CN1384877A - 从cDNA拯救腮腺炎病毒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过拯救无节段的反义单链RNA病毒－腮腺炎病毒,进行重组并且生成其免疫原性组合物的方法。其它实施例涉及制作减毒和/或感染性腮腺炎病毒的方法。从cDNA克隆中制备重组病毒,使之特定的改变,包括基因组内核苷酸/多核苷酸的缺失、插入、取代和重排。
Description
发明领域
本发明涉及一种通过重组生成无节段的反义单链RNA病毒-腮腺炎病毒，及其免疫原性组合物的方法。其它实施例涉及产生作为减毒和/或感染性腮腺炎病毒的方法。从cDNA克隆中制备重组病毒，使之获得了基因组的特定改变。本发明尚涉及用该重组病毒作为载体表达外源性遗传信息，如外源基因的应用，包括腮腺炎以外的病原体的免疫原性或药物组合物，基因治疗和细胞靶向。
发明背景
有包膜的反义单链RNA病毒的组成和表达都是独特的。反义单链病毒的基因组RNA在核衣壳中起到了两种模板作用：作为合成信使RNA(mRNA)的模板和作为合成反基因组(+)链的模板。反义单链RNA病毒编码和包装其自身RNA依赖性的RNA聚合酶。信使RNA仅在病毒进入感染细胞的细胞质中才合成。mRNA合成后，发生病毒复制，这需要持续合成病毒蛋白质。新合成的反基因组(+)链作为产生(-)链基因组RNA其它拷贝的模板。
Johnson和Goodpasture在1935年(Johnson和Goodpasture，1935)首次显示腮腺炎的病原体是病毒。从此，组织培养的繁荣促进了病毒分类和对腮腺炎病毒(MUV)生物学性质的研究。腮腺炎最初和流感病毒一起被分在粘病毒科，后来根据核衣壳形态学、基因组组成和蛋白质的生物性质又被重新分到副粘病毒科，副粘病毒亚科、风疹病毒属。风疹病毒属的其它例子包括猿病毒5(SV5)、人副流感病毒2型和4型，新城鸡瘟病毒(Lamb和Kolakofsky，1996)。与所有副粘病毒科的病毒一样，腮腺炎病毒形状是多形的，由宿主细胞衍生的脂质膜包裹着核蛋白核心；该核衣壳核心形成螺旋结构，由15,384个核苷酸的无区段反义RNA基因组与病毒核衣壳蛋白质(NP)紧密结合构成。MUV基因组的基因组成已确定是3’-NP-P-M-F-SH-HN-L-5’(Elango等，1998)。各基因编码一种蛋白质，除了P顺反子，它转录三种独特的mRNA；一种是P基因的忠实拷贝，编码V蛋白，其它两种mRNA含有在转录过程中由RNA编辑机制插入的2个和4个非模板G残基，分别编码P和I蛋白(Paterson和Lamb，1990)。与核衣壳结合的P和L蛋白形成腮腺炎病毒的功能性RNA聚合酶复合物。F和HN蛋白质是整合性膜蛋白，从病毒表面突出，并与病毒结合和侵入细胞有关。小疏水蛋白(SH)和间质(M)蛋白也与膜结合(Takeuchi等，1996和Lamb和Kolakofsky，1996)；V和I蛋白在病毒生长中的作用尚不清楚。
腮腺炎病毒的复制循环从病毒包膜和宿主细胞的细胞膜融合，然后将病毒核衣壳释放入细胞质开始。接着发生初次转录，生成所有的病毒蛋白；然后转变成病毒基因组的复制，接着装配病毒组分，形成新的病毒颗粒，从宿主细胞细胞膜上出芽。只有完整的核衣壳结构可作为RNA转录、复制和随后产生的病毒扩增的模板；因此对MUV和其它负链RNA病毒的基因操纵存在困难。正链RNA病毒的裸露基因组RNA具有感染性，在没有其它病毒因子的情况下感染性病毒可从基因组的cDNA拷贝中被恢复(Taniguchi等，1978；Racaniello和Baltimore，1981)，与正链RNA病毒不同，负链RNA病毒的裸露基因组没有感染性，cDNA中拯救病毒需要病毒NP、P和L蛋白质的胞内共表达，以及全长的正或反义的基因组RNA转录物，它们都在噬菌体T7 RNA聚合酶启动子的控制下(Schne11等，1994；Lawson等，1995；Banerjee，1997；Durbin等，1997；He等，1997；Baron和Barrett，1997；Jin等，1998；Buchholz等，1999；Peeters等，1999)。在所有报道的系统中，T7 RNA聚合酶由共转染的重组痘病毒(提供Fuerst等，1986；Wyatt等，1995)或由T7 RNA聚合酶在转化细胞系中的内源表达(Radecke等，1995)提供。
聚合酶复合物通过在基因组3’末端，特别是启动子区加入顺式激活信号促进并实现转录和复制。然后从基因组模板单向从3’到5’端转录病毒基因。通常从下游基因(如聚合酶基因(L))得到的mRNA相对于其上游邻位基因(即核蛋白基因(NP))为少。因此，相对于基因组3’末端来说，基因的位置总存在mRNA丰度的梯度。
直到最近，对这些无区段RNA病毒进行分子遗传分析是困难的，因为裸露的基因组RNA或从转染质粒胞内产生的RNA没有感染性(Boyer和Haenni，1994)。这些方法在本文中被称为“拯救”。有报道关于操纵cDNA拯救的方法，使分离一些重组无区段的负链RNA病毒成为可能(Schell等，1994)。拯救这些不同的负链病毒的技术遵循一个共同的主题；然而对于成功拯救来说，每种病毒具有特殊的必需成分(Baron和Barrett，1997；Collins等，1995；Garcin等，1995；Hoffman和Banerjee，1997；Lawson等，1995；Radecke等，1995；Schneider等，1997；He等，1997；Schnell等，1994；Whelan等，1995)。转染基因组cDNA质粒后，噬菌体T7 RNA聚合酶和载体编码的核酶序列的联合作用会生成一个基因组RNA的忠实拷贝，并且，由载体编码的核酶序列会切割RNA形成3’末端。最初由共转染表达质粒提供病毒蛋白质包装并复制该RNA。对于腮腺炎病毒而言，拯救的方式已被确立，因此需要发明一种腮腺炎拯救的方法。由于对腮腺炎病毒生物学缺乏广泛研究，发明拯救腮腺炎病毒的方法是复杂的。同时，腮腺炎病毒在组织培养系统中不能有效生长。另外，腮腺炎病毒基因组的末端序列的特征尚未详细确定，不能用于进行拯救。
为了实现从cDNA中成功拯救腮腺炎病毒，转染后必须发生许多分子事件，包括：1)T7 RNA聚合酶准确的全长合成基因组或反基因组RNA，并用核糖体序列加工3’末端；2)在适合引发复制的水平合成病毒NP、P和L；3)将基因组RNA从头包装入转录激活和能复制的核衣壳结构；和4)从新形成的核衣壳表达足够进行复制水平的病毒基因。
本发明提供了重组产生腮腺炎病毒的拯救方法。拯救腮腺炎病毒具有许多用途，如抗体产生、诊断、预防和治疗应用、细胞靶向、突变病毒的制备和免疫原性组合物的制备。另外，在这些应用中使用重组产生的腮腺炎Jeryl Lynn株有许多优点。这些优点中包括(1)减毒表型，(2)基于100,000,000次给药的基本安全记录，(3)用单剂诱导长期持续的免疫力的能力和(4)相对低水平的基因组重组。
发明简述
本发明提供了一种产生重组腮腺炎病毒的方法，包括在至少一个宿主细胞中进行拯救组合物的转染，该组合物含有(i)含有分离的核酸分子的转录载体，该核酸分子包含编码腮腺炎病毒基因组或反基因组的多核苷酸序列，和(ii)至少一个表达载体，它含有至少一条编码核衣壳包装、转录和复制所必需的反式激活蛋白的分离核酸分子。在足够使这些载体共表达，产生重组病毒的条件下进行转染。然后收集重组病毒。
另一个实施例涉及核酸序列，它在mRNA转录后，表达一条或多条下列从上述腮腺炎病毒P“顺反子”产生的腮腺炎病毒蛋白质：NP、M、F、SH、HN、L和V、P和I或其组合：相关实施例涉及含有这些核苷酸序列的核酸分子。本发明的优选例是SEQ ID NO：1、11和12的核苷酸序列。其它实施例涉及这些核苷酸、上述腮腺炎病毒蛋白质的氨基酸序列及其变体。
本发明的蛋白质和核苷酸序列具有诊断、预防和治疗腮腺炎病毒的作用。这些序列可用于设计化合物的筛选系统，干预或中断正常病毒通过包装、复制或扩增的发育。当用于表达外源基因时，核苷酸序列还可用于制备腮腺炎病毒和/或其它病原体的免疫原性组合物。另外，表达的外源基因可应用于治疗。
在优选例中，产生的感染性重组病毒，用于免疫原性组合物以及治疗或预防腮腺炎病毒和/或其它病原体感染的方法，其中该方法使用这些组合物。
在其它实施例中，本发明提供了产生减毒、感染性或两者的重组腮腺炎病毒的方法。从cDNA克隆制备重组病毒，可获得在基因组中具有限定改变的病毒。其它实施例使用共有基因组序列和/或任何腮腺炎Jeryl Lynn株群中的基因组序列表达外源基因，因为该注册疫苗株具有已建立的减毒表型，所以是安全的。由于共有序列衍生自推测的普通腮腺炎病毒基因组，Jeryl Lynn株的基因组多核苷酸序列是本发明的实施例。
本发明还涉及使用从其形成的重组病毒作为载体表达外源遗传信息，如用于多种用途的外源基因，包括腮腺炎以外的病原体的免疫原性组合物，基因治疗和细胞靶向。
本文中详细讨论了上述所称的实施例和其它实施例，代表了本发明的目的。
附图简述
图1描述了MUVCAT小复制子DNA构建物和由T7 RNA聚合酶转录的小复制子反义RNA基因组的构成。显示了DNA构建物装配中的关键限制性内切酶位点。设计的T7 RNA聚合酶启动子序列以确切的MUV 5’末端核苷酸作为转录起始，以HDV核酶序列进行定位，在小复制子RNA转录物中生成精确的MUV3’末端核苷酸。相同的T7RNA聚合酶末端信号被串联在HDV核酶序列后。CAT ORF代替了所有MUV基因组的编码和顺反子间序列；剩余的主要MUV特异性序列构成了具有临近的90nt NP基因非翻译区(UTR)的3’MUV前导序列(55nt)和临近137nt L基因UTR的5’MUV尾随序列。
图2示意性代表了MUV全长基因组cDNA构建物，包括亚基因组片段和装配过程中使用的限制性内切酶位点。T7 RNA聚合酶启动子和HDV核酶序列分别被定位于启动确切5’末端核苷酸的转录，和产生精确的MUV反义基因组3’末端核苷酸。串联的T7 RNA聚合酶终止序列与HDV核酶邻接，帮助提高RNA切割的效力。表1显示了作为标记的，用于鉴定拯救的MUV的核苷酸取代(见图8)。
图3A显示了在293个细胞中被MUV感染和实施例2所述的体外pMUVCAT转录的RNA转染后CAT活性的3个薄层层析图。
图3B描述的薄层层析图，显示了用pMUVCAT和表达MUV NP、P和L蛋白质的质粒转染后的MVA-T7感染的Hep2和A549细胞中的CAT活性。在两个细胞系中滴定pMUVNP表达质粒的水平；泳道1-4显示了用各含有200纳克pMUCAT、50纳克pMUVP、200纳克pMUVL和分别为300纳克、450纳克、600纳克、750纳克pMUVNP的混合物转染后的CAT活性；泳道5显示当从转染混合物中除去pMUVL时，产生的CAT活性。
图4描述了转染的细胞上清液在A549细胞上如实施例3所述传代(P1)。视图A、B和C对应拯救的腮腺炎病毒、无腮腺炎病毒(对照)和腮腺炎Jeryl Lynn株。如图显示A和C感染焦点相似。
图5描述了如实施例3所述的拯救的腮腺炎病毒在Vero单层细胞上全细胞ELISA。
图6显示了用于鉴定rMUV(如实施例4所述)的RT/PCR产物的凝胶分析。用转染细胞第2代rMUV病毒感染的Vero单层细胞制备了总RNA。建立的RT/PCR反应产生仅存在于pMUVFL和rMUV中，生成的cDNA跨越了3个分离的核苷酸标记位点。泳道1为1kb梯度标记(Gibco/BRL)；泳道2、3和4分别显示跨越核苷酸标记位点6081、8502和11731位的RT/PCR产物。为了证明这些RT/PCR产物不是由于质粒DNA污染衍生的，不用RT，但用与泳道4中完全相同的反应生成cDNA；泳道5显示了该反应的产物。为了证明当从转染混合物中除去pMUVL时，rMUV不能被回收，以无pMUVL时进行转染衍生的Vero细胞RNA进行如泳道4中所示的相同RT/PCR反应生成cDNA产物；泳道6显示了该反应的产物。
图7中的3张电泳图(A、B和C)显示了在rMUV、RT/PCR产物中跨越3个标记位点中每个位点的核苷酸序列(图6)。将rMUV cDNA在各尾位点获得的核苷酸序列与MUV噬斑分离物(噬斑分离物4，PI4)的共有序列进行比较，用于衍生pMUVFL。
图8是一张表(表1)，列出了全长cDNA克隆和噬斑分离物4(PI4)和Jeryl Lynn株(SEQ ID NO：1)的共有序列之间的核苷酸和氨基酸差异。
图9是一张表(表2)，描述了完整的腮腺炎病毒基因图，包括腮腺炎病毒蛋白质的基因起始和基因末端。还显示了长55个核苷酸的3’前导序列和长24个核苷酸的5’尾随序列。
图10是一张表(表3)，列出了腮腺炎病毒基因转录起始和终止的核苷酸位置，和腮腺炎病毒基因组各基因的起始和终止位置，如SEQ ID NO.1提供的。表3中从各转录(基因)的起始和终止核苷酸的位置与蛋白质NP、P、M、F、SH、HN和L的核苷酸序列相对应(分别是SEQ ID NO：93-99)。
图11是一张图表，显示荧光酶和β-半乳糖苷酶基因在M和F基因之间插入腮腺炎病毒基因组。在M基因5’非编码区中用定点诱变产生AscI位点。用嵌套PCR产生腮腺炎病毒专一性的M-F基因间序列和各报道基因侧接的末端AscI位点。用AscI消化得到的PCR产物，引入基因组AscI位点。
图12是一张图，显示两个基因插入(荧光酶和CAT)腮腺炎病毒基因组。分别将两个独立的转录单元和一个含有内部核糖体进入位点，用于表达多顺反子的第二个基因的转录单元插入存在于M-F基因间隔区中的AscI位点。用嵌套PCR产生侧接各基因和转录单元的合适腮腺炎病毒M-F基因间隔区。
图13描述了用MAPREC分析10个Mumpsvax疫苗样品的结果，如实施例7所述用RT/PCR扩增从10个小管的腮腺炎Jeryl Lynn疫苗分离出来的RNA决定JR5/JR2的相对部分。泳道1和2中的测试样品是系列稀释的未消化PCR产物，用于限定试验线性的下限。泳道3中PCR产物来自JL5的纯化分离物。泳道4中PCR产物来自JL2的纯化分离物。在泳道5-8中，PCR产物来自以下列比例混合的JL5和JL2病毒样品：分别是99JL5/1 JL2、95JL5/5 JL2、85JL5/15 JL2和75JL5/25JL2。泳道9-18的PCR产物来自Mumpsvax样品1-10。
图14描述了薄层层析，显示存在于如实施例5所述被含有CAT和荧光酶基因的rMUV感染的Vero细胞抽提物中的CAT活性。
图15的一张照片显示Vero单层细胞的细胞学染色，它被如实施例5所述含有β-半乳糖苷酶基因的rMUV感染。强蓝染色的存在表明β-半乳糖苷酶的表达和活性。C栏显示不含任何其它外源基因的rMUV“清晰”的噬斑。
引物序列简述
序列1是腮腺炎病毒Jeryl Lynn株全长基因组的共有核苷酸序列(SEQ IDNO：1)，它被写成反基因组(+，5’-3’)信使基因。
序列2是腮腺炎病毒Jeryl Lynn株NP蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。
序列3是腮腺炎病毒Jeryl Lynn株P蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)。
序列4是腮腺炎病毒Jeryl Lynn株I蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)。
序列5是腮腺炎病毒Jeryl Lynn株V蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)。
序列6是腮腺炎病毒Jeryl Lynn株M蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)。
序列7是腮腺炎病毒Jeryl Lynn株F蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO.7)。
序列8是腮腺炎病毒Jeryl Lynn株SH蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)。
序列9是腮腺炎病毒Jeryl Lynn株HN蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO.9)。
序列10是腮腺炎病毒Jeryl Lynn株L蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO.10)。
序列11是腮腺炎病毒Jeryl Lynn株JL5变体噬斑2的完整核苷酸序列(SEQ IDNO.11)。噬斑1和噬斑2在l703位不同(见表6)。序列写成反基因组(+，5’-3’)有义DNA。
序列12是腮腺炎病毒Jeryl Lynn株JL2变体噬斑2的完整核苷酸序列(SEQ IDNO.12)。噬斑1和噬斑2在5个核苷酸位置不同(见表7)。序列写成反基因组(+，5’-3’)有义DNA。
发明详述
如上所述，本发明涉及产生重组腮腺炎病毒(MUV)的方法。本领域的这种方法称为“拯救”或反向遗传学方法。在下列参考出版物中公开了不同无区段负链病毒的几种拯救方法：Baron和Barrett，1997；Collins等，1995；Garcin等，1995；He等，1997；Hoffman和Banerjee，1997；Lawson等，1995；Radecke和Billeter，1997；Radecke等，1995；Schneider等，1997；Schnell，1994；Whelan等，1995。其它关于拯救的出版物包括出版的关于MV和其它副粘病毒亚科病毒的国际专利申请WO 97/06270，和出版的关于RSV拯救的国际专利申请WO 97/12032。
进行重组腮腺炎病毒拯救之前，必须开发一种全腮腺炎病毒(Jerry Lynn株)的共有序列，并开发一种腮腺炎小复制子拯救系统(MUV)。在腮腺炎病毒感染细胞期间存在的RNA基因组群中采样，获得共有序列。因此，本发明的其它实施例涉及一个分离的多核苷酸序列，该序列编码腮腺炎病毒的基因组或反基因组或其蛋白质，以及这些序列的变体。优选在高严紧条件下，这些变体序列与编码一种或多种腮腺炎蛋白质的多核苷酸杂交(完整腮腺炎病毒图见图9的表2，包括腮腺炎病毒蛋白质基因起始和基因终止端)。更优选在高严紧条件下，这些变体序列与编码一种或多种腮腺炎病毒株的多核苷酸，如SEQ ID NO：1、11和12的多核苷酸序列杂交。为了限定高严紧DNA杂交条件，可方便的参考Sambrook等(1989)，pp.387-389(在此引入以供参考)，其中11段中的洗涤步骤视为高严紧性。本发明还涉及保守变体，其中多核苷酸序列与参照序列的不同在于核苷酸三联密码子中第三个核苷酸的改变。优选这些保守变体作为腮腺炎病毒参照多核苷酸参照序列的生物等价物。本发明的“分离”序列是非天然存在的序列。例如，这些序列可从其病毒基因组内的天然状态分离；或序列可以合成，即通过重组技术产生，如熟知的重组表达系统，或由机器产生。
本发明还涉及核酸分子，它含有一种或多种这样的多核苷酸。如上所述，给定的核苷酸共有序列在腮腺炎，如Jeryl Lynn株群中可含有一种或多种基因组。特定实施例使用SEQ ID NO.1、11或12的共有核苷酸序列，或当核苷酸序列进行转录时，表达一种或多种腮腺炎病毒蛋白质(NP、P/I/V、M、F、SH、HN和L)。见图10的表3中这些腮腺炎病毒蛋白质的基因起始、翻译起始、翻译终止和基因末端。
其它实施例涉及在SEQ ID NO2-10中分别列出的腮腺炎病毒蛋白质NP、P/I/V、M、F、SH、HN和L及其片段或变体的氨基酸序列。优选表达腮腺炎病毒蛋白质的片段和变体氨基酸序列、变体核苷酸序列在生物学上是等价的，即它们基本上保持相同的蛋白质功能，以获得所需重组腮腺炎病毒，不论弱化、感染或两者。这些变体氨基酸序列由本发明的多核苷酸序列编码。这些变体氨基酸序列可具有与腮腺炎病毒蛋白质的氨基酸序列约70％-80％，优选约90％的总相似性。变体核苷酸序列可与转录时编码腮腺炎病毒蛋白质的氨基酸序列或腮腺炎病毒蛋白质的变体氨基酸序列的核苷酸具有约70％-80％，优选约90％的总的相似性。图8和9中的表1和2分别描述了腮腺炎病毒蛋白质NP、P/I/V、M、F、SH、HN和L的示范性核苷酸序列。
通过生成核苷酸序列或蛋白质序列的变体获得其生物等价物。变体可以是模板序列的插入、取代、缺失或重排。可用常规方法，如PCR诱变、氨基酸(丙氨酸)筛选、和位点专一性诱变生成腮腺炎多核苷酸序列的变体。可用变体拯救评估变体表型，以评估是否获得所需的重组腮腺炎病毒，或获得所需的生物学效果。这些变体在免疫原性组合物中还可用于评估抗原性。
通过变核苷酸序列密码子可获得氨基酸的改变。已知用特定氨基酸取代氨基酸序列中的其它氨基酸可获得这类改变。例如，通过取代其它氨基酸，可对蛋白质赋予构型改变，导致与腮腺炎病毒的其它蛋白质结合或相互作用能力下降。其它改变可改变重组腮腺炎病毒减毒水平。
如Kyte和Doolittle(1982)所述用氨基酸亲水指数评价多肽相互作用的生物功能，发现某些氨基酸被其它具有相似亲水指数的氨基酸取代后，仍然保留相似的生物活性。反过来说，可基于亲水性作出类似氨基酸的取代，特别是当产生的多肽的生物功能要被用于免疫学实施例时。例见美国专利4,554,101(在此引入以供参考)，它描述了“蛋白质”最大局部平均亲水性由其毗邻氨基酸的亲水性决定，与其免疫原性有关。因此，可根据各氨基酸的亲水性进行取代。
在使用各氨基酸亲水性指标或疏水性指标时，优选引入的替代氨基酸的这些值是±2，特别优选±1的氨基酸取代，最优选取代是±0.5内。
本发明核苷酸序列编码的腮腺炎病毒蛋白质的优选特征包括以下的一种或多种：(a)直接与膜结合的膜蛋白或蛋白质；(b)能用SDS-丙酰胺(10％)凝胶分离的蛋白质；和(c)保持其对拯救有贡献的生物功能，在存在其它合适的腮腺炎病毒蛋白质的情况下产生所需重组腮腺炎病毒。
掌握了上述的核苷酸和氨基酸序列后，可着手拯救腮腺炎病毒。腮腺炎拯救是通过用拯救组合物在培养基中进行至少一种宿主细胞的转染或转化实现的。拯救组合物含有(i)一种含有分离的核酸分子的转录载体，它至少含有编码腮腺炎病毒的一个基因组或反基因组的一种多核苷酸序列，和(ii)至少一种表达载体，它含有编码包装、转录和复制所必需的反式激活蛋白质的一种或多种分离的核酸分子；在条件充分的情况下，可共同表达上述载体和重组病毒产物。反基因组是指一种分离的正信使有义多核苷酸序列，它作为子代基因组合成的模板。优选多核苷酸序列是cDNA序列，构建此序列以在转录后提供有意义的正链腮腺炎病毒基因组，从对应复制中间物RNA或反基因组，使之与编码转录和复制所必需的蛋白质的互补序列的有意义正链转录物杂交的可能性最小化。转录载体含有一个可操纵连接的转录单元，含有基因元件或在腮腺炎表达中具有调控作用的元件(例如启动子、结构基因或转录成腮腺炎RNA的编码序列)和合适的转录起始和终止序列。
转录载体与腮腺炎病毒蛋白质、NP、P和L共表达，这些蛋白质是核衣壳RNA复制所必需的，还是能进行RNA复制和转录的子代核衣壳成分。从编码所需蛋白质的一个或多个表达载体(如质粒)生成NP、P和L蛋白，虽然在被选宿主细胞中经加工可能产生一个或多个包含并表达这些病毒特殊基因的所需蛋白质，基因产物的改变是稳定的。在一个优选例中，经表达载体表达了NP、P和L蛋白。更优选的，从不同的表达载体，如质粒表达NP、P和L蛋白。在后一种情况下，更容易控制各种蛋白质在转染或转化期间的相对量。可从表达NP、P或L的质粒表达其它腮腺炎病毒蛋白质，或可用其它质粒表达其它蛋白质。
虽然NP、P和L量由宿主细胞对其表达的耐量决定，在细胞内，质粒表达NP、P和L被调节在一个有效的NP、P和L摩尔比。有效摩尔比是足够提供所需重组腮腺炎病毒的成功拯救的NP、P和L比。根据小复制子(CAT/报道子)实验中观察到的表达质粒率获得这些比。在一个实施例中，转染质粒pMUVNP∶pMUVP的分子比至少约16∶1，pMUVP∶pMUVL至少约1∶6。优选pMUVN∶pMUVP的的分子比约从16∶1到4∶1，pMUVP∶pMUVL约从1∶6到1∶1。更优选的，pMUVNP∶pMUVP约从6∶1到5∶1，pMUVP∶pMUVL约从1∶3到1∶2。
基因组cDNA质粒和腮腺炎病毒表达质粒pMUVNP、pMUVP和pMUVL转染或转化后，噬菌体T7 RNA聚合酶和载体编码的核酶序列(切割RNA形成3’末端)共同作用产生了基因组RNA的确切拷贝。包装该RNA并通过共转染表达质粒最初提供的病毒蛋白进行复制。就腮腺炎病毒拯救而言，来源于在宿主细胞(或细胞系)中加入T7RNA聚合酶和NP、P和L。实现腮腺炎病毒的拯救，需要共转染该细胞系和含有位置合适的T7 RNA聚合酶启动子的腮腺炎病毒基因组cDNA克隆以及编码腮腺炎病毒蛋白质NP、P和L的表达质粒。
为了拯救腮腺炎病毒，将所需病毒基因组的克隆DNA等价物置于合适的DNA-依赖性的RNA聚合酶启动子(如T7 RNA聚合酶启动子)和能插入合适转录载体(如细菌质粒)的自切割核酶序列(如肝炎δ核酶)之间。该转录载体提供了容易操纵的DNA模板，RNA聚合酶(如T7 RNA聚合酶)从中转录出病毒反基因组(或基因组)的单链RNA拷贝，其具有精确或相当精确的5’和3’末端。病毒基因组DNA拷贝、侧接启动子和核酶序列的朝向决定了转录反基因组或基因组RNA等价物。
因此，在拯救方法中，使用拯救组合物。该拯救组合物根据特殊需要或用途所需而变化。拯救组合物的一个例子是一种组合物，含有(i)含有分离的核酸分子的转录载体，该核酸分子含有编码腮腺炎病毒的基因组或反基因组的多核苷酸序列，和(ii)至少一种表达载体，它含有至少一种编码包装、转录和复制所需的反式激活蛋白质分离的核酸分子。选择转录和表达载体，使之在宿主细胞中转染拯救组合物，导致这些载体共表达并产生重组腮腺炎病毒。
如上所述，分离的核酸分子含有编码至少一种腮腺炎病毒的基因组或反基因组的序列。分离的核酸分子可能含有编码基因组、反基因组或其修饰形式的聚核苷酸序列。在一个实施例中，多核苷酸编码一个可操纵连接的启动子、所需基因组或反基因组，自切割的核酶序列和转录终止子。
在本发明的优选例中，多核苷酸编码通过核苷酸插入、重排、缺失或取代对野生型腮腺炎病毒的基因组或反基因组进行修饰。在优选例中，多核苷酸序列编码重组腮腺炎病毒的cDNA克隆。提出由于编码天然基因组和反基因组的多核苷酸的修饰增加，从拯救获得的复制病毒能力可能降低。从腮腺炎病毒的任何病毒株可获得基因组或反基因组序列。多核苷酸序列还可编码来源于重组连接的的基因组或反基因组或来自一种或多种不同来源的基因形成的嵌合基因组。
由于可使用本发明的方法形成的重组病毒作为诊断研究的工具或作为治疗或预防性免疫原性组合物，多核苷酸还可编码所选腮腺炎病毒的野生型或减毒形式。在许多实施例中，多核苷酸编码腮腺炎病毒的减毒感染形式。在具体的优选例中，多核苷酸编码在3’基因组启动子区中具有至少一种减毒突变，和在RNA聚合酶基因中具有至少一种减毒突变的腮腺炎病毒基因组或反基因组，(如公开的国际专利申请WO 98/13501，在此引入以供参考)。
除了编码上述所需腮腺炎病毒基因组和反基因组的修饰形式的多核苷酸序列，多核苷酸序列还可编码所需基因组或反基因组，以及一种或多种异源基因或所需的异源核苷酸序列。通过在编码腮腺炎的基因组或反基因组的多核苷酸序列中引入所选的核苷酸序列制备了这些变体。优选将所需的异源序列插入腮腺炎病毒基因组的基因间隔区。然而，可将所需异源序列插入腮腺炎多核苷酸序列的非编码区内，或插入非编码区和编码区之间，或插在多核苷酸序列的任何一端。在其它实施例中可将所需异源序列插入非必需基因的编码区内，或代替非必需基因的编码区。插入位点的选择可利用腮腺炎病毒表达的3’-5’梯度。异源核苷酸序列(如基因)可随所需变化。由所需重组病毒的应用决定，异源核苷酸序列可编码辅助因子、细胞因子(如白细胞介素)、T-辅助表位、限制性标记、佐剂或不同微生物病原体(如病毒、细菌、真菌或寄生虫)的蛋白质，尤其是能引起保护性免疫应答的蛋白质。理想的是选择编码辅因子、细胞因子(如白细胞介素)、T-辅助表位、限制性标记、佐剂或不同微生物病原体(如病毒、细菌或真菌)的蛋白质的免疫原性部分的异源序列，以使拯救所需腮腺炎病毒或小复制子病毒载体的可能性最大化。其它类型的非腮腺炎分子包括但不限于：癌症细胞或肿瘤细胞、变应原淀粉样肽、蛋白质或其它大分子组分。例如，在某些实施例中异源基因编码细胞因子，如白细胞介素-12，选择它改进重组病毒的预防性或治疗性特征。
这些癌症或肿瘤细胞的例子包括但不限于前列腺特异性抗原、癌胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125和MAGE-3。
这些变应原的例子包括但不限于美国专利号5,830,877和公开的国际专利申请号WO99/51259中所述的那些，在此引入以供参考，包括花粉、昆虫毒液、动物鳞屑、真菌孢子和药物(如青霉素)。这些成分涉及IgE抗体的产生，它是变应性反应的已知原因。
淀粉样肽蛋白(APP)涉及各种称为阿尔茨海默氏症、淀粉样变性或淀粉样原性疾病的疾病。β-淀粉样肽(也称为Aβ肽)是APP的一个42氨基酸片段，是β和γ分泌酶加工APP产生的，具有下列序列：
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys LeuVal Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met ValGly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NO 97)。
在一些病人中，淀粉样沉淀的形式是聚集的Aβ肽。令人惊奇的是，现在已发现应用分离的Aβ肽可在脊椎动物宿主中诱导淀粉样沉淀的Aβ肽组分的免疫应答(见出版的国际专利申请WO 99/27944)。这种Aβ肽还与非相关基团连接。因此，本发明的异源核苷酸序列包括该Aβ肽的表达和Aβ肽的片段，以及Aβ肽及其片段的抗体。Aβ肽的这样一种片段是具有下列序列的28个氨基酸的肽段(如美国专利4,666,829公开的)。
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys LeuVal Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys(SEQ ID NO 98)。
可在本发明与腮腺炎病毒载体有关的实施例中使用这些异源序列，该载体可用于对动物或人传递变异的RNA、氨基酸序列、多肽和蛋白质。本文列出的实施例4显示了在腮腺炎病毒转录启动子控制下腮腺炎病毒表达一种或多种异源基因(甚至3、4或5种基因)的能力。在其它实施例中，其它异源核酸序列可以是达7-10kb的序列，它作为一个单个的额外转录单元表达。优选遵循Six规则(Calain和Roux，1993)。在某些优选例中，该序列可达4-6kb。还可以其它单顺反子转录单元和多顺反子转录单元的形式插入异源遗传信息。使用其它单顺反子转录单元和多顺反子转录单元必需允许插入更多遗传信息。在优选例中，异源核苷酸序列作为至少一个多顺反子转录元件插入腮腺炎病毒基因组序列内，该异源核苷酸序列可含有一种或多种核糖体进入位点。在其它优选例中，异源核苷酸序列编码多蛋白和足够数目的蛋白酶，其切割上述多蛋白产生多蛋白质的单条多肽。
利用腮腺炎病毒感染的正常途径可选择异源核苷酸序列，该病毒通过呼吸道进入体内，感染各种组织和细胞，例如唾液腺、淋巴组织、乳腺、睾丸，甚至脑细胞。还可用异源基因提供用于基因治疗或靶向特异细胞的制剂。除了仅利用在腮腺炎感染的正常途径中接触的正常细胞，异源基因或片段可编码来自不同病原体的其它蛋白质或氨基酸序列，它们在作为重组腮腺炎病毒一部分使用时指导重组腮腺炎病毒到达腮腺炎病毒正常途径中没有的细胞或组织。用该方法，重组腮腺炎病毒成为传递广泛异源基因的载体。
对于使用减毒腮腺炎病毒的实施例，用常规方法引入减毒突变，产生修饰病毒，例如病毒生长期进行化学诱变，在细胞培养物中加入化学诱变原，然后选择在亚最适温度下传代的病毒，从选择温度敏感型和/或冷适应性突变，鉴定在细胞培养物中产生小噬斑的突变病毒，并通过异源宿主传代选择宿主范围突变。另一种引入减毒突变的方法包括用定点诱变产生预定的突变。可引入一种或多种突变。然后在细胞培养物和/或动物模型中筛选这些病毒以弱化其生物活性。对减毒的腮腺炎病毒进行核苷酸测序，以确定减毒突变的位点。
首先用体外方法，如序列鉴定、序列标记确定和基于抗体的试验测试拯救重组腮腺炎病毒的所需表型(温度敏感型、冷适应性、噬斑形态以及转录和复制的弱化)。
如果存在拯救病毒的减毒表型，可用合适的动物模型进行攻击实验。非人灵长类提供了人类疾病病理学的优选动物模型。首先用重组产生的减毒病毒免疫接种这些灵长类，然后用野生型病毒攻击。
根据所需病毒的选择，可改变表达载体和分离的核酸分子的选择，这些核酸分子编码包装、转录和复制所需的反式激活蛋白质。制备表达载体，以使其与转录载体在宿主细胞中共表达，并在所选条件下产生重组病毒。
腮腺炎拯救包括合适的细胞环境，优选哺乳动物，其中存在T7 RNA聚合酶以驱动从含病毒基因组cDNA的转录载体转录出反基因组(或基因组)单链RNA。共转染时或其不久后，该病毒反基因组(或基因组)RNA转录物被核衣壳蛋白质包装入功能模板，并与同时来源于编码所需病毒特异性反式激活蛋白质的共转染表达质粒所需的聚合酶组分结合。这些事件和过程导致病毒mRNA的预先转录、新基因组的复制和扩增，从而产生新的病毒子代，即拯救。
在本发明的拯救方法中，可由重组痘病毒提供T7 RNA聚合酶。然而该系统需要用物理或生物化学方法，或在作为痘病毒的不良宿主的细胞或组织中重复传代，才能从痘病毒分离出拯救病毒。使用在哺乳动物细胞中不增殖的宿主细胞限制性痘病毒株(如MVA-T7)无需这种要求。已报道了两种表达噬菌体T7 RNA聚合酶的重组MVA。MVA/T7重组病毒含有一个T7 RNA聚合酶的整合拷贝，它在7.5K弱早期/晚期启动子(Sutter等，1995)或11K强晚期启动子(Wyatt等，1995)的控制下。
在拯救组合物转染中使用的宿主细胞或细胞系可以根据拯救所选的条件广泛变化。在允许拯救组合物载体共表达的条件下培养宿主细胞，以产生所需的重组腮腺炎病毒。这些宿主细胞选自各式各样的细胞，包括真核细胞，优选脊椎动物细胞。可用鸟类细胞，但优选来自人细胞的宿主细胞，如人胚肾细胞。示范性宿主细胞是人293细胞、A549细胞和Hep2细胞。还可用Vero细胞和许多其它种类的细胞作为宿主细胞。合适宿主细胞的其它例子是：(1)人二倍体原代细胞系：如WI-38和MRC5细胞；(2)猴二倍体原代细胞系：如FRhL-胎猴肺细胞；(3)准二倍体连续细胞系：如AGMK-非洲绿猴肾细胞；(4)其它可能的细胞系，如CHO、MDCK(Madin-Darby犬肾)和原代鸡胚成纤维细胞(CEF)。一些真核细胞比其它更适合增殖病毒，而一些细胞系对于一些病毒完全不起作用。使用可得到检测的细胞病变作用的细胞系，以方便的检测活病毒拯救。对腮腺炎而言，可在Vero细胞上共培养转染的细胞，因为，该病毒可在Vero细胞上迅速传播，形成可方便检测的噬斑。一般使用所选病毒能生长的宿主细胞。
在其它优选例中，可加入转染促进剂，增加细胞的DNA吸收。这些试剂中许多是本领域已知的。LIPOFECTACE(Life Technologies，Gaithersbuig，MD)和EFFECTENE(Qiagen，Valencia，CA)是常用的例子。Lipofectace和Effectene都是阳离子脂类。它们都包裹DNA并增强细胞的DNA吸收。Lipofectace在DNA周围形成脂质体，而Effectene包裹DNA但不形成脂质体。
设计用于在宿主细胞中的表达的转录载体和表达载体可以是质粒载体。表达载体含有至少一条编码包装、转录和复制必需的反式激活蛋白的分离的核酸分子，该表达载体可从同一表达载体或至少两种不同载体表达这些蛋白质。这些载体通常是基础拯救方法已知的，不需要为了本发明的改进方法作出改变。
在本发明的方法中，可用于拯救的标准温度范围(约32℃-37℃)；然而，已显示表明在较高的温度下的拯救改善了重组RNA病毒的回收。较高的温度称为热休克温度(见公开的国际专利申请号WO 99/63064，在此引入以供参考)。有效热休克温度是进行重组病毒拯救建议的标准温度以上的温度，在该温度下重组病毒的回收水平提高。温度范围的示范性表如下：从38℃到约47℃，更优选从约42℃到约46℃。值得注意的是43℃、44℃和45℃的热休克温度是特别优选的。
使用许多方法确定所需重组腮腺炎病毒的回收水平。如本文例子中注意的，氯霉素乙酰转移酶(CAT)报道基因被用于监测和优化重组病毒的拯救条件。报道基因的对应活性建立了重组病毒表达的基线和测试水平。其它方法包括检测获得的重组病毒噬斑数和通过测序证实拯救病毒的产生。
在优选例中，在宿主细胞内，将转染的拯救组合物进行噬斑扩增步骤(即扩增步骤)。将转染的拯救组合物转移到至少一层噬斑扩增细胞(PE细胞)上。选择腮腺炎病毒或重组腮腺炎病毒显示生长增加的噬斑扩增细胞，从而改善重组病毒从转染细胞上的回收。优选将含有拯救组合物的转染细胞转移到基本汇合的PE细胞单层上。在公开的国际专利申请号WO 99/63064中还罗列出各种拯救技术的变化，包括噬斑扩增。
用本发明方法制备的重组腮腺炎病毒被用于诊断、预防和治疗性应用。优选本发明的方法制备的重组病毒已经过减毒。减毒的重组病毒与感染人类和动物宿主的野生型病毒相比，毒性应有所下降。减毒程度是在大部分个体中不产生感染症状，但病毒保持足够的复制能力，具有感染性，并引起疫苗所需的免疫应答情况。可单独使用减毒重组病毒或与药物、抗原、免疫制剂或佐剂联合使用，作为预防和改善疾病中的疫苗。可配制这些活性制剂，并用常规方法传递，如用稀释剂或在药理上可接受的载体。
因此，在本发明的其它实施例中，重组产生的减毒腮腺炎病毒被用于免疫原性组合物，这些免疫原性组合物含有(i)至少一种重组产生的减毒腮腺炎病毒，和(ii)至少一种药物学上可接受的缓冲剂或稀释剂、佐剂或载体。优选这些复合物在预防和/或改善腮腺炎感染中具有作为免疫原性组合物的治疗和预防用途。在这些用途中，本发明中至少一种重组的减毒腮腺炎病毒以其免疫有效量使用，导致正常的腮腺炎感染过程的实际缩短。
该免疫原性组合物的配方是本领域技术人员熟知的。本发明的免疫原性组合物可能含有其它的抗原组分(如多肽或其片段，或编码抗原或其片段的核酸)，优选包括药物学上可接受的载体。合适的药物学上可接受的载体和/或稀释剂包括任何和所有的常规溶剂、分散介质、填充剂、固相载体、水溶液、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂等。术语“药物学上可接受的载体”指一种在被施药的病人中不产生过敏反应或其它不良作用的载体。合适的药物学上可接受的载体包括：一种或多种水、盐、磷酸缓冲盐、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。药物学上可接受的载体还可含有少量辅助物质，例如湿润和乳化剂，防腐剂或缓冲剂，它增加抗原的半衰期或有效性。用这些介质和药物学活性物质的制剂是本领域熟知的。目前除了那些与活性成分不相容的任何常规介质或制剂，本发明中免疫原性组合物的使用是成熟的。
使用该免疫原性组合物可通过任何常规的有效形式，如鼻内、胃肠道外、口腔或通过气溶胶喷雾外用于粘膜表面，如鼻内、口腔、眼、肺、阴道或直肠表面。施药的优选方法是胃肠道外或鼻内。
口服制剂包括这些正常使用的赋形剂，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等的药物颗粒。
本发明的疫苗组合物可包含佐剂，包括但不限于氢氧化铝；磷酸铝；StimulonTM QS-21(Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Framingham，MA)；MPLTM(3-O-脱乙酰基一磷酸脂A；RIBI ImmunoChem Research，Hamilton，MT)、IL-12(Genetics Institute，Cambridge，MA)；N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙酰基-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为正-MDP)；N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘氨酸-3-羟基磷酸磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A，称为MTP-PE)；和霍乱毒素。其它可用的是霍乱毒素的无毒衍生物，包括其B亚基(例如，根据公开的国际专利申请WO 00/18434在此引入以供参考，氨基酸29位的谷氨酸被其它氨基酸，优选组氨酸取代)，和/或非腮腺炎多肽与霍乱毒素或其B亚基、前霍乱样肽、真菌多糖的偶联物或基因工程改造的融合物。
本发明重组产生的减毒腮腺炎病毒可作为免疫原性组合物中唯一的活性免疫原使用。然而，免疫原性组合物还可以含有其它活性免疫原，包括其它针对其它病原性物种的免疫学活性抗原。其它免疫学活性抗原可以是复制因子或非复制因子。复制因子如麻疹病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、副流感病毒(PIV)和呼吸道合胞病毒(RSV)的减毒形式。
本发明的重要方面之一涉及一种在哺乳动物中引起免疫应答的方法，包括提供本发明所述哺乳动物的免疫原性组合物。该免疫原性组合物是一种在治疗的动物或人中具有免疫原性的组合物，该组合物中所含的免疫学有效量的多肽引起针对腮腺炎感染的所需应答。有效量涉及一种治疗方法，包括改善或预防人类腮腺炎的感染，包括对人施用免疫学有效量的免疫原性组合物。剂量可根据个人的具体情况变化。可用本领域技术人员已知的方法在常规试验中确定该量。
当然腮腺炎病毒蛋白质的分离氨基酸序列可用于形成亚基疫苗。它们还可用作在检测抗腮腺炎病毒蛋白质反应性抗体的免疫试验中引起多克隆或单克隆抗体的抗原。本发明包括的免疫试验包括但不限于美国专利号4,367,110(双单克隆抗体夹心试验)和美国专利号4,452,901(蛋白质斑点)，这些美国专利在此引入以供参考。其它试验包括体外和体内的标记配体的免疫沉淀法和免疫细胞化学。
本发明还涉及一种诊断腮腺炎感染，或鉴定施用的腮腺炎疫苗株的方法，包括步骤：确定样品中SEQ ID NO2-10的氨基酸序列的存在。可使用任何常规诊断方法。可基于氨基酸序列或多肽的存在方便地使用这些诊断方法。优选该诊断方法匹配具有至少10个，优选至少20个与本发明的氨基酸序列相同的氨基酸的多肽。
本文公开的核酸序列还可用于许多诊断应用。这些核酸序列可用于制备相对较短的DNA和RNA序列，它们能与编码腮腺炎病毒蛋白质的核酸序列专一性杂交。根据诊断试验专一性的所选参数具有所需长度的核酸探针。探针可用于检测病原性生物体的存在，或用于鉴别在给定样品中施用的腮腺炎疫苗。使用目前先进的重组表达技术，可将核酸序列插入表达构建物，用以筛选相应的寡核苷酸和多肽与现有抗体的反应性，或产生诊断或治疗反应物的能力。合适的表达控制序列和宿主细胞/克隆载体组合是本领域熟知的，在Sambrook等(1989)中举例描述。
在优选例中，杂交研究或试验使用的核酸序列包括与至少约10-20个核苷酸长的核酸段互补的序列，虽然能使用至少约10-30，或可达30-60个核苷酸。可使用各种已知的杂交技术和系统实施本发明的杂交方面，包括例如Falkow等，美国专利4,358,535中所述的那些诊断试验。
通常猜想本文所述的杂交探针将同时用作溶液杂交中的反应物和使用固相的情况。在与固相有关的例子中，可疑的临床样品，如排泄物、体液(如羊水、中耳积液、支气管肺泡灌洗液)或甚至组织的测试DNA(或RNA)被吸收或固定在所选的基质或表面。然后使该固定的单链核酸在理想条件下与所选探针进行特异性杂交。所选条件将由基于所需的具体条件(根据例如G+C含量、靶核酸的类型、核酸来源、杂交探针大小等)的具体环境而定。洗涤杂交表面，除去非特异性结合的探针分子后，用标记方法检测或甚至定量特异性杂交。
本发明中，编码腮腺炎病毒蛋白质的核酸序列或其变体可与PCRTM技术结合，如美国专利4,603,102中所述。可利用本发明任何腮腺炎病毒序列的各种部分作为PCRTM扩增腮腺炎病毒基因限定部分或腮腺炎病毒核苷酸(然后可通过与含有互补序列的杂交探针杂交检测)的寡核苷酸探针。用这种方法，可在样品中利用本发明的核苷酸序列检测极小浓度的腮腺炎核酸。
包括下列实施例是为了说明一些本发明的实施例。然而本领域技术人员应根据本发明的公开内容，理解可对公开的具体实施例进行许多改变，并且在不违背本发明的精神和范围的情况下，仍然可获得相似或类似的结果。
提供下列实施例仅为了说明，不是为了限制上述的本发明。
实施例
实施例1
材料和方法
细胞和病毒。从SPAFAS Inc.，Preston，CT获得了原代鸡胚成纤维(CEF)细胞，在含5％胎牛血清的Eagle’s基础培养基(BME)上培养。从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得了Hep2细胞、293细胞、A549和Vero细胞，并在含10％胎牛血清的Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM)上培养。直接在CEF细胞上培养来自Mumpsvax的小指管，批号0089E，0656J和1159H(Merck和Co.，Inc.，West Point，PA)的腮腺炎病毒Jeryl Lynn株。从B.Moss[(国家卫生协会，Bethsda，MD)，见Wyatt等，1995]获得了表达噬菌体T7RNA聚合酶的重组痘病毒Ankara(MVA-T7)。
1.A.腮腺炎病毒Jeryl Lynn株共有序列的产生
腮腺炎病毒Jeryl Lynn株的生长。直接在原代鸡胚成纤维细胞(CEF，Spafas，Inc.)上，在补充有5％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)上，或在补充有5％胎牛血清的Eagle’s基础培养基(BME)上培养来自Mumpsvax的小指管，批号0089E，0656J和1159H(Merck和Co.，Inc.，)的腮腺炎病毒Jeryl Lynn株。用重悬浮的Mumpsvax以合适的0.002感染复数(moi)在室温下感染铺在T-75型盒上的CEF 2小时。37℃培养细胞4天，期间观察广泛的合胞体和细胞病变。将细胞刮到培养液中，然后在干冰/乙醇浴中冻融2次，然后在37℃培养以收集病毒。在Beckman GS-6KR离心机(Beckman Instruments，Inc.，Palo Alto，CA)中2,500rpm离心，除去细胞碎片。-80℃储藏病毒。
病毒RNA的分离、扩增和测序
从病毒的冷冻等份中用Trizol LS试剂(GibcoBRL，Grand Island NY)根据制造商的方法分离腮腺炎病毒RNA。用分离的病毒RNA作为模板，用Titan One-TubeRT-PCR系统(Boehringer Mannheim，Indiananpolis，IN)进行逆转录后进行聚合酶链式反应(RT-PCR)。以4个独立片段用下列引物扩增腮腺炎病毒基因组：
5’-1ACCAAGGGGAGAATGAATATGGG23(SEQ ID NO.95)和
5’-3875CTGAACTGCTCTTACTAATCTGGAC3851(SEQ ID NO.82)(3.9kb产物)；
5’-3773CTGTGTTACATTCTTATCTGTGACAG3798(SEQ ID NO.21)和
5’-7783TGTAACTAGGATCTGATTCCAAGC7760(SEQ ID NO.72)(4 kb产物)；
5’-7678AGAGTTAGATCAGCGTGCTTTGAG7701(SEQ ID NO.32)和
5’-11685CCTTGGATCTGTTTTCTTCTACCG11662(SEQ ID NO.62)(4kb产物)；
5’-11529GTGTTAATCCCATGCTCCGTGGAG11552(SEQ ID NO.42)和
5’-15384ACCAAGGGGAGAAAGTAAAATC15363(SEQ ID NO.53)
(3.9kb产物)。RT和PCR条件根据厂商(Boehringer Mannheim，Indiananpolis，IN，目录号1855476)的建议方案。在1％琼脂糖凝胶中纯化PCR产物。
用Applied Biosystems(ABI)377测序仪(Applied Biosystems，Inc.，Fostercity，CA)对PCR产物进行测序。为了测序，设计一系列引物，它们跨越全腮腺炎病毒基因组，如下文表4显示。这些引物序列基于从Genbank获得的对于各种不完整测序的腮腺炎病毒株的核苷酸序列信息。使用公开的序列，设计了一种编码其蛋白质的假定腮腺炎病毒基因组序列，然后从中产生引物。
为了正确确定腮腺炎病毒Jeryl Lynn株基因组的5’和3’末端，在末端连接病毒基因组RNA，然后用PCR扩增cDNA，跨越连接区。对于每次反应，在10％DMSO、5X连接缓冲液和去离子水中83℃保温3-5微克病毒RNA3分钟，使任何二级结构变性，并立即置于冰上。加入T4RNA连接酶(20单位，New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)和40单位RNasin(Promega)，得到20微升最终的连接混合物，在16℃保温过夜。用苯酚/氯仿抽提连接产物，用下列跨越基因组连接区的引物对其进行RT-PCR：
5’-15166GCGCATTGATATTGACAATG15185(SEQ ID NO.52)和
5’-216CCCTCCTCACCCCTGTCTTG197(SEQ ID NO.92)。PCR产物用下列嵌套引物进行第二轮PCR：
5’-15227GAATAAAGACTCTTCTGGC15245(SEQ ID NO.93)
和5’-138GGTAGTGTCAAAATGCCCCC119(SEQ ID NO.94)。
从凝胶纯化最终的PCR产物，并测序。
表4
测序MUV基因组的引物
1 ACCAAGGGGAGAATGAATATGGG 23 (SEQ ID NO：95)
385 CTCAGCAGGCATGCAAAATC 404 (SEQ ID NO：96)
765 CAAGATACATGCTGCAGCCG 784 (SEQ ID NO：13)
1169 GTCCTAGATGTCCAAATGCG 1188 (SEQ ID NO：14)
1544 GACTTTAGAGCACAGCCTTT 1563 (SEQ ID NO：15)
1841 CAATCTAGCCACAGCTAACT 1861 (SEQ ID NO：16)
2107 CGTTGCACCAGTACTCATTG 2126 (SEQ ID NO：17)
2484 GGCATAGACGGGAATGGAGC 2503 (SEQ ID NO：18)
3072 TTCGAGCAACGATTGGCAAAGGC 3094 (SEQ ID NO：19)
3712 CCAGCTCCGATAAATATGTC 3731 (SEQ ID NO：20)
3773 CTGTGTTACATTCTTATCTGTGACAG 3798(SEQ ID NO：21)
4062 CTGACAGTCAGCATAGGAGA 4081 (SEQ ID NO：22)
4364 GAAGTCTGCCTCAATGAGAA 4383 (SEQ ID NO：23)
4716 CCAACCCACTGATAACAGCT 4735 (SEQ ID NO：24)
5185 CCAGCATTGTCACCGATTAG 5204 (SEQ ID NO：25)
5545 CAATACAATGAGGCAGAGAG 5564 (SEQ ID NO：26)
6223 TGAATCTCCTAGGGTCGTAACGTC 6246 (SEQ ID NO：27)
5952 GAGCAACCATCAGCTCCAAT 5971 (SEQ ID NO：28)
6330 CATAACCCTGTATGTCTGGAC 6350 (SEQ ID NO：29)
6783 GGATGATCAATGATCAAGGC 6802 (SEQ ID NO：30)
7172 GGTAAGACACACTGGTGCTA 7191 (SEQ ID NO：31)
7678 AGAGTTAGATCAGCGTGCTTTGAG 7701 (SEQ ID NO：32)
7887 GCTGGTGGCCGTATGAACTCC 7907 (SEQ ID NO：33)
8344 CAGATTGACCATCACTTGAG 8363 (SEQ ID NO：34)
8660 CCTAGTCTCCGGTGGACCCG 8679 (SEQ ID NO：35)
9166 CACTGATATGTTAGAGGGAC 9185 (SEQ ID NO：36)
9583 CCGAGAGTCCATGTGTGCTC 9602 (SEQ ID NO：37)
10000 AGAGGATGACAGATTCGATC 10019 (SEQ ID NO：38)
10415 GAGATAGCAGCCTGCTTTCT 10434 (SEQ ID NO：39)
10813 GCTCAGTCATTCCGAGAAGA 10832 (SEQ ID NO：40)
11193 GTCAGGACATCACTAATGCT 11212 (SEQ ID NO：41)
11529 GTGTTAATCCCATGCTCCGTGGAG 11552(SEQ ID NO：42)
12006 GCAGTAGTGGTGATGACAAG 12025 (SEQ ID NO：43)
12375 CTCCTATGCATTCTCTAGCT 12395 (SEQ ID NO：44)
12793 GCAGATGGTAAATAGCATCA 12812 (SEQ ID NO：45)
13219 CGATTATGAGATAGTTGTTC 13238 (SEQ ID NO：46)
13623 GTTCATCCGAATCAGCATCC 13642 (SEQ ID NO：47)
14036 CAAGCAGGTATAGCAGCAGG 14055 (SEQ ID NO：48)
14388 CCGACCCGAATAATCACGAG 14407 (SEQ ID NO：49)
14775 CATCAGATCATGACACCCTA 14794 (SEQ ID NO：50)
14963 GTGATAACACCCATGGAGATTC 14984 (SEQ ID NO：51)
15166 GCGCATTGATATTGACAATG 15185 (SEQ ID NO：52)
15384 ACCAAGGGGAGAAAGTAAAATC 15363 (SEQ ID NO：53)
14977 CATGGGTGTTATCACGTCTC 14958 (SEQ ID NO：54)
14549 CAACACGCCTCCTCCAGTAC 14530 (SEQ ID NO：55)
14201 GTACACCCTCCAGATCCACA 14182 (SEQ ID NO：56)
13807 CCATGATGTGGATGATAAAC 13788 (SEQ ID NO：57)
13412 CATATTCGACAGTTTGGAGT 13393 (SEQ ID NO：58)
13021 CAAGGTCATATACACATAGT 13002 (SEQ ID NO：59)
12602 CTACACAAGACTCGACAGGT 12583 (SEQ ID NO：60)
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11382 CAGATATCTAGACAGCCAGC 11363 (SEQ ID NO：63)
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656 GTACACTGTAACACCGATCC 637 (SEQ ID NO：91)
216 CCCTCCTCACCCCTGTCTTG 197 (SEQ ID NO：92)
先前的工作显示，Jeryl Lynn疫苗株含有两种不同病毒群的混合物(Afzal等，1993)。因此为了在拯救过程中减少亚最佳蛋白-蛋白相互作用的可能性(通过将来自不同病毒群的cDNA剪切成基因组cDNA)，选择从Jeryl Lynn疫苗制备物良好分离的噬斑(称作噬斑分离物4，PI4)并扩增，衍生出全长基因组cDNA和NP、P和L表达质粒。
1.B.MUV NP、P和L蛋白质表达质粒的构建。在修饰的质粒载体pEMC(Moss等，1990)中的T7 RNA聚合酶启动子和T7 RNA聚合酶转录终止序列之间剪切各ORF的cDNA，构建MUV NP、P和L蛋白质的表达质粒(pMUVNP、pMUVP、pMUVL)。质粒pEMC含有脑心肌炎病毒(EMC)的帽非依赖性翻译增强子(CITE)。用于从全长MUV感染的细胞(CEF)的RNA以RT-PCR扩增MUV NP蛋白质ORF，其引物是：5’CGTCTCCCATGTTGTCTGTGCTCAAAGC(SEQ ID NO 99)和5’ATCATTCTCGAGTTGCGATTGGGGTTAGTTTG(SEQ ID NO 100)；凝胶纯化得到的cDNA片段，用BsmBI和XhoI截短，然后连接入NcoI/XhoI切割的pEMC，使得NP蛋白质ORF的AUG与CITE邻接。用于MUV P ORF扩增的引物是5’TTCCGGGCAAGCCATGGATC(SEQ ID NO 101)和5’ATCATTCTC GAGAGGGAATCATTGTGGCTCTC(SEQ ID NO 102)。还将P ORF cDNA(用定位诱变修饰，包括通过病毒聚合酶共转染插入的两个G核苷酸，产生P mRNA)克隆入pEMC的NcoI/XhoI位点。由于其尺寸大，L蛋白质ORF分两步装配：第一步中使用引物5’ATCATTCGTCTCCCATGGCGGGCCTAAATGAGATACTC(SEQ ID NO 103)和5’CTTCGTTCA TCTGTTTTGGATCCG(SEQ ID NO 104)，产生用BsmBI和BamHI截短的cDNA片段，然后克隆入pEMC的NcoI/BamHI位点。在第二步中，用引物5’CAGAGTACCTTATATCGGATCC(SEQ ID NO 105)和5’ATCATTCTGCAGGAATTTGGAT GTTAGTTCGGCAC(SEQ ID NO 106)扩增从步骤1扩增入质粒的BamHI/PstI位点的cDNA片段，来完成L蛋白ORF。对三个ORF中每一个的4个cDNA克隆进行测序，选择与Jeryl Lynn共有核苷酸/氨基酸序列的最高水平的同源性的ORF用于拯救实验。
1.C.合成性MUV小复制子的构建。根据图1，设计T7 RNA聚合酶启动子序列，从确切的MUV 5’末端核苷酸开始转录，放置一HDV核酶序列(Been等)在小复制子RNA转录物中产生精确的MUV 3’末端核苷酸。在HDV核酶序列后含有多个T7 RNA聚合酶终止信号。细菌氯霉素乙酰转移酶(CAT)ORF替换了所有MUV基因组的编码和顺反子间序列：剩余的主要MUV专一性序列含有3’MUV前导序列(55nt)和邻接的90nt非翻译区(UTR)和5’MUV尾随序列(24nt)，其与137nt L基因UTR相邻。
从代表修饰的MUV基因组的cDNA装配了合成性MUV小复制子(MUV CAT)，其中用CAT ORF替换了所有编码和顺反子间区。从完整感染细胞(CEF)RNA用引物对5’ACCAAGGGGAGAATGAATATGGG(SEQ ID NO 107)/5’ATCATTCGTCTCTTTTCCAGGTAGTGTCAAAATGCC(SEQ ID NO 108)和5’ACCAAGGGGAGAAAGTAAAATC(SEQ ID NO 109)/5’ATCATTCGTCTCTATCGAATAAAGACTCTTCTGGC(SEQ ID NO 110)以RT/PCR分别扩增MUV3’和5’末端的cDNA。在PCR扩增的第二轮中，用嵌套引物分别加入T7 RNA聚合酶启动子和MUV5’和3’末端的肝炎δ病毒(HDV)核酶序列NarI位点的5’端；加入T7 RNA聚合酶启动子的引物对是：5’AAGCTCGGCGGCCGCTTGTAATACGACTCACTATAACCAAGGGGAGAAA GTAAAATC(SEQ ID NO 111)/ 5’ATCATTCGTCTCTATCGAATAAAGACTCTT CTGGC (SEQ ID NO 112)；和为了加入核酶成分的引物对为：5’ATCATTGGCGCCAGCGAGGAGGCTGGGACCATGCCGGCCACCAAGGGGAGAATGAATATGGG(SEQ ID NO 113)/5’ATCATTCGTCTCTTTTCCAGGTAG TGTCAAAATGCC (SEQID NO 114)。用引物5’TCATTCGTCTCGGAAAA TGGAGAAAAAAAT CACTGGATATACC (SEQID NO 115)和5’ATCATTC GTCTCTCGATTTA CGCCCCGCCCTGCCACTC (SEQ ID NO 116)扩增CAT ORF cDNA。凝胶纯化三种组分，用BsmBI截短，在4方向连接中连接，并克隆入修饰的pBSK S(+)(Sidhu等，1995)的NotI/NarI位点，产生完整的小复制子质粒pMUVCAT。
1.D.MUV全长基因组cDNA的构建。通过将cDNA片段连续克隆入用于构建pMUVCAT(见图2)的相同质粒骨架，5’末端到3’末端装配MUV(PMUVFL)的全长基因组cDNA。用含有合适的单一限制性位点的引物对通过RT-PCR从全部感染细胞RNA扩增各cDNA片段；在各情况下，有义引物除了病毒特异性内切酶位点，还含有5’近侧NotI位点，以促进分步克隆策略。在加到生长的全长克隆之前，在pBluescriptII SK(+)(Stratagene，La Jolla，CA)中跨越病毒3’末端到BssHII的cDNA片段被分别装配。在第一步中，用5’延伸引物产生与病毒特异性BssHII位点邻接的XhoI位点，将BssHII/ClaI cDNA片段克隆入pBluescript的ClaI/XhoI位点。在第二步中，将病毒3’末端到ClaI cDNA片段克隆入来自第一步的质粒的NotI/ClaI位点，完成病毒3’末端到BssHI的序列。通过掺入用于产生病毒3’末端/ClaI末端片段的(+)义RT/PCR引物，T7 RNA聚合酶启动子序列被加到病毒3’末端。在PCR扩增的第二轮中分别修饰基因组cDNA的5’末端片段(BamHI/NarI)，以在HDV核酶序列的NarI部分加入5’末端。使用4轮克隆装配pMUVFL；在每一轮后，在新加上的cDNA区对4个克隆进行测序，并与MUV共有序列比较。然后选择含有最少数目的突变的cDNA克隆，加入下一个cDNA片段。重新对全部装配好的cDNA克隆进行测序，证实细菌扩增中的稳定性。用Electrocompetent SURE细胞(Stratagene，LaJolla，CA)和DH5α细胞(GibcoBRL，Grand Island，NY)作为细菌宿主克隆MUVcDNA。
1.E从转染的细胞拯救CAT活性。为了拯救CAT活性，用MUV感染或用体外转录的MUVCAT小复制子RNA转染细胞，或用MVA-T7感染以及用pMUVCAT联合pMUVNP、pMUVP和pMUVL表达质粒感染细胞。用4微克pMUVCAT作为T7 RNA聚合酶模板以20微升最终体积，根据厂商方案(Promega，Madison，WI)进行体外转录；然后用RQ-1 DNA酶RQ-1 DNase消化模板DNA。用MUV以1-2的moi在6孔盘中将293个细胞培养过夜，至80％汇合；在感染1小时后(hpi)，在各孔中根据厂商方案加入含有5-10微升体外转录反应物(约5-10微克RNA)和10-12微升LipofectACE(GibcoBRL)的混合物。在48hpi后，将细胞刮到悬液中，离心收集，重新悬浮在100微升0.25M Tris缓冲液(pH7.8)中，进行三轮冻融。然后用14C标记的氯霉素(Sidhu等，1995)或荧光素标记的氯霉素作为底物(Molecular Probes.Eugene，Ore)检测澄清的细胞抽提物的CAT活性，然后在Thin Layer Chromagram上分析反应产物。
为了在不存在MUV辅助病毒的存在下拯救CAT活性，在6孔盘中培养293、Hep2和A549细胞过夜至约80％汇合，用10moi MVA-T7进行感染，并在1hpi后用含有200纳克pMUVCAT、300纳克pMUVNP、50纳克pMUVP、200纳克pMUVL和10-12微升LipofectACE的混合物转染。在24hpi后，用2毫升新鲜的生长培养基替换转染混合物，再培育细胞24小时，然后制备细胞抽提物，如上所述进行CAT试验。
1.F从转染细胞回收感染性的全长MUV。为了从cDNA拯救感染性MUV，用以4moi MVA-T7感染6孔盘中培养过夜到约90％汇合的A549细胞；在1hpi时，用含有3-7微克pMUVFL、300纳克pMUVNP、50纳克pMUVP、200纳克pMUVL和14微升Lipofectace的混合物转染细胞。24hpi时，用生长培养基(含有10％胎牛血清的DMEM)替换转染混合物，在37℃再培育细胞48小时；将上清液(P1)或全部单层转染细胞刮到悬液中，然后直接转移到已在37℃培育4天的汇合A549细胞单层上，以制备全细胞ELISA(见下文)，用于检测MUV感染集落。再将这些A549指示细胞的上清液(P2)转移到汇合的Vero细胞单层上，37℃培育3-4天，观察MUV诱导的合胞体。
1.G拯救MUV的识别和鉴定。用全细胞ELISA进行最初的拯救MUV(rMUV)鉴定；用含10％甲醛的1X磷酸缓冲盐(PBS)在室温下固定用转染上清液(见上)感染的A549细胞30分钟；然后细胞用PBS漂洗1次，用封闭溶液(5％(w/v)牛奶x1 PBS)漂洗1次，然后在封闭溶液中4℃培育过夜。除去过夜的封闭溶液，在从新鲜封闭溶液1/400稀释的MUV多克隆家兔抗血清(Access Biomedical，San Diego)中室温培育细胞2-3小时。然后除去多克隆抗血清；用封闭溶液漂洗细胞5次，然后与以封闭溶液1∶1000稀释的偶联有山羊抗家兔血清(DAKO Corporation，Carpinteria，CA)的辣根过氧化物酶(HRP)在室温下培育2-3小时。然后除去山羊血清；用封闭溶液洗涤细胞5次，用PBS洗涤细胞1次，然后加入足够AEC底物(DAKO Corporation)覆盖细胞单层，在37℃培育15-20分钟，促使染色显色。
对从感染了(P2)pMUV的Vero细胞以RT/PCR扩增cDNA片段进行序列分析，在rMUV中证实核苷酸尾仅存在于pMUVFL中(不存在于任何实验室培养的Jeryl LynnMUV中)。在6孔盘中根据厂商方案用Trizol(gibcoBRL)抽提，制备RNA；根据TitanKit(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)的指示，用每个孔中的1/5总RNA作为RT/PCR扩增的模板，以引物对侧接三个独立核苷酸尾的每一个。通过电泳洗脱用1％琼脂糖凝胶纯化得到的RT/PCR片段，用Applied Bosystems(ABI)377测序仪(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)根据厂商方案进行测序。
实施例2
从转染细胞拯救报道基因活性。为了帮助定义允许从cDNA拯救感染性腮腺炎病毒的系统，装配了含有CAT报道基因的腮腺炎病毒小复制子。设计的构建体能在T7 RNA聚合酶启动子的控制下合成负极性的RNA小基因组。在构建小复制子时省去了T7启动子的三个末端G残基，以提供从MUV基因组确切5’核苷酸开始的转录起始位点。在小复制子构建物中包含的HDV核酶允许切割T7RNA聚合酶转录物，以产生真正的MUV特异性3’末端。MUVCAT小复制子RNA中的全部核苷酸(966)除以6，与Six规则一致(Calain和Roux，1993)，它陈述了除非基因组长度是6的倍数，否则不会发生充分的复制。CAT基因的表达在MUV特异性启动子的控制下，仅在小复制子RNA被NP蛋白质包装，然后与功能性MUV特异性RNA聚合酶蛋白质相互作用的情况下发生。
本文中使用两种不同的拯救系统恢复CAT活性。方法1：在体外将转录的MUVCAT RNA转染入293细胞，之前293细胞已用MUV感染。在这些条件下，拯救的CAT活性相对较低，但是可复制的，总是在背景水平以上(见图3A)。A1、A2和A3部分显示了三个独立拯救实验的结果；A1部分，泳道1显示不用体外转录的pMUVCAT RNA转染已经感染MUV的细胞所产生的CAT活性，泳道2显示以pMUVCAT体外转录的RNA转染已经感染MUV的细胞，所产生的CAT活性；泳道3显示从pMUVCAT-GG体外转录的RNA转染已经感染MUV的细胞所产生的CAT活性。A1部分中所示的各CAT实验用106转染细胞的20％抽提物在37℃进行3-4小时。A2部分，泳道1显示用pMUVCAT体外转录的RNA转染感染MUV的细胞；泳道2显示用pMUVCAT体外转录的RNA转染非感染细胞。A2部分的各CAT试验用106转染细胞的50％抽提物在37℃进行5小时。A3部分，泳道1显示用pMUVCAT体外转录的RNA转染感染MUV的细胞；泳道2显示不用pMUVCAT体外转录的RNA转染的，已经感染MUV的细胞；泳道3显示用从pMUVCAT体外转录的RNA转染的非感染的细胞。A3部分的各CAT试验用106转染细胞的50％抽提物在37℃进行4小时。
不能从含有存在于T7 RNA聚合酶启动子中的3个额外G残基的2个的MUVCAT构建物(pMUVCAT-GG)拯救CAT活性。然而，存在于相同MUVCAT构建物的MUV尾随区中的两个突变阻止了本观察中最后的翻译。这些实验的结果表明MUV基因组的nt1-145和nt15223-15384含有基因组包装、转录和可能复制的必需序列。现已明确了在表达MUV的辅助蛋白存在的前提下能拯救CAT活性的小复制子序列，故设计了第二系统进行从转染的DNA(包括pMUVCAT、pMUVNP、pMUVP和pMUVL)中拯救CAT活性。在293，Hep2和A549细胞中，MUV NP、P和L蛋白质以及MUVCAT小复制子RNA转录物在，MVA-T7诱导的T7 RNA聚合酶控制下共同表达。在293细胞中进行的最初实验表明CAT拯救是充分和可再现的。相对于293细胞来说，在Hep2细胞中，CAT拯救效力得从提高，并进行了一系列的质粒滴定，以优化各质粒在转染混合物中的相对量。相对于Hep2细胞来说，在A549细胞中拯救效率进一步的提高，在3小时CAT试验中，6孔盘单孔中的20％A549细胞裂解液底物几乎100％转化(图3B)。这些结果证明pMUVNP、pMUVP和pMUVL表达的MUV辅助蛋白质足够启动MUVCAT反义RNA小基因组的包装、复制和转录。另外，观察到的CAT拯救最佳条件提供了完全从cDNA拯救感染性MUV的起始位点。
实施例3
从转染细胞回收全长腮腺炎病毒。装配全长MUV cDNA，在T7 RNA聚合酶启动子控制下，合成病毒基因组确切15，384nt有义RNA拷贝。和MUVCAT小复制子一起，修饰T7 RNA聚合酶启动子序列，去除末端3个G残基，以提供从确切MUV末端核苷酸开始的转录起始位点。用HDV核酶产生有义基因组转录物的确切MUV 3’末端核苷酸。
为了从cDNA回收MUV，用表达T7 RNA聚合酶的MVA-T7感染A549细胞，然后用pMUVFL和表达MUV NP、P和L的质粒进行转染。从MUVCAT小复制子拯救报道基因活性的结果和针对相关的风疹病毒SV5(He等，1997；Murphy和Parks，1997)所作的类似工作的结果，表明MUV NP、P和L蛋白质对于包装、复制然后转录T7 RNA聚合酶产生有义的基因组RNA转录物是足够的，条件是存在可操纵水平和比例的相互作用的成分。选择A549细胞用于MUV拯救实验，因为它们支持MUV复制，比其它测试细胞系对CAT拯救活性更有效(可能通过更有效的转染)，它们还对MVA-T7诱导的细胞病变的抗性更强。在第一个成功的拯救实验中，将来自转染细胞的上清液(未澄清)转染新鲜的A549指示细胞。用全细胞ELISA在5个指示细胞孔之一观察到3个感染集落(图4)。将这些细胞上清液移到新鲜Vero细胞单层上后，在显微镜下观察到3个合胞体。将这些合胞体之一作为液态噬斑挑出，吹入培养液，用于感染新鲜Vero细胞；在该细胞单层上观察到许多合胞体(图5)，抽提全部感染细胞的RNA用于鉴定拯救病毒。在第二个拯救实验中，从转染细胞各孔获得至少10-20个感染集落，如用全细胞ELISA(图5)染色的指示细胞所见。在该实验除了转染混合物省去pMUVL的以外，其余均含有拯救病毒，表明拯救过程的重复性很高。目前测定的从cDNA拯救MUV的各质粒的最佳水平是300纳克pMUVNP、50纳克pMUVP、200纳克pMUVL和3-7微克pMUVFL。
实施例4
拯救MUV的鉴定。重要的是，证明rMUV衍生自pMUVFL。这可能通过在全长基因组cDNA装配期间RT/PCR错误掺入，在pMUVFL中引入三个核苷酸尾而造成。这些尾使得pMUVFL与Jeryl Lynn疫苗病毒和衍生出pMUVFL的Jeryl Lynn疫苗制备物的传代的噬斑分离物的共有序列不同。两个尾分别代表F和L基因中核苷酸6081和11731的沉默改变；第三个尾导致pMUVFL的L蛋白质(对应于核苷酸8502)第22个氨基酸Lys被Arg取代。为了显示rMUV来自于pMUVFL，而不是来自其它两个实验室培养的MUV群，在相对位置对用rMUV感染的细胞RNA制备的RT/PCR产物(跨越三个核苷酸尾中每一个)进行测序。为了证明这些RT/PCR产物仅衍生自感染的细胞RNA，而不是衍生自痕量感染性质粒DNA的带出物，用rMUV感染细胞的RNA作为PCR扩增的模板，而不预先反转录，进行反应。图6显示了RT/PCR扩增的结果和RT/PCR产物随后的测序分析。从来自转染细胞的P2 rMUV病毒感染Vero细胞单层制备总RNA。建立RT/PCR反应，生成跨越仅存在于pMUVFL和rMUV中3个独立核苷酸尾位点的cDNA产物。泳道1显示1kb标记梯(Gibco/BRL)；泳道2、3和4分别显示跨越核苷酸尾位置6081、8502和11731的RT/PCR产物。为了证明这些RT/PCR产物不是衍生自污染的质粒DNA，不用RT进行了泳道4所示的用于产生cDNA的相同反应：泳道5显示了该反应的产物。为了证明当从转染混合物中省去pMUVL时，不能回收rMUV，用从不用pMUVL进行转染衍生的Vero细胞RNA建立了与用于产生泳道4所示的cDNA产物的RT/PCR反应相同的反应；泳道6显示了该反应的产物。
图6所示的RT/PCR产物产生的共有序列数据清楚的证明，拯救的MUV含有仅存在于MUV全长基因组cDNA中的相同核苷酸尾(图7)。见图8的表1，列出了全长cDNA克隆与噬斑分离物4(PI4)，以及Jeryl Lynn病毒株的共有序列(SEQ ID NO.1)之间的核苷酸和氨基酸差异。
就上述实施例而言，总结出，从病毒基因组的DNA拷贝产生了感染性腮腺炎病毒。该方法需要共转染MVA-T7-感染的A549细胞和编码MUV NP、P和L蛋白质的质粒以及含有腮腺炎病毒全基因组的质粒。该方法的成功与全长腮腺炎病毒基因组(Jeryl Lynn株)共有序列的开发，以及腮腺炎病毒小复制子拯救系统的新发展密不可分。
注意：全长构建物中L蛋白质第22个氨基酸Lys被Arg取代不破坏拯救的腮腺炎病毒的获得。
实施例5
作为一个或多个异源基因的表达载体的腮腺炎病毒下列实验建立了作为表达载体的腮腺炎病毒。回收表达一种或多种报道基因的感染性重组腮腺炎病毒证明了该实施例。
构建含有β-半乳糖苷酶基因、萤火虫荧光素酶基因或萤火虫荧光素酶基因和CAT基因的重组腮腺炎病毒。为了在腮腺炎病毒基因组中插入异源基因或外源遗传信息，在全长基因组cDNA中用定点诱变产生了唯一的AscI限制性内切酶位点。AscI位点位于M基因的5’非编码区(基因组核苷酸4451-4458)，这样其它含有腮腺炎病毒的合适侧接调控序列和末端AscI位点的异源基因可以整合到病毒M和F基因之间的腮腺炎病毒基因组中，产生能表达外源基因的新感染性腮腺炎病毒重组株。构建了含有β-半乳糖苷酶基因或萤火虫荧光素酶基因的腮腺炎病毒重组株(图11)。还构建了含有邻接荧光素酶翻译起始密码子的EMC病毒CITE的另一种重组腮腺炎病毒，用于与利用正常腮腺炎病毒顺式激活调控元件起始翻译的含有荧光素酶的重组株产生的蛋白(荧光素酶)水平比较。
用与荧光素酶基因的ATG和UAA邻接的腮腺炎病毒特定序列(分别是基因组核苷酸4459-4538和4392-4449)两轮嵌套PCR插入腮腺炎病毒基因组，制备萤火虫荧光素酶基因。在该方法中，从PCR产生的DNA片段中除去基因组核苷酸4450，在最终含荧光素酶的重组基因组中维持“6个原则”；在相同的DNA片段中，还用7个通常在荧光素酶ATG上游发现的核苷酸替换基因组核苷酸4539-4545。存在于最终PCR产物中的末端AscI位点促使加入荧光素酶基因和侧接腮腺炎病毒的特异性序列进入腮腺炎病毒基因组。类似的，构建了含有β-半乳糖苷酶基因的分离的腮腺炎病毒重组株。掺入β-半乳糖苷酶基因和侧接腮腺炎病毒特异序列的PCR产生的DNA片段含有基因组核苷酸4450的相同缺失，与含荧光素酶的DNA片段相同。然而，在邻接β-半乳糖苷酶基因正常TAA翻译终止密码子处掺入了第二个TAA三核苷酸，以在最终重组腮腺炎病毒基因组中维持“6个原则”。另外，与含荧光素酶的构建物不同，侧接β-半乳糖苷酶ATG的7个上游核苷酸(基因组核苷酸4539-4545)是腮腺炎病毒特异性的。还构建了含有与荧光素酶基因的ATG邻接的含有EMC病毒CITE的第三个腮腺炎病毒重组株。对于仅含荧光素酶基因的重组株，用嵌套PCR反应分别在CITE和荧光素酶基因的5’末端和3’末端加入腮腺炎病毒特异性序列。在三方向连接中，CITE的3’末端和荧光素酶基因的5’末端在NcoI限制性内切酶位点连接，加入到腮腺炎病毒基因组的AscI位点。去除基因组核苷酸4450，在PCR期间在CITE的5’末端加入三核苷酸ACT，以在得到的重组腮腺炎病毒中维持“6个原则”。
构建了含有各作为两个单独的转录单位，或作为一个含有用于翻译多顺反子第二个基因(荧光素酶)的内部核糖体进入位点的转录单位的CAT基因和荧光素酶基因，构建腮腺炎病毒重组株(见图12)。用嵌套PCR产生两个DNA片段，1个含有CAT基因，另一个含有荧光素酶基因，各侧接合适的腮腺炎病毒特异性基因间cDNA序列。连接这两个片段，然后通过之前用于插入一个报告基因的AscI位点连接入腮腺炎病毒基因组cDNA。类似的，用嵌套PCR分别产生含有CAT基因和与荧光素酶基因汇合的EMC CITE的DNA片段，各侧接合适的腮腺炎病毒特异性基因间cDNA序列。连接两个DNA片段，并连接入腮腺炎病毒基因组的cDNA的AscI位点。两个基因组构建物中的报道基因顺序是5’CAT-LUC3’和5’CAT CITE LUC3’。
腮腺炎病毒重组株的拯救。如实施例3中所述，将含有重组腮腺炎病毒基因组的质粒和表达腮腺炎病毒NP、P和L蛋白质的支持质粒转染入MVA-T7-感染的A549细胞，首先在新鲜的A549细胞中扩增来自于转染细胞的全部拯救病毒(步骤1)，随后在Vero细胞进行操作，再分析拯救病毒的报道基因活性(步骤3)。
报道基因活性的试验。在用腮腺炎病毒重组株感染的细胞抽提物中，或通过感染细胞单层的细胞染色测定报道基因活性。用光度计(Analytical LuminesceLaboratory，Monolight 2010)测试被含有荧光素酶基因或与EMC病毒CITE融合的荧光素酶基因的腮腺炎病毒重组株感染的细胞抽提物的荧光酶活性。根据Enhanced Luciferase Assay Kit(Pharmingen，San Diego，CA)的厂商方案进行细胞抽提物的制备和荧光素酶试验。根据β-gal染色试剂盒(Promega，Madison，Wisc.)的方案测试用含有β-半乳糖苷酶基因的腮腺炎病毒重组株感染的细胞抽提物。在感染细胞的冻融裂解液上，如上述实施例中所述进行CAT活性的测定。
通过腮腺炎病毒表达萤火虫荧光素酶。在被拯救的病毒感染的细胞抽提物中检测到强荧光素酶活性。对于每一种情况，拯救病毒衍生自重组腮腺炎病毒基因组cDNA，它含有单独的萤火虫荧光素酶基因或串联的CAT基因和荧光素酶基因。见图14，它是一张薄层层析图，显示存在于Vero细胞抽提物中的CAT活性，这些细胞被含有CAT和荧光素酶基因的rMUV感染。在CAT试验前，从全部拯救毒中纯化含有作为一个转录单元的CAT和荧光素酶基因的重组病毒(rMUVC/C/L)。作为未噬斑纯化的总组分析作为一个转录单元的CAT和荧光素酶基因的拯救的重组病毒(rMUV/C/L)。如图14表明的，对于rMUVC/C/L和rMUVC/L病毒重组株，还测量了Vero细胞抽提物中荧光素酶活性。
另外，下文表5显示含有荧光素酶基因(rMUV LUC和rMUV CITE-LUC)的腮腺炎病毒重组株克隆群的相对光度单位(RLU)读数，这是从拯救病毒群中通过三个连续的噬斑纯化循环分离得出的。如表5所示，通过腮腺炎病毒重组株荧光素酶活性的强表达，清楚证明腮腺炎病毒能表达一种或多种来自重组基因组的异源基因。
表5由rMUVLUC和rMUVCITE-LUC产生的荧光素酶定量
| 病毒 | RLU* | LUC(皮克) | 总LUC(纳克) | LUC/细胞(飞克) |
| rMUVLUC-2 | 2.9×105 | 8.7pg | 300ng | 150fg |
| rMUVLUC-3 | 1.3×105 | 7.9pg | 170ng | 85fg |
| rMUVLUC-4 | 2.0×105 | 8.3pg | 400ng | 200fg |
| rMUVCITE-LUC-1 | 0.9×105 | 6.7pg | 190ng | 95fg |
| rMUVCITE-LUC-2 | O.2×105 | 3.2pg | 180ng | 90fg |
| rMUVCITE-LUC-4 | 1.1×105 | 7.7pg | 190ng | 95fg |
| RMUV | 0 | 0 | 0 | 0 |
*两个单层感染的平均数标准化至104输入噬斑形成单位。
通过腮腺炎病毒表达β-半乳糖苷酶。鉴定了含有β-半乳糖苷酶的拯救腮腺炎病毒。拯救病毒衍生自含有β-半乳糖苷酶基因的重组腮腺炎病毒基因组cDNA。在感染重组腮腺炎病毒，然后直接细胞染色的细胞中，β-半乳糖苷酶活性是明显的。仅在被含有β-半乳糖苷酶基因的重组腮腺炎病毒感染的细胞中存在代表β-半乳糖苷酶活性的强蓝染色。在同一染色试验中，不含任何其它异源基因的拯救腮腺炎病毒产生清晰的噬斑(见图15)。重组腮腺炎病毒对β-半乳糖苷酶活性的表达还证明腮腺炎病毒在腮腺炎病毒转录启动子控制下表达相对大的异源基因的能力。
实施例6
JL5和JL2共有序列的确定
已显示腮腺炎病毒Jeryl Lynn疫苗株由两种变体JL5和JL2构成(Afzal等，1993)。称为JL5和JL2的这两种变体显示在疫苗制备物中以约1 JL2：5JL5的比存在。由于这些变体在靠近SH和HN基因的基因组中具有序列差异，用该差异通过分离各纯的组并对其全部基因组进行测序，可辨别基因水平上的变体。
从腮腺炎病毒Jeryl Lynn株分离JL5和JL2变体。
直接在鸡胚成纤维细胞(CEF)上传一代培养腮腺炎病毒Jeryl Lynn株。然后以10倍递增系列稀释该病毒原种，用于在6孔板(Becton Dickinson，FranklinLakes，NJ)上感染融合的CEF。室温振摇细胞1.5小时感染细胞。然后用琼脂糖覆盖物(含0.9％琼脂糖[Seaplaque，FMC Bioproducts，Rockland，ME]，极限必需培养基[MEM]，0.2mM非必需氨基酸，0.2毫克/毫升青霉素/链霉素，2％胎牛血清，和0.3375％碳酸氢钠)替换各孔中的接种物。覆盖物在室温下固化后，37℃培育感染细胞6-8天，直到肉眼和光学显微镜可见噬斑。
用无菌巴斯德滴管(VWR Scientific，New York，NY)分离各噬斑，除去各噬斑上的琼脂糖插入物。将分离的噬斑置于1毫升培养液(含有2％FBS、20mM HEPES和0.1毫克/毫升青霉素/链霉素的MEM)中混匀，用于进行第二轮的噬斑纯化物感染。在随后的步骤中，用10、50、75、100或200微升各稀释的噬斑在6孔板上感染新鲜细胞。如上进行感染、覆盖和噬斑分离。在第二轮噬斑分离病毒后，该过程重复第三次。
置于6孔板中的CEF在37℃增殖从第三轮噬斑分离的病毒4-6天，制备原种。然后在T-25烧瓶中繁殖CEF，扩增病毒。5-7天后，当感染的细胞显示最大细胞病变时，收集病毒并在-80℃冻存。
分离的变体的RT-PCR和测序。
如上在实施例1.A的“病毒RNA分离、扩增和测序”部分所述，进行RNA分离和RT-PCR。用下列基因特异性引物扩增SH和HN基因部分：6223TGAATCTCCTAGGGTCGTAACGTC6246(SEQ ID NO 27)和8969ACCCACTCCACTCATTGTTGAACC8946(SEQ ID NO 69)。在1％琼脂糖上凝胶纯化，并在凝胶切片上用WizardPCR纯化试剂盒(Promega，Madison，WI)分离扩增的产物。然后在SH基因区中对扩增产物进行测序，[用引物6223TGAATCTCCTAGGGTCGTAACGTC6246(SEQ ID NO 27.6783GGATGATCAATGATCAAGGC6802(SEQ ID NO 30)，7325CATCACTGAGATATTGGATC7306(SEQID NO 74)，6909GATACCGTTACTCCGTGAAT6980(SEQ ID NO 75)]鉴定它们是JL5或JL2。
在SH基因区中进行一级序列分析，确定纯化的病毒是JL5还是JL2。起初所有的三噬斑纯化的病毒符合JL5。为了获得JL2分离物，用RT-PCR和SH基因区测序筛选噬斑纯化一次并冻存的病毒是JL2还是JL5。用该方法鉴定出两个含有JL2噬斑的分离物，对其进行两次额外的连续噬斑纯化循环。如上，在CEF中两次扩增这些分离物，进行RNA抽提，扩增和测序。
在确定各噬斑分离物是JL5还是JL2后，选择各变体的两个独立分离物对全基因组进行测序。在分离的RNA上用下列引物对进行RT-PCR，扩增跨越全基因组的片段：
1ACCAAGGGGAGAATGAATATGGG23(SEQ ID NO 95)和2507TGAGGCTCCATTCCCGTCTATG2486(SEQ ID NO 86)，2107CGTTGCACCAGTACTCATTG2126(SEQ ID NO 17)和3875CTGAACTGCTCTTACTAATCTGGAC3851(SEQ ID NO 82)，3773CTGTGTTACATTCTTATCTGTGACAG3798(SEQ ID NO 21)和6347CAGACATACAGGGTTATGATGAG6325(SEQ ID NO 76)，6223TGAATCTCCTAGGGTCGTAACGTC6246(SEQ ID NO 27)和8969ACCCACTCCACTCATTGTTGAACC8946(SEQ ID NO 69)，7678AGAGTTAGATCAGCGTGCTTTGAG7701(SEQ ID NO 32)和9753TCATGCCGCATCTCAATGAG9734(SEQ ID NO 67)，9583CCGAGAGTCCATGTGTGCTC9602(SEQ ID NO 37)和11685CCTTGGATCTGTTTTCTTCTACCG11662(SEQ ID NO 62)，11529GTGTTAATCCCATGCTCCGTGGAG11552(SEQ ID NO 42)和13412CATATTCGACAGTTTGGAGT13393(SEQ ID NO 58)，13219CGATTATGAGATAGTTGTTC13238(SEQ ID NO 46)和15384ACCAAGGGGAGAAAGTAAAATC15363(SEQ ID NO 53)。如实施例1.A的“病毒RNA分离、扩增和测序”部分所述，对扩增的产物进行纯化和测序。为了确定各病毒分离物的基因组末端的序列，连接RNA末端，然后以RT-PCR跨越接头，进行测序(如实施例1.A所述)。
用Sequencher软件(Genecodes，Ann Arbor，MI)排列序列。JL5和JL2序列代表各变体的两个测序过的噬斑分离物比较确定的共有序列。用实施例1.A的表4列出相同系列引物对纯化的JL5和JL2病毒进行测序。对于两种变体，完整测序两个独立的噬斑分离物(见SEQ ID NO.11和12)，以获得各2个变体噬斑的JL5和JL2的共有序列。如预期的，在两个JL5噬斑分离物(见表6)和两个JL2噬斑分离物(见表7)中观察到几个序列差异。JL5噬斑1和噬斑2的共有序列与Jeryl Lynn共有序列分别有4和3个核苷酸的差异(见表6)。
JL2序列含有413个与JL5的差异，散布在整个基因组中，如表8总结的。这些差异中5个存在于病毒5’或3’前导序列中。总的360个序列差异位于病毒基因的编码区内；然而这些差异中仅有73个编码氨基酸差异。剩下的48个序列差异位于病毒基因的非编码区域内。令人感兴趣的是基因间隔区或内部顺式激活信号(即基因起始或基因终止信号)的序列间没有差异。
表6 JL5的噬斑分离物之间的序列差异
| 位置 | Jeryl Lynn共有 | JL5噬斑1 | JL5噬斑2 | 氨基酸 | 基因/AA位置 |
| 1405 | G | A | A | pro(沉默) | N/420 |
| 1685 | T | C | C | tyr(T)或his(C) | N/514 |
| 1703 | T | A | T | ser(T)或thr(A) | N/520 |
| 9619 | T | C | C | phe(沉默) | L/394 |
表7 JL2噬斑分离物之间的序列差异
| 位置 | Jeryl Lynn共有 | JL2噬斑1 | JL2噬斑2 | 氨基酸 | 基因/AA位置 |
| 4 | A | C | A | gln(A)或his(C) | M/30 |
| 3352 | T | T | C | val(T)或ala(C) | M/82 |
| 3517 | T | T | C | val(T)或ala(C) | M/85 |
| 13467 | A | G | A | lys(A)或arg(G) | L/1677 |
表8 JL5和JL2变体之间序列差异总结
na＝不可得
| 基因 | JL5和JL2之间的差异 | |||
| 非编码区3’末端 5’末端 | 编码 | 沉默 | ||
| 前导 | 4 | - | Na | na |
| NP | 3 | 9 | 8 | 30 |
| P | 2 | 2 | 14 | 22 |
| M | 2 | 1 | 5 | 17 |
| F | 2 | 6 | 12 | 33 |
| SH | 1 | 6 | 5 | 5 |
| HN | 4 | 3 | 16 | 35 |
| L | 0 | 7 | 13 | 145 |
| 尾随 | - | 1 | Na | na |
| 总数： | 18 | 35 | 73 | 287 |
实施例7
JL5和JL2在Jeryl Lynn疫苗中相对丰度的测定
为了测定一批Jeryl Lynn疫苗中JL5和JL2之比，使用两种变体之间限制性内切酶多形性的序列差异开发了一种试验。该试验称为PCR突变分析和限制性内切酶切割(MAPREC)。在JL5基因组的3828位(反基因组)有一个BssH II限制性内切酶识别位点。在JL2中，该位点的G到A核苷酸变体导致BssH II识别的缺乏。从混合的JL5和JL2群中分离RNA，用该位点周围的引物扩增，得到254个碱基对的产物。使用的引物是引物
3708CAGGCCAGCGCCGATAAATATG3729(SEQ ID NO 117)和3962AATGACACCCTTCTCCATCAGGG3941(SEQ ID NO 118)。引物含有JL5和JL2的相同序列；因此预期可以相同的可能性扩增各变体的片段。另外，上面列出的第一种引物在其5’末端含有荧光素。用BssHII切割该荧光素化片段，在丙烯酰胺凝胶上分离。用FluorImager扫描凝胶，定量切割和未切割产物(分别代表JL5和JL2)的相对丰度，。用BssH II切割留下JL5的120个碱基对的荧光产物和JL2的254碱基(即未切割)的荧光产物。
从腮腺炎病毒Jeryl Lynn(Mumpsvax批号0656J，Merck and Co.，Inc.，WestPoint，PA)株从10个疫苗试管中分离RNA，用上述引物对扩增RNA，用BssH II消化PCR产物，在凝胶上分离，用FluorImager扫描。加入5个单位的BssH II(RocheMolecular Biology，Indianapolis，IN)对1/5的PCR反应混合物进行酶消化，50℃培育2.5小时。然后在6％丙烯酰胺凝胶上分离切割的产物，然后用FluorImager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)扫描。
用ImageQuant软件(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)定量扫描影像。用一系列对照作为标准；这些样品含有以下列滴度比混合的纯JL5和JL2混合物：99％JL5/1％JL2、95％JL5/5％JL2、85％JL5/15％JL2和75％JL5/25％JL2。从混合病毒中分离RNA，用于MAPREC方法。用这些对照获得的结果产生试验的标准曲线，用于确定JL5和JL2在疫苗混合物中的相对百分数。另外，用一系列2倍稀释的未消化JL5 PCR产物确定在FluorImager上测定的线性范围。另外，用纯JL2病毒RNA作为阴性对照，用纯JL5病毒RNA作为阳性对照。纯JL5样品还作为确定BssH II酶效力的对照。为了重现性，重复MAPREC试验和定量三次。结果取三次试验的平均值作为结果。图13为有代表性的扫描凝胶影像。用箭头标出切割和未切割的产物。对应JL2的未切割产物长254个碱基对，而对应JL5的切割产物长120个碱基对。为了定量各扫描凝胶的相对丰度，首先校正背景荧光和纯JL5对照样品中未消化DNA量的值。用消化的DNA量除以消化和未消化DNA的总量，乘以100％确定％JL5值。对于各实验，用来自一组混合的JL5和JL2病毒的RNA产生标准曲线。在标准曲线上定出所述疫苗样品计算结果的点，获得表9所述的值。在最后一栏中，提供了三次实验各疫苗样品的平均值。表底部显示了10个疫苗样品通过平均最后一栏的结果所获得的总平均值。
表9总结了该试验中使用的10个Mumpsvax的疫苗小指管的结果。这些样品中两种变体的相对丰度的范围是73.1％JL5/26.9％JL2-76.1％JL5/23.9％JL2。全部10个疫苗样品三次实验的总平均值是73.9％JL5/26.1％JL2。
表9 Mumpsvax样品中JL5和JL2的相对丰度
| Mumpsvax样品 | 实验1(％JL5/％JL2) | 实验2(％JL5/％JL2) | 实验3(％JL5/％JL2) | 平均(％JL5/％JL2) |
| 1 | 73.7/26.3 | 72.5/27.5 | 74.5/25.5 | 73.6/26.4 |
| 2 | 74.1/25.9 | 72.0/28.0 | 73.3/26.7 | 73.1/26.9 |
| 3 | 73.0/27.0 | 76.8/23.2 | 73.3/26.7 | 74.4/25.6 |
| 4 | 73.9/26.1 | 75.1/24.9 | 71.2/28.8 | 73.4/26.6 |
| 5 | 74.6/25.4 | 73.9/26.1 | 70.9/29.1 | 73.1/26.9 |
| 6 | 76.0/24.0 | 76.3/23.7 | 69.8/30.3 | 74.0/26.0 |
| 7 | 77.2/22.8 | 75.9/24.1 | 70.4/29.6 | 74.5/25.5 |
| 8 | 76.2/23.8 | 74.8/25.2 | 68.7/31.3 | 73.2/26.8 |
| 9 | 79.1/20.9 | 72.1/27.9 | 77.0/23.0 | 76.1/23.9 |
| 10 | 78.8/21.2 | 73.0/27.0 | 69.7/30.3 | 73.8/26.2 |
| 总平均： | 73.9/26.1 | |||
下文提供了本文应用的参考文献表。
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Claims (44)
1.一种产生重组腮腺炎病毒的方法，其特征在于，该方法包括：
在培养基内的至少一个宿主细胞中，进行一种拯救组合物的转染或转化，该组合物含有(i)转录载体，所述载体含有分离的核酸分子，所述分离的核酸分子是编码腮腺炎病毒基因组或反基因组的多核苷酸序列，或其变体的多核苷酸序列，和(ii)至少一种表达载体，所述表达载体含有另一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子是编码包装、转录和复制必需的反式激活蛋白NP、P和L的多核苷酸序列；所述转染或转化在足够使所述载体共表达和重组病毒产生的条件下进行。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括收集重组病毒。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码腮腺炎病毒基因组或反基因组的分离的核酸分子是一种以上基因组或反基因组来源的嵌合体。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码腮腺炎病毒基因组或反基因组的分离的核酸分子是选自SEQ ID N0.1、11和12的多核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码腮腺炎病毒基因组或反基因组的分离的核酸分子编码减毒病毒或一种病毒的感染形式。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码腮腺炎病毒基因组或反基因组的分离的核酸分子编码病毒的感染形式。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码腮腺炎病毒基因组或反基因组的分离的核酸分子编码减毒病毒。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码腮腺炎病毒基因组或反基因组的分离的核酸分子编码感染性的减毒病毒。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是真核细胞。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是脊椎动物细胞。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是鸟类细胞。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞衍生自人细胞。
13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞衍生自人胚胎细胞。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞衍生自人胚肾细胞。
15.用权利要求1所述的方法制备的重组腮腺炎病毒。
16.一种组合物，其特征在于，该组合物含有：(i)用权利要求1所述的方法制备的重组腮腺炎病毒，和(ii)药物学上可接受的载体。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转录载体还含有T7 RNA聚合酶基因。
18.一种免疫原性组合物，其特征在于，该组合物含有分离的重组产生的减毒腮腺炎病毒和生理学上可接受的载体。
19.一种免疫接种个体，诱导针对腮腺炎病毒的保护的方法，其特征在于，该方法包括施给个体权利要求18所述的免疫原性组合物。
20.一种核酸分子，其特征在于，该核酸分子是编码腮腺炎病毒基因组或反基因组的多核苷酸序列。
21.如权利要求20所述的核酸分子，其特征在于，该核酸分子是正链、反基因组信使有义的腮腺炎病毒序列，选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
22.一种核酸分子，其特征在于，该核酸分子是编码一种或多种腮腺炎病毒蛋白质的多核苷酸序列。
23.如权利要求20所述的核酸分子，其特征在于，所述多核苷酸序列还含有一种或多种异源核苷酸序列或一种或多种异源基因。
24.如权利要求22所述的核酸分子，其特征在于，所述多核苷酸序列还含有一种或多种异源核苷酸序列或一种或多种异源基因。
25.一种质粒，其特征在于，该质粒含有编码腮腺炎病毒基因组或反基因组的多核苷酸。
26.一种质粒，其特征在于，该质粒含有编码一种或多种腮腺炎病毒蛋白质的多核苷酸序列。
27.如权利要求25所述的质粒，其特征在于，所述多核苷酸序列还含有一种或多种异源核苷酸序列或一种或多种异源基因。
28.如权利要求26所述的质粒，其特征在于，所述多核苷酸序列还含有一种或多种异源核苷酸序列或一种或多种异源基因。
29.用权利要求25所述的至少一个质粒转化的宿主细胞。
30.用权利要求26所述的至少一个质粒转化的宿主细胞。
31.用权利要求27所述的至少一个质粒转化的宿主细胞。
32.如权利要求18所述的免疫原性组合物，其特征在于，该组合物还含有至少一种除了腮腺炎病毒以外的病原体的抗原。
33.如权利要求32所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述至少一种抗原是减毒RNA病毒。
34.如权利要求33所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述至少一种抗原是减毒病毒，选自麻疹病毒、风疹病毒、水痘带状疱疹病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒。
35.如权利要求32所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述至少一种抗原是重组产生的。
36.如权利要求32所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述至少一种抗原是重组产生的。
37.如权利要求32所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述除了腮腺炎病毒以外的病原体的至少一种抗原是由重组产生的减毒腮腺炎病毒表达的。
38.如权利要求32所述的免疫原性组合物，其特征在于，除了腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、水痘带状疱疹病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒外的病原体的所述至少一种抗原是由重组产生的减毒腮腺炎病毒表达的。
39.如权利要求27所述的质粒，其特征在于，所述异源核苷酸序列作为一个翻译单元插入腮腺炎病毒基因组序列。
40.如权利要求39所述的质粒，其特征在于，所述异源核苷酸序列作为一个或多个单顺反子翻译单元插入腮腺炎病毒基因组序列。
41.如权利要求39所述的质粒，其特征在于，所述异源核苷酸序列作为至少一个多顺反子翻译单元插入腮腺炎病毒基因组序列，所述多顺反子单元可含有一个或多个核糖体进入位点。
42.如权利要求41所述的质粒，其特征在于，所述异源核苷酸序列编码一个多蛋白和足够数量的蛋白酶，所述蛋白酶切割所述多蛋白产生单条多肽。
43.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求27所述的宿主细胞产生的重组减毒腮腺炎病毒，和生理学上可接受的载体。
44.一种核苷酸序列，其特征在于，该序列含有重组腮腺炎病毒cDNA克隆的序列。
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