CN116904403A - 一种腮腺炎病毒突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒技术领域，具体涉及一种腮腺炎病毒突变体及其应用。本发明提供一种腮腺炎病毒突变体，所述腮腺炎病毒突变体的基因组序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.1所示序列的完全互补序列所示。该腮腺炎病毒突变体具有较高的遗传稳定性，能够在病毒传代过程中保持稳定遗传。此外，该腮腺炎病毒突变体的病毒滴度高，且质量可控，具有较高的免疫原性，制得疫苗具有较高的安全性，具有较好的应用前景。

Description

一种腮腺炎病毒突变体及其应用

技术领域

本发明涉及病毒技术领域，尤其涉及一种腮腺炎病毒突变体及其应用。

背景技术

腮腺炎病毒（Mumps Virus，MuV）属于副粘病毒科、副粘病毒属病毒，呈球形，核衣壳呈螺旋对称，有包膜。病毒直径约为100~600nm，基因组为单负链RNA，全基因组由15384个核苷酸组成，RNA的排列顺序为：3’NP-V/P/I-M-F-SH-HN-L5’，编码7个蛋白：核蛋白（nucleoprotein，NP）、磷蛋白（phosphoprotein，P）、基质蛋白（matrix protein，M）、融合蛋白（fusion protein，F）、小疏水蛋白（membrane small hydrophobic protein，SH）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（hemagglutinin/neuraminidase surface proteins，HN）和大蛋白（large protein，L）。

目前，全球使用的所有含腮腺炎病毒的疫苗均为减毒活疫苗，使用的主要疫苗株包括：Jeryl Lynn或Jeryl Lynn-derived株、Urabe AM9株、Leningrad-Zagreb、Leningrad-3等，但使用最为广泛的疫苗株是Jeryl Lynn株或Jeryl Lynn-derived株。

Jeryl Lynn流行性腮腺炎活疫苗（MVL）毒株由默克公司于1966年开发，自19世纪70年代初以来已在美国和其他国家广泛使用。测序表明，该疫苗含有两种核苷酸序列截然不同的亚株的混合物。相关研究已经确定了两种亚株的完整基因组序列，并确定了414个核苷酸差异（2.69%），导致87个氨基酸取代（1.67%）（Amexis G, Rubin S, Chizhikov V, etal. Sequence diversity of Jeryl Lynn strain of mumps virus: quantitativemutant analysis for vaccine quality control.[J].Virology, 2002, 300( 2):171-179.）。通过监测它们在不同条件下繁殖的病毒群体中的动力学，发现在Vero或CEF细胞培养物中传代Jeryl Lynn毒株导致主要成分JL1的快速选择，而在胚胎鸡蛋中（ECE）生长则有利于次要成分JL2的积累。为了确保疫苗的一致性，必需对Jeryl Lynn疫苗的亚毒株组成进行质控。

现阶段中国使用的腮腺炎疫苗以S79株病毒为主，为19世纪60年代末采用JerylLynn株腮腺炎减毒活疫苗在原代鸡胚细胞上传代扩增获得。研究显示，以SH序列作为亚株分型标准，S79主要有2个亚型，即与主要亚株JL-5对应的S79major，与次要亚株JL-2对应的S79minor，经蚀斑纯化证明S79major与S79minor的比例为2:5。然而，随着传代，该比例无法维持平衡，且无法保证该比例在任意一批疫苗中的一致性。

为了解决这一问题，葛兰素史克公司通过鸡胚胎成纤维细胞（CEFs）培养物获得单个Jeryl Lynn克隆体（即RIT4385毒株）用于麻腮风减毒活联合疫苗（MMR）的制备。然而Connaughton, Sarah M等的研究发现，即使JL-5成分在鸡胚成纤维细胞中传代产生的RIT4385单克隆株疫苗，也发现了三个突变（V529A，L542L和L557P突变频率分别为6.2%，16.6%或21.3%）（Connaughton, S. M., Wheeler, J. X., Vitková, E., Minor, P.,&Schepelmann, S. (2015). In vitro and in vivo growth alter the populationdynamic and properties of a Jeryl Lynn mumps vaccine.Vaccine,33(36),4586-4593.）。由此可见，MuV具有较高的遗传不稳定性。病毒传播过程中的遗传漂变有可能改变疫苗的效力或安全性。因此亟待开发MuV传代过程毒力不增强或过度减毒，遗传漂变小的稳定腮腺炎病毒突变体。

发明内容

本发明提供一种腮腺炎病毒突变体及其应用。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种腮腺炎病毒突变体，所述腮腺炎病毒突变体的基因组序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.1所示序列的完全互补序列所示。

本发明通过大量实验偶然发现了具有上述基因组序列的腮腺炎病毒突变体具有较高的遗传稳定性，能够在传代过程中保持稳定遗传，保持较高的病毒滴度，且具有较高的免疫原性和安全性。

本发明所述的腮腺炎病毒突变体命名为腮腺炎病毒MuV-365-W株。

本发明提供一种腮腺炎病毒突变体，其已于2019年09月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为腮腺炎病毒，保藏编号为CGMCCNo.18504。

保藏编号为CGMCC No.18504的腮腺炎病毒突变体具有较高的遗传稳定性，能够在传代过程中保持稳定遗传，保持较高的病毒滴度，且具有较高的免疫原性和安全性。

第二方面，本发明提供一种病毒制剂，所述病毒制剂包含以上所述的腮腺炎病毒突变体。

上述病毒制剂可为液体或固体制剂，除包含所述腮腺炎病毒突变体外，还可包含微生物制剂领域常用的辅料。

优选地，所述病毒制剂中，所述腮腺炎病毒突变体以活病毒形式存在。

在本发明的一些实施方式中提供一种冻干病毒制剂，其包含所述腮腺炎病毒突变体和保护剂。

本发明提供所述病毒制剂的制备方法，所述方法包括培养所述腮腺炎病毒突变体并收集病毒液的步骤。

所述腮腺炎病毒突变体的培养方法包括：将SPF鸡蛋孵化至9～11日龄，经胰蛋白酶消化制备原代鸡胚细胞，细胞密度0.1~1.5亿/胚，以混合接种的方式接种MOI为0.00006~0.002的所述腮腺炎病毒突变体，在33~35℃培养，收获病毒液。优选地，所述培养的时间为130h±18h。

第三方面，本发明提供以下（1）-（4）中的任意一种生物材料

（1）序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.1所示序列的完全互补序列所示的核酸分子；

（2）含有（1）中所述核酸分子的表达盒；

（3）含有（1）中所述核酸分子或（2）中所述表达盒的载体；

（4）含有（1）中所述核酸分子或（2）中所述表达盒或（3）中所述载体的宿主细胞。

其中，所述的核酸分子可为DNA分子或RNA分子。

所述表达盒为在所述核酸分子的上游和/或下游连接用于转录、翻译的调控元件得到的重组核酸分子。

所述载体为携带所述核酸分子且能够在宿主细胞中复制或整合的质粒载体、病毒载体、噬菌体载体或转座子。

所述宿主细胞包括微生物细胞、动物细胞或细胞系。所述动物细胞或细胞系为不可繁殖为动物个体的细胞或细胞系，可为用于病毒培养的常用动物细胞，包括但不限于非洲绿猴肾传代细胞（Vero）、RD细胞等。

第四方面，本发明提供一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含以上所述的腮腺炎病毒突变体或所述病毒制剂或所述生物材料。

以上所述的免疫原性组合物中，除包含所述腮腺炎病毒突变体或所述生物材料外，还可含有有利于病毒发挥免疫原性的佐剂，包括但不限于铝佐剂等。

优选地，所述免疫原性组合物中，所述腮腺炎病毒突变体以活病毒形式存在。

第五方面，本发明提供所述腮腺炎病毒突变体或所述病毒制剂或所述生物材料或所述免疫原性组合物的以下（1）-（9）中任意一种应用：

（1）在制备预防和/或治疗腮腺炎病毒感染或腮腺炎病毒感染引起疾病的药物中的应用；

（2）在制备预防和/或治疗腮腺炎病毒感染或腮腺炎病毒感染引起疾病的疫苗中的应用；

（3）在制备预防和/或治疗腮腺炎病毒感染或腮腺炎病毒感染引起疾病的抗体中的应用；

（4）在制备预防和/或治疗腮腺炎病毒感染或腮腺炎病毒感染引起疾病的抗血清中的应用；

（5）在制备检测腮腺炎病毒的试剂或试剂盒中的应用；

（6）在非诊断和治疗目的的腮腺炎病毒疫苗的免疫原性评价中的应用；

（7）在非诊断和治疗目的的腮腺炎病毒疫苗的保护性评价中的应用；

（8）在制备腮腺炎病毒感染动物模型中的应用；

（9）在预防和/或治疗腮腺炎病毒感染或腮腺炎病毒感染引起疾病的药物筛选或药效评价中的应用。

上述应用中，所述腮腺炎病毒感染引起疾病包括流行性腮腺炎。

上述应用中，以所述腮腺炎病毒突变体作为免疫原制备所述疫苗。

上述应用中，以所述腮腺炎病毒突变体作为免疫原通过免疫动物制得所述抗体或抗血清。

上述应用中，以所述腮腺炎病毒突变体作为阳性对照品制备检测腮腺炎病毒的试剂或试剂盒。

上述应用中，以所述腮腺炎病毒突变体作为检测毒株、通过血清学方法检测受种者接种疫苗后的抗体水平。

上述应用中，以所述腮腺炎病毒突变体作为免疫毒株进行动物免疫，评价腮腺炎病毒疫苗的保护性。

第六方面，本发明提供一种产品，所述产品含有以下（1）-（4）中的任意一种或多种的组合：

（1）所述腮腺炎病毒突变体；

（2）所述病毒制剂；

（3）所述生物材料；

（4）所述免疫原性组合物。

以上所述的产品包括用于诊断、预防或治疗腮腺炎病毒感染或腮腺炎病毒感染引起疾病的产品。

所述产品可为药物、疫苗、检测试剂或试剂盒。

第七方面，本发明提供一种疫苗，所述疫苗包含以上所述的腮腺炎病毒突变体或包含所述生物材料。

上述疫苗可为减毒活疫苗、灭活疫苗、核酸疫苗、基因工程疫苗（亚单位疫苗、活载体疫苗、基因重组疫苗等）等。

优选地，所述疫苗为减毒活疫苗。

上述疫苗可为单疫苗或联合疫苗。

在本发明的一些实施方式中提供一种腮腺炎病毒单疫苗，所述疫苗包含所述腮腺炎病毒突变体。

在本发明的一些实施方式中提供一种联合疫苗，所述联合疫苗包含所述腮腺炎病毒突变体以及一种或多种减毒的麻疹病毒和/或一种或多种减毒的风疹病毒和/或一种或多种减毒的水痘病毒，或者包含灭活的麻疹病毒和/或风疹病毒和/或水痘病毒，或者包含这些病毒的亚单位。所述联合疫苗能够提供抗腮腺炎病毒和/或麻疹病毒和/或风疹病毒和/或水痘病毒的免疫保护。

第八方面，本发明提供一种麻腮风联合减毒活疫苗，所述麻腮风联合减毒活疫苗包含以上所述的腮腺炎病毒突变体以及麻疹病毒和风疹病毒。

优选地，所述麻疹病毒和风疹病毒为减毒毒株。

优选地，所述麻疹病毒为长47株，和/或，所述风疹病毒为RA27/3株。

优选地，腮腺炎病毒突变体、麻疹病毒和风疹病毒按照6:3:1的比例混合制备麻腮风联合减毒活疫苗。

第九方面，本发明提供以上所述的疫苗的制备方法，所述方法包括：将所述腮腺炎病毒突变体在鸡胚细胞中培养，收获病毒液。

优选地，所述制备方法包括：制备原代鸡胚细胞，使得细胞密度为0.1~1.5亿/胚，以混合接种的方式接种MOI为0.00006~0.002的所述腮腺炎病毒突变体，在33~35℃培养，收获病毒液。优选地，所述培养的时间为130h±18h。

第十方面，本发明提供一种药物，所述药物包含由所述腮腺炎病毒突变体免疫动物制得的抗体或抗血清。

第十一方面，本发明提供一种提高腮腺炎病毒遗传稳定性的方法，所述方法包括使得所述腮腺炎病毒的基因组包含第11位由G突变为A以及第18位由T突变为G的突变。

上述提高腮腺炎病毒遗传稳定性的方法中，核苷酸位置的参考基因组为GenBank登录号为FJ211584.1的基因组序列。所述腮腺炎病毒优选具有GenBank登录号为FJ211584.1的基因组序列，或者与登录号为FJ211584.1的序列具有至少90%相似性、且基因组第11位为G、第18位为T的基因组序列。优选地，所述腮腺炎病毒为RIT4385毒株。

本发明的有益效果至少包括以下几点：

本发明提供一种腮腺炎病毒突变体（MuV-365-W株），该突变体具有较高的遗传稳定性，能够在病毒传代过程中保持稳定遗传。经实验验证，MuV-365-W株毒种连续传代至P12，各代次病毒滴度变化趋势较为平稳，平均值为6.6 lg CCID₅₀/ml，全基因组测序结果显示，原始种子（P3）、主种子批（P4）、工作种子批（P6）、疫苗代次P7的病毒核苷酸及氨基酸序列与P2代病毒种子全基因组核苷酸同源性100%，氨基酸同源性100%，呈现出良好的遗传稳定性。

腮腺炎病毒突变体（MuV-365-W株）的病毒滴度高，且质量可控，有利于保证制备疫苗的稳定性和质量控制。

腮腺炎病毒突变体（MuV-365-W株）具有较高的免疫原性，其免疫原性优于目前使用的疫苗株，由腮腺炎病毒突变体（MuV-365-W株）制得疫苗具有良好的免疫保护作用和安全性，具有较好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中的腮腺炎病毒蚀斑（10×）。

图2为本发明实施例1中的腮腺炎病毒典型融合病变形态（10×）。

图3为本发明实施例4中MuV-365-W株在原代鸡胚细胞上连续传代病毒滴度变化趋势。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 腮腺炎病毒MuV-365-W株的单克隆筛选

本发明通过将从IMUNA PHARM引进的15 01 82/3 PL-KUM 主种子病毒进行单克隆毒株筛选，筛选用于疫苗株的稳定遗传腮腺炎病毒突变体，筛选方法包括：

1、终末稀释法

将15 01 82/3 PL-KUM 主种子病毒稀释至1~3 CCID₅₀/0.1ml，然后将不同稀释度的病毒分别混种接种至鸡胚细胞（96孔板），置34℃±1℃、5% CO₂培养箱中培养。

镜下观察腮腺炎病毒典型病变，挑选病变孔进行传代。

2、蚀斑法

将15 01 82/3 PL-KUM 主种子病毒进行10倍系列稀释至10^-3，将病毒接种于已长至薄单层的鸡胚细胞（6孔板），每孔1 ml。于34℃±1℃吸附1~2h，覆盖琼脂糖后，置于34℃±1℃、5% CO₂培养箱中倒置培养。

镜下观察到腮腺炎病毒典型蚀斑（见图1）出现时，挑选蚀斑（P1）进行传代。

将挑出的440个蚀斑进行传代至P2，根据病变形态（呈典型融合，见图2）、病变程度（不低于50%）、病毒滴度（应不低于6.0 lg CCID₅₀/ml），挑选出69个毒株进行全基因组测序，与参考株基因组序列FJ211584.1进行全基因组序列比对，具体如表1所示。

表1 69个毒株的病变程度、病毒滴度和基因组序列比对结果

注：“++~”代表病变50%~75%；“+++”代表病变75%；“+++~”代表病变75%~100%；“++++”代表病变100%。

实施例2 不同腮腺炎病毒突变体的遗传稳定性考察

全基因组序列比对结果显示，与参考株基因序列相比，69株病毒株中有16株仅存在非编码区突变和/或编码区同义突变，这16株病毒株分别为：1000-233、1000-237、1000-246、1000-256、1000-285、1000-294、1000-299、1000-301、1000-312、1000-321、1000-326、1000-365、1000-388、1000-428、1000-431、1000-435。

从毒株纯合度和安全性考虑，初步确定蚀斑号为1000-233、1000-237、1000-285、1000-326、1000-365、1000-388、1000-435的7株毒株为疫苗候选株，进行后续比较研究，这7株候选株的非编码区第11位均由G突变为A，第18位均由T突变为G。毒株编号命名分别为MuV-233、MuV-237、MuV-285、MuV-326、MuV-365-W、MuV-388、MuV-435。

将上述初步确定的疫苗候选株进行遗传稳定性分析：将疫苗候选株传代至P12，观察病变形态、病变进展，并与P2代的基因组序列进行比对。结果显示：MuV-388株传至P3，基因序列发生突变，突变位点为NCR区域3198、4451位；MuV-326株传至P5，基因序列发生突变，1547位（NP）等7个位点发生突变；MuV-233株传至P6，1543位（NP）和14497位（L）2个位点发生突变；MuV-285株传至P6，1127位（NP）等17个位点发生突变；MuV-237株传至P6，1220位（NP）发生突变，传至P7代除1220位点发生突变外，另有1443位等8个位点发生突变；MuV-435株传至P5，病变融合不典型；偶然发现一株特异的腮腺炎病毒突变体，即MuV-365-W株，该突变体毒株传至P6，各代次全长基因组序列与P2的基因组序列100%一致，传至P12，主要免疫性与安全性区域（F和HN基因序列）与P2的序列100%一致。具体结果见表2。

表2 各疫苗候选株的遗传稳定性分析结果

注：*：同义突变；**：非编码区突变；***：仅对1301-2000bp区域序列进行测定；^#：与P2代病毒种子F和HN基因序列比对；NP：核蛋白区；L：大蛋白区；NCR：非编码区； N/A代表未进行此项。

从遗传稳定性传代比较，MuV-365-W株遗传稳定性好，P3、P4、P6、P7全长序列与P2序列100%一致，P12主要免疫性与安全性区域（F和HN基因序列）与P2序列100%一致。P3至P12病毒滴度在6.4~6.9 lg CCID₅₀/ml区间内，各代次病毒滴度变化趋势较为平稳。因此，确定MuV-365-W株为疫苗研制用毒株。

实施例3 腮腺炎病毒MuV-365-W株三级种子批的建立

将MuV-365-W株蚀斑（批号1000-365）依次接种于6孔板（P2）、T225瓶（P3原始种子）、十层细胞工厂CF-10（P4主种子批）、T225瓶（P5过渡代）、CF-10（P6工作种子批），建立三级种子批，按照《中华人民共和国药典》（2020年版）三部进行检定，检定结果如表3所示，工作种子批经中国食品药品检定研究院检定合格。

表3 腮腺炎减毒活疫苗原始种子、主种子批和工作种子批检定结果

将腮腺炎病毒MuV-365-W株的腮腺炎减毒活疫苗工作种子已于2019年9月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为腮腺炎病毒，保藏编号为CGMCC No.18504。腮腺炎病毒MuV-365-W株的基因组序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例4 腮腺炎病毒MuV-365-W株的遗传稳定性检测

将MuV-365-W株毒种连续传代至P12，各代次病毒滴度变化趋势如图3所示，P4至P12的病毒滴度在6.4~7.0 lg CCID₅₀/ml区间内，平均值为6.6 lg CCID₅₀/ml，各代次病毒滴度变化趋势较为平稳。

将腮腺炎减毒活疫苗病毒种子（P2）、原始种子（P3）、主种子批（P4）、工作种子批（P6）、疫苗代次P7以及疫苗代次后5代，即P12，进行第二代全基因组序列测定。第二代全基因组测序结果显示：原始种子（P3）、主种子批（P4）、工作种子批（P6）、疫苗代次P7的病毒核苷酸及氨基酸序列与P2代病毒种子的全基因组核苷酸同源性100%，氨基酸同源性100%，测序结果见表4。且P12代主要免疫性与安全性区域（F和HN基因序列）与P2代100%一致。

表4 腮腺炎病毒MuV-365-W株遗传稳定性测序结果

实施例5 腮腺炎病毒MuV-365-W株的培养工艺

腮腺炎病毒MuV-365-W株的培养工艺如下：

将SPF鸡蛋孵化至9~11日龄，经胰蛋白酶消化制备原代鸡胚细胞，细胞密度0.1~1.5亿/胚，以混合接种的方式接种MOI为0.00006~0.002的腮腺炎病毒MuV-365-W株，在34℃±1℃培养130h±18h，收获病毒液，该工艺培养腮腺炎病毒MuV-365-W株的滴度可达7.1 lgCCID₅₀/ml（表5）。

表5 腮腺炎病毒MuV-365-W株单次病毒收获液的病毒滴度

实施例6 腮腺炎病毒MuV-365-W株的免疫原性检测

目前流行病学调查发现，流行毒株主要为F基因型，G基因型呈局部流行。本发明采用腺炎病毒MuV-365-W株与常用疫苗株S79株以5.0 lg CCID₅₀/0.1ml剂量，肌肉注射两针剂，免疫4~6周龄的雌性BALB/c小鼠，42天采血，进行腮腺炎病毒抗血清中和抗体效价测定（抗G、F基因型）和IgG抗体浓度检测。结果如表6所示。

表6 MuV-365-W株与S79株腮腺炎病毒抗血清中和抗体效价测定结果

结果显示：MuV-365-W株（批号23-2010017）免疫血清对G基因型和F基因型的抗血清效价GMT（1：X）分别为11、31，阳转率均为100%。S79株免疫血清对上述两种检测毒株的抗血清效价GMT（1：X）分别为8、18，阳转率均为100%。两株病毒免疫血清对G基因型和F基因型交叉保护均无显著差异。

IgG抗体浓度检测结果显示（表7），两株病毒一针剂免疫原性无显著差异，但在二针剂免疫原性方面，MuV-365-W株优于S79株，差异极显著。

表7 MuV-365-W株与S79株腮腺炎病毒抗血清IgG抗体浓度检测结果

实施例7 含腮腺炎病毒MuV-365-W株的麻腮风联合减毒活疫苗的制备和安全性评价

将腮腺炎病毒（MuV-365-W株）以及麻疹病毒（长47株）分别接种原代鸡胚细胞，风疹病毒（RA27/3株）接种人二倍体细胞，经培养、收获病毒液，加入适宜稳定剂，按腮腺炎病毒、麻疹病毒和风疹病毒的比例为6:3:1混合配制，经冻干制成麻腮风联合减毒活疫苗，进行安全性评价。

其中，风疹病毒（RA27/3株）购自ATCC，毒种编号为ATCC：VR-1359，麻疹病毒（长47株）购自长春生物制品研究所。

1、单次给药毒性试验

将麻腮风联合减毒活疫苗以1剂/只的剂量单次皮下注射给予CD-1小鼠40只（20只/性别），最大耐受剂量（MTD）为1剂/只（0.5ml/只）。

2、重复给药毒性试验

将麻腮风联合减毒活疫苗重复皮下注射给予SD大鼠120只（60只/性别），6周和恢复期4周的毒性试验中，麻腮风联合减毒活疫苗以1剂/只、3剂/只的剂量重复皮下注射给予SD大鼠，连续给药6周（每3周给药1次，共给药3次），未观察到临床不良反应的剂量水平（NOAEL）为3剂/只。在本试验条件下，将麻腮风联合减毒活疫苗以1剂/只、3剂/只的剂量重复皮下注射给予SD大鼠，连续给药6周（每3周给药1次，共给药3次），给药局部可见供试品相关的刺激性反应，4周后完全恢复。在本试验条件下，将麻腮风联合减毒活疫苗以1剂/只、3剂/只的剂量重复皮下注射给予SD大鼠，连续给药6周（每3周给药1次，共给药3次），可检测到抗腮腺炎的抗体，4周恢复期结束仍可检测到。

3、局部耐受性试验

将麻腮风联合减毒活疫苗单次皮下注射雄性新西兰兔6只，14天试验期间，未见动物死亡或濒死现象；一般观察状况良好，未见与供试品相关的异常临床表现；给予供试品的给药局部的肉眼观察未见异常改变。大体观察和显微镜观察均未见供试品相关的给药部位的改变。

将麻腮风联合减毒活疫苗以1剂/只（0.5ml/只）的剂量单次皮下注射给予新西兰兔，结果显示其对给药部位无刺激性。

4、全身过敏试验

将麻腮风联合减毒活疫苗以0.1剂/只和1剂/只的剂量（分别相当于临床拟用剂量的20和200倍）皮下注射45只Hartley豚鼠（雌性），致敏3次，于末次致敏后14天以双倍致敏剂量静脉注射激发，可见豚鼠发生速发型过敏反应。

将麻腮风联合减毒活疫苗以1剂/只的剂量（相当于临床拟用剂量的200倍）皮下注射致敏3次，于末次致敏后14和21天以双倍致敏剂量静脉注射激发（麻腮风联合减毒活疫苗半成品，不含明胶、不含人血清白蛋白），豚鼠发生速发型过敏反应为阴性。

以上实验结果表明，本发明制得的麻腮风联合减毒活疫苗具有较高的安全性，即表明腮腺炎病毒MuV-365-W株可用于疫苗制备，具有较高的安全性。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种腮腺炎病毒突变体，其特征在于，所述腮腺炎病毒突变体的基因组序列如SEQID NO.1所示或如SEQ ID NO.1所示序列的完全互补序列所示。

2.一种腮腺炎病毒突变体，其特征在于，所述腮腺炎病毒突变体保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 18504。

3.一种病毒制剂，其特征在于，所述病毒制剂包含权利要求1或2所述的腮腺炎病毒突变体。

4.生物材料，其特征在于，其为以下（1）-（4）中的任意一种：

（1）序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.1所示序列的完全互补序列所示的核酸分子；

（2）含有（1）中所述核酸分子的表达盒；

（3）含有（1）中所述核酸分子或（2）中所述表达盒的载体；

（4）含有（1）中所述核酸分子或（2）中所述表达盒或（3）中所述载体的宿主细胞。

5.一种免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物包含权利要求1或2所述的腮腺炎病毒突变体或权利要求3所述的病毒制剂或权利要求4所述的生物材料。

6.权利要求1或2所述的腮腺炎病毒突变体或权利要求3所述的病毒制剂或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的免疫原性组合物的以下（1）-（9）中任意一种应用：

（1）在制备预防和/或治疗腮腺炎病毒感染或腮腺炎病毒感染引起疾病的药物中的应用；

（2）在制备预防和/或治疗腮腺炎病毒感染或腮腺炎病毒感染引起疾病的疫苗中的应用；

（3）在制备预防和/或治疗腮腺炎病毒感染或腮腺炎病毒感染引起疾病的抗体中的应用；

（4）在制备预防和/或治疗腮腺炎病毒感染或腮腺炎病毒感染引起疾病的抗血清中的应用；

（5）在制备检测腮腺炎病毒的试剂或试剂盒中的应用；

（6）在非诊断和治疗目的的腮腺炎病毒疫苗的免疫原性评价中的应用；

（7）在非诊断和治疗目的的腮腺炎病毒疫苗的保护性评价中的应用；

（8）在制备腮腺炎病毒感染动物模型中的应用；

（9）在预防和/或治疗腮腺炎病毒感染或腮腺炎病毒感染引起疾病的药物筛选或药效评价中的应用。

7.一种产品，其特征在于，其含有以下（1）-（4）中的任意一种或多种的组合：

（1）权利要求1或2所述的腮腺炎病毒突变体；

（2）权利要求3所述的病毒制剂；

（3）权利要求4所述的生物材料；

（4）权利要求5所述的免疫原性组合物。

8.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1或2所述的腮腺炎病毒突变体或包含权利要求4所述的生物材料。

9.一种麻腮风联合减毒活疫苗，其特征在于，所述麻腮风联合减毒活疫苗包含权利要求1或2所述的腮腺炎病毒突变体以及麻疹病毒和风疹病毒。

10.权利要求8或9所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1或2所述的腮腺炎病毒突变体在鸡胚细胞中培养，收获病毒液。