CN1922309A

CN1922309A - 具有反式互补的基因组缺陷的呼吸道合胞病毒

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Publication number: CN1922309A
Application number: CNA2004800420638A
Authority: CN
Inventors: 威廉·卢伊特杰斯; 迈拉·努尔利·维佐约阿特莫佐
Original assignee: STAAT DER NEDERLANDEN VERT DOO
Current assignee: STAAT DER NEDERLANDEN VERT DOO
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2004-12-24
Publication date: 2007-02-28
Anticipated expiration: 2024-12-24
Also published as: DK1699919T3; EA011878B1; KR20070022210A; JP4814799B2; KR101266715B1; PT1699919T; US9107939B2; EA200601218A1; HUE032898T2; NZ548107A; US20100291035A1; ES2670713T3; US20150329833A1; US9889168B2; BRPI0418093A; NO334756B1; ES2618523T3; ZA200605218B; AU2004303719B2; JP2007516721A

Abstract

本发明涉及包含病毒基因组的肺病毒的病毒体，其中所述病毒基因组在编码肺病毒感染性所必需的蛋白质的基因中存在突变，其中该突变导致仅由该病毒基因组产生的病毒缺乏感染性，并且病毒体包含病毒体感染性所需形式和量的所述蛋白质。本发明涉及生产肺病毒的病毒体的方法，和涉及在预防或治疗肺病毒感染和疾病中使用该病毒体的方法。优选的肺病毒病毒体是呼吸道合胞病毒的病毒体，优选其中G附着蛋白基因被失活并反式互补。

Description

具有反式互补的基因组缺陷的呼吸道合胞病毒

发明领域

本发明涉及疫苗接种领域，更具体地是涉及针对由肺病毒(例如呼吸道合胞病毒(RSV))引起的疾病的疫苗。本发明涉及携带RSV基因组的RSV病毒体，其中RSV基因组中的对于感染性所必需的基因已经失活，而相应的野生型基因产物对病毒体构成反式互补。本发明还涉及生产所述RSV病毒体的方法和它们在疫苗上的用途，以及涉及生产针对肺病毒进行疫苗接种的方法。

发明背景

人呼吸道合胞病毒分类上属于肺病毒(Pneumovirus)属，副粘病毒科。它是婴儿、老年人和免疫缺陷个体中急性下呼吸道疾病的主要病因。它也是青少年和成年人中上呼吸道疾病的重要病因。目前该领域中没有有效的h-RSV疫苗。

RSV是RNA包膜病毒，其在表面表达两个主要抗原：附着蛋白G和融合蛋白F。两个蛋白都显示可激发保护性抗体。G是两个已知h-RSV亚组A和B的决定簇。在这两组中发现了抗原差异。G蛋白表现出高度变异，其在组A和组B中仅有53％的氨基酸同源性，并且在组A的G蛋白序列中表现多达20％的差异(Mufson 1988，Cane 1991)。

目前，使用以RSV富集的免疫球蛋白(Respigam)或合成的人源抗F单克隆抗体(Palivizumab)的被动式免疫处理，来用于处理和保护一些易患病的未满月婴儿(如早产婴儿)免受RSV感染(Robinson 2000，Greenough 2000)。RSV病理有两个主要方面：由病毒自身引起的细胞伤害和由过度反应的免疫系统引起的组织伤害。后者在疫苗设计中是高度复杂的因素。

RSV感染是季节性的，限于冬季并且在北半球高峰期是在年底左右。RSV可感染每一个两岁之前小孩，很多病例被感染过两次。较大的个体平均每隔一年被感染，这取决于环境；紧密接触婴儿和小孩的人具有50％的风险。病毒通过紧密接触以飞沫或污染表面进行传播。RSV不能有效地通过气溶胶传播；病毒颗粒相对不稳定。在初次感染期间，病毒从上呼吸道(URT)到下呼吸道(LRT)的体内传播主要通过吸入在URT上皮细胞中产生的病毒颗粒而发生。不能排除以形成合胞体的方式进行传播，并且这种传播在LRT感染中可能起次要作用。

通常，RSV病理始于URT；侵入部位是鼻，少部分经过眼而不是口。当限于URT组织时，尽管在成人中有时是急性的，该疾病限于普通感冒。然而，当病毒到达LRT时，在无保护的个体中会发生细支气管炎和肺炎。在幼婴中，这可危及生命，大约1/100需要住院和机械通气，在这些幼婴中超过1％会死亡。在老年人中，RSV诱发的LRT疾病是住院的主要因素；怀疑RSV导致25％的流感样疾病。

对RSV的免疫应答是复杂的。通常，接触h-RSV可建立抗LRT疾病的保护性应答。该应答随年龄增加而减弱，导致老年人群对RSV的更高敏感性。针对URT疾病的长效持久保护表明是不可行的；甚至在同一季节中再次感染很常见，这并不是由于病毒变异引起的。抗RSV感染的保护包括可预防LRT疾病的、针对血液中循环的病毒蛋白质F和G的抗体。通过抗F和G的粘膜抗体可控制URT感染，但这些抗体的寿命有限。需要针对迄今尚未得到鉴定的病毒蛋白质的CD8+T细胞，来清除受感染组织的病毒，但是看来它们的存活时间过短或不能从其储备库中高效募集。更可能的是，这可能是由G基因中编码的RSV表达的因子引起的(Srikiatkhachom，1997a)。

RSV疾病的重要方面是病理学免疫增强作用。在有限的病例中，通过从过量吸引的粒细胞释放的细胞因子对感染组织的作用，细胞免疫应答可加重RSV疾病。该反应涉及宿主易患病的体质，但也可能涉及出生后首次RSV感染的时机。不幸的是，用福尔马林灭活RSV的早期免疫试验显示在这些接种情况中，免疫普遍加剧了对野生型(wt)病毒感染的病理(Kim 1969)。RSV中含有的因子是造成该现象的原因，且它显然是由福尔马林处理而释放的。此后的40年中，逐渐表明病毒G蛋白是这些问题的主要介质，但仍旧不清楚机理(Srikiatkhachorn 1997b)。无论如何，使用超出病毒体范围的G蛋白进行接种(即在灭活病毒制剂中，作为没有完全包被在膜中或肽结构中的表达产物)，看起来在模型体系中可导致免疫增强。因此，尽管G蛋白在某种程度上有利于RSV免疫力，它的性质也使疫苗设计变得复杂。

最初候选的活RSV疫苗包括冷传代型或温度敏感型突变体。前者通过在不断降低的温度中培养而被减毒，导致依赖于低温进行生长，而后者突变体通过化学或放射诱发突变被制成依赖于特定的、通常是高温进行复制。这些候选的活疫苗呈现出减毒不足或减毒过度(Crowe 1998)。

作为中和抗体的主要目标，可从RSV-F或G蛋白衍生候选的亚单位疫苗。候选的亚单位疫苗PFP2(纯化的F蛋白)对RSV血清反应阳性病人是安全的，但不能提供针对LRT感染和相关病症的完全保护(Gonzalez2000)。另一亚单位疫苗是由多肽组成的BBG2Na，其包含融合到链球菌G蛋白的白蛋白结合结构域的h-RSV-G的氨基酸130-230(Power 1997)。BBG2Na在新生小鼠中诱导2型T辅助细胞的应答，并不引发肺的免疫病理(Siegrist 1999)。但还没有有关保护作用的数据。目前在动物模型中研究用于平衡体液和细胞免疫应答的新佐剂的用途(Plotnicky，2003)。

在动物模型中已经研究了编码RSV-F和G抗原作为候选疫苗的质粒-DNA载体的用途。这些疫苗在啮齿动物中诱导保护性应答(Li，2000)，不过，在一种啮齿动物中用野生型病毒攻击后，发现RSV-F DNA候选疫苗的免疫小鼠可产生轻度增强的肺部炎性应答(Bembridge 2000)。在人体中使用质粒DNA疫苗的可行性还不得而知，并且在充分研究了并更重要地是接受该方法(特别是婴儿)之前将至少花费15年。由表达RSV蛋白的活重组载体构建基于载体输送系统的候选疫苗。例如，表达RSV-F和G的重组牛痘病毒可在小鼠中提供保护，但在黑猩猩中缺乏该效果(Collins 1990)。问题是根据在人群和婴儿的主目标群中存在的(母体)抗痘病毒抗体，这些系统是否是安全(特别是牛痘病毒)和可行的。

一些候选疫苗是基于通过反求遗传学产生的重组活RSV。研究的一个方向集中在通过将造成冷适应和温度敏感的单个或组合突变体导入重组病毒中，来减毒这些病毒。由于减毒过度或减毒不足，这些候选疫苗没有一个是可用的。研究的另一方向集中在缺失一个或多个病毒非结构基因。现在仅有有限的关于这些病毒在模型系统中性质的资料(Jin2003)。

对于研制RSV疫苗的可选择的方法是使用牛RSV。只具有人F蛋白或具有人F和G蛋白的嵌合牛RSV，被用于评价其在黑猩猩中的效率。该候选疫苗的复制有限，其程度不能保护动物抵抗野生型h-RSV攻击(Buchholtz 2000)。

因此，目前本领域中没有有效可用的h-RSV疫苗。所有已在动物中测试过的RSV候选疫苗不能用于人。因此，在本领域中存在有效、安全的RSV疫苗的长期需求，而本发明的目的正是提供此类疫苗。

发明描述

定义

在本文及其权利要求中，动词“包含(包括)”及其变化形式用于它的非限制性意义，来表示该词后所纳入的项目，但不排除没有特别提到的项目。另外，不定冠词“一个(种)”所涉及的要素不排除存在多于一个(种)要素的可能，除非上下文清楚地规定有且只有一个(种)要素。因此不定冠词“一个(种)”通常指“至少一个(种)”。

本文所用的术语“病毒体”指在脂质包膜中含有核衣壳蛋白、病毒基因组和复制酶复合物的病毒颗粒，其中所述的脂质包膜含有病毒结构糖蛋白。

术语“病毒感染性”、“感染性病毒”、“感染性病毒颗粒”或“感染性病毒体”指能侵入合适的宿主细胞并开始病毒复制循环的病毒、病毒颗粒或病毒体，不管它能否导致产生感染性的新病毒。

发明详述

本发明的第一个方面涉及肺病毒病毒体。该病毒体包括在编码肺病毒感染性所必需的蛋白质的基因中存在突变的病毒基因组，其中突变导致仅由病毒基因组产生的病毒缺乏感染性，并且病毒体包括病毒体感染性所必需的形式和量的所述蛋白质。

肺病毒优选是呼吸道合胞病毒(RSV)，更优选是人或牛RSV。人RSV可以是亚组A或B病毒，优选是临床分离的、更优选是体外未被过度传代的分离株(如实施例中所述，优选是传代少于10、8、6或5次)。因此，任何RSV株或分离株可用于本发明的范围中，从而可理解的是通过具体的人RSV分离株98-25147-X(称为RSV分离株X)仅仅用于举例说明本发明。更优选的是病毒是最近的临床分离株，从而规定“最近”指不到10、8、6、4、3或2天前进行第一次分离。可以理解的是，尽管病毒体中的核苷酸序列不必对应于最近分离株的核苷酸序列，但优选本发明的病毒体中的蛋白质的氨基酸序列与最近临床分离株中的蛋白质序列相同。

病毒基因组在至少一个编码肺病毒感染性所必需的蛋白质的病毒基因中包括至少一个突变，其中病毒感染性如上所述。因此，肺病毒感染性所必需的蛋白质是本发明的病毒体侵入合适宿主细胞并开始病毒复制循环能力所必需的蛋白质，其中复制循环不必导致产生新的感染病毒。在本发明优选的病毒体中，突变引起病毒体在体内(即在合适的宿主机体)缺乏感染性，其中病毒体对于体外培养的合适宿主细胞仍是有感染性的。

在本发明优选的病毒体中，编码肺病毒感染性所必需的蛋白质的突变基因是编码病毒结构蛋白的基因。本文中肺病毒的结构蛋白被理解是在野生型感染性病毒的病毒体中存在的蛋白质。在本发明的病毒体中被突变的、编码结构蛋白的基因优选是编码附着蛋白G和/或融合蛋白F的基因，其中最优选是G蛋白。缺失和/或功能灭活编码G蛋白的基因，适于几个目的并可预防目前RSV候选疫苗的许多问题和并发症。一个目的是疫苗安全性：缺失G蛋白的RSV在其宿主中是高度减毒的(Karron1997，Schmidt 2002)，因为它不能有效地感染宿主。一个并发症是G蛋白非常相关于引起不必要的免疫学应答，包括加剧的免疫病理(Alwan1993，Srikiatkhachom 1997b)和在某些遗传易感性条件下可能使得免疫系统偏向于易于发生过敏症(和哮喘)状态(Openshaw 2003，Peebles2003)。可通过缺失或失活G基因预防这种情况。包含在编码G附着蛋白的基因中具有失活突变的病毒基因组、并包含病毒体感染性所需的形式和量的G附着蛋白的本发明肺病毒病毒体，称为“ΔG+G”(肺)病毒或病毒体。类似地，在编码G附着蛋白的基因中具有失活突变的、但没有功能量的G蛋白作为反式互补的病毒体，称为“ΔG”(肺)病毒或病毒体。

因此使用外部编码的、感染所必需的蛋白质，可瞬时和功能性重建本发明的肺病毒病毒体。外部编码的、感染所必需的蛋白质优选是附着蛋白G/或融合蛋白F，其中最优选是G蛋白。外部编码的、感染所必需的蛋白质优选是与存在于病毒体中的基因组相同的病毒亚组(A或B)。外部编码的、感染所必需的蛋白质更优选与存在于病毒体中的基因组是同源的，从而意味着在被失活之前，该蛋白质具有与在病毒基因组中编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列。或者，这可意味着外部编码的蛋白质的氨基酸序列与存在于野生型病毒体中的序列相同，其中野生型病毒体与一个或多个内部编码的蛋白质的氨基酸序列同它们在本发明的病毒体中的对应序列具有100％相同性。

在本发明的病毒体中，必需结构蛋白基因中的突变是导致仅由该病毒基因组产生的病毒缺乏该蛋白质或表达生物学失活的蛋白质的突变。仅由病毒基因组产生的病毒被理解为：在缺乏病毒基因组反式互补的任何编码序列的情况下仅从病毒体中存在的病毒基因组产生的病毒。因此病毒体中存在的病毒基因组不能指导必需结构蛋白的表达。通过技术人员熟知的多种方法可实施该过程，包括如翻译起始密码子的失活、将终止子导入编码的蛋白质N末端附近、该基因的一个或多个移码突变、该基因的一个或多个片段的缺失。优选通过缺失编码必需结构蛋白的至少10、20、50、75、90或95％的序列，来失活该基因。然而，最优选地是包含缺失编码蛋白(全)序列的突变的病毒体。

本发明显然包括存在多于一个突变的病毒体。具体地说，多于一个病毒蛋白质编码基因可包括所述蛋白功能的失活或变异的突变，或包括导致如上所述的病毒体缺乏该蛋白的突变。例如，本领域已知的冷传代或热敏感突变可联合失活本发明中以上公开的必需结构蛋白。

从感染的宿主机体清除肺病毒样RSV，需要合适的细胞免疫，病毒没有感染上皮细胞就不会产生有效的细胞免疫。然而，本发明突变型肺病毒缺乏体内感染宿主细胞所必需的蛋白质的遗传信息。因此本发明公开用于生产突变型肺病毒的方法，其包括在(反式)互补缺乏感染所需的蛋白质的细胞中复制突变型肺病毒。

因此在本发明另一方面中，涉及用于生产以上所述的突变型肺病毒病毒体的方法。该方法是用于生产肺病毒病毒体的方法，其中病毒体包含在编码肺病毒(体内)感染性所必需蛋白的基因中具有突变的病毒基因组，该突变导致仅由病毒基因组产生的病毒缺乏感染性，以及病毒体包含病毒体感染性所需形式和量的所述蛋白质。所述方法包括步骤：(a)用包含具有以上所述突变的病毒基因组的肺病毒来感染第一宿主细胞培养物，其中宿主细胞包含可指导所述蛋白质以病毒体感染性所需的形式和量在宿主细胞中瞬时性或组成型表达的表达载体；和(b)从感染的宿主细胞培养物中回收病毒体。从感染的宿主细胞培养物中回收病毒体包括从培养基回收或从细胞回收，或者二者都可。

第一宿主细胞是能复制肺病毒并且能或不能同时反式表达病毒体感染性所必需的蛋白质的任何宿主细胞。用于该目的的适宜宿主细胞是例如非洲青猴肾细胞培养物(例如1990年EMEA许可的Vero，ECACC lot10-87，第134代)。

在本发明优选的方法中，根据包括下列步骤的方法生产用于感染第一宿主细胞培养物的肺病毒：(a)对第二宿主细胞提供可指导下列物质在宿主细胞中表达的一个或多个表达载体：(i)在编码对肺病毒(体内)感染性是必需的蛋白质的基因中具有突变的病毒基因组RNA，其中突变导致仅由该病毒基因组产生的病毒缺乏感染性；和(ii)肺病毒聚合酶复合物和任选地一种或多种另外的病毒蛋白质；和(b)培养第二宿主细胞从而生产病毒体。在优选的方法中，使用与第二宿主细胞相同或不同的宿主细胞，通过一种或多种另外的细胞感染步骤，扩增由第二宿主细胞产生的病毒体。

第二宿主细胞是能复制肺病毒并且能或不能同时反式表达病毒体感染性所必需的蛋白质的任何宿主细胞。用于该目的的适宜宿主细胞是例如非洲青猴肾细胞培养物(例如1990年EMEA许可的Vero，ECACC lot10-87，第134代)。第二宿主细胞可以相同于或不同于第一宿主细胞。

在本发明的方法中，从在噬菌体DNA依赖性RNA聚合酶启动子的控制下的病毒DNA拷贝转录病毒基因组RNA，从而对(第二)宿主细胞提供可在噬菌体DNA依赖性RNA聚合酶的宿主细胞中指导表达的表达载体。优选地，噬菌体DNA依赖性RNA聚合酶是T7、T3或SP6聚合酶。

从第二宿主细胞的一个或多个表达载体表达的肺病毒聚合酶复合物至少包括从表达载体的对应的基因或cDNA所表达的L、P、N蛋白。为了提高裸露病毒基因组RNA的病毒组装和包装效率，在第二宿主细胞任选地表达一种或多种另外的病毒蛋白质。适于该目的的病毒蛋白质优选包括病毒基质膜蛋白，其中特别优选是M2-1蛋白。优选从被导入宿主细胞并在其中表达的病毒分离株的病毒基因组衍生L、P、N、M2-1、G或F蛋白，但或者使用来自其它异种病毒或非病毒源的同源蛋白。

技术人员可理解的是：用于在第一和/或第二宿主细胞中表达病毒基因组RNA、依赖DNA的RNA聚合酶、肺病毒聚合酶复合物和任选的更多的病毒蛋白质以及必需结构蛋白的各种表达载体和调控序列(例如启动子)，是本领域中可得到的(参见Sambrook and Russell(2001)″Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第三版)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)。

对于RNA病毒的反求遗传学，即重组RNA病毒(例如本发明的病毒体)的表达，将病毒基因组RNA的cDNA拷贝克隆入质粒，并位于在一定条件下允许从DNA复制RNA的序列的控制下。通常，将用于噬菌体RNA聚合酶的启动子序列位于RNA基因组的DNA拷贝的上游，同时将用于RNA聚合酶的适宜终止子位于基因组的下游。将自主剪切核酶序列位于终止子序列的上游，以允许通过适当的终止子核苷酸合成RNA。通常需要适当的终止子序列从合成的RNA来拯救病毒。对于非分段的负链RNA病毒，需要聚合酶复合物(用于副粘病毒的N、P和L蛋白)连同基因组RNA和反基因组RNA进行共表达，来获得重组病毒(参见Neumann 2002和本文实施例中的实例)。

其它优选的方法包括分离和/或纯化本发明的病毒体，和/或将这些病毒体配制到药物组合物中的更多步骤。对于有经验的病毒学家而言用于分离和/或纯化病毒体的方法是众所周知的。例如包括多种离心技术(如差速或密度离心)或层析技术的方法。用于将本发明的病毒体配制到药物组合物中的方法至少包括将病毒体与如下定义的药学上可接受的载体进行混和的步骤。

在另外的方面中，本发明涉及包含上述的或上述的方法中可获得的病毒体的组合物，以及药学上可接受的载体。优选组合物是适于作为疫苗的药物组合物，即组合物优选是疫苗。

在另一方面中，本发明还提供包含根据本发明的作为活性成分的病毒体和药学上可接受的载体的药物制剂。也可将药学上可接受的稳定剂、渗透剂、缓冲剂、分散剂等等掺入药物组合物中。优选的形式取决于给药和治疗性应用的计划方式。药物载体可以是适于将重建的病毒膜输送到病人的任何亲和性无毒物质。通过水、缓冲盐溶液、甘油、聚山梨醇酯20、Cremophor EL，以及辛酸/癸酸甘油酯的水性混合物，举例说明适于鼻内投药的药学上可接受的载体，并可对其缓冲处理以提供中性pH环境。

为了通过吸入给药，使用合适的推进剂(如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)，以来自施压器或雾化器的气溶胶喷雾器的形式可便利地输送本发明的药物组合物，其中病毒体存在于如所述用于鼻内投药的载体中。至于施压的气溶胶，通过提供输送可计量数量的阀来确定剂量单位。

用于制备鼻内或吸入组合物的方法是本领域众所周知的，并在多种资料来源中得到更具体地描述，包括，例如Remington′s PharmaceuticalScience(15th ed.，Mack Publishing，Easton，PA，1980)(出于所有目的，在此全部引用作为参考)。因此，可将病毒体作为活性成分配制到任何适于免疫接种的制剂中，来允许或促进免疫接种制剂有效地施用于个体，优选是人或活家畜或农畜(例如牛、猪、马、山羊、绵羊)，其中该制剂还包括载体、佐剂、稳定剂、溶解剂、防腐剂和本领域公知的赋形剂。

在另外的方面中，本发明通过对需要预防或治疗的对象施用本发明上述的、或上述可得到的治疗性或预防性有效量的病毒体(包含所述病毒体的药物组合物)，涉及用于抗肺病毒感染的接种方法，或预防或治疗肺病毒感染的方法。优选地，通过鼻内施用病毒体。

本发明同样涉及本发明上述的、或上述可得到的、用于作为药物的病毒体，优选用于抗肺病毒感染的免疫接种药物、或用于预防或治疗肺病毒感染的药物。本发明还涉及本发明的病毒体在制备用于抗肺病毒疾病或感染的免疫接种的药物中、或用于预防或治疗抗肺病毒疾病或感染的药物中的用途。药物优选是用于鼻内给药的制剂。

包含本发明用于免疫接种的病毒体的组合物优选经鼻内施用于合适的宿主。在一个实施方案中，保护小牛免受b-RSV感染。还在另一实施方案中，保护人(优选婴儿和老年人或免疫缺陷的个体)免受h-RSV感染。制剂优选包括适于以鼻内滴剂或喷剂给药的制剂，优选是鼻喷剂。组合物中的ΔG+G肺病毒颗粒只感染上呼吸道上皮细胞一次，因为从最初感染的URT上皮细胞产生的第二代病毒体缺乏其从基因组被除去编码序列的G附着蛋白。因此这些ΔG病毒体在宿主机体体内是无感染性的。然而，最初的单循环感染使得产生适宜的细胞免疫——即能清除野生型病毒感染的应答——以针对肺病毒(或特别是RSV)，而抗F的保护性抗体——即可预防下呼吸道感染的抗体——通过疫苗和无感染性子代被激发。如Palivimuzab处理的效力所示，抗F抗体可有效地限制RSV感染，其中Palivimuzab是抗F的人源单克隆抗体。这是本发明的重组肺病毒减毒型活疫苗的效力基础。这些活病毒疫苗解决了许多与目前肺病毒候选疫苗有关的问题。在病毒体的天然环境中G蛋白的存在允许产生适宜的细胞免疫，却又避免了分离的G蛋白不需要的免疫效应，所述免疫效应是分别造成对牲畜和人中b-RSV和h-RSV病原体的免疫增强的主要原因。

附图描述

图1：PRSVXΔG的构建图。上方的线条代表具有所示基因的RSV分离株X基因组RNA。下方的盒子代表RT-PCR产物和用于构建的寡核苷酸双螺旋。盒子里的数字表示如表I所列的寡核苷酸数。指出了用于克隆而导入的限制性位点。以下显示最终的克隆图：圆形物是质粒，箭头显示克隆顺序。

图2：显示RSV分离株X和pRSVXΔG序列之间差异的对比。显示了基因组方向对比的序列。指明了pRSVXΔG仅仅不同于RSV分离株X的核苷酸。相同序列用圆点(.)表示，缺口用(-)表示。基因起始信号是单下划线，基因终止信号是双下划线，并在图注中指明了基因。盒子画出了由导入的核苷酸突变引起的限制性酶识别位点。

图3：在RSV RT-PCR扩增产物，和a)Mlul、b)Xmal、c)SexA-1、d)SnaB-1的消化产物中序列标记的鉴定图。

图4：RSV分离株X和ΔG-RSV分离株X的生长曲线图。用MOI＝0的病毒感染Vero细胞(实线)和Hep-2细胞(虚线)，并于37℃孵育。在所示的时点收集细胞，并测定对Vero细胞的CCID50滴度。

表I用于RT-PCR克隆RSV分离株X的引物。

表II.用于克隆辅助质粒和克隆用于构建稳定细胞系的质粒的引物。

表III.用于对来自RSV感染的Vero细胞RNA进行诊断性RT-PCR的引物。

表IV.以ΔG-RSV分离株X进行免疫以保护棉鼠(cotton rat)免受RSV感染和RSV诱导的病理的免疫试验结果。

实施例

通过非限制性实施例来举例说明本发明，其中所述实施例仅仅用于举例说明本发明的特定实施方案，不应当错误地作为限制本发明的广泛范围或任何方面。

实施例1：病毒分离株、病毒分离、增殖和储存

重组h-RSV克隆的基础是来自莱顿大学医学中心诊断实验室(theLeiden University Medical Centre diagnostic laboratory)的临床RSV分离株。从病人上分离后，该病毒被命名为98-25147-X，其衍生于1998年12月21-24日期间的Hep-2细胞的诊断试验。后来确定它属于亚型A分离株，并称作RSV分离株X。将该病毒在装有DMEM(Gibco)、10％FCS、青霉素/链霉素/谷氨酸的T75瓶中以Hep-2细胞传代4次，并随后在装有DMEM(Gibco)、10％FCS、青霉素/链霉素/谷氨酰胺的T75瓶中以Vero2细胞传代5次。将得到的RSV分离株X作为工作上清液并在25或45％蔗糖中保存于-135℃。

实施例2：编码病毒基因组的RSV-X cDNA的构建

通过酚-胍异硫氰酸盐(Trizol，Invitrogen)提取感染Vero细胞的RSV分离株X上清，获得总RNA。使用Thermoscript(Invitrogen)反转录酶和随机六聚物引物，通过反转录来制备cDNA。该cDNA可在使用了高保真Taq聚合酶(Invitrogen)和含有限制性酶识别位点的特异引物(表I和序列表)的PCR中作为模板。根据RSV-A2(Genbank登录号M74568)和RSV-RSS2(Genbank登录号U39662)公开的序列，来设计引物。

首先分别将PCR产物克隆入不同的载体：以下列出引物对、载体、限制性酶识别位点以及得到的载体名：

RSV021/RSV047：pCAP载体(Roche)，平端成为Mlu N1，pCAP3(SH/M/P区)；

RSV018/019：pCAP载体，平端成为Mlu N1，pCAP2(G区)；

RSV016/RSV017：PUC21，Mlu I/Bam HI，pUK5(M2-2/M2-1/F区)；

RSV024/RSV025a：PUC21，Bam HI/Afl II，pUK1(NS2/NS1区)；

RSV022/RSV023：PUC21，EcoR V，pUK4(N区)；

RSV014/RSV015：PUC21，Kpn I/Mlu I，pUK2(L区)。

对从两个独立cDNA模板衍生的至少两个单独克隆进行测序；在第三个克隆上对含有该两个克隆差异的区域进行测序。如果需要，使用技术人员已知的标准分子生物技术修补克隆。得到覆盖了用于克隆的引物结合位点的额外PCR产物，并进行测序。通过基因组RNA的聚腺苷酰作用确定5’基因组末端，随后用含有下列引物的寡核苷酸进行RT-PCR：

引物ALG018：

TTAAAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，和

NS1基因引物RSV 126：

AATTCTGCAGGCCCATCTCTAACCAAAGGAGT。

用Hind III/Pst I将该片段克隆入pUC21。通过RACE(cDNA末端的快速扩增法)联合PCR法确定3’末端。装配所有的序列来生产RSV-X共有序列(Seq ID No.1)。

使用BigDye末端试剂盒，通过PCR循环测序法确定所有的序列，并通过ABI Prism310遗传分析仪进行分析。

实施例3：ΔG-RSV分离株X全长质粒的构建

通过连续连接PCR片段，来装配横跨整个RSV分离株X基因组的全长cDNA(图1)。用于噬菌体T7聚合酶的启动子位于“尾”端之前。为了产生正确的3’末端，将cDNA“前导”末端融合肝炎Δ病毒核酶(HDVR)并随后融合T7RNA聚合酶转录物终止子(参见图1)。

首先，用T4DNA激酶使编码RSV026/RSV027寡核苷酸和RSV028/029寡核苷酸的HDVR和T7终止子的两组互补寡聚物进行磷酸化、杂交，并由Rsr II/Not I连接到克隆pUK1(含有基因NS1/NS2)中，从而生成质粒pUK3。然后，将含有N的克隆pUK4的Xma I/Sex AI片段经过Xma I/Sex AI酶切连接入质粒pUK3。该质粒(pUK6)含有N基因直到融合HDVR和T7终止子的3’前导序列的区域。

其次，用Xma I和已补平Hind III的位点，将质粒pCAP3的Xma I/EcoRV片段插入质粒pUK5，这生成质粒pUK8。随后，用BssH II和BsiW I消化pUK 8，并用Klenow聚合酶补平末端并进行再次连接。该质粒含有基因M2-2、M2-1、F、SH、M以及P，并命名为pUK9。

为了合成用于RSV分离株X cDNA的低拷贝载体，用T4 DNA激酶将两个互补寡聚物，即

RSV011：

AGCTTGCGGCCGCGTCGACCCGGGACGCGTCGATCGGGTACCAT，和

RSV012：

CGATGGTACCCGATCGACGCGTCCCGGGTCGACGCGGCCGCA

进行磷酸化、杂交并插入碱性磷酸酶处理过的和Cla I/Hind III消化过的质粒ACYC 184(New England Biolabs)。得到的质粒命名为pACYC184-MCS。随后，插入含有T7启动子和L基因的pUK2D的MluI-Knp I片段，该中间载体命名为pACYCl。然后，使用Xma I/Not I，将从N基因直到3’前导序列的区域(包括融合的HDVR和pUK6的T7终止子序列)加到pACYC1，这生成中间质粒pACYC2。最后，将含有M2-2、M2-1、F、SH、M和P基因的pUK9的Xma I/Mlu I片段掺入pACYC2，生成包含缺失G基因的分离株X的RSV全基因组的质粒pACYC3。后者质粒的序列分析显示在被修补的HDVR区中的缺失，并且所得质粒命名为pRSVXΔG。

除了构建体pRSVXΔG，还生成了构建体pACYC24，其中通过反向PCR反向互补基因组RSV分离株X插入物。从该构建体可合成反基因组RSV RNA。在pACYC24中，将T7启动子位于3’前导序列之前，而将HDVR和T7终止子融合到5’尾序列。

将用于构建pRSVXΔG的所有限制性酶识别位点定位在RSV基因间隔区，并且不改变编码序列或影响转录信号(如图2所示)。

实施例4：辅助质粒的构建

如下构建表达几个RSV蛋白的辅助质粒。从实验室分离株RSV-A2(ATCC#VR1302)可衍生所有需要的基因。在Hep-2细胞上空斑纯化病毒，并随后用于感染Vero细胞。通过酚-胍异硫氰酸盐(Trizol，Invitrogen)从这些细胞提取总RNA，并用高保真Taq聚合酶(Invitrogen)和分别特异于RSV基因L、P、N和M2-1的引物组(参见表II)进行RT-PCR。随后使用如表II所示的限制性酶识别位点，将PCR产物克隆入表达质粒pcDNA3、pcDNA6或pCI。使用BigDye终止子试剂盒(AppliedBiosystems)，通过PCR循环测序法确定克隆序列，并通过ABI Prism310遗传分析仪进行分析。

实施例5：构建产生G蛋白的Vero细胞系

使用以下几种方法构建产生RSV-G蛋白的细胞系：

在方法1中，使用如表II所示的引物在来自RSV-A2或RSV分离株X感染的Vero细胞的RNA上进行RT-PCR，将来自RSV-A2或RSV分离株X的G基因、或者来自RSV-A2的G基因(其中通过引物RSV033和RSV034的修饰，已经失活内部的翻译起始密码子)克隆入表达载体pcDNA3或pcDNA6(Invitrogen)。使用化学剂CaCl₂、基于脂质体的共沉淀法或电泳法(Ausubel 1989)，将质粒导入Vero细胞。可使用适于分离稳定细胞的两种方法。在第一种方法中，转染后72小时，使用含有选择性培养基、用于pcDNA3的zeocin和用于pcDNA6的杀稻瘟菌素的不同稀释度的新鲜培养基，以分开细胞。每3-4天对细胞补给选择性培养基，直到鉴定到细胞灶。挑选单个克隆，并转入96孔平板，或者以不同稀释度进行种植以在96孔平板中得到单个细胞。通过免疫染色技术或使用了RSV G特异抗体的FACS，测试抗生素抗性克隆对RSV-G的表达。将表达G的克隆进行传代，并称其是表达G的稳定细胞系。第二种方法包括在转染72小时后使用RSV-G特异抗体进行FACS分选。将表达细胞的RSV-G以连续稀释法种植，来在96孔板中得到单个细胞，并用选择性培养基培养。在选择性培养基上传代单个细胞克隆，随后再次测试RSV-G的表达，从而得到表达RSV-G的细胞系。

在方法2中，使用Flp-In系统(Invitrogen)以生产在染色体位置具有插入位点的靶基因的Vero细胞，其中所示的染色体位置允许靶基因不同水平的表达。将通过方法1从质粒衍生的但具有G翻译起始密码子周边序列的修饰(用引物RSV151导入：表II)以允许高翻译水平的RSV-G基因，使用系统-一般方法插入这些细胞系中的每一个，从而得到稳定表达不同水平的G蛋白的Vero细胞系。

在方法3中，通过用含有来自方法1的G基因的表达质粒进行转染，或通过用牛痘病毒Ankara(MVA)(Sutter 1992)进行感染，或通过表达G蛋白的鸡痘病毒(Spehner 1990)，使得Vero细胞瞬时表达G蛋白。

实施例6：产生噬菌体T7聚合酶的细胞系的构建

使用引物ALG022和ALG023(表II)，从含有噬菌体T7聚合酶基因的噬菌体pPRT7(van Gennip 1997)中PCR扩增该基因。使用Hind III/XbaI，将PCR产物克隆入pcDNA6b载体中，从而生成质粒pc6T7pol。根据制造商(Invitrogen)的建议，使用Lipofectamine 2000来转染Vero细胞。转染72小时后，分开细胞并在含有杀稻瘟菌素的新鲜培养基中生长。每3-4天对细胞供养新鲜培养基，并分开两次以得到更大的培养体积。转染20天后，使用Lipofectamine 2000通过报告质粒pT7-IRES2-EGFP转染杀稻瘟菌素抗性细胞。为了构建质粒pT7-IRES2-EGFP，通过由Hind III/BamH1在质粒p-EGFP-N1(Clonetech)插入编码T7启动子序列(ALG32：AGCTAATACGACTCACTATAGGGAGACGCGT和ALG33：GATCACGCGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATT)的一组互补寡聚物来构建第一质粒pT7-EGFP。然后，通过由Xmal-Notl将质粒pT7-EGFP的T7-EGFP片段克隆入质粒p-IRES2-EGFP，构建pT7-IRES2-EGFP。通过FACS分选表达EGFP的细胞，并以有限稀释法进行培育，以得到单个细胞克隆。测试表达T7RNA聚合酶的单个克隆的稳定性，并在大培养体积中生长并进行保存。

实施例7：生产重组ΔG-RSV分离株X病毒的方法

将Hep-2细胞在DMEM+10％FCS(胎牛血清)+青霉素/链霉素/谷氨酰胺中培养，而Vero细胞及其衍生物在M 199+5％ FCS+青霉素/链霉素/谷氨酰胺中培养。将细胞在10mm²的培养皿中于37℃培养直至80％平板密度。对于Vero和Hep-2细胞，转染前用修饰过的Ankara-T7(MVA-T7)(Sutter 1992，Wyatt 1995)或鸡痘-T7病毒(Britton 1996)以MOI＝3(感染复数＝3)感染细胞，并将其在32℃孵育60分钟，以允许表达噬菌体T7聚合酶。用Optimem培养基(Optimem 1 with glutamax，Invitrogen)洗涤细胞(Hep-2、Vero或Vero-T7细胞)，随后使用Optimem(总体积500μl)中的Lipofectamine2000(Invitrogen)，通过编码RSV的N、P、L和M2.1基因的辅助质粒和质粒pRSVXΔG来转染细胞。加入以下量的质粒：1.6μg pRSVXΔG、1.6μg pcDNA6-A2-N、1.2μg pcDNA3-P、0.4μg pcDNA6-A2-L、0.8μg pcDNA6-A2-M2.1。在32℃孵育3-4小时后，加入补充了2％FCS的500μl Optimem培养基，并将细胞在32℃孵育3天。然后刮取细胞，并将刮取的细胞混合物和含有拯救性病毒的培养基用于感染在DMEM+2％FCS+青霉素/链霉素/谷氨酰胺中生长的Vero或Hep-2细胞的新鲜培养物。后一过程重复4-5次，以得到高滴度的病毒上清。

通过从感染Vero细胞的ΔG-RSV分离株X中分离的RNA进行RT-PCR和通过单一限制性酶消化得到的产物，来确定ΔG-RSV分离株X病毒，其中将限制性酶的识别位点导入pRSVXΔG(图2)。RSV分离株X作为对照。

为了鉴定RSV中的序列标记，用RSV分离株X或ΔG-RSV分离株X以MOI＝0.1感染Vero细胞。感染72小时后，从培养上清分离RNA，并作为RT-PCR的模板。在重组ΔG-RSV分离株X病毒的插入序列标记的两侧设计引物。在RT-PCR后，用合适的限制性酶消化得到的产物。得到下列消化产物(图3)：

a)通过引物RSV065(GTCCATTGTTGGATTTAATC)和RSV093(CAAGATAAGAGTGTACAATACTGTC)进行PCR，并用Mlu-I进行消化，以产生RSV分离株X的937bp预期片段和ΔG-RSV分离株X的459和478bp片段；

b)通过引物RSV105(GTTGGATTGAGAGACACTT)和RSV113(AGTATTAGGCAATGCTGC)进行PCR，并用Xma-I进行消化，以产生RSV分离株X的880bp预期片段和ΔG-RSV分离株X的656和224bp片段；

c)通过引物RSV112(CCCAGTGAATTTATGATTAG)和RSV160(AATTGGATCCATGGACACAACCCACAATGA)进行PCR，并用Sex A-I进行消化，以产生RSV分离株X的694bp预期片段和ΔG-RSV分离株X的492和202bp片段；

d)通过引物RSV098(TGGTAGTTCTCTTCTGGCTCG)和RSV114(ATCCCCAAGTCATTGTTCA)进行PCR，随后用SnaB-I进行消化，以产生RSV分离株X的1820bp预期片段和ΔG-RSV分离株X的507和387bp片段。

与RSV分离株X相比，在Vero和Hep-2细胞上确定ΔG-RSV分离株X的生长特征。

表III.对来自RSV感染的Vero细胞的RNA进行诊断性RT-PCR的引物

引物名	序列
引物名	序列	RSV065	GTCCATTGTTGGATTTAATC
RSV093	CAAGATAAGAGTGTACAATACTGTC	RSV065	GTCCATTGTTGGATTTAATC
RSV093	CAAGATAAGAGTGTACAATACTGTC	RSV098	TGGTAGTTCTCTTCTGGCTCG
RSV105	GTTGGATTGAGAGACACTT	RSV098	TGGTAGTTCTCTTCTGGCTCG
RSV105	GTTGGATTGAGAGACACTT	RSV112	CCCAGTGAATTTATGATTAG
RSV113	AGTATTAGGCAATGCTGC	RSV112	CCCAGTGAATTTATGATTAG
RSV113	AGTATTAGGCAATGCTGC	RSV114	ATCCCCAAGTCATTGTTCA
RSV160	AATTGGATCCATGGACACAACCCACAATGA	RSV114	ATCCCCAAGTCATTGTTCA

实施例8：生产重组ΔG+G-RSV分离株X病毒的方法

将从转染的Vero细胞衍生的ΔG-RSV分离株X病毒传代几次，以获得至少105pfu/ml(每毫升空斑形成单位)的滴度。然后将不同MOI的病毒用于感染可生产RSV-G蛋白的Vero细胞系。从培养基和/或从细胞中收集得到的ΔG+G-RSV分离株X，并通过免疫检测技术分析病毒体中G蛋白的存在情况。在Vero或Hep-2细胞上确定感染性滴度，并通过对提取自被ΔG+G-RSV分离株X病毒感染的细胞中的病毒RNA进行RT-PCR，来确定ΔG基因组的完整度。将病毒在25％或40％蔗糖中保存于-135℃。

实施例9：以ΔG-RSV分离株X进行免疫以保护棉鼠动物模型免受RSV感染和RSV诱导的病理的方法

在棉鼠(每组4-6只5-6周龄的棉鼠，雌雄都有)中进行保护试验。在试验初期，根据Prince(2001)的描述，动物显示出对RSV感染敏感，并呈现出严重的疫苗介导的肺病理，这十分类似于人的情况。在鼻内施用RSV后，肺病理的特点是支气管/细支气管的内部和周边的炎症浸润以及上皮细胞增生。通过用福尔马林失活的RSV-A2进行肌肉免疫、随后用RSV-A2进行鼻内攻击，可显示更严重的病理。至于前述的病理，观察血管周渗透和细支气管周渗透以及肺泡炎，特征在于免疫介导的病理。这些观察结果被用作所有免疫和攻击试验的“内”对照。用RSV制剂进行鼻内(两个鼻孔)感染和免疫棉鼠。对棉鼠肺进行光学显微镜病理学检查；使用具有可产生CCID₅₀滴度的RSV特异ELISA的肺匀浆连续稀释法和使用可产生pfu滴度的RSV特异抗体，在攻击后或感染/免疫后的不同时间点检测病毒对Vero细胞的滴度。用ΔG-RSV分离株X免疫两次后，充分保护棉鼠避免肺的RSV分离株X引起的感染和病状。在表IV中总结了几个试验的结果。

表IV：

	感染物	t¹	V²	感染5天后的肺病理	肺t³
	感染物	t¹	V²	感染5天后的肺病理	肺t³	ΔG-RSV分离株XRSV-A2RSV分离株X	555	100100100	是，中度是，重度是，重度	检测不到2545
第0天和第21 t¹ V²天免疫2x ΔG-RSV 5 100分离株X假试验 100	攻击日42RSV分离株XRSV分离株X	t¹55	V²100100	攻击后第5天肺病理无是，重度	肺t³检测不到5	ΔG-RSV分离株XRSV-A2RSV分离株X	555	100100100	是，中度是，重度是，重度	检测不到2545

1：病毒滴度，pfu/ml的对数值

2：每只动物所用的体积(μl)，每个鼻孔为该体积的一半

3：每克肺的病毒滴度的对数值，检测限为10²CCID₅₀

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序列表

<110>DE STAAT DER NEDERLANDEN，VERTEGENWOORDIGD DOOR DE MINISTER VANVOLKSGEZONDHEID，WELZIJN EN SPORT

<120>具有反式互补的基因组缺陷的呼吸道合胞病毒

<130>P210823 pct

<160>33

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>15213

<212>DNA

<213>Human respiratory syncytial virus

<400>1

acgagaaaaa aagtgtcaaa aactaatatc tcgtagttta gttaatatac atataaacca 60

attagatttg ggtttaaatt tattcctcct agatcaaaat gataatttta ggattagttc 120

actagaagtt attaaaaatt atataattat taattttaaa taactataat tgaatacagt 180

gttagtgtgt agccatggga atttttatta taagattttt gttcattatt cattatggaa 240

gttgtataac aaactacctg tgattttaat cagtttttta agttcattgg ttgtcaagct 300

gtttaacaat tcacttagat gaggatatgt agattctacc atatataaat gattatagtt 360

taattctgtt gatctgaaat ttaaaacatg attgaaccac tttaagatgt tcatgtgctt 420

atgatttata agtttattgc tgaaaacttc attacgtcca gctatagaat aagatagtat 480

atctccacta acaacactct ttagtttaga caatgcagta ttaattcctt tttttgttat 540

agggtaacaa agaaagggta tcaaactctt aatatttgca tcaatagact ctttatcagc 600

cttcttaggc atgatgaaat ttttggttct tgatagtatc aatttagcat tttgtactac 660

attaaatact gggaacacat ttgcaggacc tattgtaagg actaagtaaa cttcagatcc 720

ctttaactta ctgcctaagc atacataagt ttttaatata gttatgttgt ctaatttgaa 780

atcgatatca tcttgagcat gatattttac tattaacgta catttattaa ctgaagaaca 840

gtacttgcat tttcttacat gcttgctcca ctctattata attttattcc agttgactgt 900

tacaggcaat tcagcatcac agacaaaaag gctgataggt tcagcaaact ttatatgtaa 960

ataagaccaa tgaatgttgt tggttgcatc tgtagcagga atggtcaaat tttcaccata 1020

atcaatgttg atatgtccat tgtacagcct taaaaactca attggtaaac tatgatcatt 1080

acaatctttc agacttctgt aaatatatct tatatcagga tgaagttcca ctactgtacg 1140

caataataaa ttccctgctc cttcacctat gaatgctata caattaggat ctttaatttt 1200

aaggtctttt aaaatatact ctatactaat tttacaacct gtagaactaa atacaaaatt 1260

gaatctatta atatgatgcc aaggaagcat gcaataaagt gatgtgctat tgtgtactaa 1320

agatatttga tgagaagtag tagtgtaaag ttggttagat ttggctgtat tacctgaatg 1380

atctataatt ttatcaatca caaccgtagg aaataaatta tacaaatctt gtctgctgta 1440

attggttcta atcattgtag acgatttaat aagcttctta ttagataaca atggtaacat 1500

tattgagtca acatttttac ctatacaata gtcattcagt gtctttttat cattactttt 1560

aaccggattg gttagtatat tttctagggt ttctggtgta ggatgatata atttgttgta 1620

attactttct aattcagaat tagcaatcct tatatgttta gttaatagat gagtattatc 1680

tgagaagtta taattaatgt aaaaaagatt agaagtataa aattcatcat tgaatttgtg 1740

tttattttta atgtatattc tatctatatt tatcaatccc attctaacaa gatctatata 1800

agttaatatt gctttcatat gtgttggatg ataatctatg ttaacaaccc aagggcaaac 1860

tgtgaattct gctacattaa gacgtttaag aaaccatagt ttgaagctat gacatccttt 1920

tactctatgt aaacttgcat cctggctaag aatgtatttg ataacttttt gttctaaaaa 1980

taccttagac atagacttcc aataactact gtctattaat tccaatacac ataggagatc 2040

tgaagtattc atatcacact ccagctttgc tctgctgtaa cctttatgaa aacacaagag 2100

atatgtctta taagcattga agaaaacttt caaattaatg aacatatgat cagttatata 2160

tccctctccc caatcttttt caaaaatacc tttagaatct ttcataagtt gtataatcag 2220

aatccaatgt ccagctaaat tagtacttaa aatgtaagta ttatgaaaat agtcagatat 2280

cttatgcgcc aatattaaat tagaattaac attagatcca gattttagtg ttttattact 2340

taagaataat tccacatatt gagtcaaact tattttgtct ggtaaaaaca tatgctgttt 2400

ttgtatcact tgttttaact tgtgaatatc aacatcacct gtgaatatgg gaggtttcat 2460

caaatgtatc tcattaagct tgggtatgag aataattctg ttaggacata cattagtaaa 2520

ttgttctact actgacatta agctaaggcc aaagcttata cagttttgga atactatatc 2580

aatatcttca tcaccatact tttctgttaa tatgcgatta atagggctag tatcaaagtg 2640

atagtttgta gttctatagg ctggtattga tgcagggaat tcacatggtc tactactgac 2700

tgtaagacga tgcaaatagt taacacttaa atattgtgga aataattttt tggccttctc 2760

atatgctaac ccaagagttc ctatgctaag ttcctccatg aattcatcct tgttatctat 2820

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acaac 65

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acgtcctcct tcggatgccc aggtcg 26

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tcgtccactc ggatggctaa gggaataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg 60

ttttttgc 68

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aattggatcc ggggcaaata aatcatcatg g 31

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aattggatcc ggggcaaata caagatggc 29

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ttaactcgag attaactcaa agctctacat c 31

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ttaatctaga tcaggtagta tcattatttt tggc 34

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ttaatctaga agtaactact ggcgtg 26

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aatttctaga tttttaatga ctactgg 27

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aattaagctt accatggaca cgattaacat cgctaagaac g 41

Claims

1.一种包含病毒基因组的肺病毒的病毒体，其中所述的病毒基因组在编码肺病毒感染性所必需的蛋白质的基因中存在突变，其中该突变导致仅由该病毒基因组产生的病毒缺乏感染性，并且其中该病毒体包含病毒体感染性所需形式和量的所述蛋白质。

2.根据权利要求1中所述的病毒体，其中肺病毒是呼吸道合胞病毒。

3.根据权利要求1或2中所述的病毒体，其中该基因编码G附着蛋白。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的病毒体，其中突变导致仅由该病毒基因组产生的病毒缺乏所述蛋白质。

5.根据权利要求1中所述的病毒体，其中突变包括缺失编码所述蛋白质的序列。

6.一种生产肺病毒的病毒体的方法，该病毒体包含在编码肺病毒(体内)感染性所必需的蛋白质的基因中存在突变的病毒基因组，其中该突变导致仅由该病毒基因组产生的病毒缺乏感染性，并且其中该病毒体包含病毒体感染性所需形式和量的所述蛋白质，该方法包括步骤：

(a)用包含存在所述突变的病毒基因组的肺病毒感染第一宿主细胞培养物，其中宿主细胞包含可指导所述蛋白质以病毒体感染性所需的形式和量在宿主细胞中表达的表达载体；和

(b)从感染的宿主细胞培养物中回收病毒体。

7.根据权利要求6中所述的方法，其中生产用于感染第一宿主细胞培养物的肺病毒的方法包括步骤：

(a)给第二宿主细胞提供可指导下列物质在宿主细胞中表达的一个或多个表达载体：

(i)在编码肺病毒(体内)感染性所必需的蛋白质的基因中具有突变的病毒基因组RNA，其中该突变导致仅由该病毒基因组产生的病毒缺乏感染性；

(ii)肺病毒聚合酶复合物和任选地一种或多种另外的病毒蛋白质；和

(b)培养所述第二宿主细胞从而产生病毒体。

8.根据权利要求7中所述的方法，其还包括使用与第二宿主细胞相同或不同的宿主细胞，通过一或个种另外的细胞感染步骤，扩增由第二宿主细胞产生的病毒体。

9.根据权利要求7或8中所述的方法，其中从在噬菌体DNA依赖性RNA聚合酶启动子的控制下的病毒DNA拷贝转录所述病毒基因组RNA，并给所述宿主细胞提供在宿主细胞中指导噬菌体DNA依赖性RNA聚合酶表达的表达载体。

10.根据权利要求9中所述的方法，其中噬菌体DNA依赖性RNA聚合酶是T7、T3或SP6聚合酶。

11.根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其中肺病毒聚合酶复合物至少包含L、P、N蛋白。

12.根据权利要求7-11中任一项所述的方法，其中一种或多种另外的病毒蛋白质是肺病毒基质膜蛋白，优选是M2-1蛋白。

13.根据权利要求6-12中任一项所述的方法，其中肺病毒是呼吸道合胞病毒。

14.根据权利要求6-13中任一项所述的方法，其中编码感染性所必需的蛋白质的基因是编码G附着蛋白的基因。

15.一种组合物，其包含如权利要求1-5中任一项所述的病毒体或如权利要求6-14中任一项所述的方法中可得到的病毒体，以及药学上可接受的载体。

16.根据权利要求1-5中任一项所述的病毒体在制备用于预防或治疗肺病毒感染的药物中的用途。

17.根据权利要求16中所述的用途，该药物是适于鼻内施用的制剂。

18.一种用于预防或治疗肺病毒感染的方法，包括步骤：以预防或治疗感染的有效量给对象施用包含如权利要求1-5中任一项所述的病毒体的组合物。

19.根据权利要求18中所述的方法，其中所述组合物通过鼻内施用。