CN110743007B - 一种联合疫苗及其制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种联合疫苗及其制备方法、应用，所述联合疫苗包括灭活乙型脑炎病毒和灭活水痘带状疱疹病毒；所述联合疫苗中所述灭活乙型脑炎病毒总蛋白含量与所述联合疫苗中灭活水痘带状疱疹病毒总蛋白含量之比为0.25～4：1；一种联合疫苗的制备方法，所述制备方法包括：将所述灭活乙型脑炎病毒纯化液和所述灭活水痘带状疱疹病毒纯化液混合，得到混合病毒纯化液；通过采用同种人二倍体细胞作为病毒培养基质，制备得到灭活乙型脑炎病毒和灭活水痘带状疱疹病毒，通过灭活乙型脑炎病毒、灭活水痘带状疱疹病毒混合制备联合疫苗，且制备的联合疫苗安全有效，有效减少了疫苗接种次数。

Description

一种联合疫苗及其制备方法、应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种联合疫苗及其制备方法、应用。
背景技术
目前乙脑疫苗主要有乙型脑炎减毒活疫苗(地鼠肾细胞)和乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)两种类别。目前，大规模使用的乙脑疫苗有三种：(1)Nakayama株或北京株纯化鼠脑灭活疫苗，主要日本等几个亚洲国家生产；(2)Vero细胞培养的北京P3株乙脑灭活疫苗；(3)原代地鼠肾细胞培养的SA14-14-2株减毒活疫苗。在我国上市的有乙型脑炎减毒活疫苗(地鼠肾细胞)和乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)。
由于现有的乙型脑炎减毒活疫苗存在较高不良反应发生率，特别随着接种次数的增加，副反应发生率也随着增加，发生率高达1.2-1.7/10000，尤其严重的是接种疫苗后经常发生群体瘾症。而Vero细胞乙脑灭活疫苗存在的最大问题是有害物质残留，从而导致疫苗产品产生安全性隐患。这些有害残留物质包括细胞碎片、Vero细胞蛋白、Vero细胞DNA、牛血清蛋白等。
水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus，VZV)属疱疹病毒科，是一种具有高度传染性的疱疹病毒，既可引发水痘，也可引发带状疱疹(herpes zoster，HZ)。基于减毒活病毒(VZV Oka株)的水痘疫苗于上世纪70年代和80年代研制和进行临床试验。经过多年研究发展，目前市售的有数种冻干水痘减毒活疫苗，可冰箱冷藏或冷冻。这些疫苗有的为单价疫苗(仅含VZV病毒成份)，有的则与麻疹、腮腺炎、风疹三联疫苗(MMR)制成联合疫苗。
研究表明单价水痘减毒活疫苗耐受性良好，健康儿童接种水痘疫苗后最常报告的不良事件均较轻微，其中包括注射部位轻度压痛、发红和皮疹。然而，活减毒疫苗同样存在着疫苗株感染的可能，已有Oka疫苗株感染病例报道。同时活病毒水痘疫苗不适用于免疫功能低下的患者，由VZV Oka株引起的罕见并发症包括肺炎、肝炎、带状疱疹脑膜炎、复发性带状疱疹、严重皮疹以及继发性VZV传播，主要发生于免疫功能受损者或接种时有未被确诊的其他严重病症的患者。目前，对水痘的治疗没有特效药，以预防为主，只能通过接种水痘疫苗的方法预防感染VZV病毒，所以安全有效的水痘疫苗需求迫切。
目前为了预防乙型脑炎和水痘需要分别接种两种不同的疫苗，即分别接种乙型脑炎疫苗或水痘疫苗，接种程序繁琐。现有的乙型脑炎减毒活疫苗和水痘减毒活疫苗联合使用存在较大风险，因为减毒活疫苗始终存在着与野毒株重组，自身的变异，活病毒向自然界的排毒等风险，如：VZV减毒株已经有感染正常人发病的病例。并且现有的两种减毒疫苗免疫程序不同，作用机制有差异，导致两种减毒疫苗无法进行联合使用。需要研制安全性更好的乙脑、水痘联合疫苗。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种联合疫苗及其制备方法、应用。
一种联合疫苗，所述联合疫苗包括灭活乙型脑炎病毒和灭活水痘带状疱疹病毒；
所述联合疫苗中所述灭活乙型脑炎病毒总蛋白含量与所述联合疫苗中灭活水痘带状疱疹病毒总蛋白含量之比为0.25～4：1；
每剂所述联合疫苗中：含有所述灭活水痘带状疱疹病毒0.4～1份，所述灭活乙型脑炎病毒0.4～1份；
所述乙型脑炎病毒和所述水痘带状疱疹病毒的培养基质为同种人二倍体细胞。
进一步地，所述人二倍体细胞为ZFB-2细胞、ZFB-3细胞、MRC-5细胞、2BS细胞或WI-38细胞。
进一步地，所述联合疫苗还包括医学上常用的疫苗保护剂，所述疫苗保护剂包括蛋白赋形剂、无机盐和缓冲液；
所述联合疫苗中：所述蛋白赋形剂的添加量为18～22mg/mL，所述无机盐添加量为8～12mg/mL，所述缓冲液添加量为0.2～1.5mg/mL。
进一步地，所述蛋白赋形剂为蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、甘露醇中的一种或多种，较佳地，所述蛋白赋形剂为蔗糖。
进一步地，所述无机盐为氯化钠、氢氧化铝、碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或多种，较佳地，所述无机盐为氯化钠。
进一步地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中的一种。
一种联合疫苗的制备方法，所述制备方法包括：
利用人二倍体细胞培养水痘带状疱疹病毒，制备灭活水痘带状疱疹病毒纯化液；
利用所述人二倍体细胞培养乙型脑炎病毒，制备灭活乙型脑炎病毒纯化液；
将所述灭活乙型脑炎病毒纯化液和所述灭活水痘带状疱疹病毒纯化液混合，得到混合病毒纯化液；
对所述混合病毒纯化液添加保护剂，得到联合疫苗。
进一步地，所述灭活水痘带状疱疹病毒纯化液的制备包括：
将所述人二倍体细胞进行传代培养；
将水痘带状疱疹病毒接种至传代后的所述人二倍体细胞上，进行病毒培养，得到水痘带状疱疹病毒收获液；
对所述水痘带状疱疹病毒收获液进行超滤浓缩，至水痘带状疱疹病毒浓缩液中总蛋白含量为35～85mg/mL；
对所述水痘带状疱疹病毒浓缩液进行灭活、水解处理，得到水痘带状疱疹病毒灭活液；
对所述水痘带状疱疹病毒灭活液进行纯化处理，得到水痘带状疱疹病毒纯化液。
进一步地，所述水痘带状疱疹病毒浓缩液进行灭活、水解处理具体为：
所述水痘带状疱疹病毒浓缩液通过β-丙内酯进行灭活；
所述灭活条件为：水痘带状疱疹病毒浓缩液与β-丙内酯的体积比为1：2000～8000配制、灭活温度为2～8℃及灭活时间为12～36h；
将含有β-丙内酯的所述水痘带状疱疹病毒浓缩液进行水解，所述水解条件为：水解温度为34～37℃，水解时间为1～3h。
进一步地，所述灭活乙型脑炎病毒纯化液的制备包括：
将所述人二倍体细胞进行传代培养；
将乙型脑炎病毒接种至传代后的所述人二倍体细胞上，进行病毒培养，得到乙型脑炎病毒收获液；
对所述乙型脑炎病毒收获液进行超滤浓缩，至浓缩液中总蛋白含量为20～100mg/mL；
对所述乙型脑炎病毒浓缩液进行灭活、水解处理，得到乙型脑炎病毒灭活液；
对乙型脑炎病毒灭活液进行纯化，得到灭活乙型脑炎病毒纯化液。
进一步地，所述乙型脑炎病毒浓缩液进行灭活、水解处理具体为：
所述乙型脑炎病毒浓缩液通过β-丙内酯进行灭活；
所述灭活条件为：所述乙型脑炎病毒浓缩液与所述β-丙内酯的体积比为1：4000～8000、灭活温度为2～8℃及灭活时间为12～36h；
将含有β-丙内酯的所述乙型脑炎病毒浓缩液进行水解，所述水解条件为：水解温度为34～37℃、水解时间为1～3h。
进一步地，所述水痘带状疱疹病毒灭活液和/或所述乙型脑炎病毒灭活液通过琼脂糖凝胶4FF凝胶柱层析纯化法进行纯化。
一种联合疫苗在制备预防乙型脑炎和/或水痘带状疱疹药物、试剂或试剂盒中的应用。
进一步地，所述药物、试剂或试剂盒包括灭活乙型脑炎病毒和灭活水痘带状疱疹病毒。
进一步地，所述灭活乙型脑炎病毒和灭活水痘带状疱疹病毒通过上述制备方法制备得到。
本发明通过采用同种人二倍体细胞作为病毒培养基质，采用同种灭活、纯化方法，制备得到灭活乙型脑炎病毒和灭活水痘带状疱疹病毒，实现灭活乙型脑炎病毒、灭活水痘带状疱疹病毒混合制备联合疫苗，且制备的联合疫苗安全有效，有效减少了疫苗接种次数。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书以及权利要求书来实现和获得。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种联合疫苗，包括灭活乙型脑炎病毒和灭活水痘带状疱疹病毒。
联合疫苗中所述灭活乙型脑炎病毒总蛋白含量与所述联合疫苗中灭活水痘带状疱疹病毒总蛋白含量之比为0.25～4：1；
每剂所述联合疫苗中：含有所述灭活水痘带状疱疹病毒0.4～1份，所述灭活乙型脑炎病毒0.4～1份。
乙型脑炎病毒和灭活水痘带状疱疹病毒的培养基质为ZFB-2细胞、ZFB-3细胞、MRC-5细胞、2BS细胞、WI-38细胞等人二倍体细胞，优选为人二倍体细胞ZFB-2细胞和ZFB-3细胞。
采用同种细胞作为乙型脑炎病毒和水痘带状疱疹病毒的培养基质，获得滴度均衡的灭活乙型脑炎疫苗和灭活水痘疫苗。现有的灭活乙型脑炎疫苗为Vero细胞生产，而水痘疫苗是人二倍体细胞生产的，由于人二倍体细胞生产的疫苗免疫原性，滴度远高于Vero细胞，难以保证二者联合使用后，能够同时发挥作用。而本发明制备的灭活乙型脑炎疫苗和灭活水痘疫苗均能够发挥作用，确保联合疫苗安全有效。
且考虑到WI-38细胞因为检测到曾被污染，现已不用于疫苗生产。MRC-5细胞因为WHO授权的细胞数量稀少，加之二倍体细胞自身代次有限，目前生产用一般最高为35代，抗原产量严重受限，多用于减毒活疫苗生产，而且在该种细胞上适应的乙脑病毒滴度也不尽如人意，制备的抗原达不到灭活苗所需的产量。因此，在本发明中优选用人二倍体细胞ZFB-2细胞、ZFB-3细胞作为本发明乙型脑炎病毒和水痘带状疱疹病毒的培养基质。
联合疫苗还包括医学上常用的疫苗保护剂，所述疫苗保护剂包括蛋白赋形剂、无机盐和缓冲液，在联合疫苗中：蛋白赋形剂的添加量为18～22mg/mL，无机盐添加量为8～12mg/mL，缓冲液添加量为0.2～1.5mg/mL。
蛋白保护剂为蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、甘露醇中的一种或多种，优选为蔗糖；
无机盐为氯化钠、氢氧化铝、碳酸钠、碳酸氢钠中的一种或多种，优选为氯化钠；
缓冲液为磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris盐酸缓冲液)中的一种，优选为磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制而成；使用时，磷酸氢二钠的添加量为1.0～1.3mg/mL，磷酸二氢钠的添加量为0.2～0.3mg/mL。
本发明还包括一种联合疫苗的制备方法，制备方法包括以下步骤：
制备灭活水痘带状疱疹病毒纯化液；
制备灭活乙型脑炎病毒纯化液；
将灭活乙型脑炎病毒纯化液和灭活水痘带状疱疹病毒纯化液混合，
对混合后的病毒纯化液添加保护剂，得到联合疫苗。
制备灭活水痘带状疱疹病毒纯化液的步骤如下：
将人二倍体细胞进行传代培养；
将水痘带状疱疹病毒接种至传代后的人二倍体细胞上，进行病毒培养，得到水痘带状疱疹病毒收获液；
对水痘带状疱疹病毒收获液进行超滤浓缩，至浓缩液中总蛋白含量为35-85mg/mL；
对水痘带状疱疹病毒浓缩液进行灭活、水解处理，得到水痘带状疱疹病毒灭活液：
水痘带状疱疹病毒浓缩液通过β-丙内酯进行灭活；
具体灭活条件为：水痘带状疱疹病毒浓缩液与β-丙内酯的体积比为1：2000～8000配制、灭活温度为2～8℃及灭活时间为12～36h；
具体水解条件为：水解温度为34～37℃，水解时间为1～3h；
对水痘带状疱疹病毒灭活液进行纯化，得到水痘带状疱疹病毒纯化液。
制备灭活乙型脑炎病毒纯化液的步骤如下：
将人二倍体细胞进行传代培养；
将乙型脑炎病毒接种至人传代后的人二倍体细胞上，进行病毒培养，得到乙型脑炎病毒收获液；
乙型脑炎病毒收获液进行超滤浓缩至浓缩液中总蛋白含量为20～100mg/mL；
对乙型脑炎病毒浓缩液进行灭活、水解处理，得到乙型脑炎病毒灭活液；
具体的，所述乙型脑炎病毒浓缩液通过β-丙内酯进行灭活；
所述灭活条件为：所述乙型脑炎病毒浓缩液与所述β-丙内酯的体积比为1：4000～8000、灭活温度为2～8℃及灭活时间为12～36h；
将含有β-丙内酯的所述乙型脑炎病毒浓缩液进行水解，所述水解条件为：水解温度为34～37℃、水解时间为1～3h；
对乙型脑炎病毒灭活液进行纯化，得到灭活乙型脑炎病毒纯化液。
具体的，水痘带状疱疹病毒灭活液和/或所述乙型脑炎病毒灭活液通过琼脂糖凝胶4FF凝胶柱层析纯化法进行纯化。
灭活水痘带状疱疹病毒纯化液与灭活乙型脑炎病毒纯化液均采用相似的纯化工艺，使两者纯化液中剩余杂质的种类和含量完全一致，易于规模化生产。若采用不同的细胞基质培养病毒株则需要不同的培养方式和不同的纯化工艺，质量标准不易制定，产能小，成本高，无应用价值。
在联合疫苗制备过程中，水痘带状疱疹病毒浓缩液、乙型脑炎病毒浓缩液采用的灭活剂为β-丙内酯。采用β-丙内酯作为灭活剂，确保联合疫苗的在纯化工艺中无灭活剂残留，β-丙内酯灭活作用于病毒核酸，对蛋白抗原性影响较小，与常用甲醛灭活相比较，灭活时间短，水解后无残留，灭活后的蛋白免疫原性较高。
现有技术中对灭活剂甲醛去除不彻底，残留较高，残留的β-丙内酯具有潜在的致癌性，在本发明制备方法中，细胞和病毒培养过程中无需添加抗生素，结合超滤和层析两步纯化法，灭活剂去除彻底，抗原得率较高，能够达到40～80％。
本发明还涉及一种联合疫苗的应用，联合疫苗在制备预防乙型脑炎药物和/或制备预防水痘带状疱疹药物、试剂或试剂盒中的应用。
通过上述制备方法制备得到的联合疫苗，联合疫苗能够制备预防乙型脑炎药物和/或制备预防水痘带状疱疹药物、试剂盒。
通过以下实施例对本发明的联合疫苗进行进一步说明：
在下述实施例中，所涉及的生物保藏说明：
所用人二倍体细胞ZFB-2细胞，为人胚肺纤维细胞，名称为ZFB-2。已于2019年03月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.17481。
所用人二倍体细胞ZFB-3细胞，为人胚肺纤维细胞，已于2019年03月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.17482。
在下述实施例中所用磷酸缓冲盐溶液(PBS)参照《分子克隆实验指南》中关于磷酸缓冲盐溶液(PBS)配方配制，且使用前通过0.1M NaOH溶液调整磷酸缓冲盐溶液的pH值为7.0～8.0之间。
实施例1灭活水痘带状疱疹病毒纯化液的制备方法
实验材料及来源：
人二倍体细胞ZFB-3细胞；
水痘带状疱疹病毒，临床采集；
0.2％～0.5％人血白蛋白，购自于同路生物制药；
MEM培养基，购自于Thermo公司；
PBS，自制；
超滤膜包，购自于密理博公司；
β-丙内酯，购自于Serva公司；
制备方法：
1.将ZFB-3细胞在细胞培养瓶及细胞工厂中传代至20代，其中ZFB-3细胞为宿主细胞；
2.宿主细胞扩增到融合度90％以上时，将水痘带状疱疹病毒接种到宿主细胞中进行感染，M.O.I.为0.001；
3.加入含有0.2％～0.5％人血白蛋白的MEM培养基，置于34℃细胞培养箱培养；
4.每天观察细胞病变程度，待细胞CPE(病毒至细胞病变效应)达到50％以上时，倒掉培养基，用PBS洗涤细胞；
5.加入0.03％的EDTA(乙二胺四乙酸)溶液洗脱感染细胞，将细胞悬液收集于离心管中，在4℃下4000rpm离心10分钟，去掉上清，加入稳定剂合并、混匀，单瓶取样做无菌检测，-80℃冻存；
6.将检测无菌的样品置于超声瓶中进行超声破碎，在4℃下8000rpm离心10分钟，收集上清，即水痘带状疱疹病毒原液；
7.采用截留分子量为100KD的超滤膜包进行20～50倍浓缩，得到水痘带状疱疹病毒浓缩液，按照2015版药典四部Lowry法检测病毒浓缩液中总蛋白含量为35～85mg/mL；
8.将β-丙内酯与水痘带状疱疹病毒浓缩液按体积比1：2000～8000混合，3～5℃灭活12～36h，37℃水解2h，得到水痘带状疱疹病毒灭活液；
9.Sepharose 4FF凝胶柱层析纯化水痘带状疱疹病毒灭活液，紫外检测，280nm吸收处下收取VZV gE蛋白峰，得到灭活水痘带状疱疹病毒纯化液。
实施例2乙型脑炎病毒在ZFB-3细胞上的适应
实验材料及来源：
人二倍体细胞ZFB-3细胞；
乙型脑炎病毒(JEV)P3株，购自中国食品药品检定研究院
胎牛血清，购自于GIBCO和杭州四季青；
MEM培养基，购自于Thermo公司；
PBS，自制。
实验过程：
将鼠脑来源乙脑病毒P3株分别在MRC-5细胞和ZFB-3细胞上适应；
使用病毒蚀斑多次筛选的方法，将P3病毒株按照不低于10-3倍稀释后，接种于单层细胞的96孔板中，MRC-5细胞和ZFB-3细胞分别设置对应96孔板。MRC-5细胞和ZFB-3细胞上适应在相同条件下，同时开展。
试验用二倍体细胞应不超过规定的使用代次，细胞长满为单层时按照1：2传代。病毒接种后每天观察细胞病变程度，待细胞CPE达到50％以上时，收集病毒培养液。
毒种3次筛选后，经过24孔板和方瓶逐级放大，最终收获的毒种分别使用适应用细胞检测相应毒种病毒滴度，计算lgPFU/mL。
实验结果：病毒滴度检测结果如表1所示：
表1 ZFB-3细胞和MRC-5细胞病毒培养滴度
Figure GDA0002395196120000101
由表1可知，ZFB-3细胞中适应的乙脑毒种病毒滴度达到8.52lgPFU/mL，毒种在ZFB细胞上适应成功，且病毒滴度高于MRC-5细胞适应株。
实施例3灭活乙型脑炎病毒纯化液的制备方法
实验材料及来源：
人二倍体细胞ZFB-3细胞；
乙型脑炎病毒(JEV)P3株，购自中国食品药品检定研究院
0.2％～0.5％人血白蛋白，购自于同路生物制药；
MEM培养基，购自于Thermo公司；
PBS，自制；
超滤膜包，购自于密理博公司；
β-丙内酯，购自于Serva公司；
制备方法：
1.将ZFB-3细胞在细胞培养瓶及细胞工厂中传代至20代，其中ZFB-3细胞为宿主细胞；
2.宿主细胞扩增到融合度90％以上时，将乙型脑炎病毒接种到宿主细胞中进行感染，MOI为0.001；
3.加入含有0.2％～0.5％人血白蛋白的MEM培养基，置于34℃细胞培养箱培养；
4.每天观察细胞病变程度，待细胞CPE达到50％以上时，收集病毒培养液；
5.将病毒培养液收集于离心管中，在4℃下4000rpm离心10分钟，收集上清，即病毒收获液；
6.采用截留分子量为300KD的超滤膜包进行20～50倍浓缩，得到乙型脑炎病毒浓缩液按照2015版药典四部Lowry法检测乙型脑炎病毒浓缩液中总蛋白含量为20～100mg/mL；
7.将β-丙内酯与乙型脑炎病毒浓缩液按体积比1：4000～8000混合，4℃灭活24～48h，37℃水解2h，得到乙型脑炎病毒灭活液；
8.Sepharose 4FF凝胶柱层析纯化乙型脑炎病毒灭活液，紫外检测，280nm吸收处下收取乙型脑炎病毒蛋白峰，得到灭活乙型脑炎病毒纯化液。
实施例4乙型脑炎病毒和水痘带状疱疹病毒灭活及灭活验证
1.乙型脑炎病毒(JEV)灭活及灭活验证
(1)采用实施例3中灭活乙型脑炎病毒纯化液制备方法，按照制备方法中步骤1-7得到乙型脑炎病毒浓缩液；
(2)对上述步骤(1)得到的乙型脑炎病毒浓缩液与灭活剂β-丙内酯(BPL)的比例、灭活的时间、水解的时间进行研究，具体如表2所示：
表2不同灭活温度下乙型脑炎病毒浓缩液与灭活剂β-丙内酯(BPL)的比例、灭活的时间、水解的时间研究表
Figure GDA0002395196120000111
Figure GDA0002395196120000121
Figure GDA0002395196120000122
Figure GDA0002395196120000123
/>
Figure GDA0002395196120000124
由表2的检测结果可知，乙型脑炎病毒浓缩液检测其蛋白含量为20～100mg/mL时，灭活剂加入比例应为1：4000～8000，灭活温度为4～6℃，灭活时间为24～48h，水解温度为34～37℃，水解时间为2h以上。
(3)取步骤(2)中配制的灭活后乙型脑炎病毒浓缩液，先采用脑内接种的方式，接种体重12～14g小鼠8只，每只脑内接种0.03mL，同时腹腔接种0.5mL，为第1代；
7天后将第1代小鼠处死3只，取脑制成10％脑悬液，采用同种接种方法将1代脑悬液脑内接种12～14g小鼠6只，为第2代；
7天后将第2代小鼠处死3只，同法将2代脑悬液脑内接种12～14g小鼠6只，为第3代。
接种后逐日观察14天，3天内死亡者不计(动物死亡数量应不得超过试验用动物总数的20％)，每代小鼠除处死和接种后非特异性死亡的以外，统计计算病毒滴度；
(4)按照实施例2中的方法测得灭活后的病毒滴度为0，即说明灭活疫苗没有感染性。
2.水痘带状疱疹病毒(VZV)灭活及灭活验证
(1)采用实施例1灭活水痘带状疱疹病毒纯化液的制备方法，按照制备方法中步骤1-7得到水痘带状疱疹病毒浓缩液；
(2)将(1)步骤得到的病毒浓缩液检测其蛋白含量和病毒滴度，将蛋白含量为35～95mg/mL且病毒滴度不小于4.0lgPFU/mL的病毒浓缩液加入灭活剂β-丙内酯(BPL)进行灭活和水解反应，研究不同灭活温度下，灭活剂与VZV浓缩液不同比例配制后的病毒滴度，如表3所示：
表3不同灭活温度下水痘带状疱疹病毒浓缩液与灭活剂β-丙内酯(BPL)的比例、灭活的时间、水解的时间研究表
Figure GDA0002395196120000131
Figure GDA0002395196120000141
Figure GDA0002395196120000142
Figure GDA0002395196120000143
(3)根据(2)步骤结果，水痘带状疱疹病毒浓缩液检测其蛋白含量为35～95mg/mL、病毒滴度不小于4lgPFU/mL时，最佳灭活条件为：灭活剂加入比例为1：2000～8000，灭活温度为3～5℃，灭活时间为12～36h，水解温度为34～37℃，水解时间为1.5h～3h。
以此条件灭活的病毒液接入长成单层MRC-5细胞的24孔板中，34～37℃吸附1～2h后补充病毒培养液1mL，34～37℃培养70～96h时，收集病毒液接入长成单层细胞的24孔板中，这样连续盲传3代，收集病毒液用蚀斑法测病毒滴度；
(4)蚀斑法测定水痘病毒灭活疫苗的感染性
将MRC-5细胞铺6孔板，每孔接种3*105个细胞，5％CO2培养箱34～37℃孵育3～4天后，细胞长成单层后即可测定水痘病毒滴度。吸弃培养基，将水痘病毒灭活疫苗稀释到适当浓度感染细胞，在5％CO2培养箱34～37℃吸附1～2小时，然后每孔补加3mL病毒培养液，在5％CO2培养箱34～37℃培养。培养7～10天后进行染色。计数取平均值，乘以稀释系数和接种体积校正因子，得出水痘病毒灭活疫苗滴度，即用lgPFU/mL来表示，经灭活过的水痘病毒灭活疫苗滴度结果均无空斑形成。
按照上述蚀斑法测得灭活后的病毒滴度为0，即说明灭活疫苗没有感染性。
通过乙型脑炎病毒和水痘带状疱疹病毒灭活及灭活验证实验，说明在乙型脑炎病毒和水痘带状疱疹病毒对应最佳灭活水解条件下得到的灭活病毒液，不具有感染性。
实施例5联合疫苗制备
将实施例1得到的灭活水痘带状疱疹病毒纯化液和实施例3得到的灭活乙型脑炎病毒纯化液加入保护剂，混合均匀，制备液态状的联合疫苗。
在本实施例中，本实施例中所使用的灭活JEV纯化液总蛋白浓度为100μg/mL，灭活VZV纯化液的总蛋白浓度为100μg/mL。按照一定比列配制后与保护剂混合，使得混合后灭活JEV病毒纯化液中总蛋白含量和灭活VZV病毒纯化液中总蛋白含量比例为0.25：1。
向液态联合疫苗中加入冻干赋形剂和磷酸缓冲盐溶液(PBS)，充分混匀后，无菌分装，每剂量1.0mL。冻干成白色疏松体，得到联合疫苗。该联合疫苗复溶后为澄明液体，该联合疫苗的配方如表4所示：
表4灭活JEV病毒纯化液中总蛋白含量和灭活VZV病毒纯化液中总蛋白含量比例为0.25：1的联合疫苗配方
Figure GDA0002395196120000151
Figure GDA0002395196120000161
在表4的配方中，蔗糖的作用是赋形并保护蛋白，无机盐的作用是保证等渗性和生理pH，PBS参照《分子克隆实验指南》中关于磷酸缓冲盐溶液(PBS)配方配制，使用前通过0.1M NaOH溶液调整pH值为7.0～8.0之间；
病毒蛋白含量采用2015版药典四部Lowry法检测。
实施例6联合疫苗制备
将实施例1得到的灭活水痘带状疱疹病毒纯化液和实施例3得到的灭活乙型脑炎病毒纯化液加入保护剂。
本实施例中配制用灭活JEV纯化液的总蛋白浓度为100μg/mL，灭活VZV纯化液的总蛋白浓度为100μg/mL。按照一定比列配制后与保护剂混合，使得灭活JEV病毒纯化液中总蛋白含量和灭活VZV病毒纯化液中总蛋白含量比例为1：1。
向液态的联合疫苗中加入冻干赋形剂和磷酸缓冲盐溶液(PBS)，充分混匀后，无菌分装，每剂量1.0mL。冻干成白色疏松体，得到联合疫苗。该联合疫苗复溶后为澄明液体，该联合疫苗的配方如下：
表5灭活JEV病毒纯化液中总蛋白含量和灭活VZV病毒纯化液中总蛋白含量比例为1：1的联合疫苗配方
Figure GDA0002395196120000162
Figure GDA0002395196120000171
在表5的配方中，蔗糖的作用是赋形并保护蛋白，无机盐的作用是保证等渗性和生理pH，PBS参照《分子克隆实验指南》中关于磷酸缓冲盐溶液(PBS)配方配制，使用前通过0.1M NaOH溶液调整pH值为7.0～8.0之间；
本实施例中病毒蛋白含量采用2015版药典四部Lowry法检测。
实施例7联合疫苗制备
将实施例1得到的灭活水痘带状疱疹病毒纯化液和实施例3得到的灭活乙型脑炎病毒纯化液加入保护剂，混合均匀，制备液态状的联合疫苗。
在本实施例中，本实施例中所使用的灭活JEV纯化液总蛋白浓度为100μg/mL，灭活VZV纯化液的总蛋白浓度为100μg/mL。按照一定比列配制后与保护剂混合，使得灭活JEV病毒纯化液中总蛋白含量和灭活VZV病毒纯化液中总蛋白含量比例为4：1。
加入冻干赋形剂和磷酸缓冲盐溶液(PBS)，充分混匀后，无菌分装，每剂量1.0mL。冻干成白色疏松体，得到联合疫苗。该联合疫苗复溶后为澄明液体，该联合疫苗的配方如表6所示：
表6灭活JEV病毒纯化液中总蛋白含量和灭活VZV病毒纯化液中总蛋白含量比例为4：1的联合疫苗配方
成分 数量(每剂)
灭活JEV纯化液 0.8mL
灭活VZV纯化液 0.2mL
氯化钠(NaCl) 9000μg
磷酸氢二钠(Na2HPO4) 1150μg
磷酸二氢钠(NaH2PO4) 230μg
蔗糖 20mg
在表6的配方中，蔗糖的作用是赋形并保护蛋白，无机盐的作用是保证等渗性和生理pH；
PBS参照《分子克隆实验指南》中关于磷酸缓冲盐溶液(PBS)配方配制，使用前通过0.1M NaOH溶液调整pH值为7.0～8.0之间；
病毒蛋白含量采用2015版药典四部Lowry法检测。
实施例8联合疫苗的免疫学研究
实验材料及来源：
SPF级雌性BALB/c小鼠，购自于安徽医科大学；
试验设计：
雌性BALB/c小鼠，随机分组，每组6只小鼠，小鼠日龄与体重相近。免疫2次，每次1mL，两次用药间隔为1周，第二次用药后4周静脉取血。阳性对照分别为含有50μg的JEV和VZV灭活病毒液，阴性对照仅给药磷酸盐缓冲液PBS。
试验分组如表7所示：
表7不同免疫剂量的试验分组
组别 所用药物 免疫剂量(/只)
组别1 实施例5所得联合疫苗 每次1mL，注射2次
组别2 实施例6所得联合疫苗 每次1mL，注射2次
组别3 实施例7所得联合疫苗 每次1mL，注射2次
组别4 JEV阳性对照 每次1mL，注射2次
组别5 VZV阳性对照 每次1mL，注射2次
组别6 阴性对照 PBS溶液
试验结果：
采用ELISA(酶联免疫吸附实验)法检测血清中的JEV IgG(免疫球蛋白G)和VZVIgG(免疫球蛋白G)水平，与免疫前血清相比较，免疫后抗体滴度提高4倍以上视为阳转。乙型脑炎病毒和水痘带状疱疹病毒的抗体几何平均滴度(GMT)和阳转率结果如表8所示。
表8各联合疫苗使用后乙型脑炎病毒和水痘带状疱疹病毒的免疫结果
Figure GDA0002395196120000181
/>
Figure GDA0002395196120000191
注：*表示p值<0.05，即与磷酸盐缓冲液PBS组相比，两者差异具有统计学意义显著性。
由表8可知，联合疫苗均能产生有效的体液免疫。结果显示，在BALB/c小鼠中，本发明提供的疫苗能够显著(p<0.05)增加体液免疫(JEV IgG和VZV IgG抗体)水平。从实验结果看，与单独使用疫苗相较，联合使用后，抗体转阳率及抗体滴度均无显著差异，联合疫苗中两种病毒抗原组分没有相互干扰。
实施例9联合疫苗的保护性研究
1.乙脑病毒攻毒
实验材料及来源：
SPF级雌性BALB/c小鼠，购自于安徽医科大学；
试验设计：
雌性BALB/c小鼠，随机分组，每组10只小鼠，小鼠日龄与体重相近。按照实施例5、6、7制备疫苗，分别免疫体重为13～14g小鼠10只，每只1mL；
第1针和第2针用药间隔为1周，此后每隔2周免疫1针，共4针。第四次用药后第14天用P3株乙脑病毒腹腔攻击，其病毒量应不低于10倍的小鼠半数致死量(LD50)。同时每只小鼠脑内接种0.03mL乙脑病毒稀释液(PBS溶液稀释)。3天内死亡者不计；
攻击21天后判定结果，计算保护率。阳性对照为含有50μg的JEV灭活病毒液；阴性对照仅给药磷酸盐缓冲液PBS。
试验结果如表9所示：
表9多组联合疫苗对乙脑病毒攻毒的结果
组别 所用药物 免疫剂量(/只) 保护率％
组别1 实施例5所得联合疫苗 每次1mL，注射4次 80
组别2 实施例6所得联合疫苗 每次1mL，注射4次 100
组别3 实施例7所得联合疫苗 每次1mL，注射4次 100
组别4 JEV阳性对照 每次1mL，注射4次 100
组别5 阴性对照 PBS溶液 0
2.水痘病毒中和
实验材料及来源：
SPF级雌性BALB/c小鼠，购自于安徽医科大学；
试验过程：
雌性BALB/c小鼠，随机分组，每组10只小鼠，小鼠日龄与体重相近。
按照实施例5、6、7制备疫苗，分别免疫体重为13～14g小鼠10只，每只1mL。第1针和第2针用药间隔为1周，此后每个2周免疫1针，共4针。第四次用药后第14天采血，采用蚀斑法检测血清抗体中和效价。
将VZV活病毒稀释成100PFU/100μl，再将小鼠血清倍比稀释，与同体积病毒液混合后，在37℃孵育1h，补充培养液，置37℃、5％CO2培养箱培养7～10天，考马斯亮蓝染色后计空斑数，计算减少50％时血清稀释度。
阳性对照为含有50μg的VZV灭活病毒液；阴性对照仅给药磷酸盐缓冲液PBS。
试验结果如表10所示：
表10多组联合疫苗对水痘带状疱疹病毒中和效价结果
Figure GDA0002395196120000201
Figure GDA0002395196120000211
由表9和表10结果表明，本发明实施例中配制的联合疫苗均能产生有效的免疫保护效果，免疫动物后能保护其免于JEV病毒的攻击，其血清中抗体能够中和VZV病毒。
现行的灭活乙型脑炎注射程序：
6～12月龄接种第1针和第2针，时间间隔7～10天；
第2针6个月后和4～10岁时分别接种第3针和第4针；
每一次注射剂量为0.5mL。
现行水痘减毒活疫苗免疫程序：
1-12岁儿童常规免疫接种第1剂：满18月龄，接种第1剂；
第2剂：满4岁，接种第2剂；
注：已接种过1剂，年龄为4-12岁者，应接种第2剂，与前剂至少间隔3个月。
通过现有的接种程序，进一步验证了的灭活乙型脑炎疫苗和水痘减毒活疫苗免疫程序不一致，无法进行联用使用，为了预防乙脑和水痘，需要接种6针疫苗。
通过多次动物实验，可得本发明实施例的联合疫苗接种程序为：
6～12月龄接种第1针和第2针，时间间隔7～10天；
第2针在6个月后和4～10岁时分别接种第3针和第4针。
而本发明的联合疫苗大大减少了接种次数，在临床上对降低疫苗迟种、漏种等发生率具有积极意义，同时还保证了免疫效果。
本发明联合疫苗的制备方法采用同种人二倍体细胞作为乙型脑炎病毒和水痘带状疱疹病毒的培养基质，适应获得的乙脑毒种病毒滴度高，可以有效的减少原有乙脑疫苗存在的不良反应，适应后的乙脑病毒滴度得到提高，可以达到生产灭活疫苗的需要。同时由于采用相同的β-丙内脂灭活水解、纯化工艺，水解后疫苗制品中无灭活剂残留，易于大规模生产。灭活水痘疫苗可以很好的避免因毒种本身引起二次传播的风险，本发明的联合疫苗与单独使用疫苗相较，联合使用后，抗体转阳率及抗体滴度均无显著差异。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗包括灭活乙型脑炎病毒和灭活水痘带状疱疹病毒；
所述联合疫苗中所述灭活乙型脑炎病毒总蛋白含量与所述联合疫苗中灭活水痘带状疱疹病毒总蛋白含量之比为0.25~4：1；
每剂所述联合疫苗中：含有所述灭活水痘带状疱疹病毒0.4~1份，所述灭活乙型脑炎病毒0.4~1份；
所述乙型脑炎病毒和所述水痘带状疱疹病毒的培养基质为同种人二倍体细胞；
所述人二倍体细胞为ZFB-3细胞；
所述联合疫苗还包括医学上常用的疫苗保护剂，所述疫苗保护剂包括蛋白赋形剂、无机盐和缓冲液；
所述蛋白赋形剂为蔗糖；
所述无机盐为氯化钠；
所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，
所述联合疫苗中：所述蛋白赋形剂的添加量为18~22mg/mL，所述无机盐添加量为8~12mg/mL，所述缓冲液添加量为0.2~1.5mg/mL。
3.一种联合疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
利用人二倍体细胞培养水痘带状疱疹病毒，制备灭活水痘带状疱疹病毒纯化液；
利用所述人二倍体细胞培养乙型脑炎病毒，制备灭活乙型脑炎病毒纯化液；
将所述灭活乙型脑炎病毒纯化液和所述灭活水痘带状疱疹病毒纯化液混合，得到混合病毒纯化液；
对所述混合病毒纯化液添加保护剂，得到联合疫苗；
所述人二倍体细胞为ZFB-3细胞；
所述疫苗保护剂包括蛋白赋形剂、无机盐和缓冲液；
所述蛋白赋形剂为蔗糖；
所述无机盐为氯化钠；
所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述灭活水痘带状疱疹病毒纯化液的制备包括：
将所述人二倍体细胞进行传代培养；
将水痘带状疱疹病毒接种至传代后的所述人二倍体细胞上，进行病毒培养，得到水痘带状疱疹病毒收获液；
对所述水痘带状疱疹病毒收获液进行超滤浓缩，至水痘带状疱疹病毒浓缩液中总蛋白含量为35~85mg/mL；
对所述水痘带状疱疹病毒浓缩液进行灭活、水解处理，得到水痘带状疱疹病毒灭活液；
对所述水痘带状疱疹病毒灭活液进行纯化处理，得到水痘带状疱疹病毒纯化液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述水痘带状疱疹病毒浓缩液进行灭活、水解处理具体为：
所述水痘带状疱疹病毒浓缩液通过β-丙内酯进行灭活；
所述灭活条件为：水痘带状疱疹病毒浓缩液与β-丙内酯的体积比为1：2000~8000配制、灭活温度为2~8℃及灭活时间为12~36h；
将含有β-丙内酯的所述水痘带状疱疹病毒浓缩液进行水解，所述水解条件为：水解温度为34~37℃，水解时间为1~3h。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述灭活乙型脑炎病毒纯化液的制备包括：
将所述人二倍体细胞进行传代培养；
将乙型脑炎病毒接种至传代后的所述人二倍体细胞上，进行病毒培养，得到乙型脑炎病毒收获液；
对所述乙型脑炎病毒收获液进行超滤浓缩，至浓缩液中总蛋白含量为20~100mg/mL；
对所述乙型脑炎病毒浓缩液进行灭活、水解处理，得到乙型脑炎病毒灭活液；
对乙型脑炎病毒灭活液进行纯化，得到灭活乙型脑炎病毒纯化液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述乙型脑炎病毒浓缩液进行灭活、水解处理具体为：
所述乙型脑炎病毒浓缩液通过β-丙内酯进行灭活；
所述灭活条件为：所述乙型脑炎病毒浓缩液与所述β-丙内酯的体积比为1：4000~8000、灭活温度为2~8℃及灭活时间为12~36h；
将含有β-丙内酯的所述乙型脑炎病毒浓缩液进行水解，所述水解条件为：水解温度为34~37℃、水解时间为1~3h。
8.根据权利要求3-7任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述水痘带状疱疹病毒灭活液和/或所述乙型脑炎病毒灭活液通过琼脂糖凝胶4FF凝胶柱层析纯化法进行纯化。
9.一种如权利要求1-2任意一项所述联合疫苗在制备预防乙型脑炎和/或水痘带状疱疹药物、试剂或试剂盒中的应用。
10.一种用于预防乙型脑炎和/或水痘带状疱疹的药物、试剂或试剂盒，其特征在于，所述药物、试剂或试剂盒包括灭活乙型脑炎病毒和灭活水痘带状疱疹病毒；
所述灭活乙型脑炎病毒和灭活水痘带状疱疹病毒通过权利要求3-8任意一项所述的方法制备得到。
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