ATTTTTAGCA

5251 TGGATAGCTG GTCGTCAGGA ACCAGTTCTT TGGGGCCAGA GGACAATAGA

5301 AGGCAAGTAG TGACAGTCGA TGTCCACTCC ACCCAAGAGG ATACTCCCAT

5351 TCCTCCTCCA AGGTTAAAGA AACTGGCCCG GTTAGCGGCG GCGAAACAGA

5401 CCCCAGTAGC ACTTACCGTA TCGAATGATG TGGGCTCAAT GGATGAGTCC

5451 CTCTGCCTTT CATTTGGCAG CGTATCCATG TCTTTTGGAT CTTTTTCCGA

5501 CGGTGAGATC GATGAAATAA GTCGTATGAA GACTGAGTCA GAACCCGTTT

5551 TATTTGGAAC TTTTGAACCT GGAGAAGTTA ATTCCATTAT ATCGTCTCGA

5601 TCAGCCGTGT CTTTTCCACC GCTAAGGCAG AGACGTAGAC GTAGGAACAA

5651 GCGGACTGAA TACTGACTAA CCGGGGTAGG TGGGTACATA TTTTCGACGG

5701 ATACAGGGCC AGGACATCTG CAAAAGAAGT CTGTCTTGCA GAATCAATTT

5751 TCCGAACCGA CCTTGGAGCG TAACGTGCTG GAAAAGATAT ACGCTCCGAC

5801 GCTTGATACG TCGAAAGAAG AACTACTCAA ATTTAGATAC CAAATGATGC

5851 CCACCGAAGC CAATAAGAGC AGGTACCAGT CCCGCAAAGT CGAAAATCAA

5901 AAAGCCGTCA CCACTGAGCG TTTGCTTTCA GGGTTACGGC TATATACCTC

5951 GGCAACTGAT CAGCCTGAAT GTTATAAAAT TACTTACCCG AAACCTTTGT

6001 ATTCCAGCAG TGTACCAGCA AGTTACTCCG ACCCGAAGTT CGCAGTTGCC

6051 GTCTGCAATA ACTACTTGCA TGAAAACTAC CCAACGGTAG CGTCCTACCA

6101 GATTACTGAT GAATACGACG CTTACCTCGA TATGGTGGAT GGGACTGTCG

6151 CTTGCCTGGA CACCGCAACA TTCTGCCCGG CTAAACTCAG AAGTTATCCA

6201 AAGAGGCATG AGTATCGCGC ACCGAATATC CGTAGCGCAG TCCCGTCTGC

6251 TATGCAGAAC ACGTTGCAAA ACGTGCTCAT CGCTGCAACC AAGAGGAACT

6301 GCAACGTTAC ACAAATGCGT GAACTACCAA CGCTGGACTC AGCGACGTTT

6351 AACGTCGAGT GCTTTAAAAA ATATGCGTGC AACAATGAAT ACTGGGAAGA

6401 GTTTGCCCGT AAACCAATTA GAATTACCAC GGAGTTCGTT ACTGCGTATG

6451 TAGCCAGACT GAAAGGACCA AAGGCAGCAG CCTTATTTGC AAAGACGTAC

6501 AATTTGGTCC CATTGCAAGA GGTACCCATG GATAGGTTTG TTATGGATAT

6551 GAAAAGAGAT GTGAAAGTCA CACCAGGTAC CAAGCACACC GAAGAGAGAC

6601 CAAAGGTGCA GGTAATCCAA GCTGCAGAGC CACTAGCGAC GGCATATTTG

6651 TGCGGAATCC ATCGCGAGTT GGTGCGTAGA CTTACGGCGG TGTTGCTACC

6701 TAACATTCAT ACACTTTTTG ATATGTCAGC AGAGGACTTT GACGCTATTA

6751 TAGCCGAACA CTTTAAACAT GGCGATCCGG TGCTGGAGAC AGATATTGCT

6801 TCATTCGATA AGAGCCAAGA TGACGCTATG GCGTTGACTG GCCTGATGAT

6851 CTTGGAAGAT CTAGGCGTGG ATCACCTACT ACTCGACTTA ATTGAGTGTG

6901 CCTTTGGTGA AATATCGTCA ACACACTTGC CCACGGGCAC TCGTTTCAAA

6951 TTTGGTGCAA TGATGAAATC CGGAATGTTT CTTACATTAT TCGTTAACAC

7001 AGTTTTGAAT GTTGTGATCG CCTGCAGAGT ACTAGAGGAA AGGCTTAAGA

7051 TGTCGAGATG CGCGGCGTTT ATCGGCGACG ATAACATTAT ACACGGGGTA

7101 GTGTCTGATA AGGTGATGGC AGAGAGGTGC GCCACCTGGC TTAACATGGA

7151 AGTTAAGATT ATCGACGCCA TTATCGGTGA GAGACCACCG TATTTTTGCG

7201 GTGGATTTAT TCTGCAAGAC TCAGTCACTT CCACAGCGTG CCGCGTGGCC

7251 GACCCACTGA AAAGATTATT TAAGCTTGGT AAACCGCTAC CAGCCGACGA

7301 CGAGCAAGAC GAAGATAGAA GGCGAGCTTT ATTGGACGAA ACAAAGGCGT

7351 GGTTCAGAGT GGGCATTACT GATACTTTAG CAACTGCTGT AGCAACCCGG

7401 TACGAGGTAG ATAATATCAC ACCTGTCTTA TTGGCATTGA GAACGTTTGC

7451 CCAGAGCAAA AATTCGTTTC AGGCCATTAG AGGAGAAATA AAGCAACTCT

7501 ACGGTGGTCC TAAATAGTCA GCATAGCATA TTTTATCTGA CTAATACTGT

7551 AACACCCCTA CTATGAATAG AGGATTCTTT AACATGCTTG GCCGCCGCCC

7601 CTTCCCGGCC CCCACTTCTA TGTGGAGGCC ACGTAGAAGG AGGCAGGCGG

7651 CCCCGATGCC CGCCCGCAAC GGGTTGGCTT CCCAAATTCA GCAGCTTACC

7701 ACAGCAGTTA GCGCCTTGGT TATAGGACAG GCAGCTAGAC CTCAACAGCC

7751 ACGTCCTCGC CCGCCACCCC GCCAAAAGAA GCAGCCGCCA AAGCAATTAC

7801 CAAAACCGAA GAAACCGAAA ACACAGGATA AGAAGAAGCG ACAGCCCGCG

7851 AAGCCGAAAC CTGGAAAGAG GCAGCGCATG GCGCTTAAGC TAGAGGCCGA

7901 CAGACTGTTT GATGTTAAGA ACGAGAATGG TGATGTCATC GGACATGCTC

7951 TGGCCATGGA AGGAAAAGTA ATGAAACCAC TCCACGTGAA AGGAACTATA

8001 GATCACCCAG TGCTGTCGAA GCTTAAATTC ACCAAGTCGT CGGCATATGA

8051 CATGGAGTTT GCACAACTTC CTGTCAATAT GCGAAGCGAA GCTTTCACGT

8101 ACACCAGCGA GCACCCAGAA GGATTCTATA ACTGGCACCA TGGCGCAGTG

8151 CAGTATAGTG GAGGTAGATT CACTATTCCG CGTGGAGTAG GAGGCAGAGG

8201 TGACAGCGGC CGCCCGATTA TGGACAACGC AGGCCGCGTC GTCGCTATCG

8251 TCCTCGGAGG AGCTGATGAG GGAACACGTA CTGCCCTCTC GGTAGTTACC

8301 TGGAACAGTA AAGGAAAAAC GATTAAGACA TCCCCTGAGG GAACTGAAGA

8351 GTGGTCCGCA GCACCGCTGG TTACGGCCAT GTGCTTACTT GGAAATGTAA

8401 GCTTCCCTTG CAACCGTCCG CCTACTTGCT ACACCCGCGA ACCATCTAGA

8451 GCGTTAGATA TCCTGGAAGA GAATGTGAAC CATGAGGACT ACGACACTTT

8501 GCTCGACGCT ATACTGCGAT GCGATTTTTC CGGTAGAAAT AAAAGAAGTG

 8551 TTACCGGCGA CTTTACCTTG ACCAGCCCGT ACCTAGGTAC ATGTCCATAC

 8601 TGTCACCATA CCGAGCCGTG CTTTAGTCCG ATAAAGATCG AGCAGGTCTG

 8651 GGATGAAGCG GATGACACCA CTATACGCAT CCAGACCTCT GCCCAATTTG

 8701 GGTACGATCA GAGTGGAGCG ACAAGCGTAA ATAAATACCG CTACATGTCG

 8751 TTCGATCAGG ATCATACTGT GAAAGAAGGC CAGATGGACG ATATTAAGAT

 8801 CAGTACTTCA GGACCGTGCA GAAGACTTGG CCATAAAGGT TACTTCCTCC

 8851 TTGCGAAATG TCCGCCCGGG GACAGCGTGA CGGTCAGTAT AGTGAGCAGC

 8901 AGTTCAACTA CATCATGCAC GTTGGCACGT AAGATAAAAC CGAAGTTTGT

 8951 GGGACGGGAA CGGTATGATC TGCCCCCCGT TTACGGAAAG AACATCCCTT

 9001 GCAGAATGTA CGACCGTCTG AAAGAAACGT CTGCTGGCTA TATTACTATG

 9051 CACAGACCTG GCCCACATGC CTACACGTCC TATCTGGAGG AAGCGTCCGG

 9101 AAAAATTTAC GCTAAGCCAC CATCCGGAAA GAATATTACC TACGAGTGTA

 9151 AATGCGGAGA CTATAAAACA GGAACGGTAA AAACCCGCAC TGAAATTACT

 9201 GGCTGCACTG CCATTAAGCA GTGTGTCGCT TATAAGAGCG ACCAAACGAA

 9251 GTGGGTCTTT AACTCACCCG ACCTGATAAG GCATGCCGAT CACGCTGCAC

 9301 AAGGAAAGTT GCATTTACCT TTTAGATTGG TCCCGAGTTC CTGCAAGGTC

 9351 CCAGTGGCTC ACGCACCGAG TGTAGTGCAC GGCTTCAAAC ACATTAGCCT

 9401 CCAACTGGAT ACGGACCACC TGACACTGCT CACCACCAGG AGACTAGGAG

 9451 CGAATCCCGA ACCAACCTCC GAATGGATTA TCGGTAAGAC TGTTAGAAAT

 9501 TTTTCTGTTG GACGGGACGG CTTGGAGTAT ACGTGGGGCA ACCACGACCC

 9551 GGTAAGAGTT TACGCTCAAG AATCAGCGCC TGGCGATCCC CATGGATGGC

 9601 CTCATGAGAT AATACAGCAT TACTATCACC GCCATCCTGC GTATACCATC

 9651 CTAACCGTTG TCTCAGCTGC CGTTGCAGTG CTTATCGGCT TGACCGTTGC

 9701 AGCACTGTGT ACGTGTAAAG CGCGACGTGA ATGTTTAACA CCGTATGCCC

 9751 TAGCCCCGAA TGCCGTTGTT CCGACTTCGA TAGCGCTCCT ATGTTGCATT

 9801 AGATCGGCTA ACGCTGAAAC ATTTTCTGAG ACGATGAGCT ACCTGTGGTC

 9851 AAACAGTCAG CCGTTCTTTT GGGCTCAGTT GTGTATCCCC TTAGCCGCTG

 9901 TTGTCATCCT TGTGCGTTAC TGTTCATGTT GCTTGCCTTT TTTAGTGGTT

 9951 GCCGGCGTCT ACCTGGGGAA GGTAGACGCC TACGAACATG CGACCACCAT

10001 TCCAAATGTG CCGAAGATTC CGTATAAAGC ACTTGTAGAA CGGTCTGGCT

10051 ACGCCCCGCT TAACTTAGAG ATCACCGTCG TGTCGTCGCA GGTTTTACCA

10101 TCTACTAATC AAGAGTATAT CACCTGCAAG TTTACTACTG TAGTCCCCTC

10151 CCCGAAAGTC AAATGTTGCG GCTCCTTGGA ATGTCAGCCC GCCGCTCACG

10201 CCGACTATAA CTGCAAAGTT TTTGGAGGGG TTTACCCATT CATGTGGGGA

10251 GGAGCACAGT GTTTTTGCGA CAGCGAGAAC ACCCAGATGA GCGAGGCGTA

10301 CGTCAAACTG TCAGCGGACT GCGTAACGGA TTACGCACAG GCAGTTAAGG

10351 TGCATACTGC TGCAATGAAG GTAGGACTAC GCATAGTGTA TGGGAATACC

10401 ACCAGCTATT TAGATGTGTA CGTGAATGGA GTCACGCCGG GGACATCCAA

10451 AGATCTAAAA GTCATAGCTG GGCCAGTTTC GTCCTCCTTT ACGCCGTTTA

10501 ATCATAAGGT TGTCATCTAC CGTGGTTTAG TCTATAATTA TGACTTCCCT

10551 GAATACGGCG CAATGAAACC TGGAGTGTTC GGAGACATCC AAGCTACCTC

10601 CTTGACCAGT AGAGACCTTA TTGCAAGCAC GGACATTAGA TTGCTTAAGC

10651 CTTCCGTTAA AAACGTGCAC GTCCCGTACA CGCAAGCTGC TTCAGGATTC

10701 GAGATGTGGA AGAACAACTC AGGTCGACCA CTGCAGGAAA CCGCTCCTTT

10751 TGGGTGTAAG ATTGCAGTCA ACCCGCTACG AGCGGTGGAC TGTTCGTACG

10801 GTAATATTCC TATCTCCATC GATATCCCAA ATGCCGCCTT CATTAGGATA

10851 TCGGATGCGC CGCTAGTTTC GACGGTTAAA TGTGAGGTCA GCGAATGTAC

10901 CTATTCAGCT GATTTTGGTG GTATGGCAAC CCTGCAGTAT GTGTCGGACC

10951 GCGAAGGACA ATGCCCCGTG CACTCTCACT CAAGCACAGC AACACTTCAG

11001 GAATCGACAG TGCATGTCCT GGAGAAAGGG GCGGTGACCG TGCACTTTAG

11051 TACCGCCAGC CCACAGGCTA ATTTCATTAT ATCGCTGTGT GGCAAGAAAA

11101 CAACATGCAA CGCGGAATGT AAGCCACCTG CGGACCACAT TGTGAGTACA

11151 CCGCACAAAA TCGATCAGGA GTTCCAAACC GCTATTTCAA AAACATCATG

11201 GAGCTGGTTA CTGGCACTCT TTGGCGGCGC CTCGTCGCTA TTAATTATAG

11251 GACTCATGAT TTTTACTTGC AGCATGTTGC TGACAAGCAC CCGGAGATGA

11301 CCGCTATGTC CCAATGACCC GACCAGCAAA ACTCGACGTA TTTCCGAGGA

11351 ACTGATGTGC ATAATGCATC AGGCTGGTAT ATTAGATCCC CGCTCATCGC

11401 GGGCACTATA GCAACAATGA AACTCGATGT ATTTCCGAGG ATGCGCAGTG

11451 CATAATGCTG CGCCGTGTTG CCATATAATC ATTTTATTAA TCAACTATTT

11501 AGCAGACGCT AAAACTCAAT GTATTTCTGA GGAAGCGTGG TGCATAATGC

11551 CATGCAGCGT CTGTATAATT TCTTTTATTA TTCTTTTATC AATTAACCAA

11601 AATTTTGTTT TTAACATTTC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

11651 AAAAACTCGA GCAATTCTTG AAGACGAAAG GGCCTCGTGA TACGCCTATT

11701 TTTATAGGTT AATGTCATGA TAATAATGGT TTCTTAGACG TCAGGTGGCA

11751 CTTTTCGGGG AAATGTGCGC GGAACCCCTA TTTGTTTATT TTTCTAAATA

11801 CATTCAAATA TGTATCCGCT CATGAGACAA TAACCCTGAT AAATGCTTCA

11851 ATAATATTGA AAAAGGAAGA GTATGAGTAT TCAACATTTC CGTGTCGCCC

11901 TTATTCCCTT TTTTGCGGCA TTTTGCCTTC CTGTTTTTGC TCACCCAGAA

11951 ACGCTGGTGA AAGTAAAAGA TGCTGAAGAT CAGTTGGGTG CACGAGTGGG

12001 TTACATCGAA CTGGATCTCA ACAGCGGTAA GATCCTTGAG AGTTTTCGCC

12051 CCGAAGAACG TTTTCCAATG ATGAGCACTT TTAAAGTTCT GCTATGTGGC

12101 GCGGTATTAT CCCGTGTTGA CGCCGGGCAA GAGCAACTCG GTCGCCGCAT

12151 ACACTATTCT CAGAATGACT TGGTTGAGTA CTCACCAGTC ACAGAAAAGC

12201 ATCTTACGGA TGGCATGACA GTAAGAGAAT TATGCAGTGC TGCCATAACC

12251 ATGAGTGATA ACACTGCGGC CAACTTACTT CTGACAACGA TCGGAGGACC

12301 GAAGGAGCTA ACCGCTTTTT TGCACAACAT GGGGGATCAT GTAACTCGCC

12351 TTGATCGTTG GGAACCGGAG CTGAATGAAG CCATACCAAA CGACGAGCGT

12401 GACACCACGA TGCCTGCAGC AATGGCAACA ACGTTGCGCA AACTATTAAC

12451 TGGCGAACTA CTTACTCTAG CTTCCCGGCA ACAATTAATA GACTGGATGG

12501 AGGCGGATAA AGTTGCAGGA CCACTTCTGC GCTCGGCCCT TCCGGCTGGC

12551 TGGTTTATTG CTGATAAATC TGGAGCCGGT GAGCGTGGGT CTCGCGGTAT

12601 CATTGCAGCA CTGGGGCCAG ATGGTAAGCC CTCCCGTATC GTAGTTATCT

12651 ACACGACGGG GAGTCAGGCA ACTATGGATG AACGAAATAG ACAGATCGCT

12701 GAGATAGGTG CCTCACTGAT TAAGCATTGG TAACTGTCAG ACCAAGTTTA

12751 CTCATATATA CTTTAGATTG ATTTAAAACT TCATTTTTAA TTTAAAAGGA

12801 TCTAGGTGAA GATCCTTTTT GATAATCTCA TGACCAAAAT CCCTTAACGT

12851 GAGTTTTCGT TCCACTGAGC GTCAGACCCC GTAGAAAAGA TCAAAGGATC

12901 TTCTTGAGAT CCTTTTTTTC TGCGCGTAAT CTGCTGCTTG CAAACAAAAA

12951 AACCACCGCT ACCAGCGGTG GTTTGTTTGC CGGATCAAGA GCTACCAACT

13001 CTTTTTCCGA AGGTAACTGG CTTCAGCAGA GCGCAGATAC CAAATACTGT

13051 CCTTCTAGTG TAGCCGTAGT TAGGCCACCA CTTCAAGAAC TCTGTAGCAC

13101 CGCCTACATA CCTCGCTCTG CTAATCCTGT TACCAGTGGC TGCTGCCAGT

13151 GGCGATAAGT CGTGTCTTAC CGGGTTGGAC TCAAGACGAT AGTTACCGGA

13201 TAAGGCGCAG CGGTCGGGCT GAACGGGGGG TTCGTGCACA CAGCCCAGCT

13251 TGGAGCGAAC GACCTACACC GAACTGAGAT ACCTACAGCG TGAGCTATGA

13301 GAAAGCGCCA CGCTTCCCGA AGGGAGAAAG GCGGACAGGT ATCCGGTAAG

13351 CGGCAGGGTC GGAACAGGAG AGCGCACGAG GGAGCTTCCA GGGGGAAACG

13401 CCTGGTATCT TTATAGTCCT GTCGGGTTTC GCCACCTCTG ACTTGAGCGT

13451 CGATTTTTGT GATGCTCGTC AGGGGGGCGG AGCCTATGGA AAAACGCCAG

13501 CAACGCGGCC TTTTTACGGT TCCTGGCCTT TTGCTGGCCT TTTGCTCACA

13551 TGTTCTTTCC TGCGTTATCC CCTGATTCTG TGGATAACCG TATTACCGCC

13601 TTTGAGTGAG CTGATACCGC TCGCCGCAGC CGAACGACCG AGCGCAGCGA

13651 GTCAGTGAGC GAGGAAGCGG AAGAGCGCCT GATGCGGTAT TTTCTCCTTA

13701 CGCATCTGTG CGGTATTTCA CACCGCATAT GGTGCACTCT CAGTACAATC

13751 TGCTCTGATG CCGCATAGTT AAGCCAGTAT ACACTCCGCT ATCGCTACGT

13801 GACTGGGTCA TGGCTGCGCC CCGACACCCG CCAACACCCG CTGACGCGCC

13851 CTGACGGGCT TGTCTGCTCC CGGCATCCGC TTACAGACAA GCTGTGACCG

13901 TCTCCGGGAG CTGCATGTGT CAGAGGTTTT CACCGTCATC ACCGAAACGC

13951 GCGAGGCAGC TGCGGTAAAG CTCATCAGCG TGGTCGTGAA GCGATTCACA

14001 GATGTCTGCC TGTTCATCCG CGTCCAGCTC GTTGAGTTTC TCCAGAAGCG

14051 TTAATGTCTG GCTTCTGATA AAGCGGGCCA TGTTAAGGGC GGTTTTTTCC

14101 TGTTTGGTCA CTGATGCCTC CGTGTAAGGG GGATTTCTGT TCATGGGGGT

14151 AATGATACCG ATGAAACGAG AGAGGATGCT CACGATACGG GTTACTGATG

14201 ATGAACATGC CCGGTTACTG GAACGTTGTG AGGGTAAACA ACTGGCGGTA

14251 TGGATGCGGC GGGACCAGAG AAAAATCACT CAGGGTCAAT GCCAGCGCTT

14301 CGTTAATACA GATGTAGGTG TTCCACAGGG TAGCCAGCAG CATCCTGCGA

14351 TGCAGATCCG GAACATAATG GTGCAGGGCG CTGACTTCCG CGTTTCCAGA

14401 CTTTACGAAA CACGGAAACC GAAGACCATT CATGTTGTTG CTCAGGTCGC

14451 AGACGTTTTG CAGCAGCAGT CGCTTCACGT TCGCTCGCGT ATCGGTGATT

14501 CATTCTGCTA ACCAGTAAGG CAACCCCGCC AGCCTAGCCG GGTCCTCAAC

14551 GACAGGAGCA CGATCATGCG CACCCGTGGC CAGGACCCAA CGCTGCCCGA

14601 GAGCTCGATT TAGGTGACAC TATAG

其中：1-11620      病毒核苷酸序列

      11621-11655  polyA序列

      11656-11661  XhoI酶切位点

      11656-14606  pBR骨架质粒序列

      14601-14606  SacI酶切位点

      14607-14625  SP6启动子序列

2.根据权利要求1所述的XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆，其特征在于所述的线性化的质粒pBR322是通过EcoR I和Ava I酶切，除去质粒pBR322中四环素抗性基因Tetr后的剩余部分。

3.根据权利要求1或2所述的XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆，其特征在于所述的连接子由两个互补的寡核苷酸片段SX-和SX+经退火获得，其中SX-和SX+的序列分别为：

SX-：5’AATTG CTCGAG GTACC TCTAGA CTAGT GAATTC GCATGC GGATCC

        AAGCTT GAGCTC 3’：

SX+：3’C GAGCTC CATGG AGATCT GATCA CTTAAG CGTACG CCTAGG TTCGAA

        CTCGAG AGCC 5’

因而生成的所述单酶切位点为Sac I，Hind III，BamH I，Sph I，EcoR I，Spe I，Xba I，Kpn I和Xho I。

4.根据权利要求1或2所述的XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆，其特征在于所述的覆盖病毒全长基因组cDNA片段包括三个组装片段NS1、6K和S2，分别依次对应于XJ-160病毒基因组第1-2516位、第2517-8451位、  第8452-11626位核苷酸，同时在NS1片段5’端引入SP6启动子序列，在S2片段3’端引入35个连续的A，第8453位核苷酸由基因组中的C突变为T，由此引入的Xba I位点作为鉴别恢复病毒的遗传标记。

5.一种权利要求1所述的XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆的构建方法，其特征在于它包括：

(1)从感染XJ-160病毒的乳小鼠脑组织提取RNA；

(2)用三对引物通过RT-PCR扩增，得到覆盖病毒全长基因组的三个cDNA组装片段；

(3)制备上述三个cDNA组装片段的T载体克隆；

(4)经亚克隆操作构建得到XJ-160病毒的全长基因组cDNA克隆；

(5)体外转录制备病毒基因组全长RNA；

(6)用脂质体转染的方法将上述全长RNA导入哺乳动物细胞；

(7)收取含恢复病毒的细胞上清；

(8)对恢复病毒进行遗传标记的鉴定；

(9)比较恢复病毒与亲本病毒的生物学特性。

6.根据权利要求5所述的XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆的构建方法，其特征在于所述的三对引物及其序列为：

Sp6f2  5’CGAGCTCGATTTAGGTGACACTATAGATTGATTGACGGCGTAGTACACACTATTG 3’

BamR2  5’CTTGCAGGGGTTTGTAGTCTTCAT 3’

P5     5’CGGGATCCTAAGCAGTGTGG 3’

XbR    5’CTCTAGATGGTTCGCGGGTG 3’

XbF    5’CATCTAGAGCGTTAGATATCCTG 3’

X2     5’CCGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

          GAAATGTTAAAAACAAAATTTTGGTTAATTG 3’

由Sp6f2和BamR2扩增得到NS1片段，由P5和XbR扩增得到6K片段，由XbF和X2扩增得到S2片段。

7.根据权利要求5或6所述的XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆的构建方法，其特征在于所述的病毒基因组全长cDNA片段的亚克隆操作，包括下述步骤：(1)Xba I/Xho I双酶切pGEMT-S2质粒和pBR骨架质粒，得到S2片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-S2；(2)BamH I/Xba I双酶切pGEMT-6K质粒和pBR-S2质粒，得到6kb片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-6K-S2；(3)Sac I/BamH I双酶切pGEMT-NS1质粒和pBR-6K-S2质粒，得到NS1片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-NS1-6K-S2，该质粒即为XJ-160病毒全基因组cDNA克隆质粒，命名为pBR-XJ160。

8.一种根据权利要求1所述的由线性化的质粒pBR322与含单酶切位点的连接子连接而成的骨架质粒pBR，其特征在于所述的线性化的质粒pBR322是通过EcoR I和AvaI酶切除去质粒pBR322中四环素抗性基因Tetr后的剩余部分；所述的连接子由两个互补的寡核苷酸片段SX-和SX+经退火获得，其中SX-和SX+的序列分别为：

SX-：5’AATTG CTCGAG GTACC TCTAGA CTAGT GAATTC GCATGC GGATCC

        AAGCTT GAGCTC 3’；

SX+：3’C GAGCTC CATGG AGATCT GATCA CTTAAG CGTACG CCTAGG TTCGAA

        CTCGAG AGCC 5’

因而生成的所述单酶切位点为Sac I，Hind III，BamH I，Sph I，EcoR I，Spe I，Xba I，Kpn I和Xho I。

9.一种根据权利要求8中所述的骨架质粒pBR作为制备RNA病毒全长基因组感染性cDNA克隆载体的用途。

10.根据权利要求9中所述的骨架质粒pBR作为制备RNA病毒全长基因组感染性cDNA克隆载体的用途，其特征在于所述的RNA病毒为披膜病毒科病毒。

11.根据权利要求9中所述的骨架质粒pBR作为制备RNA病毒全长基因组感染性cDNA克隆载体的用途，其特征在于所述的RNA病毒为甲病毒属病毒。

12.根据权利要求9中所述的骨架质粒pBR作为制备RNA病毒全长基因组感染性cDNA克隆载体的用途，其特征在于所述的RNA病毒为辛德毕斯病毒。

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