CN112143714B - 利用低免鸡胚生产h7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明通过对种毒稀释液进行改良，在磷酸缓冲液的基础上，添加了特定比例的天冬氨酸、ZnCl₂和表皮生长因子，实现了低免鸡胚中H7亚型禽流感病毒的高效增殖，其病毒增殖水平和制备的疫苗的免疫效果与SPF鸡胚、非免鸡胚生产疫苗的水平基本接近，然而有效的降低了生产成本，降低了生产门槛，对于H7亚型禽流感疫苗的生产具有积极的意义。

Description

利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法。

背景技术：

禽流感（Avian Influenza）是由正粘病毒科甲型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，被OIE定为I类传染病，其是以侵害呼吸系统为主的疾病，常常导致家禽发病甚至死亡，亦可感染哺乳动物和人。2003年以来，高致病性禽流感在我国和世界许多国家广泛流行，给养禽业造成巨大的经济损失，同时，威胁人类的健康。目前对于禽流感的防控，疫苗免疫接种是最主要的预防手段。

在禽流感疫苗生产中，目前主要依靠鸡胚法，通常采用SPF鸡胚或者非免鸡胚进行培养，但是SPF鸡饲养条件苛刻，SPF鸡胚成本相对较高，非免疫鸡需要养殖场所处位于非疫区，且不能采用疫苗免疫，常规的养殖场所难以达到非免疫的要求。王志方等人研究表明，禽流感病毒可以在含有一定量母源抗体的低免鸡胚中进行培养。

发明内容：

本发明针对现有技术中H7亚型禽流感病毒灭活疫苗主要依赖SPF鸡胚或者非免鸡胚，其生产成本高的问题，旨在提供一种利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种利用低免鸡胚培养H7亚型禽流感病毒的方法，所述方法是将H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液稀释后接种于低免鸡胚，接种后置36～37℃继续孵育72-96小时，收获活胚的鸡胚液，经离心、浓缩后得到H7亚型禽流感病毒原液，其特征在于，所述种毒稀释液是添加了天冬氨酸、ZnCl₂和表皮生长因子的磷酸盐缓冲液。

本发明还请求保护一种利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法，包括利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒原液，经灭活后，向灭活的病毒液中加矿物油佐剂混合乳化制成H7亚型禽流感病毒灭活疫苗，所述利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒原液的方法，所述方法是将H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液稀释后接种于低免鸡胚，接种后置36～37℃继续孵育72-96小时，收获活胚的鸡胚液，经离心、浓缩后得到H7亚型禽流感病毒原液，其特征在于，所述种毒稀释液是添加了天冬氨酸、ZnCl₂和表皮生长因子的磷酸盐缓冲液。

所述磷酸盐缓冲液按照如下方法配制：取NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄﹒12H₂O2.9g，KH₂PO₄ 0.2g，将以上试剂依次溶解于800mL双蒸馏水中，边加边搅拌使其溶解，然后用NaOH或HCl调节至pH 7.4，最后加双蒸水至1000mL，灭菌备用。

所述种毒稀释液中天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl₂的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1ng/mL。

所述种毒稀释液采用如下方法制备得到：按照天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl₂的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1ng/mL的浓度将天冬氨酸、ZnCl₂和表皮生长因子与磷酸盐缓冲液混合，采用0.22μm的滤器过滤除菌，4℃下保存，备用。

所述H7亚型禽流感病毒优选为H7N9亚型H7-Re2株，由中国农业科学哈尔滨兽医研究所鉴定、保管和供应，本公司被授权生产。

所述表皮生长因子为重组人表皮生长因子（rhEGF），购自武汉艾美捷科技有限公司，产品货号为PRP100159。

所述低免鸡胚中母源抗体含量≤3log2。

本发明还请求保护一种利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤一，取H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液作10倍系列稀释，取10^-4稀释度的病毒液，尿囊腔内接种10～11日龄低免鸡胚，每胚0.1ml，接种后置36～37℃继续孵育，不必翻蛋；

步骤二，鸡胚接种后，每日照蛋2次，将在24小时前死亡的鸡胚弃去，24小时以后死亡的鸡胚随时取出，至72小时，将活胚全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷库冷却12～24小时。

步骤三，将冷却12～24小时的鸡胚取出，表面消毒后，将其推入收获操作间，采用全自动收获机对活胚吸取鸡胚液，每若干个鸡胚的胚液混合为一组，在收获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用；

步骤四，收获后的胚液置于灭菌瓶中，每组抽样测定血凝价，血凝价应不低于1:256，并逐瓶抽样2～3ml留样，收获的胚液灭活前置2~8℃保存，应不超过3日；

步骤五，将检验合格的鸡胚液通过离心机离心后，混合于一个浓缩罐内，在无菌条件下用灭菌的二级预过滤柱滤过，除去病毒液的残渣和其他杂质，再用超滤浓缩装置，将病毒液连续循环，水分不断渗去，浓缩至原体积的1/3，完成病毒浓缩过程，同时取样测定毒价，其HA效价不低于1：512；

步骤六，采用甲醛灭活，准确量取甲醛，用注射用水配制成10%的甲醛溶液，混合均匀，然后往鸡胚液加入甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合，按抗原量计，使甲醛最终浓度为0.2%，甲醛加入完毕后，启动浓缩罐升温系统，抗原温度达到37℃时，将抗原倒到另一个已灭菌的灭活罐内开始计时，灭活24小时，期间不停搅拌。至灭活24小时，取样做无菌检验和灭活检验；

步骤七，向灭活的病毒液中加矿物油佐剂混合乳化制成H7亚型禽流感病毒灭活疫苗。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明通过对种毒稀释液进行调整和优化，以磷酸缓冲液为基础，通过添加天冬氨酸、ZnCl₂和表皮生长因子，实现了H7亚型禽流感病毒在低免鸡胚中的高效增殖，采用所述方法制备得到的疫苗，其病毒含量、HA效价以及免疫后HI抗体水平均达到非免鸡胚同样的生产水平，而低免鸡胚的价格低于非免鸡胚和SPF鸡胚，该项技术的推广能够帮助企业降低生产成本，且能在一定程度上减少低免或非免鸡胚原料产量限制对于生产的约束。

另外，在本发明的种毒稀释液中首次添加了ZnCl₂和表皮生长因子，试验表明，两者的配合试验能够提高低免鸡胚接种后的活胚数量，减少鸡胚的死亡，另外，单胚尿囊液的收获量、病毒含量相比磷酸缓冲液作为种毒稀释液得到了很大的提高，病毒含量相比提高了约12倍，活胚数提高了9.1%，平均单枚活胚收获量提高了12.01%，其极大地提高了生产产出和生产效率。并且，单独提高ZnCl₂或表皮生长因子水平，其相应的技术效果相应下降，也就是说，仅有在本发明限定的ZnCl₂的浓度为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1ng/mL的情况下，才能取得最佳的培养结果。以上试验表明，在该种毒稀释液中，ZnCl₂和表皮生长因子在特定浓度比例下发挥了相互协同的作用，不仅能够提高活胚比例，减少死胚的发生，而且其也能促进尿囊液的增加以及尿囊液中病毒的增殖。

综上所述，本发明通过对种毒稀释液进行改良，在磷酸缓冲液的基础上，添加了特定比例的天冬氨酸、ZnCl₂和表皮生长因子，实现了低免鸡胚中H7亚型禽流感病毒的高效增殖，其病毒增殖水平和制备的疫苗的免疫效果与SPF鸡胚、非免鸡胚生产疫苗的水平基本接近，然而有效的降低了生产成本，降低了生产门槛，对于H7亚型禽流感疫苗的生产具有积极的意义。

具体实施方式：

本发明所选用的种毒为H7N9亚型H7-Re2株，由中国农业科学哈尔滨兽医研究所鉴定、保管和供应，所述种毒毒液的病毒含量为10^9.5EID₅₀/0.1mL，HA效价为10log2。

实施例1：种毒稀释液对低免鸡胚培养H7亚型禽流感病毒的影响

本公司在研发中发现，天冬氨酸、ZnCl₂和表皮生长因子对于鸡胚的生长以及鸡胚中病毒的增殖存在一定的影响，为了得到最合适的种毒稀释液，以提高低免鸡胚中病毒的增殖效果，本公司优化了天冬氨酸、ZnCl₂和表皮生长因子的添加量，通过前期研发，发现天冬氨酸最合适的浓度为1.5 mg/mL，因此，本发明中进一步对ZnCl₂和表皮生长因子及其用量进行了进一步的优化试验，具体试验设计如下：

H7亚型禽流感病毒的培养方法，将H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液稀释后，10^-4稀释度的病毒液接种于鸡胚，接种后置37℃继续孵育72小时，收获活胚的鸡胚液，经离心后取上清液，即为H7亚型禽流感病毒培养液。

在收获过程中记录活胚数、尿囊液总收获量，并测定病毒培养液的EID₅₀ 值。

试验设计中，选取低免活鸡胚（母源抗体含量≤3log2）600枚，SPF活鸡胚100枚。

试验分为7组，其中组1-6为低免鸡胚组，每组采用100枚低免活鸡胚，组5位实验组，采用本发明优化后的种毒稀释液；组6位空白对照组，采用磷酸盐缓冲液作为种毒稀释液；组7为SPF对照组，分别采用磷酸盐缓冲液作为种毒稀释液，接种鸡胚为SPF活鸡胚。组1-4为对照试验组。试验过程中，种毒及稀释度、接种方式、孵育条件等均相同，区别仅在于种毒稀释液的组成。具体种毒稀释液的试验设计参见以下表1。

表1 种毒稀释液组成对H7亚型禽流感病毒增殖的影响试验设计

通过对收获的鸡胚进行检验，分别记录活胚数、尿囊液总收获量，并测定病毒培养液的EID₅₀ 值。具体试验结果见下表2。

表2 鸡胚收获和病毒增殖生产情况

基于以上表2的试验结果可知，试验组5（种毒稀释液组成为天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl₂的浓度为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1ng/mL）的活胚数达到96枚，其平均收获量为14.64mL/枚，病毒含量为10^8.64EID₅₀/0.1mL，均高于空白对照组6和对照试验组1-4，经测定，组5的病毒含量相比空白对照组6提高了约12倍，且其活胚数提高了9.1%，平均单枚活胚收获量提高了12.01%；其达到常规SPF活鸡胚中同样的增殖水平，甚至略高，如平均收获量高于组7的13.95mL。通过组5和组1、组2的比较可知，单独添加ZnCl₂或者表皮生长因子均不能保证鸡胚的存活率、单胚的收获量，且病毒含量低；虽然组3和组4中均添加了ZnCl₂和表皮生长因子，其中组3中的ZnCl₂浓度远高于本发明最优的水平，组4中过量添加了表皮生长因子，尽管其取得了优于空白对照组6的活胚数和平均收获量，但是，相比而言，仅有在本发明限定的ZnCl₂的浓度为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1ng/mL的情况下，才能取得最佳的培养结果。以上试验表明，在该种毒稀释液中，ZnCl₂和表皮生长因子在特定浓度比例下发挥了相互协同的作用，不仅能够提高活胚比例，减少死胚的发生，而且其也能促进尿囊液的增加以及尿囊液中病毒的增殖，这在先前报道和现有文献中均不曾报道。并且，通过比较可知，本发明的低免鸡胚增殖方法的病毒培养效果接近SPF鸡胚常规培养方式，然而，低免鸡胚的成本大大低于SPF鸡胚，其能为企业节约大量的成本。

实施例2：利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法

步骤一，取H7亚型禽流感病毒H7-Re2株毒种用种毒稀释液作10倍系列稀释，取10^-4稀释度的病毒液，尿囊腔内接种10～11日龄低免鸡胚，每胚0.1ml，接种后置37℃继续孵育，不必翻蛋；

步骤二，鸡胚接种后，每日照蛋2次，将在24小时前死亡的鸡胚弃去，24小时以后死亡的鸡胚随时取出，至72小时，将活胚全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷库冷却12小时。

步骤三，将冷却12小时的鸡胚取出，表面消毒后，将其推入收获操作间，采用全自动收获机对活胚吸取鸡胚液，每若干个鸡胚的胚液混合为一组，在收获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用；

步骤四，收获后的胚液置于灭菌瓶中，每组抽样测定血凝价，血凝价应不低于1:256，并逐瓶抽样2～3ml留样，收获的胚液灭活前置2~8℃保存，应不超过3日；

步骤五，将检验合格的鸡胚液通过离心机离心后，混合于一个浓缩罐内，在无菌条件下用灭菌的二级预过滤柱滤过，除去病毒液的残渣和其他杂质，再用超滤浓缩装置，将病毒液连续循环，水分不断渗去，浓缩至原体积的1/3，完成病毒浓缩过程，同时取样测定毒价，其HA效价不低于1:512；

步骤六，采用甲醛灭活，准确量取甲醛，用注射用水配制成10%的甲醛溶液，混合均匀，然后往鸡胚液加入甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合，按抗原量计，使甲醛最终浓度为0.2%，甲醛加入完毕后，启动浓缩罐升温系统，抗原温度达到37℃时，将抗原倒到另一个已灭菌的灭活罐内开始计时，灭活24小时，期间不停搅拌。至灭活24小时，取样做无菌检验和灭活检验；

步骤七，向灭活的病毒液中加矿物油佐剂混合乳化制成H7亚型禽流感病毒灭活疫苗。

所述种毒稀释液采用如下方法制备得到：按照天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl₂的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1ng/mL的浓度将天冬氨酸、ZnCl₂和表皮生长因子与磷酸盐缓冲液混合，采用0.22μm的滤器过滤除菌，4℃下保存，备用。

发明人还采用以上同样的方法，将同批次的种毒采用磷酸盐缓冲液稀释后接种非免鸡胚制备得到灭活疫苗，其生产过程与以上方法的差异仅在于鸡胚为非免鸡胚，种毒稀释液为磷酸盐缓冲溶液，将其作为对照组。同时，还设置了空白对照组，其是将同批次的种毒采用磷酸盐缓冲液稀释后接种同批次的低免鸡胚制备得到灭活疫苗，其生产过程与以上方法的差异仅在于种毒稀释液为磷酸盐缓冲溶液。

以上试验组、对照组和空白对照组所涉及的活鸡胚数均为200枚。

在试验过程中，分别测定了步骤四中收获的胚液、步骤五中经浓缩后的胚液中的HA效价和EID₅₀。具体结果见下表3。

表3 浓缩前后的胚液HA效价和EID₅₀

基于以上试验结果可知，采用本发明的疫苗生产方法，其所生产的疫苗原液中的抗原水平达到了常规采用非免鸡胚生产的工艺，而当单独采用低免鸡胚进行接种时，其抗原HA水平达不到本公司相关的生产标准，即浓缩后的HA效价不低于1:512。

对于制备的疫苗，通过接种试验对本发明的低免鸡胚制备的疫苗（本发明的种毒缓冲液）以及以上采用非免鸡胚制备得到的疫苗进行了免疫效力比对。

取21日龄的SPF鸡30只，随机分为3组，其中组1接种本发明的低免鸡胚制备的疫苗（本发明的种毒缓冲液），组2接种采用非免鸡胚制备得到的疫苗，组3为对照组，注射等量的生理盐水，接种量为0.3mL/羽。免疫21天后采血检测HI抗体，经测定，组1中低免鸡胚制苗试验组的HI抗体效价HI均值为10.3，组2中采用非免鸡胚制备疫苗组的HI抗体效价HI均值为10.2，空白对照组3中经检测，其呈现HI抗体阴性。以上试验结果表明，采用低免鸡胚制备得到的疫苗，其免疫性能与采用非免鸡胚制备得到疫苗的免疫性能基本一致。

Claims (7)

1.一种利用低免鸡胚培养H7亚型禽流感病毒的方法，所述方法是将H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液稀释后接种于低免鸡胚，接种后置36～37℃继续孵育72-96小时，收获活胚的鸡胚液，经离心、浓缩后得到H7亚型禽流感病毒原液，其特征在于，所述种毒稀释液是添加了天冬氨酸、ZnCl₂和表皮生长因子的磷酸盐缓冲液；所述种毒稀释液中天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl₂的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1ng/mL；所述低免鸡胚中母源抗体含量≤3log2。

2.一种利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法，包括利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒原液，经灭活后，向灭活的病毒液中加矿物油佐剂混合乳化制成H7亚型禽流感病毒灭活疫苗，所述利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒原液的方法，所述方法是将H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液稀释后接种于低免鸡胚，接种后置36～37℃继续孵育72-96小时，收获活胚的鸡胚液，经离心、浓缩后得到H7亚型禽流感病毒原液，其特征在于，所述种毒稀释液是添加了天冬氨酸、ZnCl₂和表皮生长因子的磷酸盐缓冲液；所述种毒稀释液中天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl₂的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1ng/mL；所述低免鸡胚中母源抗体含量≤3log2。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液按照如下方法配制：取NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄﹒12H₂O 2.9g，KH₂PO₄ 0.2g，将以上试剂依次溶解于800mL双蒸馏水中，边加边搅拌使其溶解，然后用NaOH或HCl调节至pH 7.4，最后加双蒸水至1000mL，灭菌备用。

4.根据权利要求3所述的方法，所述种毒稀释液采用如下方法制备得到：按照天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl₂的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1ng/mL的浓度将天冬氨酸、ZnCl₂和表皮生长因子与磷酸盐缓冲液混合，采用0.22μm的滤器过滤除菌，4℃下保存，备用。

5.根据权利要求1或2所述的方法，所述H7亚型禽流感病毒为H7N9亚型H7-Re2株。

6.根据权利要求1或2所述的方法，所述表皮生长因子为重组人表皮生长因子。

7.一种利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤一，取H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液作10倍系列稀释，取10^-4稀释度的病毒液，尿囊腔内接种10～11日龄低免鸡胚，每胚0.1ml，接种后置36～37℃继续孵育，不必翻蛋；所述种毒稀释液是添加了天冬氨酸、ZnCl₂和表皮生长因子的磷酸盐缓冲液，所述种毒稀释液中天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl₂的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1ng/mL，所述低免鸡胚中母源抗体含量≤3log2；

步骤二，鸡胚接种后，每日照蛋2次，将在24小时前死亡的鸡胚弃去，24小时以后死亡的鸡胚随时取出，至72小时，将活胚全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷库冷却12～24小时；

步骤三，将冷却12～24小时的鸡胚取出，表面消毒后，将其推入收获操作间，采用全自动收获机对活胚吸取鸡胚液，每若干个鸡胚的胚液混合为一组，在收获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用；

步骤四，收获后的胚液置于灭菌瓶中，每组抽样测定血凝价，血凝价应不低于1:256，并逐瓶抽样2～3ml留样，收获的胚液灭活前置2~8℃保存，应不超过3日；

步骤五，将检验合格的鸡胚液通过离心机离心后，混合于一个浓缩罐内，在无菌条件下用灭菌的二级预过滤柱滤过，除去病毒液的残渣和其他杂质，再用超滤浓缩装置，将病毒液连续循环，水分不断渗去，浓缩至原体积的1/3，完成病毒浓缩过程，同时取样测定毒价，其HA效价不低于1：512；

步骤六，采用甲醛灭活，准确量取甲醛，用注射用水配制成10%的甲醛溶液，混合均匀，然后往鸡胚液加入甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合，按抗原量计，使甲醛最终浓度为0.2%，甲醛加入完毕后，启动浓缩罐升温系统，抗原温度达到37℃时，将抗原倒到另一个已灭菌的灭活罐内开始计时，灭活24小时，期间不停搅拌，至灭活24小时，取样做无菌检验和灭活检验；

步骤七，向灭活的病毒液中加矿物油佐剂混合乳化制成H7亚型禽流感病毒灭活疫苗。